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INTRODUCTION

- 2 -

La résistance aux agents antimicrobiens, qui était reconnue depuis

plus de 50 ans, continue d’être une source majeure de mortalité, et de

l’augmentation du coût de soins de santé (1).

Au Maroc comme partout dans le monde, la maîtrise de la diffusion

des bactéries multi-résistantes (BMR) est une priorité dans la lutte contre

les infections nosocomiales. Parmi les pathogènes labellisés BMR, les

deux principaux sont représentés par Staphylococcus aureus résistants à la

méticilline (SARM), et par les entérobactéries productrices de bêta-

lactamases à spectre élargi (EBLSE). Ces dernières ont été décrites pour la

première fois en 1983 (27) et ont causées depuis de nombreuses épidémies

(26).

Les bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE) confèrent aux

entérobactéries des résistances aux monobactames et oxyimino-

céphalosporines, mais pas aux céphamycines et carbapénèmes.

Les études génétiques ont montrés que les BLSE dérivaient par

mutation(s) ponctuelles(s) d’anciennes bêta-lactamases de type TEM-1,

TEM-2 et SHV-1 (40) appartenant à la classe A des bêta-lactamases selon

la classification d’AMBLER (31,33). La dénomination des bêta-lactamases

n’obéit à aucune règle précise de nomenclature. En effet, la première

enzyme dénommée TEM a été isolée d’un malade appelé

« TEMONIERA » (7). Alors que celle du type SHV correspond à une

propriété biochimique « sulphydryl variable » de cette bêta-lactamase.

Actuellement, environ plus de 150 types de BLSE ont été identifiées

partout dans le monde et chez de nombreuses espèces de la famille des

Enterobacteriaceae et Pseudomonas aeruginosa (17).

INTRODUCTION

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Le but de cette étude est de :

� Etudier l’épidémiologie des souches d’entérobactéries productrices

de BLSE .

� Comparer les méthodes de mise en évidence des BLSE .

� Formuler des recommandations pour la maîtrise de la diffusion de

ces BLSE.

ETUIDE BIBLIOGRAPHIQUE

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L’étude de la résistance des bacilles à gram négatif par production de

BLSE aux bêta-lactamines nécessite de connaître les différents groupes de

cette famille d’antibiotiques et les mécanismes de résistance à cette famille

d’antibiotiques.

I- CLASSIFICATION DES BETA-LACTAMINES :(16,42)

Au cours des années 1980, le nombre de bêta-lactamines naturelles ou

synthétiques a augmenté de façon spectaculaire.

Les composés qui appartiennent à cette famille se caractérisent par

un squelette commun : le cycle bêta-lactamine ( voir Fig.1 ). C’est à partir

de cette structure de base et de sa structure adjointe que la classification

des bêta-lactamines a été établie.


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S CH3

R CO NH CH3

Pénicilline

N

O COOH

Cycle bêta-lactame

S

R1 NH

Céphalosporine N

O CH2 R2

Figure 1 : Structure de base des pénicillines et des céphalosporines (43)


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Les pénicillines et les céphalosporines se distinguent par la structure

de leur second noyau et de leur (s) chaînes (s) latérale (s). Les bêta-

lactamines constituent la principale famille d’antibiotiques. Elles

comprennent :

I-1- PENAMES (PENICILLINES ) :

Depuis que Fleming a observé le pouvoir bactéricide du filtrat brut

d’une culture de Penicillium notatum, la molécule de pénicilline a été

purifiée et modifiée, et de nombreuses pénicillines naturelles et

synthétiques ont été isolées ou élaborées. L’utilisation d’une souche

mutante de penicillium chrysogenum dans des conditions particulières de

culture a permis d’améliorer considérablement le rendement de

fabrication et les caractéristiques des pénicillines. Les pénicillines semi-

synthétiques sont obtenues par synthèse à partir du noyau acide 6-

aminopenicillanique (A6-AP) (voir Fig.2) (41).


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Figure 2 : Développement des pénicillines semi- synthétiques

(41)


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I-2- DERIVES DE L’ACIDE PENICILLANIQUE SULFONE :

Les dérivés de l’acide pénicillanique sulfone sont des inhibiteurs de

bêta-lactamases. Ils comprennent le sulbactam et le tazobactam. Ces

inhibiteurs sont commercialisés en association avec une bêta-lactamine à

large spectre pour augmenter le spectre d’action.

Exemple : pipéracilline-tazobactam

ampicilline-sulbactam

I-3- CARBAPENEMES :

Les carbapénèmes sont représentés par l’imipénème, le méropénème

et le biapénème. Parmi ces antibiotiques, l’imipénème est actuellement le

seul produit d’usage clinique au Maroc. C’est un antibiotique à large

spectre, actif sur Pseudomonas aeruginosa et il présente une grande

stabilité vis-à-vis des BLSE. Il est commercialisé en association avec la

cilastine. Ce dernier composé empêche une inactivation prématurée de

l’imipénème par le rein.

I-4- CLAVAMES :

Parmi les clavames, l’une des premières substances isolées est

l’acide clavulanique, produite par Streptomyces clavuligerus, dont la

structure de base est le noyau clavame. L’acide clavulanique est un

puissant inhibiteur de différents types de bêta-lactamases, mais il n’a

aucun pouvoir antibactérien. On l’utilise avec les pénicillines à large


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spectre, telles l’amoxicilline et la ticarcilline, pour élargir leur spectre

d’action sur les micro-organismes producteurs de bêta-lactamases.

I-5- CEPHEMES (CEPHALOSPORINES) :

La découverte de la céphalosporine C, produite par un

champignon ; Cephalosporium acremonium, a permis aux chimistes

d’élaborer des dérivés semi-synthétiques.

I-5-1- Céphalosporines de 1ère génération :

Les céphalosporines de 1ère génération ont des activités

antibactériennes similaires et elles associent les caractéristiques des

pénicillines à large spectre (ampicilline) à celles des méticillines. Elles

sont résistantes à la pénicillinase du Staphylococcus et sensibles aux

céphalosporinases. On distingue : céfalotine, céfalexine, céfaloridine,

céfadroxil, céfazoline, céfaclor, céfacétrile, céfapirine, céfradine.

I-5-2- Céphalosporines de 2ème génération :

Les céphalosporines de 2ème génération ont une activité

antibactérienne similaire à celle des composés de la 1ère génération, elles

se distinguent cependant par une activité légèrement moindre sur les

cocci à gram positif et par un spectre élargi à certains bacilles à gram

négatif. On distingue : céfamandole, céfuroxime et céfotiam.


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I-5-3- Céphalosporines de 3ème génération :

Les Céphalosporines de 3ème génération ont une activité réduite sur

les cocci à gram positif, mais une activité supérieure sur les bacilles à

gram négatif. Elles sont résistantes aux céphalosporinases. Seule la

céftazidime exerce une activité sur Pseudomonas aeruginosa . On

distingue deux groupes :

� C3G du groupe 1 = méthoxy-iminocéphalosporines :

céfotaxime, céftrixone, céfopérazone, céftizoxime,

céfpirome et céfépime.

� C3G du groupe 2 = céftazidime.

I-5-4- Céphamycines :

Les Céphamycines sont de nouvelles céphalosporines , élaborées

par semi-synthèse à partir d’une molécule de céphamycine isolée des

produits de fermentation d’une bactérie filamenteuse du genre

streptomyces. Dans cette catégorie on distingue deux antibiotiques qui

sont la céfoxitine et le céfotétan.

I-5-5- Oxacéphèmes :

Les chimistes ont substitués un atome d’oxygène à l’atome de soufre

du cycle dihydrothiazine du noyau céphème pour produire des

céphalosporines avec un spectre d’activité élargie. On les a nommés

oxacéphèmes ou oxacéphalosporines. Le moxalactame ( aussi appelé

lamoxactam ) est le seul composé de ce groupe, il a été retiré du marché


- 12 -

en raison de son effet sur l’hémostase et des risques d’hémorragie qu’il

provoque.

I-6- MONOBACTAMES :

Le monobactam le plus connu est l’aztréonam produit par

Chromobactérium violaceum . c’est un antibiotique à spectre très étroit.

Il a une bonne stabilité vis-à-vis des bêta-lactamases et n’agit que sur les

bactéries à gram négatif.


- 13 -

Tableau I : Nomenclature des bêta-lactamines en fonction de la structure de leur noyau (43)


- 14 -

II- RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES AUX BETA- LACTAMINES :

II -1- DEFINITION DE LA RESISTANCE :

Une souche est dite « résistante» lorsque la concentration

d’antibiotique qu’elle est capable de supporter est notablement plus élevée

que la concentration atteignable in vivo (16).

