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Cécile M. Bébéar 04/12/2006 1

L’ADN BACTERIEN

- Chromosome - Plasmides


1. Chromosome

1.1 Mise en évidence

1.1.1 Microscopie optique

- Difficile (beaucoup d’ARN) - Après RNAse puis colorants basiques - Agents intercalants fluorescents

bromure d'éthidium (UV), acridine orange

é


1.1.2 Microscopie électronique

- Aspect fibrillaire, clair - Pas de membrane nucléaire


1.2 Structure et organisation

1 seul / bactérie, circulaire, pas de membrane nucléaire

- marquage à la thymidine tritiée 3H - transfert génétique par conjugaison

Exceptions :

- Chromosome linéaire: Borrelia, Streptomyces - 2 ou 3 chromosomes: Brucella, Vibrio

cholerae, etc..

A l'intérieur de la cellule: molécule d'ADN circulaire surenroulé, sous la responsabilité d'enzymes essentielles, les topoisomérases (ADN gyrase)

E. coli : 1,6 mm (bactérie : 1 x 2 µm) Surenroulement = moyen idéal pour compacter une molécule circulaire dans un petit espace


→ ≠ formes topologiques : superenroulée, circulaire relâchée ou linéaire, visibles par ultracentrifugation, m. électronique ou électrophorèse en gel d’agarose.


Taille

Organisation in vivo

- Core central + boucles (50)

Core : ARN polymérase + ARN (messagers) - Lien avec la membrane cytoplasmique


Réarrangements génomiques au sein du génome bactérien: délétion, duplication, inversion

1.3 Réplication de l'ADN

Semi-conservative

Démarre à une origine de réplication, avec une fourche bidirectionnelle

Système très complexe avec nbses protéines et enzymes

- ADN polymérases - topoisomérases - utilisation pratique en BM (séquençage, PCR,

hybridation ADN avec sondes marquées)

⇒ Applications Caractérisation de l’ADN Pratiques Amplification de l’ADN

Séquençage de l’ADN ADN, cible d’antibiotiques


1.4 Caractérisation de l’ADN bactérien

1.4.1 Taille

1.4.2 Composition en bases : % G+C

- paramètre quantitatif Tm (température de fusion)

simple brin

double brin

Séparation des 2 chaînes de la double hélice par dénaturation ⇒ DO260 ↑, fonction du nb de paires GC :

- variable en fonction des espèces - critère taxonomique, de classification des bactéries Ex : 26-28% pour les mycoplasmes

60% pour certaines espèces


1.4.3 Hybridation ADN-ADN % ≥ 70% : même espèce 30 < % < 70% : espèces proches

1.4.4 Etude du polymorphisme de restriction de l’ADN chromosomique

- Intérêt épidémiologique pour faire une comparaison

fine de souches de même espèce ou pas (infection nosocomiale)

- Hydrolyse de l’ADN par les enzymes de restriction :

profil de restriction, différent suivant les espèces bactériennes et les souches au sein d’une même espèce

- 3 méthodes

Profil de restriction après électrophorèse conventionnelle (Restriction Fragment Length Polymorphism)


Lecture difficile car nombre de bandes très élevé Présence de plasmides → perturbation du profil Interprétation simplifiée possible avec un logiciel informatique

Etude après hybridation (Southern blot)

- Plusieurs étapes

1. Hydrolyse de restriction de l’ADN bactérien total et

séparation des fragments par électrophorèse conventionnelle en gel d’agarose

2. Transfert sur membrane de nylon ou nitrocellulose 3. Hybridation avec une sonde nucléique marquée

"chaude ou froide" Lecture simple → nombre réduit de bandes révélées


1-clivage enzymatique de restriction

2- électrophorèse sur gel d'agarose

3- dénaturation dans le gel des fragments de restriction

4- transfert sur support solide (membrane de nylon ou nitrocellulose) par capillarité (buvardage)

5- fixation de l'ADN sur la membrane par cuisson (mb. nitrocellulose) ou exposition U.V (mb.nylon)

