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La protéomique :ses techniques d’études analytiques et quantitatives et ses applications

Aubry M.A. , Aussagues Y. , Berge A. , Brunel L. , Cabeau J. , Chevalier S. , Chicanne G. , Dubreuil B. , Friry C. , Morello E. , Samson A. , Trinchero N. , Zelazny E. DESS Expression Génique et Protéines Recombinantes, Université Paul Sabatier, Toulouse, France. Abstract Proteomics, the systematic analysis of expressed protein, is a tool for the identification of proteins involved in cellular process. Genomic can’t explain all the regulation nor all the interactions observed in living cells. These technologies are based on high-throughput techniques for the separation and the identification of proteins, allowing an integral study of many proteins at the same time. Changes in protein expression in variable condition (overexpression, silencing, drugs influence) can be detected. Proteomics try to determine all the bio-chemicals and physical properties of proteins such as molecular weigh (MW), pHi, proteins sequences, 3-D structures. The most efficient technologies used in these researches are Mass Spectrometry (MS) linked with two dimensional polyacrylamide gel electropheresis or sometimes liquid chromatography (LC) some attempts on quantitative measurements are also reported ... In this review, practical and technical aspects, scientific innovations and health applications are discussed. Sommaire 1 Introduction 2 Techniques d’études analytiques

2.1 Electrophorèse bi-dimensionnelle 2.2 Méthodologies de spectrométrie de masse et de chromatographie

3 Techniques d’études quantitatives 3.1 Présentation 3.2 Quantification sur gel 3.3 Quantification par méthode immunologique 3.4 Quantification par spectrométrie de masse

4 Applications scientifiques de la protéomique 4.1 Variations de profil d’expression 4.2 Analyse des modifications post-traductionnelles. 4.3 Etude des interactions Protéine / Protéine 4.4 Analyse protéomique de microorganismes et de champignons 4.5 Analyse protéomique de cellules eucaryotes 4.6 Utilisation des cartes protéiques 4.7 Les bases de données Protéomiques

5 Applications médicales 5.1 Etude de l’efficacité et de la toxicité des agents thérapeutiques 5.2 Application aux différents types de pathologies humaines

6 Conclusion 7 Figures 8 Références bibliographiques 1 Introduction

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Maintenant que les séquences génomiques de plusieurs organismes ont été décrites ( E. coli [1], S. cerevisae [2], Caenorhabditis elegans [3], Arabidopsis thaliana [4]…) il est primordial de comprendre et d’intégrer les mécanismes cellulaires globaux. L’analyse génomique ne donne qu’une vue partielle et statistique du fonctionnement cellulaire. L’établissement d’un organisme pluricellulaire, les capacités évolutives des microorganismes c’est à dire l’acquisition d’un phénotype, ne peut être élucidé que par des études génétiques (la génomique). L’aire de la protéomique (définie comme l’étude de l’expression des protéines totales d’un organisme ou d’un type cellulaire ) permet aujourd’hui de mieux comprendre l’implication des protéines dans la machinerie cellulaire. La protéomique passe par l’étude structurale et fonctionnelle de ces macromolécules, par l’analyse quantitative mettant en évidence les mécanismes de régulation régissant leur synthèse et par le regroupement de toutes les données à l’aide d’outils informatiques de plus en plus performants. L’ensemble de ces connaissances entraîne des innovations majeurs, en recherche fondamentale, en biotechnologie industrielle et en biotechnologie appliquée au domaine de la santé. Aujourd’hui, il apparaît que la biologie entre dans une nouvelle phase permise par le développement de techniques et d’appareils de plus en plus perfectionnés et de plus en plus résolutifs. Les études analytiques, identifiant et caractérisant la structure et la fonction de protéines, font intervenir des techniques très variées mais dont leur combinaison apparaît de plus en plus indispensable. Les électrophorèses en gels deux dimensions [5] assurent la détermination de paramètres protéiques comme la masse moléculaire et le point isoélectrique. La spectrométrie de masse coupléé à des techniques de séparation-purification chromatographiques permet de déterminer avec précision la masse moléculaire ainsi que la séquence primaire de la protéine étudiée. Cette technique donne des résultats si précis qu’elle apparaît comme la technique de choix en protéomique analytique. Les études quantitatives permettent de mettre en évidence l’évolution de la quantité de molécules protéiques dans un organisme ou dans un type cellulaire donné. L’étude du transcriptome, mesurant le taux d’ARNm, a montré qu’il n’existe pas réellement de corrélation entre le taux d’ARNmessagers (ARNm) et le taux de protéine [6]. De nombreux mécanismes post-transcriptionnels interviennent pour réguler la synthèse protéique. Il est possible d’estimer la quantité de protéine sur un gel à deux dimensions à l’aide de colorants comme le bleu de coomasie ou à l’aide de coloration par l’argent. Or les marquages radioactifs ou fluorescents donnent des quantifications plus sensibles. D’autres méthodes comme les quantifications immunologiques telle que l’IDAT (Immuno Detection Amplified by T7 RNA polymerase) et des méthodes couplées à la spectrométrie de masse telle que l’ICAT (Isotope Coded Affiny Tag ) utilisant des isotopes lourds, donnent des quantifications relatives utilisées en protéomique. Dans cette publication, il a été présenté un tour d’horizon de ces techniques d’analyses protéomiques ainsi que des exemples sur leurs applications tant au niveau de la recherche fondamentale qu’au niveau médical. 2 Techniques d’études analytiques

2.1 Electrophorèse bi-dimensionnelle

Afin d’étudier l’ensemble des protéines exprimées par un organisme ou un type cellulaire donné, il convient de mettre en oeuvre des méthodes analytiques et reproductibles. L’électrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) introduite par O’Farrel en 1975 [5] est l’une de

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ces méthodes . Elle permet, à l’issue de deux migrations électrophorétiques successives, de visualiser un grand nombre de protéines de façon simultanée [7] .

Dans la première dimension, les protéines migrent dans un gradient de pH selon leur point isoélectrique. Cette étape, appelée isoélectrofocalisation (IEF), est suivie d’une seconde migration, généralement menée dans une direction perpendiculaire à la première, où les protéines sont séparées selon leurs poids moléculaires [7] .

D’un point de vue pratique, les protéines doivent être préalablement solubilisées sans modifier leur charge intrinsèque. C’est pourquoi, la solution de solubilisation contient , entre autre, des détergents, du β-mercaptoéthanol et un agent dénaturant tel que l’urée. Cette solution doit permettre de dissocier les chaînes polypeptidiques sans modifier leur charge intrinsèque. L’IEF a lieu dans un gel de polyacrylamide où un gradient de pH a été établi. Celui-ci est ensuite déposé le long d’un gel SDS–PAGE. Un champ électrique est appliqué : les protéines migrent selon leur poids moléculaire [7] A la fin du processus, les protéines peuvent être visualisées par coloration au bleu de coomassie ou au nitrate d’argent. Chaque protéine apparaît sous la forme d’un spot. Une ‘carte protéique’, pouvant contenir jusqu’à 2000 spots, est ainsi obtenue. Les spots peuvent subir divers traitements (digestion enzymatique puis étude par spectrométrie de masse) afin de séquencer ,ou d’évaluer la masse moléculaire de la protéine correspondant à un spot donné. Ceci démontre le rôle central de l’électrophorèse bi-dimensionnelle dans l’analyse du protéome [8]. A l’origine, le gradient de pH nécessaire à la réalisation de l’IEF était établi après la polymérisation du gel d’acrylamide, par migration dans un champ électrique de ‘carrier – ampholyte’ (CA) ayant un fort pouvoir tampon local. Le gradient de pH ainsi établi dépendait donc intimement de la tension appliquée sur le gel. Ceci posait notamment des problèmes de reproductibilité , néfaste pour une étude du protéome [5 ]. Pour résoudre ces problèmes, un nouveau type de gradient de pH a été développé . Immobilized pH gradients (IPG)

L’électrophorèse bidimensionnelle basée sur l’utilisation de gradients de pH immobilisés (IPG) a été introduite en 1987 [9]. Les IPG permettent l’isoélectrofocalisation (IEF) des protéines lors de la première dimension de la 2-DE . Ils ont permis de surpasser les limites imposées par les anciens gradients d’ampholytes utilisés pour l’IEF [9]. Contrairement à ces derniers, dans les IPG, le gradient de pH fait parti intégrante du gel de polyacrylamide. Il est obtenu en incorporant dans le gel par copolymérisation, des groupements acides et basiques ayant un effet tampon et appelés immobilines.

Les IPG se présentent sous forme de bandelettes, faciles à utiliser et dont les dimensions les plus courantes sont 180mm X 3.5mm pour seulement 0.05mm d’épaisseur. Avant d’effectuer la migration, ces bandelettes sont réhydratées dans un tampon contenant 8M d’urée, 0.5-2 % d’un détergent, 0.2 % de dithiothreitol (DTT) et 0.2 % d’ampholytes (CA) [8]. Les gels IPG réhydratés sont placés dans la chambre d’électrofocalisation qui est réfrigérée pour éviter toute surchauffe lors de la migration des protéines. L’extrémité acide de la bande IPG doit être placée du côté anodique.

Les échantillons protéiques (de 40 à 80 μl) sont déposés sur le gel grâce à des cupules de dépôt (cup loading). La concentration des échantillons ne doit pas excéder 5 à 10 mg / ml pour limiter les risques de précipitation des protéines[8]. Toujours dans ce but, le voltage doit être appliqué de façon progressive [9].

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Le temps de migration dépend du gradient de pH utilisé et de la longueur de la bande IPG.

Les gel de type IPG permettent d’obtenir de très bonnes résolutions, notamment parce qu’ils présentent des gammes de pH très variées. Selon les applications, un IPG avec un intervalle de pH faible (une unité pH), moyen (3 à 5 unités pH) ou important (7 unités pH) peut être employé. Les IPG sont très utiles pour séparer des protéines basiques qui ne sont pas visualisées par un gradient d’ampholytes. Ainsi, Norbeck et Blomberg [10] ont montré que 25 % des protéines (basiques) de la levure n’étaient pas résolus par un gradient d’ampholytes mais mis en évidence par un IPG de pH 3-10.

Les IPG permettent d’obtenir des pH proches de 12, ils sont donc très intéressants pour analyser des protéines très basiques comme les histones et les protéines ribosomales [11]. Grâce à certains IPG, présentant un gradient de pH étroit, des peptides dont les pI diffèrent de 0.003 unités pH sont séparés. Cette très haute résolution est utile pour distinguer des protéines mutantes [11].

La résolution en 2-DE est augmentée en utilisant des gels IPG présentant de faibles intervalles de pH se chevauchant. Wildgruber et al. [12] ont pu révéler 2286 spots protéiques chez la levure grâce à cinq IPG de pH 4-5, 4.5-5.5, 5-6, 5.5-6.7, 6-9. La même étude avec un IPG de pH 3-10 ne permet de révéler que 755 spots. Une étape de l’analyse est présentée en figure 1 : Comparaison des profils 2-DE obtenus avec un extrait protéique de levure, deux IPG présentant des intervalles de pH différents. Les IPG, contrairement au gradients d’ampholytes, offrent une très haute reproductibilité au niveau de la position des spots en 2-DE. [9 ;10]. Par contre, la reproductibilité quantitative pour les différents spots est moins élevée [10]. Solubilisation des protéines membranaires en 2-DE

Une des difficultés en 2-DE est l’analyse des protéines membranaires. Ces dernières sont sous représentées dans les profils de gels 2-DE, à cause de problèmes de solubilisation. En effet, les domaines hydrophobes de ces protéines ont tendance à s’agréger en milieux aqueux [ 13]. Les tampons habituellement utilisés pour solubiliser les protéines avant l’IEF sont inefficaces pour ce type de protéines.