II-2- MECANISMES DE RESISTANCE AUX BETA - LACTAMINES :

Les principaux mécanismes de résistances des germes aux

antibiotiques sont de trois ordres (45) :

� L’antibiotique ne peut pas atteindre sa cible, soit par imperméabilité

de la paroi (exemple : résistance à l’impénème par défaut

d’expression de la porine), soit par un mécanisme d’efflux

( pompage actif de l’antibiotique hors de la cellule bactérienne ).

� L’antibiotique ne peut se fixer sur sa cible il peut y avoir une cible

supplémentaire ou une baisse de l’affinité par modification de la

cible.

� L’antibiotique peut être inactivé avant d’atteindre sa cible : il s’agit

alors le plus souvent d’un mécanisme enzymatique avec notamment

les bêta-lactamases , et il s’agit dans ce cas d’un mécanisme de

résistance majoritaire universellement répandu à travers de très

nombreux genres bactériens.


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Tableau II : Mécanismes de résistance acquise des bactéries aux ββββ- lactamines (15)

Mécanismes Bactéries à gram Positif Bactéries à gram négatif

Production d’une β-lactamase + +++

Imperméabilité de la paroi - ++

Modification des PLP +++ +

La résistance par production de bêta-lactamases peut être naturelle ou

acquise.

II-2-1- La résistance naturelle (45) :

La résistance naturelle est un caractère propre à une espèce bactérienne

au même titre que tout caractère cultural ou biochimique elle concerne

(presque) 100% des souches de l’espèce concernée et préexiste à

l’introduction de tout antibiotique .

La résistance naturelle est chromosomique, portée par des gènes

d’expression constitutive (la résistance des K. pneumoniae à l’ampicilline)

ou inductible (Enterobacter cloacae et C3G ).

II-2-2- la résistance acquise (45) :

La résistance acquise ne concerne qu’ une fraction des souches elle

nécessite un événement génétique ( mutation ou acquisition de plasmides ) ,

et son niveau augmente à partir de l’utilisation de l’antibiotique. Ainsi


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l’antibiotique ne crée pas la résistance à l’échelle de la population

bactérienne, il ne fait que sélectionner un mécanisme de résistance.

II-2-2-1- La résistance chromosomique :

Il s’agit d’une mutation du chromosome bactérien sur un locus

contrôlant la sensibilité à un antibiotique, c’est un événement spontané c'est-

à-dire non provoqué directement par la présence de l’antibiotique, spécifique,

et indépendant n’entraînant que la résistance à un antibiotique ou à une

famille d’antibiotiques.

II-2-2-2- La résistance extra-chromosomique (plasmidique) :

Elle est liée à l’introduction dans la bactérie d’un élément génétique non

chromosomique formée de fragments d’ADN intra-cytoplasmique et appelé

« plasmide de résistance » ou « plasmide R ».

Les « plasmides R » peuvent être transmis par divers mécanismes :

� Par transduction : l’ADN du plasmide est inclus dans un

bactériophage et ensuite transmis par celui-ci après lyse bactérienne

à une autre bactérie.

� Par transformation : l’ADN libre passe d’une cellule à l’autre et va

altérer le génotype de la cellule réceptrice.

� Par conjugaison : elle s’effectue par passage des plasmides à

travers des tubules protéiques provenant de l’extension des pili

d’une bactérie vers l’autre (pili sexuel).


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� Par translocation : il se produit un échange de courtes séquences

d’ADN (transposons) entre deux plasmides, ou entre un plasmide et

une portion d’un chromosome bactérien situé à l’intérieur d’une

cellule bactérienne. Un transposon peut transmettre une résistance

unique ou multiple.

III- CLASSIFICATION DES BETA-LACTAMASES :

Plusieurs classifications des bêta-lactamases ont été proposées.


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Tableau III : Classification des ββββ-lactamases (15)

BACTERIES A GRAM POSITIF BACTERIES A GRAM NEGATIF

PLASMIDIQUES CHROMOSOMIQUES PLASMIDIQUES

Inductibles

Pénicillinases

( spécifiques)

S. aureus LARGE SPECTRE LARGE SPECTRE SPECTRE ELARGIE

S. epidermidis «Pénicillinases» «Pénicillinases» TEM-1 ➔ TEM-22

K. pneumoniae TEM-1, TEM-2, SHV-2 ➔ SHV-5

( SHV-1) OXA-1,2,3,4 chez toutes les Entérobactéries

K. oxytoca SHV-1 essentiellement K. pneumoniae

Levinea chez toutes les espèces +YOU-1 ET 2, MGH-1, MRH-1

CEPHALOSPORINASES PSE-1, 2, 3, 4

CONSTITUTIVES INDUCTIBLES DEREPRIMEES Céphamycinaese*

E. coli E. cloacae, E. aerogenes à très haut niveau ( Klebsiella + E. coli)

très bas niveau C. freundii Citrobacter CMY-1 et 2, MIR-1 ( E. coli)

Serratia Enterobacter

M. morganii Providencia

Bacteroïdes Providencia, P. aeruginosa P. aeruginosa

( Cefuroximases) P. vulgaris Serratia *non dérivés de TEM

(E.coli)

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

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III -1- CLASSIFICATION DES BETA - LACTAMASES SELON RICHMOND-SYKES : (31)

Selon Richmond-sykes, il existe cinq types :

Type I : enzymes principalement actives sur les céphalosporines,

inhibées par les isoxazoyl-pénicillines et partiellement par la carbénicilline

mais non inhibées par l’acide clavulanique et le sulbactam. Ces enzymes sont

d’origine chromosomique.

Type II : enzymes actives sur les pénicillines, inhibées par isoxazoyl-

pénicillines et l’acide clavulanique, mais pas par la carbénicilline . Ces

enzymes sont d’origine chromosomique.

Type III : enzymes actives sur les pénicillines et les céphalosporines

de 1ère génération, inhibées par les isoxazoyl-pénicillines, l’acide clavulanique

et le sulbactam ; elles présentent une faible activité sur la carbénicilline. Ces

enzymes sont d’origine plasmidique.

Type IV : enzymes actives sur les pénicillines et les céphalosporines,

résistantes à l’inhibition par les isoxazoyl-pénicillines et la carbénicilline,

inhibées par l’acide clavulanique et le sulbactam . Ces enzymes sont d’origine

chromosomique.

Type V : enzymes actives sur les pénicillines et les céphalosporines,

hydrolysent mieux les isoxazoyl-pénicillines que les céphalosporines et

inhibées par l’acide clavulanique. Ces enzymes sont d’origine plasmidique.


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Tableau IV : Classification de RICHMOND ET SYKES des ββββ- lactamases des bactéries à gram négatif (15)

Médiation Type Classe Inductibilité Activité préférentielle Péni CSP

Inhibée par

Cloxa PCMB

Principaux germes

Chr Case Ia I - +++ S R Enterobacter Citrobacter

Chr Case Ib C - + S R E. coli

Chr Case Ic I - ++ S R Proteus vulgaris

Chr Case Id I - + S R P. aeruginosa

Chr Pase II C ++ - S R Proteus mirabilis

Pl Case III C +++ + S R Médiation

plasmidique type

TEM

Chr Case IV C + + R S Klebsiella species

Pl Pase V C ++ - R S Médiation

plasmidique type

OXA, PSE


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III-2- CLASSIFICATION DES BETA - LACTAMASES SELON BUSH ET AL.: (8)

Bush a classé les bêta-lactamines en trois groupes:

Groupe1: sont des céphalosporinases à sérine, non inhibées par l’acide

clavulanique. Ces enzymes sont de classe C. Elles inactivent essentiellement

les céphalosporines I et II (l’activité des céphalosporines III et IV est variable

selon le niveau d’expression). Les carbapénèmes restent actifs.

Groupe 2 : sont des bêta-lactamases à sérine, la plupart sont inhibées par

l’acide clavulanique. Ces enzymes sont de classe A et D. Elles inactivent

essentiellement les pénicillines et les céphalosporines ( en fonction du sous-

groupe ). Les céphalosporines III et IV, les monobactames et les

carbapénèmes restent actifs.

Groupe 3 : sont des métallo-bêta-lactamases, inhibées par l’EDTA . Ces

enzymes sont de classe B. Elles inactivent des agents stables comme les

carbapénèmes.

III-3- CLASSIFICATION DES BETA - LACTAMASES SELON AMBLER ET AL. : (31,33)

Ambler a classé les enzymes en trois classes A, B et C selon leur

séquence en acide aminés :


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Les enzymes de classe A : ont une grande importance clinique. Ces

enzymes sont toutes sensibles aux inhibiteurs de bêta-lactamases. Les bêta-

lactamases de type TEM et SHV appartiennent a cette classe.

