JULIE LAFERRIÈRE

INTERACTION DES CELLULES CANCÉREUSES AVEC L’ENDOTHÉLIUM VASCULAIRE DANS LE PROCESSUS

MÉTASTATIQUE

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Biologie cellulaire et moléculaire FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL

JUILLET 2003 © Julie Laferrière, 2003

i

Résumé Les métastases sont une complication souvent irréversibles et fatales du cancer. L'adhérence et

la migration des cellules cancéreuses sur et à travers l'endothélium vasculaire sont des étapes

critiques du processus métastatique. Nous avons étudié le rôle des molécules d'adhérence,

E-sélectine et intégrines, ainsi que celui de la kinase SAPK2/p38 dans la régulation de

l'adhérence et la migration transendothéliale des cellules HT-29 provenant d’un carcinome du

colon. Le TNFα augmente fortement l'expression de la E-sélectine par les cellules

endothéliales humaine HUVEC. Cet effet est indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induit

par le TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de cellules HUVEC

prétraitées au TNFα dépend de l'expression de la E-sélectine mais est indépendante de

l'activité de SAPK2/p38 des cellules HUVEC et des cellules cancéreuses. Le blocage par des

anticorps spécifiques des intégrines des cellules HT-29 révèle aussi la participation de

l'intégrine β4 dans leur adhérence aux cellules HUVEC activées par le TNFα. L'adhérence par

l’intégrine β4 est impliquée plus tardivement que l’adhérence par la E-sélectine. L'adhérence

des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées mène à l'activation de SAPK2/p38 dans les

cellules cancéreuses. De plus, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc induit l'activation

spécifique des kinases SAPK2/p38 et ERK des cellules HT-29. Ceci suggère que l'attachement

des cellules HT-29 à la E-sélectine implique un récepteur fonctionnel et signalétique.

Cependant, la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-29 n’a pas conduit à la phosphorylation

de l’intégrine β4, suggérant que ces deux événements ne sont pas liés signalétiquement.

L’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées implique également un facteur

soluble non identifié. Ceci suggère que l’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium

est comparable à celle des lymphocytes, c’est-à-dire qu’elle implique l’utilisation séquentielle

de sélectines, chimiokines et intégrines. Le blocage de l'augmentation de l'activité de

SAPK2/p38 induite par l’adhérence des cellules HT-29 empêche leur migration

transendothéliale. Nos résultats suggèrent que la régulation de la migration transendothéliale

des cellules cancéreuses implique deux étapes essentielles: une interaction spécifique avec

l'endothélium par l'utilisation séquentielle de molécules d'adhérence, telles que la E-sélectine

et l’intégrine β4, et une augmentation du potentiel migratoire par l'activation médiée par

l’adhérence de la voie SAPK2/p38.

ii

Abstract Metastasis is a dreadful complication of cancer. Adhesion and migration of tumor cells on and

through the vascular endothelium are critical steps of the metastatic process. We investigated

the roles of the adhesion molecules E-selectin and integrins, as well as the role of the MAP

kinase SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2/p38), in modulating endothelial adhesion

and transendothelial migration of HT-29 colon carcinoma cells. TNFα strongly increases the

expression of E-selectin in human endothelial cells HUVEC. This effect is independent of the

activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells on a monolayer of

HUVEC pre-treated with TNFα is dependent on E-selectin expression but is independent of

SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. Blocking the integrins from HT-29

cells (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) with specific antibodies reveals a role for β4 integrin in

their adhesion to TNFα-treated HUVEC. The sequence of events showed that β4 integrin

adhesion is involved later then E-selectin adhesion. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-

treated HUVEC leads to the activation of SAPK2/p38 in the tumor cells, as reflected by the

increased phosphorylation of its downstream target, the actin polymerizing factor HSP27.

Moreover, a recombinant E-selectin/Fc chimera induces the specific activation of SAPK2/p38

and ERK (extracellular signal-regulated kinases) in HT-29 cells, suggesting that the binding of

E-selectin to HT-29 cells involves a functional and signaling receptor. However, the binding

of E-selectin to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of β4 integrin suggesting that the

two adhesion events are not signalingly linked. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated

HUVEC also implicates a soluble unidentified factor. This indicates that the adhesion of

cancer cells to the endothelium uses the same sequence as lymphocytes namely, selectins,

chemokines and integrins. Blocking the adhesion-mediated increase of SAPK2/p38 activity of

HT-29 cells inhibits their transendothelial migration. Overall, our results suggest that the

specific regulation of transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps: 1)

adhesion to the endothelium by the sequential use of adhesion molecules, such as E-selectin

and β4 integrin, 2) increased motogenic potential through adhesion-mediated activation of the

SAPK2p38 pathway.

iii

Avant-propos

J’ai reporté l’écriture de cette section jusqu’à la toute fin. Elle se veut le point final de cette

aventure qui a été pour moi les études graduées. Je crois qu’il faut une certaine naïveté pour

débuter un doctorat. Cette innocence se perd tranquillement au fil du temps, pour faire place à

la détermination et à l’endurance, les deux composantes nécessaires pour terminer de telles

études. Au cours des années passées à l’Université Laval et au centre de recherche de l’Hôtel-

Dieu de Québec (CRHDQ), j’ai eu l’occasion de côtoyer plusieurs personnes qui ont eu sur

moi une influence importante. Je tiens à les remercier ici.

Je commence par mon directeur de recherche, le Dr Jacques Huot. Cet homme a été pour moi

un mentor. C’est un scientifique passionné, toujours motivé par de nouveaux résultats et qui

sait apporter de l’originalité à un projet. Il m’a permis d’apprendre que pour rester

concurrentiel dans un monde où les moyens sont parfois inégaux entre les différents groupes,

il suffisait d’une approche nouvelle et originale. C’est également un excellent pédagogue et

superviseur. Il m’a offert une grande liberté de pensée tout en étant présent pour me diriger au

quotidien. Il possède surtout de grandes qualités humaines, dont le souci du bien-être de ceux

qui l’entoure. En sa compagnie, j’ai pu cheminer scientifiquement ainsi que personnellement.

Merci Dr Huot!

Dans le laboratoire du Dr Huot, j’ai eu le privilège de développer le projet de recherche qui

fait l’objet de cette thèse. Cette opportunité m’a permis d’apprendre comment débuter un

projet, l’orienter selon les objectifs du laboratoire ainsi que de mettre au point différentes

techniques. Au cours de mon séjour dans cette équipe, j’ai côtoyé plusieurs personnes. Je

tiens ici à remercier particulièrement Simon Rousseau, qui a été pour moi un modèle à suivre;

François Houle, l’assistant de recherche du Dr Huot, qui m’a appris comment travailler dans

un laboratoire ainsi que Laurent Lamalice, un compère de paillasse qui a rendu le quotidien

agréable. Au cours de mes sept années passées au centre de recherche, j’ai également

rencontrer des gens qui ont transcendé le milieu du travail. Leur présence dans mon entourage

est encore bien vivante; je parle de Genevière Gingras-Breton, d’Olivier Larochelle et de Réna

Deschesnes. Leur présence a été très enrichissante. Également, je ne peux passer sous silence

iv

tous les différents chercheurs, personnel et étudiants que j’ai côtoyés au cours du temps qui

ont permis de rendre le séjour intéressant. Je crois sincèrement que le milieu est tout aussi

important que le travail qu’on y fait.

Évidemment, les études graduées sont rendues possible financièrement grâce à l’aide des

organismes subventionnaires. J’ai reçu des bourses du CRHDQ, du Fonds pour la formation

des Chercheurs et l’Aide à la Recherche-Fond de Recherche en Santé du Québec (FCAR-

FRSQ), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), et

de la Société de Recherche sur le Cancer Inc (SRC). Je dois également mentionner l’octroi

d’une bourse de congrès de l’Institut National du Cancer du Canada (INCC) et les subventions

des Instituts de Recherches en Santé du Canada (IRSC, anciennement le CRM, le Conseil de

Recherche médical du Canada) ainsi qu’une subvention et son renouvellement de la SRC sur

la base de mes travaux. Ces différentes sources financières m’ont également permis d’aller

présenter mes travaux à différents congrès nationaux et internationaux et ce, à toutes les

années de mes études graduées. Cette expérience m’a permis de mettre en perspectives tous

mes résultats ainsi que de rencontrer des gens fascinants et d’entendre parler de science de

manière inouïe. Je crois que tout étudiant devrait pouvoir aller en congrès au moins une fois

au cours de son doctorat.

La motivation de base pour aller en science était pour moi aussi forte qu’un battement de

coeur. Le soutien constant est venu de mes parents. Ils m’ont appris que les limites que l’on

possède sont celle que l’on s’impose et m’ont offert comme cadeau depuis le berceau la

curiosité, leur support inconditionnel et leur conviction en mon potentiel. Ils m’ont donné des

ailes pour voler. De manière plus large, je suis entouré de gens fiers de moi, qui me donnent

sans cesse l’énergie de continuer. Je pense ici à mon frère André, à mes oncles, tantes,

cousins et cousines qui m’ont tous suivi d’une manière ou d’une autre au cours de cette

aventure. Plus récemment, au cours de mes études graduées s’est également ajoutée une belle-

famille, également une source de support importante. J’ajoute ici aussi mes amies,

particulièrement Mélanie Kavanagh, qui est une complice du baccalauréat et qui termine son

doctorat également cette année, sa présence a été rassurante, agréable et stimulante.

Finalement, l’homme de ma vie, mon conjoint Eric Trottier. C’est le plus beau souvenir du

centre du recherche que je garde avec moi. Eric m’a encouragée, dirigée, stimulée, consolée,

v

félicitée et permis de vivre pleinement cette aventure. Il est ma source de motivation, mon

premier critique et mon réconfort. Si je termine aujourd’hui, c’est qu’il m’a encouragé dans

les doutes et les moments plus difficile et applaudi dans les moments de réussite. Il est une

partie intégrante de tout ce travail.

Voilà, mes travaux tendent à démontrer que le processus métastatique est dynamique et

articulé. J’ai aimé travailler sur mon projet, je souhaite qu’il puisse continuer et que la lecture

de cette thèse soit agréable et stimulante.

À Alice, Pierrette, Maurice et Raymond, Qui ont donné un visage au cancer

et

À Eric, mon guide dans cette aventure

vii

Table des matières

Résumé........................................................................................................................................ i

Abstract...................................................................................................................................... ii

Avant-propos............................................................................................................................ iii

Table des matières .................................................................................................................. vii

Liste des tableaux...................................................................................................................... x

Liste des figures........................................................................................................................ xi

Liste des abréviations ............................................................................................................ xiii

1 Introduction....................................................................................................................... 2

1.1 Vue d’ensemble .......................................................................................................... 2

1.2 Le processus inflammatoire ........................................................................................ 4 1.2.1 Inflammation et cancer ....................................................................................... 9

1.3 Les cytokines ............................................................................................................ 10 1.3.1 Le facteur de nécrose tumorale, TNF (Tumor-Necrosis Factor) ...................... 12 1.3.2 Chimioattractants / Chimiokines....................................................................... 16

1.4 Les molécules d’adhérence....................................................................................... 20 1.4.1 Les sélectines..................................................................................................... 22 1.4.2 Les intégrines .................................................................................................... 27 1.4.3 Les cadhérines................................................................................................... 31 1.4.4 La superfamille des Immunoglobulines – Molécules d’adhérence cellulaires

(Ig–CAM) .......................................................................................................... 33 1.5 Les voies MAP kinases............................................................................................. 36

1.5.1 ERK (extracellular signal-regulated kinase) .................................................... 41 1.5.2 p38..................................................................................................................... 42

1.6 La migration cellulaire.............................................................................................. 45 1.6.1 Les points focaux d’adhérence et le cytosquelette ............................................ 45 1.6.2 L’invasion.......................................................................................................... 47 1.6.3 La migration transendothéliale......................................................................... 51

1.7 Les métastases .......................................................................................................... 52 1.7.1 Spécificité du processus métastatique............................................................... 53 1.7.2 Approche thérapeutique .................................................................................... 56

1.8 Objectifs du projet de recherche ............................................................................... 59 1.8.1 Aperçu de la thèse ............................................................................................. 60

viii

2 La migration transendothéliale des cellules de carcinome de côlon nécessite l’expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales et l’activation de SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2) dans la cellule tumorale. ................... 62

2.1 Résumé ..................................................................................................................... 63

2.2 Article ....................................................................................................................... 64 2.2.1 Summary............................................................................................................ 65 2.2.2 Footnotes........................................................................................................... 65 2.2.3 Introduction....................................................................................................... 66 2.2.4 Experimental procedures .................................................................................. 67 2.2.5 Results ............................................................................................................... 72 2.2.6 Discussion ......................................................................................................... 91 2.2.7 Acknowledgments .............................................................................................. 94 2.2.8 References ......................................................................................................... 94

3 Régulation du processus métastatique par la E-sélectine et SAPK2/p38 ................ 100

3.1 Résumé ................................................................................................................... 101

3.2 Article ..................................................................................................................... 102 3.2.1 Abstract ........................................................................................................... 103 3.2.2 Selectins: classification, structure and binding .............................................. 103 3.2.3 E-Selectin and cell signaling........................................................................... 105 3.2.4 Stress-activated protein kinase-2/p38 (SAPK2/p38)....................................... 107 3.2.5 Joint role of E-selectin and SAPK2/p38 in metastasis.................................... 110 3.2.6 Conclusions and future directions .................................................................. 113 3.2.7 Acknowledgments ............................................................................................ 114 3.2.8 References ....................................................................................................... 116

4 L'adhérence E-sélectine-dépendante des cellules cancéreuses HT-29 aux cellules endothéliales médie l'adhérence intégrine β4-dépendante des cellules cancéreuses........................................................................................................................................ 122

4.1 Résumé ................................................................................................................... 123

4.2 Article ..................................................................................................................... 124 4.2.1 Summary.......................................................................................................... 126 4.2.2 Introduction..................................................................................................... 126 4.2.3 Experimental procedures ................................................................................ 128 4.2.4 Results ............................................................................................................. 130 4.2.5 Discussion ....................................................................................................... 138 4.2.6 References ....................................................................................................... 141

5 Résultats complémentaires........................................................................................... 148

5.1 Rôle d’un médiateur soluble d’origine endothéliale dans l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules endothéliales............................................................................ 148

5.2 Identification du ligand de la E-sélectine ............................................................... 151

5.3 Adhérence des cellules HT-29 à des cellules endothéliales d’origine différentes.. 156

ix

6 Discussion générale ....................................................................................................... 164

6.1 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est séquentielle ................. 165

6.2 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est spécifique.................... 167

6.3 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est signalétique................. 168

7 Conclusions et perspectives.......................................................................................... 170

7.1 Conclusions générales ............................................................................................ 170

7.2 Perspectives et orientation future............................................................................ 170 7.2.1 Identification du ligand de la E-sélectine ....................................................... 171 7.2.2 Caractérisation du facteur soluble.................................................................. 171 7.2.3 Caractérisation de la spécificité de l’interaction selon l’origine des cellules

endothéliales et cancéreuses. .......................................................................... 173 7.2.4 Développement d’un modèle d’adhérence en condition de flux ..................... 173

7.3 Applications ............................................................................................................ 174

A Statistiques canadiennes du cancer ............................................................................. 178

A.1 Nomenclature.......................................................................................................... 178

A.2 Métastases selon l’origine du cancer ...................................................................... 179

B CV - Curriculum Vitae .................................................................................................. 193

B.1 Publications............................................................................................................. 193

B.2 Communications ..................................................................................................... 194

Bibliographie ......................................................................................................................... 196

x

Liste des tableaux Tableau 1-1 Les familles de chimiokines et leurs récepteurs ............................................... 19

Tableau 1-2 Nomenclature des MAP kinases ........................................................................ 37

Tableau 1-3 Nomenclature des MKK .................................................................................... 39

Tableau 1-4 Nomenclature des MAP3K ................................................................................ 39

Tableau 1-5 Gènes suppresseur de métastases ...................................................................... 55

Tableau 1-6 Phénotype métastatique de cancer humains .................................................... 56

Tableau 1-7 Approche thérapeutique contre la cascade métastatique ............................... 58

Tableau A-1 Incidence des métastases dans les organes principaux................................. 191

xi

Liste des figures Figure 1-1 Paradigme du recrutement leucocytaire............................................................... 5

Figure 1-2 Modèle de spécificité d’interaction. ....................................................................... 8

Figure 1-3 Cibles moléculaires des AINS et des drogues anticancéreuses dans la cellule cancéreuse du côlon............................................................................................... 11

Figure 1-4 Modèle d’interactions entre cytokines ................................................................ 13

Figure 1-5 Famille des récepteurs d’adhérence .................................................................... 21

Figure 1-6 Les différents hétérodimères d’intégrines et leurs substrats ............................ 29

Figure 1-7 Représentation schématique des sentiers signalétiques induit par VCAM-1.. 35

Figure 1-8 Le coeur du module MAP kinase......................................................................... 38

Figure 1-9 Représentation schématique de la cascade ERK ............................................... 43

Figure 1-10 La migration cellulaire ....................................................................................... 49

Figure 1-11 Plasticité de la migration tumorale.................................................................... 50

Figure 1-12 La cascade métastatique ..................................................................................... 54

Figure 2-1 TNFα-induced de novo expression of E-selectin is not mediated by activation of SAPK2/p38......................................................................................................... 74

Figure 2-2 E-selectin-dependent adhesion of tumor cells to endothelial cells does not require activation of SAPK2/p38. ........................................................................ 76

Figure 2-3 Dose- and time-dependent activation of SAPK2/p38 induced by TNFα in HUVEC................................................................................................................... 79

Figure 2-4 Transendothelial migration of HT-29 tumor cells requires E-selectin expression by endothelial cells and increased SAPK2/p38 activity in the tumor cells.......................................................................................................................... 81

Figure 2-5 Inducibility of the SAPK2/p38 pathway in HT-29 tumor cells. ........................ 84

Figure 2-6 E-selectin-mediated adhesion of HT-29 tumor cells to endothelial cells activates the phosphorylation of HSP27 in the tumor cells. .............................. 86

Figure 2-7 Time-dependent activation of SAPK2/p38 by E-Selectin. ................................. 87

Figure 2-8 Migration of HeLa cells through but not adhesion on endothelial cells depends on SAPK2/p38 activity. ......................................................................................... 90

xii

Figure 3-1 Selectins and their counterreceptors/ligands.................................................... 106

Figure 3-2 The SAPK2/p38 pathway. .................................................................................. 109

Figure 3-3 Activation of SAPK2/p38 by E-selectin and regulation of transedothelial migration by E-selectin-mediated activation of SAPK2/p38 in cancer cells. . 112

Figure 3-4 A working model to explain the regulation of transendothelial migration of cancer cells. .......................................................................................................... 115

Figure 4-1 HT-29 cells adhesion to E-selectin/Fc chimera................................................. 133

Figure 4-2 Adhesion of HT-29 cells to by TNFα-activated HUVEC is mediated sequentially by E-selectin and β4 integrin. ....................................................... 135

Figure 4-3 Time-dependent activation of p38 and ERK induced by the binding of HT-29 cells to E-selectin/Fc. ........................................................................................... 136

Figure 4-4 Binding of E-selectin/Fc to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of integrin β4. ........................................................................................................... 137

Figure 5-1 Influence du milieu conditionné par un prétraitement au TNF sur l’adhérence des cellules HT-29 ................................................................................................ 150

Figure 5-2 Mise en évidence sur les cellules HT-29 d’un candidat potentiel d’un ligand de la E-sélectine ........................................................................................................ 154

Figure 5-3 L’isolation du candidat comme ligand de la E-sélectine est sensible au calcium............................................................................................................................... 155

Figure 5-4 Réponse de la kinase p38 de différentes lignées endothéliales à un stress ..... 158

Figure 5-5 Adhérence des cellules HT-29 aux HUVEC et aux HBrMEC ........................ 160

Figure 5-6 La E-sélectine est exprimée uniquement sur les cellules HUVEC.................. 161

Figure 7-1 Chambre de flux parallèle .................................................................................. 175

xiii

Liste des abréviations GÉNÉRALES

5-FU 5-Fluorouracile

ADN Acide désoxyribonucléique

AINS Anti-inflammatoires non-stéroïdiens

AMFR Autocrine Motility Factor Receptor

AMPc Adénosine Monophosphate cyclique

AP Protéine activatrice (Activator Protein)

APC Adenomatous polyposis coli

ATF-2 Facteur de transcription d'activation-2 (Activation Transcription Factor)

CAM Molécule d'adhérence cellulaire (Cellular Adhesion Molecule)

CDKs Kinases dépendantes des cyclines (Cyclin-Dependent Kinases)

COX Cyclooxygénase

CPT-11 Irinotecan

CRP Complement Regulatory Protein

DD Domaine de la mort (Death Domain)

E-cadhérine Cadhérine de l'épithélium (Epithelilal-cadherin)

EGF Facteur de croissance épidermique (Epidermal Growth Factor)

EGFR Récepteur du facteur de croissance épidermal (Epidermal Growth Factor Receptor)

ERM Ezrin-Radixin-Moesin

ERK Kinase régulée par un signal extracellulaire (Extracellular signal-Regulated Kinase)

ESL-1 Ligand 1 de la E-selectine (E-selectin ligand-1)

FADD Protéine associée au domaine de la mort de FAS (FAS-Associated Death Domain)

xiv

FAK Kinase d'adhérence focale (Focal Adhesion Kinase)

FGF Facteur de croissance fibroblastique (Fibroblast Growth Factor)

GF Facteur de croissance ( Growth Factor )

GFP Protéine fluorescente verte ( Green Fluorescent Protein )

GlyCAM-1 Molécule-1 d'adhérence cellulaire dépendante de la glycosylation (Glycosylation-dependent Cell Adhesion Molecule-1)

GDP Guanosine di-phosphate

GTP Guanosine tri-phosphate

HAPEC Cellules endothéliales humaines immortalisées de l'appendice

HBrMEC Cellules endothéliales humaines immortalisées du cerveau

HEV High Endothelial Venules

HIMEC Cellules endothéliales humaines immortalisées de l'intestin

HLMEC Cellules endothéliales humaines immortalisées du poumon

HPLNEC.B3 Cellules endothéliales humaines immortalisées des ganglions lymphatiques

HSkMEC Cellules endothéliales humaines immortalisées de la peau

HSPs Protéines de choc thermique (Heat Shock Proteins)

HSpMEC Cellules endothéliales humaines immortalisées de la rate

HSP27 Protéine de choc thermique 27 (Heat Shock protein of 27 kDa)

HUVEC Cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical humain (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)

ICAM Molécule d'adhérence intercellulaire (Intercellular Adhesion Molecule)

IEF/2D Séparation isoélectrique à deux dimensions (Isoelectric focussing/two dimension)

IFN Interféron

IκB Inhibiteur cytoplasmique de NF-kappa B (Inhibitor kappa B)

IκK Kinase de IκB (IκB kinase)

IL Interleukine

xv

ILK Kinase liée aux intégrines (Integrin-linked kinase)

IRS Substrat du récepteur de l'insuline (Insulin Receptor Substrate)

JNK Kinase de la partie N-terminale de la protéine c-Jun (c-Jun N-terminal Kinase)

KSR Protéine kinase suppresseur de RAS (Kinase suppressor of Ras)

LAD-1 Déficit d'adhérence leucocytaire de type I (Leukocyte Adhesion Deficiency)

LC-MS/MS Chromatographie Liquide, couplée à la Spectrométrie de Masse

LFA-1 Intégrine αLβ2 (Leucocyte Function Antigen)

LMNH Les lymphomes malins non hodgkinien

LPS Lipopolysaccharide

LuECAM Molécule d'adhérence des cellules endothéliales du poumon (Lung Endothelial Cell Adhesion Molecule)

MAC-1 Intégrine αMβ2

MAdCAM-1 Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule

MALDI-TOF Désorption-Ionisation au Laser Assistée par Matrice - Temps de Vol (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight)

MALT Mucosa Associated Lymphoid Tissue

MAP Protéine activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein)

MAPK Protéine-kinase activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein Kinase)

Mapkapk-2/3 MAPK-activated protein kinase 2/3

MAPKK Protéine-kinase kinase activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase)

MEC Matrice extra-cellulaire

MEK MAP/ERK kinase

MKK MAP kinase kinases

MKKK MAP kinase kinase kinases

MMPs Métalloprotéinases de la matrice (Matrix Metallproteinase)

MNK MAP kinase-interacting kinase

xvi

MSK mitogen- and stress-activated protein kinase

NF-κB Facteur nucléaire kappa B (Nuclear factor kappa B)

Oligo Oligonucléotide

PAF Fateur activateur des plaquettes (Platelet-activating factor)

PAGE Électrophorèse en gel de polyacrylamide (Polyacrylamide gel electrophoresis)

PAK p21-activated protein kinase

PCR Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)

pI Point isoélectrique

P13K Kinase-3 phosphoinositide (Phosphoinositide 3-Kinase)

p38 Protéine-kinase de 38 kDa

PDGF Facteur de croissance dérivé des plaquettes (Platelet-derived growth factor)

PKA Protéine kinase A

PKC Protéine kinase C

PMN Polymorphonucléaires

PRAK p38-regulated/activated kinase

PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1

PTB Domaine d'attachement phosphotyrosine (Phosphotyrosine binding domain)

ROS Reactive Oxygen Species

SAPK Protéine-kinase activée par le stress (Stress Activated Protein Kinase)

SAPK2 Protéine-kinase 2 activée par le stress (Stress Activated Protein Kinase-2)

SOS Facteur d’échange de GTP pour Ras (Son of Sevenless)

TADC Cellules dendritiques associées aux tumeurs (Tumor-associated dendritic cells)

TAM Macrophages associés aux tumeurs (Tumor-associated macrophages)

TCF Facteur de transcription (terneray complex factor)

TGF-β Facteur de croissance tumorale-béta (Tumor growth factor-β)

xvii

TIL Lymphocytes associés aux tumeurs (Tumor-infiltrating lymphocyte)

TNF Facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor)

TNF-α Facteur de nécrose tumorale alpha (Tumor Necrosis Factor Alpha)

TNFR Récepteur du facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor Receptor)

TRADD Protéine associée au domaine de la mort du TNFR (TNFR-Associated Death Domain)

TRAF Facteur associé au TNFR (TNFR-Associated Factor)

TRAIL Ligand inducteur d'apoptose relié au facteur de nécrose tumorale (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand)

uPA Urokinase Plasminogen Activator

uPAR Urokinase Plasminogen Activator Receptor

VLA-4 Intégrine α4β1 (Very late antigen)

VCAM-1 Molécule d'adhérence de la cellule vasculaire (Vascular Cell Adhesion Molecule)

VE-cadhérine Cadhérine spécifique à l'endothélium vasculaire (Vascular endothelial-specific cadherin)

VEGF Facteur de croissance endothélial vasculaire (Vascular Endothelial Growth Factor)

WT Wild Type

UNITÉS

µ Micro

Ci Curie

Da Dalton

g Gramme

h Heure

kb Kilobase

m Milli

xviii

M Molaire

min Minute

mm Millimètre

n Nano

RÉACTIFS ET SUBSTANCES CHIMIQUES

DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO Sulfoxyde de diméthyle

DTT Dithiothréitol

EBSS Earle’s balanced salt solution

ECGS Endothelial cell growth supplement

EDTA Acide éthylène-diamine tétra acétique (ethylene diamine tetraacetic acid)

EGTA Acide éthylène glycol-bis-b aminoéthyl éther-N, N, N', N'-tétra acétique (ethylene glycol tetra acetic acid)

FBS Sérum fœtal de bovin (Fœtal Bovine Serum)

FBS HI Sérum foetal de bovin inactivé par la chaleur (Heat inactivated FBS)

FITC Fluorescein isothiocyanate

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HRP Peroxydase de raifort (Horseradish Peroxidase)

MOPS Acide propane sulfonique 3-(N-morpholino)

PBS Tampon phosphate salin (Phosphate buffer salin)

PMSF Fluorure de phényl-méthyl sulfoxide (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride)

SDS Dodécyle-sulfate de sodium (Sodium Dodecyl Sulfate)

TRIS Tris(hydroxyméthyle)aminométhane

Chapitre 1

Introduction

2

1 Introduction

1.1 Vue d’ensemble

Le mot cancer est un mot latin, qui signifie crabe ou écrevisse. Tout comme le crabe qui

représente plusieurs espèces, le cancer comprend près de deux cents maladies différentes,

toutes caractérisées par une croissance incontrôlée de cellules. Ces cellules s’accumulent pour

former une tumeur qui envahit et détruit, par la suite, les tissus normaux avoisinants, d’où la

malignité.

En 2001 au Canada, le cancer était la deuxième cause principale de mortalité. Il était

cependant la première cause de décès prématuré. Pour tous les cancers confondus, les

estimations sont qu’une personne sur trois sera atteinte d’un cancer au cours de sa vie et

qu’une personne sur quatre mourra des suites de cette maladie (Source : Société Canadienne

du Cancer). Les principales complications morbides associées au cancer sont la résistance à la

thérapie traditionnelle (chimiothérapie, radiothérapie), ainsi que l’apparition de métastases,

c’est-à-dire de nouvelles tumeurs à distance de la première lésion.

Le processus métastatique implique une série d’étapes consécutives inter-reliées. Pour former

une métastase cliniquement visible, toutes ces étapes doivent être réussies. La tumeur initiale

doit se vasculariser pour dépasser le diamètre critique de 1mm. Après l’invasion du tissu

environnant, les cellules cancéreuses peuvent pénétrer dans les vaisseaux sanguins ou

lymphatiques. Une fois dans ces vaisseaux, les cellules cancéreuses peuvent proliférer à cet

endroit, se détacher et se déplacer avec la circulation. Cette embolie tumorale doit survivre en

circulation pour s’arrêter dans un nouveau lit vasculaire. La cellule cancéreuse doit par la

suite s’attacher à l’endothélium, le traverser, migrer dans l’environnement du nouvel organe

puis proliférer pour former une micrométastase. La micrométastase devra développer un

réseau vasculaire et éviter la réponse immunitaire pour survivre et croître [1].

3

Ce n’est pas toutes les cellules d’une tumeur qui ont le potentiel de former une métastase. En

1889, Stephen Paget observait, suite à l’analyse de plus de 900 rapports d’autopsie, que les

métastases ne se produisaient pas de manière aléatoire. Il a alors postulé l’hypothèse,

maintenant célèbre, du « seed and soil ». Cette hypothèse veut que certaines cellules

tumorales (la semence - seed) ont une affinité particulière pour l’environnement de certains

organes (le sol - soil). La croissance d’une métastase est seulement possible lorsque la

semence est compatible avec le sol. Cette idée a survécu à diverses tendances et d’autres

idées. Aujourd’hui, cette hypothèse réside sur trois principes [2]:

1- Les tumeurs sont composées de cellules cancéreuses et de cellules de l’hôte. De plus,

la tumeur est elle-même hétérogène et contient des sous-populations génotypique et

phénotypique de cellules.

2- Le processus métastatique est sélectif pour une cellule qui réussit à franchir toutes les

étapes, de l’invasion initiale à la nouvelle vascularisation. Ainsi, bien qu’une

métastase puisse avoir une origine clonale, chaque métastase peut être différente.

3- La métastase peut se développer uniquement dans un organe particulier.

L’environnement de cet organe est unique, la métastase en est influencée et elle

interagit avec les mécanismes homéostatiques de cet endroit.

L’avenir de la thérapie contre le cancer et ses métastases n’est pas de cibler uniquement la

cellule tumorale, mais bien les mécanismes locaux qui promeuvent sa progression et sa survie

[2].

Ces mécanismes locaux sous-entendent des contacts étroits entre les cellules tumorales et

l’hôte. Ces contacts sont assurés par les molécules d’adhérence. L’expression et l’affinité de

ces dernières peuvent êtres modifiées au cours de la progression tumorale. Les mécanismes

locaux qui favorisent la croissance et la survie tumorale dépendent également des différents

signaux intracellulaires qui seront générés suite à ces contacts.

Cette thèse porte sur l’étude des mécanismes de l’interaction entre la cellule cancéreuse et la

cellule endothéliale, une étape importante du processus métastatique. Plus précisément, ces

travaux visent, à l’aide de lignées cellulaires humaines en sytème reconstitué, à spécifier les

4

molécules favorisant le contact cellule cancéreuse – cellule endothéliale et à identifier la

signalisation intracellulaire qui en découle. L’interaction des cellules circulantes avec

l’endothélium est un phénomène connu et étudié dans le processus inflammatoire et le trafic

leucocytaire. Le processus inflammatoire est un bon modèle de référence et a permis

d’extrapoler l’hypothèse que les cellules cancéreuses usurpent le processus inflammatoire pour

interagir avec l’endothélium. L’originalité de ce travail est de permettre de relier une

signalisation spécifique initiée dans la cellule cancéreuse suite à leur adhérence aux cellules

endothéliales.