6- hybridation avec une sonde marquée dénaturée 7- lavages

8- autoradiographie


Sondes utilisables? Complémentaires de :

- un gène spécifique - une séquence d’insertion

Ex: programme national de comparaison des génotypes de M. tuberculosis → RFLP IS6110

- gènes codant pour les ARNr 16S, 23S = ribotypage ou ribotypie (cf ARN)

FIG. 3. Southern blot hybridization of the IS probe to EcoRI digests of DNAs from 11 strains of M. fermentans. The unmarked lane corresponds to the size marker (in base pairs). Lanes 1 to 7, articular isolates, lane 8, urethral isolate; lanes PG (strain PG18) K7, and Mi, references strains. (A) Ethidium bromide-stained 0.8% agarose gel. (B) Autoradiography of a Southern blot of the gel in panel A for the IS.

Profil de restriction après électrophorèse en champ pulsé (PFGE)

- Principe Champs électriques dans des angles de direction différents et activés alternativement (champs pulsés). "Gold standard" des méthodes de typage moléculaire. → Obtention de gros fragments d’ADN, enzymes de restriction qui coupent peu.


- Différents systèmes, règles d’interprétation - Exemple : Enquête microbiologique

épidémiologique sur différentes souches de Legionella pneumophila

↓ Définir s'il s'agit d'une légionellose communautaire (liée ou non à un voyage) ou nosocomiale, et de repérer les cas groupés.


1.5 Amplification d’une séquence déterminée par Polymerase Chain Reaction (PCR) Objectif : obtenir un grand nombre de copies d’une séquence donnée d’ADN Plusieurs étapes : dénaturation, hybridation, extension Notion de PCR en temps réel, de PCR quantitative… Applications en Bactériologie

- Détection de certaines bactéries de culture difficile (Chlamydia trachomatis)


- Caractérisation de certains gènes : facteurs de virulence, résistance aux antibiotiques (gène mecA) etc…

- Comparaison de souches


1.6 Séquençage de l’ADN

Technique enzymatique de Sanger aux didésoxynucléosides triphosphates ou "terminateurs de chaîne" ++

Principe : synthèse d'un brin d'ADN complémentaire du brin dont on veut déterminer la séquence

5' GCTAAGTCCTGTGAC 3' 3' ← CTG 5'

Utilisation d'une amorce qui va se fixer en 3' du brin à séquencer, à partir de laquelle l'ADN polymérase va copier la matrice. Utilisation de didésoxynucléosides triphosphates (ddNTPs) analogues de désoxynucléosides triphosphates (dNTPs) sans groupement OH en 3' → incorporation dans une chaîne d'ADN en cours de synthèse puis STOP de la chaîne (pas de liaison suivante possible). Automatisation du séquençage à l'heure actuelle avec un marquage non radioactif par des fluorochromes des ddNTPs : → fluorescence émise lue par un laser qui transmet les informations à l'ordinateur.


A

Traitement informatique de la séquence

B

Exemple d'un gel de séquençage et d'un électrophorégramme. L’image de la migration électrophorétique des produits d’extension (A) est traitée à l’aide du logiciel « Sequencing Analysis 3.3 » afin de déterminer la séquence nucléotidique du produit de chaque piste (B).


1.7 Antibiotiques agissant sur l’ADN

1.7.1 Quinolones et fluoroquinolones

- Acide nalidixique, ciprofloxacine - Blocage de la synthèse de l’ADN au niveau de 2

topoisomérases bactériennes ADN gyrase : GyrA, GyrB Topoisomérase IV : ParC, ParE

→ interaction complexe entre quinolone, enzymes et ADN → inhibition de la réplication

1.7.2 Rifampicine Inhibition de la transcription de l’ADN en ARNm par inhibition de l’ARN polymérase (sous-unité β).

1.7.3 Nitroimidazolés

- Actifs à l’état réduit : seulement chez anaérobies - Fixation des dérivés réduits sur l’ADN → coupures

des brins → bactéricidie

1.7.4 Nitrofuranes

- Inhibition de la synthèse des folates - Rôle essentiel dans la synthèse des acides

nucléiques


2. Plasmides

2.1 Définitions

ADN bicaténaires, extrachromosomiques Ex : contenu plasmidique de souches de Klebsiella

Capables de réplication autonome : réplicons (oriC +) Transmis de façon stable à la descendance Facultatifs → propriétés nouvelles, meilleure adaptation des bactéries Aspect - 0,5 à 500 kpb - circulaires sauf certains linéaires (Borrelia burgdorferi: 1 chr. linéaire + 21 plasmides linéaires) Nomenclature : pIP15, pUC etc….

