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»Plateforme technique stress oxydant " LBFA INSERM1055 Domaine universitaire 2280 rue de la piscine 38400 Saint MarKn D’Hères Gieres

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   »Plateforme  technique  stress  oxydant  "      

LBFA  INSERM1055  Domaine  universitaire  2280  rue  de  la  piscine  

38400  Saint  MarKn  D’Hères  -­‐Gieres  

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Nombre de citations sur le stress oxydant dans la littérature médicale internationale

Harman    théorie  du  vieillissement  

Mac  Cord  Superoxyde  dismutase  

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an9oxydants   ERO

Production défense

Stress  oxydant  

Defini9on  :  «  déséquilibre  de  la  balance  prooxydante/an5oxydante  en  faveur  des  systèmes  de  produc5on  »                      H.  SIES,  1985  

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STRESS OX. ET PATHOLOGIES

Le stress oxydant est une constante de nombreuses maladies Il est impliqué aussi bien dans la genèse que dans les conséquences de ces maladies

Cancers Autoimmunité Cataracte Dégénérescence maculaire Sclérose latérale amyotrophique Photo-veillissement cutané Photosensibilisation Irradiation Intoxications: CCl4, Cd, Fe, alcool, Hémochromatose

Diabéte Insuffisance rénale Mucoviscidose SIDA Choc septique Infarctus du myocarde Ischémies reperfusion Parkinson Thalassémie Greffes d’organes

Maladie d’Alzheimer Stérilités masculines Maladies virales: EBV, HVB Rhumatismes Atherome Asthme Insuffisance respiratoire

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SOURCES  DE  RADICAUX  LIBRES  

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Comment l’organisme contrôle la production radicalaire ?

PRODUCTION    RADICALAIRE  

DEFENSES  ANTIOXYDANTES  

A l’état basal il existe un équilibre entre les radicaux produits et nos défenses anti-oxydantes

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SYSTEME DE DEFENSE ANTIOXYDANTE

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Défense antioxydante

Systèmes enzymatiques

Piégeurs moléculaires

Systèmes de réparation de l’ ADN : BER/ NER

Des Protéines : protéasomes

Des Ac am : MSR

Système de séquestration des métaux de transition : ferritine, ceruloplasmine,

lactoferrine méthionothionines

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Systèmes enzymatiques

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O2

H2O2

O2•

OH•

Cycle redoxNADPH ox.mitochondrie

Fe2+

Fe3+

SOD

O2 + H2O

Catalase

H2O

GSH

GSSG

GPxGR

NADPH+H+

NADP+

Composésélectrophiles

GST

GSH conjugués

L•

LH O2

LOO•

LOOH

Vit E

Vit E•

LOH + O2

Vit C

Vit C•

GSH

GSSG DHLA

ALA

LHLOOH

LO•

LO•Fe2+

Fe3+

Dommagesoxydatifs

Processus de peroxydationlipidique

HOClCl MPO

Vit CFlavonoïdes

ferritine,transferrine,céruloplasmine

Vit C, Vit E, ac urique,GSH , caroténoïdes,

Tau, His…

Vit C

R

R•

ALA : acide α-lipoïqueDHLA : acide dihydro-lipoïqueGSH : glutathion réduitGSSG : glutathion oxydéGPx : glutathion peroxydasesGR : glutathion réductaseGST : glutathion-S-transféraseMPO : myéloperoxydaseHis : histidineLH : acide gras polyinsaturéL• : radical lipidique

LO• : radical lipidique alkoxyleLOO• : radical lipidique peroxyleLOOH : hydroperoxyde lipidiqueR : molécule non radicalaireR• : radical centré sur le carboneSOD : superoxyde dismutaseTau : taurineVit C : acide ascorbiqueVit C• : radical ascorbyleVit E : α-tocophérolVit E• : radical tocophéryle

