La nouvelle génération de préparation et d’analyse des N ... · La nouvelle génération de...

[ SOLUTIONS POUR L’ANALYSE DES GLYCANES ]

La nouvelle génération de préparation et d’analyse des N-glycanes

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[ SOLUTIONS POUR L’ANALYSE DES GLYCANES ] [ SOLUTIONS POUR L’ANALYSE DES GLYCANES ]

ANALYSE DES GLYCANESCOMPOSITION EN

MONOSACCHARIDES

Com

plex

ité d

e la

mét

hode

Augmentation du nombre d’informations

ANALYSE DES SOUS-UNITÉS

ANALYSE DE CARTES GLYCOPEPTIDIQUES

ANALYSE DE PROTÉINES INTACTES

Alliance des techniques d’optimisation de l’analyse des glycanesWaters propose des approches complètes et fondées sur la gestion des protocoles permettant d’analyser les glycoprotéines à tous les niveaux de leur structure.

¡ Profil des glycoprotéines ¡ Caractérisation et contrôle des glycanes

¡ Analyse des sous-unités ¡ Composition en monosaccharides

¡ Analyse de cartes glycopeptidiques

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Et si... l’analyse des N-glycanes se révélait non

seulement plus simple, mais aussi hautement sensible ?

Enfin un protocole intelligent sans compromis.

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Méthode d’analyse de protéines intactes

INJECTION SUR UN SYSTEME LC

Cartouche d’élimination des sels MassPREP™, ou colonne ACQUITY UPLC® BEH C4, 300 Å, mélange d’étalons de protéines MassPREP,

et kit d’analyse de masse intacte

ANALYSE PAR LCAVEC DÉTECTEUR TUVSystèmes ACQUITY UPLC

CONFIRMATION DE LA MASSE GRÂCE AU QTof MS

Xevo® G2-XS QTof MSSYNAPT® G2-Si HDMS

GLYCOPROTÉINE

Étalon de contrôle des mAb en

masse intacte

Méthode d’analyse des sous-unités

Méthode d’analyse des cartes glycopeptidiques

Méthode d’analyse de la composition en monosaccharides


Colonne ACQUITY UPLC Protein BEH C4, 300 Å


Phase inverse ou colonne BEH Amide de Waters

MARQUAGE AU MOYEN D’UN FLUOROPHORE

ANALYSE PAR LCAVEC DÉTECTEUR TUV

Systèmes Alliance® HPLC ouACQUITY UPLC

ANALYSE PAR LC AVEC DÉTECTEUR TUVSystèmes ACQUITY UPLC


Colonne ACQUITY UPLC BEH C18,

130 Å, 1,7 μm, 2,1 x 100 mm

DIGESTION ENZYMATIQUE IdeS AVEC RÉDUCTION FACULTATIVE

RÉDUCTION, ALKYLATION, ET DIGESTION ENZYMATIQUE

Fragments peptidiques glycosylés et non glycosylés

LIBÉRATION DE MONOSACCHARIDES

Hydrolyse acide

GLYCOPROTÉINE

GLYCOPROTÉINE

GLYCOPROTÉINE


masse intacte


masse intacte

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5


TRAITEMENT DES DONNÉESLogiciels UNIFI® et

MassLynx®

masa147700 148000 148300 148600 148900 149200

F0G/F0

G

F1G/F0

G

F2G/F0

G ,F1G/F1

G

F2G/F1

G

F2G/F2

G

Espectro ESI-TOF MS deconvolucionado

m/z2000 2500 3000 3500

+51

+48+54

Espectro ESI-TOF MS de un mAb

CONFIRMATION DE LA MASSE GRÂCE AU QTof MS

Xevo G2-XS QTof MS SYNAPT G2-Si HDMS

ANALYSE DE CARTES PEPTIDIQUES GRÂCE

AU QTof MSXevo G2-XS QTof

SYNAPT G2-Si HDMS

ANALYSE PAR LCGRÂCE AU DÉTECTEUR FLR

Systèmes Alliance HPLC ouACQUITY UPLC

TRAITEMENT DES DONNÉESLogiciel MassLynx

TRAITEMENT DES DONNÉESLogiciels MassLynx et

UNIFI

TRAITEMENT DES DONNÉESLogiciel Empower® 3

0,00

0,06

0,12

0,18

0,24

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 min

A21

4

Fc/2 + glicanos

LC Fd’

50

45

40

35

30

25

20

EU

15

10

5

0

10 15 20 25 30 min-5

1

2

3 4 5

6

1. N-acetilglucosamina (GlcNAc)2. N-acetilgalactosamina (GalNAc)3. Galactosa (Gal)4. Manosa (Man)5. Glucosa (Glc)6. Fucosa (Fuc)

A

B

5 10 510 20 25 30 35 40 45 min

Glycopeptides

MS (BPI)

grossi 6 fois

grossi 4 fois

UV, à 280 nm

Résultats

Résultats

Résultats

Résultats

Contrôle des N-glycanes marqués par

RapiFluor-MS, au moyen d’un système

ACQUITY UPLC H-Class Bio, couplé aux

détecteurs FLR et ACQUITY QDa, pour la

confirmation des structures connues et

l’obtention de données de masse relatives

aux pics non identifiés.

