La cristallographie en biologie structurale

R. Fourme

Univ. Paris-Sud et SOLEIL

roger.fourme@synchrotron-soleil.fr tel. 0608258675

1

Cristallisation

Réservoir de solution avec proportion accrue de précipitant

Goutte de solution saturée de protéine

Méthode de cristallisation dite de la goutte pendante

Des cristaux aux propriétés très remarquables

Des cristaux biphasiques mi-solides, mi-liquides (de 30 à 80% de liquide). L’arrangement du cristal est du à l’empilement des molécules, les parties vides étant comblées par la solution.

Assez rigides pour présenter un ordre à très grande distance. La perfection de l’arrangement est attestée par la grande finesse des profils de diffraction, qui peut parfois atteindre quelques millièmes de degré.

Assez plastiques pour supporter des réarrangements importants (déshydratation, amélioration de la qualité cristalline par recuit thermique, compression > 10% sous haute pression….)

Peuvent être trempés à basse température (éventuellement en ajoutant de l’antigel à la solution ) mais ne supportent pas un refroidissement lent au-dessous de 0° (la glace doit rester amorphe, et non cristalliser).

Montage d’un cristal dans une mini-boucle de nylon. Cet échantillon est trempé dans de l’azote liquide puis conservé dans un jet de gaz froid pendant l’enregistrement des

données pour diminuer les dommages secondaires sous irradiation X.

Les cristaux biologiques supportent bien une compression hydrostatique. La cristallographie sous haute pression (HPMX) est une méthode mature. Les enregistrements sont effectués sur les lignes de lumière CRISTAL (SOLEIL), ID27 et ID09 (ESRF).

Coupe d‘une cellule haute-pression à diamants de grande ouverture, avec génération de force pneumatique. Dimensions du cylindre : 59 mm x 30 mm

1

3

Fragment de diamant utilisé pour combattre l’orientation préférentielle du cristal par rapport aux culots des diamants

Cristal frais de la protéine urate oxydasecomprimé dans la cellule à diamants. Diamètre de la cavité dans le joint 350 m

Cristal de la protéine lysozyme après irradiations successives et translations.

La gamme utile de pression est limitée par la pression de dénaturation de la macromolécule, 0,1-2 GPa (1000 à 20000 atmosphères).

La diffraction X

cristal

RX

diffraction = T.F.

= T.F.-1

Le calcul par TF-1 de la densité électronique en chaque point (x,y,z) donne une « image » du cristal.

équivalence

x

z

y

I ~ F2

hkl hkl

(x,y,z) = F e-2i(hx+ky+lz)hklh k l

1V

Coefficients = facteurs de structure = nombres complexes.

(modules |F| connus à partir des intensités, mais les phases restent inconnues)

C'est le problème des phases !

|F| Ihkl hkl|F|

i

r

2

reconstruction

Fhkl = fi e2i(hxi+kyi+lzi)1

nn atomes en {xi, yi, zi} :

La densité est calculable si la position des atomes est connue (donc si … le problème est résolu)

|F|

Facteur de diffusion du ième atome

Tous les atomes interviennent pour établir la densité électronique en chaque point de l'espace et vice-versa.

Technique globale

F = facteur de structure (nb. complexe) = contribution des atomes à la diffraction

3

Un facteur de structure Fhkl estla somme des contributions de

tous les atomes

Variation du facteur de diffusion atomique f de quelques atomes avec l’angle de Bragg (unité: nombre d’électrons).f est la TF de la densité électronique de l’atome à symétrie sphérique. Pour un angle de Bragg nul, f = Z.

f diminue rapidement aux grands angles, car l’extension du diffuseur (cortège électronique) n’est pas négligeable devant la longueur d’onde du rayonnement comme dans le cas des neutrons. Cette diminution est encore plus rapide si la densité est étalée par du désordre statique ou dynamique.

Atome "ponctuel" ( à 0 K), B =0

f = fo e-Bsin 2

B = facteur d'agitation thermique (unité : Å2) (ou facteur de Debye-Waller)

fo = facteur de diffusion

Atome très peu agité (B~5Å2)

Atome peu agité (B~10Å2)

Atome assez agité (B>15Å2)

1

0

Équivalence entre angle de Bragg et résolution pour = 1 Å.

d (Å)

10 20 30

basse moyenne haute (rare pour les macromolécules)

f ~ I ~ Z2 U diffracte 8500fois plus que H

2,8 Å 1 Å1,5 Å5,7 Å

17

facteur d'atténuation dû à l’agitation thermique (et au désordre).