O2

H2O2

O2•

OH•

Cycle redoxNADPH ox.mitochondrie

Fe2+

Fe3+

SOD

O2 + H2O

Catalase

H2O

GSH

GSSG

GPxGR

NADPH+H+

NADP+

Composésélectrophiles

GST

GSH conjugués

L•

LH O2

LOO•

LOOH

Vit E

Vit E•

LOH + O2

Vit C

Vit C•

GSH

GSSG DHLA

ALA

LHLOOH

LO•

LO•Fe2+

Fe3+

Dommagesoxydatifs

Processus de peroxydationlipidique

HOClCl MPO

Vit CFlavonoïdes

ferritine,transferrine,céruloplasmine

Vit C, Vit E, ac urique,GSH , caroténoïdes,

Tau, His…

Vit C

R

R•

ALA : acide α-lipoïqueDHLA : acide dihydro-lipoïqueGSH : glutathion réduitGSSG : glutathion oxydéGPx : glutathion peroxydasesGR : glutathion réductaseGST : glutathion-S-transféraseMPO : myéloperoxydaseHis : histidineLH : acide gras polyinsaturéL• : radical lipidique

LO• : radical lipidique alkoxyleLOO• : radical lipidique peroxyleLOOH : hydroperoxyde lipidiqueR : molécule non radicalaireR• : radical centré sur le carboneSOD : superoxyde dismutaseTau : taurineVit C : acide ascorbiqueVit C• : radical ascorbyleVit E : α-tocophérolVit E• : radical tocophéryle

Homéostasie  rédox    

SOD  

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Les systèmes enzymatiques de défense

O2 i-

H2O2

SOD Cu,Zn

SOD Mn

H2O

Catalase

Peroxydase (GPx-Se)

Piégeurs de radicaux libres:

Vit E, C, caroténoïdes

i OH Fe++

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Stress  oxydant  

SituaKon  physiologique  

Intensité  du  stress  oxydaKf  

EvoluKon  des  anKoxydants  

AdaptaKon  au  stress  

Mort  cellulaire  

ERO°  Durée  

Marqueurs  du  stress  ox  

+  stress  est  important,  +  il  est  chronique  et  +  les  lésions  s’accumulent    et  deviennent  irréversibles  et  importantes    

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Stress oxydant

oxydation

Protéines lipides

A.D.N.

lipoperoxyda9on    LDLox  

-­‐ Oxyda9on,  (C=O;)  -­‐   non  oxyda9on  (SH)      -­‐ glyca9on  -­‐   enzymes  :  nac9va9on  

Oxyda9on  cassures  Muta9ons  ADNn  =  1base  /130  000  ADN  mt    =  1/8000    

Signalisation cellulaire

°OH  

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-­‐  Régula9on  des  voies  de  signaling    

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Méthodologie  

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Méthodologie  stress  oxydant    

•  STATUT  NUTRITIONNEL  –  Apport  :  enquête  alimentaire  –  Diminu9on  du  statut  

•     En  micronutriment  an9oxydants  •   an9oxydants  endogènes  (GSH)  •  Total  an9ox  capacité  (FRAP,ORAC)  

•  ALTÉRATIONS  BIOCHIMIQUES  –  Lipides:  

•  MDA  ;  TBARs  •  diènes  conjugués  •   isoprostanes  •  Lipoproteines  oxida9on  

–  Proteines  •  Carbonyles  (C=O)  •  Plasma  thiols  (SH)  •   nitrotyrosine  

–  DNA  •  8oxo  d-­‐Guanosine  •  Comet  assay  +FPG  

•     ACTIVITÉS  ENZYMATIQUES  -­‐ An9oxydantes  :  SOD,  GPx,  Grase,  TRXase;  Grase  -­‐   Proxydantes  :  

Xanthine  oxydase;  NADPH  oxydase  

En  rouge  :    analyses  réalisées    au  LBFA  

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Par  défini9on  :  molécules  fragiles  Peuvent  s’oxyder  très  facilement  après  le  prélèvement    ou  lors  du  traitement  de  l’échan9llon  

Problèmes liés à la mesure du stress oxydant

-­‐Techniques  performantes  qui  minimisent  le  risque  d’oxyda9on    

   Traitement  des  tubes  par  les  labo  préleveurs  dans  la  ½  heure  qui  suit  le  prélèvement  Centrifuga9on  des  tubes  doit  être  faite  à  +4°c  Tubes  spéciaux  nécessaires  pour  certains  dosages  (stabilisateurs/  an9oxydants  )  Aliquoter  les  tubes  et  les  congeler  à  -­‐80°  le  plus  rapidement  possible  