Récemment, de nouveaux agents ont donc dû être employés afin d’améliorer cette solubilisation. Parmi les chaotropes, qui induisent le dépliement des protéines, la thiourée a permis d’augmenter, la solubilité des protéines et, par la même occasion la résolution en 2-DE [14; 15]. La thiourée, pour être soluble dans l’eau, doit être associée à de fortes concentrations en urée, les conditions optimales d’utilisation étant 2 M de thiourée et 5-7 M d’urée.

Dernièrement, de nouveaux surfactants de la famille des sulfobétaïnes ont permis de favoriser la solubilisation des protéines [15]. Il s’agit du CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanosulfonate) et du SB 3-10 (N-decyl-N,N-diméthyl -3-ammonio-1-propane sulfonate) ce dernier ayant un pouvoir solubilisant plus élevé du fait de sa queue alkyl apolaire. Néanmoins, l’efficacité du CHAPS diminue pour de forte concentrations en thiourée et le SB 3-10 est insoluble au dessus de 5 M d’urée. Pour résoudre ces problèmes, de nouvelles amidosulfobétaïnes ont été synthétisées : l’ASB 14 (amidosulfobétaïne 14) et le C8φ [15].

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Possédant des groupes de tête plus polaires que SB 3-10, elles sont solubles dans de fortes concentrations d’urée et comparées au CHAPS, elles permettent de visualiser plus de protéines en 2-DE [15].

Le tributyl phosphine (TBP) est l’agent réducteur donnant les meilleurs résultats de solubilisation des protéines lors de l ‘IEF [15].

Dans tous les cas, ces agents doivent être utilisés combinés pour une solubilisation maximale. Nouvelles stratégies suivies dans la résolution des protéines hydrophobes

Les protéines membranaires hydrophobes sont susceptibles d’interagir avec les dérivés acrylamido constitutifs de la matrice du gel , compromettant ainsi leur migration lors de l’IEF. Diverses solutions ont été envisagées . L’une d’elle consiste à augmenter les quantités de protéines chargées sur le gel. Celui-ci est réhydraté avec un tampon contenant l’échantillon protéique. Ce procédé permet d’augmenter les volumes de chargement en résolvant les problèmes d’agrégation protéique observés lors du ‘cup-loading’. Par cette méthode, plus de 450 μl d’extrait protéique peuvent être déposés sur un gel IPG de 18cm , contre seulement 100μl par la méthode du ‘cup-loading’. De plus, l’IEF peut être menée dès la fin de la réhydratation ce qui constitue un gain de temps par rapport au technique classique de chargement des gels [15]. Afin d’optimiser la résolution des cartes protéiques, une autre voie a été suivie . Elle consiste en une extraction séquentielle des protéines à partir de l’extrait protéique selon leur propriété de solubilisation [15;16]. Chaque extrait est analysée sur des gels.

L’extraction par des solvants organiques comme le phénol/chloroforme a également été testée [17] . Des études menées sur E. coli ont démontré que les protéines résolues par cette technique étaient essentiellement des protéines périplasmiques ou des lipoprotéines . Ces résultats ont suggéré que les solvants organiques étaient insuffisants pour dissoudre les bi-couches lipidiques. Les protéines transmembranaires ne sont toujours pas résolues . Ainsi, il pourrait être souhaitable d’isoler , dans un premier temps les membranes biologiques puis de mener sur ces membranes divers traitements au triton X114 [18] ou à base de carbonate de sodium en vue d’extraire ces protéines membranaires. Pré-fractionnement des échantillons protéiques

Toujours en vue d’améliorer la résolution en 2-DE, Herbet et al. [19] introduisent la technique du pré-fractionnement des échantillons protéiques via un électrolyseur multicompartiment. Elle consiste à établir un gradient de pH permettant l’IEF, en créant une série de chambres séparées par des membranes de polyacrylamide contenant des immobilines de pH unique. Ces membranes agissent comme des barrières « pI sélectives ». Après avoir appliqué la tension dans l’électrolyseur, chaque protéine va migrer puis s’immobiliser dans une chambre délimitée par deux membranes dont les pH encadrent le pI de la protéine. Chaque fraction isolée est utilisée pour effectuer une IPG 2-DE. Un pré-fractionnement réaliser sur un extrait protéique de E. coli et faisant intervenir cinq membranes de pH 3, 4, 5, 6, 10.5 a été réalisé. En comparant les résultats obtenus en IPG 2-DE (pH 4-5) avec un échantillon non pré- fractionné et la fraction de la chambre de pH 4-5, les auteurs constatent que le pré- fractionnement augmente considérablement la résolution. De plus, grâce à cette

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technique, une plus grande quantité de protéines peut être déposée sur le gel, la sensibilité de détection peut donc être accrue. Au regard des différents points évoqués ci-dessus, il apparaît clair qu’il est impossible de visualiser sur un gel unique l’ensemble du protéome d’un organisme ou d’un type cellulaire donné : les spots des protéines les plus abondantes masquent ceux des protéines les moins abondantes .Il est par ailleurs, impossible de solubiliser en une seule étape toutes les protéines C’est pourquoi, de plus en plus de protocoles font intervenir un pré-fractionnement des échantillons protéiques via un électrolyseur multicompartiment.

Des auteurs tels que Cordwell ont ainsi introduit la notion de sous protéome[16;20] . Les cellules et tissus sont initialement pré-fractionnés selon le compartiment cellulaire ou la solubilité relative des protéines .Les échantillons sont préalablement « screenés » sur gel IPG à large gamme de PH pour déterminer la complexité du protéome puis , si nécessaire, analysés sur des gels plus résolutifs pour visualiser les protéines exprimées à plus bas niveau (figure 2 ). Le protéome est donc visualisé , de manière exhaustive, sur des cartes dites composites .

2.2 Méthodologies de spectrométrie de masse et de chromatographie

Combinée à la bioinformatique, la spectrométrie de masse (MS) est l’outil indispensable pour la détermination à très faible quantité de la séquences des protéines. Par ailleurs, on vient de voir que pour l ‘analyse protéomique, on utilise le plus souvent l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel, en dépit des problèmes rencontrés pour l’études des protéines hydrophobes et de la dénaturation des protéines détruisant les interactions Protéine-Protéine. ? ? ? ?Au vu de ces limitations, divers groupes de recherche tentent de trouver d’autres techniques que les techniques électrophorétiques. Les techniques chromatographiques permettent des couplages plus facile entre méthode de séparation et spectrométrie de masse, que dans le cas des gels 2D [figure 3] .

Aperçu général [figure 4a et 4b]

Un spectromètre de masse se divise en trois parties : une source permettant l’ionisation

des peptides et des protéines, un analyseur permettant de différencier les ions formés et un détecteur. La source peut être une source MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) qui permet la formation d’ions par excitation d’une matrice contenant l’analyte cristallisé ou une source ESI (Electrospray Ionization) qui permet la formation d’ions par nébulisation de l’analyte. Le MALDI va permettre de former des ions mono ou multichargés, par contre, l’ESI forme essentiellement des ions multichargés analysés pour la caractérisation et l’identification des protéines [21]. Les analyseurs utilisés pour l’étude du protéome sont de deux types. Le TOF (Time Of Flight) mesure le temps de vol des ions pour arriver au détecteur. Principalement utilisé avec le MALDI, cet analyseur permet d’avoir de très hautes résolutions. Le second type d’analyseur est le quadripôle qui a la particularité de n’avoir qu’une résolution unitaire [22]. L’ensemle de cette partie est à réécrire, je m’en charge….

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Le MALDI. Cette technique contrairement à l’ESI est tolérante à la présence de petite molécules, de sels et de détergeant. Elle nécessite au préalable la séparation des protéines par gel 2D. Les analytes seront cristallisés dans une matrice et ionisés à l’aide d’un laser UV ou IR. Cette technique permet d’engendrer des états de charge faible ce qui permet d’obtenir des spectres de complexité réduite. L’analyseur TOF utilisé avec le MALDI peut être amélioré par l’utilisation d’un réflectron permettant d’augmenter la résolution et par l’utilisation d’un PSD (Post Source Decay) qui permet d’homogénéiser la vitesse des ions afin d’obtenir une meilleure précision des résultats. Le détecteur est suivie d’un traitement informatique permettant l’identification des protéines en fonction des peptides analysés. Cette technique permet d’obtenir une sensibilité allant de la fmol à l’amol, une résolution de masse supérieure à 10000Da et une exactitude inférieure à 30 ppm. L’ESI. C’est une technique de choix pour les expériences de haute sensibilité SM et SM/SM. Contrairement au MALDI, cette technique permet le couplage avec la chromatographie liquide tel que la chromatographie d’exclusion et la chromatographie phase inverse. De plus, la source d’ionisation peut être améliorée par un nanospray qui va augmenter la sensibilité de la technique en diminuant la quantité d’analyte entrant dans la source. L’analyseur SM principalement utilisé est un quadripôle, mais pour augmenter la sensibilité on utilise des analyseurs en tandem : triple quadripôle avec présence d’un CID (Collision Induced Dissociation) ou combinaison Q-TOF. Comme en MALDI, le détecteur est suivie d’un traitement informatique permettant l’analyse des données pour la détermination des séquences. [23] Comparaison des deux techniques d’ionisation [24]

Les deux techniques d’ionisation utilisés pour l’étude du protéome donnent des informations différentes sur les protéines. En effet le MALDI est préférentiellement utilisés pour obtenir des informations sur la séquence des protéines alors que l’ESI permet de déterminer la masse des analytes. Toutefois, la spectrométrie en tandem permet d’utiliser l’ESI pour la détermination de séquences.

Jörg T. Regula a démontré par l’étude du protéome de Mycoplasma pneumonia que les deux méthodes d’analyses ont des caractéristiques différentes concernant la vitesse d’opération et l’exactitude des masses. En effet une analyse en MALDI est 10 fois plus rapide que l’ESI. Par contre l’ESI est un technique plus sensible permettant d’obtenir des mesures de masses beaucoup plus précises.

Exemple de MS/MS Le mode MS/MS ou spectrométrie en tandem correspond à l’utilisation de plusieurs

analyseurs en série. Quelque soit le type d’analyseur utilisés le principe est le même : filtrer les ions provenant de la source, fragmenter les ions sélectionnés, analyser les ions fils et les guider vers le détecteur.

Pour l’étude du protéome, trois types de spectromètre en tandem sont utilisés : ·Le triple quadripôle. [25] Comme son nom l’indique il est constitué de trois

quadripôles en série : Q1, Q2 et Q3. Q1 permet de filtrer les ions en fonction de leur ratio m/z grâce à une modification de son champs électrique qui induit la modification de la trajectoire des ions. Q2 correspond à une cellule de collision (CID) permettant de fragmenter les ions. Q3 permet de sélectionner certains ions fils qui sont dirigés vers l’analyseur. Cette technique

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permet de générer des spectres très simple dont les informations sur la séquence sont facilement extractibles. Une simple lecture des spectres donnera la séquence de petits peptides en calculant la différence de masse des pics.