Paires de Friedel et réflexions équivalentes par symétrie

Pour la diffusion « normale »,

les deux membres d’une paire de Friedel ont la même intensité

I(hkl) = I(-h –k -l),

les intensités des réflexions équivalentes par symétrie sont également identiques.Ex: pour une maille orthorhombique

I(hkl) = I(-h k l) = I(h –k l) = I(h k –l) = I(-h -k l)…

r

iAh,k,l

Bh,k,l

B-h,-k,-l

h,k,l

h,k,l = --h,-k,-l

|Fh,k,l| = |F-h,-k,-l|

11

Fh,k,l

F-h,-k,-l

Notion de résolution

Relation de Bragg:

2d sin =

Les réflexions de Bragg aux « grands angles »(de Bragg), donc associées à des distances interréticulaires d petites, véhiculent l’information à haute résolution.

Ces réflexions sont de faible intensité compte tenu du déclin des facteurs de diffusion aux grands angles, aggravé par de gros (10-60 Å2) facteurs de Debye-Waller.

En cristallographie des macromolécules, la valeur moyenne des intensités est faible (la diffusion se partage entre un très grand nombre de réflexions) et le désordre statique et dynamique est important. L’art du cristallographe est d’améliorer le signal sur bruit: détecteur sans bruit propre, taches de Braggpetites (faisceau X parallèle et monochromatique, bon cristal), combattre la dégradation du cristal. Le RS est essentiel.

On appelle résolution utile du diagramme de diffraction la valeur minimale dmin de d pour laquelle le signal de diffraction est supérieur au bruit. dmin correspond sensiblement à la distance minimale pour laquelle deux points de la structure sont vus séparément. La résolution «atomique» (rare) est obtenue pour dmin < 1,3 Å. La meilleure résolution jamais atteinte est autourde 0,5 Å.

Application et visualisation des densités électroniques

(x,y,z) = |F | e-2i(hx+ky+lz)+hkl

hkl h k l

1V

x

y

z=n z=n+1 etc...En 2D :

24

Structure de la pénicilline (sel de K+)

Dorothy Hodgkin-Crawfoot, 1949

x

yz

N

S

CH3

CH3

O

HNR

O

COO- K+

En 3D :

25

Autre présentation en 3D ("TURBO", "O"…)

26

(x,y,z) = |F| e -2i(hx+ky+lz) +hkl

hklh k l

1V

FONCTION de PATTERSON

Modules connus à partir des intensités

Phase inconnue

Ihkl |F|hkl

2 Ihkl = Fhkl F*hkl

Ihkl = fi e2i(hxi+kyi+lzi) fj e-2i(hxj+kyj+lzj)i=1

i=n

j=1

j=n

Ihkl = fi fje2i[ h(xi -xj ) + k(yi -yj) +l(zi - zj) ]i j

Vecteur différence entre les deux atomes i et j

facteurs de diffusion de la paire i-j

• Le facteur de structure F est la somme des contributions des positions atomiques•L'intensité I (ou F2) est la somme des contributions des différences des positions atomiques (vecteurs différences) pondérées par le produit des facteurs de diffusion de la paire i-j.

Fourier :

20

Noté : {|F|,}

Autres propriétés :•Analogue à une densité mais les pics correspondent à des vecteurs-différences entre atomes. (n atomes n(n+1) pics Intensité des pics ~ Z2. Beaucoup plus compliquée !

FONCTION de PATTERSON

Si (x,y,z), calculée avec F, dépend de la position des atomes, la même fonction, calculée avec F2 dépendra des différences entre atomes. On l'appelle P(u,v,w)

Si (x,y,z) dépend d'une origine qui doit être connue( vecteurs 0 -> atomes), P(u,v,w) ne dépend plus quedes vecteurs-différence {u,v,w}, donc pas de l'origine.

Ce Fourier (noté {|F|2,0} ) est appelé Patterson

P(u,v,w) = |F|2 e-2i(hu+kv+lw)

hklh k l

1V

P(u,v,w) calculable en tout point à partir de l’expérience.

P(u,v,w) a la même périodicité que (x,y,z)

•Élargissement des pics recouvrements importants.