0

240

480

min10 15 20 25 30

Inte

nsité

0

1,6x106

3,2x106

min10 15 20 25 30

EU

MS

FLR


CONTRÔLE RÉGULIER

Explorez les possibilités

En raison de l’amélioration de l’efficacité d’ionisation du réactif RapiFluor MS et de son affinité élevée envers

les protons, la détection des glycanes à l’aide du détecteur de masse ACQUITY QDa est enfin possible.

¡ Une sensibilité inégalée pour la détection par spectrométrie de masse et par fluorescence.

¡ Une confiance totale grâce à la confirmation de la masse des pics détectés par fluorescence.

¡ Une diminution des temps d’analyse par chromatographie avec le profil MS des glycanes ciblés, pour un développement rapide des procédés de fabrication.

¡ Une intégration facile dans la méthode UPLC existante et conforme aux Bonnes Pratiques de Fabrication, grâce au logiciel Empower 3.

Contrôle des glycanes au moyen du système ACQUITY UPLC H-Class Bio, avec détecteurs FLR et ACQUITY QDa

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6


Kit GlycoWorks RapiFluor-MS pour l’analyse des N-glycanes.

Waters, société la plus innovante en matière d’analyse biothérapeutique, a repensé le protocole permettant l’analyse

des N-glycanes. Notre nouveau réactif, RapiFluor-MS,™ possède les capacités d’ionisation nécessaires à l’obtention de

données générées par spectrométrie de masse. Cette nouvelle méthode accélère la libération des monosaccharides et

facilite leur marquage.

Il s’agit d’un protocole intelligent que tous les laboratoires biopharmaceutiques attendaient : vous n’avez plus à choisir

entre un outil de marquage « rapide » et la sensibilité de la spectrométrie de masse. Vous pouvez désormais oublier

ces procédés compliqués et contraignants qui comportent souvent des risques d’erreur.

Waters ne fait aucun compromis entre la rapidité et la sensibilité pour la préparation des échantillons, et garantit

simplement la fiabilité de vos résultats analytiques.

QUANTIFICATION FLRPERFORMANCES MSRAPIDITÉ/VITESSE D'ANALYSE

Quittez les sentiers battus aux côtés de l’équipe Waters et découvrez les nouveautés dédiées à

l’analyse des glycanes

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TRAITEMENT DES DONNÉES

Logiciels UNIFI, MassLynx, et Empower

GLYCOPROTÉINE

N-GLYCANES

ANALYSE PAR LCAVEC DÉTECTEUR

FLR

Systèmes Alliance HPLC ou ACQUITY UPLC

CARACTÉRISATION OU CONFIRMATION DE LA

MASSE

Détecteur ACQUITY® QDa® Xevo G2-XS QTof MSSYNAPT G2-Si HDMS

0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

MS

FLR

Résultats

N-GLYCANES OBTENUS PAR

DÉGLYCOSYLATION

GlycoWorks™ Rapid PNGase F, tampon, et

tensioactif RapiGest™ SF

GLYCANES MARQUÉS

Marquage avec GlycoWorks

RapiFluor-MS

GLYCANES PURIFIÉS

Plaque µElution ou cartouches GlycoWorks HILIC


Colonne BEH Amide, étalon Glycan Performance et étalon

Dextran Calibration Ladder

GLYCOPROTÉINE

Étalon de contrôle des mAb en masse

intacte

Comment fonctionne-t-il ?

Riche en informations, l’analyse des N-glycanes requiert des

procédures de préparation d’échantillons compliquées. Une fois les

glycanes libérés par l’enzyme PNGase F, un marquage est nécessaire

afin d’effectuer une séparation et une détection efficaces. Grâce au

nouveau protocole de Waters, vous bénéficiez désormais d’une méthode

polyvalente pour :

¡ L’identification des glycanes ¡ La structure des glycanes

¡ Le contrôle des glycanes

Découvrez la science sur laquelle repose notre NOUVEAU réactif GlycoWorks RapiFluor-MS, offrant de nouvelles perspectives pour l’analyse, le contrôle et la caractérisation des glycanes. Regardez notre vidéo sur waters.com/SeeTheScience


N-GLYCANES

GlycoWorks Rapid PNGase F, tampon, et tensioactif

RapiGest SF

GLYCANES MARQUÉS

Marquage avec GlycoWorks RapiFluor-MS

GLYCOPROTÉINE

Étalon de contrôle des mAb en masse intacte

GLYCANES PURIFIÉS

Plaque µElution ou cartouches GlycoWorks

HILIC

Et si la préparation des échantillons de N-glycanes se révélait facile et rapide ?