Les enzymes de classe B : sont des métallo-enzymes, heureusement peu

fréquentes car elles hydrolysent des agents stables aux bêta-lactamases

comme l’imipénème.

Les enzymes de classe C : sont des bêta-lactamases codées par un gène

chromosomique et dont l’expression peut être inductible ou constitutive , de

bas ou de haut niveau (31). Ces bêta-lactamases sont produites naturellement

chez Enterobacter spp, Serratia marcescens, Citrobacter freundii,

Morganella morganii et Pseudomonas aeruginosa (25,32). Récemment, elles

ont été identifiées comme bêta-lactamases plasmidiques chez Escherichia coli

(6,12,19), Klebsiella pneumoniae (12,19), Proteus mirabilis et Salmonella spp.

(14, 28). La présence de cette bêta-lactamase (AmpC) au niveau de plasmide

favorise la diffusion de la multirésistance entre les micro-organismes (20).

IV- BETA-LACTAMASES A SPECTRE ELARGI :

IV -1- DEFINITION -HISTORIQUE :

Les BLSE sont des enzymes à sérine qui agissent par un mécanisme

fondé sur l’attaque du groupement hydroxyle porté par une sérine au fond du

site catalytique. Ces enzymes confèrent des résistances à la plupart des bêta-

lactamines chez les bactéries à gram (-) (45).

La majorité des BLSE dérive des enzymes TEM ou SHV. Et il existe

maintenant plus de 90 bêta-lactamases de type TEM et plus de 25 bêta-

lactamases de type SHV. TEM et SHV sont le plus souvent retrouvés chez


- 23 -

Esherichia coli et Klebsiella pneumoniae , d’ailleurs la 1ère bêta-lactamase

(TEM-1) a été décrite chez E. Coli à partir d’une hémoculture d’un patient

qui s’appelait TEMONIERA en Grèce, d’où la désignation TEM, mais ceci

n’exclut pas le fait qu’on les retrouve aussi chez Proteus, Providencia et

d’autres genres de la famille des Enterobactériaceae (7).

Si les plus classiques des BLSE appartiennent aux familles TEM et

SHV il en existe aujourd’hui de nouvelles très différentes sur le plan

génétique notamment les CTX-M (45).

D’une manière générale les BLSE dérivant des enzymes TEM-1 TEM-2

et SHV-1 sont inhibés par l’acide clavulanique (à l’exception des souches IRT

inhibitor–résistant Tem) et sont incapables d’hydrolyser les céphamycines

(céfoxitine,céfotétan) et les carbapénèmes (Imipénème). En revanche elles

inactivent les oxyimino-bêta-lactamines et les céphalosporines de 4ème

génération (céfépime, céfpirome). Les souches productrices de ces BLSE sont

habituellement co-résistantes aux aminosides, tétracyclines, et

fluoroquinolones (45).

IV-2- FACTEURS LIES A L ’EMERGENCE D ’ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BLSE :

Le premier facteur qu’on peut souligner concerne l’utilisation accrue

des antibiotiques à large spectre, notamment les céphalosporines de 3ème

génération. De nombreuses études ont été effectuées ces dernières années à ce

propos, et ont montré le rôle prépondérant des antibiotiques lors de

l’émergence des entérobactéries productrices BLSE (3,7,36).


- 24 -

En effet les antibiotiques agissent à plusieurs niveaux ; ils peuvent par

exemple transformer la flore habituelle des patients, favoriser la colonisation

par des bactéries résistantes ou encore sélectionner des souches résistantes et

faciliter leur dissémination, en d’autres termes les antibiotiques exercent une

pression de sélection non négligeable (44), cette pression de sélection est

d’autant plus marquée que la durée d’antibiothérapie est longue ; ainsi une

comparaison entre un groupe de patients porteurs de souches résistantes et un

groupe de patients porteurs de souches sensibles a mis en évidence une

exposition à une antibiothérapie de plus longue durée dans le 1er groupe, de

plus une relation linéaire entre le nombre de jours de traitement avec le

céfotaxime et la probabilité de développer une résistance a été démontré, en

revanche avec la céftazidime ce risque était d’emblée maximum dès le 1er

jour du traitement (3).

Le 2ème facteur de risque rassemble d’une part le problème des

réservoirs et d’autre part le problème de la transmission.

En matière de BLSE le patient lui-même représente un réservoir très

important . Le site du portage préférentiel est constitué par le tube digestif qui

a été reconnu comme source majeure de germes producteurs de BLSE chez

les patients colonisés (17), le second réservoir est constitué par le matériel

médical utilisé au sein des hôpitaux, à savoir les sondes urinaires, cathéter, ou

autres dispositifs invasifs (1), et par le personnel soignant (17). Ces deux

réservoirs ont été mentionné aussi comme des facteurs déterminants de la

transmission des BLSE entre malades notamment par manuportage (cas du

personnel) (17).


- 25 -

Il faut aussi noter le rôle joué par les réadmissions des patients, leur

transfert entre hôpitaux, et leur circulation entre les services dans la

dissémination des entérobactéries productrices de BLSE.

V- ENTEROBACTERIES :

V-1- DEFINITION : (43)

Dans La famille des Enterobacteriaceae sont regroupés les bacilles à

gram (-) qui sont soit mobiles avec une ciliature péritriche, soit immobiles,

non sporulés ; aérobies et anaérobies facultatifs ; qui cultivent sur des milieux

ordinaires à base d’extrait de viande ; qui fermentent le glucose avec ou sans

production de gaz ; qui possèdent une nitrate-réductase ( réduction des

nitrates en nitrites) à l’exception de certaines souches d’ Erwinia et quelques

rares mutants ; leurs cultures donnent toujours une réaction négative des

oxydases. Enfin les entérobactéries possèdent une catalase à l’exception des

Shigella dysenteriae du sérotype l.

V-1-1- Habitat :

Le nom d’entérobactéries avait été donné à cette famille parce que

beaucoup des membres qui la composent sont des hôtes du tube digestif. Mais

cette localisation n’est pas exclusive chez l’homme et les animaux, on les

isole du sol et des végétaux qui sont même le gîte habituel de certaines

espèces, tels les Enterobacter agglomerans et les Erwinia.

V-1-2- Morphologie :

Ce sont des bacilles à gram négatif asporulés. Certains genres sont

composés de bactéries toujours immobiles ( Klebsiella, Shigella ), d’autres


- 26 -

sont mobiles par ciliature péritriche. La présence d’une capsule visible au

microscope est habituelle chez les Klebsiella.

V-1-3- Culture :

Les entérobactéries aérobies-anaérobies facultatives se développent

facilement sur milieux nutritifs simples.

Sur milieux gélosés, les colonies d’entérobactéries sont habituellement

lisses, brillantes, de structure homogène (type « smooth » ou S ). Cet aspect

peut évoluer après cultures successives pour donner des colonies à surface

sèche rugueuse ( type « rough » ou R ).

Les colonies des bactéries capsulées telles que les Klebsiella sont

mucoîdes, plus grandes que les colonies S avec une tendance à la confluence.

V-1-4- Structure antigénique :

Chez les entérobactéries on peut distinguer :

� Des antigènes de paroi ou antigènes O toujours présents .

� Des antigènes flagellaires ou antigènes H.

� Des antigènes de surface (capsule ou enveloppe)

V-1-5- Pouvoir pathogène:

Sur le plan de la pathologie humaine, il convient de distinguer :


- 27 -

� Les bactéries pathogènes spécifiques (BPS) que l’on ne trouve

pas à l’état commensal (en dehors des porteurs sains) et dont la

présence en milieu extérieur n’est qu’un phénomène de transit. Les

maladies qu’elles engendrent sont dues à un défaut d’hygiène et la

contamination se produit soit par contact direct, soit par

l’intermédiaire d’un vecteur (alimentaire ou animal). Citons les

Salmonella, les Shigella et les Yersinia.

� Les bactéries pathogènes opportunistes (BPO), elles peuvent

provenir de la flore digestive commensale normalement résidente.

Les infections ont donc un point de départ endogène. Toutefois,

elles se trouvent par excrétion dans la nature à l’état transitoire et si

elles n’engendrent généralement pas d’infections, elles sont

cependant le signe d’une contamination fécale voire de défaut

d’hygiène.

V-2- INFECTIONS ASSOCIEES :

Les entérobactéries représentent plus de 80% des bacilles à gram négatif

isolés aux laboratoires de microbiologie (24).

V-2-1 Escherchia coli :

E. coli est un germe très courant, trouvé en abondance dans la flore

commensale , en particulier dans le tube digestif.