•Pic à l'origine = somme des distances entre atomes identiques (coord. zéro).

•Symétrie du Patterson = celle du groupe de Laue (P2/m pour monoclinique, etc..). Donc centro-symétrique.

•Symétrie initiale : les différences entre positions symétriques entraîneront des positions spéciales : sections de Harker.

21

Autres types de Patterson's

Patterson différence

Patterson anomal

Patterson ponctualisé

P(u,v,w) = coef 2 e-2i(hu+kv+lw)

hklh k l

1V

Coef2 =(|Fo|-|Fc|)2

Coef2 =F2point

Fpoint = facteur de structure ponctualisé

Fpoint=Fréel.

Pour les protéines : Coef2 =(|Fderivé|-|Fnative|)2

<Z>F0 e- Bsin2/2

Suppression du pic à l'origine si coef2= (F2point

-fi2 )

Coef2 = F±2

28

Des détecteurs à localisation de surfacehaut de gamme

Détecteur MARResearch à plaque photosensible («imaging plate»). Diamètre utile 345 mm. La lecture est faite par mesure de la luminescence excitée par laser, avec un balayage en spirale assurant un temps de mesure constant par point.(principe: le faisceau laser se déplace radialement à vitesse constante; la vitesse angulaire de la plaque varie continûment avec = k/r. La plaque tourne donc de plus en plus vite à mesure que le faisceau laser se rapproche du centre). Temps de lecture: environ 60 sec (pour le diamètre maximal et des pixels de 140 m). Pixels de 100 m possibles.

Détecteur ADSC avec matrice de 9 grands CCD. Surface active : carré de 315 mm de côté.Conversion photons X-visible par phosphore.Chaque CCD est couplé à l’écran par fibres optiques assurant une démagnification de l’image. Temps de lecture de l’ordre de la seconde.Utilisé sur la ligne de lumière PROXIMA I de SOLEIL

Détecteur MARResearch à conversion directe photons X-électrons dans une couche mince de sélénium. Dimensions 420 x 320mm. Les charges sont détectées sur une surface pixelisée. Temps de lecture de l’ordre de la seconde. Efficacité de détection correcte dans un domaine de longueurs d’onde étendu, notamment à courte longueur d’onde.

Pilatus 6M de DECTRIS. Compteur de photons X à pixels hybrides.

Number of modules 5 x 12 = 60Sensor Reverse-biased silicon diode arraySensor thickness 320 µmPixel size 172 x 172 µm2

Format 2463 x 2527 = 6,224,001 pixelsArea 431 x 448 mm2Intermodule gap x: 7 pixels, y: 17 pixels, 8.4% of total areaDynamic range 20 bits (1:1,048,576)Count rate per pixel > 2 x 106 photons/sEnergy range 3 – 30 keVCalculated DQE 3 keV: 80%; 8 keV: 99%; 15 keV: 55%Energy resolution 500 eVAdjust. threshold range 2 – 20 keVThreshold dispersion 50 eVReadout time 3.6 msFraming rate 12 HzPoint-spread function 1 pixelData formats Raw data, TIF, EDF, CBFExternal trigger/gate 5V TTL, 3 different modesSoftware interface Through socket connection; clients for EPICS, SPEC and

stand-alone operation are availableCooling Close-circuit cooling unit for temperature stabilizationPower consumption 350 WDimensions (WHD) Approx. 600 x 600 x 550 mmWeight Approx. 95 kg

Caractéristiques du Pilatus 6M

Image obtenue avec le détecteur à CCD. La gradation des couleurs (+ chaud = + intense) image la gradation des intensités.

De l’intensité Ihkl au module du facteur de structure Fhkl

- Dépendance angulaire2

I

Io

- Polarisation

- Correction de Lorentz

|F| = c IL p

Facteurd’échelle Facteur de

Lorentz

Polarisation

Intensité

Polarisation P

IoI

1+cos22p =2

34

35

Correction de Lorentz L

Les réflexions ne traversent pas toutes la sphère d’Ewald à la même vitesse

Sens de rotation •

• • • •

• • • • •

• • • • •

• • • • •

• • • • •

I1

I ~ aire S

Géométrie de rotation : correction L ~ 1/sin pour que S1 = S2

Pour deux « équivalentes » :

