Katia DUQUESNE Maitre de Conférences - AMU Groupe BioCat Equipe BioSciences Institut des Sciences...

Biocatalyse entre

Biotechnologie Blancheet

Chimie Verte

Katia DUQUESNEMaitre de Conférences - AMU

Groupe BioCat Equipe BioSciences

Institut des Sciences Moléculaires de Marseille – iSm2 [email protected]

PlanA - Biocatalyse

I – Definitions des BiotechnologiesII - BiocatalyseurIII - InterêtIV - Réactions catalysées par les enzymesV - Historique

1ère vague2ème vague3ème vague

B – Apport des Biotechnologies I - Recherche de nouvelles enzymesII - Amélioration des enzymes

1) Evolution dirigée2) Conception rationnelle3) Approches semi-rationnelles4) Les cribles

III – Les nouveaux biocatalyseurs1) Hôte de choix2) Autres hôtes3) Construction de nouvelles souches

C – Biocatalyse et Chimie verteDeveloppement durableChimie verte12 principes appliqués

A - Biocatalyse

Biotechnologie : intégration des sciences naturelles et des sciences de l'ingénieur en vue de l'utilisation d'organismes, de cellules, de certains de leurs éléments et de leurs analogues moléculaires pour obtenir des produits et des services. »

Fédération européenne de Biotechnologie (EFB)

I - Définitions

Biotechnologies

Or, etc…

« Application de la biotechnologie pour la production industrielle de produits chimiques et de bioénergie, qui utilise des cellules vivantes ou leurs enzymes »

Biotechnologies blanches ou industrielles

emploi de systèmes biologiques (bactéries, enzymes, levures)

pour la fabrication, transformation, ou dégradation de molécules

grâce à des procédés enzymatiques ou fermentaires

à visée industrielle.

Elles sont utilisées comme alternative aux procédés chimiques

classiques dans un soucis économique et environnemental.

Biotechnologies blanches ou industrielles

Bioénergies : des carburants

Agromatériaux : polymères, construction (isolation, remblai, couleurs et colles), papier (fibres, couleurs, additifs), textile

Biomolécules : dissolvants, détergents, laques, colles et produits d'entretien, produits phytosanitaires, environnement (traitement des déchets)

Ingrédients et actifs : médecine, industrie pharmaceutique et cosmétique, industrie agroalimentaire (acides aminées, vitamines, arômes, colorants) et parfums.

Biotechnologies blanches et applications

Fermen-tation

Biologie de synthèse

Biocatalyse

BioconversionBiotransformation

Produits du métabolisme de microorganismes mis en culture

Biosynthèse

Ingénierie de composants et de systèmes biologiques n’existant pas dans la nature et la réingénierie d’éléments biologiques existants OCDE

Transformation d’un composé ajouté au milieu en un composé d’intérêt

Biologie Synthétique

Biotechnologies blanches

Une réaction catalysée est une réaction chimique transformant une molécule A en molécule B, en une ou plusieurs étapes, à l’aide d’un catalyseur chimique.

Molécule A Molécule B

Catalyseur ou réactif chimique


Catalyseur ou réactif chimique

Une réaction biocatalysée est une réaction chimique transformant une molécule A en molécule B, en une ou plusieurs étapes, à l’aide d’un biocatalyseur, c’est-à-dire une enzyme ou une cellule.

Enzyme(s) ou cellules

• Molécule de synthèse• Produit naturel• Molécule biosourcée

• Synthon• Molécule d’intérêt• Produit naturel ou « bio »

La biocatalyse est à l’interface de la Biotechnologie et de la Chimie

Chimie VerteBiotechnologie

Bio

cata

lyse

II – Qu’est-ce qu’un biocatalyseur ?


Biocatalyseur

Enzymes • Enzyme libre• Poudre acétonique• Enzyme immobilisée

Cellules entières (whole cells) • Microorganismes, • Algues, • Plantes,• Animaux (microsomes de foie)

• Cellule au repos (resting cells)• Cellules proliférantes• Cellules immobilisées• Spores

1) Accélération des réactions

• ne figurent pas dans le bilan de la réaction • ne modifient pas les constantes d’équilibre• accélèrent la vitesse de réaction par abaissement de la

barrière d ’énergie entre substrat et produit

Les enzymes sont des catalyseurs

III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?