E. coli cause principalement des infections du tube digestif (gastro-

entérites), et on distingue 5 pathovars :


- 28 -

� E . coli entéropathogène (diarrhées infantiles)

� E. coli entérotoxinogène (tourista)

� E. coli entéroinvasif (invasion des cellules intestinales)

� E.coli entérohémorragique (diarrhées sanglantes)

� E.coli entéroadhérant (diarrhées du voyageur).

C’est également le germe préférentiel des infections urinaires (impliqué

dans 80% des infections du tractus urinaire).

E. coli peut aussi coloniser le vagin et générer des méningites néonatales

suite au passage du nouveau-né à travers la voie génital maternelle colonisée.

V-2-2- Klebsiella pneumoniae :

K. pneumoniae est un germe commensal du tube digestif et des voies

aériennes supérieures. C’est aussi un germe opportuniste impliqué dans des

infections nosocomiales, des infections urinaires, des pneumopathies et des

septicémies.

V-2-3- Serratia marcescens :

Longtemps considérée comme un saprophyte, S. marcescens se

comporte de plus en plus souvent comme un pathogène opportuniste

responsable à l’hôpital, d’infections nosocomiales, urinaires, pulmonaires,

cutanées ou bactériémiques.


- 29 -

V-2-4- Salmonella :

Les samonelles sont des bactéries pathogènes à transmission oro-fécale

elles constituent un vaste groupe de bactéries composé de plus de 2000

sérovars, leur pouvoir pathogène est différent pour les salmonelles majeures

( que l’on ne trouve que chez l’homme) et les salmonelles mineures

( ubiquistes).

Les salmonelles majeures : S. typhi, S. partyphi, sont respectivement

responsables des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes.

Les salmonelles mineures : responsables de gastro-entérites (bactéries

entéro-pathogènes invasives). Elles sont impliquées dans 30 à 60 % des

infections alimentaires.

V-2-5- Shigella :

Les shigelles sont des bactéries strictement humaines. Elles sont

responsables de l’historique « dysenterie bacillaire » ( shigella dysenteriae).

Actuellement, elles sont la cause, chez l’adulte, de colites infectieuses et

chez l’enfant, de gastro-entérites sévères avec diarrhée mucopurulente et

sanglante, fièvre et déshydratation.

V-2-6- Enterobacter :

Les souches du genres Enterobacter sont souvent responsables

d’infections nosocomiales . E. cloacae et E. aerogenes peuvent être à

l’origine d’infections urinaires.


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V-2-7- Proteus mirabilis :

C’est un germe commensal du tube digestif de l’homme et des animaux.

En bactériologie médicale, les Proteus sont isolés de différents types

d’infections, notamment au cours d’infections urinaires, respiratoires hautes

ou de bactériémies.

- 31 -

MATERIEL ET METHODES

- 32 -

I- MATERIEL :

I-1- SOUCHES BACTERIENNES :

Les souches d’entérobactéries productrices de BLSE de notre étude, ont

été isolées de divers prélèvements qui ont été analysés dans le laboratoire de

microbiologie du CHU Ibn Rochd de Casablanca tels que les urines, pus,

hémocultures, sondes urinaires, sécrétions bronchiques…etc.

Ces prélèvements provenaient de malades hospitalisés et aussi de patients

externes.

I-2- PERIODE D’ETUDE :

Au cours de notre stage au laboratoire de microbiologie du CHU Ibn

Rochd, nous nous sommes intéressés aux souches d’entérobactéries

productrices de BLSE et leurs méthodes de détections.

Cette étude c’est étalée du 1er janvier 2005 au 31 mars 2005.


- 33 -

I-3- MATERIEL D ’ETUDE :

I-3-1- les milieux utilisés :

� milieu Muller-Hinton 2 (MH 2, Riomérieux) :

C’est un milieu prêt à emploi commercialisé par Biomérieux, France.

Généralement utilisé pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques et

sulfamides. ( composition : voir annexe).

� milieu Mac conkey :

Milieu sélectif pour les bacilles à gram négatif (BGN) par sa teneur en

cristal violet. Il est préparé au laboratoire à partir d’un milieu déshydraté.

� milieu Mac conkey + céfotaxime : (voir annexe)

� milieu Muller Hinton + cloxacilline : ( voir annexe)

� milieu Kligler Hajna :

C’est un milieu également préparé au laboratoire, milieu complexe

coloré en rouge par le rouge de phénol, et qui permet d’apprécier 3 caractères

métaboliques :

� Fermentation du lactose.

� Fermentation du glucose et production de gaz.

� La production de H2S.


- 34 -

I-3-2- Les disques d’antibiotique utilisés :

Les disques d’antibiotique sont commercialisés par « oxoid England ».

(les différents disques d’antibiotique avec leur charge figurent en annexe).

I-3-3- Matériel d’identification :

� Galerie Api 20E , Biomérieux :

C’est un système d’identification des entérobactéries utilisant 23 tests

biochimiques.

� Catalase IDR, Biomérieux .

� Oxydase sur disque, Biomérieux.

I-3-4- Exploitation des résultats :

Les résultats ont été saisis sur ordinateur, et l’analyse a été réalisée grâce

à l’utilisation du logiciels : WHONET 5.3 (logiciel de l’OMS).


- 35 -

II- METHODES :

II-1- ISOLEMENT DES ENTEROBACTERIES :

L’isolement a été réalisé par mise en culture des prélèvements sur milieu

gélosé de Mac Conkey, qui par sa teneur en cristal violet laisse pousser les

bacilles à gram négatif, et inhibe les autres bactéries.

II-2- IDENTIFICATION DES ENTEROBACTERIES :

L’identification est faite sur la base des caractères biochimiques à l’aide

des galeries Api 20 E (Biomérieux). Les micro-tubes sont inoculés avec une

suspension bactérienne ajustée à 0.5 Mac Farland.

Les réactions produites pendant l’incubation (24 h et à 37°C) se

traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’additions des

réactifs ; FeCl3 , réactif de Kovacs.

La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture, le code

obtenu permet d’avoir une identification en se référant au catalogue

analytique proposé par Biomérieux.

II-3- ANTIBIOGRAMME ET DETECTION DUCARACTERE BLSE :

Pour chaque souche, un antibiogramme, par la méthode de diffusion en

milieu gélosé (gélose Muller- Hinton2 ) a été réalisé par ensemencement de la

surfaces de la gélose par un écouvillon imbibé d’un inoculum de 0.5 Mac

Farland.

Les antibiotiques utilisés : (voir annexe) .


- 36 -

L’interprétation des souches (sensibles, intermédiaires ou résistantes) se

fait selon les diamètres critiques recommandés par NCCLS.

Mais avant d’interpréter les résultats, il faut s’assurer que le contrôle de

qualité est correcte. Un contrôle de qualité a été effectué une fois par

semaine, et il consiste à vérifier que les diamètres obtenus avec les souches de

contrôle figurent à l’intérieur des limites acceptables.

Les souches de contrôle utilisé étaient :

� Escherchia coli ATCC 25922.

� Staphylococcus aureus ATCC 25923.

� Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

La recherche du phénotype BLSE est réalisée sur l’antibiogramme selon

la technique de synergie décrite par Jarlier et al (7), en plaçant les disques de

CTX (30 µg) et de CAZ (30 µg) à une distance de 20-30 mm ( de centre à

centre) d’un disque d’amoxicilline / acide clavulanique ( 20/10 µg). Ceci

permet de mettre en évidence (après incubation de 24 h à 37°C) une

augmentation très nette du diamètre d’inhibition des disques contenant les

C3G en regard du disque contenant l’acide clavulanique / amoxicilline,

prenant ainsi la forme d’un « bouchon de champagne » pour les souches

productrices de BLSE (voir Fig.3).


- 37 -

II-4- METHODE DES DISQUES COMBINES :

Cette méthode consiste à placer sur une gélose Mueller-Hinton2

préalablement inoculée avec une suspension bactérienne ajustée à 0.5 Mac

Farland, 2 couples d’antibiotiques ; un disque de CTX en regard d’un disque

de CTX / acide clavulanique à une distance de 25 mm (centre à centre), et un

disque de CAZ en regard d’un disque de CAZ / Acide claulanique (même

distance).

Une augmentation ≥ à 5 mm du diamètre d’inhibition des disques

contenant l’acide clavulanique par rapport à ceux qui n’en contiennent pas, est

en faveur de la présence d’une BLSE (voir Fig.4).

II-5- METHODE A LA CLOXACILLINE :

La détection de la production d’une BLSE est parfois difficile compte

tenu d’une éventuelle production d’une céphalospoinase à haut niveau, C’est

pourquoi on utilise la méthode à la cloxacilline.