·La trappe à ions. [26] Le mode MS/MS est constitué d’une trappe à ions qui opère par piégeage des ions dans un champ électrique tridimensionnel. Elle permet la sélection d’un ion déterminé, sa fragmentation par collision avec un gaz et la libération séquentielle des ions fils vers le détecteur.

·Le Q-TOF. [27] Cette technique permet la combinaison d’un analyseur quadripôle et d’un analyseur TOF en un seul instrument. Le quadripôle est utilisé pour filtrer les ions en fonction de leur ratio m/z et le TOF permet la mesure des masses avec une grande sensibilité et une haute résolution. Cette technique a la capacité de produire des spectres d’une haute qualité avec des quantités d’échantillon de l’ordre de l’attomole (10-18 mole). En outre, le Q-TOF est un analyseur de plus en plus utilisés car il permet d’utiliser l’ESI et ses nombreux avantages. C’est donc un puissant outil d’analyse pour la caractérisation et le séquençage des protéines.

Dan Bach Kristensen et co. [27] montrent, par une série d’expériences, l’utilité d’un

spectromètre de masse Q-TOF pour la caractérisation de protéines, notamment en utilisant le mode MS/MS.

Les chercheurs démontrent la très grande sensibilité du Q-TOF en mode MS/MS en réalisant le séquençage complet du peptide modèle [Glu1]-fibrinopeptide B à 10fmol/µL avec seulement 69 amol (alors qu’il faut 138 amol pour une acquisition en mode MS).De plus, si on passe la concentration du [Glu1]-fibrinopeptide B à 100 fmol/µL, le séquençage ne nécessite que 35 amol.

Il a été démontré à partir d’une série de dilutions que la sensibilité du Q-TOF en mode MS/MS dépasse la sensibilité de la révélation à l’argent. Les auteurs réussissent à séquencer la BSA avec 25 fmol de la protéine, alors que la bande en coloration à l’argent est invisible.

L’analyse en mode MS/MS permet le séquençage de nouvelles protéines à partir d’un gel 2-D. Le groupe de recherche nous montre un exemple d’étude sur des protéines de peau de grenouille. Après sélection d’une bande inconnue d’un gel 2-D et digestion trypsique, l’étude MS/MS d’un peptide permet d’obtenir une séquence de 21 a.a. inconnue des banques de données, ce qui démontre la découverte d’une nouvelle protéine. Les auteurs soulignent de plus l’utilité de réaliser la digestion trypsique en présence de H2

18O, afin de réaliser un marquage et d’identifier les ions fils N-ter et C-ter dans le spectre de MS/MS (du fait de l’apparition de pics intenses de +2 Da pour le C-ter résultant de la coupure trypsique).

L’intérêt de l’utilisation de la MS/MS pour l’analyse du protéome est tout d’abord une

très bonne sensibilité (séquençage avec une centaine d’attomoles), une identification sans ambiguïté des protéines par le séquençage d’un peptide (notamment pour des protéines de rapport M/Z identiques), la découverte et le séquençage partiel rapide de nouvelles protéines. Avec l’avènement de l’automatisation, la MS/MS va s’établir comme une méthode de choix pour une analyse rapide et fiable du protéome.

Couplage MS et chromatographie 2-D

Les techniques de chromatographie sont utilisées en amont de la SM. Elles permettent en général de concentrer les analytes, de séparer certaines protéines et d’éliminer les contaminants tel que les sels.

Pour le MALDI, la chromatographie est utilisé off-line c’est à dire qu’il n’y a pas de couplage entre la chromatographie et la source d’ionisation du fait de la cristallisation des analytes pour l’ionisation. Dans ce cas, cela permet un enrichissement en certaines protéines

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la plus part du temps avant la séparation sur gel 2D. En général, on utilise cette technique pour les protéines étant en faible abondance (non visible sur gel 2D) et pour l’étude de l’expression différentielle des protéines. La chromatographie sera sélectionnée en fonction des protéines à étudier. La chromatographie d’interactions hydrophobes permet de séparer des protéines en fonction de leurs différences d’hydrophobicité (variation du nombre de sites hydrophobes). Cette technique est principalement utilisée pour les enzymes et les protéines ribosomales [28]. La chromatographie sur héparine qui se comporte comme un échangeuse de cation permet de séparer les protéines se fixant aux acides nucléiques, les facteurs de croissance et de synthèse protéique. Cette technique peut être utilisés pour l’étude du désordre du système nerveux central (maladie d’ Alzheimer, schizophrénie…) [29]. La chromatographie sur hydroxyapatite permet grâce à des interactions électrostatiques de séparer différentes classes de protéines : enzymes (sites catalytiques variés), protéines de choc thermique et nouvelles protéines à fonction inconnue. Cette technique a permis l’étude du protéome d’Escherichia coli en enrichissant les protéines de faible abondance [30]. Enfin , la chromatographie d’affinité par immobilisation d’ions métalliques (Fer, Aluminium, Gallium) permet la séparation et la caractérisation des phospholipides (2% des protéines totales) pour l’étude des signaux de régulation et de prolifération [31].

Pour l’ESI, la chromatographie est utilisé on-line ce qui permet d’affiner la séparation du gel 2D. C’est une approche robuste et facile pour l’identification des protéines en routine. La LC-ESI-MS utilise des colonnes C8 ou C18 permettant la séparation des protéines en fonction de leur polarité [32] ou des colonnes d’exclusion de taille [33]. Certains auteurs couplent plusieurs colonnes chromatographiques en amont du spectromètre de masse (LC-LC-ESI-MS). Cette technique de haute résolution permet des séparer toutes les protéines en fonction de leur caractéristiques biochimiques (masse, polarité, taille). La LC-LC-ESI-MS présente différents avantages : c’est un système automatisable ce qui permet de diminuer l’intervention de l’opérateur et la perte d’analyte, il permet la séparation deux dimensions et enfin c’est un système rigoureux permettant un gain de temps. La première chromatographie deux dimensions a été réalisée en couplant une chromatographie échangeuse de cations suivie d’une RPLC [34]. Cette méthode permet dans un premier temps de séparer les protéines en fonction de leur pI puis en fonction de leur polarité. Une seconde approche correspond au couplage de 6 colonnes d’exclusion de taille (en série) suivie de deux colonnes C18 en parallèle [35]. La première séparation se fait en fonction de taille des protéines puis en fonction de leur polarité. Ces techniques sont très complexes à réaliser du fait de l’importance de la vitesse du flux entre les deux chromatographies et de l’utilisation de valves pour coupler les colonnes. Mais le plus grand problème de ces techniques réside dans la sensibilité de l’ESI aux solvants [36]. En effet, le solvant ne doit pas contenir d’additif tel que les acides phosphoriques et trifluoroacétique, des détergents et des agents chaotropiques qui inhibent l’ionisation des protéines. De plus on ne doit pas retrouver des sels et des composés organiques non volatiles qui peuvent boucher les capillaires, rendant l’analyse impossible. Pour optimiser la détection en ESI lors de couplage avec des techniques chromatographiques il faut mettre au point : la composition du solvant (acides formique ou acétique), la concentration en additif, la vitesse du flux, la conductivité et le pH de la solution. De ce fait, le choix des conditions de la chromatographie se fait en fonction de l’ESI.

Couplage EC et utilisation de la FT-ICR L’évolution de la spectrométrie de masse vers la miniaturisation a permis l’élaboration de nouvelles techniques telle que le nano-electrospray [37]. Cette dernière technique rend possible de nouveaux couplages notamment avec l’électrophorèse capillaire [38]. L’avantage

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de l’électrophorèse capillaire couplée au spectromètre de masse est une séparation rapide des peptides, qui plus est, en ligne, avant de réaliser l’analyse en MS. Divers groupes de recherche cherchent à montrer l’utilité d’utiliser un spectromètre de masse à résonance cyclotronique à transformée de Fourier [39]. Pour l’analyse du protéome, cette technique est intéressante du fait de sa très bonne résolution (>106), de la très haute sensibilité (attomole), mais surtout du fait qu’elle permet l’étude de protéines intactes de haut poids moléculaire (100 kDa). Miniaturisation, bioinformatique et automatisation

Après la révolution des puces à ADN, les divers groupes travaillant sur le protéome ont essayés de développer la même approche avec des micropuces (lab on a chip) pour la recherche protéomique. Les avantages de tels systèmes sont : moins d’analyte requis, les puces jetables ont un faible coût, rapidité des analyses, possibilité de contrôles et de dosages automatiques à différentes étapes de l’analyse, automatisation facilitée. Beaucoup de ces systèmes sont couplés en ligne avec des spectromètres de masse afin d’identifier les protéines étudiées [40].

On peut trouver plusieurs types de puces couplés en ligne : - des puces à microdialyse [41]

Une membrane de dialyse est comprise entre deux puces et permet d’éliminer les sels gênant l’analyse en MS et d’introduire un tampon compatible avec l’analyse MS au fur et à mesure que l’échantillon avance vers le spectromètre de masse.

- des puces à IEF [42] Des ampholytes transporteurs forment un gradient de pH mobile sous l’action d’un champ électrique permettant la séparation des analytes switterioniques en fonction de leur pI avant l’analyse en MS.

- des puces à électrophorèse [43] Les capillaires en silices de micropuces permettent de réaliser une séparation électrophorétique avant une analyse par MS. La Bioinformatique est un outil indispensable pour l’identification des protéines lors d’une analyse protéomique. On consulte les banques de données, telles que Swiss-Prot ou trEMBL, avec des logiciels dédiés à l’identification des protéines (Sequest, Mascot, Peptide Search, Prowl, Protein Prospector, MS-FIT, Sequence retrieval system).Les logiciels vont tout d’abord commencer par comparer la masse de la protéine étudiée aux masses des protéines des banques de données. Ceci permet de réduire dans un premier temps le nombre de candidats potentiels à l’identification. Si la protéine n’est pas identifiée, on réalise la comparaison avec les masses des peptides issues de la digestion trypsique. Si un doute persiste sur l’identification, un séquençage par MS/MS permettra d’enlever toute ambiguïté. L’identification des protéines n’est pas le seul intérêt de la bioinformatique, c’est aussi un moyen indispensable pour permettre l’automatisation des systèmes d’analyse. L’automatisation est l’avenir de l’étude protéomique car elle permet un haut débit des résultats et une analyse complète, sans intervention humaine, qui est à l’origine de beaucoup d’erreurs lors des manipulations. Un exemple de ce qu’est l’automatisation complète d’une analyse protéomique nous est donné par Dunlop. [44]. Les auteurs identifient des bactéries grâce à l’analyse de leur protéome. Des extraits bactériens de E.Coli et de B.Globogii sont analysés par LC-ESI-MS contrôlé par l’Agilent Chem Station. L’identification est réalisée par le logiciel Sequence Retrieval System sur les banques de données Swiss-Prot et trEMBL. L’analyse est entièrement automatisée, de l’injection de l’échantillon à l’analyse des spectres,

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et permet, par l’identification de plus de quarante protéines, de reconnaître sans ambiguïté les bactéries.

De nombreuses perspectives d’avenir apparaissent, avec la miniaturisation et l’automatisation de l’analyse protéomique, grâce aux divers couplages possibles avec la chromatographie et la spectrométrie de masse.