Energie (sans catalyse)

Les enzymes diminuent l'énergie

d'activation par stabilisation de l'état

de transition

1) Accélération des réactions

• ne figurent pas dans le bilan de la réaction • ne modifient pas les constantes d’équilibre• accélèrent la vitesse de réaction par abaissement de la

barrière d ’énergie entre substrat et produit

Les enzymes sont des catalyseurs


Efficacité très élevée par rapport aux catalyseurs chimiques - chimie: 0,1 à 1 %- enzyme : 10-4 à 10-3 %

facteur d’accélération = 108 à 1010 voire 1012 à 1017

2) Extraordinaire sélectivité des enzymes


lipases hydrolysent les esters et pas les amides (amidases)

RCO2R = RCOORRCO2H

RCONH2

lipases

amidases

Chimiosélectivité

Capacité à distinguer entre des fonctions chimiques différentes

Ex: hydrolyse



Régiosélectivité

Capacité à distinguer des fonctions chimiques identiques selon leur position sur la molécule

Ex: hydroxylation des stéroïdes



• Enantiosélectivité Stéréospécificité

Achiral : superposable

Chiral : miroir, non superposable



• Enantiosélectivité Stéréospécificité

Achiral : superposableChiral : miroir



• Enantiosélectivité

Composé

Stéréospécificité2 énantiomères présentent des activités physico-chimiques identiques mais peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.

(S)

(Z)

(R)

(Z)

(R)-limonène(S)-limonène

(R)

O

(R)-carvone (S)

O

(S)-carvone



Stéréospécificité • Diastéréosélectivité

2 diastéréoisomères présentent des activités physico-chimiques différentes et peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.

C4O4H4

X



Stéréospécificité • Diastéréosélectivité

deux diastéréoisomères présentent des activités physico-chimiques différentes et peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.

Vitamine CAcide L-ascorbique (vitamine C) (1a)

Acide D-ascorbique (1b)

Acide L-isoascorbique (2a)

Acide D-isoascorbique (2b)



prochiralracémique

Composé énantiopurComposé

Stéréospécificité • Enantiosélectivité• Diastéréosélectivité•…/… ~100%

3) Extraordinaire « promiscuité » de substrats


Vrai surtout pour les enzymes de dégradation (≠ biosynthèse)

• Promiscuité de substrats Enzyme promiscuitaire(« promiscuous »)

• Promiscuité catalytique ou de réactions



Biocatalyseur

1) Accélération de réactions

2) Sélectivité (chimio, régio, stéréo, énantio)

3) Promiscuité de substrats

4) Capacité à catalyser de nombreuses réactions

IV- Réactions enzymatiques les plus fréquentes (Biocatalyse)

Hydrolyses ……………. hydrolyse d’esters, amides, nitriles, époxydesOxydations ……………. oxydation d’hétéroatomes (S, N, etc…)

hydroxylations (d’atome de C non activé)époxydationsréaction de Baeyer Villigerdéshydrogénations

Réductions ……………. de fonctions simples : C=O , C=Cdéshydroxylationshydrogénation de C=C

Condensations ………… acylationestérificationéthérificationglycosidation

Isomérisations ………… réarrangementsracémisation

Formation de liaisons … C-C, C-N , etc…Dégradations …………… décarboxylations

Avantages et inconvénients des biocatalyseurs A – Avantages1 –Très efficaces :

- Vitesse de réaction élevée / réactions chimiques correspondantes.- Concentration en catalyseur très faible. [biocatalyseur] << [catalyseur chimique].

2 – EcologiqueFacilement dégradés dans la nature à la différence de métaux lourds (Co, Mn...) utilisés

pour la catalyse chimique.

3 – Fonctionnent dans des conditions douces- eau- pH : 5 à 8- Température : 20-40°C

Permet de minimiser les réactions secondaires comme les dégradations, isomérisations, réarrangement, racémisation etc...

4 – Compatibles entre euxPermet de réaliser des processus séquentiels. Déplacement d’équilibre, non isolement

d’un intermédiaire instable.