2.2 Réplication

Différents systèmes Utilisent les enzymes de la bactérie ou codent pour leurs propre enzymes


Contrôle génétique, propre au plasmide → régulat° du nombre de copies du plasmide dans

la bactérie : - grands plasmides : 1 ou 2, plasmides mono-

copies - petits plasmides : plusieurs, plasmides multi-

copies (10 à 50 ) → vecteur de clonage ++

→ Classification en groupe d’incompatibilité (Inc)

2.3 Transfert horizontal

2.3.1 Plasmides conjugatifs

- Autotransférables d'1 bactérie à 1 autre par la conjugaison, souvent sans spécificité d’hôte (diffusion entres espèces différentes ++)

- Grands plasmides, plasmide F chez E. coli: 90 kb codent pour pili : exemple pili F ou pili sexuels


2.3.2 Plasmides non conjugatifs

- Petits plasmides 5 kb - Transfert possible

o par mobilisation (coexistence avec un plasmide conjugatif)

o ou par transduction, transformation…

2.4 Rôle dans la résistance aux ATB

2.4.1 Mise en évidence

Epidémie de diarrhées à entérobactéries (Shigella) multirésistantes au Japon (1950)

2.4.2 Fréquence

Mécanisme de résistance le plus répandu Présents chez la plupart des Gram+ et Gram-


2.4.3 ATB concernés : tous !

- β-lactamines, aminosides, macrolides, chloramphénicol, tétracyclines…

- Plusieurs gènes de résistance sur 1 plasmide - Mécanisme : souvent production d’enzymes

inactivant l’antibiotique - Egalement résistance antiseptiques, métaux lourds..

2.4.4 Transfert

- Transfert horizontal ⇒ extension résistance, entre espèces voisines ou pas

- Transfert entre 2 plasmides, ou entre plasmide et chromosome (transposon, intégron)

2.5 Rôle dans le pouvoir pathogène

- Exotoxines (E. coli) - Facteurs d’adhérence - Facteurs invasifs (Shigella) - Oncogénèse….


2.6 Métabolisme

- Acides aminés, hydrates de carbone, hydrocarbures

2.7 Plasmides cryptiques Ex : Addition de toutes ces propriétés dans une seule souche bactérienne

2.8 Caractérisation des plasmides

2.8.1 Nombre, taille

- Comparaison du profil plasmidique de différentes souches.

- Comparaison de la taille des fragments obtenus après hydrolyse de restriction.


- Limites : o mobilité et instabilité des plasmides o possibilité de modification génétique des

plasmides (transposition) o faible pouvoir discriminant si les bactéries

hébergent seulement 1 ou 2 plasmides. o technique supplantée actuellement par

l’étude de l’ADN chromosomique.

2.8.2 Structure : extraction, purification et analyse de l'ADN plasmidique


3. Transposons (Tn)

3.1 Historique

- Expériences de génétique du maïs - Recombinaison de gènes de résistance aux

antibiotiques avec accroissement de la taille du plasmide receveur.

3.2 Définitions

- Séquences d'ADN mobiles pouvant se déplacer d'un site à un autre de l'ADN sans jamais apparaître sous forme libre

- 700 à 10 000 pb

- Pas de réplication autonome mais codent pour leur propre transposition (transposase)

- Transposition : addition de gènes de taille définie au sein d’un génome (chromosome ou plasmide) en l’absence d’homologie de séquence nucléotidique :


o au sein d'un même chromosome Chromosome ⇔ Chromosome Chromosome ⇔ Plasmide

o Pas besoin d'homologie génétique entre le Tn et le site d'insertion pour qu'il y ait intégration ou transposition

= recombinaison illégitime

- Plusieurs modes de transposition selon, par ex, qu'il y ait ou non conservation du Tn au site donneur.