Néanmoins, malgré les progrès qu’autorisent ces nouvelles techniques, un travail très important reste à faire sur l’aspect quantitatif de l’analyse du protéome.

3 Techniques d’études quantitatives

3.1 Présentation

Un domaine important de la protéomique est le dosage quantitatif du niveau d’expression des protéines dans une cellule ou un tissu. Depuis les récentes avancées de la génomique avec le séquençage systématique, l’utilisation de puces à ADN est devenu un outil très puissant pour étudier la population en ARNm dans une cellule. Ceci permet de déterminer le niveau de transcription de chaque gène dans un type de cellule donné, dans un état donné : c’est ce qu’on appelle le « transcriptome ». Bien que ces analyses apportent d’importantes informations, il serait également très intéressant de pouvoir mesurer individuellement le niveau d’expression en terme de protéines par des analyses protéomiques. En effet, bien que le taux d’ARNm reflète dans un sens le taux de protéines, de nombreux événements post-transcriptionnels font qu’il n’y a pas de corrélation directe entre le taux d’ARNm et le taux de protéines [6] notamment pour les gènes ayant un faible taux d’expression. Ainsi les études de protéomiques quantitatives constituent une nouvelle approche pour l’étude des mécanismes cellulaires [45].

En « protéomique classique », on étudie l’ensemble des protéines d’une cellule ou d’un tissu sur un gel à deux dimensions où les protéines sont séparées en fonction de leur charge puis de leur masse. Plusieurs centaines de protéines séparées sur le gel peuvent alors être visualisées par coloration au bleu de coomassie ou à l’argent, ou par marquage radioactif ou fluorescent. Les différences d’expression de protéines, entre deux états différents d’une cellule, peuvent être mesurées en quantifiant le ratio de l’intensité des spots entre deux gel-2D indépendants. Ceci requiert en général une assistance informatique. D’autres techniques ont été mises au point pour faire de la quantification protéique sans passer par le gel-2D qui pose des problèmes de reproductibilité. De plus, toutes les protéines ne sont pas représentées sur ces gels et les protéines à faibles abondances ne sont pas détectées. Ainsi des techniques utilisant l’immunodétection ou la spectrométrie de masse vont devenir incontournable pour les expériences d’études du taux d’expression des protéines.

3.2 Quantification sur gel Le principal problème technique dans la caractérisation de l'expression protéique

réside dans la quantification. Il n'existe pas de méthode simple de quantification absolue valable pour l'ensemble des protéines (les colorants ou marqueurs ne se fixant pas de manière uniforme sur toutes les protéines). Il ne peut y avoir par conséquent que des quantifications relatives, en comparant des protéines de même famille par exemple. En outre la plupart des techniques de mise en image présentent des phénomènes de saturation au-delà d'un certain seuil ; seuls les Imagers évitent cet écueil. L’approche standard de l’analyse protéomique par la technique de l’électrophorèse à deux dimensions couplée à la spectrométrie de masse (2DE-

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MS), permet de comparer, de façon relative, l’abondance d’une protéine dans deux cellules ou tissus différents en comparant l’intensité d’un spot, dans un gel, à celle du même spot dans un autre gel. Cependant, certaines classes de protéines sont exclues et non représentées sur un profil de gel 2D. Ceci inclus les protéines très acides ou très basiques, les très grosses ou les très petites protéines ainsi que les protéines membranaires. Ainsi le nombre de spots sur un gel 2D n’est pas représentatif du nombre total de gènes exprimés. De plus, la technique 2DE détecte uniquement les protéines présentent dans les cellules de façon abondantes et, l’importante classe des protéines régulatrices (faiblement exprimées) sont difficilement détectable. Enfin, le pré fractionnement et la concentration des échantillons, nécessaire à la détection des protéines de faible abondance rend la quantification impossible.

Il existe différentes techniques permettant de détecter et quantifier les protéines à partir d’un gel [46]. L’utilisation du bleu de coomassie est une des méthodes les plus utilisées en détection bien que cette coloration s’avère peu sensible et ne fournit une réponse linéaire que sur une faible gamme de concentration protéique (de 100ng à 1 µg). La coloration à l’argent, également très utilisée, présente elle une plus grande sensibilité mais n’est pas applicable à la quantification des protéines sur gel du fait de sa faible linéarité de réponse. Il est cependant possible de parvenir à une quantification efficace des protéines d’un gel 2D en utilisant un marquage radioactif ou fluorescent. En effet, ces deux types de marquage protéique sont actuellement les plus sensibles en permettant des détections de l’ordre de 10-13 mole (soit 1.5 à 20ng pour une protéine de15 à 200 Kda), tout en offrant une réponse linéaire jusqu’à des concentrations de l’ordre du µg.

Ces techniques de quantification sur gel requièrent alors l’utilisation d’un appareillage performant d’imagerie tel que les caméras CDD, les scanners laser, les densitomètres ou les fluorimagers. Il existe de plus des logiciels d’assistance informatique, pour le traitement des images, mis sur le marché par BioRad (Melanie II, Quest), par Genomic Solutions (Bio Image 2D) et par Amersham Pharmacia Biotech (Phoretix 2D Full) [47].

Il faut cependant considérer le fait que ces techniques de quantification sur gel posent des problèmes du fait de leur faible reproductibilité et de la non représentation de certaines classes de protéines.

3.3 Quantification par méthode immunologique De nouvelles techniques basées sur la spécificité de reconnaissance entre un anticorps et sa protéine cible ont été développées pour la protéomique quantitative. Il est en effet possible lorsque l’on possède les anticorps spécifiques, de quantifier le taux d’expression de ces protéines par la méthode ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)[48]. Cependant, la trop faible sensibilité de cette technique n’autorise pas l’étude du niveau d’expression des protéines faiblement représentée. Ainsi, Zhang et al [49], ont récemment publié une technique, basée sur le principe de l’ELISA sandwich, permettant d’augmenter sa sensibilité d’un facteur 109. Pour cela après immobilisation de la protéine d’intérêt par l’anticorps primaire correspondant, la révélation est effectuée par le biais d’un anticorps secondaire permettant une amplification du signal et non un système enzymatique comme la peroxydase ou la phosphatase alcaline. Dans la technique appelée IDAT (Immuno Detection Amplified by T7 RNA polymerase) un fragment d’ADN double brin contenant le promoteur de la RNA polymérase du phage T7 suivi d’une courte séquence de taille définie est fixé de manière covalente à l’anticorps secondaire. Ainsi, après fixation spécifique de ces anticorps secondaires, la RNA polymérase T7 est ajoutée avec des NTP marqués au 32P dans le mélange réactionnel. Il y aura alors amplification linéaire des brins d’ADN fixés. La quantité des brins d’ARN marqués

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synthétisés sera directement proportionnelle à la quantité d’anticorps secondaires et donc à la quantité de protéines présentes.

3.4 Quantification par spectrométrie de masse De nouvelles techniques ont été mises en place en utilisant un marqueur isotopique

stable. La méthode consiste à l’addition dans l’échantillon d’un standard interne, correspondant à la même entité chimique que l’analyte(s), mais marqué par un isotope lourd (15N, 13C, 2H, 18O). Comme l’efficacité de l’étape d’ionisation est très variable pour les peptides, le meilleur standard interne pour un peptide donné est le même peptide marqué avec un isotope stable. Ces 2 entités ayant les mêmes caractéristiques physico-chimiques, ils subiront de la même façon les étapes d’isolation, purification, séparation et ionisation. On obtiendra sur le spectre de masse une paire d’ions-peptides séparée par le supplément de masse apporté par l’isotope lourd. Ainsi, le ratio entre l’intensité des deux entités nous donnera l’abondance relative d’une protéine en fonction des conditions, du type cellulaire ou d’autres applications.

Une première technique, décrite par Oda et al [50] consiste à cultiver un type cellulaire dans deux conditions différentes afin d’étudier les variations dans leur taux d’expression protéique. Pour cela, une des deux cultures est réalisée en présence exclusive d’une source d’azote lourd (15N). Un nombre équivalent de cellules de chacune des deux cultures est rassemblé avant de subir une extraction et une séparation protéique par SDS-PAGE. Après digestion trypsique dans le gel des spots sélectionnés, les peptides sont analysés en MALDI-MS-MS.Cette analyse en spectrométrie de masse permettra l’identification de la protéine ainsi qu’une quantification relative par mesure du ratio d’intensité des pics entres les peptides non marqués et leurs homologues lourds. On peut ainsi déterminer les différents niveaux d’expression des gènes en terme de protéines en fonction des conditions de culture appliquées. Les problèmes de cette technique résident dans le fait qu’une telle analyse n’est pas applicable aux tissus et que les milieux enrichis en 15N peuvent perturber le taux d’expression protéique. Pour palier à ces inconvénients, une amélioration de cette technique, l’ICAT (Isotope Coded Affiny Tag ) [51,52], a été mise au point. Dans cette technique, bien que le principe général soit similaire , l’incorporation des isotopes est réalisée après isolation des protéines par alkylation sélective des cystéines avec un réactif soit lourd, soit léger [figure 5]. Ce réactif portant une biotine, il permet après digestion trypsique des protéines marquées, de réduire sur colonne avidine la complexité du mélange peptidique. Cette technique est donc compatible avec l’étude des protéines des fluides biologiques, des tissus ou de tous types de cellules, bien qu’inapplicable aux protéines dépourvues de cystéines. De plus la sensibilité de l’analyse dépend de la quantité de molécules marquées par le réactif. Or la réactivité du réactif a une grande importance pour permettre le marquage des protéines à faible concentrations, cette réactivité n’a pas été évaluée à notre connaissance. Une troisième technique, récemment publiée par Xudong Yao [53] est basée sur l’incorporation d’18O le marquage des peptides du type cellulaire étudié est directement effectué lors de la digestion trypsique par incorporation d’18O, lors de la réaction d’hydrolyse, en présence d’H2

18O. Ainsi, l’incorporation de deux 18O lors du clivage permettra de visualiser le pic correspondant à 4 unités de masse du même peptide clivé en milieu H2

16O. Cette méthode présente l’avantage de permettre le clivage et le marquage des protéines en une seule étape et facilite la déduction des séquences peptidiques sur le spectre de masse obtenu par rapport à la technique de l’ICAT, où ce réactif, avait une masse de 500 Da .

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4 Applications scientifiques de la protéomique Les progrès en miniaturisation, en automatisation et en gain de résolution de toutes ces techniques permettent de caractériser de plus en plus de structures, de plus en plus de paramètres physiques et biochimiques. La spectrométrie de masse et l’analyse en gel 2D représentent les méthodes majeures d’utilisation en recherche fondamentale. De nombreux profils d’expression d’organismes , soumis à différents stimuli, sont établies. Les variations de structures lors des modifications post-traductionnelles accompagnées d’interactions protéiques multiples sont étudiés avec plus de facilité. La collecte de toutes ces données dans les bases de données facilite d’autant plus l’essor de la protéomique.