5 – Spécificité de substrat assez largeCapable de fonctionner sur des familles de substrats.

6 - Grand choix de réactions possiblesPratiquement toutes les réactions de la chimie organique.En plus Hydroxylation des ACNA

7 – ChimiosélectivitéNe réagissent qu’avec un type de fonction :

8 - Régio et diastéréosélectivité (diastéréotoposélectivité)

9 – Stéréo et Enantiosélectivité (énantiotoposélectivité)

Estérase

Lipase

O

COOR

O

COOH

HO

OH

COOR

Epoxyde

hydrolase

COOR

COOR

COOR

COOHEstérase

enz

enz

produits opt. actifsrésolution

racémique

chiral opt. actifprochiral

B – Inconvénients

1- Choix du biocatalyseurReste très empirique (screening ...)

2- N’existent que sous une forme énantiomérique Constitués de L-aa. Impossible à ce jour de créer une enzyme image dans un miroir (D-aa)

impossible d’inverser l’induction chirale en prenant l’autre énantiomère du biocatalyseur Solution = screening ou une modification de biocatalyseurs.

3- Recyclage de cofacteur pour les enzymes non hydrolytiques

4- Conditions expérimentales assez strictesTempérature et pH

5- Activité maximum dans l’eauProblème : majorité des produits organiques sont peu solubles dans l’eau [substrat] faible. Parfois possibilité de travailler dans des solvants organiques (ex : lipases)

6 - Problème d’inhibition Par le substrat (solution : addition en continu, système biphasique, résine ...) Par le produit (difficile à résoudre : extraction en continu, système biphasique, résine …)

1) Acheter

2) Faire sa propre production (microorganismes recombinants)

Sigma Aldrich, Amano, DSM, etc…. Lipases mais aussi laccases, oxygénases, réductases…/…

Achat de gène de synthèse

Lipases bon marchéPrix plus élevé des autres enzymes

Pas de limite Généralement bon marché (si équipement adéquat)

Ingénierie métabolique

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris

Comment accéder aux enzymes ?


1900 1970 2000- 4000

V- Historique

5000 ans avant JC : Production de vinaigre à partir d’éthanol

CH3CH2OH O2 CH3COOH H2O+ +Acetobacter

acetiEthanol

Acideacétique

Implication d’un microorganisme suspecté par Christiaan Persoon en 1822, confirmé par Pasteur en 1862

Les prémisses


1ère vague

1900 1970 2000- 4000

V- Historique

Biocatalyse : 1ière vague

1ère vague (1900-1970)

1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)Clostridium acetobutylicum

amidonChaim Weizmannchimiste et 1er président d’Israel

Clostridium acetobutylicum

(anaérobie)3 x Acetone,6 x Butanol1 x Ethanol

considérée comme la première fermentation industrielle

supplantée après la 2nde guerre mondiale par des procédés basés sur le pétrole

(la dernière usine a été fermée en Afrique du Sud en 1983)


1ère vague (1900-1970)

1934 : Synthèse de la vitamine C

1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)

Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose


CH2OH

OH

H

OH

OH

CH2OH

H

HO

H

H

D-Sorbitol

Acetobacter

suboxydans

CH2OH

OH

H

OH

O

CH2OH

H

HO

H

L-Sorbose

300 g/L

O O

HO OH

CH2OHHO

H

H

acide ascorbique(vitamine C)

1ière étape de la synthèse de la vitamine C Tadeus Reichstein

Procédé Hoffmann-La Roche


1ère vague (1900-1970)


1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)


Hydroxylation régio- et stéreosélective de la progestérone





800 t/an

Hydroxylation régio- et stéreosélective impossible en 1 étape par voie chimique

1ière d’une série de biotransformations permettant l’accès à de nbreux corticoïdes

diosgénine, saponine extraite de l’igname

a permis de diviser le prix de la cortisone par un facteur 400…mais a fait monter celui de la diosgénine par un facteur 2000!