1.2 Le processus inflammatoire

L’inflammation est un processus normal de réponse tissulaire à toute agression. Elle est

caractérisée par quatre signes cardinaux : douleur, rougeur, chaleur et œdème. Au niveau

cellulaire, elle se caractérise par une infiltration leucocytaire. Le recrutement leucocytaire est

un paradigme multi-étapes bien documenté.

Une inflammation aiguë est caractérisée par l’expression et la sécrétion de médiateurs

solubles, telles les cytokines. Ces dernières activent l’endothélium qui exprimera différentes

molécules d’adhérence. L’adhérence des leucocytes avec l’endothélium activé se fait en trois

étapes séquentielles. Premièrement les leucocytes sont captés et roulent sur l’endothélium par

l’intermédiaire des sélectines. Par la suite, les leucocytes sont activés par les chimioattractants

relargués par l’endothélium. Finalement les leucocytes s’arrêtent, adhèrent fortement à

l’endothélium et migrent à travers ce dernier. Ce processus de migration fait intervenir les

intégrines du leucocyte qui se lient à des membres de la superfamille des immunoglobulines

exprimés sur l’endothélium [3, 4]. Ces étapes sont schématisées à la figure 1-1.

5

Figure 1-1 Paradigme du recrutement leucocytaire.

L’entrée des leucocytes dans les tissus est contrôlée par une cascade d’interactions. L’attachement initial des leucocytes à la surface des cellules endothéliales se fait par les sélectines, ce qui leur permet de rouler. Par la suite, les leucocytes entreront en contact avec des facteurs activateurs, tels les chimiokines, présents sur la surface de l’endothélium. Ceci permet l’activation des intégrines du leucocyte. Les intégrines activées lieront les membres de la superfamille des immunoglobulines (CAMs – Cell Adhesion Molecules), ce qui permettra une adhérence ferme, le pré-requis pour une migration dirigée des leucocytes sur la surface des cellules endothéliales. Adapté de [5].

6

7

Le processus d’émigration leucocytaire a été décrit pour la première fois en 1889 par

Cohnheim [6]. Cette séquence d’événements a été reconstruite in vitro à l’aide des éléments

purifiés. Les travaux de Lawrence et Springer [6] ont démontré qu’en présence du

chimiostimulant fMLP, un neutrophile soumis à un flux pouvait rouler et s’immobiliser en

s’attachant fermement sur une bicouche lipidique contentant uniquement la P-sélectine et

ICAM-1. Ces expériences ont permis de reproduire in vitro le recrutement de leucocytes lors

de l’inflammation, et donc de préciser la séquence minimale d’événements moléculaires

impliqués. Ces travaux ont également permis de démontrer l’importance des résultats

d’adhérence sous un flux circulant versus une adhérence statique. En effet, dans un essai

d’adhérence statique, les neutrophiles activés peuvent s’attacher fortement à la molécule

ICAM-1 par l’intermédiaire de leurs intégrines. Cependant, sous une condition de flux avec

une force de cisaillement comparable à celle que l’on retrouve en circulation dans les veinules

post-capillaires, le neutrophile activé ne parvient pas à s’attacher à ICAM-1. Pour y parvenir,

le neutrophile nécessite la présence de la P-sélectine afin de sortir du flux circulant en roulant

et de pouvoir s’arrêter sur ICAM-1.

Les différentes molécules identifiées par Lawrence et Springer comme étant minimalement

essentielles pour permettre le roulement et l’adhérence des neutrophiles peuvent être

remplacées par différents membres de leurs familles respectives (sélectines, chimiokines et

intégrines) pour apporter une spécificité. En effet, il a été proposé par Springer [4] le modèle

du code de lieux à trois étapes (Three-Step Area Code Model) : la séquence sélectines,

chimioattractants et intégrines. Ce modèle permet d’expliquer l’infiltration leucocytaire à un

site inflammatoire précis ainsi que la recirculation distinctive de différentes sous-classes de

lymphocytes. Ce concept est illustré à la figure 1-2.

8

Figure 1-2 Modèle de spécificité d’interaction.

Les leucocytes utilisent séquentiellement des interactions médiées par les sélectines, les chimioattractants et par les intégrines. L’utilisation combinatoire des différentes molécules à chaque étape peut être spécifique pour des sous-populations de leucocytes. Cette spécificité pour les monocytes et/ou neutrophiles peut être produite à un site inflammatoire donné. Adapté de [4].

9

1.2.1 Inflammation et cancer

On retrouve plusieurs cellules inflammatoires associées aux tumeurs. Cette observation a été

signalée pour la première fois en 1863 par Rudolf Virchow, qui nota la présence de leucocytes

dans le tissue néoplasique et supposa qu’il existait un lien entre l’inflammation et le cancer

[7]. On retrouve des cellules associées à l’inflammation dans le stroma ainsi que dans la

tumeur. Ce sont les macrophages associés aux tumeurs (TAM – Tumor-associated

macrophages), les cellules dendritiques associées aux tumeurs (TADC – Tumor-associated

dendritic cells) et les lymphocytes associés aux tumeurs (TIL – Tumor-infiltrating

lymphocyte), principalement des lymphocytes T. L’ensemble de ces cellules contribuent à la

production de cytokines, à la croissance tumorale ainsi qu’à l’immunosuppression associée au

cancer. En effet, une tumeur amène le paradoxe d’une inflammation locale avec un effet anti-

inflammatoire systémique [7].

L’inflammation est divisée de manière commune en trois phases : l’inflammation aigüe, la

réponse immune et l’inflammation chronique. La source de l’inflammation est souvent

d’étiologie inconnue, ce qui amène des traitements dont le but est le soulagement de la douleur

et la diminution, ou l’arrêt des processus de dommages tissulaires. Le traitement le plus

commun est l’utilisation des anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS). Les AINS incluent

une variété de molécules, l’aspirine et les salicylates ainsi que d’autres composés comme

l’ibuprofène et le sulindac. Le principal mécanisme d’action est l’inhibition de la biosynthèse

des prostaglandines en bloquant l’enzyme cyclo-oxygénase (COX). Selon l’AINS, l’inhibition

est réversible ou irréversible et elle affecte l’isoforme I et/ou II de la COX. Les effets non

désirés incluent l’ulcération gastrique et des défaillances rénales [8].

Les AINS semblent maintenant impliqués dans la prévention du cancer. En effet, une

utilisation prolongée des AINS diminue le risque de cancer colorectal [9]. Les mécanismes

responsables cet effet protecteur agiraient à plusieurs niveaux. Les AINS auraient un effet

directement sur la cellule cancéreuse. La résistance des cellules cancéreuses à la

chimiothérapie est en partie due à la résistance à l’induction de l’apoptose. Les AINS auraient

un effet indépendant de celui sur la COX sur l’induction de l’apoptose dans la cellule

10

cancéreuse (figure 1-3). Ainsi, on pourrait imaginer une thérapie combinatoire de la

chimiothérapie classique conjuguée aux AINS pour diminuer la croissance tumorale [10].

1.3 Les cytokines

Les cytokines sont des médiateurs solubles sécrétés par une variété de cellules, ayant un effet

autocrine ou paracrine. Elles sont généralement synthétisées rapidement suite à un stimulus.

Les cytokines ont une variété d’effets, allant d’une amplification de la réponse immunitaire, à

l’inflammation, au recrutement cellulaire, au développement lymphoïde en passant par le

SIDA et le cancer. [11, 12]

L’effet des cytokines est transmis par l’intermédiaire de leurs récepteurs spécifiques. Ils

peuvent être séparés en cinq familles [11, 13]:

1- Les récepteurs de l’IL-1. Ceux-ci possèdent une structure typique des membres de la

superfamille des immunoglobulines

2- Les récepteurs de la famille des hématopoïétines. Certains récepteurs de cette famille

ont plusieurs chaînes, tel IL-2R qui est composé des chaînes IL-2R α, β et γ. Un point

intéressant de cette famille est que la chaîne IL-2Rγ est partagée par d’autres

récepteurs, tels les récepteurs de l’IL-4, 7, 9 et 13.

3- Les récepteurs de la famille du TNF [14]. Ces récepteurs partagent une homologie de

structure dans le site d’interaction avec le ligand. Il semble que tous les ligands de

cette famille agissent en trimères. Il en sera question au point 1.3.1.

4- Les récepteurs de l’interféron. Les interférons sont connus pour leur activité anti-

virale et leur capacité de moduler la réponse immune.

5- Les récepteurs des chimiokines [12]. Ce sont des récepteurs à sept domaines trans-

membranaires couplés à des protéines G. Il en sera question au point 1.3.2.

11

Figure 1-3 Cibles moléculaires des AINS et des drogues anticancéreuses dans la cellule cancéreuse du côlon

Représentation schématique des sentiers activés par les cytokines, les facteurs de croissance et les ligands de type FAS sur la survie et l’apoptose. Les AINS sont représentés en rouge et les drogues anti-cancéreuses, en bleu. Adapté de [10]

12

Dans les tissus, on retrouve un réseau inter-reliées de production de cytokines. De manière

individuelle, elles peuvent stimuler, inhiber ou modifier la réponse à d’autres cytokines. Cette

interrelation est illustrée à la figure 1-4. Dans le développement d’une tumeur, elles régulent

l’infiltration leucocytaire, stimulent la néovascularisation et peuvent contribuer au processus

métastatique. Les cytokines peuvent également influencer la croissance et la survie des

cellules cancéreuses. Cependant, dans certaines conditions, elles peuvent contribuer à la

destruction de la tumeur par la réponse immunitaire. Ces différents effets sont modulés selon

les cytokines exprimées, ce qui peut être modifié dans un contexte cancéreux et ainsi

promouvoir la croissance tumorale [15].

1.3.1 Le facteur de nécrose tumorale, TNF (Tumor-Necrosis Factor)

L’histoire de la découverte du TNF (ou TNFα) est intimement liée à celle de la thérapie du

cancer. En 1868, Brunes avait observé chez certaines personnes atteintes du cancer que les

tumeurs régressaient spontanément suite à une infection bactérienne aiguë. En 1894, William

Colley observe qu’un extrait bactérien peut amener une régression tumorale. En 1944, Shear

et collaborateur isole le LPS (lipopolysaccharide) de bactéries Gram-négative. Le LPS induit

chez la souris une nécrose hémorragique des tumeurs. En 1962, O’Malley transfère du sérum

de souris traités au LPS chez des souris porteuses de tumeurs et observe une nécrose tumorale.

En 1975, c’est l’apparition du terme tumor-necrosis factor par Carswell et collaborateur, qui

ont confirmé l’effet du sérum induit par le LPS sur les tumeurs de souris et ont également

démontré l’effet du sérum induit par le LPS sur la mortalité de cellules cancéreuses en culture.

C’est finalement en 1984 que le groupe de Pennica a rapporté le clonage de l’ADN

complémentaire de la protéine TNF [16].

13

Figure 1-4 Modèle d’interactions entre cytokines

Les cytokines interagissent de manière très contrôlée avec l’environnement. Ici, la présence ou l’absence de certaines cytokines modifient la régulation de l’angiogénèse. Par exemple, en présence de IL-12 il y a production d’interféron, qui diminue les chimiokines ELR (chimiokines CXC possédant le motif ELR avant la première cystéine) et augmente les chimiokines non-ELR, ce qui inhibe l’angiogénèse. Adapté de [12]

14

Le TNF est un polypeptide de 17 kDa qui agit sous forme d’homotrimère. Il se présente

comme une protéine trans-membranaire, pouvant agir de façon juxtacrine. Il peut également

être clivé et relargué sous forme soluble. Il possède deux récepteurs, le p55 TNFR (CD120a)

et le p75 TNFR (CD120b). La forme p55 est exprimée de manière ubiquiste et est responsable

de plusieurs aspects de la réponse immunitaire. Au niveau cellulaire, elle entraîne également

l’apoptose et dans l’organisme, elle est responsable de l’induction de changements tels la

fièvre, la perte d’appétit et la cachexie. Le récepteur p75 est exprimé principalement sur les

cellules hématopoïétiques et est activé principalement par le TNF membranaire. Ses effets

semblent plutôt limités et dans la plupart des cas, ses réponses peuvent être induites également

par le récepteur p55 [14, 15].

La liaison du TNF à son récepteur active différents sentiers de signalisation dont la spécificité

est acquise par les différents adaptateurs recrutés au récepteur. On distingue cinq sentiers

émanant de la liaison du TNF à son récepteur [14] :

1- Les sentiers d’induction de mort cellulaire – Le récepteur du TNF possède dans son

domaine cytoplasmique un domaine de mort (DD, Death Domain), une séquence

importante dans l’effet cytotoxique du récepteur. Le domaine DD du TNFR recrute la

protéine adaptatrice TRADD (TNFR-associated death domain), qui par la suite

recrutera des protéines tel FADD (FAS-associated death domain). Ces dernières

amènent à l’activation des pro-caspase-8 et –10, impliquées dans la réponse

apoptotique [14, 16].

2- La signalisation lipidique – La liaison du TNF à son récepteur conduit à la formation

de différents médiateurs lipidiques. Bien que les effets et les cascades soient moins

décrits que pour le sentier d’apoptose, l’activité des enzymes sphyngomyélinases

(production de céramide) et phospholipases (production d’acide arachidonique) est

augmentée [14].

3- Les sentiers MAP kinases – L’activation des trois sentiers MAP kinase, ERK, JNK et

p38 survient rapidement suite à la liaison du TNF à son récepteur. Ces trois sentiers

sont surtout connus pour leurs effets comme activateurs de facteurs de transcription et

de l’expression génique, principalement de l’expression des gènes reliés à

15

l’inflammation [14]. JNK et p38 seraient aussi impliqués dans l’expression de la E-

sélectine, une molécule d’adhérence propre aux cellules endothéliales [17].

4- Le sentier NF-κB – Le facteur de transcription NF-κB est composé de deux sous-

unités, p65 et p50. Son activation est régulée par un inhibiteur cytoplasmique, IκB.

Suite à la liaison du TNF à son récepteur, IκB est phosphorylé par sa kinase IKK (IκB

kinase), ce qui amène sa dégradation par le protéasome. NF-κB transloque par la suite

au noyau pour augmenter l’expression de gènes inflammatoires et immuns [14, 18, 19].

Selon le contexte, ce sentier peut induire des dommages tissulaires avec

l’inflammation, mais il peut également protéger de l’apoptose. Ces deux effets

opposés suggèrent la prudence si on voulait en faire une cible thérapeutique [20].

5- Les autres cibles signalétiques potentielles – Selon le contexte et le type cellulaire, la

liaison du TNF à son récepteur peut également activer d’autres sentiers. Citons en

exemple la protéine kinase C et le sentier JAK/STAT. L’information disponible sur

leurs effets est cependant plus fragmentaire [14].

L’effet des cytokines est souvent redondant. Plusieurs effets du TNF peuvent être reproduits

par l’IL-1. Cette relation s’expliquerait par la similarité des voies de signalisation utilisées

dans les deux cas. Les deux cytokines utilisent un membre de la famille TRAF (TNFR-

associated factor), TRAF6 pour l’IL-1 et TRAF2 pour le TNF. Ces deux protéines

adaptatrices partagent différentes cibles et peuvent même s’associer, ce qui expliquerait l’effet

synergique du TNF et de l’IL-1 [14].

Selon le contexte cellulaire, le TNF peut entraîner ses effets cytotoxiques par les sentiers de

mort. Les effets inflammatoires du TNF incluent l’activation de cellules hématopoïétique,

l’activation de la cascade de cytokines ainsi que l’activation des cellules endothéliales.

L’activation des cellules endothéliales par le TNF entraine la réorganisation du cytosquelette

d’actine [21] et la modification de la perméabilité de la couche endothéliale par un mécanisme

impliquant une protéine G sensible à la toxine pertussique [22] et une diminution de l’AMPc

[23]. Le TNF a également un effet transcriptionnel. Dans les cellules endothéliales, il induit

l’expression des molécules d’adhérence telles la E- et P-sélectine, ICAM-1 (Intercellular

Adhesion Molecule-1) et VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) [24-26]. Cependant,

16

les différents niveaux d’induction de ces molécules d’adhérence varient selon l’origine des

cellules endothéliales [24, 26]. Les cellules endothéliales sont hétérogènes quant à la réponse

et la production de cytokines [27].

Dans un contexte cancéreux, le TNF peut être impliqué dans la prolifération et la

transformation cellulaire. Son expression (ou celle de son récepteur) est généralement associé

à un mauvais pronostic. De plus, il amène l’expression de facteurs pro-angiogéniques. L’effet

du TNF est paradoxal, une dose élevée localement détruira les vaisseaux sanguins, mais

lorsqu’il est produit de façon chronique, il contribue au remodelage tissulaire et au

développement du stroma nécessaire à la croissance et l’invasion cancéreuse [15].

La cachexie (une perte de poids massive dans le tissu adipeux et les muscles squelettiques)

apparaît dans les stades avancés de maladies et préférentiellement dans certains types de

cancers, tel ceux du tractus gastro-intestinal. Le TNF serait un médiateur potentiel de la

cachexie. Cependant, les thérapies visant à bloquer la production ou l’action du TNF ont eu

peu de succès dans l’augmentation de la masse corporelle, bien qu’il pourrait y avoir une

augmentation de l’appétit [28].

1.3.2 Chimioattractants / Chimiokines

Les chimiokines sont de petites cytokines (8-14 kDa) ayant une propriété de chimioattractant

[15]. Cependant, le spectre de leur effet biologique est encore plus large. Elles sont

impliquées dans la réponse inflammatoire, dans le recrutement cellulaire, dans la maturation

du système immunitaire ainsi que dans la réponse immune, dans la croissance tumorale ainsi

que dans les métastases. Certaines chimiokines peuvent être produites exclusivement par un

seul tissu, ou encore être produites par différentes cellules. Il en va de même pour leurs

récepteurs [12].

La plupart des chimiokines ont quatre cystéines caractéristiques et selon l’arrangement des

deux premières, on les regroupe en quatre classes :

17

1- CXC ou chimiokine alpha. Ce groupe se scinde en deux, selon la présence ou non

du motif ELR précédant la première cystéine. Les chimiokines ELR-CXC sont

connues comme des facteurs angiogéniques tandis que les chimiokines non-ELR-

CXC sont des facteurs angiostatiques qui inhibent l’effet des premières [12]. Les

chimiokines CXC ciblent principalement les neutrophiles [29].

2- CC ou chimiokine bêta. Les chimiokines CC ciblent principalement les monocytes

et les cellules T. Ils sont étudiées entre autres dans les réactions allergiques pour

leur capacité à recruter les éosinophiles, cellules T et monocytes [29].

3- C ou chimiokine gamma. Cette famille de chimiokines ne possède que deux résidus

cystéines conservés, le deuxième et le quatrième. Elle inclut la lymphotactine

(XCL1), un peptide chimiotactique pour les lymphocytes [29].

4- CX3C ou chimiokine delta. Cette famille ne contient qu’un seul membre pour

l’instant, la fractalkine, la seule chimiokine liée à la membrane par une tige

glycosylée semblable aux mucines [29].

Les récepteurs des chimiokines sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires

couplés aux protéines G. Un même récepteur peut avoir plusieurs ligands. Leur appellation

provient de la famille de ligand auquel il est associé, CCR pour les récepteurs liant les

chimiokines CC, CXCR pour les récepteurs liant les chimiokines CXC, XCR pour les

récepteur liant les chimiokines C et CX3CR pour les récepteur liant les chimiokines CX3C

[12].

Les chimiokines peuvent être séparées selon leurs fonctions, celles reliées à l’homéostasie et

celles reliées à l’inflammation. Les chimiokines inflammatoires sont induites suite à un

stimulus pro-inflammatoire ou par des cytokines sur les monocytes, macrophages, cellules

endothéliales, épithéliales ou fibroblastique. Les chimiokines homéostatiques sont plutôt

caractérisées par une expression spécifique à un tissu ou organe, en absence d’inflammation

[12].

En 1998, suite à une Gordon Conference sur les chimiokines, un comité présidé par le Dr.

Osamu Yochie ont cherché à standardiser l’appellation de ces molécules, en croissance

18

constante. Ces recommandations ont été présentées et acceptées en 1999 à un Keystone

Symposium sur les chimiokines. Ainsi, les ligands possèdent un L après le nom de leur famille

et les récepteurs un R, le tout suivi d’un chiffre. Ces nouvelles appellations se retrouvent au

tableau 1-1.

Les chimiokines ont été associées au cancer pour différentes raisons. Certaines chimiokines

CC ont été identifiées comme déterminants majeurs pour l’infiltration des lymphocytes et des

macrophages dans les carcinomes. Les chimiokines sont également impliquées dans

l’induction ou l’inhibition de l’angiogénèse, avec comme exemple en promoteur de

l’angiogénèse CXCL8 (IL-8) et en inhibiteur, CXCL10 (IP-10). Les chimiokines ont

également un rôle dans la promotion tumorale [15]. La première démonstration en importance

de l’implication des chimiokines dans les métastases a été faite par le groupe de Albert Zlotnik

[30]. Ils ont démontré que les cellules cancéreuses du sein, par opposition aux cellules

épithéliales mammaires normales, exprimaient fortement les récepteurs de chimiokines

CXCR4 et CCR7. Les ligands de ces derniers, respectivement CXCL12 (SDF-1α) et CCL21

(6Ckine) sont exprimés normalement dans les organes préférentiels pour des métastases du

cancer du sein. CXCL-12 est exprimé fortement dans les nodules lymphatiques, les poumons,

le foie et la moelle osseuse et est un excellent chimioattractant pour les lymphocytes. CCL21

est exprimé principalement dans les nodules lymphatiques et est impliqué dans le « homing »

des lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires. De plus, la signalisation induite

par CXCR4 et CCR7 dans la cellule cancéreuse du sein amène une polymérisation d’actine

ainsi qu’une augmentation de la migration. Les mélanomes malins, qui ont un patron de

dissémination métastatique semblable au cancer du sein expriment également CXCR4 et

CCR7. Cependant, il exprime en plus CCR10, qui lie son ligand CCL27 (CTAK), exprimé

dans la peau. L’ensemble de ces résultats suggère que les cellules cancéreuses expriment les

récepteurs des chimiokines de manière non aléatoire et que ceux-ci sont impliqués dans la

détermination de la destination de la dissémination métastatique [30].

19

Tableau 1-1 Les familles de chimiokines et leurs récepteurs

20

Nouvelle nomenclature des chimiokines humaines ainsi que les autres appellations communément retrouvées dans la littérature. Adapté de [29]

1.4 Les molécules d’adhérence

L’adhérence cellulaire est un processus multiple qui sous-entend i) le contact cellule – matrice,

ii) le contact homotypique cellule – cellule et iii) le contact hétérotypique cellule – cellule. Il

permet le maintien de la structure tridimensionnelle des tissus, la formation de complexe

signalétique ainsi que la morphogenèse. Il existe quatre familles de récepteur d’adhérence :

les intégrines, les cadhérines, la superfamille des immunoglobulines – CAM (Cell Adhesion

Molecule) ainsi que les sélectines. Ils sont représentés schématiquement à la figure 1-5. Il ne

faut pas voir l’adhérence comme un phénomène statique, l’adhérence et la signalisation

intracellulaire sont deux phénomènes intimement liés [31].

Les lymphomes malins non hodgkinien (LMNH) sont un groupe de tumeurs qui originent de

la prolifération de cellules d’origine lymphoïde. Ceux-ci sont caractérisés par une grande

hétérogénéité histopathologique et clinique. Certains sous-groupes présentent une spécificité

quant à leur dispersion [32]. Les lymphomes extra ganglionnaires de type MALT (mucosa

associated lymphoïd tissue) ont une préférence anatomique, tels les lymphomes digestifs, qui

se retrouvent avec une localisation gastrique, souvent accompagnées de localisation

amygdalienne suivies de localisation au grêle [32]. Les récepteurs de l’adhérence présents sur

les lymphocytes normaux sont conservés, en partie, sur leurs homologues de LMNH. Ces

récepteurs d’adhérence contribuent à l’agressivité du lymphome et seraient impliqués dans le

patron de dissémination spécifique à certains tissus de certains sous-types de lymphomes. Par

exemple, l’intégrine α4β7 amène le ciblage des lymphocytes à la muqueuse intestinale par une

interaction avec MAdCAM-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule), un membre de la

superfamille des immunoglobulines exprimé sur l’endothélium muqueux de l’intestin. On

retrouve l’expression de l’intégrine α4β7 sur la plupart des cas de lymphome B de faible

malignité de type MALT ainsi que sur les lymphomes intestinaux à cellule T [33]. Les

molécules d’adhérence fournissent une piste d’explication pour les sites de dissémination des

lymphomes.

21

Figure 1-5 Famille des récepteurs d’adhérence

Ce schéma présente les différentes familles de molécules d’adhérence. Leurs structures approximatives, leurs ligands ou contre-récepteur ainsi que certaines

22

protéines liant le cytosquelette sont représentées. INT = milieu intracellulaire et EXT = milieu extracellulaire. Adapté de [34] et de [35].

1.4.1 Les sélectines

Les sélectines (CD62) sont une famille de trois récepteurs d'adhérence dépendants du calcium

qui regroupent la L -, P- et E-sélectine. La L-sélectine est exprimée constitutivement par les

lymphocytes, tandis que la E-sélectine est exprimée exclusivement par les cellules

endothéliales activées. La P-sélectine se retrouve dans les plaquettes et les cellules

endothéliales où elle est entreposée dans les granules α et les corps de Weibel-Palade

respectivement. La partie extracellulaire de chaque sélectine est constituée de trois domaines

différents; un domaine lectine de type C de 120 acides aminés en N-terminal, un domaine de

type EGF de 35-40 acides aminés et de 2 à 9 courtes répétitions consensus (~60 acides

aminés) qui sont retrouvées dans les protéines régulatrices du complément (CRP). Chez

l’humain, on retrouve 2 répétitions CRP sur la L-sélectine, 6 sur la E-sélectine et 9 sur la P-

sélectine. Les sélectines sont ancrées dans la membrane par un court domaine

transmembranaire simple qui est suivi d'une queue cytoplasmique courte de 17 acides aminés

pour la L-sélectine, de 32 pour la E-sélectine et de 35 pour la P-sélectine [5, 35]. Les

sélectines contribuent à l'entrée des leucocytes dans les tissus inflammés, tel que décrit au

point 1.2. Sous un flux circulant, l’adhérence des cellules à une surface ou à d’autres cellules

varie de manière inversement proportionnelle avec l’amplitude de la force de cisaillement

appliquée. Pour les sélectines, il a été démontré qu’un niveau seuil de force de cisaillement est

nécessaire pour favoriser le roulement et l'adhérence des leucocytes par les sélectines [36].

Les sélectines lient des sucres présentés par une molécule porteuse. Cette dernière est connue

comme le ligand (ou contre-récepteur), par opposition à la sélectine qui est le récepteur. Le

ligand peut présenter divers sucres, tel les sialyl-Lewis a et x (SLea et SLex) ou encore d’autres

oligosaccharides fucosylés. La protéine de présentation seule n’a aucune capacité de liaison

par elle-même, elle doit être exprimée dans le contexte cellulaire adéquat avec les enzymes de

glycolysation appropriées pour présenter l’activité liante pour les sélectines [5, 37]. Psgl-1 (P-

selectin glycoprotein ligand-1), un ligand partagé pour la P- et la E-sélectine, est une protéine

o-glycosylée transmembranaire qui se trouve sur les cellules lymphoïdes, myéloïdes et sur

23

certaines autres cellules non-hématopoïétique [5, 38]. Une sous-population de MadCAM-1

(Mucosal addressin cell adhesion molecule-1) qui est trouvée sur la surface des cellules

endothéliales des veinules mésentériques est un ligand de la L-sélectine. MadCAM-1 avait été

initialement identifiée comme ligand de l’intégrine α4β7 [5].

1.4.1.1 L-sélectine

Le ligand de la L-sélectine GlyCAM-1 (glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1) est

exprimé sur les cellules endothéliales des HEV (high endothelial venules) afin de permettre le

« homing » des lymphocytes aux nodules lymphatiques. C’est, d’ailleurs, le seul endroit où

les deux autres sélectines ne sont pas impliquées [5].

Dans la réponse immune, la L-sélectine des lymphocytes interagit avec l’endothélium. Elle

est par la suite rapidement clivée et l’ectodomaine est libéré sous forme soluble (le processus

est connu sous le nom de « shedding »). Ainsi, la libération de la L-sélectine, est associée à

l’activation du leucocyte. Cette activation amène rapidement une surexpression à partir des

granules d’entreposage de l’intégrine αMβ2 (CD11b/CD18 ou Mac-1), une intégrine qui lie la

protéine ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) sur les cellules endothéliales [5, 39]. Le

libération de la L-sélectine peut être induite par le peroxyde et les ions superoxydes, par une

diminution de volume du neutrophile ou encore suite à une stimulation par un facteur de

croissance. Ce processus est dépendant de l’activation de la MAP kinase p38, et de ERK dans

le cas d’une stimulation par un facteur de croissance [40-42]. L’agrégation de la L-sélectine

permet directement l’activation du sentier p38 dans le neutrophile, ce qui permet d’en modifier

sa forme, d’activer les intégrines et de relarguer les granules sécrétoires (dégranulation) [39].

24

1.4.1.2 P-sélectine

La P-sélectine possède deux mécanismes de régulation. Le premier implique l’expression de

la P-sélectine entreposée (dans les granules α et les corps de Weibel-Pallade) et le second, une

activation transcriptionnelle du gène. Suite à un traitement à l’histamine, à la thrombine ou à

certains agents pharmacologiques, la P-sélectine est exprimée en quelques minutes à la surface

de l’endothélium (quelques secondes pour les plaquettes). Cette expression est transitoire, car

la molécule est internalisée de 30 à 60 minutes plus tard par endocytose [5]. Un traitement au

LPS ou au TNF amène une synthèse de P-sélectine. Cependant, dans certains cas, telles les

veinules de la peau, on peut retrouver une expression de P-sélectine sans stimulus

inflammatoire [5, 24].

La souris déficiente dans l’expression du gène de la P-sélectine a été produite sans phénotype

notable. Cependant, elle présente une diminution de l’émigration des neutrophiles à des temps

court (1 à 2 heures) dans une péritonite induite chimiquement et une diminution du roulement

des leucocytes [5]. La souris déficiente pour les gènes de la E- et de la P-sélectine (les

sélectines endothéliales) est presque complètement déficiente dans le roulement, l’adhérence

et l’émigration des leucocytes dans les premières 24 heures d’un traitement antigénique [43].

Cependant, une réponse inflammatoire induite par le TNF permet tout de même le roulement

et le recrutement des leucocytes. Il existe donc un roulement indépendant des sélectines [44].

La P-sélectine peut également amener une spécificité dans le recrutement des leucocytes. Les

HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) traitées au TNF recrutent une variété de

leucocytes, principalement par la E-sélectine et VCAM-1. Les HUVEC traitées avec de

l’interleukine-4 (IL-4) recrutent principalement des éosinophiles par la P-sélectine [45]. La P-

sélectine a également été impliquée dans différentes signalisations, tel que la signalisation

juxtacrine dépendante de PAF (Platelet-activating factor) sur les cellules endothéliales pour

activer l’intégrine β2 des neutrophiles. Également, le domaine cytoplasmique de la P-

sélectine des plaquettes est rapidement phosphorylé puis déphosphorylé suite à l’activation des

plaquettes [5, 35].

25

1.4.1.3 E-sélectine

La E-sélectine n'est pas exprimée par les cellules endothéliales non activées. Cependant, elle

est rapidement et transitoirement exprimée suite à des stimuli pro-inflammatoires tels que le

TNF, l’IL-1β, la thrombine et le LPS [5, 46]. De manière intéressante, l’hyperglycémie et le

VEGF amène également l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales [47, 48].

L’expression varie selon l’origine des cellules endothéliales [26]. L’expression de la E-

sélectine est habituellement maximale de 3 à 4 heures suite à la stimulation, pour retourner à

un niveau basal en 16 à 24 heures. Le promoteur de la E-sélectine contient quatre éléments de

régulation : trois sites de liaison à NF-κB et un site ATF (Activating transcription factor).

Lorsque les cellules sont stimulées par le TNF, trois voies convergent sur l'activation du

promoteur du gène de la E-sélectine; la voie NF-κB, les voies des kinases JNK et p38. Ces

deux dernières permettent la phosphorylation des facteurs de transcription c-Jun et ATF2,

menant à l’expression de la E-sélectine [5, 17].