La cloxacilline utilisée ici comme inhibiteur de céphalosporinases, est

incorporée dans la gélose MH2 . Les disques de CAZ et de CTX sont placés à

une distance de 20 mm (de centre à centre) d’un disque contenant la

ticarcilline / acide clavulanique.

Les souches productrices de BLSE présentent une synergie entre les

disques de CTX et /ou CAZ et le disque ticarcilline / acide clavulanique

(voir Fig.5).


- 38 -

II-6- CAS PARTICULIERS DES PORTAGES DIGESTIFS :

La recherche des entérobactéries productrices de BLSE dans les selles

des malades hospitalisés a été réalisée par écouvillonnages rectaux mis en

culture sur un milieu sélectif : gélose Mac conkey contenant 1000 Gamma de

CTX. Les germes ayant poussés sur ce milieu sont considérés comme

potentiellement producteurs de BLSE. La confirmation est faite par le test de

synergie, méthode des disques combinés et la méthode à la cloxacilline.


- 39 -

Figure 3 : Test de synergie positif (aspect en bouchon de champagne)

Figure 4 : Méthode des disques combinés (test positif)


- 40 -

Figure 5 :Méthode à la cloxacilline (image de synergie positive)

- 41 -

RESULTATS

- 42 -

Au cours de la période d’étude, 104 souches d’entérobactéries

productrices de BLSE ont été isolées (chez 104 patients) ; les doublons ont été

éliminés lorsqu’il a été isolé, la même espèce BLSE, plus d’une fois chez le

même patient.

92 souches (88.46 %) proviennent de prélèvements cliniques à visées

diagnostic, alors que 12 souches (11.54 % ) ont été isolées chez les patients

pour lesquels une colonisation digestive a été suspectée (portage digestif).

I- REPARTITION DES BLSE DE PORTAGE :

Ce portage digestif de souches d’entérobactéries BLSE a touché

essentiellement 4 services hospitaliers, 2 en particulier : pédiatrie et médecine

(voir Fig.6). La répartition de ces souches montre que ce portage a été

enregistré au cours des mois de janvier et février, mais pas au cours du mois

de mars (voir tableau V).

RESULTATS

- 43 -

Tableau V : Répartition des BLSE de portage digestif :

service Nombre de

souches

% Janvier Février Mars

Pédiatrie1 6 50 5 1 -

Médecine1 3 25 1 2 -

Chirurgie 2 2 17 - 2 -

Réanimation 6 1 8 - 1 -

Total 12 100 6 6 0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

%

Service

Pédiatrie 1 Médecine 1 Chirurgie 2 Réanimation 6

Figure 6 : Répartition des BLSE de portage digestif selon les services

RESULTATS

- 44 -

II- REPARTITION DES AUTRES BLSE :

II-1- REPARTITION DES GERMES :

La répartition des micro-organismes est présentée sur la figure 7. On y

note une prédominance des Klebsiella pneumoniae (28.26 %) et des

Escherichia coli (27.17 %). On trouve néanmoins d’autres espèces

différentes à savoir : Enterobacter cloacae (15.21%), Proteus. miralibis

(6.52%), Citrobacer freundii (5.43%), Providencia stuartii (4.34 %),

Klebsiella oxytoca (3.20%), Serratia marcescens (2.17%), Citrobacter

Koseri (2.16%), Enterobacter spp. (1.08 %), M. morganii (1.08%), Pantoea

agglomerans ( 1.08%), S. liquefaciens ( 1.08), S. odorifera (1.08%).

K. pneumoniae (28,26%) E. coli (27,17%) E. cloacae (15,21%)

P. mirabilis (6,52%) C. freundii (5,43%) P. stuartii (4,34%)

K. oxytoca (3,20%) Autres (9,73%)

Figure 7 : Répartition des bactéries selon les espèces.

RESULTATS

- 45 -

II-2- REPARTITION DES BLSE PAR SPECIALITES :

Parmi nos souches, 43 ont été isolées à partir de prélèvements

provenant des services de soins intensifs, qui représentent environ 47 %,

suivis des services de chirurgie avec un pourcentage de 18 % et de pédiatrie

(16 %). (voir tableau VI et Fig.8)

Tableau VI : Répartition des BLSE par spécialités

Nombre souches % janvier Février mars

Réanimation 43 46.74 20 10 13

Chirurgie 17 18.48 3 8 6

Pédiatrie 15 16.30 5 8 2

Externe 10 10.87 5 4 1

Médecine 7 7.61 5 - 2

Total 92 100 38 30 24

Ce tableau montre aussi que 38 sur 92 souches (41.30%) ont été isolées

pendant le mois de janvier, 30 sur 92 (32.60% ) pendant le mois de février, et

24 sur 92 souches (26.08 %) pendant le mois de mars.

RESULTATS

- 46 -

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

%

S p é c ia lité s

R éan im a t io n C h iru rg ie P éd ia t r ie E x te rne M éd ec ine

Figure 8 : Répartition des BLSE par spécialités

II -3- REPARTITION DES BLSE DANS LES ERVICES DE REANIMATION :

Etant donné que presque la moitié des isolats des souches BLSE

provenait des services de réanimation (46.74%), nous nous sommes intéressés

à la répartition des isolats dans ces services. Et nous avons remarqué que

deux réanimations (réanimation1 et réanimation2) se partageaient plus de 50

% des isolats ; 30.23% pour la réanimation1 et 20.93% pour la réanimation 2.

(Voir tableau VII et Fig.9).

RESULTATS

- 47 -

Tableau VII : Répartition des BLSE dans les services de réanimation

Nombre de

souches

% janvier février mars

Réanimation 1 13 30.23 9 2 2

Réanimation 2 9 20.93 6 1 2




Réanimation 6 3 6.97 - 2 1

0

5

10

15

20

25

30

35

%

Services

Réa 1 Réa 2 Réa 3 Réa 4 Réa 5 Réa 5

Figure 9 :Répartition des BLSE dans les services de réanimation

RESULTATS

- 48 -

II-4- REPARTITION DES BLSE EN FONCTION DE LA NATURE DES PRELEVEMENTS : La répartition des prélèvements, présentée par le tableau VIII (Fig.10),

montre une prédominance des atteintes de l’appareil urinaire (46.73%),

suivies de celles de la peau ( 21.73%) et du sang (13.04%).

Tableau VIII : répartition des souches BLSE par prélèvements et par

Spécialités

Prélèvements Nombre de souches % spécialité

Réa. Méd. Ext. Péd. Chir.

Urines 43 46.73 10 3 10 10 10

Pus 20 21.73 10 3 - 1 6 Sang 12 13.04 8 1 - 3 - Bronchique 7 7.60 7 - - - - Cathéter 7 7.60 6 - - - 1 Liquide pleural 2 2.17 2 - - - - trachéal 1 1.08 - - - 1 -

RESULTATS

- 49 -

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

%

Prélèvements

Urines Pus Sang Bronchique Cathéter Liquide pleural Trachéal

Figure 10 : Répartition des souches BLSE selon les prélèvements

RESULTATS

- 50 -

III- GERMES MULTIRESISTANTS :

Le caractère commun entre ces différentes souches est leur résistance

à toutes les bêta-lactamines testées sauf à l’imépénème.

Les différences résident dans leur comportement vis-à-vis des

aminosides et fluoroquinolones. (Tableau IX, Fig.11)

Tableau IX : Pourcentages de résistance de souches BLSE aux différents antibiotiques testés

Antibiotiques % de résistance

Amikacine 21.7

Gentamycine 89.8

Netilmicine 77.8

Tobramycine 96.6

Ciprofloxacine 59

Norfloxacine 50

Pipercilline/ tazobactam 70.2

Trimethoprime/ sulfamethoxazole 74.1

RESULTATS

- 51 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

Antibiotiques

TOB CN NET TSU TZP CIP NOR AK

Figure 11 : Pourcentage de résistance de souches BLSE aux différents

antibiotiques testés

Les pourcentages de résistance vis-à-vis des aminosides s’étendent

de 21.7 % pour l’Amikacine à 96.6% pour la Tobramycine.

Concernant les fluoroquinolones, les valeurs de résistance avoisinent

les 50%, ainsi 50% des souches ont montrées une résistance vis-à-vis de la

norfloxacine, et 59% vis-à-vis de la ciprofloxacine.

RESULTATS

- 52 -

III- METHODES DE MISE EN EVIDENCE DES BLSE :

Sur les 104 souches isolées, détectées comme BLSE (+), 82 (78.8%) ont

pu l’être grâce au test de synergie, 100 (96.2%) grâce à la méthode des

disques combinés, et 96 (92.3%) grâce à la méthode à la cloxacilline.