4.1 Variations de profil d’expression L’objectif de nombreuses études fondamentales est l’identification de protéines sur ou sous exprimées selon différentes conditions expérimentales. Une comparaison des profils d’expression protéique obtenus par gel 2D permet, par exemple, des études de variation d’expression de protéine en réponse à des stimuli ou lors d’un phénomène de différentiation ou encore au cours du développement d’organisme. Globalement, les protéines sont extraites de tissus ou cellules issus de deux conditions différentes puis séparées par gel 2D. Les protéines peuvent être visualisées par un traitement du gel à l’argent ou au bleu de coomassie. Des logiciels analysent les profils obtenus et quantifient les différents spots. Le ou les spots d’intérêt peuvent ensuite être récupérés et analysés par spectrométrie de masse. La figure 6 montre les variations d’expressions pouvant être observées lors d’une comparaison de profils d’expression protéique[54]. De nombreuses applications sont retrouvées dans la littérature. Par exemple, des études ont démontré le pouvoir d’une approche protéomique pour effectuer une corrélation directe de la réponse d’un organisme à des stimuli environnementaux. En effet, Quadroni et al. ont montré qu’une privation de sulfate induit chez Pseudomonas aeruginosa une surexpression d’un certain nombre de protéines régulatrices [55]. Une étude similaire a permis d’identifier chez Bradyrhizobium japonicum, différentes protéines induites par choc thermique (28°C à 43°C) [56]. Une récente étude s’est intéressée aux variations d’expression protéique suite à une interaction symbiotique entre la bactérie Sinorhizobium meliloti et le trèfle Melilotus alba. Une comparaison du profil d’expression d’un état symbiotique et non-symbiotique a mis en evidence l’induction et la répression de différentes protéines. Cette étude a permis de caractériser des protéines responsable de la symbiose et de déterminer les différentes modifications induites par la symbiose, au seins des deux partenaires [57].

Des études toxicologiques utilisent fréquemment les analyses protéomiques pour comprendre le mécanisme d’action d’une drogue ou pour identifier ses cibles. Vido et al. ont cherché à identifier des activités responsables de la détoxification du cadmium, métal lourd très toxique à faible concentration, chez Saccharomyces cerevisiae. Ils ont comparé le profil d’expression des protéines totales de levures soumises à un stress au cadmium et non traitées : 54 protéines sont induites et 43 sont réprimées. Parmi ces protéines induites, ils ont pu identifier deux voies : glutathion et thioredoxine, qui semblent être essentiels pour une protection contre l’empoisonnement au cadmium [58]. De façon similaire, Aicher et al. ont observé une corrélation entre le niveau d’expression de la calbindine-D 28K, protéine liant la calcium, et la nephrotoxicité induite par la cyclosporine A (CsA). La calbindine-D 28K a été identifiée en comparant des profils d’expression de reins sensibles ou non à la toxicité de la CsA, et peut donc être considéré comme marqueur de cette nephrotoxicité [59].

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L’analyse protéomique peut également permettre de caractériser des protéines spécifiques d’une souche ou d’une espèce particulière. En effet la comparaison du protéome de souches saines de Mycobacterium bovis BCG et de souches virulentes de Mycobacterium tuberculosis a permis d’identifier entre autre, des facteurs de pathogénicité, ainsi que des protéines exprimées spécifiquement chez M. tuberculosis, protéines susceptibles d’être impliquées dans la maladie [60]. De façon analogue, les protéines de trois souches d’Helicobacter pylori ont été séparées par gel 2D. L’équipe de Jungblut a ainsi identifié quelques spots communs à ces trois souches, pouvant être considérés comme marqueurs potentiels [61]. Un autre exemple est l’étude par Komatsu et al. de deux espèces de riz, le riz vert et le riz étiolé. L’ensembles des protéines extraites ont été séparées par gel 2D et plus de 300 spots sont révélés et analysés. Les profils d’expressions obtenus, couplés à une analyse partielle de la séquence de certaines protéines, ont révélé la présence de protéines phosphosynthétiques chez le riz vert, protéines absentes chez l’étiolé où des enzymes antioxydantes sont retrouvées. Cette approche permet donc d’identifier des protéines spécifiques à une espèce, à une condition physiologique particulière, permettant ainsi la compréhension du rôle de ces protéines [62].

Les techniques classiques de séparation des protéines par électrophorèse bi-dimensionnelle et l’analyse des spots obtenus par spectrométrie de masse ouvrent donc un grand champs d’application à l’analyse du protéome. Nous avons vu que les cellules, soumises à différentes conditions environnementales, expriment un ensemble de protéines qui peut varier d’une condition à l’autre. Ainsi ces différentes techniques complétées par le traitement bioinformatique des données peut permettre la caractérisation de protéines déjà connues ; la mise en évidence de nouvelles protéines et à terme, la reconstitution de voies de signalisation et/ou de transduction.

4.2 Analyse des modifications post-traductionnelles. Les modifications post-traductionnelles constituent un autre champs d’application très important au niveau du métabolisme des protéines et de leur régulation qui peut être explorée par l’analyse protéomique. L’importance et le grand nombre des modifications post-traductionnelles sont des évènements bien admis. Transitoires ou permanentes, elles jouent un rôle important non seulement dans la fonction mais aussi dans la régulation de la fonction des protéines. Ces différentes modifications s’effectuent sur des acides aminés particuliers pendant la maturation de la protéine dans l’appareil de Golgi. Elles se caractérisent soit par l’addition de composés ou groupements chimiques comme l’acétylations N-terminale pour la plus commune soit par une protéolyse partielle de la protéine. Parmi les modifications post-traductionnelles, il existe aussi des méthylations, des phosphorylations, des glycosylations, des addition de composés lipidiques, par exemple acylation, prénylation, greffe d’une ancre Glycérophosphoinositol (GPI) et beaucoup d’autres.

Les différents types de modifications et les plus importantes ont été recensées par Natalia N. Nalivaeva et Anthony J. Turner [63] ainsi que leur influence sur l’enzyme acétylcholinesterase. Cette enzyme, en dehors de son activité de dégradation du neurotransmetteur acétylcholine, est impliquée dans la prolifération et la différentiation cellulaire, la conductivité membranaire ainsi que dans la réponse au stress, l’apprentissage et la mémoire. La N-glycosylation sur des asparagines de cette enzyme influence sa durée de vie. Sa phosphorylation sur des motifs spécifiques par la Protéine Kinase A limite sa perte d’activité lorsqu’elle est soumise à des agents inhibiteurs ; cette phosphorylation, in vivo, pourrait avoir un rôle protecteur au niveau des transmissions cholinergiques.

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Ces modifications post-traductionnelles provoquent des changements des propriétés physico-chimiques de la protéine. Une variation du point isoélectrique et de la masse est observée. Ces variations vont avoir des conséquences lors de l’analyse par les techniques d’électrophorèse 2D où la formation de traînée pendant la migration de la protéine peut être observée. De même, lors de l’analyse en spectrométrie de masse, le spectre obtenu pour cette protéine sera aussi modifié. Ces différences de propriétés identifiées et répertoriées peuvent alors être utilisées pour caractériser ces modifications post-traductionnelles. Ainsi, A. Sickmann et al. [64] donnent plusieurs exemples : l’analyse en MALDI-TOF de la cyclophiline A de souris révèle un pic à 2048,99 Da qui peut seulement être expliqué par une modification de type acétylation N-terminale confirmée par l’analyse en MALDI-PSD. Un autre exemple est donné pour la phosphorylation où ils constatent que les fragments de peptides modifiés révèlent un signal à –80 Da et –98 Da expliqué par la perte respective de HPO3 et H2PO4 en MALDI-PSD par le fragment phosphorylé [Figure 7 ]. Connaissant l’importance de l’évènement de phosphorylation dans les signaux de transduction (modulation de l’activité de certaines enzymes et de certains récepteurs), les mêmes auteurs A. Sickmann et al [65] rappellent que selon les différents types d’acides aminés O-phosphorylés, N-phosphorylés, S-phosphorylés, des précautions doivent être prises lors de la préparation des échantillons pour l’analyse. En effet la stabilité de la phosphorylation varient selon les acides aminés sur lesquels elle s’effectue, ainsi les phospho-thréonines, -sérines, et -tyrosines sont stables en milieu acide comme en milieu alcalin contrairement aux phospho-aspartates, -glutamates dont le phosphate est très instable dans ces deux types de milieu. Le taux de protéines phosphorylées étant très faible, la préparation des échantillons doit passer par une étape d’enrichissement en la forme phosphorylée par analyse en chromatographie échangeuses d’ions après incorporation ou non de phosphate radioactif. Une technique de chromatographie d’affinité, IMAC (Immobilized Gallium(III) Affinity Chromatography) [66] peut aussi être utilisée, les phosphopeptides sont retenus de façon sélective et en quantité suffisante pour être analysés en spectrométrie de masse MALDI/TOF ou ESI. Les travaux de P.B. Mills et al.[67] ont montré qu’il était possible de déterminer les sites et les types de glycosylation retrouvées sur la protéine α1-antitrypsine. La séparation par électrophorèse 2D révèle la présence de 8 isoformes de la protéine [Figure 8 : Analyse en électrophorèse 2-D PAGE du plasma] dans un intervalle de pH de 4,5 à 5,5. Des digestions dans le gel par diverses protéases (PNGase F, trypsine, chymotrypsine) et glycosidases complétées par l’analyse en MALDI-TOF-MS leur permettent de localiser les sites de glycosylation sur les asparagines 46, 83, 247. Ainsi la macrohétérogénéité des isoformes de la protéine, c’est à dire l’état de la protéine en terme d’occupation des sites de glycosylation, a été définie. Par la suite, la déglycosylation des peptides et l’analyse des sucres, en MALDI-TOF, permet d’identifier les différentes glycosylations présentes sur ces acides aminés pour définir ici, la microhétérogénéité des isoformes de l’α1-antitrypsine. Ainsi, ils trouvent, par exemple, que l’isoforme M4 possède 2 groupements glycanes bi antennaires et un groupement tri antennaire. La possibilité de caractérisation des sucres sur les glycoprotéines peut se révéler très utile. L’utilisation combinée de l’électrophorèse 2D-PAGE et de la spectrométrie MALDI-TOF peut constituer une stratégie de diagnostic pour des patients atteints de maladies dues à une altération du processus de glycosylation.

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4.3 Etude des interactions Protéine / Protéine La recherche d’homologies entre protéines permet d’attribuer un rôle assez général au produit d’un gène. Cependant, il est plus complexe de déterminer la fonction physiologique exacte d’une protéine. Même si les mécanismes d’actions de protéines homologues sont les mêmes, les voies métaboliques auxquels ils appartiennent peuvent être très différentes.

L’étude des interactions protéine/protéine semblent être une approche intéressante pour lier une protéine inconnue à un processus cellulaire connu. Des informations sur la fonction peuvent aussi être obtenus en identifiant des partenaires d’action connus. L’une des techniques les plus utilisées est celle du double hybride chez la levure [68], cependant son utilisation est limitée pour l’étude d’éléments physiologiques spécifiques des organismes pluricellulaires [69].