La glycoprotéine ESL-1 (E-selectin ligand-1) est un ligand potentiel pour la E-sélectine qui est

présent sur les cellules myéloïdes et lymphoïdes. Cette protéine est une variante d'un

récepteur à activité tyrosine kinase pour FGF (Fibroblast Growth Factor) du poulet, ce qui

suggère qu'il puisse être impliqué dans la signalisation suite à la liaison de la E-sélectine. Il

est, d’ailleurs, situé sur les microvillis (interfaces destinées au contact cellule – cellule) des

leucocytes [49-51].

La signalisation impliquant les sélectines est bidirectionnelle, elle provient de la queue

cytoplasmique des sélectines et également de leurs ligands ou contre-récepteurs activés. Elles

ressemblent en ce sens à la signalisation par les éphrines et leurs récepteurs [52]. On retrouve

dans la queue cytoplasmique de 32 acides aminées de la E-sélectine six résidus sérine et deux

résidus tyrosine (acides aminés 603 et 608 – SwissProt annotated protein record: P16581).

L’agrégation de la E-sélectine suite à son engagement avec un ligand sur des leucocytes

adhérés ou encore avec des anticorps amène plusieurs événements signalétiques. La tyrosine

603 est phosphorylée, ce qui permet le recrutement de SHP2 et la formation d'un complexe de

protéines adaptatrices, Shc•Grb2•Sos menant à l'activation de la MAP kinase ERK par

26

l’intermédiaire de Ras•Raf-1•phospho-MEK [53, 54]. L’agrégation de la E-sélectine mène

également à l'association de la E-sélectine avec l'actine et les protéines associées à l’actine,

comme l'α-actinine, la vinculine, la filamine, la paxilline et la kinase FAK (focal adhesion

kinase) [55]. Ces observations peuvent expliquer la modification de la forme des cellules

endothéliales qui est induite suite à l’agrégation de la E-sélectine avec les anticorps

spécifiques [56]. La signalisation induite par la liaison à la E-sélectine a été rapportée pour la

première fois par Soltesz et collaborateurs en 1997. Ces auteurs ont démontré que l'adhérence

des cellules de carcinome HT-29 à une chimère de E-sélectine–IgG augmentait la

phosphorylation sur tyrosine de diverses protéines, dont c-Src [57]. La E-sélectine soluble peut

activer des neutrophiles directement en augmentant la production des espèces réactives de

l’oxygène et en synergie avec le facteur PAF (platelet-activating factor) pour activer

l’intégrine β2. Ces résultats suggèrent une possibilité de contrôle de l’état d’activation du

neutrophile selon le répertoire des molécules d’adhérence impliquées [58]. Les neutrophiles

roulant sur la E-sélectine peuvent également générer un signal passant par les sentiers ERK et

p38 (en absence de stimulus) pour activer l’intégrine β2. Il est à noter que le signal

d’activation de l’intégrine peut être indépendant des récepteurs couplés aux protéines G

hétérotrimériques (récepteur de chimiokines) [59].

De façon générale, ces études indiquent que l'interaction de la E-sélectine avec son ligand

induit deux signaux différents: un dans les cellules endothéliales et un dans les cellules

adhérantes. Cette signalisation bidirectionnelle règle les interactions secondaires des deux

types de cellules avec des intégrines et mène finalement à former les modifications qui

permettent la transmigration des cellules adhérantes.

La liaison à la E-sélectine joue un rôle important dans l'adhérence des cellules cancéreuses

d’origine épithéliale à l'endothélium [60]. La capacité de la cellule cancéreuse à lier la E-

sélectine sur les cellules endothéliales est directement proportionnelle à leur potentiel

métastatique [61]. D'ailleurs, la cimétidine, une drogue qui empêche l'expression de la E-

sélectine (de manière indépendante de son action anti-histaminique sur les récepteurs H2),

bloque l'adhérence des cellules tumorales à l'endothélium et empêche la formation de

métastases [62]. Plus spécifiquement, l’utilisation d’un antisens c-raf pour empêcher

l’expression de E-sélectine au foie diminue les métastases hépatiques provenant d’un

27

carcinome colorectal [63]. L’utilisation d’un autre antisens, dirigé cette fois contre la

fucosyltransférase génératrice du ligand de la E-sélectine dans cellule cancéreuse, diminue

également les métastases hépatiques [64]. De même, l’utilisation d’une forme recombinante

soluble de E-sélectine (E-sélectine–Immunoglobuline) dans un modèle de métastases

pulmonaire d’un carcinome de côlon a permis de diminuer l’adhérence des cellules

cancéreuses et la formation de métastases [65]. Les cellules de carcinome de poumon de

Lewis amènent l'expression de la E-sélectine sur l'endothélium sinusoïdal du foie, augmentant

ainsi leur potentiel métastatique et suggérant que ceci puisse être à la base de la spécificité de

la colonisation hépatique [66, 67]. En clinique, chez l'homme, le niveau de E-sélectine

circulant est associé à des métastases. En particulier, chez les patients avec cancer du sein, il a

été suggéré qu’à un stade avancé, une concentration élevée de E-sélectine soluble dans la

circulation sanguine (sE-sélectine) est associée aux métastases hépatiques [68]. En revanche,

des niveaux sanguins bas de sE-sélectine ont une valeur pronostique forte pour la survie et

l’absence de récidive chez les patients avec cancer du sein à nodule négatif [69].

1.4.2 Les intégrines

Les intégrines sont des glycoprotéines transmembranaires qui servent de récepteur à la matrice

extracellulaire ainsi qu’à d’autres récepteurs (ou contre-récepteurs) d’adhérence sur une

cellule voisine. Les intégrines sont des hétérodimères composés de deux sous-unités, α et β,

liées de manière non-covalente. Il existe au moins 8 sous-unités β et 18 sous-unités α. La

combinaison spécifique des différentes sous-unités α et β donne la spécificité de l’intégrine

pour son substrat [35, 70]. Ces combinaisons sont représentées à la figure 1-6. L’étude des

souris « knock-out » pour différentes sous-unités ont permis de démontrer la spécificité pour

chaque hétérodimères. En effet, chaque inactivation génique a apporté un phénotype distinct.

Il est intéressant de noter que certaines inactivations ont reproduit des maladies humaines, telle

l’inactivation de β2 qui reproduit la maladie immunitaire du déficit d'adhérence leucocytaire

(LAD-1 : Leukocyte Adhesion Deficiency) [71].

28

Les intégrines ne possèdent pas d’activité kinase intrinsèque. Lorsqu’une intégrine s’engage

avec son ligand, elle s’oligomérise (clustering) et recrute différents adaptateurs et kinases

cytoplasmiques. C’est ce qui s’appelle la signalisation « outside-in ». La signalisation de

l’intégrine est intimement liée au cytosquelette. En effet, la réorganisation du cytosquelette

induite par l’engagement des intégrines pourra favoriser l’oligomérisation de celles-ci [72]. La

signalisation induite par la combinaison ligand – intégrine est spécifique pour les protéines

recrutées et l’intégrine impliquée [73]. Par exemple, l’intégrine α2β1 engagée dans une

matrice de collagène, active la MAP kinase p38α, ce qui augmente la transcription du gène de

collagène de type I [74].

L’affinité d’une intégrine se définit comme la force de l’interaction entre l’intégrine et son

ligand. Une augmentation de l’avidité se définit comme une augmentation de la force de

l’adhérence de la cellule, qui peut être induit par une oligomérisation des intégrines plutôt que

par une augmentation d’affinité de celles-ci. L’affinité et l’avidité des intégrines peuvent êtres

modifiés par différents signaux intracellulaire, qui amèneront la liaison de différentes

protéines au domaine cytoplasmique et un changement de conformation de l’intégrine. C’est

la signalisation « inside-out » [70]. Les études sur la structure tridimensionnelle des intégrines

suggèrent qu’à l’état de repos, la portion extracellulaire est repliée avec la « tête » de

l’intégrine près de la membrane. Suite à l’activation, les portions juxta-membranaires des

sous-unités se déplacent, ce qui amène la « tête » de l’intégrine à se redresser et à exposer de

nouveaux épitopes [75].

Les différentes intégrines sont exprimées différentiellement au cours du développement et de

la vie adulte. De plus, certaines conditions physiologiques ou pathologiques peuvent modifier

ce patron d’expression (telle la réparation tissulaire ou le cancer). Il existe un autre niveau de

contrôle, celui des variants d’épissage, autrement connu sous le nom d’isoforme. En effet,

plusieurs sous-unités α et β possèdent des isoformes dans la portion extra- ou intracellulaire.

Ces variants permettraient de moduler l’affinité ou la signalisation d’une intégrine particulière

[76].

29

Figure 1-6 Les différents hétérodimères d’intégrines et leurs substrats

Les intégrines de la famille de β1, β4 et αv lient différentes composantes de la matrice tels la laminine, la fibronectine, le collagène et la vitronectine. L’intégrine β3 peut lier en plus certaines composantes sériques, tel le facteur de von Willebrand. La famille β2 est spécifique aux leucocytes et médie l’adhérence cellule – cellule par l’intermédiaire des CAMs (Cell Adhesion Molecules). Adapté de [76].

30

Le patron d’expression des intégrines change dans une cellule cancéreuse. Il en va de même

pour l’affinité et l’avidité des intégrines exprimées. Par exemple, αvβ3 est fortement

exprimée dans le mélanome malin, α6β4 est induite dans les carcinomes thyroïdiens et

l’expression de α5β1 diminue la tumorigénèse de lignées cellulaires. Les intégrines jouent un

rôle dans la migration des cellules cancéreuses (tel que discuté dans la section 1.6) ainsi que

dans leur survie [70]. L’activation de l’intégrine β1 par la matrice amène, chez la cellule

cancéreuse du poumon, une diminution de l’expression de ICAM-1 [77]. Les différentes

familles de molécules d’adhérence sont donc reliées entre elles.

1.4.2.1 L’intégrine bêta 4

L’intégrine β4 est différente des autres sous-unités β. En effet, elle est exprimée

principalement sur la membrane basale des épithéliums et elle lie la laminine. Son domaine

cytoplasmique d’environ 1000 acides aminés constitue la principale différence. Il contient

deux paires de répétitions fibronectine de type III séparées par un court segment et permet la

liaison des filaments intermédiaires dans les hémidesmosomes. Dans les cellules en

migration, l’intégrine β4 se dissocie des hémidesmosomes et s’associe à l’actine dans le front

migratoire de la cellule [78].

L’engagement de l’intégrine β4 amène la phosphorylation de son domaine cytoplasmique et

l’activation de différents sentiers. La phosphorylation de la tyrosine 1526, situé dans le

troisième domaine fibronectine de type III, lie le domaine PTB (Phosphotyrosine binding

domain) de Shc [79]. Shc recrute l’adaptateur Grb2 et active le sentier ERK par

l’intermédiaire de Ras et le sentier JNK par l’intermédiaire de Rac, Ras et PI3K [80]. La

phosphorylation de la tyrosine 1494, également situé dans le troisième domaine fibronectine

de type III, mène à l’activation du sentier PI3K (phosphoinositide-3-OH kinase), par

l’intermédiaire de IRS (insulin receptor substrate), une protéine sans activité kinase qui

permet d’organiser des complexes signalétiques [81]. L’activation de PI3K a été démontrée

comme suffisante pour promouvoir la migration de la cellule cancéreuse [82]. L’intégrine

31

α6β4 active le sentier PI3K et promeut l’invasion des carcinomes, en amenant la formation de

lamellipodes [83]. De plus, l’intégrine β4 coopère avec le récepteur à activité tyrosine kinase

ErbB-2, de manière indépendante de son domaine extracellulaire, pour activer le sentier PI3K

et favoriser l’invasion [84]. La formation des lamellipodes et la migration est également

médié par RhoA, qui est activé par l’intégrine β4 par un mécanisme impliquant l’AMPc [85,

86].

L’intégrine β4 est associée à l’agressivité de certaines tumeurs. En effet, son expression est

maintenue ou augmentée dans les carcinomes de la peau, du sein, du rein et du côlon, pour ne

nommer que ces derniers. L’agressivité a été associée à une augmentation du potentiel invasif

et migratoire des cellules, qui serait due à une relocalisation de l’intégrine des

hémidesmosomes vers les lamellipodes [87]. De plus, l’intégrine peut stimuler la survie des

cellules cancéreuses ayant perdu p53 en stimulant le sentier AKT/PKB [88]. L’activation du

sentier AKT/PKB par la tyrosine 1494 de l’intégrine β4 dans un carcinome du sein permet

également d’augmenter la traduction du VEGF, ce qui a un effet autocrine qui stimule la

survie et la progression du carcinome [89].

1.4.3 Les cadhérines

Les cadhérines sont une famille de protéines transmembranaires impliquées dans l’interaction

homotypique cellule–cellule. Classiquement, le domaine extracellulaire est composé de cinq

répétitions en tandem, suivi d’un segment transmembranaire et d’une portion cytoplasmique

d’environ 150 acides aminés. La portion extracellulaire d’une cadhérine interagit en présence

de calcium avec la portion extracellulaire d’une autre cadhérine sur la cellule voisine. Les

cadhérines se localisent au niveau membranaire dans les jonctions adhérentes. La portion

cytoplasmique permet de lier le cytosquelette d’actine par l’intermédiaire des caténines. Les

caténines constituent un groupe de trois protéines, α- β- et γ-caténine (également connue

comme la plakoglobine). La β-caténine lie le domaine cytoplasmique de la cadhérine, l’α-

caténine se lie à la β-caténine et lie à son tour directement l’actine et l’α-actinine. La

32

γ-caténine peut parfois remplacer la β-caténine. De plus, l’association entre les cadhérines et

l’actine peut être bloquée par une phosphorylation de la β-caténine [35].

La VE-cadhérine (Vascular endothelial-specific cadherin) est impliquée dans le maintien de

l’intégrité de l’endothélium vasculaire. La migration transendothéliale des monocytes a

généralement lieu entre les bordures latérales des cellules endothéliales. L’adhérence à une

couche endothéliale et la migration transendothéliale des monocytes sous un flux circulant

défait de manière réversible et localisée les complexes VE-cadhérines [90].

La perte de la E-cadhérine (Epithelilal-cadherin) est associée à une perte de cohésion

tissulaire et un gain d’invasivité. Dans le processus cancéreux, la perte de la E-cadhérine est

associée à un mauvais pronostic et un phénotype métastatique. La perte des caténines peut

amener le même résultat. D’ailleurs la protéine APC (Adenomatous polyposis coli, un gène

suppresseur de tumeur), impliquée dans les cancer colorectaux, interagit normalement avec la

β-caténine libre pour réguler sa dégradation. Lors d’une perte ou d’une mutation de APC, la

β-caténine s’accumule et amène une augmentation de l’expression génique, ce qui agit comme

un oncogène. Ainsi, l’implication des cadhérines-caténines dans la progression tumorale n’est

pas seulement au niveau de l’adhérence et de la migration, mais également au niveau de la

survie et de la croissance néoplasique [91]. La force de l’interaction entre les cadhérines est

suffisante pour empêcher un agrégat cellulaire de se séparer, même en présence d’un flux

circulant de la force de celui présent dans les artères. Ainsi, la perte de la E-cadhérine peut

faciliter la dissémination des cellules cancéreuses d’une tumeur [92].

33

1.4.4 La superfamille des Immunoglobulines – Molécules d’adhérence cellulaires (Ig–CAM)

Une grande variété de récepteurs cellulaires sont inclus dans cette famille. De manière

générale, les protéines de cette famille possèdent une ou plusieurs copies d’une structure Ig,

une structure compacte avec deux cystéines séparées par 55 à 75 acides aminés arrangés en

deux feuillets β anti-parallèles. Souvent, les membres de cette famille possèdent également

une ou plusieurs copies du domaine de type III de répétition de fibronectine (fibronectin type

III repeat). Ces récepteurs possèdent une portion transmembranaire unique et une portion

cytoplasmique [35].

1.4.4.1 ICAM (Intercellular Adhesion Molecule)

Présentement, cinq membres de la famille ont été identifiés : ICAM-1 (CD54), ICAM-2

(CD102), ICAM-3 (CD50), ICAM-4 et ICAM-5 (telencephalin). ICAM-1 est exprimée par

différentes cellules, dont les cellules endothéliales, les leucocytes et certains carcinomes.

ICAM-1 lie l’intégrine αLβ2 (LFA-1 ou CD11a/CD18) ainsi que αMβ2 (Mac-1 ou

CD11b/CD18) [93]. Divers agonistes pro-inflammatoires (IL-1β, TNF, LPS), le VEGF et le

peroxyde augmente tous l’expression de la molécule [25, 26, 48]. ICAM-1 est impliquée dans

l’adhérence des neutrophiles à l’endothélium, ainsi que dans l’adhérence et la migration des

lymphocytes à travers les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux [59, 94].

34

1.4.4.2 VCAM (Vascular cell adhesion molecule)

La protéine VCAM-1 (CD106) est exprimée sur l’endothélium vasculaire activé par l’IL-1, le

LPS ou le TNF. Elle permet l’adhérence des monocytes, lymphocytes, basophiles et

éosinophiles à l’endothélium. Les neutrophiles ne peuvent s’y lier, car ils ne possèdent pas le

contre-récepteur de VCAM-1, l’intégrine α4β1 (VLA-4 ou CD49d/CD29) [26, 93].

VCAM-1, tout comme les sélectines, peut être libérée des cellules sous forme soluble. La

forme soluble de VCAM-1, retrouvée dans le plasma des femmes avec cancer du sein, semble

être un marqueur de l’angiogénèse. Sa détection permet de donner un indice sur l’évolution de

l’angiogénèse tumorale du cancer du sein [95].

L’adhérence des leucocytes à l’endothélium par VCAM-1 provoque une structure d’ancrage à

la membrane avec le recrutement des protéines moésine et ezrine (famille des protéines ERM

– Ezrin, Radixin & Moesin – qui régule la dynamique d’actine corticale). Il n’est pas encore

clair comment le domaine cytoplasmique de 19 acides aminés de VCAM-1 peut signaler.

Cependant, l’agrégation de VCAM-1 conduit à l’activation de p38 par l’intermédiaire de Rac,

pour ultimement amener à la modulation de l’intégrité de l’endothélium. Les sentiers activés

suite à l’engagement de VCAM-1 régule ainsi les interactions endothéliales cellule – cellule

pour permettre une migration transendothéliale [96, 97]. Voir le modèle à la figure 1-7.

35

Figure 1-7 Représentation schématique des sentiers signalétiques induit par VCAM-1

Suite à l’adhérence médiée par les intégrines, il y a agrégation de VCAM-1 et signalisation par des mécanismes encore inconnus. La signalisation implique l’activation d’un sentier dépendant de Rac, qui amène la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS – Reactive Oxygen Species) et l’activation de p38. Le lien entre p38 et la VE-cadhérine reste à faire. Adapté de [96]

36

1.5 Les voies MAP kinases

Les voies MAP kinases font partie des systèmes de signalisation des cellules eucaryotes les

plus répandus. Toutes les cellules eucaryotes ont différents sentiers MAP kinases qui

répondent spécifiquement à différents stimuli. Il existe trois familles principales de MAPK, le

sentier ERK (extracellular signal-regulated kinase) et les deux sentiers de stress, les SAPK

(Stress activated protein kinase) JNK (c-jun NH2-terminal kinase) et p38. Ces sentiers

possèdent diverses appellations, ils sont retrouvés au tableau 1-2.

Les sentiers sont composés par un module MAP kinase. Le module est constitué de trois

kinases successives. Voir figure 1-8. Les MAPKs (Mitogen activated Protein Kinases) sont

des sérines/thréonines kinases qui possèdent un motif Thr-X-Tyr conservé dans la boucle

d’activation du sous-domaine kinase VIII. L’identité du X dans ce motif détermine

l’appartenance à une des familles. Ainsi Thr-Gly-Tyr fait partie des kinases p38, Thr-Glu-Tyr

fait partie des kinases ERK et Thr-Pro-Tyr fait partie des kinases JNK. La MAPK est

phosphorylée par une kinase à double spécificité (thréonine/tyrosine), la MAPK-kinase (MKK

ou MEK pour MAPK/ERK-kinases). Les MKKs possèdent également un motif conservé dans

la boucle d’activation du sous-domaine kinase VIII. Les MKK sont phosphorylées par les

MAPK-kinase-kinase ou MAP3K. Les MAP3K sont pour leur part régulées par une variété

d’activateurs et d’inhibiteurs. Il existe diverses appellations pour les différentes MKK et

MAP3K, dont les plus communes se retrouvent au tableau 1-3 et 1-4.

37

Tableau 1-2 Nomenclature des MAP kinases

Adapté de [98] et de [99]

38

Figure 1-8 Le coeur du module MAP kinase

39

Divers signaux convergent vers le module MAPK-kinase-kinase (MAP3K)∏ MAPK-kinase (MKK)∏ MAPK, qui recrutent alors des réponses appropriées. Adapté de [98]

Tableau 1-3 Nomenclature des MKK

Adapté de [98] et de [99]

Tableau 1-4 Nomenclature des MAP3K

Adapté de [98] et de [99]

40

41

Les voies MAP kinases fonctionnent toutes de la même façon et partagent quatre principes

généraux [98] :

1- Les MAPK sont des kinases « proline-dirigées ». Cependant, la sélectivité du substrat

est obtenue grâce à des sites de reconnaissance spécifique à la kinase.

2- Les composantes du module MAPK ne sont pas exclusives à un seul module. Ainsi,

une MKK peut phosphoryler différentes MAPK. De la même façon, toutes les

composantes d’un module MAPK peuvent être contrôlées par des signaux différents.

3- La spécificité d’un sentier est obtenue avec des protéines d’échafaudage (Scaffold

proteins). Ces dernières peuvent lier et séquestrer certaines composantes du module et

être recrutées par certains types de signaux.

4- Pour activer le module, la régulation des MAP3K implique un recrutement

membranaire, une oligomérisation et une phosphorylation.

Les MAPK peuvent être activés par divers agonistes se liant à des récepteurs à activité

tyrosine kinase, à des récepteurs à sept domaines trans-membranaires couplés aux protéines-G.

Ils peuvent également être activés par les cytokines ainsi que par les stress physiques ou

chimiques. Ils ont des effets sur l’apoptose, la transformation oncogénique, le développement,

l’inflammation, la réponse immune et sur divers autres phénomènes [98, 100]. La réponse à

un stimulus donné pourra varier selon le type et le contexte cellulaire. Les modules ont une

organisation spatiale et temporelle dans la cellule. Cependant, les sentiers MAPKs ne sont ni

rectilignes, ni hermétiques. Ils peuvent interagir avec d’autres sentiers « parallèles », ce qui

est connu sous le nom de cross-talk [101, 102].

1.5.1 ERK (extracellular signal-regulated kinase)

Le sentier ERK est impliqué dans différents phénomènes physiologiques et pathologiques. Il

est présenté à la figure 1-9. Citons que 30% de tous les cancers humains confondus ont une

42

mutation dans Ras (en amont du module ERK). Ce taux monte à 90% dans le cancer

pancréatique et à 50% dans le cancer du côlon. La MAP3K Raf est également mutée dans une

grande variété de cancer et jusqu’à 66% dans les mélanomes malins [103].

Un résultat intéressant a été obtenu par le groupe de Liliana Ossowski [104]. Ils ont démontré

que le ratio d’activité entre ERK et p38 était déterminant pour passer d’un phénotype de

croissance tumorale (ERK>p38) vers un phénotype d’arrêt de croissance, de dormance

tumorale (p38>ERK). Les cellules cancéreuses dormantes sont difficilement identifiables

cliniquement et sont souvent responsables de l’apparition de métastases tardives après une

période d’apparente rémission. Le passage d’un état de croissance vers un état de dormance

implique les récepteurs membranaires (dont uPAR –urokinase plasminogen activator

receptor- et l’intégrine α5β1). Ce passage suppose que l’arrivée dans un nouvel organe

(métastase) peut changer les récepteurs membranaires utilisés et ainsi changer le statut de la

cellule cancéreuse de la croissance vers la dormance.

1.5.2 p38

La kinase p38 est l’équivalent chez la levure S. cerevisiae de la MAPK Hog1, la kinase

sensible à l’osmolarité. L’appellation SAPK2 (Stress activated protein kinase) se rapporte aux

isoformes α et β de la protéine p38. La famille inclut également les kinases p38γ (SAPK3) et

p38δ (SAPK4). La voie p38 est fortement activée par les stress (lumière UV, choc thermique,

stress oxydant, agents chimiothérapeutiques), les cytokines inflammatoires (TNF, IL-1, LPS),

et divers facteur de croissance comme le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) [98,

100, 105]. Les composés pyrinidyl imidazole tels que le SB203580, se lient spécifiquement à

p38 [106]. L’inhibiteur SB203580 fonctionne en compétitionnant avec l’ATP au niveau de

son site de liaison sur la kinase p38, ce qui bloque son activité [107]. L’inhibiteur est,

d’ailleurs, spécifique aux isoformes p38α et p38β [108].

43

Figure 1-9 Représentation schématique de la cascade ERK

Divers signaux convergent vers le module Raf•MEK•ERK. KSR (Kinase suppressor of Ras) est une protéine d’échafaudage en amont de MEK et qui est nécessaire à l’activation du module, tout comme MP-1 qui lie préférentiellement MEK1 et ERK1. ERK phosphoryle diverses protéines qui régulent les protéines du cytosquelette, le métabolisme, le remodelage de la chromatine et divers facteurs de transcription. Adapté de [103] et de [99]

44

La MAPK p38 est activée par deux MKKs, soit MKK3 et MKK6. MKK6 active toutes les

isoformes de p38 tandis que MKK3 active les isoformes α, γ et δ. MKK4, qui active la voie de

JNK, active l'isoforme α de p38 [109-112]. Les MAP3K et leurs activateurs sont multiples

avec plusieurs branchements. Pour une synthèse, voir l’article de revue écrit par John M.

Kyriakis & Joseph Avruch [98].

L’activation du sentier p38 mène à l’activation de différentes cibles nucléaires et

cytoplasmiques. Les cibles nucléaires incluent des facteurs de transcription tels ATF-2,

GADD153 et Elk-1, tandis que les cibles cytoplasmiques incluent Mapkapk-2/3 (MAPK-

activated protein kinase 2/3) et MNK [98, 100]. L'activation de MAPKAPK2/3 par p38 mène

à la phosphorylation de la petite protéine de stress HSP27, qui module la dynamique d'actine

et amène la formation de fibres de tension [113]. Dans les cellules HeLa, la phosphorylation

de HSP27 peut également résulter de PRAK (p38-regulated/activated kinase), une autre cible

cytoplasmique de p38 [114].

Le sentier p38 est impliqué dans la réponse inflammatoire, dans l’induction de l’expression de

cytokines et de molécules d’adhérence. Le sentier p38 est également impliqué dans la

régulation de l’apoptose induite, entre autres, par le stress oxydant et les agents

chimiothérapeutiques [115, 116]. Il joue également un rôle, de concert avec la kinase FAK,

dans la migration des cellules endothéliales induite par le VEGF, une étape importante de

l’angiogénèse [105, 117]. Dans la progression tumorale, l’invasion des tissus est un processus

qui implique la production de protéase, afin de dégrader la matrice environnante. Parmi ces

protéases, l’uPA (urokinase plasminogen activator), une sérine protéase, ainsi que son

récepteur, uPAR, sont associés à la progression tumorale. Dans le cancer du sein, l’activité

basale de p38 est élevée et est corrélée avec le caractère invasif des cellules. De plus, p38α est

impliquée dans la stabilisation des ARNm de uPA et uPAR, deux molécules associées à un

mauvais pronostic [118]. Le même groupe a démontré que l’activité basale plus élevée de p38

était associée à la liaison de l’intégrine αv à la vitronectine et ce, seulement dans des cellules

malignes [119].

45

1.6 La migration cellulaire

L’analyse de la migration cellulaire donnera des résultats différents selon l’environnement

dans lequel elle est étudiée. En effet, l’invasion d’une cellule dans un tissu environnant et la

migration transendothéliale d’un leucocyte soumis à un flux sont deux phénomènes ayant des

contraintes différentes et donc, des mécanismes qui peuvent varier.

1.6.1 Les points focaux d’adhérence et le cytosquelette

L’interaction d’une cellule avec sa matrice environnante se fait par les différents récepteurs

d’adhérence exprimés à la membrane. On y retrouve, entre autres, les intégrines pour lier la

matrice extracellulaire (MEC) [70, 120], CD44 (une famille de molécules liant les

hyaluronanes, qui est impliqué dans l’adhérence, la migration et les métastases [121]), ainsi

que des protéases, telles certaines MMPs (matrix metallproteinase) [122]. L’interaction avec

la matrice se fait de manière organisée, c’est-à-dire que les récepteurs se regroupent en points

focaux d’adhérence, où les différents récepteurs permettent de faire le lien entre la MEC et le

cytosquelette [123]. De plus, les points focaux d’adhérence sont des structures dynamiques,

signalétiques et sensibles aux modifications de l’environnement.

En commencant par l’extérieur de la cellule, les points focaux d’adhérence débutent par la

liaison et l’oligomérisation des intégrines spécifique à une composante de la MEC. Par

exemple, l’intégrine α5β1 lie la fibronectine, αvβ3, la vitronectine, α6β1 et α6β4 la laminine.

Ces intégrines recrutent diverses molécules pour faire le lien avec le cytosquelette d’actine.

Ce sont les protéines de la plaque d’adhérence. On y retrouve, entre autres, la vinculine, la

taline, la paxilline et l’α-actinine. L’affinité, le recrutement, la localisation des intégrines et

des protéines de la plaque d’adhérence peuvent être modifiés par phosphorylation. En ce sens,

les points focaux d’adhérence contiennent diverses kinases, dont FAK, Src, ILK (Integrin-

linked kinase), PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) et les membres de la famille des petites

46

GTPases Rho. Les points focaux d’adhérence assurent la liaison au cytosquelette d’actine.

On y retrouve donc, aussi, les filaments d’actine ainsi que certaines protéines qui en régulent

la structure et l’organisation. Ces protéines incluent des protéines de coiffe, de polymérisation

et de branchement de l’actine [35, 123-127].

La présence de nombreux points focaux d’adhérence permet d’organiser les réseaux d’actine

en fibre de tension. Ces dernières sont des structures rigides, associées à la contractilité de la

cellule. De manière opposée, l’actine corticale est composée d’un réseau dynamique qui

permet la formation de structures telles les filipodes et lamellipodes. Les points focaux

d’adhérence se font et se défont constamment dans une cellule. Ces deux processus se

produisent de manière contrôlée et dirigée. Il en va de même pour l’actine et ses différentes

structures. Plus une cellule est attachée fortement avec de nombreux points focaux

d’adhérence, moins elle défait ses contacts et migre. Inversement, moins une cellule est

attachée fortement, plus facilement elle pourra se détacher et migrer, jusqu’au point ou ses

points focaux d’adhérence seront trop faibles et peu nombreux pour supporter une adhérence

forte et ainsi, une migration [120, 124, 128]. Cette relation entre la vitesse de migration et la

force de l’adhérence est exprimé par une courbe en forme de cloche, décrite par Palecek et

collaborateurs [129].

1.6.1.1 FAK (Focal Adhesion Kinase)

À l’origine, la kinase FAK a été identifiée comme un substrat tyrosine phosphorylé dans des

cellules transformées avec l’oncogène v-src. Son caractère essentiel a été démontré par les

travaux qui ont rapporté que l’inactivation du gène dans une souris, fak -/-, est létale au stade

embryonnaire. FAK est impliquée dans la signalisation découlant de l’adhérence des

intégrines. Elle est impliquée dans diverses cascades de signalisation menant, entre autres,

vers l’adhérence et la migration [130].

Les travaux du groupe de Schlaepfer [131] ont démontré que FAK assure le lien physique

entre certaines intégrines et les récepteurs de l’EGF (epithelial growth factor) et du PDGF

47

(Platelet-derived growth factor). Ainsi, elle permet d’intégrer les signaux du PDGF ou de

l’EGF et des intégrines pour promouvoir la migration. La kinase devient un noeud

signalétique dans le « cross-talk » entre les facteurs de croissance et les intégrines.

FAK est également surexprimée, tôt, dans la progression de certains cancer [130].