(tableau X, Fig .12)

Tableau X : comparaison des méthodes de mise en évidence des BLSE

Méthode Nombre de souches

BLSE (+) détectées

% Nombre de souches

BLSE(+) non détectées

%

Test de synergie 82 78.8 22 21.2

Méthode des disques combinés 100 96.2 4 3.8

Méthode à la cloxacilline 96 92.3 8 7.7

Figure 12 : Pourcentages de détection des méthodes de mise en évidence

des BLSE

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% de détection

Méthodes

Test de synergie Méthode des disques combinésMéthode à la cloxacilline

- 53 -

DISCUSSION

- 54 -

I- EPIDEMIOLOGIE DES ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BLSE :

Les bactéries productrices de BLSE constituent une préoccupation

majeure en milieu hospitalier en raison de leur diffusion épidémique et de

leur multirésistance aux antibiotiques. Les BLSE sont retrouvées chez une

vaste proportion de bacilles à gram négatif, mais les entérobactéries

représentent les germes les plus incriminés (17).

Klebsiella pneumoniae semble être le producteur numéro 1 de BLSE,

suivie d’ E. coli, d’après de nombreuses études (1, 17, 30, 40, 44). Dans notre

série d’étude, K. pneumoniae ne fait pas exception à la règle représentant

28,26% des souches isolées, ensuite viennent E. coli (27,17%), E. cloacae

(15,21%)...

En 2001 en France, K pneumoniae représentait 3% des microorganismes

isolés d’infections nosocomiales. Des épidémies hospitalières de souches

résistantes aux C3G par production de BLSE sont observées depuis le milieu

des années 1980 dans de nombreux pays; les souches classiques de

K. pneumoniae productrices de BLSE sont encore sensibles à l’imipénème.

Cependant, durant l’année 2004, une souche de K. pneumoniae résistante à

toutes les bêta-lactamines, y compris l’imipénème, a été isolée chez 6

patients d’un service de chirurgie en région parisienne (20).

Il faut, cependant, noter que certaines études détrônent K. pneumoniae

de la place qu’elle occupait, et placent E. aerogenes au 1er rang des

entérobactéries productrices de BLSE (22, 27). Ce phénomène a été observé

en France, aux USA et en Espagne (22).

DISCUSSION

- 55 -

Les souches d’entérobactéries productrices de BLSE isolées au cours de

notre étude, sont issues majoritairement des services de réanimation avec un

pourcentage de 46,74%. En effet , les patients hospitalisés au sein des unités

de soins intensifs présentent plus de risques à contracter une BLSE (44), vu la

durée d’hospitalisation (qui est généralement longue), la sévérité de la

maladie, l’usage d’un certain nombre de dispositifs invasifs (sondes

urinaires, cathéters, ventilation, intubation…), et les traitements antibiotiques

multiples notamment avec les céphalosporines à large spectre (1, 44).

Dans la présente étude, le tractus urinaire est à l’origine de 46,73% des

entérobactéries productrices de BLSE isolées. Ceci confirme les résultats

apportés par une étude menée en 1999 dans un hôpital universitaire à Paris

par Lucet et al. Et dans laquelle les infections du tractus urinaire à

entérobactéries productrices de BLSE représentaient 52% (26). Les

principaux facteurs de risque de colonisation, puis d’infections urinaires

nosocomiales, sont la dépendance fonctionnelle et surtout la mise en place

d’une sonde urinaire, qui doit être posée suite à une indication précise, puis

retirée le plus rapidement possible. Le respect de ces indications à côté de la

mise en place de mesures d’isolements et la mise en œuvre de consignes

d’hygiènes, ont permis, d’après une étude menée dans un service de

médecine interne gériatrique, de diminuer de 52% l’incidence des infections

à entérobactéries productrices de BLSE au CHU d’Amiens (21).

Jusqu'à présent, la plupart des études épidémiologiques concernant les

entérobactéries productrices de BLSE se sont intéressées à l’infection plutôt

qu’à la colonisation par ce type de germes. Pourtant, la compréhension des

facteurs de risque de colonisation digestive par les entérobactéries

productrices de BLSE est d’une importance vitale pour plusieurs raisons :

DISCUSSION

- 56 -

� Tout d’abord, le tube digestif a été reconnu comme réservoir et

source majeure d’entérobactéries à BLSE chez les patients

colonisés (17).

� Et puis, la colonisation a été reconnue comme un élément

précédent l’infection (4).

Donc, le contrôle et l’élimination des réservoirs constitués par les

patients colonisés, permettraient de diminuer la prévalence des infections à

BLSE.

Dans notre étude 12/104 (11,54%) des patients ont été sujets à une

colonisation digestive.

Une étude réalisée au CHU Ibn Rochd de Casablanca, qui s’est

intéressée à la colonisation digestive par les entérobactéries productrices de

BLSE, a montré que la ventilation mécanique, l’emplacement de tubes

nasogastriques, la durée de séjour, ainsi que les traitements antibiotiques

constituent les facteurs de risques les plus associés à la colonisation digestive

par les germes BLSE (29). Paradoxalement, une autre étude a montrée que

cette colonisation est associée seulement à la durée d’hospitalisation , et n’a

aucune relation avec le traitement antimicrobien, et que les mesures visant à

limiter la transmission de ces bactéries pouvaient à elles seules réduire la

prévalence de la colonisation digestive à entérobactéries productrices de

BLSE (4).

DISCUSSION

- 57 -

II- ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES :

Face à l’apparition de nouvelles résistances aux antibiotiques chez les

entérobactéries, l’évaluation de la sensibilité aux antibiotiques est devenue

indispensable.

Les souches isolées dans notre étude sont résistantes à toutes les bêta-

lactamines utilisées, sauf à l’imipénème avec des niveaux de résistances

différents aux aminosides (Amikacine 21,7%, Netilmicine 77,8%,

Gentamycine 89,8%, Tobramycine 96,6%), aux fluoroquinolones

(Ciprofloxacine 59%, Norfloxacine 50%), et à la Sulfaméthoxazol-

trimethoprime (74,1%).

Cette résistance croisée est due au fait que les plasmides portant les

gènes codant pour les BLSE, pourraient porter également des gènes de

résistance à différents autres antibiotiques (17, 44). Cette hypothèse a fait

l’objet de nombreuses études, parmi lesquelles celle menée par Oteo et al.

(1962 souches d’E. coli collectées dans 27 hôpital en Espagne) qui ont pu

montrer que le niveau de résistance aux antibiotiques non bêta-lactamines

était plus important pour les souches productrices de BLSE que pour les

souches non productrices (Cotrimoxazol 77,3% contre 32,9%,

Ciprofloxacine 63,3% contre 17,2% et Gentamycine 16,7% contre 6,3%

respectivement ) (27). Paterson et al. Ont aussi montré, d’après une étude

effectuée dans 18 hôpital et 7 pays, que 18% des souches BLSE étaient

également résistantes à la Ciprofloxacine (35).

L’augmentation de la résistance à ces familles d’antibiotiques limite leur

utilisation en cas d’infections à germes BLSE et la rend problématique. Cette

DISCUSSION

- 58 -

augmentation fait des carbapénèmes ( imipénème et méropénème ) les

antibiotiques de choix dans le traitement de ce genre d’infections (36, 44), du

fait de leur grande sensibilité vis à vis de l’action hydrolytique des BLSE

(44). Actuellement, l’imipénème et l’association bêta-lactamines / inhibiteurs

de bêt-lactamases sont souvent les plus utilisés en milieu hospitalier ; chez

les immunodéprimés, les patients ayant déjà subit un traitement avec des

C3G, et dans les services de réanimation (13) où règne une forte prévalence

d’entérobactéries productrices de BLSE, ce qui constitue un risque de

sélection de germes résistants aux carbapénèmes. C’est d’ailleurs le cas pour

une souche de K.pneumoniae, résistante à toutes les bêta-lactamines y

compris à l’imipénème, qui a été isolée dans un service de chirurgie en

région parisienne (20).

III- METHODES DE MISE EN EVIDENCE DES BLSE :

Depuis leur description en 1983, les entérobactéries productrices de

BLSE ont causé de nombreuses épidémies un peu partout dans le monde (26).

C’est pourquoi la détection de ces BLSE devient une nécessité et doit être

une pratique de routine dans les laboratoires de microbiologie médicale afin

d’éviter les échecs thérapeutiques chez les malades infectés par ces bactéries

productrices de BLSE et limiter leur dissémination.

Dans notre étude nous avons utilisé, pour détecter la production de

BLSE, trois méthodes à savoir : le test de synergie, méthode des disques

combinés, et la méthode à la cloxacilline.