- Tn conjugatifs, capables d'autotransfert, de grande taille.

Ex: Tn916 (gène tet(M) de résistance à la tétracycline) chez Enterococcus faecalis, transféré in vitro et in vivo chez ≠ espèces bactériennes.

3.3 Classification

- Les plus simples: séquences d'insertion des bactéries "IS", extrémités identiques avec séquences inverses répétées (IR), (Figure (a)).

- Les plus complexes: véhiculent d'autres gènes que ceux nécessaires à leur transposition (excision + intégration) ex : gènes de R aux ATB, (Figure (b)).

- Plusieurs familles de Tn, chez les bactéries à Gram négatif et bactéries à Gram positif .


3.4 Conséquences lors de l'insertion dans l'ADN

⇒ Modifier l'expression des gènes de la bactérie

- Patrimoine génétique commun à la bactérie, « génie génétique in vivo » de la bactérie.

- Tn=agent mutagène par insertion :

- Réarrangements génomiques - Propriétés additionnelles portées par les

gènes du Tn (R ATB, gènes de virulence) - Utilisés en biologie moléculaire: mutagenèse in

vitro par transposition aléatoire


4. Intégrons (In) 4.1 Définition

- Système de capture et d’expression des gènes sous

forme de cassettes. - Cassettes : éléments génétiques mobiles capables

d’être intégrés et excisés par un mécanisme de recombinaison site spécifique médié par une intégrase

- Insérés dans des plasmides, des transposons ou dans

le chromosome bactérien - bactéries à Gram négatif+++

Plasmide Transposon

Intégron

4.2 Structure - Incapables d’auto réplication, immobiles - Portés par 1 réplicon (plasmide ou chromosome) ou 1

élément transposable - Plusieurs classe d’In selon la nature des gènes

codant pour l’intégrase


- Différences avec les Tn : Pas de gène dans les cassettes qui catalyse leur mouvement pas de séquences inversées répétées aux extrémités

intégrase cassette 4.3 Fonction - Cassettes : gènes de résistance aux ATB ou aux antiseptiques → dissémination, mosaïque de combinaisons ++ - Bactéries à Gram négatif essentiellement, >60 cassettes décrites 5. Modifications de l’ADN génomique (génétique bactérienne) - Modification du génome : mutations, modulation de l’expression des gènes.

- Acquisition de gènes (transformation, conjugaison, transduction).


- Applications en biologie moléculaire (recherche, industrie alimentaire, pharmaceutique) : clonage de gènes, mutagenèse par insertion, transfert de plasmides etc… Pour en savoir plus : http://www.microbes-edu.org/etudiant/


LE RIBOSOME BACTERIEN

Très nombreux : 25 000 / bactérie en ↑ active → aspect granulaire

Certains : polyribosomes liés à l'ARNm (~ 40) parfois liés à la membrane cytoplasmique 1. Structure

1.1 Taille : ~ 20 nm ∅

1.2 Deux sous-unités

30S 70S

50S

1 ensemble (70S) ou 2 sous-unités fonction de la [c] en Mg++ : forte [c] 2-20 mM →70S faible [c] 0,1-1 mM →30S + 50S

Aspect asymétrique « armchair-like » : 50S « embryo-like » : allongée (30S)


2. Composition

Globale : 2/3 ARNr 1/3 protéines

36 (L1 - L36)


Figure 12. Structure du ribosome 70S de T. thermophilus déterminée parcristallographie aux rayons X (355). A. Vue de l’interface entre les deux sous-unités, sous-unité 30S à gauche, sous-unité 50S à droite avec un aminoacyl-ARNt en orange àl’interface, au niveau du site A. B. Vue de l’arrière de la sous-unité 50S, indiquant la sortie du tunnel. C. Vue de la sous-unité 50S depuis l’interface entre les deux sous-unités. Les ARNt présents aux sites A, P et E sont en orange et rouge. D. Vue de la sous-unité 30S depuis l’interface entre les deux sous-unités.