Garantie d’une assurance qualité Garantie de résultats

Respect de la Chaîne de froid ( carboglace )

Contraintes  Analy5ques    

Contraintes dans le transport des prélèvements

Contraintes  Pré  –  analy5ques  lourdes    

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Analyse sur sang total Type d’analyse Quantité Contenant Traitement post prélèvement Stockage

Glutathion – Glutathion oxydé 100 µL Eppendorf (1.5 mL)

•  Ajout de 900 µL d’acide métaphosphorique (MPA) à 6 %

•  Centrifuger (10 min, 3000g, 4°C) •  Récupérer le surnageant - 80°C

comet 500 µl Eppendorf Ajout à un mélange 400/100µl RPMI/DMSO – congélation lente

Analyse sur plasma Centrifuger le sang total (10 min, 3000g, 4°C)

Type d’analyse Quantité Contenant Stockage

Biochimie du sang 230 µL Eppendorf (1.5 mL)

- 80°C

Eléments – trace (Zn et Cu) 500 µL Eppendorf « oligo-free »

TBARs 230 µL Eppendorf Groupements thiols 230 µL Eppendorf

Statut antioxydant total 150 µL Eppendorf

Glutathion Peroxydase 150 µL Eppendorf

Analyse sur globules rouges Centrifuger le sang total (10 min, 3000g, 4°C)

Type d’analyse Quantité Contenant Traitement post prélèvement Stockage Eléments – trace

(Zn et Cu) 200 µL Eppendorf (1.5 mL) Dilution au ¼ (600 µL) avec du tampon de lyse (Tris-HCl, 5 mM, pH 7.4)

- 80°C Catalase 200 µL Eppendorf

•  Laver 3 fois les globules rouges avec du chlorure de sodium 0.9 %

•  Prélever 100 µL de culot globulaire •  Diluer au 1/10 avec du tampon de lyse (Tris-HCl, 5

mM, pH 7.4)

Superoxyde dismutase 250 µL Eppendorf •  Laver 3 fois les globules rouges avec du chlorure de

sodium 0.9 % •  Qsp 1 mL d’eau froide

CONTRAINTES  ANALYSES  STRESS  OX  /  QUANTITE  DE  PRELEVEMENT    

Prélèvement  sur  Héparinate  de  Lithium  

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!

1000g  

10000g  10000g  

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Analyses  

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Dosage  AUTOMATE/Hitachi  912  

Biochimie     Stress  Ox    Triglycérides   GPx  cholesterol   SOD  Cu,Zn    

(GR;  Tissus)  glucose   FRAP  Acide  gras  libres  

SH  

Ac  urique   GSH;  GSSG  Protéines  

Dosage  manuel    fluorimètre    :  TBARS,    Spectrophotomètre:  TRX,  Grase,  Catalase;  (SOD  Mn  )  

Tampon;  solu9on    !!!  

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Analyse   Plasma     cerveau   Foie     Muscle   Mito  cerveau  

Protéines  SH   pur   pur   PE  réduite   pur    1/10  

FRAP   1/10   1/10   1/4   1/7  

TBARS   Pur     ¼   1/2   1/10  

Prot  tot  Prot.  Soluble  

Pur  Pur  (PE  réduite)  

1/30  

GPx    1/60   Pur    

1/60    1/4  Cœur  1/10  

1/10  

Grase   1/2  

SOD   1/60  Erythocyte  

Pur      

1/20  

Catalase   Pur   1/50  

TRX   Pur    

GSH   Pur   1/30   1/5  

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Les  superoxydes  dismutases  

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Les  superoxydes  dismutases  

2 O2°- + 2 H+ --------> O2 + H2O2

l o c a l i s a t i o n subcellulaire

 nom abrégé

 cytosol

 SOD1

 mitochondrie

 SOD2

  

 SOD3

 extracellulaire

 SOD4

  