¡ Préparez rapidement et simplement des échantillons de N-glycanes marqués.

¡ Minimisez le risque d’erreur et de perte d’échantillon.

¡ Formez facilement les analystes et communiquez les méthodes au sein de votre laboratoire.

3 ÉTAPES – 30 MINUTES

< 15 minutes

10 minutes

5 minutes

ÉTAPE 1 ÉTAPE 2 ÉTAPE 3

Regardez la vidéo de démonstration de 2 minutes sur le kit RapiFluor-MS pour l’analyse des N-glycanes.

www.waters.com/RapiFluorMS

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Que pensez-vous d’une meilleure sensibilité obtenue par fluorescence et par spectrométrie de masse ?

¡ Améliorez la compréhension de vos échantillons grâce à la caractérisation complète des pics jusqu’alors non identifiés au moyen d’une quantification par fluorescence et par spectrométrie de masse.

¡ Accélérez le processus décisionnel.

¡ Identifiez plus aisément les N-glycanes de faible abondance.

SENSIBILITÉ INÉGALÉE

Signal de fluorescence 14 fois supérieur et signal MS 160 fois supérieur par rapport aux techniques de marquage classique (2-AB et procaïnamide). Signal de fluorescence 2 fois supérieur et signal MS 1000 fois supérieur par rapport aux techniques de marquage immédiat.

*Sur la base de valeurs théoriques publiées.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Res

pues

ta re

lativ

a (%

)

52,5

7,00,1 0,6

30,0*

7,0*

Fluorescencia MS (intensidad del pico base)

2X

1000X

3X

160X14X

Marcaje instantáneo con AB

Marcaje con RapiFluor-MS

Marcaje con 2-AB

Marcaje con procainamida

NH

O

NH

NNH

O

N

Glicano

NH

O

NHGlycan

O

NH2

NHGlycan

NH2O

NHGlicano

O

NHN

Proc

aina

mida*

RapiFluor

-MS

2-AB

AB in

stan

táne

a

RapiFluor

-MS

2-AB

AB in

stan

táne

a

Proc

aina

mida*

Découvrez les possibilités prometteuses que vous pouvez offrir à vos analyses quotidiennes.

www.waters.com/XevoG2XS

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0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

MS

FLR

L’efficacité de l’ionisation, améliorée par RapiFluor-MS, permet une analyse quantitative par fluorescence couplée à une détection de masse via le détecteur ACQUITY QDa.

Et si les analyses de routine des glycanes disposaient continuellement d’un accès facile aux données de masse ?

¡ Renforcez votre confiance dans le contrôle des glycanes grâce à une détection de masse régulière.

¡ Obtenez des informations relatives aux modifications des procédés de fabrication grâce à une vitesse de traitement accrue.

¡ Surmontez rapidement vos défis en matière de développement et de transfert de méthodes.

CONFIANCE

Détail du profil des N-glycanes d’un mAb

Regardez une vidéo d’une minute et découvrez comment offrir à votre laboratoire la détection de masse.

www.waters.com/QDa

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Kits complets pour la préparation des échantillons

Description Réf.

Kit de démarrage GlycoWorks RapiFluor-MS pour l’analyse des N-glycanes

Contenu du kit : produits de déglycosylation GlycoWorks, produits de marquage GlycoWorks, produits de lavage GlycoWorks, produits de collecte des échantillons GlycoWorks, colonne ACQUITY UPLC BEH Amide pour les glycanes, 1,7 μm, 2,1 x 150, sel de la phase mobile : formiate d'ammonium

176003635

Kit GlycoWorks RapiFluor-MS pour l’analyse des N-glycanes

Contenu du kit : produits de déglycosylation GlycoWorks, produits de marquage GlycoWorks, produits de lavage GlycoWorks, produits de collecte des échantillons GlycoWorks

176003606

Informations commerciales

Étalons et accessoires

Description Qté Réf.