1.6.2 L’invasion

La première revue intégrée sur les mécanismes moléculaires de la migration a été publiée en

1996 par Lauffenburger et Horwitz [132]. Les différentes études qui ont porté sur la migration

des cellules cancéreuses, semblent indiquer que les mêmes étapes ont été conservées, c’est-à-

dire :

1- La protrusion d’un bord de la cellule : La cellule se polarise, l’actine corticale se

polymérise et projette la membrane vers l’avant. C’est l’apparition des filipodes et le

début de la signalisation.

2- Formation des points focaux d’adhérence et des interactions cellule – matrice : Les

intégrines reconnaissent les ligands dans la MEC et s’oligomérisent. Elles recrutent

alors les protéines de la plaque d’adhérence, les kinases et les protéines liant l’actine.

Finalement l’actine s’y lie, ce qui forme un point d’ancrage du cytosquelette.

3- Le recrutement des protéases : Les sites d’interaction avec la MEC amènent le

recrutement de protéases, telles les MMPs. Ces dernières sont activées et clivent la

matrice environnante, en exposant de nouveaux sites et en libérant l’espace pour la

migration [122]. (Cette étape n’était pas décrite pour la migration en deux dimensions

par Lauffenburger)

4- Contraction de la cellule : La myosine génère la force de contraction sur les fibres

d’actines polymérisées, ce qui permet d’avancer l’arrière de la cellule.

48

5- Détachement de l’arrière de la cellule : Les points focaux d’adhérence se défont à

l’arrière de la cellule et les différentes composantes sont recyclées vers le bord

avançant de la cellule.

Ces étapes sont schématisées à la figure 1-10

Une cellule cancéreuse pour devenir invasive, doit généralement perdre ou acquérir des

caractéristiques. Par exemple, la perte de la E-cadhérine dans un épithélium va amener une

transition épithélio-mésanchymateuse. Cette transition modifie le phénotype de la cellule vers

des caractéristiques mésenchymales, moins structurés et plus mobiles [133]. La cellule pourra

alors migrer tel que décrit ci-haut. Il existe également un autre type de migration, la migration

de type amibe. Dans ce type de migration, les points focaux d’adhérence sont peu nombreux

et il n’y a pas de fibre de tension d’actine. La migration est permise par l’actine corticale.

Celle-ci permet à la cellule de se déformer rapidement avec une succession de protrusions et

contractions de la membrane tout en créant que de faibles interactions avec le substrat. Ce

type de migration est utilisé par les leucocytes et les cellules de certains types de cancers, tels

les lymphomes [124].

Une des particularité de la migration des cellules cancéreuses est leur plasticité. En effet, elles

peuvent s’adapter à un nouvel environnement ou à une nouvelle contrainte, en modifiant le

type de migration utilisée. Cette caractéristique leur fournit un mécanisme d’évitement à

diverses thérapies qui viserait une étape en particulier de la migration. L’utilisation de

drogues pour inhiber les protéases, le blocage des intégrines ou des cadhérines, en empêchant

un type de migration, peut amener ces transitions, bien qu’elles peuvent survenir de manière

spontanée [124].

La plasticité dans les mécanismes de migration est illustrée à la figure 1-11. On y retrouve en

plus de la migration des cellules isolées, la migration collective. C’est-à-dire qu’un amas de

cellule, ou un feuillet, peut utiliser les même mécanismes de migration pour envahir un tissu,

sans avoir à disséminer des cellules isolées.

49

Figure 1-10 La migration cellulaire

Représentation schématique des différentes étapes de la migration d’une cellule dans une matrice en trois dimensions. Tiré de [124]. Reprinted and translated by permission from Nature Reviews Cancer [124] copyright (2003) Macmillan Magazines Ltd.

50

Figure 1-11 Plasticité de la migration tumorale

Les cellules cancéreuses adaptent leur mode de migration selon les modifications qu’elles subissent. Ainsi, la perte de l’interaction cellule-cellule tend vers une migration de type mésenchymale, tandis que la perte d’intégrines ou de protéases amène une migration de type amibe. Tiré de [124]. Reprinted and translated by permission from Nature Reviews Cancer [124] copyright (2003) Macmillan Magazines Ltd.

51

1.6.3 La migration transendothéliale

La particularité de la migration transendothéliale tient à deux facteurs. Premièrement, le

leucocyte ou la cellule cancéreuse qui migre doit composer avec le flux circulant (une

contrainte absente des tissus) et interagir avec une cellule différente (la cellule endothéliale).

C’est pourquoi les molécules d’adhérence qui permettent un contact hétérotypique cellule –

cellule sont impliquées dans ce type de migration. Deuxièmement, l’endothélium vasculaire

doit se modifier de manière temporaire, afin de retrouver et de conserver son intégrité suite à

la migration.

La migration du leucocyte sur la cellule endothéliale utilise des étapes similaire à la migration

mésenchymateuse. Une fois la cellule adhérée et sortie du flux circulant, elle devient

polarisée, elle forme des points focaux d’adhérence puis rétracte le pôle arrière [134]. Les

deux principales différences tiennent en l’absence du rôle des protéases pour dégrader la

matrice et aux mécanismes d’activation des intégrines, qui peuvent être activées par les

chimiokines et les sélectines. De plus, des travaux sur la migration transendothéliale des

monocytes ont démontré l’implication de l’intégrine αvβ3 pour moduler l’affinité de

l’adhérence de l’intégrine αLβ2 à ICAM-1. Ainsi on peut observer une communication entre

les deux intégrines [135].

Le contact des monocytes sur les cellules endothéliales modifie de manière transitoire les

cellules endothéliales. En plus de défaire le complexe VE-cadhérine [90], les monocytes

amènent une diminution transitoire de l’activité de FAK ainsi que des modifications du

cytosquelette dans la cellule endothéliale [136]. Ainsi, la cellule endothéliale peut modifier

son organisation pour faciliter la migration transendothéliale.

52

1.7 Les métastases

L’étude des métastases a connu deux courants majeurs. Le premier a découlé de l’hypothèse

de Paget, proposé en 1889, sur la spécificité des métastases selon l’organe rencontré. Le

deuxième courant a été proposé en 1929 par James Ewing. Celui-ci a supposé que la

dissémination métastatique était seulement due à des facteurs mécaniques, résultant de la

structure anatomique des vaisseaux sanguins. À partir des années 1970, des données ont

commencé à s’accumuler pour démontrer la sélectivité des métastases. De nos jours, ces deux

courants se rencontrent, principalement par les observations de Leonard Weiss [2]. En effet,

les métastases régionales peuvent s’expliquer par le drainage lymphatique dans les nodules

environnant la tumeur, mais certaines métastases dans des organes éloignés s’expliquent par la

permissivité de ce milieu pour la croissance des cellules métastatiques.

L’apparition d’une métastase dépend d’une série d’étapes consécutives inter-reliées. Toutes

ces étapes doivent être réussies pour avoir la formation d’une métastase. Ces dernières sont

schématisées à la figure 1-12.

Une étape alternative a été décrite pour la cascade métastatique au poumon. En effet, les

travaux de Al-Mehdi et collaborateurs ont démontré que les cellules cancéreuses peuvent

croître localement dans le vaisseau sanguin, sans extravasation. Ainsi, de manière précoce, la

micrométastase se retrouve dans le vaisseau sanguin et non dans le stroma pulmonaire [137] .

La formation des métastases est en fait un processus très inefficace. Très peu de cellules qui

quittent la tumeur primaire arriveront à former une métastase cliniquement visible. Parmi ces

étapes, surtout les dernières sont limitantes et sont responsables de cette inefficacité. En effet,

les cellules circulantes vont pratiquement toutes s’arrêter dans le premier lit vasculaire qu’elles

rencontreront. La grosseur de la cellule cancéreuse par rapport à celle des capillaires est

souvent suffisante pour permettre l’arrêt et l’extravasation dans un nouvel organe. Une fois

implantées dans le nouvel environnement, certaines cellules vont mourir, d’autres proliférer

jusqu’à induire l’angiogénèse donnant naissance à une tumeur volumineuse. Certaines

cellules cancéreuses vont rester dans un état de latence. Ces cellules dormantes (ou solitaires)

53

sont insensibles à la chimiothérapie traditionnelle qui vise les cellules à division rapide. Elles

sont responsables de l’apparition de métastases tardives (quelques mois ou années après la

tumeur primaire) [138].

De manière similaire aux gènes suppresseurs de tumeurs, il existe des gènes suppresseurs de

métastases. Ils sont énumérés au tableau 1-5. Ces derniers se caractérisent par une diminution

d’expression dans les cellules métastatiques par rapport aux cellules tumorales non

métastatiques. Une fois réintroduit dans une lignée tumorale, la formation de métastases in

vivo est réduite, sans toutefois réduire la tumorogénicité [139]. Contrairement aux gènes

suppresseurs de tumeurs qui sont souvent reliés au cycle cellulaire (par exemple Rb), les gènes

suppresseurs de métastases sont plutôt reliés aux sentiers de signalisation. Il est intéressant de

remarquer que les trois sentiers MAP kinases, ERK, JNK et p38, sont touchés par les gènes

suppresseurs de métastases.

1.7.1 Spécificité du processus métastatique

Malgré les étapes communes de la progression métastatique, chaque type de cancer aura une

stratégie différente pour y parvenir. Ainsi, les protéases utilisées pour l’invasion et

l’intravasation peuvent différer pour le cancer du poumon et celui du côlon. De la même

façon, chaque étape du processus métastatique peut avoir une spécificité selon le type de

tumeur et l’organe visé. Ainsi, les chimiokines et leurs récepteurs permettent de cibler le

cancer du sein aux nodules lymphatiques et au poumon [30] et la E-sélectine permet de cibler

le cancer du côlon au foie [67]. Le tableau 1-6 compile les différents phénotypes observés

chez des cancer humains, l’intérêt serait de pouvoir utiliser ces caractéristiques afin de

caractériser le potentiel métastatique de manière pronostique.

Les sites de métastases varient selon l’origine du cancer. L’annexe A regroupe ces

informations pour 16 différents cancers humains.

54

Figure 1-12 La cascade métastatique

Les étapes de la progression métastatique. a) La tumeur se forme localement. b) Les cellules deviennent invasives, elles traversent la membrane basale et migrent. Les cellules entrent dans la circulation par c) l’intermédiaire du système lymphatique ou d) directement dans le système sanguin. e) Les cellules survivent en circulation s’arrêtent et entrent dans un nouvel organe. Les deux dernières étapes sont parfois appelées la colonisation métastatique, f) les cellules isolées survivent dans le nouvel

55

organe et g) commencent à croître et se vascularisent pour former une métastase visible. Adapté de [139]

Tableau 1-5 Gènes suppresseur de métastases

Adapté de [139].

56

Tableau 1-6 Phénotype métastatique de cancer humains

↑ = surexpression, ↓ = répression, — = aucun changement. Adapté de [140]

1.7.2 Approche thérapeutique

Trois raisons expliquent la complexité de traitement du cancer et de ses métastases.

Premièrement, les tumeurs, bien que d’origine clonale, deviennent rapidement hétérogènes.

Elles deviennent composées de sous-populations de cellules avec des potentiels prolifératifs,

angiogéniques, invasifs et métastatiques différents. Deuxièmement, bien que la métastase peut

être également d’origine clonale, l’instabilité génétique amène rapidement de nouvelles sous-

populations hétérogènes. Finalement, l’efficacité de la métastase dépend des multiples

interactions des cellules cancéreuses avec l’environnement. La cellule métastatique peut

s’adapter et être modifiée par les réponses homéostatiques spécifiques d’un organe [141].

Les traitements traditionnel du cancer, c’est-à-dire la chirurgie, l’irradiation et la

chimiothérapie, ont peu d’effets sur les métastases. La fenêtre thérapeutique pour le

traitement des métastases peut être ciblée sur toutes les étapes du processus métastatique. Le

tableau 1-7 situe différents traitement par rapport à l’étape du processus métastatique qu’ils

peuvent inhiber.

Faute de pouvoir traiter la métastase avant sa formation, l’intérêt est peut-être de le traiter

comme une maladie chronique et de l’empêcher de proliférer. [142]

57

58

Tableau 1-7 Approche thérapeutique contre la cascade métastatique

Abréviations : A, adhérence; D, dégradation (de la matrice); M, migration; R, récepteur de facteur de croissance; C, chirurgie; IR, irradiation, CH, chimiothérapie Adapté de [143].

59

1.8 Objectifs du projet de recherche

Le but de ce travail de doctorat est de caractériser le rôle des interactions cellule cancéreuses –

cellules endothéliales dans le processus métastatique. Principalement, ce projet de recherche a

été élaboré à partir de trois observations. Premièrement, les travaux de Read et collaborateur

[17] impliquait la kinase p38 dans le contrôle de l’expression de la E-sélectine.

Deuxièmement, la liaison à la E-sélectine a été liée à l’adhérence des cellules cancéreuses à

l’endothélium [60, 144, 145]. La capacité de lier la E-sélectine corrélait avec le potentiel

métastatique de cellules cancéreuses du côlon [61]. Finalement, les travaux de Soltesz et

collaborateur [57] laissait sous-entendre une signalisation dans la cellule cancéreuse par

l’intermédiaire de la liaison à la E-sélectine. À partir de ces résultats, les objectifs suivants ont

été fixés :

1- Vérifier le rôle de la kinase p38 dans l’expression de la E-sélectine.

2- Étudier les molécules médiant l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules

endothéliales, avec comme modèle de cellules endothéliales humaines, les HUVEC

(Human Umbilical Vein Endothelial Cell).

3- Vérifier l’implication et la sélectivité de la E-sélectine dans l’adhérence des cellules

cancéreuses aux HUVEC.

4- Déterminer le rôle de la kinase p38 dans l’adhérence des cellules cancéreuses aux

HUVEC et préciser son implication dans la migration transendothéliale.

60

1.8.1 Aperçu de la thèse

Les premiers résultats ont démontré que le sentier p38 n’est pas essentiel à l’expression de la

E-sélectine, cependant, la liaison à la E-sélectine active le sentier p38 dans la cellule

cancéreuse et cette activation est nécessaire pour la migration transendothéliale des cellules

cancéreuses. Cet article représente le chapitre 2 de la thèse.

Ces premiers résultats permettaient de lier l’activation de la cellule cancéreuse par l’adhérence

à la E-sélectine au sentier p38 et à la migration. J’ai écrit une revue à ce sujet, qui se trouve au

chapitre 3.

Par la suite, nous avons vérifié l’implication des intégrines dans l’adhérence des cellules

cancéreuses HT-29 aux HUVEC. C’est ainsi que nous avons démontré que l’intégrine β4 est

impliquée dans l’adhérence aux cellules endothéliales activées. De plus, nous démontrons

qu’il existe un lien entre la liaison à la E-sélectine et l’intégrine β4. Ces travaux sont

présentés dans le chapitre 4.

Le chapitre 5 présente des résultats complémentaires, qui n’ont pas encore fait l’objet de

publications. On y retrouve entre autres des résultats préliminaires sur le ligand de la

E-sélectine ainsi que sur la spécificité d’adhérence des cellules HT-29 sur des lignées

endothéliales de diverses origines.

Le chapitre 6 fait état d’une discussion générale et conclusion sur l’ensemble de ces résultats.

Il ouvre également sur l’implication clinique potentiel de ces résultats.

L’annexe A présente une compilation des différents sites métastatiques chez l’humain

accompagnée des statistiques canadienne sur le cancer en 2003. L’annexe B présente les

résumés que j’ai présentés aux différents congrès auquel j’ai participé durant ma formation

ainsi que ma contribution dans un autre article scientifique du laboratoire.

Les chapitres 2, 3 et 4 ont leur propre bibliographie en fin de chapitre. Pour ce qui est des

chapitres 1, 5, 6, 7 et les annexes, la bibliographie complète se trouve à la fin de la thèse.

Chapitre 2

L’adhérence par la E-sélectine et l’activation de la

kinase p38 dans la migration

62

2 La migration transendothéliale des cellules de carcinome de côlon nécessite l’expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales et l’activation de SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2) dans la cellule tumorale.

Ce chapitre fait l’objet d’une publication dans la revue The Journal of Biological Chemistry

(276 (36), pp.33762-33772, 2001) et constitue la version finale telle que publiée dans ce

journal. Ce travail est reproduit ici avec la permission du journal. Cet article a été écrit avec

mes travaux. J’ai effectué l’ensemble des figures à l’exception de la figure 2-4b ainsi que la

version finale de la figure 2-6a à 2-6d qui a été effectuée par le second auteur. J’ai également

contribué à son écriture. Les auteurs 3 & 4 (de Virginia Commonwealth University) nous ont

fournis les cellules utilisées dans la figure 2-8.

63

2.1 Résumé

L'adhérence et la migration des cellules tumorales sur et à travers l'endothélium vasculaire

sont des étapes critiques de l'invasion métastatique. Nous avons étudié les rôles de la E-

sélectine et de la kinase SAPK2/p38 dans la modulation de l'adhérence et de la migration

transendothéliale des cellules de carcinome HT-29. Le TNFα a fortement augmenté

l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine

(HUVEC). Cet effet s’est avéré indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induite par le

TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de HUVEC traitée préalablement

avec du TNFα s’est aussi démontrée dépendante de l'expression de la E-sélectine mais

indépendante de l'activité SAPK2/p38 des HUVEC et des cellules tumorales. L'adhérence des

cellules HT-29 aux HUVEC exprimant la E-sélectine a mené à l'activation de SAPK2/p38

dans les cellules tumorales tel que reflété par la phosphorylation augmenté du facteur de

polymérisation d'actine HSP27 par la kinase MAPKAP k2/3, une cible directe de SAPK2/p38.

D'ailleurs, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc a rapidement augmenté l'activation de

SAPK2/p38 dans les cellules HT-29. Le blocage de l’activité de SAPK2/p38 des cellules HT-

29 par le SB203580 ou en exprimant une forme dominante négative de SAPK2/p38 a empêché

leur migration transendothéliale. De même, les cellules HeLa exprimant stablement un mutant

kinase-inactif de SAPK2/p38 ont montré une capacité diminuée de traverser une couche de

HUVEC. De façon générale, nos résultats suggèrent que le contrôle de la migration

transendothéliale des cellules tumorales implique deux étapes essentielles: l’adhérence à

l'endothélium par des molécules d'adhérence, telle la E-sélectine, et un potentiel motogénique

accru suite à l'activation, médiée par l’adhérence, de la voie SAPK2/p38.

64

2.2 Article

Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by

endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the

tumor cells

Julie Laferrière1, François Houle1, Mohiuddin M. Taher2, Kristoffer Valerie2, and

Jacques Huot1

From 1 Le Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de

Québec, Québec G1R-2J6, Canada and 2 Department of Radiation Oncology, Massey Cancer

Center, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia 23298-0058

This work was supported by Canadian Institutes of Health Research Grant MT15402, the

Cancer Research Society Inc., and United States Public Health Grant PHS CA53199.

Julie Laferrière holds studentships from FRSQ/FCAR-CRSNG and The Cancer Research

Society Inc.

To whom correspondence should be addressed: Centre de Recherche en Cancérologie de

l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 11 Côte du Palais, Québec, G1R 2J6, Canada.

Tel.: 418-691-5553; Fax: 418-691-5439; E-mail: Jacques.Huot@phc.ulaval.ca

RUNNING TITLE: E-selectin adhesion and SAPK2/p38 activation in metastasis

65

2.2.1 Summary

Adhesion and migration of tumor cells on and through the vascular endothelium are critical

steps of the metastatic invasion. We investigated the roles of E-selectin and of stress-activated

protein kinase-2 (SAPK2/p38) in modulating endothelial adhesion and transendothelial

migration of HT-29 colon carcinoma cells. Tumor necrosis factor (TNFα) strongly increased

the expression of E-selectin in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). This effect

was independent of the activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells

on a monolayer of HUVEC pretreated with TNFα was dependent on E-selectin expression but

was independent of SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. The adhesion of

HT-29 cells to E-selectin-expressing HUVEC led to the activation of SAPK2/p38 in the tumor

cells as reflected by the increased phosphorylation of the actin-polymerizing factor HSP27 by

mitogen-activated protein kinase 2/3, a direct target of SAPK2/p38. Moreover, a recombinant

E-selectin/Fc chimera quickly increased the activation of SAPK2/p38 in HT-29 cells.

Blocking the increased activity of SAPK2/p38 of HT-29 cells by SB203580 or by expressing a

dominant negative form of SAPK2/p38 inhibited their transendothelial migration. Similarly,

HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 showed a decreased

capacity to cross a layer of HUVEC. Overall, our results suggest that the regulation of

transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps as follows: adhesion to

the endothelium through adhesion molecules, such as E-selectin, and increased motogenic

potential through adhesion-mediated activation of the SAPK2/p38 pathway.

2.2.2 Footnotes

The abbreviations used are: ICAM, intercellular adhesion molecule; ATF2, activating

transcription factor-2; FAK, focal adhesion kinase; HSP, heat shock protein; HUVEC, human

umbilical vein endothelial cells; JNK, Jun-N-terminal kinase; MAP kinase, mitogen activated

protein kinase; MAPKAP K2, MAP kinase-activated protein kinase 2; SAPK, stress-activated

66

protein kinase; TNFα, tumor necrosis factor α; VEGF, vascular endothelial growth factor;

GST, glutathione S-transferase; MOPS, 4-morpholinopropanesulfonic acid; FBS, fetal bovine

serum; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis;

IEF, isoelectric focusing.

2.2.3 Introduction

Circulating tumor cells attach to adhesive endothelial molecules, and these interactions are

pivotal during the metastatic process. E-selectin, whose expression is induced by cytokines

and growth factors released by tumor cells, promotes the endothelial adhesion of tumor cells

from various origins, and this correlates with metastatic dissemination of tumor cells, e.g. to

liver, lung and bones (1-4). The ability of colon tumor cell clones to bind E-selectin on

endothelial cells is even directly proportional to their metastatic potential (5). Moreover,

inhibiting the expression of E-selectin with drugs such as cimetidine prevents metastasis (6).

Metastatic colonization also correlates with the expression of other types of endothelial

adhesion molecules such as P-selectin and ICAM (7-12). Futhermore, the metastatic potential

is associated with the circulating levels of soluble endothelial adhesion molecules shed by

activated endothelial cells of cancer patients (13-17). The increased metastatic potential

associated with adhesion of tumor cells to the endothelium might result from two distinctive

processes as follows: local intravascular proliferation of the attached tumor cells or

extravasation of these cells following their transendothelial migration into the sub-vascular

tissues (18,19). In both cases, the underlying biochemical mechanisms remain ill-defined.

Stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38), a member of the MAP kinase cascade family,

transduces the signals generated by stress and growth factors (20-22). Like other MAP kinase

signaling pathways, the SAPK2/p38 pathway consists of the MAP kinase module, the MAP

kinase itself (SAPK2/p38), the MAP kinase kinases (e.g. MKK3, MKK4 and MKK6) and the

MAP kinase kinase kinases (e.g. ASK1 and TAK1) (23,24). Activation of SAPK2/p38 is

involved in the synthesis of pro-inflammatory cytokines and activates a number of

67

transcription factors such as MEF2C, ELK-1 and ATF-2 (25-28). It also regulates the

activation of cytoplasmic kinases such as MAPKAP kinases 2/3 (29-33) which leads to

phosphorylation of the actin-polymerizing factor HSP27. In endothelial cells, a cell type that

expresses high levels of HSP27, SAPK2/p38-mediated phosphorylation of HSP27 triggers

actin polymerization and reorganization into stress fibers in response to oxidative stress and

VEGF (21,22,34). In the case of VEGF, activation of SAPK2/p38, downstream of VEGFR2,

is accompanied by an HSP90-dependent tyrosine phosphorylation of FAK, a key protein

kinase involved in the assembly of focal adhesions. SAPK2/38-mediated actin polymerization

with FAK-dependent assembly of focal adhesions allow the actin reorganization required for

cell migration in various cellular systems (20,22,35-38).

In the present study, we show that E-selectin mediates adhesion of colon carcinoma HT-29

cells to endothelial cells. This contributes to activate the SAPK2/p38 pathway in the tumor

cells and enhances their motogenic potential and transendothelial migration.

2.2.4 Experimental procedures

Materials--[γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) and Na51Cr (200-500mCi/mg) were purchased from

Dupont and Amersham Pharmacia Biotech, respectively. TNFα and SB203580 were

purchased from Calbiochem. Calcein-AM was obtained from Molecular Probes (Eugene,

OR), cycloheximide was from Sigma, and Tfx-50 was from Promega (Madison, WI).

Recombinant HSP27 was purified from Escherichia coli transformed with a plasmid

containing the coding sequence for Chinese hamster HSP27 (39). Myc-tagged human HSP27

and LT-tagged-MAPKAP K2 plasmids were obtained from Dr. Jacques Landry (Laval

University). pCMV-flag-p38 (Ala, Gly, Phe) was a gift from Dr. Roger Davis (University of

Massachusetts). Recombinant human E-selectin/Fc chimera was obtained from R&D Systems

(Minneapolis, MN). pEGFP-C1 was purchased from Clonetech (Palo Alto, CA). Chemicals

for electrophoresis were obtained from Bio-Rad and Fisher.

68

Antibodies--Anti-MAPKAP K 2/3 is a polyclonal antibody raised in the rabbit after injecting a

glutathione S-transferase (GST) fusion protein containing the 223 C-terminal amino acids of

Chinese hamster MAPKAP kinase-2 (33). Anti-E-selectin (Brig-E4 and BBA26) antibodies

are mouse monoclonal antibodies that were purchased from R&D Systems and Chemicon

(Temicula, CA) respectively. Anti-human TNFα neutralizing antibody was purchased from

R&D Systems. Mouse IgG1κ was obtained from Sigma. Myc was detected with the

monoclonal antibody 9E10 (40). The phospho-p38/SAPK2 antibody is a rabbit polyclonal

antibody purchased from New England Biolabs (Beverly, MA).

Cells--Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase

digestion of umbilical veins from undamaged sections of fresh cords (34). Briefly, the

umbilical vein was cannulated, washed with Earle’s balanced salt solution, and perfused for 10

min with collagenase (1 mg/ml) in Earle’s balanced salt solution at 37oC. After perfusion, the

detached cells were collected, and the vein was washed with medium 199 and the wash-off

pooled with the perfusate. The cells were washed by centrifugation and plated on gelatin-

coated 75 cm2 culture dishes in medium 199 containing 20% heat-inactivated fetal bovine

serum (FBS), endothelial cell growth supplement (60 µg/ml), glutamine, heparin and

antibiotics. Replicated cultures were obtained by trypsinization and were used at passages ≤ 5.

The identity of HUVEC as endothelial cells was confirmed by their polygonal morphology

and by detecting their immunoreactivity for factor VIII-related antigens. HT-29 human colon

carcinoma cells were obtained from ATCC (Manassas, MD). They were cultivated in McCoy

5A medium supplemented with 10% fetal bovine serum. HL-60 cells, obtained from ATCC,

were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 20% heat-inactivated FBS. HeLa

cells stably transfected with a plasmid containing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38α

(p38(AGF)/HeLa) and the parental HIVCat/HeLa cells (HeLa) were maintained in Dulbecco’s

modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS and appropriate selection drugs (G418

and hygromycin B) (41, 42). Cultures were kept at 37oC in a humidified atmosphere

containing 5% CO2.

Transfection-- HT-29 cells were plated 24 h before lipofection (1.3 x 106 cells/25cm2 flasks or

1.106/60-mm petri dishes) and incubated, for 2 h in the absence of serum, with 6.3 or 8.15

µg/dish of plasmids (pCMV-flag-p38 AGF, Myc-tagged human HSP27, LT-tagged-MAPKAP

69

K2, pEGFP-C1) and Tfx-50TM at a ratio of 3:1. The incubation medium was then changed

with fresh medium, and treatments were applied 24 h post-transfection.

Immunoprecipitation--After treatments, cells were scraped and extracted in lysis buffer

containing 20 mM MOPS pH 7.0, 10% glycerol, 80 mM β−glycerophosphate, 5 mM EGTA,

0.5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 5 mM Na4P2O7, 50 mM NaF, 1% Triton X-100, 1 mM

benzamidine, 1 mM dithiothreitol, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). The

extracts were vortexed and centrifuged at 17,000 x g for 12 min at 4oC. The clarified

supernatants were stored at -80oC. The further steps were carried out at 4oC. The clarified

supernatant was diluted 4 times in buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 mM

EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 1 mM Na3VO4, 1% Triton, 1 mM PMSF). Undiluted

antibodies were added in limiting concentrations, and the mixtures were incubated for 1 h.

Ten µl of protein A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) 50% v/v in buffer I were

added, and the mixtures were incubated for 30 min. Samples were centrifuged for 15 sec and

washed 3 times with 300 µl of buffer I. Immunoprecipitates were directly used for the kinase

assays.

Kinase assays--SAPK2/p38 activation was measured by assessing the activity of its substrate

MAPKAP K2. The activity of immunoprecipitated MAPKAP K2 was measured using

recombinant HSP27 (34). The assays were carried out in 20 µl of kinase buffer K: 100 µM

ATP, 3 µCi of [γ32P] ATP (3000 Ci/mmole), 40 mM p-nitrophenyl phosphate, 20 mM MOPS,

pH 7, 10% glycerol, 15 mM MgCl2, 0.05% Triton X-100, 1 mM dithiothreitol, 1 mM

leupeptin, and 0.1 mM PMSF. The kinase activity was assayed for 30 min at 30oC and was

stopped by the addition of 10 µl SDS-PAGE loading buffer. In the case of SAPK1/JNK

activity, the cell extract was adsorbed on GST-Jun beads, and the kinase was tested using the

same GST-N-terminal Jun as substrate (34). Briefly, the GST-Jun fusion proteins bound to

glutathione-Sepharose beads were incubated for 30 min at 4oC with the extracts in buffer I.

The beads were then pelleted, washed with I buffer and incubated for 30 min at 30oC with 3

µCi [γ-32P]-ATP (3000 Ci/mmol) in kinase buffer K containing 10 mM MgCl2. The

phosphorylated GST-Jun was boiled in SDS sample buffer to stop the reaction. The activity of

the various kinases was quantified by measuring the incorporation of radioactivity into the

70

specific substrate after SDS-PAGE. Kinase activities were evaluated by measuring

incorporation of the radioactivity into the specific substrates after resolution by SDS-PAGE

and quantification using liquid scintillation counting or by PhosphorImager (Molecular

Dynamics). In certain experiments, SAPK2/p38 activity was evaluated by Western blotting

using an antibody that recognizes the phosphorylated form of SAPK2/p38 (New England

Biolabs).

Phosphorylation of HSP27--HT-29 cells co-transfected with Myc-tagged HSP27, and

LT-tagged MAPKAP K2 plasmids were trypsinized, put in suspension and then left to adhere

to plastic only (Petri dish), to control HUVEC or to HUVEC-expressing E-selectin following

exposure to TNFα in the presence or not of a neutralizing anti-TNFα antibody. After 30 min,

adhering cells were extracted in IEF buffer, and protein were fractionated by IEF and

transferred onto nitrocellulose as described previously (34). After blotting Myc-tagged HSP27

isoforms A-D were revealed with the monoclonal anti-Myc antibody 9E10 and an ECL

detection kit (Amersham Pharmacia Biotech). The proportion of each of the isoforms has

been quantified after normalization for the same amount of HSP27/sample.

Adhesion assays--HUVEC were plated on gelatin-coated slides and left to grow to confluence

for 24-48 hours. HT-29 cells, HL-60 cells and HeLa cells were labeled for 30 min at 37ºC

with calcein. Labeled cells were left to adhere to the endothelial layer for 30 min at 37ºC.

The endothelial layer was washed twice with phosphate-buffered saline, and the attached cells

were quantified by measuring the fluorescence emission using a fluorometer.

Transendothelial cell migration assay-- Cell migration was assayed using a modified Boyden

chamber assay. HUVEC (150, 000) were grown to confluence (48 h) on an 5.0 µm pore size

gelatinized polycarbonate membrane separating the two compartments of a 6.5 mm migration

chamber (Transwell Costar). HUVEC were treated or not with 10 ng/ml TNFα for 90 min.

Thereafter, culture media were changed for fresh media and cells incubated for an additional

2.5h. Tumor cells in suspension were labeled for 1.5h with 100 µCi 51Cr/106 cells and then

added in migration buffer (medium 199, 10 mM HEPES pH 7.4, 1.0 mM MgCl2, 0.5% bovine

serum albumin) on the monolayer of HUVEC, previously washed with the same buffer. After

4.5h, cells on the upper face of the membrane were scraped using a cotton swab. The number

71

of tumor cells that have migrated to the lower face of the filter was counted by detaching the

membrane and counting the radioactivity.