 SOD5

 

CuZn  

Mn  

CuZn  

CuZn  

CuZn  

Cu2+  nécessaire  à  l’ac9vité  cataly9que  Zn2+  :  stabilise  la  structure  

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Principe  du  dosage  La  méthode  est  une  adapta9on  des  dosages  décrits  par  Marklund  et  Marklund  (1980)  La  méthode  emploie  la  xanthine  et  la  xanthine  oxydase  pour  générer  des  radicaux  superoxydes  qui  réagissent  avec  le  2-­‐(4-­‐iodophényl)-­‐3-­‐(4-­‐nitrophénol)-­‐5-­‐phényltetrazolium  chloride  (I.N.T.)  pour  former  le  composé  formazan  rouge.    .    

Xanthine Acide Urique + O2.

I.N.T. Formazan coloré

OU

O2. + O2

. + 2H+ O2 + H2O2

XOD

O2.

SOD

Xanthine Acide Urique + O2.

I.N.T. Formazan coloré

OU

O2. + O2

. + 2H+ O2 + H2O2

XOD

O2.

SOD

Dosage de la superoxyde dismutase (SOD)

L’ac9vité  superoxyde  dismutase  est  mesurée  par  le  degré  d’inhibi9on  de  ceue  réac9on.    Une  unité  de  SOD  diminue  de  moi9é  la  vitesse  de  réduc9on  de  l’INT  dans  les  condi9ons  du  dosage  

°-­‐  

°-­‐   °-­‐  

°-­‐  

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L’autooxyda9on  du  pyrogallol    

Recherche  du  volume  de  pyrogallol  donnant  une  varia9on  d’absorbance  maximale  comprise  entre  0.03  et  0.032  Abs/min    Ceue  absorbance  correspond  à  0%  d’ihinibi9on  Ajuster  le  PH  avec  ac  cacodylique      pour  obtenir  la  varia9on  de  DO  recherché    Λ=420  nm  ;  Temp°  :25°C    

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                   pyrogallol    Reduit                                                    +  O2  

Principe  du  dosage      L’autooxyda9on  du  pyrogallol  est  inhibée  par  la  SOD.              A  un    pH  7.9  à  9.1,  la  réac9on  est  inhibée  jusqu'à  90%  par  la  SOD,  ce  qui  indique  une  totale  dépendance  de  l’anion  superoxyde  (O2

.-­‐)  dans  ceue  autooxyda9on.  Le  principe  du  dosage  est  basé  sur  une  compé99on  entre  la  réac9on  d’oxyda9on  du  pyrogallol  par  O2

.-­‐  et  la  dismuta9on  de  O2.-­‐  par  la  SOD.  

+O2-­‐.    

Une  unité  enzyma9que  est  définie  comme  la  quan9té  d’enzyme  capable  d’inhiber  50%  de  l’oxyda9on  du  pyrogallol.  

SOD  

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                   pyrogallol    Reduit                                                    +  O2  

Principe  du  dosage      L’autooxyda9on  du  pyrogallol  est  inhibée  par  la  SOD.            A  un    pH  7.9  à  9.1,  la  réac9on  est  inhibée  jusqu'à  90%  par  la  SOD,  ce  qui  indique  une  totale  dépendance  de  l’anion  superoxyde  (O2

.-­‐)  dans  ceue  autooxyda9on.  Le  principe  du  dosage  est  basé  sur  une  compé99on  entre  la  réac9on  d’oxyda9on  du  pyrogallol  par  O2

.-­‐  et  la  dismuta9on  de  O2.-­‐  par  la  SOD.  

+O2-­‐.    

KCN  =inhibiteur  de    la  SOD  Cu,Zn    

SOD  Mn  

+KCN  

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Calcul  

SOD  tot  =  (%Inhibi9onX1000)/  (V  PE  X50)  =U/ml  SOD  Cu/Zn  =  SOD  totale-­‐  SOD  Mn  

%  d’inhibi9on  doit  être    de  50%  .  La  valeur  doit  être  comprise  entre  50-­‐60%  :  zone  de  linéarité  d’une  gamme  établi  avec  SOD.    Pour  se  trouver  dans  ceue  zone  :  dilu9ons  si  nécessaire  de  l’échan9llon  ….  