S1 >> S2

I2

Moyenne :n

(Si n équivalentes pour Ihkl)Ihkl =

<Ii>hklI = 1

I = n

Une sphère d’Ewald non-idéale a une certaine « épaisseur  »

directetangente

S1

S2

36

Facteur d’échelle c

Comparaison de jeux de données Fhkl de :

Cristaux différents

Enregistrements à différentes

Iabs= fi2

Pour une maille qui contient n atomes, l’intensité totale théorique (absolue) est :

I = 1

I = n

(f = facteur de diffusion de l’atome)

Iabs= fio e-2B(sin )/I = 1

I = n 22

Approximation : B ~ le même pour tous2

I = 1

I = n

Iabs= e-2B(sin )/ . fio

22 2

I réel = c I absI = 1

I = n

Iréel= c e-2B(sin )/ fio

22 2

I = 1

I = n

Iréel

2

2 2

fio

= c e-2B(sin )/ ln ( ) = ln c -2B(sin )/

I = 1

I = n

Iréel

2 fio

2 2

= équation d’une droite (droite de Wilson)

37

Droite de Wilson

Facteur d’échelle c

o o

o

o o

o o

o o

o o o o

o o

Pente = -2B

ln c

(sin )/2 2

ln (

)

I =

1

I =

nI réel

2

f io

Iréel : moyennes des Ihkl par tranche de résolution

c = facteur d’échelle globalB = facteur d’agitation thermique global

Importance des phases dans le calcul de la densité

Analogie en lumière visible (conte du canard et du chat)

Réalisation d’une expérience de diffraction optique :

masque

Laser fentes

écranInterférences

Masque = « cristal fictif »

« molécule »« cristal »

4

Importance des phases dans le calcul de la densité

FT

FT-1

..Un canard basse résolution

FT-1

FT

FT-1

Un canard...

Sa transformée de Fourier..

Un chat ..

Sa transformée de Fourier..

5

100

50

0

Échelled’intensités

Variantes autour des données de diffraction

Si on « coupe » en résolution :On voit un canard flou (mal résolu)

Si on n’utilise que la haute résolution : on voit seulement les bords du canard

FT-1

Kevin Cowtan's book of Fourier :http://www.ysbl.york.ac.uk/~cowtan/fourier/fourier.html

FT-1

Amplitudes

Phases

Phases

Les termes les plus important dans la transformée de Fourier sont les phases (inconnues) et non les

amplitudes (connues) !

Importance des phases dans le calcul de la densité

calculer un canardchat ou un chatcanard ?

Cartes composites

??

??

6

Si on omet une région (secteur) des données,la reconstruction perpendiculaire sera déformée :

Si on supprime des petites (10 %) zones aléatoirement distribuées :on retrouve une image « correcte » mais avec du bruit

Résolution de la structure cristalline :

Approches expérimentales

De la diffraction à la carte de densité électronique

Données de diffraction Carte de densité électronique

Résolution de la structure : détermination de la phase

Remplacement moléculaire

Structure 3D connue maille

Il faut placer au mieux la modèle dans la maille. La connaissance d’un fragment de la structure peut suffire à amorcer le phasage.

Programme AMORE de J. Navaza

Principe du phasage de novo

Chaque facteur de structure Fhkl est une somme d’ondes planes. En traduction vectorielle, c’est un nombre complexe somme de nombres complexes.

On détermine successivement la phase de chacun des Fhkl. On travaille donc réflexion par réflexion.

Supposons que la structure totale puisse se décomposer en deux sous-ensembles:

- La structure principale, complexe et inconnue, constituée d’atomes de Z petits (C, N, O, H…) ou moyens (S)- Une structure relativement simple (dite structure de référence) constituée d’atomes qui diffusent d’une manière remarquable :

- soit des atomes lourds (à Z élevé)- soit des atomes lourds ou mi-lourds en situation de diffusion anomale

La contribution de la diffusion de la structure de référence à chaque Fhkl est calculable (module et phase) car la position de tous ses atomes est connue (la structure a été «résolue» au préalable).Cette onde peut donc être utilisée comme onde de référence.

L’expérience ne permet de mesurer que les amplitudes des ondes. Il faut donc transformer l’information sur les amplitudes en information sur les phases.

Il faut en général faire trois mesures d’intensités pour déterminer une phase sans ambiguïté. On fait en effet une triangulation.