Des auteurs ont combiné une technique qui utilise des protéines mutées « piégeuses de substrats » et des approches protéomiques pour découvrir des substrats de tyrosine phosphatase (PTPs) [69]. Ces enzymes déphosphorylent les protéines phosphorylées sur une tyrosine. La technique mise en œuvre utilise des enzymes mutées comme sonde, elles peuvent se lier à leur substrat mais ne peuvent plus le déphosphoryler, le substrat est donc piégé [70]. Cette procédure a été adaptée à une approche protéomique pour sonder des substrats candidats d’extraits cellulaires qui ont été séparés par gel 2D et transférés sur membrane. Les interactions enzyme-substrat sont révélées par far Western et les protéines substrats positives sont ensuite identifiées en spectrométrie de masse utilisant un appareil Z-spray Q-TOF en mode MS/MS. L’utilisation de gels 2D a permis d’augmenter la résolution et la spécificité et donc de mieux séparer les substrats potentiels. L’utilisation de la tyrosine phosphatase mutée FAP-1 comme sonde a révélé 2 substrats potentiels de tyrosine phosphatase. Les séquences peptidiques obtenues par spectrométrie de masse se sont révélées homologues à une α-tubuline humaine pour le 1er spot et une ATPase du réticulum endoplasmique humain pour le 2ième spot. La combinaison du far western immunoblot et de l’approche protéomique (gel 2D et MS/MS) a permis d’attribuer des substrats connus et donc de mieux comprendre le rôle physiologique de la tyrosine phosphatase FAP-1. Cette technique, contrairement à celle du double hybride ne nécessite pas d’étape de transfection de cellules et permet une bonne résolution grâce au gel 2D. Cependant la principale limite est que les protéines sondées sont dénaturées, les résultas obtenus en conditions natives seraient peut être différents. Les outils de l’analyse protéomique peuvent donc être utilisés pour analyser les interactions protéine/protéine, cependant des analyses complémentaires, notamment en conditions natives peuvent être nécessaire.

4.4 Analyse protéomique de microorganismes et de champignons

L’approche du protéome par les gels 2D permet de cartographier la localisation des protéines en fonction de leur masse moléculaire et de leur pI. Cette approche est de plus en plus réalisée sur des microorganismes modèles ou pathogènes ou sur des champignons. Plusieurs types de protéines sont retrouvés dans ces analyses : 1°- les protéines phénotypiques qui caractérisent l’état d’une protéine spécifique dans une condition donnée à un temps t ; 2°- les « stimulons » qui appartiennent à un ensemble de protéines dont le taux de synthèse change selon un stimulus ; 3°- les signatures protéomiques qui sont caractéristiques d’une réponse à une condition donnée. La signature correspond le plus souvent à des voies de signalisation ou à des fonctions biologiques. Le « mapping » ou cartographie consiste à cataloguer toutes les séries de protéines par gel ou chromatographie liquide. C’est une approche bien réelle pour la protéomique microbienne:

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502 protéines de H. influenzae ont été annotées par Langen et al [72] grâce à l’approche de la protéomique. De même, 401 protéines de S. cerevisiae ont été caractérisées par Perrot et al [73] soit 6.8% des protéines totales de S. cerevisiae. Ceci a permis de caractériser des fonctions protéiques dans le métabolisme du carbone (20%), les protéines du métabolisme (30%) et les protéines intervenant dans la synthèse des protéines et des acides nucléiques (25%) néanmoins 38 protéines ont encore une fonction inconnue.

Les techniques protéomiques (puissance de résolution, étroite gamme de pH et le prefractionnement cellulaire) permettent de révéler environ 75% des protéines du génome [74]. Un pourcentage plus faible est observé pour les espèces difficilement cultivables : H. pylori et les mycobactéries qui poussent sur des milieux complexes. Mais malgré les techniques d’analyse encore imprécises, certains basent leurs études sur les protéines les plus abondantes. Futcher et al [75], en étudiant S. cerevisiae, révèlent 1400 spots sur un gel 2-D mais n’identifient que 148 protéines sur les 6000 protéines prédites : leur étude est alors basée sur 2.5% du génome de S. cerevisiae. Pour remédier à cela, il faut développer de nouvelles techniques plus sensibles.

Les protéines les plus étudiées chez les microorganismes pathogènes sont les protéines membranaires [76] et de la paroi qui sont à l’interface organisme - milieu extérieur et les protéines excrétées qui représentent des facteurs de pathogénicité [60] et de toxicité. Cependant, leur analyse est difficile car dans le milieu de culture les protéines excrétées sont en présence de contaminants : peptone, tryptone et de fragment cytosolique due au turn over des cellules. Les protéines membranaires sont elles aussi difficiles à analyser en raison de leur hydrophobicité intrinsèque. Les cartes de référence des protéines membranaires ont été achevés pour E.coli [77], Pseudomonas aeruginosa [78] (récemment complétés pour la souche pathogène PA01 de 400 protéines associées aux membranes ), H. pylori [79] et pour Borrelia burgdorferi [80]. Cette liste montre seulement un échantillon de l’avancée de la protéomique sur les protéines membranaires, elle reste néanmoins exhaustive car de nombreuses études sont toujours en cours.

L’une des difficultés rencontrées sur la protéomique des microorganismes est le manque de matériel de référence dans certaines banques de données comme pour l’étude des protéines de la paroi de Trichoderma reesei [81]. Il est l’un des champignons filamenteux parmi les plus puissant producteur de protéines extracellulaires et ne possède pas encore de banque de données complète. Le projet génome et du protéome de T. reesei a débuté en l’an 2000. L’utilisation des banque de données de S. cerevisiae n’est pas un support adéquate pour la détermination des protéines de la paroi de Trichoderma reesei.

4.5 Analyse protéomique de cellules eucaryotes

Les technologies analytiques ont aussi permis d’établir des cartes 2D de référence en

utilisant différents tissus ou différentes lignées cellulaires. La complexité des cellules eucaryotes ne permet pas de caractériser la totalité du protéome. Mais grâce à la réalisation d’un protéome subcellulaire composé de compartiments cellulaires et de structures macromoléculaires, l’analyse des protéines est facilitée. La plupart des études sur les organelles (définies ici comme un compartiment cellulaire limité par une membrane) sont restreintes aux plus abondantes telles que les mitochondries, le réticulum endoplasmique (RE) / appareil de Golgi, les lysosomes et le noyau.

Les mitochondries sont les organelles les plus importantes. Elles représentent dans certaines cellules jusqu’à 25% du volume total. Une étude sur les protéines de placenta

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humain [82] a permis de mettre en évidence une carte protéique de références et de localiser 53 protéines connues par séquençage N-terminal, immunoblotting et empreintes peptidiques. Pour le RE et l’appareil de Golgi qui sont le siège des modifications post-traductionnelles, une approche protéomique fut réalisée sur des complexes de Golgi d’hépatocyte de rat [83] et a permis de localiser 173 protéines.

Le noyau qui contient l’information génétique représente environ 5% du volume total cellulaire. Des cartes de référence sur des protéines nucléaires ont été construites à partir de lignées cellulaires de lymphomes de Burkitt (BL60) [84].

De plus une étude sur des lysosomes de placenta humain [85] a permis de créer une carte de référence et d’identifier 3 nouvelles protéines, de localiser 14 protéines luminales et 5 protéines membranaires.

Ces techniques de compartimentation des cartes protéiques peut permettre de découvrir de nouvelles voies de signalisation dépendant de la localisation cellulaire. Les structures macromoléculaires sont aussi utilisées pour l’analyse des protéines du fait de leur intérêt dans la compréhension des fonctions biologiques. Des études ont été effectuées sur la matrice nucléaire [86], sur les spliceosomes [87] et sur les pores nucléaires [88]. L’étude de ces derniers a mis en évidence 29 protéines appartenant aux pores nucléaires et 11 facteurs de transport. Elle a servi de base pour former un modèle 3D des pores nucléaires.

4.6 Utilisation des cartes protéiques

L’analyse soustractive de deux patterns d’expression suivant des conditions expérimentales définies peut permettre d’étudier les « stimulons » qui sont des protéines induites ou réprimées suivant des facteurs environnementaux et les marqueurs ou signatures protéomiques qui correspondent soit à une souche spécifique soit à un facteur spécifique tel que des facteurs de résistance, de pathogénicité.

Ces études peuvent aussi permettre d’observer de nouvelles voies de signalisation et de prédire de nouvelles fonctions protéiques par les banques de données et par l’utilisation du concept « d’analyse des fonctions voisines les plus proches ». Ce concept est valable lorsque l’on étudie des structures macromoléculaires. Chaque protéine a un rôle propre dans la structure mais la mise en corrélation de toutes les fonctions protéiques donne sa raison d’être à la structure macromoléculaire. C’est pourquoi l’analyse des fonctions voisines les plus proches peut permettre de prédire une fonction encore inconnue.

4.7 Les bases de données Protéomiques

Les bases de données protéomiques contiennent et organisent les nombreuses informations des analyses protéomiques. D’une manière générale, elles contiennent de nombreux gels 2D annotés réalisés dans des conditions cellulaires définies pouvant ainsi servir de cartes de références. Ces bases de données contiennent également les informations concernant les protéines identifiées au niveau de ces gels 2D, décrivant ainsi l’état du protéome d’une cellule, d’un organite ou d’un organisme dans des conditions déterminées.

L’ensemble des bases de données protéomiques est répertorié et disponible sur le site EXPASY (http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html ). Pour chaque base de donnée, une description du ou des organismes ou du type cellulaire étudié est donnée accompagné d’un lien hypertexte qui permet d’accéder directement à la base de donnée en question. Les principales bases de données sont celles des organismes modèles comme Saccharomyces cerevisiae (YPD), Arabidopsis thaliana, Escherichia coli, Mus musculus, mais aussi des bases concernant différents types cellulaires et fluides humains ( Human and mouse 2D PAGE database, Heart-2D PAGE ; Protein Disease database) ou encore concernant les

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microorganismes pathogènes (2-DE database au Max Planck Institute for Infection Biology) ou les parasites (Parasite proteome maps).

Le site de la SWISS 2D PAGE (http://www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html)est parmi les plus complets, les plus faciles à utiliser et les plus interrogés ce qui en fait la principale plate forme d’informations en ce qui concerne les analyses protéomiques de gels 2D [36]. Elle contient 31 cartes 2D de référence des différents organismes : cellules d’humain et de souris, d’E.coli, d’A. thaliana. Cela représente 2824 spots identifiés correspondant à 614 protéines [89]. Les résultats sont présentés sous la forme d’une page Web donnant la description de la protéine, les protocoles de réalisation des cartes de références, les informations physiologiques et pathologiques, les données expérimentales (pI, poids moléculaire, composition en acides aminés …) ainsi que les références bibliographiques liées à MEDLINE [89].

Il existe des bases de données spécialisées comme la YPD : Yeast Proteome database [90,91], base de donnée de la levure S. cerevisiae (http://www.proteome.com/databases/index.html). Cette base de donnée est aussi un modèle d’organisation et de présentation d’informations compréhensibles en ce qui concerne les protéines [92]. Les résultats, présentés sous forme de «YPD protein report», contiennent une partie description de la protéine ( nom, séquence, liens vers d’autres bases), une partie propriétés (fonction, activité enzymatique, interaction physique, génétique, localisation, régulation …) et une partie de références bibliographiques liées à MEDLINE. Cependant, la localisation des protéines sur gel 2D se fait via le site YPM : Yeast Protein Map (http://www.ibgc.u-bordeaux2.fr/YPM). Il est possible d’accéder aux protocoles de construction des cartes 2D de référence via les références bibliographiques. En effet ces cartes sont utilisées comme référence pour les scientifiques qui cherchent à mettre en évidence des différences dans le protéome d’une cellule dans différentes conditions. Il est donc indispensable de réaliser les essais dans les mêmes conditions que les témoins, i-e les cartes de référence, pour une comparaison efficace. Le développement de bases de données concernant les organismes pathogènes doit être effectué. L’interconnexion de ces bases avec celles des organismes modèles permettra notamment d’exprimer le pouvoir des approches génomique/protéomique dans l’étude des problèmes biologiques et médicaux [91].