(Merck, 31 étapes, 615 kg acide désoxycholique => 1 kg de cortisone - 200$/g)

6 étapeschimiques

1ers procédés industriels…..mais victoire au finish de la pétrochimie

1ère vague (1900-1970)



1974 : Isomérisation du glucose en fructose


Utilisation massive dans les sodas, USA après la guerre



Hydroxylation régio- et stéreosélective de la progestérone


1ère vague

2ème vague

1900 1970 2000- 4000

stéroides

acrylamide

V- Historique

XXI°, siècle de la Biotechnologie blanche ?

Synthèse industrielle de l’acrylamideProcédé Nitto (Mitsubishi Rayon)

50 000 t /an

hydratation de l’acrylonitrile

H2C

NH2

O

H2C CH

C N

acrylonitrile acrylamide

Nitrile hydratase

Rhodococcus rhodochrous

• évite l'utilisation d'un catalyseur au Cuivre

• permet une pureté plus élevée

• présente plusieurs avantages industriels : température réactionnelle inférieure, concentration plus élevée, demande en énergie production de CO2

plus faibles.

Biocatalyse : 3ème vague


1ère vague

2ème vague

3ème vague

1900 1970 2000- 4000

stéroides

acrylamide

V- Historique

Biocatalyse

Biotechnologie

Chimie verte

B - Apport des Biotechnologies

I- Recherche de nouvelles enzymes

réactions prometteuses mais productivité souvent insuffisante

Nécessité de trouver des biocatalyseurs plus efficaces

a) Examen de la littérature

Empirique:

b) Screening systématique (souches commerciales ou de labo)

• Bactéries : oxydations, dégradations oxydatives

• Levures : réductions

• Champignons : hydroxylation, hydrolyse


Méthodologie:

• Isolement• Culture• (Purification)• Tests d’activité

Astuce:prélèvements de flore riche (sols d’usine, de stations d’épuration) + Cycles de culture sur le produit à transformer comme source de carbone

(enrichissement par pression de sélection)

c) Isolement de nouvelles souches

Nautile-IFREMER

Mer morte

Halorubrum coriense

Rio Tinto (Espagne)

Chlamydo-monas

http://serc.carleton.edu/microbelife/extreme

Lac Vostok (Antartique)

Lac Mono (USA)

Anabeana : algue filamenteuse

Yellowstone

MésophilesPro et Eucaryotes

Acidophiles

Alcalinophiles

Halophiles

Thermophiles

MéthanogènesSulfatoreducteursSulfooxydantsMéthanotrophes ……

Barophiles

20°C

-5°C

3% sels

35% sels

pH 2

pH 9

pH 0

pH 11

50°C120°C

1 atmO2

1000 atm

N2, CH4, H2S, SO4-

Extrêmophiles

ArchéesPsychrophiles



d) Exploration des bases de données (bioinformatique)

• GenBank, SWISSPROT, UniProtKB, BRENDA, Expasy, KEGG, BioCyc, ….

12 millions de séquences protéiques 5% à 10% correctement annotées16 000 structures 3D d’enzymes.

Banques annotées rigoureusement : UniProtKB, CAZy

• Comparaison de séquences (BLAST)

Inconvénient: recherche de ressemblances avec l’existantQuid de la nouveauté « nouvelle » ?

% d’identité, de similarité


e) Métagénomique

Exploration automatiséedes métagénomes

Avancées des techniques / expression des gènes (exemples : expression de gènes hétérologues, "gene knockouts")

Avancées des techniques / contrôle de la synthèse de protéines

Données / génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique

Connaissances / modèles élaborés de systèmes biologiques (reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome)

développement ingénierie métabolique ("metabolic engineering") = transformer des organismes vivants pour produire ou transformer des composés organiques d'intérêt industriel ("microbial cell factories").

Les nouveaux domaines en "omique" et l'ingénierie métabolique

B – Biotechnologie: amélioration enzymes

II- Amélioration des enzymes

Objectifs:



1) Evolution dirigée

• Informations structurales sur l’enzyme• Compréhension du mécanisme réactionnel

Pas besoin de

car Mutations aléatoires

idée : Simuler l’évolution darwiniste

Biocatalyse : 3ème vague


1) Evolution dirigée

tests

Mutagénèse aléatoire

Comment engendrer la diversité?

Error prone PCR, Agents chimiques mutagènes, etc…

Mutagénèse saturanteRemplacement de tous les aa par

chacun des 19 autresOn oublie !