In some experiments, HT-29 cells were not radiolabeled. After migration, cells on the upper

face of the membrane were scraped using a cotton swab and cells on the lower face were fixed

with 3.7% formaldehyde and stained with Mayer’s hematoxylin solution. The number of cells

on the lower face of the filter was counted in five fields under X 100 magnification. HT-29

cell number has been determined after correction for the background of HUVEC (<10% of

total number of counted cells).

Confocal fluorescence microscopy--Confocal microscopy was used for immunofluorescent

visualization of F-actin, E-selectin and ICAM (33). The cells were plated on gelatin-coated

LabTek dishes. After treatment, they were fixed with 3.7% formaldehyde and permeabilized

with 0.1% saponin in phosphate buffered saline, pH 7.5. F-actin was detected using

fluorescein isothiocyanate-conjugated phalloidin (33.3 µg/ml) diluted 1:50 in phosphate

buffer. Brig-E4 monoclonal antibody was used to detect E-selectin. The antigen-antibody

complexes were detected with biotin-labeled anti–mouse IgG and were revealed with Texas-

Red conjugated streptavidin. The cells were examined as reported previously by confocal

microscopy with a Bio-Rad MRC-1024 imaging system mounted on a Nikon Diaphot-TDM

equipped with a X 60 objective lens with a 1.4 numerical aperture (34).

Statistical analysis--Data are mean +/- S.D. Statistical analysis was done by using the

appropriate Student t test. p< 0.05 was considered as significant.

72

2.2.5 Results

E-Selectin-dependent adhesion of tumor cells to endothelial cells is independent of

SAPK2/p38 activity – In primary cultures of HUVEC, TNFα induced a strong activation of

the expression of endothelial adhesion proteins that include E-selectin and ICAM (Figures 2-

1a to 2-1d and data not shown). This induction was maximal after 4 h and required de novo

protein synthesis being inhibited by cycloheximide (Figure 2-1e and 2-1f). As illustrated in

figures 2-2a to 2-2c, the expression of E-selectin correlated with an increased adhesion of

both colon carcinoma HT-29 cells and HL-60 leukemia cells to a monolayer of HUVEC.

After 30 min, the number of HT-29 cells that adhered to HUVEC-expressing E-selectin,

following activation with TNFα, was 5-fold higher than when adhering to inactivated HUVEC.

Similarly, HT-29 cells quickly adhered to immobilized recombinant human E-selectin/Fc

chimera (data not shown). An anti-E-selectin neutralizing antibody, but not a matched

isotype antibody, decreased the adhesion of both cancer cell types to the activated endothelium

(Figures 2-2a to 2-2c). Cycloheximide also inhibited the adhesion of HT-29 cells, which is

consistent with the fact that adhesion required de novo E-selectin synthesis (Figure 2-2a).

These results indicate that E-selectin expression is a major determinant in the adhesion of

tumor cells to endothelial cells.

73

74

Figure 2-1 TNFα-induced de novo expression of E-selectin is not mediated by activation of SAPK2/p38.

HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated (A and B) or were pre-treated for 60 min with 100 µM cycloheximide (E and F) or with 5 µM SB203580 (G and H). Then TNFα (10 ng/ml) was added for 90 min to C to H. Thereafter, culture media were changed for fresh media alone (A to D) or fresh media containing 100 µM cycloheximide (E and F) or 5 µM SB203580 (G and H) and cells were incubated for an additional 2.5h. After treatments, cells were processed for actin staining using fluorescein isothiocyanate-conjugated phalloidin (A, C, E, G) or E-selectin detection with monoclonal antibody Brig-E4 complexed with a biotin-labeled anti-mouse IgG and revealed with Texas Red-conjugated streptavidin (B, D, F, H). Cells were then examined by confocal microscopy.

75

76

Figure 2-2 E-selectin-dependent adhesion of tumor cells to endothelial cells does not require activation of SAPK2/p38.

A and B, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were treated for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were changed for fresh media, and cells were incubated for an additional 2.5h in the presence or absence of increasing concentrations of an anti-E-selectin neutralizing antibody (BBA26, last 60 min), of a matched isotype antibody (last 60 min), of 5 µM SB203580 (last 30 min) or of 100 µM cycloheximide (1h prior to TNFα treatment). HT-29 cells labelled with calcein-AM were then added to the endothelial layer and left to adhere for 30 min at 37˚C. After washing, fluorescence was quantified to measure the number of adherent cells. C, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were treated for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were changed for fresh media and cells were incubated for an additional 2.5h in the presence or absence of an anti-E-selectin neutralizing antibody (last 60 min) or with a matched isotype antibody (last 60 min). HL-60 cells labeled with calcein-AM were then added on the HUVEC layer and left to adhere for 30 min at 37˚C. After washing, fluorescence was quantified to determine the number of adherent HL-60 cells. Data points represent the mean + SD. p was determined by the Student’s t test. *: p< 0.0125 and †: p <0.0005. mAb, monoclonal antibody.

77

TNFα also induced in HUVEC, a marked time- and dose-dependent stimulation of

SAPK2/p38 that is characterized by an increased activity of MAPKAP K2/3, a direct

physiological target of SAPK2/p38 (21). Maximal stimulation was obtained after 10 min

exposure to concentrations of TNFα equal to or higher than 5 ng/ml (Figure 2-3a and 2-3b).

The pyridinylimidazole derivative SB203580, in concentrations of 1-5 µM, completely

inhibited the TNFα-induced increase in SAPK2/p38 activity as reflected by the inhibition of

MAPKAP K2/3 activation in cells exposed to TNFα (Figure 2-3c). In contrast, SB203580

had no effect on the activity of SAPK1/JNK that was co-activated with SAPK2/p38 in the

presence of TNFα (Figure 2-3d). Inhibiting the TNFα-induced increase in SAPK2/p38

activity by SB203580 did not impair the expression of E-selectin which suggested that

activation of SAPK2/p38 was not required for the expression of this adhesion molecule

(Figure 2-1g and 2-1h). Accordingly, blocking the SAPK2/p38 activity of HUVEC with

SB203580 did not inhibit the adhesion of HT-29 cells to HUVEC (Figures 2-2a). Overall,

these results indicate that activation of SAPK2/p38 is not necessary for the expression of E-

selectin by endothelial cells nor for the adhesion of tumor cells to endothelial cells.

E-Selectin expression by endothelial cells and activation of SAPK2/p38 in the tumor cells

are both required for the transendothelial migration of tumor cells – E-selectin-dependent

adhesion of leukocytes to the endothelium is a prerequisite to their transendothelial migration

during the inflammatory process (43). We thus verified whether E-selectin-mediated adhesion

was required for the migration of tumor cells across an endothelial layer separating the upper

and lower compartments of a Boyden-modified chamber. HT-29 cells have by themselves a

very low motogenic potential, being unable to traverse a polycarbonate membrane, even

following the addition of FBS in the lower chamber (data not shown). However, HT-29 cells

migrated across an endothelial layer of HUVEC, and this migration was enhanced by

pretreating HUVEC with TNFα (Figure 2-4a). This increase in cell migration was reduced

down to control levels by pretreating HUVEC with the anti-E-selectin antibody indicating the

requirement of E-selectin expression and E-selectin-dependent adhesion for HT-29 cell

migration across an endothelial cell layer (Figure 2-4a).

78

79

Figure 2-3 Dose- and time-dependent activation of SAPK2/p38 induced by TNFα in HUVEC

HUVEC were treated for 15 min with increasing concentrations of TNFα (A) or for various periods with 10 ng/ml TNFα (B). C, HUVEC were pretreated for 1h with vehicle (DMSO 0.25%) or with 5 µM SB203580 before administration of 10 ng/ml TNFα for 15 min. After treatments, samples were extracted and SAPK2/p38 activity was evaluated in immunocomplex assays by measuring the activity of MAPKAP K2, using a specific anti-MAPKAP K2 antibody and rHSP27 as substrate. Results are expressed as the ratio of kinase activity of stimulated cells over the activity of unstimulated cells. Representative results from three experiments are shown. D, HUVEC were pretreated for 1h with vehicle (DMSO 0.25%) or with 5 µM SB203580 before administration of 25 ng/ml TNFα for 15 min. After treatments, samples were extracted and were adsorbed on GST-c-Jun beads, and the kinase activity was tested using the same GST-N-terminal Jun as substrate. Results are expressed as the ratio of kinase activity of stimulated cells over the activity of unstimulated cells.

80

81

Figure 2-4 Transendothelial migration of HT-29 tumor cells requires E-selectin expression by endothelial cells and increased SAPK2/p38 activity in the tumor cells.

HUVEC were grown to confluency for 48 h on a 5-µm pore size polycarbonate membrane in Boyden-modified chambers. HUVEC were treated or not with 10 ng/ml TNFα for 90 min. Thereafter, culture media were changed for fresh media and cells incubated for an additional 2.5h. A, HUVEC were treated or not for the last 60 min with an anti-E-selectin neutralizing antibody. HT-29 cells pretreated for 30 min with 5 µM SB203580 or with the vehicle (DMSO 0.1%) were then added on the endothelial layer and left to migrate for 4.5h at 37˚C. B, HT-29 cells were transiently transfected with the indicated amount of pCMV-flag-p38 AGF cDNA for 24h before being harvested and added to the layer of HUVEC and then left to migrate for 4.5h. Results are expressed as the ratio of the number of HT-29 cells that have crossed the activated endothelial layer over the number of HT-29 cells that have crossed the unstimulated endothelial layer. A, data points represent the mean + SD. p was determined by the Student’s t test, n = 3-6 from two different experiments. B, data points represent the means from duplicates, and results are representative from two different experiments.

82

We recently reported that activation of SAPK2/p38, by leading to the phosphorylation of the

actin polymerizing factor HSP27, is importantly involved in transducing the motogenic signal

elicited by VEGF in endothelial cells (20,22). Moreover, SAPK2/p38 was highly reactive in

HT-29 cells being activated by cytokines, such as TNFα, that are associated with the

neoplastic process. SB203580 inhibited this increased SAPK2/p38 activity in response to

TNFα (Figure 2-5). From these observations, we hypothesized that E-selectin-mediated

adhesion could activate the SAPK2/p38-HSP27 pathway in the tumor cells and that this could

trigger their transendothelial migration.

We then examined whether E-selectin-mediated adhesion could activate the

SAPK2/p38/HSP27 pathway. HT-29 cells were transiently transfected with Myc-tagged

human HSP27 and LT-tagged MAPKAP K2 and then were put in suspension and added to

plastic only (Petri dish), to control HUVEC or to HUVEC-expressing E-selectin following

activation with TNFα. Thirty minutes after adhesion, cell extracts were prepared from

adhering cells and phosphorylation of HSP27 was evaluated by IEF electrophoresis to separate

the four major isoforms of HSP27, A-D, that represent unphosphorylated,

monophosphorylated, biphosphorylated and triphosphorylated variants of the protein. Results

showed that adhesion of HT-29 cells to HUVEC-expressing E-selectin was associated with a

3.5-fold increase in the proportion of phosphorylated C form in comparison with the

proportion of C form found in HT-29 cells that have adhered to plastic or to untreated HUVEC

(Figure 2-6a and 2-6d). This was associated with a proportional significant decrease in the

amount of the unphosphorylated A form in the HT29 cells adhering to E-selectin-expressing

HUVEC (Figure 2-6b). Phosphorylated B form was present in any of the adhering

conditions, but its proportion did not vary (Figure 2-6c). Expression of E-selectin in HUVEC

has been induced by pre-treating the cells for 90 min with 10 ng/ml TNFα followed by a

medium change and a further 2h30 incubation in fresh medium. Hence, it is possible that a

fraction of TNFα exogenously added to HUVEC to trigger synthesis of E-selectin remained

bound to HUVEC or in solution in the fresh culture medium at the time of adding HT-29 cells

to activated HUVEC. Since TNFα activated SAPK2/p38 in HT-29 cells (Figure 2-5), we thus

considered the eventuality that residual TNFα contributed to increase the phosphorylation of

HSP27 in the adherent HT-29 cells. To exclude this possibility, enzyme-linked

immunosorbent assays (Quantikine from R&D Systems) were performed to detect TNFα

83

bound to HUVEC as well as remaining in the fresh culture medium. We found that only trace

amounts of TNFα (4.2 pg/5x105 cells) were associated with HUVEC whereas 0.25 ng/ml were

found in the fresh culture medium. In both cases, these concentrations were below the

minimal concentration of TNFα (0.5 µg/ml) that was required to activate SAPK2/p38 in HT-

29 cells. We thus concluded that was unlikely that residual TNFα was involved in activating

SAPK2/p38 in HT-29 cells adhering to HUVEC. Accordingly, addition of a neutralizing anti-

TNFα, in concentration (0.5 µg/ml) that totally inhibited the activation of SAPK2/p38 by 1

ng/ml TNFα, did not impair the increased phosphorylation of HSP27 in HT-29 adhering to

HUVEC (Figure 2-6e and f). These results support the hypothesis that the E-selectin-

dependent adhesion of HT-29 tumor cells to endothelial cells activates the SAPK2/p38-HSP27

pathway in the tumor cells. In fact, the activity of SAPK2/p38 of HT-29 cells was quickly

increased by adhesion of the cells to immobilized recombinant human E-selectin/Fc chimera

(data not shown). Reciprocally, addition of recombinant human E-selectin/Fc chimera, in

concentration (1 µg/ml) that increased adhesion of HT-29 by 10-fold in comparison to bovine

serum albumin controls, activated in these cells the SAPK2/38 in a time-dependent manner

with a peak of activation of 6.5-fold after 5 min (Figure 2-7 and data not shown). Together,

these findings indicate that E-selectin did not only mediate the adhesion of HT-29 cells to

HUVEC but that it could also act as agonistic ligand that activated the SAPK2/p38-HSP27

motogenic pathway in the tumor cells.

84

Figure 2-5 Inducibility of the SAPK2/p38 pathway in HT-29 tumor cells.

HT-29 cells were pretreated for 30 min with the vehicle (DMSO) or with 5 µM SB203580 before the administration of 20 ng/ml TNFα for 15 minutes. After treatments, samples were extracted and SAPK2/p38 activity was evaluated in immunocomplex assays by measuring the activity of MAPKAP K2 using a specific anti-MAPKAP K2 antibody and rHSP27 as substrate. Results are expressed as the ratio of kinase activity of stimulated cells over the activity of unstimulated cells. n=2. Representative results from 2 experiments are shown.

85

86

Figure 2-6 E-selectin-mediated adhesion of HT-29 tumor cells to endothelial cells activates the phosphorylation of HSP27 in the tumor cells.

HUVEC were grown to confluency and treated or not with 10 ng/ml TNFα for 90 min. Thereafter, culture media were changed for fresh media, and HUVEC were incubated for an additional 2.5h. HT-29 cells, transiently transfected with Myc-tagged human HSP27 and LT-tagged MAPKAP K2, were put in suspension in HUVEC media, and then were added to free Petri dishes only (Plastic), to a layer of inactivated HUVEC (HUVEC) or to a layer of TNFα-activated HUVEC (HUVEC/TNF). HT-29 cells were left to adhere for 30 min. Then adherent cells were lysed in IEF buffer, and proteins were fractionated by IEF. The proteins were then transferred on nitrocellulose membrane, and Myc-tagged HSP27 was revealed by Western blotting using the anti-Myc monoclonal antibody 9E10. Representative IEF blots of triplicate samples are shown in A. B-D show the quantitative variation in the proportion of the A(unphosphorylated), B (monophosphorylated) and C (biphosphorylated) isoforms of HSP27, respectively. The proportion of each isoforms has been quantified after normalization for the same amount of HSP27/sample. E, HUVEC were grown to confluency and treated with 10 ng/ml TNFα for 90 min. Thereafter, culture media were changed for fresh media and HUVEC were incubated for an additional 1.5h. Then, 0.5 µg/ml of an anti-TNFα neutralizing antibody (goat IgG) or 0.5 µg/ml of an irrelevant antibody (goat IgG anti-rabbit) were added for 1 h prior to the addition of transfected HT-29 cells. The extracts were then processed for HSP27 phosphorylation as in A. F, HUVEC were pretreated for 1 h with 0.5 µg/ml of an anti-TNFα neutralizing antibody (goat IgG) or with 0.5 µg/ml of an irrelevant antibody (goat IgG anti-rabbit) before the addition of 1.0 ng/ml of TNFα for 10 min. SAPK2/p38 activity was determined by Western blotting using a phospho-p38 antibody (PY-p38). Data point represent the mean + SD. p values were determined by the Student’s t test.

87

Figure 2-7 Time-dependent activation of SAPK2/p38 by E-Selectin.

HT-29 cells were grown for 24 hours and then treated for various periods with 1 µg/ml of recombinant human E-selectin/Fc chimera. Thereafter, SAPK2/p38 activity was determined by Western blotting using a phospho-p38 antibody (PY-p38).

88

Impairing E-selectin-mediated activation of SAPK2p38 and HSP27 phosphorylation of HT-29

cells with SB203580 (Figures 2-4a and data not shown) or by expressing a dominant negative

form of SAPK2/p38 inhibited their migration across activated HUVEC (Figures 2-4b). This

supports the hypothesis that E-selectin-mediated activation of the SAPK2/p38-HSP27

pathway in HT-29 cells is determinantly involved in triggering the transendothelial migration

of these cells. The role of SAPK2/p38 as a motogenic pathway in tumor cells was further

supported by the finding that HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant form of

SAPK2/p38 had a lower capacity than the parental cells to migrate across a monolayer of

HUVEC (Figure 2-8a and 2-8b). Intriguingly, the adhesion of both types of HeLa cells was

not increased when added to HUVEC stimulated with TNFα (Figure 2-8c). These findings

confirmed the results of figure 2-1a that SAPK2/p38 was not involved in mediating adhesion

of cancer cells to HUVEC and they indicated that, conversely to HT-29 cells, adhesion of

HeLa cells to HUVEC did not require the expression of E-selectin or of other adhesion

molecules that depend on TNFα exposure. This raises the interesting possibility that

activation of SAPK2/p38 of the cancer cells may be a common motogenic event that involves

different types of adhesive interactions that may differ from tumor cells to tumor cells and

from endothelial cells from different origins.

89

90

Figure 2-8 Migration of HeLa cells through but not adhesion on endothelial cells depends on SAPK2/p38 activity.

A, Parental HeLa (HIVCat/HeLa) cells and HeLa cells expressing kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 (p38 (AGF)/HeLa) were treated or not for with TNFα, as indicated. Thereafter, SAPK2/p38 activity was determined by Western blotting using a phospho-p38 antibody (PY-p38) or by measuring the activity of its substrate MAPKAP K2 in immunocomplexes using a specific anti-MAPKAP K2 antibody and rHSP27 as substrate. B, HUVEC were grown to confluency for 48 h on a 5-µm pore size polycarbonate membrane in Boyden-modified chambers. Parental HeLa (HIVCat/HeLa) cells and HeLa cells expressing kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 (p38 (AGF)/HeLa) were then added on the endothelial layer and left to migrate for 4.5h at 37˚C. Results are expressed as the number of HeLa cells that have crossed the endothelial layer. C, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were treated for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were changed for fresh media, and cells were incubated for an additional 2.5h. HT-29 and parental HeLa (HIVCat/HeLa) cells or HeLa cells expressing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 (p38 AGF/HeLa) were labeled with calcein-AM and added to a monolayer of unstimulated or TNFα-stimulated HUVEC. Cells were left for adhesion during 30 min at 37˚C, washed twice, and then fluorescence was quantified. The number of HT-29 cells and HeLa cells were determined using standard curves. Data points represent the mean + SD. p was determined by the Student’s t test. *: p< 0.0125 and †: p <0.0005.

91

2.2.6 Discussion

Adhesion of circulating tumor cells to vascular endothelium and their subsequent

transendothelial migration are two important steps associated with extravasation of tumor cells

and metastatic spreading. Here, we obtained results which suggest that E-selectin adhesion of

tumor cells to endothelial cells contributes to activate the motogenic SAPK2/p38 pathway in

the tumor cells, which triggers their transendothelial migration.

E-selectin is not expressed in unstimulated endothelial cells. However, its expression is

quickly and transiently turned on following activation of endothelial cells with TNFα. The

induction of E-selectin expression results from the transcriptional activation of the E-selectin

gene. Three pathways converge on the activation of the E-selectin gene promoter following

stimulation of endothelial cells with TNFα, the NF-κB pathway, and the SAPK1/JNK and

SAPK2/p38 MAP kinase pathways. Both the SAPK1/JNK and SAPK2/p38 pathways mediate

increases in E-selectin gene promoter activity through activation of the transcription factors

ATF2 and c-Jun (44). Activation of the NF-ΚB and SAPK1/JNK pathways are required for

full activation of the E-selectin gene (44). In contrast, the SAPK2/p38-mediated activation of

the E-selectin gene is ancillary and dispensable for full expression of the protein since we

found that inhibiting SAPK2/p38 with SB203580 did not inhibit the expression of E-selectin.

This suggests that activation of ATF2 and c-Jun by JNK can rescue the inhibition that results

from exposure of cells to SB203580.

The best characterized physiological role for selectins is their involvement in the adhesion of

leukocytes to activated endothelial cells during the inflammatory process (45). This adhesion

is the first step that underlies the transendothelial migration of leukocytes to the inflammatory

sites and to the subsequent destruction of the invading pathogens. Numerous studies have also

implicated endothelial adhesion molecules and especially E-selectin in adhesion of carcinoma

cells to vascular endothelial cells (2). The necessity of E-selectin expression for the adhesion

of tumor cells from solid (HT-29) and hematological tumors (HL-60) is supported by our

observation that pretreating endothelial cells with an anti-E-selectin neutralizing antibody, but

not a matched isotype antibody, inhibited in a dose-dependent manner the adhesion of both

92

tumor cell lines to HUVEC. The binding of tumor cells to endothelial cells is clinically

significant, being associated with metastasis. Notably, the ability of colon tumor cell clones to

bind E-selectin expressed by activated endothelial cells is directly proportional to their

metastatic potential (5). Moreover, drugs like cimetidine which inhibit the expression of E-

selectin, prevents metastasis (6).

Two mechanisms may underlie the metastatic development in response to adhesion of tumor

cells to the endothelium as follows: intravascular proliferation of attached tumor cells or

extravasation of these cells (18,19). In the latter case, this implicates numerous factors that

may work separately or in combination. This implies among others that circulating tumor cells

have a higher intrinsic motogenic potential, that they respond to circulating motogenic signals,

or that contact of tumor cells with endothelial cells activates the motogenic potential of the

tumor cells. A major conclusion of our study is to provide evidence that E-selectin-mediated

adhesion of HT-29 tumor cells to HUVEC increased the activity of the motogenic SAPK2/p38

pathway of the tumor cells enabling their transendothelial migration. Two lines of evidence

support this conclusion. First, addition of HT-29 cells to HUVEC-expressing E-selectin led to

an increased phosphorylation of HSP27, as indicated by the significant enhanced amount of

HSP27-phosphorylated C form in the HT-29 cells that adhered to TNFα-treated HUVEC in

comparison to those that adhered only to plastic or to untreated HUVEC. HSP27 is an

actin-polymerizing factor whose phosphorylation downstream of the SAPK2/p38 pathway

(34) contributes with FAK phosphorylation to induce the actin reorganization that is required

for cell migration (20,46-48). Second, inhibiting SAPK2/p38 activity and phosphorylation of

HSP27 of HT-29 cells with SB203580 or with an inactive kinase mutant of SAPK2/p38

resulted in an inhibition of the transendothelial migration of the tumor cells.

The finding that recombinant human E-selectin/Fc chimera activates SAPK2/p38 indicates

that E-selectin acts as an agonist that binds to counter-receptors at the surface of tumor cells to

initiate a cascade of events leading to SAPK2/p38 activation. The tumor cells binding to E-

selectin involves oligosaccharides such as sialyl Lewis a and x presented by counter-receptors

for E-selectin (49). Binding of E-selectin to these receptors initiates signaling events

involving tyrosine phosphorylation of various proteins (50). One such potential E-selectin

receptor on HT-29 cells might be E-selectin ligand-1, a member of the fibroblast growth factor

93

tyrosine kinase receptor family that is expressed by various tumor cell lines including myeloid

cells. SAPK2/p38 is strongly activated by VEGF binding to VEGFR2, another tyrosine kinase

receptor (20,22). E-selectin ligand-1 is thus possibly implicated as a counter-receptor

responsible for binding of E-selectin and for transmitting the signal that triggers activation of

SAPK2/p38. The capacity of selectins to activate SAPK2/p38 has recently been reported in a

study that showed that clustering of L-selectin in neutrophils activates SAPK2/p38, which

triggers neutrophil degranulation (51). It remains possible that a secondary adhesion molecule

could contribute with E-selectin to trigger adhesion-mediated signaling to SAPK2/p38. In this

context, the role of ICAM that is co-expressed with E-selectin in endothelial cells activated by

TNFα remains to be investigated. Integrins are importantly involved in transducing signals

initiated by cell-cell adhesion (52). For example, tumor cell-bound α4 integrin strengthens

adhesion of tumor cells to the endothelium and promotes transendothelial migration (53).

Moreover, activation of SAPK2/p38 by adhesion of osteosarcoma cells onto collagen is

mediated by α2ß1 integrin (54). Thus, integrins may act jointly with selectins to regulate the

SAPK2/p38 mediated motogenic signal elicited in tumor cells when they adhere to endothelial

cells.

Interestingly, adhesion of HeLa cells to HUVEC is not markedly increased following

treatment of endothelial cells with TNFα suggesting that E-selectin does not have a major role

in the process. Nevertheless, transendothelial migration of Hela cells also required

SAPK2/p38 activity since HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant of

SAPK2/p38 showed a decreased capacity to cross the endothelial layer compared to the

parental cells. These observations suggest the following: first, activation of SAPK2/p38 might

be a common mechanism that triggers transendothelial migration of tumor cells following

their adhesion to the endothelium, and second, that different endothelial adhesive molecules

may contribute to activate this pathway. Endothelial adhesive molecules differ between

endothelial cells from different origins, and the specificity of the cancer cell-endothelial cell

interactions may well constitute the basis for the organ specificity of metastatic colonization.

Notably, hepatic colonization by metastatic cells requires the expression of E-selectin by liver

sinusoidal endothelial cells, whereas pulmonary metastasis rather requires the expression of

the lung endothelial cell adhesion molecule, LuECAM (3,55).

94

In summary, we have shown here that transendothelial migration of tumor cells requires the

expression of endothelial adhesion molecules such as E-selectin which are necessary to enable

tumor cells to adhere to the endothelium adhesion and which contribute to activate the

motogenic pathway SAPK2/p38-HSP27 in the tumor cells. This might represent a pivotal and

insidious paracrine mechanism of metastatic spreading since tumor cells may activate the

expression of E-selectin (3).

2.2.7 Acknowledgments

We thank Dr. Jacques Landry, Steve Charette and Herman Lambert for providing Myc-tagged

HSP27 construct and Dr. Roger J. Davis for giving pCMV-flag-p38 (Ala, Gly, Phe).

2.2.8 References

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Chapitre 3

E-sélectine et p38 dans les métastases

100

3 Régulation du processus métastatique par la E-sélectine et SAPK2/p38

Ce chapitre fait l’objet d’une publication dans la revue Annals of New York Academy of

Science (973, pp.562-572, 2002) et constitue la version finale telle que publiée dans ce journal.

Ce travail est reproduit avec la permission du journal (Copyright 2002 New York Acadmy of

sciences, U.S.A.). Cet article de revue a été écrit dans le cadre d’un congrès : « Cell signaling,

transcription and translation as therapeutic targets », qui a eu lieu au Luxembourg en

janvier/février 2002. J’ai présenté une affiche à ce congrès. J’ai structuré et écrit la première

version de cet article ainsi que contribué à la version finale. J’ai également fait toutes les

figures.

101

3.1 Résumé

La formation des métastases est une complication redoutable du cancer qui est associée à un

mauvais pronostique. Plusieurs observations cliniques et résultats expérimentaux indiquent

que le processus métastatique est non aléatoire et implique un série d’événements multiples

qui peuvent tous être visés par la thérapie. Ceci inclut l'angiogénèse du néoplasme primaire, le

dégagement des cellules malignes de ce néoplasme, l’entrée des cellules cancéreuses dans la

circulation sanguine, l'interaction des cellules cancéreuses avec les cellules endothéliales

vasculaires dans les organes éloignés, la croissance des cellules cancéreuses localement dans

les vaisseaux sanguin ou d'une manière distale après extravasation. Notre hypothèse de travail

est que les cellules cancéreuses métastatiques parasitent les mécanismes de l'inflammation

pour émigrer efficacement dans les organes éloignés. Ceci implique, entre autres, un rôle

important des interactions adhésives spécifiques des cellules cancéreuses avec les cellules

endothéliales vasculaires ainsi que l'activation des voies migratrices dans les cellules

cancéreuses. Nous passons en revue ici les rôles joués par la molécule d’adhérence

endothéliale E-sélectine et de la voie kinase SAPK2/p38 des cellules cancéreuses pour

moduler la migration transendothéliale des cellules cancéreuses.

102

3.2 Article

Running title : Laferrière et al.: E-Selectin and SAPK2/p38 in metastasis

Regulation of the metastatic process by E-selectin and stress-activated protein kinase-2 /

p38

Julie Laferrière, François Houle and Jacques Huot

Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec,

G1R 2J6, Canada

Address for correspondence: Jacques Huot, Centre de Recherche en Cancérologie de

l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 9 rue McMahon, Québec, Québec, G1R 2J6,

Canada. Voice: 418-525-4444, extension 5553; fax: 418-691-5439 e-mail:

jacques.huot@phc.ulaval.ca

Key words : E-selectin; selectins; metastasis; liver metastasis; SAPK2/p38; MAPK;

migration; endothelial cells; colon cancer; breast cancer; integrins; adhesive molecules

103

3.2.1 Abstract

The formation of metastasis is a dreadful complication of cancer that is associated with a poor

prognostis. Several clinical observations and experimental findings indicate that the metastatic

process is nonrandom and involves a sequence of multistep events that may all be targeted for

therapy. This includes angiogenesis of the primary neoplasm, release of malignant cells from

this neoplasm, entry of cancer cells into the blood circulation, interaction of cancer cells with

vascular endothelial cells in distant organs, and growth of blood-borne cancer cells locally in

the vessels or distally following extravasation. Our working hypothesis is that metastatic

cancer cells exploit the mechanisms of the inflammation process to succesfully migrate into

distant organs. This implies a pivotal role for specific adhesive interactions between cancer

cells and vascular endothelial cells and activation of migratory pathways in the cancer cells.

We review here the roles played by the endothelial adhesive molecule E-selectin and of the

motogenic stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) pathway of cancer cells in

modulating transendothelial migration of cancer cells.

3.2.2 Selectins: classification, structure and binding

The selectins are a family of three calcium-dependent adhesion receptors that regroup L-, P-

and E-selectin. L-selectin is expressed constitutively by lymphocytes, whereas E-selectin is

expressed exclusively by activated endothelial cells. P-selectin is found in platelets and

endothelial cells, where it is stored in α−granules and Weibel-Palade bodies, respectively. The

extracellular portion of each selectin is composed of three different domains; a C-type lectin

domain of 120 amino acids in the amino-terminal, an epidermal growth factor (EGF)-type

domain of 30-40 amino acids, and 2-9 short consensus repeats (~60 amino acids) that are

found in complement regulatory proteins (CRP). The selectins are anchored in the membrane

through a single helicoidal transmembrane domain that is followed by a short cytoplasmic tail

(1,2). The selectins contribute importantly to the entry of leukocytes into inflamed tissues.

104

Initial tethering of leukocytes to the endothelium is mediated by selectins and is followed by

their rolling on the endothelial layer. The rolling leukocytes sense chemokines on the surface

of the endothelium, an event which activates their integrins and trigger firmer adhesion and

subsequent transendothelial migration to the inflammatory site (2-4). A treshold level of fluid

shear stress is necessary to promote rolling and adhesion of leukocytes through selectins (5).

E-selectin is not expressed in non-activated endothelial cells. However, it is quickly and

transiently expressed following a challenge by proinflammatory stimuli such as tumor necrosis

factor-α (��F-α), interleukin-1β, thrombin and bacterial lipopolysaccharide (LPS) (2,6,7).

Intriguingly, hyperglycemia also turns on the expression of E-selectin by endothelial cells (8).

Maximal E-selectin mRNA levels are usually found within 3 to 4 h of exposure to appropriate

stimuli (6,9). Three pathways converge on the activation of the E-selectin gene promoter

following stimulation of endothelial cells with TNF-α: the NF-κB pathway, the SAPK1/JNK

pathway and the SAPK2/p38 MAP kinase pathway. Both the SAPK1/JNK and SAPK2/p38

pathways mediate increases in E-selectin gene promoter activity through activation of the

transcription factors c-Jun and ATF2 (10). The SAPK2/p38-mediated activation of the E-

selectin gene is ancillary and dispensable for full expression of the protein (11). Of note, the

endothelial selectins may be expressed differentially in blood vessels from different tissues.

