La recherche expérimentale d’aval: Evaluation des antibiotiques

dans les modèles animaux

Bruno FANTIN

Hôpital Beaujon, Service de Médecine Interne.

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Limites techniques et utilisation des modèles expérimentaux

2. Apport des modèles expérimentaux pour

l’évaluation des antibiotiques

Technical Issues in Animal Models: identification of the critical steps

Animal End Points

Create infection

Start of therapy

End of therapy

Sacrifice

«In vitro» inoculum

«In vivo» inoculum

Infection PK/PD Regrowth Carry-over

• Survival • CFU • R

Lack of Relationship between « in vitro » and « in vivo » Inocula

Murine E. coli pyelonephritis 0 h 48 h

109 ≈105-106

≈ 1000-fold decrease

Rabbit S. aureus endocarditis 0 h 48 h

≈108

≈ 100-fold increase

106

Time Interval between Infection and Treatment

Two major impacts:

• Severity of the systemic infection • Characteristics of the « in vivo » inoculum

• growth phase • inoculum size • risk of emergence of resistance • « phenotypic tolerance »

Bacterial Growth between Inoculation and Treatment in Murine K. pneumoniae Infection

Leggett et al., JID,1989

Influence of Duration of Infection on Antibiotic Activity in S. epidermidis Endocarditis in Rats

Entenza et al., JID, 1994

When to Start Therapy?

What is the question ?

• Efficacy • Killing rate • PK/PD parameters

• Influence of disease state on efficacy • Risk of emergence of resistance

Early phase Exponential growth Standardized inoculum ~ 106 CFU (# MBC inoculum)

Late treatment Stationary phase High inoculum ~ 107-108 CFU

Duration of Therapy

• Rate of killing, efficacy - CFU 0-24 h discriminant parameter correlated with survival • Emergence of resistance - more prolonged duration of treatment required onset of selection depends on mechanism of resistance (mutation or not) growth of R subpopulation under selective antibiotic pressure

Duration of Therapy and Development of Resistance in Endocarditis due to VanB E. faecalis

Aslangul et al., JID, 1997

Rational for Antimicrobial Dosing in Animals

Serum elimination half-lives of selected antibiotics in mice and humans

Half-life in minutes

Drug Mice Humans Amikacin 17 104 Imipenem 8 60 Cefazolin 15 108 Ciprofloxacin 32 240 Minocycline 120 1080

Andes & Craig, IJAA, 2002

Simulation of Human Pharmacokinetics

Andes & Craig, AAC, 1998 Piroth et al., AAC, 1999

Uranyl nitrate-induced renal impairment in mice

Human amoxicillin PK simulation in rabbits

Simulation of Human Pharmacokinetics

Lepeule et al, AAC, 2012

Simulation of fT>MIC in mice

Duration of Time from End of Therapy to Sacrifice (1)

If CFU the end point: not too late (avoid regrowth)

not too soon (avoid carryover)

minimize [antibiotic concentration/MIC] ratio in tissue samples

Duration of Time from End of Therapy to Sacrifice (2)

If sterilization rate or « cure rate » are the end points: delay sacrifice « relapse » study Results of therapy in rabbits with E. coli endocarditis

Regimen Log10 CFU/g of vegetation ± SD on: Day 1 Day 6 Control 8.8 ± 0.5 (0/7) 8.1 ± 1.4 (0/8) Ceftriaxone 6.7 ± 1.1 (0/8) 7.6 ± 1.5 (0/7) Netilmicin 5.7 ± 2.0 (0/7) 8.3 ± 1.1 (0/9) Ceftriaxone + netilmicin 2.6 ± 0.9 (4/8) 3.6 ± 2.3 (3/8) Fantin et al., AAC, 1989

Animal Models: end points

• Efficacy • Qualitative

- Survival rate - Sterilization rate

• Quantitative - CFU - parameters calculated from the Emax model dose to kill x log bacteriostatic dose protective dose • Emergence of resistance

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Limites techniques et utilisation des modèles expérimentaux

2. Apport des modèles expérimentaux pour

l’évaluation des antibiotiques

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques

Détermination des paramètres PK/PD prédictifs de l’activité antibactérienne in vivo

• Doses et régimes thérapeutiques multiples • Relation entre données PK/PD observées et activité

in vivo

Andes & Craig, IJAA, 2002

Approche PK/PD

• Approche indispensable parallèlement à la phase I • Permet de définir:

– Le paramètre PK/PD à optimiser chez l’homme – Le mode d’administration optimal chez l’homme

• Modèles utilisés: – Infection de cuisse de souris – Infection pulmonaire de souris

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques

Andes & Craig, AAC 98

Simulation de la pharmacocinétique humaine

Andes & Craig, AAC 98

Vérification de la virulence des souches

Andes & Craig, AAC 98

Etude de l’activité in vivo pour chaque niveau de CMI

Relation dose - effet bactéricide de la témocilline dans les reins de souris

0

1

2

3

4

5

6

7

8

fT > CMI (%)

log

CFU/

g

CFT073

CFT073Tc P89

0 34-36 46-48 92-97

Soubirou et al, sous presse

De Jongh R, JAC 2008

PK Témocilline chez l’homme

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques

Experimental endocarditis in rabbits

Experimental vegetations in rabbits

Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie : diffusion homogène

Crémieux et al, JID, 1989

Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie: diffusion avec gradient décroissant