Problèmes à résoudre dans l’ordre:- Fabriquer la structure de référence- Déterminer les coordonnées de ses atomes-Déterminer la phase de la structure complexe en s’appuyant sur la (ou les) structure(s) de référence.

Interférence constructive

Comment résoudre en principe les phases de novo

Hg

protéine

Interférence constructive

L'onde de référence vient d'un ou plusieurs atomes diffusant de manière remarquable (atome lourd ou diffuseur anomal) placés à des positions connues dans le cristal.

Ainsi, une information (inconnue) de phase a été transférée en amplitude (donc mesurable)

Principe : utiliser comme pivot une structure de référence qui émet un contribution calculable à chaque facteur de structure

I

I

39

Interférence destructive

Diffusion anomale à différentes longueurs d’onde

Remplacement isomorphe

dérivée native

λ1 λ2

Méthode MIR

La méthode MIR pure et dure exige trois mesures de l’intensité du facteur de structure Fhkl

Une mesure venant du cristal natifUne mesure venant d’un cristal dérivé IUne mesure venant d’un cristal dérivé II

Avec deux mesures seulement, il y a 2 solutions pour la phase de la structure principaleL’ambiguïté est levée par la 3ème mesure

AvantagesA ouvert la cristallographie des protéines (Max Perutz, Hb)Forts signaux, applicable à de très grosses structures.

Difficultés: Fabriquer plusieurs dérivésLes mesures ne sont pas effectuées sur le même cristal Perte de temps et cause d’erreurs. Et surtout, les structures dérivées doivent être strictement identiques à la structure native (aux atomes lourds près). Ceci n’est que rarement réalisé Phases imprécises. La structure principale et les sous-structures ne sont pas complètement séparables (c’est à dire Fh1, Fh2… tirés des mesures sont approximatifs) ne structure de référence qui émet un contribution calculable à chaque facteur de structure

La référence des phases

condition d'isomorphisme :

(Xh,Yh,Zh) Phases h

Fph

Fp

Fh

Fph = Fp + Fh

L'atome lourd ne doit pasperturber le réseau cristallin

• |Fh| connu (approximativment) à partir de la variation Iph- Ip

Fh(hkl) = fh e 2i(hXh + kYh + l Zh)

h

41

Atome lourd :

Pt, Hg, U, Sm, Yb, Pb, Au,… sous forme de sel

fabrication de dérivés d’atomes lourds

Protéine + liqueur-mère+ sel d’atome lourd

Par trempage de cristaux natifs Par co-cristallisation

Remplacement isomorphe

Acétate d'uranyle UO22+ 92

Fluoro-uranate de potassium UO2F53- 92

Sodium hexachloroplatinate Pt(Cl)62- 78

Chlorure de mercure Hg2+ 80

Triméthyl acétate de plomb Pb(CH3) 3+ 82

Chlorure de plomb Pb2+ 82

Xénon Xe 54

M. Schiltz et al. (1994) J. Appl. Cryst. 27, 950

crystalQuartz capillary

Xenon input1- 60 bar

First structure solved using xenon binding under pressure

2 Xe sites with 100% occupancy

LURE W32 beamline

W. Bourguet, M. Ruff, P. Chambon, H. Gronemeyer & D. Moras (1995), Nature 375, 377

Ligand binding domain of the human nuclear receptor RXR

Pour une sous-structure simple, calculer la Patterson-différence {||Fph|-|Fp||2,0} pour localiser les atomes lourds

Site principal

Site secondaire

42

|Fp||Fph|

F

ho

o'

A

A'

Un seul dérivé =

2 phases valident la relation:

Fph = Fp + Fh

|Fph|1 = module du dérivé 1 |Fp| = module de la native

Pour chaque hkl :

Plan complexe

réel

imaginaire

Comment déterminer les phases de la protéine ?= construction de Harker

Fh = facteur de structure d'un atome lourd-1

1

Deux dérivés

Une seule phase !

A” Fh

Fh = facteur de structure d'un atome lourd-2

|Fph|2 = module du dérivé 2

|Fph|2

o”

44

p

Autres "densités » utiles pour améliorer la structure.

