La réplication d’acides nucléiques. 2 Parce que des fois ceci... 3.

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  • La rplication dacides nucliques
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  • Parce que des fois ceci... 3
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  • ...nous mne ici! (Yikes!) http://www.scienceclarified.com/Ex-Ga/Fertilization.html 4
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  • Pour grandir, le nombre de cellules doit augmenter Les cellules doivent dupliquer leur contenu Chaque division cellulaire donne lieu deux cellules filles (bleue) Tout lADN doit tre copi Les erreurs doivent tre gardes au minimum (haute fidlit de rplication) Le taux de mutations est de 1 nuclotide/10 9 nuclotides (6.4x10 9 bp dans une cellule diplode humaine) 5
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  • La rplication dans le cycle cellulaire Le cycle cellulaire est le procd ordonn de duplication cellulaire La rplication de lADN se produit seulement en phase S M phase: mitose G1 et G2: gap priodes o la cellule se prpare pour ltape suivante 6
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  • Distribution des brins dADN les possibilits Diffrentes possibilits de distribution: 1 parental: 1 fille semi- conservateur (Watson- Crick) Parental et fille (conservateur) (Bloch) Briser lADN bicatnaire pour synthtiser les nouveaux brins (dispersive) (Delbrck) 8 http://web.virginia.edu/Heidi/chapter30/chp30.htm
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  • Lexprience Meselson-Stahl prparation 14 N (lger) est la forme la plus abondant dN 15 N (lourd) est fonctionnel et pas radioactif Centrifuge lADN extrait de colonies de E. coli sur un gradient CsCl, puis on prend une photo de labsorbance UV 9 Meselson M, Stahl FW. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli. PNAS Vol 44: 671-682
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  • Lexprience Meselson-Stahl les rsultats Les gnrations sont mesures aprs laddition de 14 N gnration 0: 1 bande gnration 1: 1 bande gnration 1.9: 2 bandes 10 Pourquoi est-ce quil y a deux bandes gnration 1.9? Pourquoi est-ce quil y a 3 bandes quand on mlange 0 et 1.9?
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  • Distribution des brins dADN 11 Cette thorie est prouve http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/DNAreplicationModes.png
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  • Base pour la rplication dADN Pour pouvoir accomplir la rplication, le strict minimum requis: Les 4 dsoxyribonuclotides triphosphates (dNTPs) dATP, dTTP, dCTP, dGTP ADN matrice Amorce dADN/ARN pour commencer la raction ADN polymrase 13
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  • La rplication dADN La complmentarit des bases selon les rgle de Watson-Crick Lhydrolyse donne lieu un lien phosphodiester Relche une molcule pyrophosphate (qui est aussi hydrolys en phosphate, produit de lnergie) 14
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  • Formation du lien phosphodiester 15 Nature. 1998. 391:231-232 Le nuclotide amne deux molcules de Mg 2+ attach au triphosphate Mg 2+ se lieu au Asp de la polymrase (conserv) Le Mg 2+ baisse laffinit de loxygne pour lhydrogne, et permet la raction de se produire Le groupement OH attaque le triphosphate de la base azote 35 3
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  • Synthse dADN - polymrase Le nuclotide ajout doit tre complmentaire la matrice pour tre reconnue par la polymrase LADN polymrase catalyse la formation du lien phosphodiester La processivit de lADN polymrase est le nombre de lien phosphodiester form avant que la raction ne cesse 16
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  • La rplication de lADN 18 Figure 5-6 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Par microscopie, on peut observer la rplication dun plasmide Chaque fourche dans lADN est compos dADN parental et du brin rpliqu Le point de dpart sappelle lorigine de rplication Les grosses molcules dADN peuvent avoir plus quune origine
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  • La fourche de rplication LADN est dnature La rplication se fait toujours 53 dans les organismes Une exprience avec 3 H dans des bactries a dmontr la prsence de molcules dADN de 1000-2000nt: les fragments dOkazaki Fragments dOkazaki dans eucaryotes: 100-200nt 19
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  • Amorces pour le brin tardif chaque 100-200nt (eucaryotes), une amorce est requise pour que la rplication se produise Les amorces sont synthtises par lADN primase Les amorces sont base dARN Ont une taille de 10nt 20
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  • Rplication du brin tardif Les amorces dARN sont tendues par lADN polymrase III La polymrase III tombe du brin quand elle rencontre une structure bicatnaire ADN polymrase I efface lARN et la remplace par ADN ADN ligase forme les liens phosphodiester 21
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  • Types dADN polymrases 23
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  • Comment garder la polymrase sur lADN La polymrase ne reste pas sur lADN bien longtemps avant quelle ne tombe La pince coulissante (sliding clamp) garde la polymrase sur le brin dADN La pince est charge sur lADN par le facteur de chargement (clamp loader) Le processus requiert lATP 24 Dpend dATP!
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  • Polymerase more than a protein... 25 Pince coulissante
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  • Le complexe se forme 26 Chaque forme est une protine distincte. Ensemble, elles forment le complexe appel polymrase.
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  • La correction derreurs ADN polymrase III a une activit exonuclase 35 Si les nuclotides ne sont pas complmentaires, il y a un transfert la sous- unit ddition Le mauvais nuclotide est enlev (35) et la synthse continue 27
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  • La correction derreur... 28
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  • ADN ligase 29 Il manque un lien phosphodiester sur le brin dADN Dans les bactries: ligase dpend de NAD + comme nergie Dans eucaryotes: la ligase dpend dATP ADN ligase
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  • Dlier lADN Pour tre rplique, la structure bicatnaire doit tre ouverte Double hlix est trs stable Lhlicase utilise lATP pour se propulser le long du brin Peut dlier lADN jusqu 1000bp/s 30
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  • Garder lADN droit Des rgions de complmentarit existent sur le brin dli Ces rgions dstabilisent la polymrase Single-strand DNA- binding protein (SSB) stabilise le brin simple SSB ne recouvre pas les nuclotides, permettant la rplication 31
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  • Lorigine In E. coli: DnaA se lie lorigine Cette rgion est prs dune rgion riche en AT Lhlicase est DnaB La primase est DnaG 33
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  • La fourche de rplication active 34
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  • Putting it all together 35
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  • Squenage dADN par Mthode de Sanger 37 Chaque ddNTP est color laide dun fluorochrome de couleur diffrente
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  • PCR Technique commune dans tous les labo de biochimie Aprs 25 cycles, la squence gnique est amplifie 10 6 (2 n =n est le nombre de cycles) Utilis pour identifier des pathognes lors dinfections, types de cancer, maladies gntiques, parmi bien dautres... 38 https://sites.google.com/a/luther.edu/genetics/students/tyler-best/pcr-amplification