Étalon Dextran Calibration Ladder RapiFluor-MS 50 μg par flacon 186007982

Étalon de Glycan Performance RapiFluor-MS 400 pmol par flacon 186007983

Solution de formiate d’ammonium pour l’analyse des glycanes — 186007081

Cales pour système “manifold” sous vide — 186007986

Espaceur pour “manifold” à pression positive pour le kit GlycoWorks RapiFluor-MS

— 186007987

176003635 176003606

Découvrez comment marquer vos glycanes lors d’un séminaire

Vous souhaitez en savoir plus sur l’analyse des N-Glycanes à l’aide du kit RapiFluor-MS et du détecteur de masse ACQUITY QDa ? Laissez-nous vous présenter ces techniques innovantes lors d’un séminaire. Pour de plus amples informations, rendez-vous sur waters.com/GlycansForLunch

Séminaire technique

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5,5 10,0 15,0 20,0 25,0 min

Glicano obtenido a partir de 10 µg de proteína

2-AB convencional

Preparación de muestra: 1,5 días

RapiFluor-MSGlicano obtenido a partir de 0,1 μg de proteína

Preparación de muestra: <1 hora

1: TOF MS ES+BPI

6.93e6

1: TOF MS ES+BPI

6.93e6

z/m 0061008

FA2G2Ga11130,9423, 2+

Fucosa

GlcNAc

Manosas

Galactosa

O NH

ON

O

NHN

N

O

O

RápidoFluorescencia

MS

Grupo de marcaje rápidode carbamato de NHS Fluoróforo de quinolinil

Marcaje de cargade amina terciaria

La nouvelle génération de techniques de marquage des glycanes

Fondé sur l’expertise de Waters en matière de marquage

rapide par fluorescence des acides aminés, le réactif

RapiFluor-MS possède des propriétés chimiques

perfectionnées pour une analyse plus minutieuse des

glycanes. En seulement 5 minutes, le réactif RapiFluor-MS

modifie les glycosylamines issues de la digestion

enzymatique.

¡ Marquage rapide

¡ Fluorescence efficace

¡ Signal de spectrométrie de masse unique


Identifiez facilement et en toute confiance les glycanes à de plus faibles concentrations

Atteignez des niveaux exceptionnels de sensibilité pour l’identification structurale MS

et MS/MS grâce à l’association du réactif RapiFluor-MS et des spectromètres de masse

les plus performants Xevo G2-XS QTof ou SYNAPT G2-Si HDMS.

Caractérisation des glycanes par UPLC® FLR avec le spectromètre Xevo G2-XS QTof

Comparaison du chromatogramme LC/MS des N-glycanes marqués par 2-AB et des N-glycanes marqués par RapiFluor-MS provenant du même mAb. L’échantillon marqué par RapiFluor-MS a présenté une réponse MS en mode ESI+ 100 fois supérieure. L’encadré représente le spectre MS total pour un glycane de faible abondance dans l’échantillon.

CARACTÉRISATION

Réactif RapiFluor-MS

GlycoWorks RapiFluor-MS

Waters, « T he Science of What’s Possible », ACQUITY UPLC, UPLC, Alliance, ACQUITY, QDa, UNIFI, SYNAPT, Empower, Xevo, MassPREP, et MassLynx sont des marques déposées de Waters Corporation. RapiFluor-MS, GlycoWorks, et RapiGest sont des marques de Waters Corporation.

©2015 Waters Corporation. Imprimé aux États-Unis d’Amérique.Février 2015 720005271FR KP-SIG

www.waters.com/glycans

Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757 U.S.A. T: 508 478 2000 F: 508 872 1990 www.waters.com

BUREAUX DE VENTE :

Autriche +43 1 877 18 07

Australie +61 2 9933 1777

Belgique et Luxembourg +32 2 726 1000

Brésil +55 11 4134 3788

Canada +1 800 252 4752

Chine +86 21 6156 2666

République tchèque +420 2 617 11384

Danemark +45 46 59 8080

Finlande +358 9 5659 6288

France +33 1 30 48 72 00

Allemagne +49 6196 400 600

Hong Kong +852 2964 1800

Hongrie +36 1 350 5086

Inde +91 080 49292200 03

Irlande +353 1 448 1500

Israël +9723 3731391

Italie +39 02 265 0983

Japon +81 3 3471 7191

Corée +82 2 6300 9200

Mexique +52 55 52 00 1860

Pays-Bas +31 76 508 7200

Norvège +47 6 384 6050

Pologne +48 22 101 5900

Portugal +351 21 893 61 77

Porto Rico +1 787 747 8445

Russie/CEI +7 495 727 4490/336 7000

Singapour +65 6593 7100

Espagne +34 93 600 9300

Suède +46 8 555 115 00

Suisse +41 56 676 7000

Taïwan +886 2 2508 5500

UAE 971 4 214 62 38

Royaume-Uni +44 208 238 6100

États-Unis +1 800 252 4752

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