For example, LPS and TNF-α strongly induce the expression of P-selectin on endothelial cells

of the leptomeninges, but at a weaker level on some blood vessels of the brain parenchyma

(9).

The selectins bind to various carbohydrates such as sialyl-Lewis a and x (SLea and SLex) or

other fucosylated oligosacccharides that are presented by a scaffold protein and possibly a

lipid carrier molecule on the adhering cells (2,12,13). This macromolecular scaffolding

complex, known as selectin ligand or counterreceptor, is essential for binding. The sialyl-

Lewis sugars alone have only a weak affinity for selectins, whereas the presenter proteins have

no binding capacity by themselves. The sugar-protein complex of binding contributes to the

specificity of interactions since the binding affinity of a given sugar for a given selectin varies

depending on the presenter proteins. P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), a shared

ligand for both P- and E-selectins, is a transmembrane o-glycosylated protein that is found on

leukocytes and lymphoid cells (14). Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1

105

(GlyCAM-1) and CD34 are two mucin-like potential ligands for L-selectin that are both

presented by endothelial cells. GlyCAM-1 expressed on high endothelial venules (HEVs)

allows homing of lymphocytes to lymph nodes. Mucosal addressin cell adhesion molecule-1

(MadCam-1) is another L-selectin ligand that is found on the surface of endothelial cells from

mesenteric venules (2). The glycoprotein E-selectin ligand-1 (ESL-1) is a potential ligand for

E-selectin that is present on neutrophil and myeloid leukemia cells (15,16). This protein is a

variant of a tyrosine kinase receptor for FGF, which suggests that it may be involved in

transducing signal elicited from its binding with E-selectin (Figure 3-1).

3.2.3 E-Selectin and cell signaling

Signaling involving the selectins is bidirectional in that sense that it originates from the

cytoplasmic tail of the selectins and also from their activated counterreceptors or ligands.

Several studies showed that the cytoplasmic tail of the selectins mediates signaling. In

neutrophils, the cross-linking of L-selectin primes degranulation, in a process that requires the

activation of the SAPK2/p38 MAPkinase (17). Similarly, cross-linking of E-selectin initiates

in endothelial cells the tyrosine phosphorylation of tyrosine 603, which allows the recruitment

of SHP2 and then the building up of an adapter protein complex that leads to actvation of ERK

(18). Moreover, adhesion of leukocytes in IL1-ß-activated endothelial cells induces the

clustering of E-selectin, which leads in these cells to the association with actin and actin-

associated proteins such as α-actinin, vinculin, filamin, paxillin and focal adhesion kinase

(FAK) (19). These observations may explain the modification of endothelial cell shape that is

induced by cross-linking of E-selectin with specific antibodies (20). Signaling from E-selectin

ligands has been initially reported in 1997 by Soltesz et al., who showed that the adhesion of

colon carcinoma HT-29 cells to an E-selectin-IgG chimera increased the tyrosine

phosphorylation of various proteins including c-Src (21). As discussed below, we found that

the binding to E-selectin increases the activity of SAPK2/p38 in HT-29 cells (11).

Interestingly, the activation of neutrophils that results from tethering to E-selectin acts in

synergy with platelet-activating factor (PAF) to transduce the signals that activate integrin β2

from the neutrophils and to prolong PAF-induced calcium mobilization (22).

106

Figure 3-1 Selectins and their counterreceptors/ligands.

The extracellular portion of selectins is composed of a terminal C-type lectin domain that binds to counterreceptors or ligands on adhering cells. The lectin domain is followed by a single EGF-type repeat and various numbers of consensus repeats found in complement regulatory proteins (CRP). The selectins have single transmembrane region and a short cytoplasmic tail. The selectin ligands on adhering cells consist of a scaffolding complex that contains various carbohydrates such as sialyl-Lewis a and x or other fucosylated oligosaccahrides that are presented by carrier proteins and possibly lipid molecules. The best-known selectin ligands are GlyCAM-1 (glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1) for L-selectin, ESL-1 (E-selectin ligand-1) for E-selectin and PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) for E- and P-selectin.

107

Overall, these studies indicate that interaction of E-selectin with its counterreceptors/ligands

induces two different signals: one in the endothelial cells and one in the adhering cells. This

bidirectional signaling regulates the secondary interactions of both types of cells with integrins

and ultimately leads to shape modifications that allow transmigration of the adhering cells.

3.2.4 Stress-activated protein kinase-2/p38 (SAPK2/p38)

Stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) refers to the α and β isoforms of the p38

mitogen-activated protein kinase (MAPK) that also comprise SAPK3 (p38γ) and SAPK4

(p38δ) (23). The SAPK2/p38 pathway is strongly activated by stressful stimuli (UV light, heat

shock, oxidative stress, chemotherapeutic agents), inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1,

LPS), and vascular endothelial growth factor (VEGF) (11,23-25). SAPK2/p38 is

characterized by its dual-phosphorylation site on a TGY motif in the loop 12 linker between

kinase subdomains VII and VIII (26,27). Compounds such as the pyrinidyl imidazole

inhibitors SB203580 and SB202190 specifically bind to the ATP-binding site of SAPK2/38,

which inhibits its kinase activity (28). Like other members of the MAP kinase family, the

SAPK2/p38 pathway consists of membrane receptors or sensors that are connected, through

adapter proteins, to small GTPases that are upstream of MAPK kinase kinases (MAPKKKs),

MAPK kinases (MAPKKs) and the MAPK itself. MKK3 and MKK6 are two dual-activity

kinases (MAPKK) that are specific activators of SAPK2/p38. MKK6 activates all isoforms of

SAPK2/p38, whereas MKK3 activates the α, γ and δ isoforms. MKK4, which activates the

SAPK1/JNK pathway, activates the p38α isoform (26,27,29,30). The MAPKKKs are less

characterized, while the small GTPases vary according to cell types and may involve Rac and

cdc42 (23). Stimulation of SAPK2/p38 culminates in the activation of both nuclear and

cytoplasmic targets (Figure 3-2). Major nuclear targets of SAPK2/p38 include the

transcription factors ATF-2, GADD153, and Elk-1 (23), whereas MAPKAPK-2/3 (mitogen-

activated protein kinase-activated protein kinase 2/3) is the better known of its cytoplasmic

targets. Activation of MAPKAPK2/3 by SAPK2/p38 leads to the phosphorylation of the small

heat shock protein HSP27, which triggers actin polymerization and remodeling into stress

108

fibers (31,32). In HeLa cells, phosphorylation of HSP27 may also result from PRAK, another

target of SAPK2/p38 (33).

The SAPK2/p38 pathway is implicated in conveying signals that trigger the induction of a

variety of responses in many different types of cells. In particular, the inflammatory response

is tightly associated with the activation of SAPK2/p38. It leads to induction of proinflamatory

cytokines such as TNF-α and interleukins by macrophages, induction of adhesive molecules

(E-selectin) on endothelial cells, induction of the respiratory burst, and up-regulation of β2

integrins in neutrophils ((10,24,34,35). SAPK2/p38 is also importantly involved in regulating

apoptosis to oxidative stress, chemotherapeutic agents and heat shock (36-38). Apart from its

role in regulating the inflammatory response and apoptosis, SAPK2/p38 plays direct roles in

cancer and metastasis. For example, endogenous SAPK2/p38 activity is elevated in invasive

breast cancer cells. This contributes to promote the stability of urokinase plasminogen

activator (uPA) and its receptor (uPAR) mRNA, which leads to overproduction of uPA and

uPAR, both essential for tumor cell invasion and metastasis (39). Interestingly, αv integrin is

tightly associated with this SAPK2/p38-mediated invasive phenotype since antibody against

αv integrin inhibits both the activation of SAPK2/p38 and the synthesis of uPA (40). Of note,

increased actin polymerization generated through activation of SAPK2/p38 by VEGF

contributes with FAK-mediated assembly/deassembly of focal adhesions to initiate the actin

remodeling required to drive endothelial cell migration, an essential step of angiogenesis

(25,41).

109

Figure 3-2 The SAPK2/p38 pathway.

Like other members of the MAP kinase family, the SAPK2/p38 pathway is composed of the MAP kinase module that comprises the MAP kinase (SAPK2/p38), the MAP kinase kinases (MKK3/MKK6) and the MAP kinase kinase kinases (PAK). The module is connected to membrane receptors or stress sensors by means of adapter proteins and small GTPases. Activation of SAPK2/p38 leads to the phosphorylation of various transcription factors and also of MAPKAP kinase 2. Then activated MAPKAP kinase 2 phosphorylates the actin polymerizing factor HSP27.

110

3.2.5 Joint role of E-selectin and SAPK2/p38 in metastasis

E-Selectin played a major role in the adhesion of epithelial cancer cells to the endothelium

(42). The ability of cancer cell clones to bind E-selectin on endothelial cells is even directly

proportional to their metastatic potential (43). Moreover, drugs such as cimetidine, which

inhibits the expression of E-selectin, blocks the adhesion of tumor cells to the endothelium and

prevents metastasis (44). Similarly, interfering with the binding of colon carcinoma cells to the

endothelium, by using an E-selectin-immunoglobulin, blocks the retention of these cells in the

lung and impairs the formation of lung metastasis (45). Interestingly, Lewis lung carcinoma

cells trigger the expression of E-selectin by liver sinusoidal endothelium, increasing their

metastatic potential, and suggesting that this may underlie specificity for hepatic colonization

(46,47). In humans, the circulating levels of E-selectin are associated with clinical metastasis.

In particular, in patients with breast cancer, it has been suggested that, at advanced stages,

high concentrations of circulating soluble E-selectin (sE-selectin) are associated with liver

metastasis (48). In contrast, low levels of circulating sE-selectin are associated with a strong

prognostic value for overall and disease-free survival in patients with node-negative breast

cancer (49). Of note, metastatic colonization also correlates with the expression of other types

of endothelial adhesive molecules such as P-selectin and ICAM (50-55). The increased

metastatic potential associated with adhesion of tumor cells to the endothelium might result

from two distinctive processes: local intravascular proliferation of the attached tumor cells or

extravasation of these cells following their transendothelial migration into the subvascular

tissues (56,57). In both cases, the underlying biochemical mechanisms remain ill defined.

111

112

Figure 3-3 Activation of SAPK2/p38 by E-selectin and regulation of transedothelial migration by E-selectin-mediated activation of SAPK2/p38 in cancer cells.

(A) Colon carcinoma HT-29 cells were grown for 24 h and then treated for various periods with 1 µg/ml of recombinant human E-Selectin/Fc chimera. Thereafter, SAPK2/p38 activity was determined by Western blotting using a phospho-p38 antibody (PY-p38). (B) HUVECs were grown to confluency for 48 h on a 5-µm pore size polycarbonate membrane in Boyden-modified chambers. HUVECs were treated or not with 10 ng/ml TNF-α for 90 min. Thereafter, culture media were changed for fresh media and cells incubated for an additional 2.5h. HUVECs were treated or not for the last 60 min with an anti-E-selectin-neutralizing antibody. HT-29 cells pretreated for 30 min with 5 µM SB203580 or with the vehicle (DMSO 0.1%) were then added on the endothelial layer and left to migrate for 4.5h at 37˚C. (Reprinted from Laferrière et al. (11) with permission.)

113

We recently obtained ground-breaking findings concerning the way by which E-selectin may

trigger metastasis. We found that the ligation of a recombinant human E-Selectin/Fc chimera

to metastatic colon carcinoma HT-29 cells induced a rapid activation of the SAPK2/p38

pathway (Figure 3-3a). In turn, this activation is necessary to trigger transendothelial

migration since pretreatment of the cancer cells with the SAPK2/p38 inhibitor SB203580

(Figure 3-3b) or with p38AGF, a dominant-negative form of p38α, inhibits the migration of

HT-29 cells across a layer of endothelial cells that express E-selectin following exposure to

TNF-α (11). This clearly shows that the insidious usage of the E-selectin interaction can be

instrumental in metastasis by activating motogenic pathways in cancer cells, thereby

increasing their invasive potential. Interestingly, adhesion of HeLa cells to human umbilical

vein endothelial cells (HUVECs) is not markedly increased following treatment of endothelial

cells with TNF-α. This suggests that E-selectin lacks a major role in the adhesion of HeLa

cells. Nevertheless, transendothelial migration of Hela cells also requires SAPK2/p38 activity,

since HeLa cells stably expressing a kinase-inactive mutant of SAPK2/p38 has a lower

capacity to cross the endothelial layer compared to the parental cells. These observations

suggest, first, that activation of SAPK2/p38 may be a common mechanism that triggers

transendothelial migration of tumor cells following their adhesion to the endothelium and

second, that different endothelial adhesive molecules may contribute to activate this pathway.

Endothelial adhesive molecules differ between endothelial cells from different origins, and the

specificity of the cancer cell - endothelial cell interactions may well constitute the basis for the

organ specificity of metastatic colonization. Notably hepatic colonization by Lewis lung

mestastatic cells requires the expression of E-selectin by liver sinusoidal endothelial cells,

whereas pulmonary metastasis requires the expression of the lung endothelial cell adhesion

molecule (LuECAM) (47,58).

3.2.6 Conclusions and future directions

Our findings indicate that the E-selectin interaction with its counterreceptors/ligands is not

only an adhesive interaction but that it is also an important signaling event. We suggest that it

is the first step in a sequence of events that lead to the successful transendothelial migration of

the tumor cells (Figure 3-4). Several questions remain to be answered. For example, it

114

remains to determined whether binding of E-selectin to cancer cells involves the activation of

other motogenic pathways that should complement the role of SAPK2/p38. In this context, the

phosphoinositide-3 kinase (PI-3K) pathway that is associated with cell migration and with

ovarian tumor metastasis is a plausible candidate (59). It remains also to clarify the role of

other molecules, such as integrins β1 and β4 that are implicated in mediating the adhesion of

cancer cells to the endothelium (60,61). Chemokines and their receptors have a critical role in

determining the metastatic destination of tumor cells as indicated by the implication of

CXCL12/CXCR4 in allowing breast cancer cells to form metastases in lymph nodes and lungs

(62). Accordingly, it should also be interesting to undertand the interaction between the E-

selectin ligand and the receptors for chemokine. In this context, the expression of E-selectin by

bone marrow endothelial cells facilitates the mediated homing by chemokine stromal derived

factor-1 (SDF-1) of CD34+ cells to the bone marrow (63). The understanding of the molecular

events that result from the cancer cell interaction with the endothelium can lead to

identification of specific targets for therapy. In particular, identifying the E-selectin ligand on

cancer cells will help in the design of agents that will inhibit transendothelial migration from

its inception.

3.2.7 Acknowledgments

This work was supported by grant from the Cancer Research Society. Julie Laferrière holds

studentships from the FRSQ/FCAR and the Cancer Research Society.

115

Figure 3-4 A working model to explain the regulation of transendothelial migration of cancer cells.

Cancer cells first adhere to endothelial cells through interactions involving endothelial adhesive molecules such as E-selectin and their counterreceptors or ligands on the cancer cells. This initiates, in the cancer cells, the activation of motogenic pathways such as SAPK2/p38, which triggers the transendothelial migration of the cancer, cells enabling them to form secondary neoplasms. Other adhesive interactions involving the integrins are also possibly involved in the process. Intriguingly, binding of E-selectin to its ligand activates E-selectin itself. In turn, this elicits signals in endothelial cells that are possibly involved in inducing changes in endothelial cell shape that facilitate the passage of the cancer cells.

116

3.2.8 References

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Chapitre 4

Adhérence par la E-sélectine et l’intégrine β4

122

4 L'adhérence E-sélectine-dépendante des cellules cancéreuses HT-29 aux cellules endothéliales médie l'adhérence intégrine β4-dépendante des cellules cancéreuses

Ce chapitre fait l’objet d’un manuscrit en préparation pour soumission au cours de l’automne

2003. Cet article a été écrit avec mes travaux. Le deuxième auteur a contribué à la figure 4.

J’ai structuré et écrit le document.

123

4.1 Résumé

L’adhérence des cellules de carcinome du colon HT-29 aux cellules endothéliales HUVEC

(human umbilical vein endothelial cells) activées par le TNFα se fait par l'interaction

spécifique à la E-sélectine. Cette interaction active, dans les cellules cancéreuses, la MAP

kinase SAPK2/p38, qui mène à leur migration transendothéliale (Laferrière et al.,

J.Biol.Chem. 276, 33762, 2001). Nous avons regardé l’implication de la E-sélectine dans

l’adhérence médiée par les intégrines. Sur les cellules HT-29, le blocage de différentes

intégrines (α2, α3, α6, αvβ5, β1 et β4), à l’aide d’anticorps spécifiques, montre que

l'intégrine β4 joue un rôle dans l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées .

L'adhérence dépendante de l’intégrine β4 est maximale après 30 minutes, tandis que

l'adhérence dépendante de la E-sélectine est maximale après 15 minutes. Ceci suggère une

séquence d’événements reliés entre l'adhérence par la E-sélectine et celle par l’intégrine β4

des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales. La liaison des cellules HT-29 à une

protéine chimérique de E-sélectine/Fc active les deux MAP kinases SAPK2/p38 et ERK. Nous

concluons que l'adhérence des cellules de carcinome du côlon HT-29 aux cellules

endothéliales activées par le TNFα est médiée initialement par l'interaction de la E-sélectine

suivie de l’interaction de l’intégrine β4 à leurs récepteurs respectifs sur les cellules

endothéliales. Ces deux évènements sont séquentiels mais semblent non dépendants au point

de vue signalisation.

124

4.2 Article

Adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells requires sequential events

involving E-selectin and integrin β4

Julie Laferrière, François Houle and Jacques Huot

Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec,

G1R 2J6, Canada

Address for correspondence: Jacques Huot, Centre de Recherche en Cancérologie de

l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 9 rue McMahon, Québec, Québec, G1R 2J6,

Canada. Voice: 418-525-4444, extension 5553; fax: 418-691-5439 E-mail:

jacques.huot@phc.ulaval.ca

This work was supported by a grant from the Cancer Research Society. Julie Laferrière holds

studentships from the FRSQ/FCAR and the Cancer Research Society.

KEYWORDS: E-selectin, integrin β4; adhesion; SAPK2/p38; ERK

125

126

4.2.1 Summary

HT-29 colon carcinoma cells attach to TNFα-activated human umbilical vein endothelial cells

(HUVECs) by the specific binding to E-selectin. This interaction activates, in the cancer cells,

the mitogen activated protein (MAP) kinase SAPK2/p38, which leads to their transendothelial

migration (Laferrière et al., J.Biol.Chem. 276, 33762, 2001). In this study, we investigated the

role of E-selectin in activating integrins to strengthen adhesion and to regulate integrin-

mediated events. Blocking the integrins (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) from HT-29 cells with

specific antibodies reveals a role for β4 integrin in their adhesion to TNFα-treated HUVECs.

The β4 integrin-dependent adhesion was maximal after 30 minutes, whereas the-E-selectin-

dependent adhesion was maximal after 15 minutes. This suggested an interrelated sequence of

signaling events between E-selectin and β4-mediated adhesion of cancer cells to endothelial

cells. The binding of HT-29 cells to a recombinant E-selectin/Fc chimera activated both the

SAPK2/p38 and the extracellular signal regulated kinase (ERK) MAP kinases. However, the

binding of E-selectin is not associated with an increased phosphorylation of integrin β4. We

conclude that the adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to the activated endothelial cells is

mediated initially by the binding of E-selectin to its receptor on carcinoma cells and then by

the binding of β4 integrin to its receptor on endothelial cells. Both events are sequential but

appear to be signalingly independent.

4.2.2 Introduction

Metastasis is a specific process that implies the successful completion of several steps [1].

One of them, the interaction of cancer cells with the endothelium, is mediated by adhesion

molecules, such as those used by leucocytes during inflammation [2]. The sequence of events

that underlies the interaction of leucocytes with endothelial cells is well characterized and has

been described as the "multistep paradigm". It involves the sequential participation of

127

selectins, chemokines and integrins [3]. Selectins are a family of lectin-like carbohydrate

binding proteins that consist of three members, L-, P- and E-selectin [4]. E-selectin, whose

expression by endothelial cells is induced by cytokines and growth factor, promotes the

adhesion of epithelial cancer cell lines to the endothelium [4-6]. The ability of colon tumor

cell to bind E-selectin is even directly proportional to their metastatic potential [7]. Moreover,

inhibiting the expression of E-selectin with drugs such as cimetidine or with a c-raf antisens

oligonucleotide prevents metastasis [8, 9]. The binding of colon carcinoma cells to E-selectin

increases the tyrosine phosphorylation of several proteins [10-12]. It also leads to activation

of the SAPK2/p38 mitogen activated protein (MAP) kinase [13]. Interestingly, the rolling of

neutrophils on E-selectin, under shear stress but in the absence of chemotactic stimulation,

also activates SAPK2/p38, which leads to cell arrest via β2 integrin on ICAM-1 [14].

Integrins are a family of adhesion receptors that mediates the adhesion of cells with the

extracellular matrix or other cells. Integrins are composed of an heterodimer of an α and β

subunit, non-covalently associated. Each distinct pair of α and β subunits binds to a specific

set of ligands to mediate various cellular effects [15]. The intracellular domain of the α and β

subunits is short (generally less than fifty amino acids) and is actively involved in cell

signaling, namely to the actin cytoskeleton [16]. The β4 integrin is different from other β

subunits. With a cytoplasmic domain of about 1000 amino acids, β4 is implicated in the

binding to intermediate filaments in hemidesmosomes. Upon cell activation by chemotactic

agents, β4 quickly translocates in the lamellipodia of migrating cells and becomes associated

with cortical F-actin [17]. Furthermore, the expression of α6β4 integrin is associated with

tumor aggressiveness and is implicated in the invasive phenotype of carcinoma [18]. The

α6β4 integrin leads to activation of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3K), which

promotes the formation of lamellae and the invasion of carcinoma cells [19]. Interestingly, the

activation of PI-3K and promotion of invasion can be independent of the extracellular domain

of β4 integrin [20].

The kinase SAPK2/p38 is a member of the MAP kinase cascade family that transduces signals

generated by stress and growth factors [21, 22]. It regulates the activation of transcription

factors such as ATF2 and of cytoplasmic kinases such as MAPKAP kinases 2/3, a kinase that

128

phosphorylates the actin-polymerizing factor HSP27 [23]. In endothelial cells, a cell type that

expresses high levels of HSP27, SAPK2/p38-mediated phosphorylation of HSP27 triggers

actin polymerization and reorganization into stress fibers in response to oxidative stress and

VEGF [22, 24]. The activation of SAPK2/p38 also leads to migration of endothelial cells in

response to VEGF and to the transendothelial migration of cancer cells [13, 22, 25]. The ERK

kinase transduces signals generated mainly by growth factors. It targets transcription factors

(Elk-1, ETS), kinases (S6 kinase, MLCK) and cytoskeletal proteins (paxillin, tropomyosin-1)

[26, 27]. It is implicated in growth, survival and invasion of cancer cells [28, 29]. There is an

intense crosstalk between the ERK and SAPK2/p38 kinase pathways, the activity of one

influencing that of the other [30-32]. Notably, the ratio of the ERK and SAPK2/p38 activities

can be predictive of cell proliferation (ERK>p38) or dormancy (p38>ERK) of tumor cells

[33].

In the present study, we investigated the signaling interaction between E-selectin binding and

β4 integrin in HT-29 cells. We show that the binding of E-selectin to HT-29 cells triggers the

activation of SAPK2/p38 and ERK. The E-selectin mediated adhesion is a prerequisite to β4

mediated adhesion of HT-29 cells to endothelial cells.

4.2.3 Experimental procedures

Materials–TNFα was purchased from Calbiochem (San Diego, CA). Calcein-AM was

obtained from Molecular Probes (Eugene, OR) and recombinant human E-selectin/Fc chimera

was obtained from R&D Systems (Minneapolis, MN). Chemicals for electrophoresis were

obtained from Bio-Rad and Fisher.

Antibodies–Anti-E-selectin (BBA26) antibody is a mouse monoclonal antibody that was

purchased from Chemicon (Temicula, CA). The various anti-integrin antibodies were

purchased from Chemicon. Mouse IgG1κ was obtained from Sigma. The anti phospho-p38

and phospho-ERK antibodies are rabbit polyclonal and mouse monoclonal antibodies

respectively that were purchased from New England Biolabs (Beverly, MA).

129

Cells–Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase

digestion of umbilical veins from undamaged sections of fresh cords. Briefly, the umbilical

vein was cannulated, washed with Earle’s balanced salt solution and perfused for 10 min with

collagenase (1 mg/ml) in Earle’s balanced salt solution at 37oC. After perfusion, the detached

cells were collected, the vein was washed with medium 199 and the wash-off pooled with the

perfusate. The cells were washed by centrifugation and plated on gelatin-coated 75 cm2

culture dishes in medium 199 containing 20% heat-inactivated fetal bovine serum, endothelial

cell growth supplement (60 µg/ml), glutamine, heparin and antibiotics. Replicated cultures

were obtained by trypsinization and were used at passages ≤ 5. The identity of HUVEC as

endothelial cells was confirmed by their polygonal morphology and by detecting their

immunoreactivity for factor VIII-related antigens. HT-29 human colon carcinoma cells were

obtained from ATCC (Manassas, MD). They were cultivated in McCoy 5A medium

supplemented with 10% fetal bovine serum. Cultures were kept at 37oC in a humidified

atmosphere containing 5% CO2.

Kinase assays–SAPK2/p38 and ERK activation were evaluated by Western blotting

(following the manufacturer’s protocol) using an antibody that recognizes the phosphorylated

form of the kinases (New England Biolabs).

In vivo phosphorylation–HT-29 cells plated in 35mm Petri dishes were incubated in PO4 free

medium for 1 h prior to be labeled with H3[32P]O4 (60-200 µCi/ml) for 90 min. Cells were

treated and then were lysed for immunoprecipitation in 75 µl of buffer B (150 mM NaCl, 50

mM Tris-HCl pH 7.5, 1% Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate, 2 mM EDTA, 2 mM

EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM leupeptin, 50 µg/ml pepstatin, and 1 mM phenylmethylsulfonyl

fluoride). Samples were diluted three times and precleared with 10 µl of a 50% v/v Protein-G

sepharose suspension for 15 min with shaking on ice. Supernatants were incubated on for 90

min with 8 µl of anti-β4 antibody and then 10 µl of 50% v/v Protein-G Sepharose (Amersham

Pharmacia Biotech) were added and incubation was extend for 30 min on ice with shaking.

Antibody-antigen complexes were washed four times with B buffer after then SDS-PAGE

loading buffer was added. Proteins were separated through SDS-PAGE and the gel was dried

or transferred onto nitrocellulose for Western blotting using anti-integrin β4 antibody.

130

Adhesion assays to HUVEC–HUVEC were plated on gelatin-coated slides and left to grow to

confluence for 24 h. HT-29 cells were labeled for 30 min at 37oC with calcein-AM. Labeled

cells were left to adhere to the endothelial layer for 15 or 30 min at 37oC. The endothelial

layer was washed twice with phosphate-buffered saline and the attached cells were quantified

by measuring the fluorescence emission using a fluorometer. The actual number of adhering

cells was calculated from a standard curve.

Adhesion assays to matrix–Proteins were absorbed to 96 well plates 1h at 37oC or overnight

at 4oC (prior to 1h at 37oC) with 50 µl of matrix solution at the appropriate concentration.

The wells were then blocked with 1% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline for

at least 20 min. HT-29 cells were then added in complete media and left to adhere for 30 min

at 37oC (105 cells/well in 100 µl). When used, antibodies were preincubated for 20 min with

the cells in suspension prior to the adhesion. Wells were then washed twice with media to

remove non-adherent cells. The cells were then fixed for 30 min with 1% glutaraldehyde in

phosphate-buffered saline and colored with 0.1% violet crystal for 15 min. The wells were

then washed extensively with water and solubilized in 1% SDS. Optical density was then read

at 550 nm.

Statistical analysis–Data are mean +/- S.D, as indicated in the text.

4.2.4 Results

Sequential E-selectin– and integrin β4–dependent adhesion of tumor cells to endothelial

cells – In primary cultures of HUVEC, TNFα induces a strong activation of the expression of

E-selectin, which leads to an increased adhesion of HT-29 cancer cells to HUVEC [13]. In

fact, HT-29 cells directly adhere to a chimeric form of E-selectin/Fc coated in plastic wells.

The adhesion is dose-dependent and is inhibited by a specific anti-E-selectin antibody (Figure

4-1). In contrast, they do not adhere to BSA or to plastic. This confirms that E-selectin is a

major determinant of cancer cell adhesion. The expression of E-selectin is also importantly

131

involved in the adhesion and rolling of leucocytes on the endothelium during the inflammatory

processes [4]. In that case, the E-selectin-mediated adhesion is followed by a longer term

adhesion that involves integrins. We investigated here whether the integrins expressed by HT-

29 cells also participate in their adhesion to HUVEC.

The integrins expressed by HT-29 cells have been identified as α2, α3, α6, αv, β1, β4 and β5

[34]. To determine the role of these integrins in the adhesion of HT-29 cells to endothelial

cells, we pre-treated calcein-labelled HT-29 cells in suspension with anti-integrin blocking

antibodies and then left the cells to adhere for 15 to 30 min to TNFα-activated HUVEC

expressing E-selectin. We found that the 30 minutes-, but not the 15 minutes-, adhesion of

HT-29 cells to endothelial cells was impaired by the anti β4 integrin blocking antibody.

However, none of the other anti-integrin antibodies had any influence on the adhesion of HT-

29 cells (Figure 4-2A). This underscores a critical role for integrin β4 of HT-29 cells in their

adhesion to endothelial cells expressing E-selectin. In accordance, HT-29 cells strongly

adhere to laminin, a typical extracellular matrix that bind to β4 integrin (Figure 4-1).

Interestingly, blocking E-selectin with an anti-E-selectin antibody inhibits the adhesion of HT-

29 cells as early as within 15 minutes of adhesion to TNFα-treated HUVEC (Figure 4-2B).

Hence, both E-selectin from endothelial cells and integrin β4 from HT-29 tumor cells are

sequentially implicated in mediating their mutual adhesive interactions. This raised the

questions as to whether or not the E-selectin and β4-mediated adhesions are separated or

linked events.

E-selectin- and integrin β4-dependent adhesions of cancer cells to endothelial cells are

sequential but signalingly independent –The binding of E-selectin to HT-29 cells induces a

time-dependent stimulation of SAPK2/p38 ([13] and Figure 4-3). In turn, this increases the

migratory potential of HT-29 cells enabling their transendothelial migration [13]. We verified

here whether the E-selectin binding to HT-29 also induced the activation of the two other

MAP kinases, ERK and JNK, with the aim of identifying the downstream events associated

with the activation. HT-29 cells was added to wells coated with E-selectin/Fc in concentration

(5µg/ml) that induced maximal adhesion and then MAP kinase activation was assayed by

using antibody that specifically recognized the phosphorylated/activated form of the kinases.

132

We found that E-selectin binding to HT-29 cells resulted in a time-dependent activation of

both ERK and SAPK2/p38. The maximal activation of ERK occurs after 60 min in contrast of

10 min in the case of SAPK2/p38 (Figure 4-3). Intriguingly, JNK was not activated by E-

selectin, neither was the focal adhesion kinase FAK (data not shown), which suggested a

specificity in the signaling pathways activated by the binding of E-selectin to its ligand.

Interestingly, the activation of ERK occurs simultaneously to β4-mediated maximal adhesion

of HT-29 cells to HUVEC. Since ERK is known to be activated following tyrosine

phosphorylation of β4 on residue Y1526 [17], this raised the possibility that the binding of E-

selectin activates ERK via inducing the tyrosine phosphorylation of integrin β4. Alternatively,

since β4 integrin is known to be activated by phosphorylation [35], the concordance between

the peaks of ERK activation and β4-mediated adhesion suggested that E-selectin-induced

activation of ERK could be involved in the phosphorylation of integrin β4. We thus

ascertained whether integrin β4 was phosphorylated following in vivo labeling in the presence

of H3[32P]04 in response to E-selectin and whether this occurs specifically on tyrosine residues.