Fantin et al., AAC, 1994

Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie: diffusion hétérogène

Saleh-Mghir et al, AAC 1999

Types de diffusion des antibiotiques marqués dans la végétation

• Amoxicilline, clavulanate • Péfloxacine, téma, sparflo

• Tobramycine • Spiramycine, quinupristine

• Daptomycine

Non homogène

Gradient de diffusion • Ceftriaxone, pénicilline

• Dalfoprisitine • Tigecycline Périphérique Teicoplanine Hétérogène Oritavancine

Homogène

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques

Témocilline dans la pyélonéphrite murine à E. coli BLSE

log CFU/g dans les reins de souris ± et (no stérile/no total)

Souches E. coli

Contrôles début de

traitement

Témocilline 200mg/kg

q2h Céfotaxime Imipénème

CFT073 4,23 ± 1,17 (1/18)

2,10 ± 1,70

(9/21) 1,92 ± 1,38

(6/13) 1,98 ± 1,67

(6/14) CFT073 Tc P89

4,86 ± 0,69 (0/20)

1,43 ± 1,52

(14/22) 3,95 ± 1,18

(0/13) 1,34 ± 1,50

(12/15)

Pas de mutants in vivo

Soubirou et al, sous presse

Activity of Daptomycin against VanA E. faecium D400

Caron et al, AAC 1992

Difffusion of Daptomycin in cardiac vegetations

Caron et al, AAC 1992

Cions in human with a 6mg/kg dose:

Peak # 88-95 µg/ml

Trough # 10 µg/ml

Chakraborty, JAC 2009

Activity of Daptomycin in VanA E. faecium rabbit endocarditis

Caron et al, AAC 1992

Discrepancy between in vitro and in vivo activity of Daptomycin against E. faecium

Protein binding in human # 90%

Caron et al, AAC 1992

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques

Gènes qnr et activité des quinolones

Souches de E. coli CMI (mg/L) x CMI Sauvage 0,004 Transconjugant (Tc) qnrA1 0,25 64 Mutant gyrA 0,25 64

Concentration minimale inhibitrice (CMI) de la ciprofloxacine en fonction des mécanismes de résistances

Rodriguez-Martinez et al, AAC 2007

CMI=0,5 mg/L: seuil de sensibilité à la ciprofloxacine (CA-SFM)

Première étape: préparation d’un système isogénique chez Escherichia coli

E. coli CFT073 (référence pour modèle in vivo)

E. coli CFT073-RR (résistante à la rifampicine)

E. coli Hm13 (plasmide pQnrA1) E. coli CFT073 –RR-gyrA

E. coli CFT073-RR Tc (pQnrA1)

E. coli PS105 (plasmide pQnrS1)

E. coli CFT073-RR Tc (pQnrS1)

Souches cliniques donatrices:

Allou et al, AAC 2009

Activité de la ciprofloxacine in vitro

Souches de E. coli CMI CPM CPM/ CMI PMR

CFT703-RR 0,0075 0,06 8 0,8 (± 0,4) x 10-8

CFT073-RR Tc (pQnrA1) 0,5 4 8 0,6 (± 0,7) x 10-8

CFT073-RR Tc (pQnrS1) 0,25 2 8 1,1 (± 1,5) x 10-8

CT073-RR-gyrA 0,25 2 8 0,3 (± 0,4) x 10-8

PMR: proportion de mutants résistants / ciprofloxacine à 4 fois la CMI

Allou et al, AAC 2009

Experimental pyelonephritis in mice

CBA female mice 8-week-old

Intra-urethral injection under general anesthesia of 50 µL from an inoculum of 5 x 1010 bactéries/mL (108).

Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR

P=0,003

Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR Tc (pQnrS1)

012345678

Contrôle débuttraitement (n=15)

Contrôle fintraitement (n=15)

Souris traitées(n=16)

log/

ufc g

de

vess

ie

P=0,6

0

1

2

3

4

5

Contrôle débuttraitement (n=15)

Contrôle fintraitement (n=15)

Souris traitées(n=16)

log

ufc/g

de

rein

Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR-gyrA

P=0,9

Paramètres PK/PD de la ciprofloxacine chez la souris

Souches de E. coli CMI

ASC0→24h /CMI

Cmax /CMI

CFT073-RR 0,007 827 147

CFT073-RR Tc(pQnrA1) 0,5 12.4 2.2

CFT073-RR Tc(pQnrS1) 0,25 24.8 4.4

CFT073-RR-gyrA 0,25 24.8 4.4

Cmax: 1,1 +/- 0,2 µg/ml; ASC0→24h : 6.2 +/- 1.2 µg.h/ml

Allou et al, AAC 2009

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques

1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques

Etude de l’association levofloxacine-rifampicine dans l’ostéite expérimentale

Muller-Seyries et al, AAC 2009

Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques:

conclusions

• Pas de modèle « universel » • Intérêt des modèles non discriminants pour

l’approche PK/PD • Intérêt des modèles discriminants pour une

approche explicative des facteurs limitant l’activité in vivo