     Faire  deux  essais  :  écart  entre  deux  valeurs  <0,5  

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Exemple1    :    Détermina9on    de  la  dilu9on  de  l’échan9llon    

EchanKllon   diluKon   V1-­‐V2   Calcul  %  InhibiKon  

Éch°  1   1/2   7,927-­‐7,826   (30,15-­‐7,927)x100      =    74%    30,15  

 

Éch°  1    

1/3   1,852-­‐15,145   (30,15-­‐  14,852)x100      =50%    30,15  

 

Blanc  Tampon  avec  pyrogallol    =  30,15  

On  travaille  avec  la  dilu9on    1/3      

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Courbes  standard    :    %  inhibi9on  

60  %  

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0

5

10

15

20

muscle foie

Radic

aux libres (unités

arbitraires)

au repos

à l'exercice

Concentra9ons  de  radicaux  libres  (évaluée  par  RPE)  et  lipoperoxida9on    dans  le  muscle  et  le  foie  

 après  un  exercice  épuisant.  

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Repos Modéré Intense

TBARs/Prot

Mesure de la Production Mesure de la Peroxydation

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Sport et stress oxydant

•  preuves directes et indirectes

• Augmentation avec exercice chez sujets non entraînés

•  Chez sujets entraînés => pas d’augmentation du stress oxydatif après exercice épuisant

- Adaptation des systèmes de défenses enzymatiques

sédentaires amateurs professionnels Haut niveau

SOD +/-

275 40

590 230

400 185

325* 65

Cyclisme : Tour d’Espagne

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:  Joël  Pincemail,  Jacques  Lecomte,  Emmanuel  Collart,  Jean-­‐Pierre  Cas8aux,  Jean-­‐Olivier  Defraigne.  

Stress oxydant, antioxydants et exercice physique

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GPx-­‐SelCyst-­‐SeH  +  GS-­‐SG  

GPx-­‐SelCyst-­‐Se-­‐SHG  

GPx-­‐SelCyst-­‐SeOH  +  GSH  

GPx-­‐SelCyst-­‐SeOH  

GPx-­‐SelCyst-­‐SeH   H2O2  ou  ROOH  

H2O  ;  ROH  

GSH  

H2O  GSH  

GSSG  

La  glutathion  peroxydase  (Se)  

Régénère  les  lipides    oxydées  ROOH  +  2GSH  è  GSSG  +H20  +  ROH  Détoxifie  :  H2O2  +2GSH  è  GSSG  +  H20  +ROH  

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GPx  plasma,  plaqueues;  GR;    9ssus    

•  Principe  du  dosage.  repose  sur  le  couplage  des  réac9ons  enzyma9ques  suivantes,  faisant  

intervenir  la  glutathion  peroxydase  (GPX)  et  la  glutathion  réductase  (Grase).  

•  La  GPx  réduit  un  hydroperoxyde  tandis  que  le  glutathion  est  oxydé  (GSSG):                2  GSH  +  tBOOH                                                              GSSG    +  tBOH  +  H2O          

     GSSG  +                                                                                                                                  2  GSH  +  NADP+  

GPX  

GRase  

NADPH  +  H+    λ  340nm    

Nous  mesurons  la  quan9té  de  glutathion  oxydé  par  le  terbutyl  en  suivant  la  décroissance  d’absorp9on  du  NADPH2  à  340  nm.      Les  résultats  obtenus  sont  exprimés  en  U/g  d’hémoglobine  pour  la  GPX  érythrocytaire,  en  U/l  pour  la  GPX  plasma9que  et  en  U/g  de  protéines  pour  la  GPX  cellulaire  et  9ssulaire.  