Fo - Fc

2Fo - Fc

Visualisation des densités résiduelles- Recherche des atomes d’hydrogène- Mise en évidence des défauts

Valable si calc réel

« Omit" maps

(x,y,z)= ||Fcalc|-|Fobs|| e-2i(hx+ky+lz)+calchkl

hkl h k l

1V

avec phases : calchkl

On "enlève" la contribution d'une partie douteuse de la

molécule dans le calcul des Fcalc. Une carte (Fo-Fc) ne

montrera que la partie soustraite, sans biais du modèle initial.

27

- Pour amélioration des détails

Choix d ’une origine commune(Fouriers croisés {Fi, j} )

Organigramme / Étapes :

(h, k, l, F)p (h, k, l, F)h1 (h, k, l, F)h2

Mise à l’échelle

Patterson différence {F2, }

Localisation atome(s) lourds principaux

Fourier-différence {F, h}

Pics résiduels ?

{|Fh|, h}

Oui, (sites secondaires) inclusion dans la sous-structure (x,y,z,B,Occup)

Affinement xi, yi,zi, Bi, occupi

non

...

Sous-structure d ’atomes lourds déterminée, donc Fh

i

SCALA

FFT

MOSFLM, DENZOSCALEIT, TRUNCATE...

VECSUM,RSPS,PEAKMAX

MLPHARE, FHLE

FFT

SHARP, MLPHARE

(Détection des sites minoritaires)

53

FFT

(suite..) Organigramme / Étapes :

Sous-structure d’atomes lourds

Calcul des Fh

Construction de HarkerDétermination des phases probables

Modification de densité(aplatissement de solvant ..)

Calcul de Fourier (carte de densité)

départ

best Fourier inverse, calcul des Fbest

Fourier final, construction du modèle

FFT

SHARP, PHASE,MLPHARE, ….

DM, SOLOMON

FFT, O,TURBO-FRODO

54

|F|obs

Amélioration des phases : Modification de densité

Une "bonne" carte de densité doit avoir une région de solvant « plate »

Rarement le cas car les phases exp sont imprécises

On impose donc une densité = 0 dans la région du solvant

Méthode : 1) On calcule un masque M(x,y,z) pour lequel :

Densité = 0 dans la zone solvantDensité = 1 dans la zone protéine

2) On modifie la densité expérimentale selon :

corr(x,y,z) = initiale(x, y, z) x M(x, y, z)

3) On inverse (FT-1) pour obtenir les Fcorr(hkl)

4) On recalcule une carte avec |F|obs et corr

55

Amélioration des phases : Modification de densité

En principe : meilleure carte, mais attention à bien définir la "frontière" protéine/solvant

Résultat :

Tiré de : http://www.ccp4.ac.uk/talks

56

Carte initiale :

Méthodes de phasage de novo utilisant la diffusion anomale

Dépendance de f selon

f (et ) ~ 3

... mais la décroissance régulière de f et subit des variations brutales au passage

d’un seuil d’absorption

(c

m-1

)

18

Pouvoir de diffusion et d’absorption d’un atome

• Si est proche d’une transition électronique, le facteur de diffusion f de l’atome concerné est modifié et devient un nombre complexe, ce qui traduit des changements de l’amplitude et de la phase de l’onde diffusée. Ces changements sont dépendants de …

f f = f° + f’ + if”

partie constante(indép. de )

corrections réelle et imaginaire

Ex: variation de f’ et f ’’ pour Se au voisinage de son seuil d’absorption K

58

Conséquence sur les facteurs de structure :

La loi de Friedel ... ..n'est plus exacte :

Fhkl

Fhkl

hkl

sans diffuseuranomal :

avec diffuseuranomal :

hkl

hkl

f ’

f ”

|F| = |F|hkl hklhkl hkl

|F| ≠ |F|hkl hkl

≠hkl hkl

∆f±hkl=|F()|hkl - |F()|hkl

fhkl= différences anomaleF+ F-

61

f ”

protéine

at. lourdtotal

f ” (+/2)f ’

Fa

Fa

Une sous-structure constituée de diffuseurs anomaux permet donc d’obtenir l’équivalent de dérivés lourds. Mais tout se passe à l‘intérieur du même cristal.La structure ne change pas, c’est l’onde diffusée qui est modulée par changement de la longueur d’onde. L’isomorphisme est parfait et un cristal est suffisant (s’il résiste au rayonnement X).