285 x 19 5500 enzymes

Inconvenients:Nombre important de mutants à tester(+s dizaine de milliers temps)



3) Approches semi-rationnelles tests

• Informations structurales sur l’enzyme• Compréhension du mécanisme réactionnel au niveau moléculaire (modélisation)

Nécessite

• Mutagénèse saturante de site• Mutagénèse dirigée

• Autres techniquesdestinées à diminuer le nombres de mutants à tester

ex: Mutagénèse saturante itérative

2) Conception rationnelle

Modélisation par analogie



4) Cribles

Test UV : 1/4h par analyses , plaque 96 puits => 15 hTest HPLC : 1/4h par analyses; 6000 mutants => 1500 h => 2 mois (24h/24)

Ex: 6000 mutants à tester

Importance des cribles …..importance des chimistes, des physiciens

B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs

III - Les nouveaux biocatalyseurs

Avantages / WT• Surexpression

augmentation des vitesses/rendementslimitation des réactions secondaires

• Microorganisme bien connu expression hétéroloqueoutils disponibles rapidité

• Ingénierie métaboliqueSuppression de réactions indésirablesModulation possible des flux métaboliques

1) Hôte de choix : E. coli



• Champignons (Aspergillus - insertion directe dans le génome)

• Levures (Pichia , Yarrowia)

• Bactéries (Pseudomonas, Deinococcus,…) biocarburants de 2ème génération composés biochimiques d’intérêt industriel nouveaux antibiotiques enzymes pour la remédiation des plastiques

2) Autres hôtes



3) Construction de souches sur mesure

Ingéniérie métabolique

Développement de la fluxomique

Biologie de synthèse

Biocatalyse

Biotechnologie

C - Chimie verte

« un développement qui répond aux besoins du présent sans compromettre la capacité des générations futures à répondre aux leurs »

Rapport sur l’environnement, Mme Brundtland (1er Ministre norvégien), 1987

(Sustainability)

Environnement• Préserver la diversité des

espèces , les ressources naturelles et énergétiques

Société• Satisfaire les besoins en

santé, éducation, habitat, emploi

• Prévenir l’exclusion et les inégalités

Economie• Créer des richesses• Améliorer les conditions

de vie matérielles

Viable Vivable

Équi-table

« un développement économiquement efficace, socialement équitable et écologiquement soutenable »

Sommet de la Terre , Rio (1992)

Les 3 piliers du Développement Durable

« Concevoir des produits et des procédés de synthèse permettant de réduire ou d’éliminer l’utilisation et la génération de substances dangereuses »

Concept défini en 1998 par P. Anastas et J. C. Warner (EPA – Environmental Protection Agency)

in « Green Chemistry; Theory and Practice »

Chimie verte

Green Chemistry Challenge

Récompense depuis 1996 les procédés chimiques qui incorporent les principes de la Chimie Verte aussi bien dans le domaine de la santé que de l’environnement

Paul Anastas et John Warner –(EPA) in « Green Chemistry; Theory and Practice » 1998

Les 12 principes fondateurs de la chimie verte

Principes 1 & 2 appliqués à la Biocatalyse

1. Limiter la production de déchets : il vaut mieux produire moins de déchets qu'investir dans l'assainissement des effluents ou l'élimination des déchets.

Vrai pour la biocatalyse dans la plupart des cas (si l’eau ne compte pas comme déchet)

rdt élevé, ee élévé, purification aisée,….

Très bon si on ne considère que les produits à transformer, très mauvais si on considère le système dans sa totalité (enzyme ou bactérie)

Autres: Intensité massique, productivité massique, efficacité en carbone,….

2. Maximiser l’économie d'atomes : les synthèses doivent être conçues dans le but de maximiser l'incorporation des matériaux utilisés au cours du procédé dans le produit final.


3. Concevoir des synthèses moins toxiques: les méthodes de synthèse doivent être conçues pour utiliser et créer des substances faiblement ou non toxiques pour les humains et sans conséquences sur l'environnement.