5 Applications médicales Les avancées dans le domaine de la protéomique génèrent actuellement un grand

nombre de cibles thérapeutiques potentielles et permettent la découverte de marqueurs de maladies.

Un des principaux défis du secteur pharmaceutique est d’augmenter l’efficacité de la détection de la toxicité des médicaments par comparaison des profils protéiques entre des individus soumis à un traitement et des individus non traités.

5.1 Etude de l’efficacité et de la toxicité des agents thérapeutiques

De nombreuses études utilisant la protéomique ont déjà été utilisées pour étudier les effets d’un médicament sur des échantillons biologiques.

Ainsi, la protéomique a joué un rôle prépondérant dans la découverte des mécanismes de la néphrotoxicité induite par un traitement à la cyclosporine A (CsA). L’étude des modifications de profils protéiques sur gels 2DE entre des rats traités à la CsA ou non traités a permis de mettre en évidence la régulation négative, en cas de traitement à la CsA, d’une protéine de liaison au calcium, ce qui induit une accumulation de calcium dans les tubules du

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rein et donc une toxicité tubulaire [93]. Cette étude a ensuite été généralisée à d’autres espèces, mettant en évidence l’existence d’un mécanisme similaire de néphrotoxicité chez l’homme [94].

Une autre application de la protéomique aux effets d’agents thérapeutiques est l’établissement de profils protéiques typiques d’une catégorie d’agents. L’indométhacine a ainsi servi à établir un profil d’expression protéique typique des agents anti-inflammatoires non stéroidiens (NSAID) [95]. En établissant le même type de profil pour d’autres NSAID potentiels, il devient alors possible de prédire leur efficacité par comparaison avec le profil type correspondant au traitement à l’indométhacine.

Il est aussi possible d’observer le devenir d’un système de prise de thérapeutique par voie intraveineuse constitué de particules de latex servant de transporteur pour l’agent thérapeutique. En comparant les gels 2D des protéines adsorbées sur ces particules dans différents milieux in vitro, sérum frais ou inactivé, plasma, on a pu déterminé que ces particules provoquaient l’activation de la voie alternative du complément, permettant ainsi leur élimination in vivo [96].

La protéomique permet de plus une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et la détection de modifications post-traductionnelles induites par un traitement ou une pathologie [97]. Mais l’intérêt de la protéomique consiste aussi en la détermination de protéines pouvant être utilisées comme marqueurs des maladies, détectables de façon précoce et pouvant ensuite être utilisées comme cibles thérapeutiques.

5.2 Application aux différents types de pathologies humaines

Pathologies du système nerveux central (SNC)

L’étude du liquide céphalorachidien (CSF) et du sérum permet de voir les changements du profil d’expression protéique tout au long d’une maladie et de découvrir quelles sont les protéines impliquées dans le développement de la pathologie.

Ainsi, dans le cas de la maladie d’Alzheimer (AD), ou de la schizophrénie, des études ont démontré que l’expression de diverses protéines synaptiques était altérée. Les protéines SNAP 25 et GFAP (glial fibrillary acidic protein) par exemple, se révélent être des protéines associées à la maladie d’Alzheimer et leur présence a été décelée à l’aide d’études protéomiques dans le cerebellum et dans les lobes frontaux, pariétaux, temporaux et occipitaux du cortex de patients atteints d’AD[98].

D’autres études du protéome ont montré, chez des patients atteints d’AD, une diminution globale de l’expression d’une protéine inhibitrice de la liaison au diazepam (DBI) qui permet de réguler négativement la transmission GABAergique, alors que cette protéine est régulée positivement dans le liquide cérébrospinal des mêmes patients [99].

Ces études sont désormais facilitées par l’établissement de cartes 2DE des protéines du cerveau humain (180 protéines ont été caractérisées) [100].

De plus, puisqu’il est désormais connu que durant l’apoptose, la mitochondrie délivre diverses protéines pro-apoptotiques comme le cytochrome c et des facteurs d’induction de l’apoptose, son dysfonctionnement pourrait avoir un rôle critique dans le développement de maladies neurodégénératives comme AD, Parkinson, ou la chorée de Huntington. Une carte du protéome de la mitochondrie est donc en cours d’élaboration [101].

Pathologies cardiaques

Les maladies cardiaques sont souvent multifactorielles, ainsi la capacité d’obtenir une vue globale des changements d’expression dans les cellules du myocarde pour les cas

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d’hypertension, d’ischémie, d’arrêt cardiaque ou de la cardiomyopathie dilatée (DCM) permet une meilleure compréhension des mécanismes causant ces maladies. La réalisation de banque de données de gel 2D des protéines cardiaques de l’homme et d’espèces modèles comme le chien et le rat permet aujourd’hui des recherches in vivo sur ces espèces modèles et de les transposer à l’homme par la connaissance des protéines homologues. En analysant les gels 2D de chiens chez lesquels une DCM a été provoquée, trente et une protéines voient leurs taux d’expression modifié parmi lesquelles de nombreuses sont impliquées soit dans la production d’énergie par les mitochondries, soit dans le système de contraction ou dans l’apport d’oxygène dans les cellules du myocarde [102].

La comparaison des gels 2D de cellules du myocarde saines et hypertrophiées (état des cellules dans le cas d’hypertension, d’infarctus ou de DCM) in vitro, a permis d’identifier onze protéines changeant de taux d’expression dont cinq isoformes de la chaîne légère de l’actine démontrant l’implication du système de contraction dans ces maladies [103]. Maladies infectieuses

Actuellement de nouveaux agents infectieux tels que le HIV, Ebola, Borrelia burgdorferi apparaissent et s’ajoutent à d’anciens pathogènes que l’on croyait contrôler comme Mycobacterium tuberculosis.

L’établissement du profil protéique de ces agents infectieux est donc essentiel au développement de vaccins, de traitements et de méthodes de diagnostique.

Ainsi, la comparaison entre le profil protéique des souches de Streptococcus pneumoniae résistantes à l’érythromycine et le profil de la souche sensible, a démontré qu’un des deux phénotypes de résistance présente une surexpression de GAPDH (glycéraldéhyde-3-Phosphate déshydrogénase) ainsi que des modifications post-traductionnelles sur cette même protéine [104]. Le rôle possible de la GAPDH sur la résistance à l’érythromycine doit donc être considéré.

De même, l’étude des profils protéiques de Mycobacterium tuberculosis, à l’aide de gels 2DE et d’analyses de spectrométrie de masse, a permis la découverte de nouveaux marqueurs de la maladie, dont un marqueur permettant de déceler avec beaucoup plus de sensibilité et de spécificité, les individus positifs pour le VIH et atteints de tuberculose [105]. Cancers (vésicule biliaire, sein, rein…)

L’apport de la protéomique dans la recherche sur les différents cancers existants est

crucial. Tout d’abord, l’identification et la détermination des fonctions des protéines permet une meilleure compréhension des évènements cellulaires, ce qui procure de nouvelles pistes de recherche dans les mécanismes de cancérisation. De plus, la comparaison des profils protéiques sur gel 2D de personnes atteintes de cancer et de personnes saines, suivi d’une étude en spectrométrie de masse pour identifier les protéines, fournit un outil pour la découverte de marqueurs pour chaque type de cancers comme dans le cas de la fig 1 pour le cancer du colon. Ces nouveaux marqueurs peuvent être essentiels pour établir des diagnostiques plus précoces et plus précis, mais peuvent également devenir de nouvelles cibles thérapeutiques et permettre ainsi d’entrevoir de nouvelles drogues anticancérigènes.

L’établissement d’une banque de données de gel 2D des protéines urinaires [106] et des deux types de cancer de la vésicule biliaire [107] a permis la découverte de marqueurs de ces cancers dont un est externalisé dans les urines, ce qui fournirait un outil de diagnostique simple [108].

De la même façon des études de profils protéiques ont été réalisées sur le cancer du sein qui montrent la diminution d’expression de différents membres de la famille des

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cytokératines et de certaines isoformes de la tropomyosine associées à la progression du cancer[109]. De plus, ils ont observé l’augmentation d’expression des antigènes nucléaires de prolifération cellulaire et de protéines du stress. Une autre étude récente portant sur les différences de modifications post-traductionnelles dans le cancer du sein, en particulier sur les différences de glycosylation des protéines [110], a démontré l’augmentation du taux de glycosylation de certaines protéines comme HPA-gly1 dans les cellules cancéreuses.

En comparant les profils protéiques sur gel 2D de sujets sains et malades, de nombreux marqueurs sont trouvés pour d’autres cancers comme celui de la prostate où, en plus de l’augmentation d’expression de la tropomyosine retrouvée dans les cas de cancer du sein, il a été trouvé une protéine de 40kDa, la phosphatase acide prostatique, dont le taux d’expression diminue dans les cellules malignes [111].

Ainsi, l’identification de marqueurs par des analyses similaires pour de nombreux cancers montre parfois des similarités entre certains cancers comme dans le cas de la tropomyosine ce qui permettra éventuellement d’identifier des cibles potentielles pour de nouveaux traitements. Les études actuelles sont pour l’instant focalisées dans la recherche de marqueurs afin d’améliorer les diagnostiques et de classer les tumeurs pour mieux adapter les traitements.

La protéomique permet donc un gain de temps considérable, en favorisant la

découverte de marqueur de maladies mais aussi en facilitant les tests de nouveaux agents thérapeutiques, en particulier dans les phases d’essais cliniques. Ceci est facilité par l’apparition des biocapteurs qui du fait de leur forte sensibilité va permettre dans les années à venir l’ouverture vers des techniques de diagnostiques automatisées. 6 Conclusion L’aire de la biologie actuelle traverse une phase de transition, la génomique laissant place de plus en plus à la protéomique. La compréhension du fonctionnement cellulaire nécessite une vue d’ensemble des caractéristiques structurales et fonctionnelles des protéines. La protéomique met en jeux de nombreuses expériences, d’identifications, de caractérisations, de quantifications, de mapping protéiques. Les avancées scientifiques proviennent d’une symbiose des techniques physico-chimique telle que la spéctrométrie de masse, de techniques biochimiques comme la chromatographie (souvent couplées aux MS) ou encore des techniques électrophorétiques comme l’IEF. Parmi ces techniques analytiques, la spectrométrie de masse représente la technique de pointe, elle assure de meilleures résolutions et une meilleure sensibilité. La protéomique quantitative, elle, utilise préférentiellement les techniques de coloration ou de marquage ( immunologiques IDAT ou radioactifs ICAT) sur gel. Les techniques chromatographiques telle la chromatographie liquide sont aménées à jouer un rôle très important, la qualité de la séparation/purification protéique est une étape limitante, en particuliers dans les mélanges complexes, mais ses dévellopements sont encore très balbutiant. Les applications qui découlent de la protéomique en recherche fondamentale et en développement industriels augmentent considérablement les innovations conceptuelles et matérielles en biotechnologie. Il est actuellement en étude des procédés et des outils de dépistage et de diagnostiques en recherche clinique, facilitant les réduction de coût tout en augmentant la précision et la sensibilité des détections de pathologies.