DC

Rotation90°

Tunnel de sortie

A B

39


3. Protéines ribosomiques

B

D

C

Figure 15. Le tunnel de sortie des polypeptides (d’après 219). A. La sous-unité 50S a étécoupée en deux dans la longueur du tunnel et ouverte comme un livre. L’ARNr est en bleu clair; les protéines sont en vert. PT, centre peptidyl transférase. B. Localisation des domaines de l’ARNr 23S et des protéines ribosomiques autour du tunnel. C. Vue rapprochée de la première moitié du tunnel montrant la proximité du centre peptidyl transférase et des protéines L4 et L22 formant une constriction. D. Structure secondaire de l’ARNr 23S. Les séquences approchant le tunnel sont en rouge.


⇒ Exemple d’applications: - Etude de l’assemblage des ribosomes - Etude de la résistance aux antibiotiques agissant sur

le ribosome 4. ARN ribosomiques ARNr

4.1 Opérons ribosomiques - Regroupent les gènes codant pour les ARNr - Nombre variable selon les espèces 1 à 2 pour mycoplasmes 7 pour E. coli (rrnA etc... )

E. coli


4.2 Structure générale d’un opéron ribosomique

- Gène 16S - ARNt - gène 23S - gène 5S – ARNt

- Séquence des opérons

- gènes des ARNr presque identiques pour une bactérie et très conservés entre les espèces

- régions situées avant, entre et après les gènes, différentes (« spacers »)

- région 16S – 23S : 1 ou 2 tRNA région après 5S : 0 à 2 tRNA

- ARNr 16S très utilisé - séquences connues pour très nb bactéries - zones très conservées, zones variables

(signature oligonucléotidique pour certains groupes de bactéries)


4.2 Structure des ARNr

- ARNr 16S organisé en 4 domaines (structure secondaire)


- ARNr 23S organisé en 6 domaines

5. Applications

5.1 Phylogénie

- ARNr 16S : chronomètres moléculaires - Arbre phylogénique

Appréciation des distances phylogéniques entre bactéries


5.2 Identification d'espèces nouvelles

Ex : maladie de Whipple

- 1991 : ARNr 16S d’une nouvelle bactérie classée dans actinomycètes

- 1997 : 1ère culture : Tropheryma whippleii

5.3 Détection par PCR

- Séquences prises dans gènes ARNr 16S - Très utilisées pour l'amplification

5.4 Caractérisation des espèces : ribotypie

RFLP et Southern blot avec une sonde complémentaire des gènes codant pour les ARNr (ribotypage ou ribotypie) :

- universelle, séquences très conservées entre

espèces bactériennes → ARNr 16S et 23S E. coli

- discriminante, gènes codant pour les ARNr

groupés en opérons présents en plusieurs copies, situées à des endroits différents sur les chromosomes bactériens

→ profils obtenus ≠

Les espèces ayant plusieurs opérons ribosomiques (E. coli) donneront des profils variables.


Celles ayant 1 seul opéron ribosomique (M. pneumoniae) donneront des profils homogènes

→ ribotype caractéristique de l'espèce mais trop faiblement discriminant comme marqueur épidémiologique

Large application épidémiologique

5.5 Site d’action des antibiotiques


5.5.1 Grande SU 50S Macrolides et apparentés

Inhibition élongation, erreurs de lecture, interruption prématurée de la traduction du polypeptide ARNr 23S domaines II et V

Chloramphénicol Inhibition élongation, pas de transpeptidation ARNr 23S, domaine V

Oxazolidinones Inhibition phase d’initiation de la traduction ARNr 23S

Acide fusidique Inhibition translocation

5.5.2 Petite SU 30S Tétracyclines

Inhibition de la fixation du complexe aa-ARNt sur le site aminé A du ribosome, ARNr 16S

Aminosides Inhibition de la translocation, ARNr 16S

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