Results showed that E-selectin did not induce the tyrosine phopshorylation of integrin β4

following probing with two different antiphosphotyrosine antibodies nor did it induce

phosphorylation following incubation with labeled [32P] (Figure 4A and 4B). In contrast,

exposure of cells to sodium vanadate, a classical inducer of tyrosine phosphorylation of

integrin β4 [35], resulted, in both cases, in a marked phosphorylation of β4. These results

suggest that E-selectin binding to its ligand on the cancer cells does not lead to

phosphorylation of integrin β4. In corollary, the results support the hypothesis that the E-

selectin-and integrin β4-mediated adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial

cells are two sequential but signalingly independent events.

133

Figure 4-1 HT-29 cells adhesion to E-selectin/Fc chimera.

HT-29 cells were left to adhere for 30 minutes to different concentration of matrices in the presence or not of 25 µg/ml blocking E-selectin antibody or a matching isotype. Data points represent the mean + SD.

134

135

Figure 4-2 Adhesion of HT-29 cells to by TNFα-activated HUVEC is mediated sequentially by E-selectin and β4 integrin.

In A and B, HUVEC plated on gelatin-coated slides were left untreated or were treated for 90 min with 10 ng/ml TNFα. Thereafter, culture media were washed and changed for fresh media and cells were incubated for an additional 2h30 with function blocking integrin antibodies for the last 20 minutes (A) or in the presence or not of an anti-E-selectin neutralizing antibody or with a matched isotype antibody (last 60 min) (B). HT-29 cells labelled with Calcein AM were incubated (A) or not (B) for 30 min at 37°C with function blocking integrin antibodies and then added to the endothelial layer and left to adhere for 15 or 30 min at 37°C. After washing, fluorescence was quantified to measure the number of adherent cells. Data points represent the mean ± SD. Representative of 2 different experiments

136

Figure 4-3 Time-dependent activation of p38 and ERK induced by the binding of HT-29 cells to E-selectin/Fc.

HT-29 cells were put in suspension for 75 minutes and then left to adhere to a Petri dish coated with 5µg/ml of E-selectin/Fc. Non-adherent cells were washed away and adherent cells were then extracted and the kinase activity was assessed by Western blotting. To control the maximal induction of the kinases, adherent cells were treated or not with 10 mM H2O2 for 45 minutes.

137

Figure 4-4 Binding of E-selectin/Fc to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of integrin β4.

A, HT-29 cells were untreated (control) or treated with E-selectin/Fc for 30 minutes or with Vanadate. β4 integrin was immunoprecipitated and tyrosine-phosphorylation assessed by Western blotting with a specific phospho-tyrosine antibody. B, Cells were incubated for 1 h in phosphate free medium prior to their labeling for 90 minutes with H3 [32P]O4. The cells were then left untreated (control) or treated with E-selectine/Fc for 30 min or Vanadate. After treatment, cells were lysed and β4 integrin was immunoprecipitated. Incorporation of 32P into β4 containing band is indicated

138

4.2.5 Discussion

Metastasis depends on the successful completion of several distinct processes. One of them,

the interaction of cancer cells with endothelial cells, is mediated by specific adhesion

molecules [2]. Here, we obtained evidence that the adhesive interactions between cancer cells

and endothelial cells are sequential and involved interrelated signaling cascades. Specifically,

HT-29 colon carcinoma cells adhere to HUVEC by sequential interactions involving E-

selectin and β4 integrin. The E-selectin binding to HT-29 cells activates the MAP kinases

ERK within the same time frame (30-60 min) as the β4-dependent adhesion of HT-29 cells to

HUVEC. However, the binding of E-selectin did not lead to phosphorylation of β4 integrin,

which suggests that the activation of ERK by E-selectin is not upstream or downstream of β4.

The binding of E-selectin to HT-29 cells also induces the activation of SAPK2/p38, which, as

we previously shown, increases their migratory potential [13].

The necessity of E-selectin expression for the adhesion of tumor cells HT-29 is supported by

the observation that pre-treating endothelial cells with an anti-E-selectin neutralizing antibody,

but not a matched isotype antibody, inhibited the adhesion of the tumor cells to HUVEC. This

is also supported by the findings that HT-29 cells directly adhere to E-selectin when added to

wells coated with a chimeric form of recombinant E-selectin/Fc. Here again, the adhesion is

inhibited by an anti-E-selectin antibody but not by an irrelevant matched isotype antibody.

Interestingly, we found that the adhesion of HT-29 cells increased with the concentration of E-

selectin being maximal at 5µg/ml. Moreover, it was time-dependent being maximal after 15

minutes of adhesion to HUVEC. Several studies have shown that the E-selectin-mediated

adhesion of neutrophils to endothelial cells was followed by a stronger adhesion involving

integrins [14, 36]. Moreover, the binding of LS174T colon carcinoma to HUVEC under

physiological flow conditions requires the binding of E-selectin and integrins [37]. Along

these lines, we found that the adhesion of HT-29 cells required the participation of integrin β4

from HT-29 cells. This is supported by the findings that HT-29 cells directly adhere to

laminin, the typical matrix protein that binds to β4, and also by the fact that treating HT-29

cells with an anti-β4 blocking antibody inhibits the adhesion of HT-29 cells to HUVEC.

139

Interestingly, the dependence on β4 is selective since none of the antibodies directed against

the other integrins expressed by HT-29 inhibited their adhesion to HUVEC.

The ability of colon tumor cell clones to bind E-selectin expressed by activated endothelial

cells is directly proportional to their metastatic potential [7]. Moreover, drugs like cimetidine

which inhibit the expression of E-selectin prevents metastasis [8]. The adhesion of HT-29 cells

by the binding to E-selectin and β4 integrin occurs on TNFα-activated endothelium. This is

important since cancer cell lines that metastasize to the liver, once they enter the hepatic

circulation release TNFα and induces the expression of E-selectin on sinusoidal endothelium

[38]. Analogously, pro-inflammatory mediators stimulate the cancer cells to release soluble

mediators that increases the expression of E-selection and of other cell adhesion molecules on

endothelial cells [39]. These results suggest that the cancer cells, through paracrine

mechanisms, promote their own adhesion and migration in providing an appropriate

environment.

The selectins bind to various carbohydrate such as sialyl-Lewis a and x (SLea and SLex) or

other fucosylated oligosacccharides that are presented by a scaffold protein and possibly a

lipid carrier molecule on the adhering cells [40]. This macromolecular scaffolding complex,

known as selectin ligand or counter-receptor, is essential for binding. The sialyl-Lewis sugars

alone have only a weak affinity for selectins whereas the presenter proteins have no binding

capacity by themselves. The sugar-protein complex of binding contributes to the specificity of

interactions since the binding affinity of a given sugar for a given selectin varies depending on

the presenter proteins. Here, we found that binding of E-selectin to HT-29 cells resulted in the

activation of the MAP kinases ERK and SAPK2/p38. Moreover, the binding of E-selectin on

cancer cells induced, in HT-29 cells and T84 colon carcinoma cells, an increased tyrosine

phosphorylation of several proteins [10, 12]. In T84 the binding of E-selectin is also

associated with intracellular calcium mobilization, cytoskeleton reorganization, collagenase

secretion and increased motile behavior [11, 12]. Overall, these findings suggest that the E-

selectin receptor on colon cancer cells is a tyrosine kinase receptor or a kinase-associated

receptor. In that sense, the glycoprotein ESL-1 (E-selectin ligand-1), a potential ligand for E-

selectin on neutrophil and myeloid leukemia cells is a variant of a tyrosine kinase receptor for

FGF [41]. However, by mass spectra analysis we did not found any evidence that ESL-1 was a

140

receptor for E-selectin on HT-29 cells (data not shown). Hence, E-selectin ligand on HT-29

cells remains to be identified.

Several studies also point out to the determinant role played by integrin β4 (α6β4) in

conferring a metastatic phenotype [18]. In particular, the β4 integrin is importantly implicated

in cancer invasiveness [17]. Upon cell activation by chemotactic growth factors, β4 is

phosphorylated on both tyrosine and serine/threonine resisdues and quickly translocates from

hemidesmosomes to filopodia and lamellae conferring an invasive phenotype by promoting

cell migration [19, 42, 43]. Intriguingly, expression of β4 is insufficient alone to confer

metastasis [44]. Notably, the signalling properties of α6β4 are influenced by its association

with Erb2 receptor [20]. A major contribution of our study is to have shown that the binding

of E-selectin is a pre-requesite for the β4-dependent adhesion. The β4-dependent adhesion

coincides with the maximal activation of ERK, which suggested the possibility of signaling

link between both events. However, the binding of E-selectin/Fc to HT-29 cells was not

associated with phosphorylation of β4, which renders unlikely the fact that the E-selectin

ligand is directly signaling to β4, neither through ERK nor through other pathways. We thus

conclude that the E-selectin- and β4-dependent adhesions are sequential but not signalingly

associated. However, the possibility of an indirect cross-talk involving chemokines generated

by endothelial cells upon binding of HT-29 cells remains to be ascertain. Little is known

concerning the β4 ligand or counter-receptor on endothelial cells. Recently, mouse lung

endothelial Ca2+-activated chloride channel protein mCLCA1 has been shown to bind β4

integrin, which leads to activation of focal adhesion kinase (FAK) and downstream signaling

to extracellular signal-regulated kinase (ERK) in the cancer cells [45]. The β4 ligand on

HUVEC thus remains to be identified. Its characterization should yield determinant

information since this β4 counter-receptor may be involved non-only in the activation of β4

itself but it may also be implicated in generating signals in the endothelial cells.

In summary, we have shown here that the E-selectin interaction of cancer cells on endothelial

cells promotes the β4 integrin adhesion. This constitutes the first demonstration that cancer

cells attach to the endothelium by the sequential binding of selectins and integrins and that

these events may be linked by signaling pathways. This supports the idea that metastatic

141

cancer cells my use the multistep paradigm of the inflammatory process, [3], to mediate the

selective homing of most types of metastasis. Chemokines and their receptors are implicated

in the metastatic specificty of tumor cells [46]. Whether or not chemokines have a role to play

in the E-selectin-mediated adhesion of cancer cells remains to be demonstrated.

4.2.6 References

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Nature, 2001. 410(6824): p. 50-6.

Chapitre 5

Autres résultats

148

5 Résultats complémentaires

Ce chapitre comprend différents résultats ne faisant pas partie des articles publiés, présentés

dans les chapitres précédents. Les résultats qui y sont rapportés ouvrent néanmoins le projet

sur d’importantes perspectives nouvelles. Certaines de ces perspectives conduisent à des

projets de recherche distincts qui sont déjà poursuivis ou le seront par d’autres étudiants. Le

chapitre est séparé en trois sections : 1) des résultats qui démontrent que l’adhérence des

cellules HT-29 aux cellules HUVEC implique un facteur soluble, 2) une identification

préliminaire du ligand possible de la E-sélectine sur les cellules HT-29, 3) des résultats

d’adhérence des cellules HT-29 sur des lignées endothéliales humaines de différentes origines.

5.1 Rôle d’un médiateur soluble d’origine endothéliale dans l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules endothéliales

Dans le chapitre 2, les résultats montrent que les cellules HT-29 s’attachent aux cellules

HUVEC activées par le TNF par l’intermédiaire de la E-sélectine, que les cellules HL-60

utilisent partiellement la E-sélectine, alors que les cellules HeLa ne l’utilisent pas du tout

(figure 2-2 et 2-8). Le chapitre 4 a démontré l’implication de l’intégrine β4 dans l’adhérence

des cellules HT-29 aux HUVEC activées par le TNF (figure 4-2). Ce résultat a amené

l’hypothèse que l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales utilisait les

mêmes étapes que celle des lymphocytes [4], soit la séquence sélectines, chimiokines solubles

et intégrines. L’hypothèse est d’ailleurs renforcée par un résultat préliminaire obtenu en

étudiant l’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC et qui suggère l’implication d’un

médiateur soluble produit par les cellules endothéliales activées.

L’activation des cellules HUVEC se fait par un prétraitement au TNF. Cette activation amène

l’expression de la E-sélectine. Cette expression est maximale quatre heures après le début du

traitement au TNF. Le présence du TNF n’est pas requise durant les quatre heures

149

d’activation pour obtenir une expression maximale de la E-sélectine. En effet, un

prétraitement minimal de 1h30 au TNF suffi pour amener l’expression maximale de la E-

sélectine quatre heures après le début du traitement.

Afin d’identifier l’effet d’un médiateur produit par les cellules endothéliales, le milieu

conditionné par le prétraitement au TNF a été enlevé avant l’ajout des cellules HT-29 à

l’endothélium pour différents temps. Comme on peut observer à la figure 5-1, le fait d’enlever

le milieu conditionné (cercle bleu plein) plutôt que de laisser le milieu présent (carré rouge

plein (TNF 4 heures), triangle vert plein (TNF 1h30)), diminue l’adhérence des cellules HT-

29, à tous les temps observés. Ces données suggèrent que l’augmentation d’adhérence n’est

pas due au TNF lui-même, mais bien à ses effets, c’est-à-dire aux molécules d’adhérence

exprimées (telle la E-sélectine) et à un possible médiateur sécrété. Ce médiateur pourrait être

synthétisé de novo par les cellules endothéliales. En effet, l’adhérence est diminuée en

changeant le milieu conditionné par les cellules HUVEC traitées durant 4h avec le TNF, alors

qu’une adhérence maximale est obtenue après un changement de milieu effectué à 1h30 de

traitement au TNF suivi d’une période de 2h30 avant l’ajout des cellules cancéreuses.

L’implication d’un médiateur soluble pourrait être confirmée par des expériences d’adhérence

effectuées en utilisant un milieu conditionné sans TNF et en présence ou en absence d’un

inhibiteur de synthèse protéique, telle la cycloheximide. Si le facteur soluble permet d’activer

directement les intégrines des cellules cancéreuses, alors une adhérence avec un milieu

conditionné devrait donner une adhérence maximale. De plus, si la synthèse est de novo, un

prétraitement avec la cycloheximide avant le traitement au TNF, devrait inhiber l’effet du

milieu conditionné, suggérant ainsi le relargage d’une protéine membranaire ou entreposée

dans des granules. Ce facteur soluble devrait être par la suite isolé pour identification et

vérification de son effet sur l’adhérence des cellules cancéreuses à un endothélium activé ou

non.

150

Figure 5-1 Influence du milieu conditionné par un prétraitement au TNF sur l’adhérence des cellules HT-29

Les cellules HT-29 ont été laissées à adhérer pour le temps indiqué en abscisse. Les différents prétraitements cités en légende ont été faits aux cellules endothéliales avant l’ajout des cellules HT-29. La durée totale du prétraitement était de 4 heures. Les cellules endothéliales ont été traitées (motif plein) ou non (motif vide) avec 10 µg/ml de TNFα. Dans une situation (∆ plein et vide), le milieu a été changé après 1h30 de traitement pour un milieu frais durant les 2h30 précédant l’ajout des cellules HT-29. Dans un autre situation (O plein et vide), le milieu a été changé après 4 heures de traitement pour du milieu frais, juste avant l’ajout des cellules HT-29. Pour le détail du protocole d’adhérence, voir les sections 2.2.4 et 4.2.3. Ce résultat provient de la compilation de quatre expériences différentes, toutes en triplicat pour chaque point. Chaque temps d’adhérence a été reproduit au moins à deux occasions.

151

À noter que les résultats précédents ont été obtenus seulement avec l’adhérence des cellules

HT-29 sur des cellules HUVEC activées au TNF. Ils serait intéressant de comparer ce résultat

avec l’adhérence des cellules HL-60, qui ont également une adhérence augmentée sur

l’endothélium activé. De plus, le TNF a des effets similaire à l’interleukine-1 pour

l’expression de diverses molécules d’adhérence [26, 146]. Il serait intéressant de vérifier si

l’interleukine-1 induit la production de ce facteur soluble, afin de cerner si cette production est

spécifique au prétraitement par le TNF, ou si d’autres cytokines peuvent également le

produire.

Bien que ces résultats suggèrent un rôle pour un facteur soluble relargué par l’endothélium, il

n’est pas à négliger que in vivo, les cytokines comme le TNF et l’IL1α peuvent également

activer les cellules cancéreuses. Il a d’ailleurs été démontré que les cellules cancéreuses, suite

à un traitement par différents facteurs pro-inflammatoires, relarguent des facteurs solubles qui

amènent une expression des molécules d’adhérence sur l’endothélium [147]. La possibilité

d’un rôle joué par un facteur libéré par les cellules cancéreuses doit donc aussi être envisagée.

5.2 Identification du ligand de la E-sélectine

L’activation des MAP kinases ERK et SAPK2/p38 par la liaison de la E-sélectine aux cellules

HT-29, nous a amené à supposer la présence sur ces cellules d’un récepteur de la E-sélectine à

activité kinase intrinsèque ou associé. Cette observation répond en fait au premier critère d’un

récepteur biologique fonctionnel, soit celui que la liaison se doit d’être associée à un effet

biologique. En effet, les critères pour définir un « vrai » ligand de la E-sélectine pourrait se

définir comme suit [148]:

1- Le ligand se doit d’être exprimé au bon endroit au bon moment. Dans notre

modèle de métastase, cela veut dire qu’il doit être présent sur la surface de la

cellule cancéreuse lors de sa circulation sanguine.

152

2- Le blocage du ligand, ou son absence, doit inhiber son effet. Ainsi, dans les

cellules HT-29, le blocage du ligand devrait bloquer l’activation des kinases ERK

et p38.

3- Le ligand doit être spécifique à la sélectine. Les sucres seuls, qui sont nécessaires à

la liaison, possèdent une faible affinité pour les sélectines. C’est leur présentation

particulière sur une protéine définie qui permet la génération de ligand de haute

affinité. En ce sens, il est important de se souvenir que le ligand recherché peut être

une protéine connue qui est modifiée de manière nouvelle dans la cellule

cancéreuse, de sorte à devenir un ligand pour la E-sélectine. De manière similaire,

PSGL-1 est exprimé sur différents leucocytes. Cependant, il ne permet pas la

liaison à la P-sélectine sur tous ces types cellulaires. De plus, sur le neutrophile,

seulement environ 20% de PSGL-1 exprimé peut lier de manière efficace la P-

sélectine [148].

Pour la liaison à la E-sélectine quelques ligands peuvent satisfaire ces caractéristiques. ESL-1

(E-selectin ligand 1) est spécifique à la E-sélectine, il est exprimé sur les microvilli et permet

l’adhérence des cellules circulantes [5, 50, 51]. Les deux autres ligands de haute affinité

identifiés sont PSGL-1 et la L-sélectine sur les neutrophiles humains [5]. Sur les cellules

progénitrices hématopoïétiques (CD34+) et non sur leurs consœurs matures, la protéine CD44

a été identifiée comme un ligand N-glycosylé de la E-sélectine. Ce ligand permet le roulement

et l’adhérence aux cellules de la microvasculature de la moelle osseuse qui expriment la

E-sélectine de manière constitutive [149].

L’addition des structures oligosaccharidiques sur la protéine présentatrice peut se réaliser par

N-glycosylation, c’est-à-dire par des liaisons N-glycosidiques entre le groupement

carboxamide de l’asparagine et un groupement hydroxy de la chaîne oligosaccharidique. On

observe également, quoi que plus rarement, de la O-glycosylation entre le groupement

hydroxy de la thréonine ou de la sérine et un groupement hydroxy de la chaîne

oligosaccharidique. Afin de vérifier la glycosylation du candidat isolé sur les cellules HT-29,

il serait possible de traiter les cellules ou les extraits avec l’enzyme N-glycosidase F pour

enlever la N-glycosylation [149]. De plus, un traitement à la trypsine peut enlever toutes les

153

glycoprotéines et l’utilisation de combinaison de différents inhibiteurs et enzymes peut

spécifier la nature de la glycosylation du ligand de la E-sélectine sur les cellules HT-29 [150].

Afin d’identifier le ligand ou contre-récepteur de la E-sélectine, une approche d’isolation par

affinité a été utilisée, principalement basée sur les travaux du groupe de D.Vestweber pour

l’identification de ESL-1 [50]. Les premiers résultats ont été obtenus en essayant d’éluer le

récepteur de l’appât, soit une chimère de E-sélectine/Fc. Comme la E-sélectine/Fc était

également partiellement éluée, j’ai plutôt opté pour une isolation sur gel à deux dimensions.

Cette méthode a permis d’isoler un candidat, d’un poids moléculaire approximatif de plus de

116 kDa, et un point isoélectrique (pI) acide, près de 3 (figure 5-2). L’analyse de ce candidat

par spectre de masse (MALDI-TOF) a révélé qu’il ne correspondait pas à ESL-1 ni d’ailleurs à

aucune autre protéine connue.

Par la suite, j’ai affiné ma méthode d’isolation. Afin de s’assurer de la spécificité de la liaison

à la E-sélectine, les isolations ont été faites en présence de calcium ou d’EDTA, un agent

chélateur de calcium. Cette approche a été choisie parce que les sélectines lient leur ligand de

manière calcium-dépendante. Dans ces conditions, la liaison de la E-sélectine à son ligand

devrait diminuer, ou même disparaître en présence d’EDTA. De plus, afin d’affiner la

migration des candidats potentiels, les bandes ont été équilibrées, après la focalisation

isoélectrique (IEF – première dimension) et avant la migration dans la deuxième dimension

(SDS-PAGE), en présence d’agent réducteur (β-mercaptoéthanol et iodoacétamide). Cette

dernière isolation est visible à la figure 5-3. Le candidat a été envoyé pour analyse par LC-

MS/MS. L’identification n’a pas révélé de récepteurs connus de la E-sélectine. Par ailleurs,

l’analyse a révélé la présence d’un peptide appartenant à une protéine membre des récepteurs

d’adhérence de la famille des gamma cadhérines.

154

Figure 5-2 Mise en évidence sur les cellules HT-29 d’un candidat potentiel d’un ligand de la E-sélectine

Les cellules ont été lysées dans un tampon composé de 3% CHAPS, 50 mM TrisHCl pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml ovalbumine et 1 mM PMSF; puis centrifugées 10 min à 10 000 g à 4°C. Le surnageant a été recueilli et passé une première fois sur des billes de protéine-A Sépharose, puis centrifugé. Par la suite, le surnageant a été incubé avec la E-sélectine/Fc préalablement adsorbée sur des billes de protéine-A Sépharose, durant 4 h à 4°C avec agitation sur glace. Les billes ont été lavées 3 fois dans 0.05% Triton X-100, 50 mM TrisHCl pH 8.5, 400 mM NaCl et 1 mM CaCl2; puis 2 fois dans 0.05% Triton X-100, 50 mM TrisHCl pH 8.5 et 150 mM NaCl. Les billes ont été par la suite extraite pour la première migration (IEF) sur des bandes de pH 3-10, dans une solution de 7 M urée, 4% CHAPS, 0.5% tampon IPG et 20 mM DTT. Les bandes ont par la suite migré sur un gel de 7.5% acrylamide, coloré par la suite au nitrate d’argent. Un extrait du gel se trouve en A et B. A ne contient pas d’extrait cellulaire, par opposition à B, ou le candidat a été encerclé.

155

Figure 5-3 L’isolation du candidat comme ligand de la E-sélectine est sensible au calcium

Les extraits ont été fait de la même façon qu’à la figure 5-2, à la différence que dans le gel B, le tampon de lyse contenait 1 mM CaCl2, alors que dans le gel A, le tampon de lyse contenait à la place 2 mM EDTA. Il en était de même dans le premier milieu de lavage. Les bandes d’IEF ont été équilibrée dans 5% de β-mercaptoéthanol et 250 mg d’iodoacétamide par 10 ml de tampon d’équilibration avant la migration dans la deuxième dimension sur un gel de 7.5% acrylamide, qui a été coloré au nitrate d’argent. Le candidat est identifié par une flèche rouge.

156

D’autres approches pourraient être envisagées pour identifier le ligand de la E-sélectine sur les

cellules HT-29. En gardant l’approche par isolation d’affinité, il serait possible d’utiliser des

extraits membranaires plutôt que des extraits totaux, augmentant ainsi nos chances d’isoler de

manière abondante un candidat. Déjà des études en ce sens sont d’ailleurs amorcées dans le

laboratoire. Elles pourraient confirmer, entre autres, l’implication du candidat membre de la

famille des cadhérines. Une autre approche serait de chercher à identifier la kinase la plus

précocement associée à la liaison à la E-sélectine. Les cellules HT-29 pourraient être traitées

avec de la E-sélectine puis fractionnées, pour identifier une protéine phosphorylée de manière

différentielle (augmentation ou diminution de la phosphorylation dans le temps) suite au

traitement à la E-sélectine. Cette approche aurait l’avantage de pouvoir identifier d’autres

cibles signalétiques de la liaison de la E-sélectine à son ligand (autre que les kinases

SAPK2/p38 et ERK). De plus, pour vérifier la spécificité de liaison à la E-sélectine, un

prétraitement avec des enzymes ou des inhibiteurs de la glycosylation comme la tunicamycine

pourrait être une étape intéressante. Tel que mentionné précédemment, l’identification du

ligand de la E-sélectine que j’ai amorcée fait présentement l’objet d’un projet de maîtrise dans

le laboratoire.

5.3 Adhérence des cellules HT-29 à des cellules endothéliales d’origine différentes

Tous les résultats précédents ont été obtenus avec les cellules endothéliales de la veine du

cordon ombilical (HUVEC). Ces cellules sont largement utilisées comme modèle

expérimental en raison de leur facilité d’obtention et de la possibilité d’utiliser du matériel

humain non transformé. Cependant, plusieurs des propriétés des cellules endothéliales varient

selon leur origine [26]. En ce sens, il est bien connu que les molécules d’adhérence exprimées

par les cellules endothéliales varient avec leur origine tissulaire. Cette variation est

sous-jacente au homing bien connu des leucocytes. Il y a donc un intérêt majeur à vérifier si

les interactions d’adhérence cellules cancéreuses à l’endothélium varient avec l’origine des

157

cellules endothéliales. Cela pourrait, en effet, être à la base de l’envahissement métastatique

sélectif à un organe donné.

J’ai donc entrepris une série d’expérience en ce sens en vérifiant l’adhérence des cellules

HT-29 à des cellules endothéliales humaines immortalisées provenant de différents organes.

Ces cellules nous ont été fournies par le Dre Claudine Kieda, d’Orléans (France). Les lignées

testées originent de l’intestin (HIMEC), du cerveau (HBrMEC), de l’appendice (HAPEC), des

poumons (HLMEC), des ganglions lymphatiques (HPLNEC.B3), de la peau (HSkMEC) et de

la rate (HSpMEC). De manière générale, ces différentes lignées endothéliales présentes des

cellules plus petites que les HUVEC et sont très sensibles aux stress de culture cellulaire. Une

dilution trop grande est mortelle et la décongélation est particulièrement difficile pour les

cellules de l’intestin (HIMEC).

Dans un premier temps, j’ai démontré que toutes ces lignées sont sensibles, quoiqu’à des

niveaux différents, au TNF et au H2O2, puisque ces deux agents y induisent l’activation de la

kinase p38 (figure 5-4).

Par la suite, en compagnie de Sophie Guay, un étudiante d’été sous ma supervision, nous

avons vérifié l’adhérence des cellules HT-29 sur les différentes lignées endothéliales

prétraitées ou non au TNF. Nous avons aussi vérifié si le TNF induit l’expression de la

E-sélectine par ces cellules endothéliales. Dans l’ensemble les données obtenues avec les

différentes lignées indiquent que le TNF n’induit pas l’expression de E-sélectine. De plus,

nous avons observé que, dépendamment des lignées endothéliales, l’adhérence des cellules

HT-29 se fait de façon dépendante ou non du TNF. À titre d’exemple je présente ici seulement

les résultats obtenus avec la lignée de cellules endothéliales du cerveau (HBrMEC). Dans ce

cas, l’adhérence des cellules HT-29 aux HBrMEC n’est pas modulée par un pré-traitement au

TNF, par opposition aux cellules HUVEC. De plus, l’adhérence est toujours maximale,

comparée aux cellules HUVEC (figure 5-5).

158

Figure 5-4 Réponse de la kinase p38 de différentes lignées endothéliales à un stress

Les différentes lignées ont été stimulées avec 100 µM, 10 min de peroxyde ou avec 10 µg/mL de TNF pour 10 min. Les extraits ont été séparés par SDS-PAGE et l’activité kinase évaluée à l’aide d’un anticorps spécifique antiphospho-p38 (NEB). HIMEC= cellules endothéliales de l’intestin, HBrMEC= cellules endothéliales du cerveau, HAPEC= cellules endothéliales de l’appendice, HLMEC= cellules endothéliales des poumons, HPLNEC.B3= cellules endothéliales des ganglions lymphatiques, HSkMEC= cellules endothéliales de la peau, HSpMEC= cellules endothéliales de la rate, HUVEC= cellules endothéliales du cordon ombilical et HT-29= cellules de carcinome de côlon.

159

Les données de la figure 5-6 montre bien que la E-sélectine n’est pas exprimée sur les cellules

endothéliales de cerveau (figure 5-6). Ce résultat était inattendu. En effet, des études sur les

cellules endothéliales de microvaisseaux de cerveaux humains ont démontré l’expression de la

E-sélectine et son implication dans l’adhérence des lymphocytes [94]. Cependant, certains

travaux ont démontré une diminution de l’expression des molécules d’adhérence avec les

passages des cellules endothéliales [146].

L’intérêt de l’ensemble des expériences d’adhérence des cellules HT-29 aux différentes

lignées de cellules endothéliales utilisées, est que les résultats sont en accord avec le principe

que l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales peut solliciter différentes

molécules d’adhérence endothéliales. En corollaire, ces données sont compatibles avec

l’hypothèse du seed and soil.

On doit, cependant, questionner l’effet de l’immortalisation des cellules endothéliales sur

l’expression des molécules d’adhérence. En effet, l’utilisation des cellules endothéliales

immortalisées n’est peut-être pas tout à fait représentatif des cellules endothéliales de

différents organes. Il est difficile de cerner si l’effet observé est dû à l’origine des cellules ou

au procédé d’immortalisation. De plus, un autre facteur ayant pu influencer le phénotype est

l’origine vasculaire des cellules. En effet, les HUVEC proviennent d’une veine, tandis que les

cellules fournies par le Dre Kieda sont d’origine microvasculaire, c’est-à-dire un phénotype de

capillaire. Ces vaisseaux sont soumis à des contraintes différentes, la force de flux varie, les

composantes du vaisseaux peuvent varier (une media – des cellules musculaires lisses – dans

les vaisseaux de gros calibre versus des péricytes pour les capillaires). L’utilisation de modèle

animaux avec système isolé peut devenir une alternative intéressante pour étudier la spécificité

de l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules endothéliales de différents organes et de

différentes origines vasculaires.

160

Figure 5-5 Adhérence des cellules HT-29 aux HUVEC et aux HBrMEC

Les différentes cellules endothéliales ont ont été traitées ou non avec 10 µg/ml de TNFα. La durée totale du prétraitement était de 4 h. Dans certains cas, le milieu a été changé après 1.5h de traitement pour un milieu frais durant les 2.5h restantes avant d’ajouter des cellules HT-29 à adhérer. Les cellules HT-29 ont été laissées à adhérer pendant 30 min. Pour le détail du protocole d’adhérence, voir les sections 2.2.4 et 4.2.3. Ce résultat est représentatif de trois expériences, n=3.

161

Figure 5-6 La E-sélectine est exprimée uniquement sur les cellules HUVEC

Pour le détail du protocole d’immunofluorescence, voir la section 2.2.4. Observation sur un microscope Eclipse TE 300 avec un objectif 40X. Les images ont été prises à l’aide d’une caméra Micromax.

162

Chapitre 6

Discussion

164

6 Discussion générale

Les métastases sont une complication morbide du cancer. Elles sont le résultat d’une

séquence d’événements où toutes les étapes doivent être franchies avec succès. La tumeur

doit croître et se vasculariser pour survivre. Certaines cellules tumorales peuvent se détacher

pour entrer dans la circulation sanguine. Ces dernières s’arrêteront dans un nouvel organe

pour y entrer, survivre et croître de nouveau [2]. Le succès d’une métastase ne dépend pas

seulement du potentiel de la cellule cancéreuse, mais aussi de toutes les interactions qui seront

créées avec l’environnement de l’hôte. Ainsi, l’approche thérapeutique doit non seulement

viser la cellule cancéreuse, mais également tous les mécanismes de l’hôte qui favorisent la

réussite d’une métastase [141].