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La  méthode  a  été  décrite  par  Akerboom  et  al.  (Akerboom,  1981).  La   forme   réduite   et   oxydée   du   glutathion   est   déterminée   en   u9lisant   une   méthode   ciné9que   où   GSH,   GSSG   et   la  glutathion   réductase   (GRase)  provoque  une   réduc9on  con9nue  du  DTNB   (agent   réducteur  des  ponts  disulfures)  par   le  NADPH    en  selon  la  réac9on  suivante  :    

Dosage du glutathion (GSH) et du glutathion oxyde (GSSG)

•   Principe  du  dosage  :  cinéKque  enzymaKque    

1)        Dosage  des  GSH  totaux  

2)      Dosage  des  GSSG  

2)  En  présence  de  Vinyl-­‐pyridine    GSH-­‐VP  +GSSG  +NADPH,H+è  NADP+  +2GSH    2GSH  +DTNBè  GSSG  +  2TNB    

Déduc9on  GSH  

λ412  nm    

2GSH + DTNB GSSG + 2 TNB

GSSG + NADPH+H+ NADP+ + 2GSHGRase

2GSH + DTNB GSSG + 2 TNB

GSSG + NADPH+H+ NADP+ + 2GSHGRase

1)  La  forma9on  du  5-­‐thio-­‐2-­‐nitrobenzoate  (TNB)  est  suivi  par  spectrophotométrie  à  412  nm  en  ciné9que  

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La  thioredoxine  réductase  

•  Régénère  une  protéine  très  importante  la  thioredoxine  qui:  – Détruit  les  peroxydes    – Régénère  les  protéines  dont  les  thiols  sont  oxydés  – Par9cipe  dans  la  régula9on  de  plusieurs  voies  de  signalisa9on  cellulaire  et  contrôle  l’ac9vité  des  facteurs  de  transcrip9on  NFkB  et  p53  

– Nécessaire  au  fonc9onnement  du  cycle  cellulaire  (mul9plica9on  des  cellules)  

 

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+2 TNB  

Principe  du  dosage  de  la  TRxR  

•  Principe  du  dosage  :  Mesure cinétique •  La   méthode   est   une   adapta9on   des   dosages   décrits   par  Marklund   et   Marklund  

(1980 •  Détermination de l’activité de la TRxR  par méthode colorimétrique à 412 nm

    + DTNB + NADPH + H+ + NADP+  

     

 

S  I  S  

SH    SH  

TRxR  

la réaction est réalisée en absence et en présence d’un inhibiteur de la TRxR:

l’aurothioglucose

X  

2TRSH   TRS-­‐STR  

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0,02  

0,04  

0,06  

0,08  

0,1  

0,12  

0,14  

1   2  Se-­‐                                                                    Se  +  

U/gP  

Foie  

0  

0,05  

0,1  

0,15  

0,2  

0,25  

1   2  

Trx  U/g  P  

Coeur  

TRXase-­‐Se  

Se-­‐                                                                    Se  +  

P<0,05  

P<0,001  

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 Mesures  d  ’effets  biologiques    -­‐  noKon  de    biomarqueurs    

Protéines lipides

A.D.N.

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produits de décomposit ion

COOH

COOH

COOH

OOH

OO

O O

e ndope roxyde hydrope roxyde

+ Fer

arachidonate

radical

radicalpe roxyl

arachidonate

radicalHO

O2radical die ne conjugué

+

+

+

e thanepentane

Hydroxynone nal

COOH COOH

COOH

COOH

O

OH

réaction enchaîneradicalaire

O O

MDA

f igure 3 : schéma de la peroxydation de l‘acide arachidonique

++

STRESS  OXYDANT  ET  LIPIDES  :  LA  PEROXYDATION  LIPIDIQUE  

Mesure  des  produits  «  terminaux  »  de  peroxyda9on  

Réagissent  avec  l’acide  

thiobarbiturique  

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Détec9on  en  fluorescence  

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Dosage des espECes rEActives à l’acide thiobarbiturique (TBARs) • Principe  du  dosage    

Ac thiobarbiturique + MDA MDA(TBA)2 (complexe de couleur rose)Ac thiobarbiturique + MDA MDA(TBA)2 (complexe de couleur rose)

 Les  fonc9ons  aldéhydiques  du  dialdéhyde  malonique  (MDA),  libérées  par  hydrolyse  acide  à  95°C  réagissent    avec  l’acide  thiobarbiturique    (TBA)pour  donner  un  complexe  coloré  en  rose  (MDA(TBA)2).  Ceue  méthode  fluorimétrique  décrite  par  Richard  et  al.  (Richard,  1992)  permet  la  quan9fica9on  spécifique  des  complexes  formés.    