DISCUSSION

- 59 -

III-1 - TEST DE SYNERGIE :

Généralement la production de BLSE est mise en évidence sur

l’antibiogramme par :

� Une sensibilité réduite à l’un ou plusieurs des antibiotiques suivants

(44) : Cefpodoxime, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, ou

aztréonam. Il faut, cependant, noter que le degré de résistance vis à vis

des C3G peut être très variable d’une BLSE à une autre ; c’est à dire

pendant que certaines souches BLSE montrent une franche résistance,

d’autres se montrent intermédiaires ou même sensibles. Ceci peut être

dû en partie à la qualité de l’inoculum, d’après certains investigateurs

(44).

� L’aspect en « bouchon de champagne » dû à un effet

synergique entre les disques contenant l’acide clavulanique et les

disques de C3G et celui d’aztréonam. Ce test de synergie est l’un des

premiers tests à être décrit par Jarlier et al. (7).

� Une résistance associée aux aminosides.

Grâce à ce test, nous avons pu détecter 78,8% des souches BLSE de

notre étude. C’est un test facile à réaliser, non coûteux qui pourrait, ou

devrait, être réalisé en routine dans les laboratoires de microbiologie, mais

dont le désavantage réside dans le fait que le phénomène de synergie peut

passer inaperçu lorsque l’inoculum est trop dilué ou lorsque les disques sont

placés loin les uns des autres (43), mais aussi en cas d’association, chez la

DISCUSSION

- 60 -

même bactérie, d’une BLSE et d’une céphalosporinase (7). Ce qui explique,

probablement, les 21,2% des souches non détectées.

C’est pourquoi certains auteurs suggèrent, afin d’améliorer la sensibilité

du test, la réduction de la distance entre les disques de C3G et le disque

contenant l’acide clavulanique à 20 mm et l’utilisation de céfpodoxime

comme antibiotique de choix, avec alternativement , l’addition de 4 µg/ml

d’acide clavulanique. à la gélose Mueller-Hinton (7). Alors que d’autres

auteurs proposent la distance de 15 mm comme étant la meilleure (44).

Une autre modification du test a été proposée par Pitout et al. (37) ; elle

utilise la combinaison cefepime (30µg) et piperacilline/tazobactam

(100µg/10µg), et a permis de mettre en évidence des souches productrices de

BLSE et de céphalosporinases haut niveau, ainsi que la production de BLSE

chez une E. coli ayant donné un résultat négatif avec la méthode préconisée

par le NCCLS.

III-2 - METHODE DES DISQUES COMBINES :

Dans la présente étude nous avons utilisé deux couples de disques

d’antibiotiques : CAZ avec CAZ/acide clavulanique et CTX avec CTX/ acide

clavulanique. Les souches testées étaient celles pour lesquelles le diamètre

d’inhibition de CTX est < ou égale à 22 mm, et à 27 mm pour la CAZ, celles

présentant un phénomène de synergie, et celles ayant une résistance associée

aux aminosides (Conformément à ce qui a été préconisé par le NCCLS).

Un test similaire a été décrit par Jacoby et Han (19), dans lequel 20µg

de sulbactam a été ajouté aux disques contenant l’un des oxyimino-bêta-

DISCUSSION

- 61 -

lactamines, et il a montré qu’un nombre significatif de souches n’a pas pu

être détecté par cette méthode.

Une autre étude a montré que l’utilisation des disques combinant les

C3G et l’acide clavulanique n’est pas une méthode fiable car elle ne permet

pas de différencier les souches produisant des BLSE de celles produisant des

céphalosporinases (AmpC), et de détecter les BLSE chez les souches

produisant à la fois une céphalosporinase AmpC et une BLSE (11).

96,2% des souches de notre étude ont montré un résultat positif avec la

méthode des disques combinés. A titre comparatif, lors d’une étude conduite

en Buenos-aires (Argentine) (40), la combinaison CTX/CTX-clav a permis de

détecter 84% des souches BLSE, la combinaison CAZ/CAZ-clav a permis de

détecter 59%, et la combinaison FEP/FEP-clav , quant à elle, a permis de

détecter 97% des souches.

III-3 - METHODE A LA CLOXACILLINE :

Technique décrite , récemment , sur des souches d’Acinetobacter

baumannï produisant une BLSE de type VEB-1 (38), qui consiste à réaliser

un test de synergie sur un milieu Mueller-Hinton contenant 250 mg/l de

cloxacilline. Cet antibiotique inhibe partiellement l’activité des

céphalosporinases, permettant ainsi aux BLSE de s’exprimer librement.

Pour la détection de nos souches, nous avons utilisé 500 mg/l de

cloxacilline, et contrairement à ce qui était prévu seulement 92,3% des

souches ont été détectées par cette méthode, car l’addition de cloxacilline

était sensée résoudre le problème de la production de céphalosporinases

DISCUSSION

- 62 -

rencontré avec les deux autres méthodes. Ceci nous laisse penser que,

probablement, la concentration en cloxacilline utilisée n’a pas été suffisante

pour inhiber les céphalosporinases et laisser s’exprimer les BLSE. D’autres

causes d’erreurs, d’ordre technique, pourraient expliquer en partie le

pourcentage de souches BLSE non détectées :

o Coulage non horizontal des milieux.

o Epaisseur insuffisante du milieu gélosé.

o Inoculum, trop léger, ou trop lourd.

o Mauvaise application des disques d’antibiotiques à la surface du

milieu gélosé.

o Conditions d’incubation : température, trop basse par suite

d’ouvertures fréquentes et/ou prolongées de l’étuve .

Malgré l’intérêt que peut apporter chacune de ces méthodes pour la

détection et la confirmation de la production des BLSE, aucune d’entre elles

n’a pu détecter de manière absolue toutes les souches productrices de BLSE.

Pour détecter autrement le caractère BLSE, certains auteurs utilisent la

recherche de CMI ( concentration minimale inhibitrice ), suivant la méthode

de microdilution en milieu liquide (4, 9).

Une autre technique facile à mettre en œuvre, mais néanmoins

coûteuse, utilisant des bandelettes E-test, s’est avérée intéressante pour sa

sensibilité à détecter les BLSE (5). Le E-test tire profit des avantages du test

par diffusion ( rapidité et simplicité), et du test par dilution ( obtention d’une

valeur quantitative de la sensibilité ).

DISCUSSION

- 63 -

Un autre test a été décrit par Thomson et Sanders (7), comme étant très

sensible pour la détection des BLSE, à savoir le test tri-dimentionnel, mais il

est techniquement plus compliqué que les autres méthodes et requière des

connaissances particulières pour son interprétation.

En ce qui concerne nos trois méthodes utilisées, nous avons constaté

une certaine complémentarité : la 1ère méthode (test de synergie) est une

technique valable pour les entérobactéries productrices de BLSE non

productrices de céphalosporinases . Sur le même antibiogramme un test

présomptif est à prendre également en considération ; c’est la diminution des

diamètres d’inhibition de la CTX et CAZ (inférieur ou égale à 22 mm et 27

mm respectivement) . Les deux autres méthodes sont complémentaires au

test de synergie dans les situations décrites précédemment .

Donc, d’après notre étude, il s’est avéré obligatoire l’utilisation de

deux techniques afin de pouvoir détecter les souches BLSE qui peuvent

échapper à l’une des deux méthodes.

IV- MAITRISE DE LA DIFFUSION DES BLSE : (11)

La maîtrise de la résistance bactérienne aux antibiotiques, notamment

par production de BLSE est une priorité de santé publique qui nécessite des

actions concertées reposant sur deux axes complémentaires :

• La prévention de la diffusion de ces bactéries par transmission

croisée.

• La réduction de la pression de sélection exercée par les

antibiotiques.

DISCUSSION

- 64 -

IV -1- PREVENTION DE LA DIFFUSION PARTRANSMISSION CROISEE :

Cette prévention repose sur deux types de mesures :

IV-1-1- L’identification précoce des patients porteurs :

Elle est primordiale car c’est elle qui permet de mettre en œuvre les

mesures d’isolement et elle comprend :

� La détection de la résistance au laboratoire.

� La notification rapide et claire par le laboratoire qui permet de faire

connaître les patients porteurs à l’équipe soignante. Cette notification

repose sur le contact personnalisé entre le biologiste et l’équipe

soignante, et la mention du caractère multirésistant de la bactérie sur

la feuille des résultats.

� La signalisation des patients porteurs de ce genre de BMR dans le

service d’hospitalisation.

IV-1-2- L’isolement des patients porteurs :

Il s’agit d’un isolement technique et géographique ; l’isolement

technique vise à instaurer une barrière physique autour d’un patient porteur

pour éviter la dissémination des bactéries multirésistantes. Il repose sur :

• Le lavage antiseptique (hygiénique) des mains après contact avec le

patient, et la désinfection des mains avec une solution hydro-

DISCUSSION

- 65 -

alcoolique par friction. L’installation d’un lavabo équipé par chambre

est un pré-requis indispensable au respect du lavage des mains.