Mesurer l’amplitude de Fhkl à 3 longueurs d’onde permet la détermination non ambiguë de la phase pour la structure principale. En fait, deux mesures suffisent à cause de la violation de la loi de Friedel (paire de Fridel) et de la séparation des réflexions équivalentes en deux classes (paires de Bijvoët).

Dans la méthode MAD, on sépare sans approximation la sous-structure de la structure principale. En effet on obtient une liste des coefficients Fh qui permet de résoudre la sous-structure par méthode directe de phasage. Cette sous-structure peut posséder jusqu’à une bonne centaine d’atomes, la complexité d’une « petite » molécule.

T pour Total

bleu = dépendant A pour Anomal

noir = indépendant

|GT(±h,)|2 = |FT (h)|2 + a() |FA(h)| 2

+ b() |FT (h)| |FA(h)| cos (T-A)

± c() |FT(h)| |FA(h)| sin (T-A)

Le problème des phase a une solution analytique !

Conclusion :

• Les termes dépendant & indépendant de la long. d’onde peuvent être séparés (Karle, Hendrickson):

sous forme d'une fonction : GT() = FT(h) + DA()

|GT(±h,)|2 = p1+ a()p2 + b()p3 + c()p4

( h : vecteur hkl )

62

|GT(±h,)|2 = p1+ a() p2+ b() p3 + c() p4

avec :

p1 = |FT (h)|2

p2 = |FA (h)|2

p3 = |FT (h)| |FA (h)| cos (T-A)

p4 = |FT (h)| |FA (h)| sin (T-A)

inconnus

(Contrainte additionnelle : p1 p2 = p32 + p4

2 )

Et aussi :

a() =

b() = 2

c() = 2

f°2

f’2()+ f”2()

f°

f°

f’()

f”()

déterminés à 3 long. d'ondedifférentes

Ceci est un jeu de 4 équations linéaires à 4 inconnues avec une contrainte. p1…p4 peuvent être

calculés, puis |FT| , |FA| et finalement .

63

f' etf" connus

Atomes possédant un signal anomal utilisableDomaine pratique des longueurs d'onde en diffraction X

(Å)

trop d’absorptiondiffractionfaible

0.5 1.8

• seuils K (5e-)

• seuils LIII (10 -32 e-)

SrFe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr Rb

(0,7699 Å)(1,7433 Å) (1,2837 Å) (0,9795 Å)

Lanthanides

Sm ... Lu(1.8460)..(1.3412)

U

(0.7223)

Sm Tb Ho Pt Hg

(1.0722) (1.0093)

60

MoK CuK0.707 1.5418

• seuils M (80 -100 e-)limité à: U (= 2,2-3,4 Å)

En résumé

MIR MADTrois enregistrements à longueur d’onde fixe 3 cristaux différents

Deux ou trois enregistrements à des longueurs d’onde différentesUn seul cristal incluant un diffuseur anomal

- les atomes lourdsdoivent être …“lourds”Ex : Pt, Hg, U

- metallo-enzymes (Fe, Mn, Cu, Zn..)- protéines modifiées Se-Met, Se-Cys

sources de RX: labos ou RS

source de RX: accordable (RS) et très stable.

64

Autres méthodes de phasage (mixtes)

SIR = Single Isomorphous Replacement

SIRAS = SIR + Anomalous Scattering

SAD = Single Anomalous Diffraction

Etc..

1 seul dérivé lourd (+ native). On accepte l'ambiguité de phase en prenant la valeur centroïde --> erreur importante

1 dérivé lourd (+ signal anomal) + native. L'ambiguité de phase est levée par le terme anomal.

1 cristal avec diffuseur anomal à 2 long. d'ondes ( = native +dérivé anomal).

65

Construction du modèle moléculaire

Densité électronique à résolution non-atomique

Pré-requis : - On part en général d'une chaîne poly-Ala construite sur un tracé-repère calculé automatiquement (Ex: option "bones" de O)

- Si résolution ≥ 1,7 Å : séquence nécessaire

- Utilisation de "contraintes" chimiques et structurales de la chaîne peptidique.

Modèle moléculaire

67

Étapes d'une "reconstruction"

Carte de densité initiale ( |F|obs, calc)

"Squelettonisation" de la densité

-Modèle poly-alanine (chaîne des C)-choix de la direction de chaîne

Construction des chaînes latéralesà partir de motifs-repères (Cys, Tyr, Trp..)