Généralement vrai surtout en comparant avec les synthèses chimiques ex réduction : pas de métaux lourds

Milieu confiné de préférence

Peut être vrai ex: certains polyesters dégradables sont impossibles à fabriquer

chimiquement

4. Concevoir des produits chimiques plus sûrs:

Principe 12 appliqué à la Biocatalyse

12. Minimiser les risques d’accidents: Les substances et la forme des substances utilisées dans un procédé chimique devraient être choisies de façon à minimiser les risques d'accidents chimiques, incluant les rejets, les explosions et les incendies.

Généralement vrai surtout en comparant avec les synthèses chimiques ex réduction : H2 sous pression évité;

oxydation: pas de peracides explosifs

Milieu confiné de préférence (risque biologique pour les travailleurs limité par l’utilisation de miroorganismes GRAS (Generally Recognized As Safe))

Ne les exclus pas toujours ex: rejet d’ammoniaque (nitrilase)

ou de cyanure (hydroxynitrile lyase)


5. Réduire les substances auxiliaires: supprimer l'utilisation de substances auxiliaires (solvants, agents de séparation, ...) ou utiliser des substances inoffensives. Des méthodes non conventionnelles d'activation peuvent être utilisées : eau, fluides supercritiques ou liquides ioniques comme solvant, chauffage par micro-ondes, etc.

Vrai Solvants = eau ou liquides ioniques ou CO2 supercritiquePeu d’auxiliaires (inutilité des auxiliaires chiraux pour la résolutions d’énantiomères)

Étapes de protection souvent inutilesGénéralement réduction du nombre d’étapes

Ex: synthèse de sucres

8. Eviter les produits dérivés: toute déviation inutile du schéma de synthèse (utilisation d'agents bloquants, protection / déprotection, modification temporaire du procédé physique/chimique) doit être réduite ou éliminée.

Principe 9 appliqué à la Biocatalyse

9. Préférer les réactions catalysées: Les réactifs catalytiques sont plus efficaces que les réactifs stœchiométriques (1 mole pour 1 mole). De plus, il faut favoriser l'utilisation de réactifs catalytiques les plus sélectifs possibles.

Turn-over des réactions souvent élevé

Enzymologie: Turnover number = kcat : nb de moles de substrat qu’une mole d’enzyme peut convertir par site catalytique par unités de tps kcat = Vmax/[E]T

Chimie : Turnover number (TON) : nb de moles de substrat qu’une mole de catalyseur peut convertir avant d’être inactivé Turnover frequency (TOF): TON par unité de tps

(se rapproche du kcat)

10−2 - 102 s−1 pour un catalyseur103 - 107 s−1 pour une enzyme


6. Réduire les dépenses énergétiques: Les besoins énergétiques des procédés chimiques ont des répercussions sur l'économie et l'environnement dont il faut tenir compte et qu'il faut minimiser. Il faut mettre au point des méthodes de synthèse dans les conditions de température et de pression ambiantes.

7. Préférer les matières premières renouvelables: Lorsque la technologie et les moyens financiers le permettent, les matières premières utilisées doivent être renouvelables plutôt que non renouvelables.

Généralement, Température et pression ambiante


10. Penser la dégradation finale: Les produits chimiques doivent être conçus de façon à pouvoir se dissocier en produits de dégradation non nocifs à la fin de leur durée d'utilisation, cela dans le but d'éviter leur persistance dans l'environnement.

Mise au point facilitée par des conditions de réaction plus douces

Enzymes ou microorganismes biodégradablesSous-produits du métabolisme naturels et biodégradables

(sucres, minéraux , acides organiques,….)

11. Analyser en temps réel: Des méthodologies analytiques doivent être élaborées afin de permettre une surveillance et un contrôle en temps réel et en cours de production avant qu'il y ait apparition de substances dangereuses.