• Le port de gants à usage unique lors de tous contacts

particulièrement contaminant avec le patient. L’utilisation de gants ne

dispense en aucun cas du lavage des mains après le contact.

• Le port de tablier ou surblouse lors de soins exposant à un large

contact avec le patient.

• L’utilisation de matériel de soins réservé à chaque patient.

Quant à l’isolement géographique, il facilite considérablement

l’application des mesures d’isolement technique. Il se fait en chambre

individuelle ou à défaut en chambre à plusieurs lits regroupant des patients

porteurs du même type de bactéries multirésistantes.

IV-1-3- Mesures complémentaires :

Elles visent à dépister , et si possible réaliser une décontamination

digestive afin d’éliminer les réservoirs de BLSE.

DISCUSSION

- 66 -

IV-2- REDUCTION DE LA PRESSION DE SELECTION :

Pour lutter contre la pression de sélection exercée par les antibiotiques,

il est recommandé d’utiliser ces antibiotiques de façon rationnelle en

considérant les points suivants :

• Préférer l’usage d’associations à celui des monothérapies.

• Respecter l’emploi de posologies adéquates.

- 67 -

CONCLUSION

- 68 -

La découverte des antibiotiques a constitué un grand pas dans la lutte

contre les maladies infectieuses notamment dans les infections dites

nosocomiales. Mais au moment où les laboratoires pharmaceutiques se

désinvestissent pour la recherche de nouvelles molécules en antibiothérapie,

les bactéries quant à elles, continuent de développer de nouveaux mécanismes

de résistance.

En milieu hospitalier, certaines bactéries sont devenues résistantes à un

ou plusieurs antibiotiques. Ce phénomène affecte surtout les unités de

réanimation où sont hospitalisés les patients les plus sévères et les

établissements de long séjour où sont hébergés les patients atteints de

pathologies chroniques.

Au Maroc, le problème se pose essentiellement pour les entérobactéries

productrices de BLSE qui posent, pratiquement, trois types de problèmes au

monde médical :

� Un problème thérapeutique : pour le clinicien qui doit

prescrire un antibiotique efficace, éviter les échecs

thérapeutiques et la sélection de mutants résistants.

� Un problème microbiologique : une détection difficile,

nécessitant la mise en œuvre de méthodes spécifiques.

� Un problème épidémiologique : pour les équipes de contrôle

de l’infection qui doivent limiter la dissémination de souches

multirésistantes.

C’est dans cette optique que nous avons entrepris d’étudier

l’épidémiologie de 104 souches d’entérobactéries productrices de BLSE,

CONCLUSION

- 69 -

isolées chez 104 patients ( dont 94 hospitalisés et 10 reçus à titre externe ),

et comparer trois méthodes de détection de ce type de germes, à savoir : le test

de synergie, la méthode des disques combinés et la méthode à la cloxacilline.

L’exploitation des résultats a été faite avec le logiciel WHONET 5.3

Au terme de cette étude, les résultats montrent que :

� Parmi les souches isolées, K. pneumoniae était la plus fréquente

représentant 28,26%, suivie de E. coli (27,17%) et de E. cloacae

(15,21%)…

� Ces souches étaient résistantes à toutes les bêta-lactamines testées, sauf à

l’imipénème, avec des niveaux de résistance différents aux aminosides

(Amikacine 21,7%, Netilmicine 77,8%, Gentamycine 89,8%, Tobramicine

96,6% ), aux fluoroquinolones ( Ciprofloxacine 59%, Norfloxacine 50% )

et à la sulfaméthoxazol-trimethoprime ( 74,1% ). Il demeure donc

nécessaire d’utiliser ces antibiotiques en association (surtout Amikacine,

Norfloxacine et Ciprofloxacine ) afin de préserver leur activité sur les

souches BLSE qui se caractérisent par leur aptitude à la multirésistance, et

constituer une alternative au traitement par l’imipénème qui est

difficilement accessible du fait de son coût.

� Concernant nos méthodes de mise en évidence des BLSE :

� Le test de synergie ; nous a permis de détecter 78,8% de nos

souches BLSE. C’est un test facile à mettre en œuvre et non

coûteux.

� La méthode des disques combinés ; a permis de détecter 96,2%

des souches. Un pourcentage intéressant qui fait de cette

méthode un bon outil pour la mise en évidence des BLSE.

CONCLUSION

- 70 -

Pour ces deux méthodes, on a noté que la production de

céphalosporinases peut être gênante.

� La méthode à la cloxacilline ; contrairement à ce qui était prévu

seuls 92,3% des souches a été détecté. L’addition de cloxacilline

était sensée résoudre le problème de production de

céphalosporinases rencontré avec les deux autres méthodes.

� Donc aucune de nos trois méthodes n’a pu détecter de manière absolue

toutes les souches productrices de BLSE. En conclusion, le test de

synergie doit être utilisé en routine sur tous les isolats bactériens au sein

des laboratoires de microbiologie, les cas suspects doivent faire l’objet

d’une confirmation par les deux autres méthodes, vu la complémentarité

qu’a montrée ces dernières avec le test de synergie.

Enfin, et dans le cadre de mesures destinées à limiter l’apparition

d’épidémies intra-hospitalières dues à des souches d’entérobactéries

productrices de BLSE : le dépistage précoce des infections à germes BLSE, le

contrôle des réservoirs et des voies de transmission par isolement technique et

géographique de patients colonisés ou infectés et le bon usage des

antibiotiques sont à l’évidence des mesures qui permettent la réduction de la

prévalence de ces bactéries multirésistantes. Cependant, leur mise en œuvre

nécessite la prise de conscience collective de ces notions, la coopération de

tous les services et par la formation approfondie des équipes soignantes.

- 71 -

ANNEXE

- 72 -

Tableau XI : Disques d’antibiotiques utilisés pour l’antibiogramme

Antibiotiques ( Oxoîd, England ) Charges ( µg )

Ampicilline ( AMP ) 10

Augmentin ( AMC )

(Amoxicilline/Acide-clavulanique )

20 /10

Céfalotine ( CF ) 30

Céfotaxime ( CTX ) 30

Céftazidime ( CAZ ) 30

Imipénème ( IMP ) 10

Gentamycine ( CN ) 10

Amikacine ( AK ) 30

Netilmicine ( NET ) 30

Tobramycine ( TOB ) 10

Ciprofloxacine ( CIP ) 5

Colistine ( CT ) 50

Sulfaméthoxazol /trimethoprime ( TSU ) 1,25/23,75

Tableau XII : Disques d’antibiotiques utilisés pour les tests de confirmation

Antibiotiques Charges (µg )

Céfotaxime (CTX ) 10

Céfotaxime/Ac. Clav 30/10

Céftazidime (CAZ ) 30

Céftazidime/Ac. Clav 30/10

Piperacilline/Tazobactam ( TZP ) 100/10

Ticarcilline/Ac. Clav ( TCC ) 75/10

ANNEXE

- 73 -

Milieux de culture :

� Milieu MH 2 ( Mueller-Hinton ) :

C’est un milieu prêt à usage fourni par le fabriquant ( Biomérieux ).

Généralement utilisé pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques et

sulfamides.

*Composition : - Infusion de bœuf 300g

- Caséine 1,75g

- Starch 1,5g

- Agar 17g

- Eau distillée 1 litre

� Milieu Mac-conkey :

Milieu sélectif aux bacilles à gram négatif par sa teneur en cristal

violet.

* Composition : - Bacto-peptone 17g

- Protéose ou polypeptone 3g

- Lactose 10g

- Sels biliaires 1,5g

- NaCl 5g

- Agar 13,5g

- Rouge neutre 0,03g

- Cristal violet 0,001g

- Eau distillée 1litre

ANNEXE

- 74 -

� Milieu MH/Cloxacilline :

* Composition : - Cloxacilline (500mg/l) 125µl

-Gélose Mueller-Hinton 250ml

* Préparation : - Faire fondre la gélose MH, ramener à 50°C ,

incorporer la solution mère de cloxacilline dans la gélose,

homogénéiser et couler en boite de pétri.

� Milieu Mac-conkey/CTX :

* Composition : - Solution mère de CTX 30µl

- Gélose Mac-conkey 60ml

* Préparation : - Faire fondre la gélose Mac-conkey, ramener à

50°C, incorporer 30µl de la solution mère de CTX ( 1000 Gamma )

dans 60ml de gélose, homogénéiser et couler en boite de pétri.

- 75 -

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