Blanc de gamme Point de gamme Blanc de Plasma

Plasma

100µL eau 100µL étalons (1à8 µM)

100 µL plasma 100 µL échantillon

Mélange TBA/HClO4

750 µL

Fermer non hermétiquement les tubes – Vortexer Bain-marie 95°C - 60 min

Refroidir dans la glace pour arrêter l’hydrolyse (2-3 min) Butanol -1 2mL

Vortexer Centrifuger 10 min à 4000 tr/min à 4°C

Lecture au fluorimétre sur phase supérieure λ d’excitation : 532 nm - λ d’émission : 553 nm

Limites  :  peu  spécifiques  du  MDA  mais  très  bonne  corréla9on  TBARS/MDA.  Améliora9on  specificité  :      dosage  du  MDA  par  HPLC  avec  détecteur  fluorimétrique  

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Age and caloric restriction 3lipid peroxidation

age (months)

pero

xides

nmol/

ml

0

1

2

3

4

5 18 31

ALCR

Tian 1995

TBAR

S  µm

ol/L  

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• Pas  d  ’extrac9on  •   Analyse  sur  les  noyaux  inclus  dans  de    l  ’agarose  et  présentés  sur  lame  •   Dénatura9on    •     migra9on  par        éléctrophorèse  

Dosage des lésions à l’ADN : les test COMET • Principe  du  dosage    

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Unité    arbitraire      

(%  tail,  tail  lengh,  TEM,  OTM  )  

•   FragmentaKon  de  l  ’ADN  •  Cassures  de  mono-­‐brins      d’ADN  (Single  Strand    Break)  

Mesures  

 ou  Score  visuel    

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Comparaison des Tail DNA entre cellules du sang total et splénocytes murins

selon l'âge de l'animal

00,51

1,52

2,53

3,5

Souris

2 mois

Souris

3 mois

Souris

4 mois

Souris

6 mois

Tail

DN

A

Comparaison  des  Tail  DNA  entre  cellules  du  sang  total  et  splénocytes  murins  isolés  à  parKr  d’organes  d’animaux  dont  les  âges  varient  entre  chaque  essai.    

 

5eme  année  recherche    :  Mathilde  Bayer  

sang  

splénocytes  

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 è les  propriétés  an9oxydantes  ou  la  non  toxicité  d’une    molécule/nutriment/aliment  (M/N/P)  

è   un  stress  oxydant  dans  l’é9ologie  d’une  pathologie  (ex  :  insulino-­‐résistance)  

è   Simuler  expérimentalement  un  stress  oxydant  pour  l’explora9on  des      effets    biologiques  

 

V.  EXEMPLES  D’ETUDES  REALISEES  AU  LBFA  

Pour  Evaluer  :    

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Head (30µm) Head Tail (80 µm)

Cellules  témoins   Cellules  après  dommages  oxyda9fs  

H N

N

N

N

O H

2 N H

H N

N

N

N

O H

2 N H

0

20

40

60

80

100

120

140

Tail DNA

témoinsfumeurs

Effet  du  tabac  sur  les  dommages  à  l’ADN  

Effet  du  tabac  sur  les  dommages    à  l’ADN  

Témoins  :  n=10  Fumeurs  :  n=10  

HININGER  I,.  Et  al.  Mut.  Res.  14  (558)  :75-­‐80;  2004  

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Effet  du  tabac  sur  le  taux  de  GSH  

720740760780800820840860880900920

GSH

non fumeurFumeur

*  *  

I.  HININGER,.    Eur  J.  Clin.  Nutr.  51,  601-­‐606;  1997  

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TEST  D’OXYDATION  DES  LDL    

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Sujets en syndrome métabolique

TBARS (µm/L)

Corrélation entre le niveau de la peroxydation lipidique et la glycémie

TBARS  µM  

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Effet  du  régime  «  Fructose  »  :    1)  sur  les  ac9vités  enzyma9que  an9.ox.  