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La protéomique est actuellement une discipline en pleine expension, cependant de rares équipes ont commencé à pousser encore plus la recherche pour dépasser l’intérêt non plus pour les protéines mais sur l’effet de ces protéines sur les produits métabolisme cellulaire [112,113]. Par analogie, ce programme d’étude a été appelé Métabolome. Il étudie les phénomènes de reconnaissance moléculaire et l’implication des messagers secondaires modulant les différentes voies et flux métaboliques [114,115]. Les industriels travaillent sur des outils d’analyse de plus en plus automatisables pour que les études de protéomique, qui aujourd’hui motive de nombreuses équipes de recherches, puisse utiliser des techniques d’analyses qui s’améliorent constamment en se miniaturisant et offrir du haut débit d’analyse. La biologie doit miser aussi sur la bio-informatique pour créer des bases de données (Swiss-Prot ou trEMBL)et logiciels d’analyses de séquences soit protéiques soit génomiques(Sequest, Mascot, Peptide Search, Prowl, Protein Prospector, MS-FIT, Sequence retrieval system, Genbank). Cet outil, à l’interface des différentes disciplines de biotechnologie, apparaît comme un élément moteur de la recherche scientifique. Les données provenant de ces études doivent pouvoir être stockées, échangées pour les transferts de connaissances et des technologies.

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7 Figures et légendes

Figure 1 : Comparaison des profils 2-DE obtenus avec un extrait protéique de levure, deux IPG présentant des intervalles de pH différents. Widgruber, et Al., Electrophoresis 2000, 21, 2610-2616.

Figure 2 : Screening sur gel IPG à large gamme de PH d’échantillon protéique.

(a)

(b)

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Cordwell et al. Electrophoresis 2000,21,1094-1103

Figure 3 : Illustration schématique d’une analyse standard du protéome par gel d’électrophorèse 2D et Spectrométrie de Masse.

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Figure 4a : Représentation générale de l’utilisation de l’ESI.

Figure 4b : Représentation générale de l’utilisation du MALDI.

ESIESI Méthode de choix pour les expériences de haute sensibilité MS et MS/MS

COUPLAGE

Technique du« peak parking »

Augmentation de la sensibilité

•Chromato d’exclusion•Chromato d’échange d’ion

⇒élimination sels et concentration de l’échantillon

•Chromato capillaire

•Chromato phase inverseNanospray

(petite vitesse flux) Grande sensibilité

S A D

•Analyte en solution •Spray de gouttelette en

phase gazeuse

Série d’ions multichargé pour chaque peptide

Combinaisontriple quadripole/TOF

Exactide: 5ppmSensibilité: fmol

Trappe à ion

Traitement informatique

Détermination des séquences

Sensible au flux du solvant et à sa composition

Triple quadripole

Spectre d’ion supérieur

ESIESI Méthode de choix pour les expériences de haute sensibilité MS et MS/MS

COUPLAGE

Technique du« peak parking »

Augmentation de la sensibilité

•Chromato d’exclusion•Chromato d’échange d’ion

⇒élimination sels et concentration de l’échantillon

•Chromato capillaire

•Chromato phase inverseNanospray

(petite vitesse flux) Grande sensibilité

S A DS A D

•Analyte en solution •Spray de gouttelette en

phase gazeuse

Série d’ions multichargé pour chaque peptide

Combinaisontriple quadripole/TOF

Exactide: 5ppmSensibilité: fmol

Trappe à ion

Traitement informatique

Détermination des séquences

Sensible au flux du solvant et à sa composition

Triple quadripole

Spectre d’ion supérieur

Chromato d’intéraction hydrophobe et hydroxyapatite

S A D

Technique de préconcentration et d’enrichissement

Préconcentration analyte et élimination mol interférantes

GEL 2D

•Matrice = mb polymérique•Laser UV ou IR•Etat de charge faible ⇒ spectre

de complexité réduite

TOF

Réflectron

Augmentation résolution

Info sur séquences obtenue grâce :• PSD: Post Source Decay• CID: Collision Induce Dissociation

Traitement informatiqueDétermination protéines en fonction des peptides

•Sensibilité: fmol amol•Résolution masse > 10000Da•Exactitude < 30ppm

Etape critique pour l’analyse de petit volume et donc de petite quantité

MALDIMALDI Technique tolérante à la présence de petites molécules,de sels et de détergent

Chromato d’intéraction hydrophobe et hydroxyapatite

S A DS A D

Technique de préconcentration et d’enrichissement

Préconcentration analyte et élimination mol interférantes

GEL 2D

•Matrice = mb polymérique•Laser UV ou IR•Etat de charge faible ⇒ spectre

de complexité réduite

TOF

Réflectron

Augmentation résolution

Info sur séquences obtenue grâce :• PSD: Post Source Decay• CID: Collision Induce Dissociation

Traitement informatiqueDétermination protéines en fonction des peptides

Traitement informatiqueDétermination protéines en fonction des peptides

•Sensibilité: fmol amol•Résolution masse > 10000Da•Exactitude < 30ppm

Etape critique pour l’analyse de petit volume et donc de petite quantité

MALDIMALDI Technique tolérante à la présence de petites molécules,de sels et de détergent

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Figure5 : Stratégie ICAT de quantification de l’expression protéique Gygi, Rist Nat. Biotechnol., Vol.17, october 1999, 994-999. Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11:396-401.

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Figure 6 : . Partie de gel 2D comparant le profil des protéines cellulaires extraites de souches de Staphylococcus aureus résistante et sensible à un antibiotique, la méthicilline. A. Görg , IPG-Dalt of very alkaline proteins, Methods of Molecular Biology. 1999;112 :197-209. Review.

Figure 7 : (A) Spectre MALDI-MS d’une fraction HPLC radioactive contenant le fragment tryptique autophosphorylé in vitro PI4K92h. (B) Spectre MALDI-PSD d’un fragment issu du phosphopeptide. A. Sickmann et Al, Identification of post-translationally modified proteins in proteome studies, Electrophoresis 2001, 22, 1669-1676.

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Figure 8 : Analyse en électrophorèse 2-D PAGE du plasma dans l’intervalle de pH 4,5-5,5. P.B. Mills et Al, Analysis by matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry of the post-translational modifications of α1-antitrypsin isoforms separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, Proteomics 2001, 1, 778-786.

Figure 9:Exemple représentatif de l’approche protéomique pour l’étude du cancer du colon G. Chambers, L. Lawrie, P. Cash, G. I. Murray, Proteomics: a new approach to the study of disease, Journal of Pathology 2000, 192, 280-288

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Légendes Figure 1: Comparaison des profils 2-DE obtenus avec un extrait protéique de levure, deux IPG présentant des intervalles de pH différents ayant été utilisés :

(a)IPG 3-10 et (b) IPG 6-9 (18 cm) . Un total de 596 spots est détecté avec l’IPG 6-9, alors que dans la région de pH 6-9 de l’IPG 3-10, seulement 294 spots sont visualisés.

Widgruber et al., Toward higher resolution : Two dimensional electrophoresis of Saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping narrow immobilized pH gradients, Electrophoresis 2000, 21, 2610-2616. Figure 2: Les cellules et tissus sont initialement pré-fractionner selon le compartiment cellulaire ou la solubilité relative des protéines .Les échantillons sont préalablement screenés sur gel IPG à large gamme de PH pour déterminer la complexité du protéome puis , si nécessaire, analyser sur des gels plus résolutifs pour visualiser les protéines exprimées à plus bas niveau .

Cordwell et al. Electrophoresis 2000,21,1094-1103

Figure 3 : Illustration schématique d’une analyse standard du protéome par gel d’électrophorèse 2D et Spectrométrie de Masse. Les protéines sont séparées par gel 2D. Les spots d’intérêt sont excisés, digérés dans le gel avec la trypsine, et les peptides en résultant sont séparés par HPLC. Un peptide élué est ionisé par ESI, puis pénètre dans le spectromètre de masse et est fragmenté pour récupérer les informations sur la séquence (tandem MS). Le spectre du peptide ionisé sélectionné est comparé avec le spectre de masse théorique généré par ordinateur à partir de banques de séquences pour identifier la protéine. Une identification sans ambiguïté de la protéine est effectuée lorsque plusieurs peptides de la même protéine sont retrouvés. m/z : rapport masse sur charge Figure 5 : stratégie ICAT de quantification de l’expression protéique

(a): structure du réactif ICAT composé d’un tag biotine, d’un linker pouvant incorporer des isotopes stables, et d’un groupe réactif spécifique des groupements thiols(cystéines).

(b): schématisation de la stratégie ICAT ; La méthode présente l’analyse d’une seule protéine mais est applicable au lysat cellulaire total. Les protéines des deux cellules à deux stades différents sont dénaturées, réduites, et marquées sur les résidus cystéine avec l’ICAT lourd ou léger respectivement. Les préparation sont rassemblées et digérées . Les peptides portants l’ICAT sont isolés grâce au groupement biotine par chromatographie d’affinité et analysés par HPLC couplé à un spectromètre de masse (MS-MS). Le ratio de l’intensité pour une paire de peptides marqués avec l’ICAT représente l’abondance relative de ces protéines parentes dans les deux conditions de culture . De plus, le spectre de masse MS-MS permet d’identifier la séquence du peptide étudié et donc la protéine. Cette technique permet donc de quantifier et d’identifier toutes les protéines d’une préparation, et est en théorie applicable aussi bien à une partie qu’au protéome complet. Gygi, Rist Nat. Biotechnol., Vol.17, october 1999, 994-999.

Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11:396-401. Figure 6 : Partie de gel 2D comparant le profil des protéines cellulaires extraites de souches de Staphylococcus aureus résistante et sensible à un antibiotique, la méthicilline. A, B,

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protéines exprimées spécifiquement dans une des 2 souches ; C, protéines sur ou sous exprimées selon la souche ; *, protéines ayant un profil de migration différent entre les deux souches.

A. Görg , IPG-Dalt of very alkaline proteins, Methods of Molecular Biology. 1999;112 :197-209. Review. Figure 7 : (A) Spectre MALDI-MS d’une fraction HPLC radioactive contenant le fragment tryptique autophosphorylé in vitro PI4K92h. L’ion de m/z 1848,8 Da est sélectionné pour une analyse en MALDI-PSD (voir B). Les pics supplémentaires obtenus en mode réflecteur correspondent aux fragments caractéristiques contenant une phosphothréonine issu de la perte de H2PO4 et HPO3. (B) Spectre MALDI-PSD d’un fragment issu du phosphopeptide. La série d’ions b (fragmentation N-terminale) et d’ions y (fragmentation C-terminale) sont visibles et permettent d’identifier la phosphorylation de la thréonine 423. La génération des fragments caractéristiques issus de la perte de H2PO4 et HPO3 au cours de l’analyse est détecté par un décalage de –80 Da et –98 Da des ions b et y.

A. Sickmann et Al, Identification of post-translationally modified proteins in proteome studies, Electrophoresis 2001, 22, 1669-1676. Figure 8 : Analyse en électrophorèse 2-D PAGE du plasma dans l’intervalle de pH 4,5-5,5. La série d’isoformes de la protéine α1-antitrypsine sont indiquées par les lettres M1 à M8.

P.B. Mills et Al, Analysis by matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry of the post-translational modifications of α1-antitrypsin isoforms separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, Proteomics 2001, 1, 778-786.

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