(CH2)7COOH

-linolenic acid

13-LOX

(CH2)7COOH

H OOH

13-HPOT hydroperoxide

O

O(CH2)7COOH

CYP74

Cis-3-hexenal

12-oxo-(9Z)-dodecenoic acid

cis-3-hexenal:Arôme note verte

hydropéroxide lyase provenant de la goyave

lipoxygénase provenant de la farine de soja

Exemple d’application par enzymes purifiées

L’exemple

d’une réaction biocatalysée emblématique

Synthèse de la Sitagliptine

N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3C

nouvel anti-diabétique de type 2 Merck 2005

N

N

NN

O O

F

F

F

F3C

N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3C

N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3C

ee =97%Insuffisant pour pdt pharmaceutique ! trace de Rhodium

Recristallisation indispensableRendement

Synthèse 1ere génération:

NH4OAc

1) Rh(Josiphos) H2 sous 17 atm 2) purification

Synthèse 2eme génération : Hydrogénation asymétrique d’enamine non protégée

• 8 étapes, • bcp d’extractions aqueuses, • perte de réactifs non réutilisables

Néanmoins 3 étapesRdt de 50%Déchets de 80%

Sur durée de vie du pdt : 150 000 t de déchets évités (estimation Merck)

Intro: Synthèse de la sitagliptine

2006 Greener Synthetic Pathways Award

Merck

sitagliptine

Merck et Codexis

N

N

NN

O O

F

F

F

F3C

N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3C

ee =99,95%

Synthèse 3ème génération : Trans-amination enzymatique

transaminase

•1 étape•Productivité de 56%•Rdt de 13%•Déchets de 20%•Elimination métaux lourds•Pas d’équipement résistant à la pression Réduction du cout total de fabrication

Pro-sitagliptine

sitagliptine


2010 Greener Reaction Conditions Award

Transaminases:transforment seulement les methyl cétones

Construction d’un modèle structural par homologie

ATA-117 d’Arthrobacter sp

Transamination

Faible transamination (4% conversion)

Pas de réaction

Bleu: small binding pocket: (trifluorophenyl)Orange : large binding pocket (triazolopyrazine)

Gène stérique pour le groupe trifluorophenyl


O NH2

Grande et petite poches dans site actif

1er round: Améliorer la réactivité vis-à-vis de l’analogue de la méthyl dicétone

12 positions susceptibles d’interférer: mutagénèse saturante

S223P Amélioration 11 fois


interactions hydrophobes

Sérine en proline

Amélioration mais toujours pas d’activité sur la cible

2eme round: Agrandir la petite poche pour le groupe trifluorophenyl

À partir de S223P 4 positions susceptibles d’interférer mutagénèse saturante

+ petites librairies combinatoires V->G ou A (216 éléments)

1ere activité décelable (0,7% en 24 h) pour un variant de 4 mutations

•soit résidus de plus petite taille, •soit création de stacking aromatique


N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3C

Y26H, V65A, V69G, F122I, A284G

N

N

NN

O O

F

F

F

F3C

N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3CNH2 O+ +

Contrainte:

• Réaction équilibrée gde quantité d’isopropylamine et/ou enlèvement acétone

• Solubilité prositagliptine dans eau faible solvant + température élevée

donneur d’amine

Objectif industriel

100g/L prostagliptine1M i-PrNH2>25% DMSOT>40°CEe>99.9%

3eme round: Améliorer la réactivité du variant actif

Nouveau variant 75 fois plus actif (12 mutations)

Combinaison des mutations positives des 2 rounds


11 rounds au finalMutagenèse saturante de positions extérieures au site actifMutagenèse dirigée par comparaison avec d’autres transaminasesMutagénèse aléatoire


Crible :

Mutagenèse saturante de positions extérieures au site actifMutagenèse dirigée par comparaison avec d’autres transaminasesMutagénèse aléatoire

•100g/L prostagliptine•1M i-PrNH2•>25% DMSO•T>40°C•ee>99.9%

• 200g/L prostagliptine• 1M i-PrNH2• 50% DMSO• T=45°C• 92 % rdt• ee>99.95%

27 mutations• 1/2 dans petite et grande poche (accommodement du substrat)• 1/4 mutations ds région infaciale des monomères

(renforcement des interactions stabilisant le dimère actif)• 1/4 autres

Objectif Conditionsoptimisées


11 rounds au final

Merci pour votre attention

Katia DUQUESNE Maitre de Conférences - AMU Groupe BioCat Equipe BioSciences Institut des Sciences...

Documents

Transcript of Katia DUQUESNE Maitre de Conférences - AMU Groupe BioCat Equipe BioSciences Institut des Sciences...