0

0,5

1

1,5

2

Témoin Fructose

Cu,Zn  SOD  (U/g  Hb)  

*   *  

150

155

160

165

Témoin Fructose

Se-­‐GPx  (U/g  Hb)  

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Bénéfice  du  régime  enrichi  en  extraits  de  thé  vert    sur  la  diminu9on  de  l’oxyda9on  des  protéines  et  des  lipides  au  niveau  cérébral  

Péroxydation lipidique (TBARs)

0123456

Fructose Fructose + thé

µM/g

P

*  

Peroxyda9on  lipidiques  (TBARS)   Oxydation des protéines (groupements SH)

0

50100

150

200

Fructose Fructose + thé

µM

/gP

*  

Groupements  thiols  protéiques  

Effet  du  régime  «  Fructose  »  enrichi  en    extrait  de  thé    :    

2)  sur  sur  le  statut  GSH/GSSG.  

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Témoin Hacat

HACAT + H2O2 50µM

p

SH 77.98 ± 6.79 53.48 ± 6.04 0,001

TBARS 0.11 ± 0.03 0.17 ± 0.02 0,01

Comètes 4 ± 0.27 6 ± 0.4 0,002

Effet  de  H2O2    (50µM)  sur  les  marqueurs  du  stress  oxydant  

è   MODELE  CELLULAIRE  PROOXYDANT      

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200H2O2  µM  

%  DNA  dommages  

Effet  dose-­‐réponse  de  H2O2    sur  les  dommages  à  l’ADN  (comet)  

100%  

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Les  Limites  des  marqueurs    du  stress  ox    

•   Pas  de  standardisa9on  :  valeur  laboratoire  •  Analyse  pas  tjs  nécessaire  :    

–  ex  :  Gpx  si  statut  en  Se  •  extrapola9on  difficile  à  l’échelle  individuelle  •   adapta9on  «  physiologique  »  au  stress  oxydant  :  quelle  

interpréta9on  ?  •   quelles  valeurs  pour  une  pathologie  ?  •  Nécessité  de  plusieurs  marqueurs  :    

-­‐  Des  valeurs  élevées  des  systèmes  de  défense  ?  Protec5on  ou  exposi5on  à  un  stress  

-­‐  Bases  oxydées  :  répara5on  ou  dommages  ?  

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perspec9ves  

•  Innover:  nouveaux  marqueurs,  nouvelles  technologies  – Valida9on  chez  animal  

•  Standardiser  les  méthodes  et  protocoles  •  Valider  dans  des  études  de  cohortes  en  comparant  biomarqueurs  et  appari9on  des  cancers  

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CONCLUSION  • Le  stress  oxydant  est  une  réalité  biologique  

• Indicateur  :    -­‐  d’un  déséquilibre    rédox  de  l’organisme      -­‐  d’altéra9ons  biologiques              -­‐    ils  ne  sont  pas  spécifiques  d’une  pathologie        -­‐  De  risque  de  développer  dans  un  futur  plus  ou    

moins  proche  des  maladies  (?)  

•   Leur  interpréta9on  doit  être  prudente  

•   L’évolu9on  de  la  plateforme  permeurait  une  évolu9on  dans  la  compréhension  des  ERO°  comme  des  médiateurs  cellulaires  et  non  comme  des  espèces  toxiques              

ER0°

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Biomarqueurs  et  alléga9ons-­‐santé  

•  Quelles  revendica9ons  des  aliments  –santé  peuvent  découlées  d’un  effet  sur  un  biomarqueur  de  risque:  –   Effet  protecteur?  –  Diminu9on  de  facteurs  de  risque  ?  –  Ou  effet  spécifique  vis  à  vis  d’un  mécanisme:  ex  améliora9on  de  l’élimina9on  des  substances  carcinogénes,    protec9on  de  l’ADN,  …?  

•   doit  on  exiger  un  ensemble  de  marqueurs,  et  non  un  marqueur  isolé:  – Métabolisme  +  génotoxicité  +  apoptose  +  immunité