+ de résidus construits ? Oui Non

Affinement de lastructure

Nouvelledensité

68

Affinement des structures obtenues

But : Obtenir une structure aussi précise que possible, compatible avec les données de diffraction (résolution…)

Critère : Minimisation d'un facteur d'accord observé/calculé

-Au sens de Hamilton : R =

-Au sens des moindres-carrés : R =

inconvénient : seuls les |F|obs sont expérimentaux (pas les phases)

||F|calc-|F|obs|

|Fobs|

||F|calc-|F|obs|2

|Fobs|2

… Sur l'ensemble des réflexions

Méthode : affinement des différences (observées/calculées)Par moindres-carrés sur :

- coordonnées- facteur de température- ...

72

D = wr(Foi-Fci)2

F = p1x1 + p2x2 + ….. + pnxn

La structure est décrite comme une fonction linéaire d'une série de n inconnues xi

On possède m points de mesure (les modules |Fo|)

m équations à n inconnues (m > n)

Poids (de l'observation)

observécalculé

Les valeurs exactes des paramètres pi sont ceux qui minimisent la quantité :

On fait varier les paramètres de façon à ce que

i=1

i=m

wr(Foi-Fci)2i=1

i=m∂Fci

∂pj=0 j = 1, 2, …, n

Calcul des dérivées trop long, on approxime (série de Taylor)

73

La dégradation des cristaux par irradiation X: Origine

Le dommage par irradiation est un problème majeur car il limite la résolution de l’imagerie du matériau biologique.

Le dommage initial est dominé par l’absorption photoélectrique: un photon X est absorbé avec éjection d’un électron d’une couche profonde. La lacune ainsi provoquée est comblée par un électron d’une couche externe. Pour les atomes concernés (principalement C, N, O, S, P) l’énergie de cette transition est transmise primairement à un autre électron externe, qui est éjecté comme un électron Auger. Ces électrons produisent des des cascades d’électrons secondaires. Ces divers processus sont courts, à l’échelle de quelques femtosecondes (fs).

La perte d’électrons et la formation de radicaux dans la protéine et l’eau produisent, avec une échelle de temps comparativement beaucoup plus longue, des changements électroniques et chimiques dans l’échantillon.

Dommages par irradiation: les moyens d’y rémédier

Les principaux procédés permettant de combattre ces effets sont les suivants:

Refroidir les échantillons à très basse température(<100K), ce qui ralentit la propagation des radicaux produits. Dans le cas de cristaux, il faut empêcher la formation de glace en procédant à une trempe et/ou en ajoutant un antigel. Utiliser des photons X de haute énergie: 25-40 keV au lieu du canonique 12 keV). C’est un nouveau paradigme, mais qui nécessite un détecteur ayant une bonne efficacité à ces énergies. L’utilisation de composés chimiques piégeant les radicaux est généralement peu efficace.

Une approche nouvelle consiste à utiliser un rayonnement constitué de pulses courts et extrêmement intenses produits par des lasers X à électrons libres (X-FEL) (par exemple le LCLS à Stanford, TESLA en construction à Hambourg). Dans ce cas, des diagrammes de diffraction avec une résolution limitée par la diffraction peuvent être enregistrés avant destruction de l’échantillon. Cette méthode ouvre aussi la perspective de résoudre la structure de nanocristaux ou même de matériaux non cristallisés. Dans ces deux cas, l’intensité diffractée est faible à cause de la réduction ou de la suppression de l’effet amplificateur d’un grand nombre d’unités répétées. L’énorme intensité du pulse compense plus ou moins cette perte d’intensité. Le problème des phases peut en principe être résolu par des méthodes de sur-échantillonnage avec des algorithmes itératifs. Ce domaine de recherches est en plein essor.

hémoglobine

Octanucléotide GGTATACC (modèle de la forme A de l’ADN). Structures précises (résolution 1,6 Å ) à P ambiante et 1.4 GPa(paire stéréo).

Cette molécule est très compressible axialement et pratiquement pas transversalement. C’est un ressort moléculaire. La géométrie des paires Watson-Crick, qui portent l’information génétique, est quasi-invariante avec la pression. Importance possible de ces propriétés pour la sélection de molécules prébiotiques si conditions environnementales extrêmes.

Protéase de VIH avec un inhibiteur lié au site actif

Ribosome