Il est possible de faire des parallèles entre les différentes étapes du processus métastatique et

deux processus normaux, soit l’invasion lymphocytaire et la réparation tissulaire. En effet, la

progression d’une tumeur fait appel à plusieurs processus caractéristiques à la réparation

tissulaire, tel que la production de facteur de croissance par le stroma activé, l’induction de

l’angiogénèse, l’infiltration de cellules immunitaires et la génération de protéases [151]. Un

parallèle similaire existe pour l’adhérence à l’endothélium et la migration des leucocytes vers

une zone inflammée. Les molécules d’adhérence utilisées pour l’interaction des leucocytes

avec l’endothélium le sont également pour l’interaction des cellules cancéreuses avec

l’endothélium [91]. Les travaux de cette thèse ont été basés sur cette hypothèse, c’est-à-dire

que les cellules cancéreuses usurpent les mécanismes inflammatoires pour interagir avec

l’endothélium.

Mes travaux ont démontré que les cellules HT-29 d’un carcinome de côlon interagissent

spécifiquement avec les cellules endothéliales HUVEC, activées par le TNF, par

l’intermédiaire de la E-sélectine puis par l’intégrine β4. De plus, cette interaction permet

d’activer différents sentiers, dont celui de la MAP kinase p38, ce qui conduit à leur migration

transendothéliale.

165

6.1 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est séquentielle

Dans le modèle inflammatoire, les leucocytes interagissent avec l’endothélium par

l’intermédiaire des sélectines, puis une chimiokine active les intégrines du leucocyte pour

qu’il s’attache fermement à l’endothélium. Cette séquence, sélectines, chimiokines et

intégrines, est connue comme le paradigme multi-étapes du recrutement leucocytaire [4]. Mon

hypothèse voulait que l’adhérence des cellules cancéreuses HT-29 aux cellules endothéliales

HUVEC utilisait ces mêmes étapes. Les résultats d’adhérence impliquant la E-sélectine

(chapitre 2, figure 2-2), plus tardivement l’intégrine β4 (chapitre 4, figure 4-2) et un facteur

soluble (chapitre 5, figure 5-1), suggèrent fortement que les cellules cancéreuses adhèrent en

suivant ce paradigme.

Cependant, il existe des différences importantes entre l’adhérence des leucocytes dans le

modèle inflammatoire et l’adhérence des cellules cancéreuses. Kitayama et collaborateurs ont

comparé l’adhérence à la E-sélectine de cellules du cancer du côlon à celle de

polymorphonucléaires (PMN) sous des conditions de flux circulant [152]. Le roulement sur la

E-sélectine était moindre avec les cellules cancéreuses qu’avec les PMN. Cependant,

contrairement aux PMN qui nécessitent l’implication des intégrines pour adhérer fermement,

les cellules cancéreuses du côlon colo201, peuvent s’attacher uniquement par la E-sélectine en

présence de flux. Cette lignée présentait une particularité quand à un ligand de la E-sélectine,

le groupement syalil-Lewis-x (sLex). Ce dernier était exprimé de manière régionale, par

plaque, sur la membrane par opposition à un expression uniforme pour le PMN [152]. Les

travaux de Burdick et collaborateurs ont également démontré des particularités pour la liaison

à la E-sélectine de cellules cancéreuses soumises à un flux circulant [150]. Les cellules de

l’adénocarcinome du côlon LS174T se lient aux cellules HUVEC sous un flux circulant par

l’intermédiaire de ligands de la E-sélectine ainsi que par certaines intégrines. Deux résultats

sont à retenir de cette étude. Dans la cellule cancéreuse, plusieurs ligands médient

l’interaction avec la E-sélectine, des glycoprotéines (par opposition au glycolipides) syalilés

(sLex et di-sLex) et un ligand non-sialylé. La E-sélectine possède donc plusieurs partenaires

possibles. Dans la cellule endothéliale, une différence importante est apparue par rapport au

166

devenir de la E-sélectine. Après 2 minutes d’adhérence des LS174T sous le flux circulant, la

E-sélectine est internalisée dans les compartiments lysosomiaux [150], comparativement aux

cellules HL-60 (lignée leucocytaire provenant d’une leucémie [153]) qui avait induit une

agglomération de la E-sélectine après 10 minutes d’adhérence statique [55]. Ce résultat peut

s’expliquer de deux manières. Premièrement, l’adhérence à la E-sélectine est différente pour

les cellules cancéreuses versus les cellules d’origine leucocytaires. Deuxièmement, la force de

cisaillement pourrait modifier la durée de l’interaction. Considérant l’importance du flux pour

les résultats d’adhérence versus un résultat statique [6], la force de cisaillement a sûrement un

rôle important à jouer.

La séquence sélectines, chimiokines et intégrines implique l’expression de ces dernières par

les cellules endothéliales. De manière intéressante, la présence de stimuli pro-inflammatoires

sur les cellules cancéreuses amène la production de facteurs solubles qui augmentent

l’expression des molécules d’adhérences sur les cellules endothéliales. Les stimuli pro-

inflammatoire, tel le LPS, le TNFα et l’IL-1β, ne sont pas équivalents dans leur effet [147].

Dans des modèles de leucémies aiguës, la co-culture de cellules leucémiques avec des cellules

endothéliales amène l’expression, par les cellules leucémiques, de cytokines, dont le TNF et

l’IL-1. Ces cytokines activent les cellules endothéliales, augmentent l’expression de

molécules d’adhérences dont la E-sélectine, ICAM-1 et VCAM-1 et augmentent l’adhérence

des leucocytes à l’endothélium. Les leucocytes créent donc les conditions propices à leurs

adhérence [154]. Cette induction de molécule d’adhérence est même spécifique au tropisme

métastatique. Ainsi, les cellules du carcinome du poumon H59 qui métastasient au foie,

induisent une expression de TNF ainsi qu’une augmentation de l’expression de la E-sélectine

sur les cellules endothéliales sinusoïdales suite à leur entrée dans cet organe. Les cellules du

carcinome du poumon M-27 qui ne font pas spontanément de métastases au foie, n’ont pas cet

effet inducteur de cytokines et de E-sélectine [66].

167

6.2 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est spécifique

L’interaction des cellules cancéreuses avec les cellules endothéliales varie selon l’identité de

chacune. En effet, mes résultats permettent de conclure qu’une spécificité d’adhérence est

obtenue par l’intermédiaire des molécules d’adhérence, et que ces dernières varient selon

l’origine de la cellule cancéreuses et de la cellule endothéliale. Ainsi, la spécificité des

molécules exprimées par les cellules cancéreuses permettent, ou non, l’interaction avec la E-

sélectine exprimée par les cellules HUVEC activées par le TNF. Les cellules HT-29

s’attachent entièrement par l’intermédiaire de la E-sélectine, les cellules HL-60 utilisent

partiellement la E-sélectine et les cellules HeLa ne l’utilisent pas du tout (figure 2-2 et 2-8).

De plus, seul certaines molécules d’adhérence exprimée par les cellules cancéreuses

permettent l’interaction avec les cellules endothéliales. Ainsi, parmi toutes les intégrines

exprimées par les cellules HT-29, seule l’intégrine β4 est impliquée dans l’adhérence des

cellules HT-29 aux HUVEC activées par le TNF (figure 4-2).

L’intégrine β4 existe sous cinq isoformes différentes, β4A, β4B, β4C, β4D et β4E.

L’isoforme A est la plus courante [76]. Dans la maturation des cellules de l’intestin dans l’axe

crypte – villosité, il y a deux variantes de l’isoforme β4A et ils ont des fonctionnalités

différentes [155]. Ainsi, au delà des variations entre les types de cancer pour l’expression des

molécules d’adhérence, un même type cellulaire peut modifier son patron d’expression de

molécules d’adhérence. C’est ainsi que la migration transendothéliale des cellules HL-60,

différenciées, se fait par l’intermédiaire de la E-sélectine [156].

De la même façon qu’une spécificité est acquise par l’identité de la cellule cancéreuse,

l’origine des cellules endothéliales modifie l’adhérence. Les résultats obtenus avec les lignées

endothéliales de diverses origines suggèrent une différence d’adhérence des cellules

cancéreuses selon l’origine de la cellule endothéliale (figure 5-5) ainsi qu’une différence au

niveau de l’expression de molécule d’adhérence, dont la E-sélectine (figure 5-6). Une étude

comparant le phénotype de sept lignées endothéliales établies avec trois lignées endothéliales

primaires (dont les HUVEC) a démontré plusieurs différences quant à l’expression de

168

molécule de surface et à la réponse de situmli pro-inflammatoire. Entre autres, certaines

lignées perdaient l’expression de la E-sélectine en réponse au TNF [157]. L’ensemble de ces

résultats vont dans le sens de l’hypothèse du seed and soil, à savoir que les métastases sont

intimement liées à des interactions d’adhérence spécifiques entre la cellule cancéreuse (seed)

et la cellule endothéliale (soil). En corollaire, les résultats soutiennent la possibilité que la

sélectivité de colonisation métastatique dépend de la spécificité de ces interactions et des

conditions locales telle l’inflammation, reproduite dans notre modèle par l’ajout de TNF.

6.3 L’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est signalétique.

Un des résultats important de cette thèse est la démonstration de l’existence d’une cascade de

signalisation menant à un effet biologique suite à la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-

29, c’est-à-dire l’activation du sentier kinase p38 menant à la migration transendothéliale

(chapitre 2 ou [158]). Ce résultat permet de voir l’interaction entre les cellules cancéreuses et

endothéliales comme une cascade d’interactions physique-chimiques (les molécules

d’adhérence) menant à divers événements signalétiques. La signalisation par la liaison de la

E-sélectine est maintenant démontré dans d’autres contexte cancéreux. L’adhérence à la E-

sélectine des cellules du côlon T84 induit différents phénotypes, dont la migration et

l’invasion et induit d’autre cascades signalétiques, entre autres par l’intermédiaire du calcium

[159, 160].

Le ligand de la E-sélectine sur les cellules HT-29 reste à identifier. Il est important de noter

que bien des molécules peuvent lier la sélectine, cela n’en fait pas des ligands pour autant, le

ligand doit être associé à une fonction [148]. Il en va de même pour le rôle de l’intégrine β4.

La démonstration de son ligand sur la cellule endothéliale ainsi que la signalisation induite

dans la cellule cancéreuse reste à démontrer. Des études sont d’ailleurs en cours dans le

laboratoire pour identifier ces deux ligands.

Chapitre 7

Conclusions

170

7 Conclusions et perspectives

7.1 Conclusions générales

L’objectif de cette thèse était de caractériser les interactions entre les cellules cancéreuses et

les cellules endothéliales dans le processus métastatique. Les résultats ont démontré que

l’interaction se fait par l’intermédiaire des molécules d’adhérence spécifiques dont la nature

dépend de l’origine de la cellule cancéreuse et de la cellule endothéliale. De plus, pour la

première fois, la liaison de la E-sélectine à son récepteur sur les cellules HT-29 a été

démontrée comme un événement signalétique menant vers une fonction biologique, la

migration transendothéliale. Ceci suggère que les interactions entre les molécules d’adhérence

peuvent être signalétiques de manière bidirectionnelle, engendrant des signaux dans la cellule

cancéreuse ainsi que dans la cellule endothéliale. Surtout, cette signalisation bidirectionnelle

donne un avantage sélectif en favorisant la réussite de la métastase. L’activation de la cellule

cancéreuse augmente sa migration transendothéliale (chapitre 2), tandis que l’activation de la

cellule endothéliale modifie sa perméabilité, ce qui favorise le passage de la cellule cancéreuse

[90, 96].

7.2 Perspectives et orientation future

Les résultats de cette thèse ouvrent de nouvelles perspectives quant à l’étude de l’interaction

des cellules cancéreuses avec les cellules endothéliales. Quatre avenues pourraient être

approfondies :

1- L’identification du ligand de la E-sélectine.

2- La caractérisation du facteur soluble.

171

3- La caractérisation de la spécificité de l’interaction selon l’origine des cellules

endothéliales et cancéreuses.

4- Développement d’un modèle d’adhérence en condition de flux.

7.2.1 Identification du ligand de la E-sélectine

Un résultat important présenté dans cette thèse est la présence d’un récepteur à activité kinase

intrinsèque, ou associée, comme ligand de la E-sélectine. L’identification de ce ligand sera

important afin de caractériser le couplage moléculaire liant le récepteur aux sentiers p38 et

ERK. Elle sera aussi importante afin de confirmer sa présence sur d’autres lignées

cancéreuses utilisant la liaison à la E-sélectine et pourra potentiellement servir comme

marqueur d’agressivité dans les tumeurs. De plus, son état de glycosylation ainsi que sa

distribution cellulaire serait intéressante à connaître, afin de pleinement caractériser ce ligand.

7.2.2 Caractérisation du facteur soluble

L’identité de ce facteur soluble peut être multiple. Il peut s’agir d’un médiateur lipidique,

d’une protéine présente dans des granules de sécrétion ou de chimiokines par exemple.

Les chimiokines produites par les cellules endothéliales suite à une stimulation par le TNF

sont assez diverses. Citons la production de CCL2 (MCP-1), CXCL8 (IL-8), CXCL5 (ENA-

78), CXCL1 (Groα), CXCL7 (NAP-2), CXCL6 (GCP-2) et CX3CL1 (fractalkine) [161]. De

manière intéressante, la production de CCL2 en réponse au TNFα dépend du sentier

SAPK2/p38 [162]. La pertinence d’identifier une chimiokine associée à l’adhérence à la E-

sélectine dans l’adhérence d’une cellule cancéreuse du côlon à l’endothélium provient du fait

que de telles associations ont déjà été rapportées dans d’autres types d’interactions cellules –

172

cellules. L’adhérence et la migration transendothéliale à travers les cellules endothéliales de la

moelle osseuse est associée à la E-sélectine ainsi qu’à CXCL12 (SDF-1). Les mégacaryocytes

matures [163] et les cellules CD34+ [164] utilisent ce système pour migrer à la moelle

osseuse. D’ailleurs, les cellules CD34+ adhèrent grâce aux intégrines α4β1 (VLA-4) et αLβ2

(LFA-1) par l’intermédiaire de CXCL12 [165]. Dans le même sens, les lymphocytes migrent

sélectivement à la peau par l’intermédiaire de la E-sélectine qui interagit avec le CLA

(cutaneous lymphocyte antigen). Les patients atteint de dermatite atopique recrutent les

lymphocytes Th2 par l’intermédiaire de la E-sélectine/CLA et de CCL22, dont le ligand CCR4

est exprimé sur les lymphocytes [166]. Dans les cas de dermatite atopique et de psoriasis

vulgaris, il y a une corrélation entre les niveau sérique de CCL27 (CTAK; cutaneous T cell-

attracting chemokine) et de E-sélectine soluble chez ces patients [167].

Sur le plan expérimental, différentes approches pourraient être utilisées pour aborder la

caractérisation d’un facteur soluble. Un nouvel inhibiteur chimique, le APC0576, permet de

bloquer l’activité transcriptionnelle de NF-κB, activité responsable de l’induction de

chimiokines en réponse à des cytokines pro-inflammatoire sur les cellules endothéliales [168].

Cet outil, ou tout autre inhibiteur spécifique de cette voie, pourrait être utile afin d’étudier

l’adhérence des cellules cancéreuses HT-29 sur les cellules endothéliales traitées au TNF.

L’expression du récepteur des chimiokines CCR6 sur les cellules cancéreuses, a été associée,

chez l’humain, aux métastases hépatiques [169]. Il serait donc intéressant de vérifier si le

ligand de CCR6, c’est-à-dire CCL20 (MIP-3α/LARC), est exprimé par les cellules

endothéliales suite à un traitement au TNF. De manière analogue, l’effet possible d’une

chimiokine pourrait être étudiée à l’aide de la toxine pertussique sur les cellules cancéreuses

[163, 166]. En effet, la toxine pertussique permet de bloquer le signal provenant des

récepteurs couplés aux protéines G, plus précisément de la sous-unitée Gi. Ainsi, si un

prétraitement à la toxine pertussique diminue l’adhérence des cellules cancéreuses aux cellules

endothéliales, on pourra imaginer l’effet d’un récepteur des chimiokines.

173

7.2.3 Caractérisation de la spécificité de l’interaction selon l’origine des cellules endothéliales et cancéreuses.

Afin de vérifier la spécificité de l’interaction entre les cellules cancéreuses et endothéliales,

deux approches pourraient être utilisées. Premièrement, le modèle d’adhérence in vitro peut

permettre de comparer les interactions entre différents types de cellules cancéreuses à

l’endothélium. Comme la spécificité d’interaction semble associée à plus d’un facteur

(sélectine, chimiokine et intégrines), l’intérêt serait de trouver la séquence utilisée pour chaque

lignée cancéreuse. Deuxièmement, les mêmes cellules cancéreuses pourraient être injectées

dans une souris afin d’étudier le rôle de ces mêmes molécules in vivo. Par exemple, suite à

une injection splénique, les cellules HT-29 forment des métastases dans le foie de souris

immunodéficientes (nu/nu) par l’intermédiaire de la E-sélectine [64, 170]. Le même modèle

de métastases pourrait être utilisé pour vérifier l’implication de l’intégrine β4 dans l’adhérence

des cellules HT-29 in vivo, confirmant ainsi les résultats d’adhérence statique. En comparant

l’utilisation de la E-sélectine et de l’intégrine β4 pour différentes lignées de cancer du côlon,

on pourrait généraliser l’implication de ces deux molécules dans les métastases du cancer du

côlon au foie. On peut même imaginer que l’utilisation d’une certaine combinaison des

molécules d’adhérence serait en corrélation avec le potentiel métastatique de ces différentes

lignées.

7.2.4 Développement d’un modèle d’adhérence en condition de flux

L’ensemble des résultats d’adhérence et de migration ont été obtenus avec un modèle statique.

Ces techniques avaient l’avantage d’être relativement simples d’utilisation et de pouvoir

étudier différents facteurs séparément (adhérence courte, migration, adhérence à des matrices).

Cependant, afin de pouvoir se rapprocher de la réalité clinique, c’est-à-dire de la cellule

cancéreuse qui est en circulation et doit sortir du flux sanguin pour s’attacher à l’endothélium,

il serait important de valider tous ces résultats en présence d’un flux circulant. Entre autres,

174

les cellules cancéreuses HT-29 présentent des caractéristiques différentes d’adhérence aux

matrices selon la présence ou l’absence de flux circulant [171]. Pour étudier l’adhérence en

présence de flux, le principal modèle in vitro disponible est l’utilisation d’une chambre de flux

parallèle, dont l’arrangement est montré à la figure 7-1. Cette chambre permet d’étudier

l’interaction de cellules circulantes avec une matrice, des protéines recombinantes ou avec une

couche de cellules endothéliales [6, 150, 171]. La chambre de flux pourrait aussi permettre

d’étudier la migration transendothéliale dans un contexte plus près du in vivo et de valider les

données obtenues en chambre de Boyden [172].

7.3 Applications

La littérature tend à démontrer que la E-sélectine peut être un promoteur et un marqueur de

métastase hépatique [62-64, 66-68, 173]. D’ailleurs, la E-sélectine soluble est plus élevée lors

de présence de métastases et pourrait être utilisée cliniquement comme marqueur d’évolution

d’une tumeur [68, 69]. Pour ce qui est de l’intégrine β4, bien que seule elle ne soit pas

suffisante pour promouvoir les métastases [174], elle pourrait, néanmoins, être utilisée en

combinaison avec la E-sélectine comme marqueur pronostique. De plus, une fois les ligands

de la E-sélectine et de l’intégrine β4 connus, elles pourront être ciblées thérapeutiquement afin

de bloquer l’étape d’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium dans le processus

métastatique. L’avenir du traitement des métastases est dans le traitement spécifique de celles-

ci. Mes travaux démontrant des différences d’adhérence selon l’origine de la cellule

cancéreuse et l’origine de la cellule endothéliale. L’objectif serait de personnaliser les cibles

thérapeutiques selon l’origine du cancer et son phénotype

175

Figure 7-1 Chambre de flux parallèle

La chambre de flux est schématisée la tête en bas. Une vitre forme le bas de la chambre de flux parallèle et peut présenter une matrice ou des cellules endothéliales. Le montage est installé sur un microscope inversé, équipé d’une caméra vidéo. La

176

suspension cellulaire est amenée à la chambre à l’aide d’une pompe-seringue. Adapté de [6]

Par ailleurs, sachant que la présence d’agent pro-inflammatoire peut promouvoir l’expression

de la E-sélectine, et potentiellement de facteurs solubles, l’inflammation devient une cible

thérapeutique intéressante dans le cancer. Comme la réponse inflammatoire a une phase aiguë

qui devient chronique, il pourrait être intéressant de traiter ces deux phases différemment.

Ainsi, un traitement aigu ciblant un excès de TNFα par l’intermédiaire de l’Infliximab (un

anticorps qui lie le TNFα membranaire ou soluble) et l’Etanercept (un récepteur imposteur

« decoy receptor », une portion de TNFR2 ou p75), peut diminuer les effets secondaires et

ainsi empêcher l’établissement de la cascade de cytokines et des effets associés [175]. De

manière plus, fine, on peut imaginer moduler la réponse inflammatoire plutôt que de la

bloquer systématiquement. On pourrait, par exemple, utiliser la réponse de l’hôte contre la

tumeur [176] et diminuer efficacement le risque de métastases.

ANNEXE A

Statistiques canadiennes du cancer

178

A Statistiques canadiennes du cancer

Ces informations proviennent de deux sources :

1- Le document « Statistiques Canadiennes sur le Cancer 2003 », disponible sur internet à

www.cancer.ca. Il est produit en collaboration par la Société Canadienne du Cancer,

l’Institut National du Cancer du Canada, Statistique Canada, les registres du cancer des

provinces et des territoires et par Santé Canada. Ce document contient les données

réelles pour l’incidence du cancer en 1998 et pour la mortalité associée au cancer en

1999. Il contient également des estimés de ces même valeurs pour l’année 2003.

2- Les informations disponible par le « Service d’information sur le cancer » de la Société

canadienne du cancer, entres autres dans l’Encyclopédie canadienne du cancer

(ECCMD), disponible par internet à www.cancer.ca ou par téléphone au 1-888-939-

3333.

A.1 Nomenclature

En clinique, les tumeurs sont classées selon le système TNM. Ce système a été développé par

l’AJCC (American Joint Committee on Cancer) pour décrire l’étendue d’une tumeur. La lettre

T décrit la tumeur (tumor), sa taille et sa localisation. La lettre N indique si les nodules

lymphatiques (lymph node) environnant la tumeur ont été atteints. Finalement, la lettre M

indique s’il y a présence de métastases (metastasis) à un autre endroit de l’organisme ou non.

Ce ne sont pas toutes les tumeurs qui métastasient systématiquement vers un organe

particulier. Certaines tumeurs ont des comportements plutôt prévisible et utilisent le plus

souvent le même moyen de propagation. Ainsi, une tumeur peut se propager par :

1- Envahissement local des tissus environnants. La tumeur, en croissant, s’étend dans les

tissus environnants.

179

2- Dissémination lymphatique. Les cellules cancéreuses entrent dans la circulation

lymphatique par les ganglions environnant la tumeur.

3- Dissémination hématogène. Les cellules cancéreuses traversent la paroi endothéliale et

circulent dans l’organisme par la circulation sanguine.

4- Dissémination à distance (métastase). Parfois le chemin emprunté par la cellule

cancéreuse est incertain, mais le résultat est une métastase dans un organe particulier.

Pour ce qui est des statistiques, un chiffre intéressant est le ratio entre le nombre de décès et le

nombre de nouveaux cas. Ce ratio permet de séparer les différents cancers selon trois groupes.

Le premier groupe, avec un ratio égal ou inférieur à 30%, présente un pronostic très favorable,

il inclus des cancers tels que celui du sein, de la prostate, le mélanome et le cancer de la

vessie. Le second groupe, avec des ratio supérieur à 30% mais inférieur à 50%, présente un

pronostic passable et inclus des cancer comme les lymphomes non hodgkiniens, le cancer

colorectal, le cancer du rein et du larynx. Finalement, le dernier groupe avec des ratio

supérieur à 50% ont un pronostic sombre et inclus le cancer du poumon, du pancréas, de

l’ovaire, de l’encéphale et les leucémies. Ainsi, de manière absolue, les cancers les plus

fréquents sont le cancer du sein et de la prostate, mais celui causant le plus de décès est le

cancer du poumon.

A.2 Métastases selon l’origine du cancer

Les tableaux suivants présentent de l’information sur les métastases pour 16 cancers d’origines

différentes, par ordre alphabétique. On y retrouve également de l’information sur le moyen de

propagation privilégié ainsi que les statistiques pour l’année 2003, lorsque disponibles.

180

Cancer du cerveau et de la moelle épinière, chez l’adulte

Site de métastases pour Envahissement local

Le cerveau est un site de métastases pour les cancers du sein, du poumon, du rein, du côlon, les mélanomes, etc. L’encéphale peut aussi être un site d’extension des tumeurs nasales.

Les cellules cancéreuses peuvent se disséminer dans le système nerveux central (SNC) par la voie du liquide céphalorachidien (LCR), mais elles s'étendent rarement à l'extérieur des méninges.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998 pour le cancer du cerveau, il y avait :

2400 Nouveaux cas, 1600 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.66

Cancer du col de l’utérus

Envahissement local Dissémination lymphatique

Dissémination hématogène

Métastases (dissémination à

distance)

Ce type de cancer tend à envahir plus profondément le col et les tissus à proximité comme la partie supérieure du vagin, la vulve et d’autres régions de l’utérus. Il peut s’étendre également à l’abdomen.

Peut envahir le système lymphatique, les ganglions lymphatiques du bassin, de l’abdomen, de l’aorte et du cou.

Par la circulation sanguine, les métastases peuvent s’étendre jusqu’aux uretères, à la vessie, au rectum, à l’abdomen.

On retrouve des métastases dans les poumons, le foie, les os et le cerveau.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

1400 Nouveaux cas, 420 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.31

181

Cancer colorectal

Envahissement local Dissémination lymphatique

Dissémination hématogène

Métastases (dissémination à

distance)

Lorsque les cellules cancéreuses traversent la paroi intestinale, elles peuvent s'installer dans le gras périrectal ou dans les parois du bassin. Les cellules peuvent également se propager à la prostate, au vagin, à la vessie, aux uretères, au pancréas, au foie, à la région rétropéritonéale ou à l'épiploon. D'autres segments de l'intestin peuvent aussi être atteints, que ce soit dans le gros intestin ou l'intestin grêle, s'ils se situent assez près de la tumeur

Le risque d'atteinte métastatique des ganglions lymphatiques augmente selon le degré de différenciation de la tumeur : lorsque la tumeur est indolente, l'atteinte des ganglions lymphatiques ne touche que 30 % des patients, tandis que chez environ 80 % d'entre eux, le système lymphatique sera atteint si la tumeur est agressive.

Le foie est le foyer de métastases le plus fréquent lorsque les cellules cancéreuses ont pénétré dans le courant sanguin. Le poumon vient au second rang. Le cancer du côlon se propage rarement à d'autres organes par le sang sans avoir avant tout atteint le foie ou les poumons. Dans bon nombre de cas, le foie est le seul organe touché.

L'implantation des cellules cancéreuses peut se produire le long de la muqueuse interne de l'intestin (espace intraluminal), des cellules peuvent aussi atteindre la surface externe de l'intestin (séreuse) vers laquelle les cellules qui se sont détachées de la tumeur se sont dirigées. Elles s'installent sur n'importe quelle surface de la cavité abdominale (métastases péritonéales ou implants). Cela peut se produire peu importe si la circulation sanguine ou le système lymphatique ont été atteints.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

18000 Nouveaux cas, 8300 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.46

182

Cancer de l’estomac

Envahissement local Dissémination lymphatique Métastases (dissémination à distance)

Dans le cancer de l’estomac, il y a extension directe à travers la paroi de l'estomac vers les organes adjacents et par voie transcoelomique (vers la cavité péritonéale, ou abdominale).

Plusieurs ganglions lymphatiques peuvent être atteints : dans les ganglions situés près de l'estomac, près du foie et de la rate (dans l'abdomen) et même plus loin, soit du côté gauche du cou, au-dessus de la clavicule (ganglion de Troisier) ou à l'aisselle gauche (ganglion d'Irish). L'envahissement ganglionnaire se manifeste habituellement au début de la maladie.

On peut retrouver des métastases à l’oesophage, à la muqueuse de la cavité abdominale (cavité péritonéale) et épiploon, à l’intestin grêle (duodénum), au pancréas, au côlon, aux ovaires, au rectum, à la rate, au tissu sous-cutané (tissu adipeux) autour de l'ombilic (nombril), au rein, à la glande surrénale, au poumon, aux os et au cerveau dans des cas rares.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

2800 Nouveaux cas, 1900 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.69

Cancer du foie

Envahissement local Dissémination lymphatique Métastases (dissémination à distance)

Le cancer du foie peut se développer dans une région et, éventuellement, s'étendre partout dans le foie, ou il peut se développer dans différentes parties du foie au même moment.

Environ 50 % des cancers primitifs du foie ne se propagent pas à l'extérieur du foie.

Le cancer du foie a tendance à envahir les ganglions lymphatiques environnants

Le cancer du foie a tendance à envahir le diaphragme, les poumons (environ 20 % de l'étendue extrahépatique va aux poumons), les tissus avoisinants, les veines hépatique et porte, les os, le cerveau, ou les sites variés partout dans le reste de la cavité abdominale (spécialement l'estomac et les glandes surrénales).

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998 pour le cancer du foie et du passage biliaire, il y avait :

2010 Nouveaux cas, 1780 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.89

183

Leucémie - adulte

Dissémination lymphatique Dissémination hématogène Métastases (dissémination à distance)

Les cellules leucémiques peuvent également se disséminer dans le système lymphatique et atteindre les ganglions lymphatiques.

Comme la leucémie est un cancer du sang, elle peut se propager dans toutes les parties du corps où le sang circule.

Les cellules leucémiques peuvent se propager dans la moelle osseuse (la moelle osseuse et le sang sont les sites de récidive habituels), les ganglions lymphatiques, la rate, le foie, les méninges et les testicules

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura : 3600 Nouveaux cas, 2200 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.61

Cancer des os

Site de métastases pour Dissémination hématogène Métastases (dissémination à distance)

Les cancers qui se disséminent habituellement dans les os comprennent les cancers du sein, de la prostate et des poumons.

les cellules cancéreuses peuvent entrer dans la circulation sanguine tôt dans l'évolution de la maladie, pour se déposer dans les poumons.

La dissémination hématogène des cellules cancéreuses vers d'autres os donne lieu à des foyers de métastase secondaire.

Les métastases discontinues sont des tumeurs disséminées à partir de la tumeur primitive sur le même os, mais séparées par quelques centimètre de tissu sain.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998, il y avait :

282 Nouveaux cas, 132 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.47

184

Cancer de l’ovaire

Envahissement local

Dissémination lymphatique

Dissémination hématogène

Métastases (dissémination à distance)

Parmi les structures qui peuvent être touchées figurent l'ovaire du côté opposé (s'il n'est pas déjà atteint), l'utérus, les trompes de Fallope, la vessie, le rectum et le péritoine de la cavité pelvienne.

La dissémination peut s'effectuer par voie lymphatique, même au stade précoce du cancer ovarien. Si certains vaisseaux lymphatiques sont obstrués par les tumeurs secondaires, en particulier les vaisseaux situés sous le diaphragme et autour du sternum, ils ne peuvent plus drainer le liquide péritonéal, qui s'accumule alors dans la cavité abdominale. Cette situation est appelée ascite.

Le cancer ovarien peut se propager par voie hématogène, ou sanguine, bien que rarement. L'envahissement des vaisseaux sanguins par les cellules tumorales entraîne habituellement des métastases pulmonaires, hépatiques ou cérébrales.

La dissémination s'effectue souvent par essaimage péritonéal. Les cellules cancéreuses se détachent de la tumeur et flottent dans les cavités pelvienne et abdominale, pour se déposer et former des métastases sur pratiquement n'importe quel organe. Les tumeurs secondaires se forment le plus souvent sur les épiploons (replis péritonéaux qui attachent les viscères entre eux), la surface des intestins, l'utérus, la vessie et le péritoine. En circulant, le liquide péritonéal transporte les cellules cancéreuses jusqu'au diaphragme, ce qui explique la fréquence des tumeurs secondaires sous cette structure. Transportées par le liquide péritonéal, les cellules cancéreuses peuvent également traverser le diaphragme, atteindre les poumons et causer l'accumulation de liquide autour de ceux-ci (épanchement pleural).

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

2600 Nouveaux cas, 1550 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.61

185

Cancer du pancréas

Envahissement local Dissémination lymphatique

Dissémination hématogène

Métastases (dissémination à

distance)

Le cancer du pancréas peut envahir les nerfs ou les tissus voisins, comme les canaux biliaires ou le duodénum.

Il peut se disséminer dans les ganglions lymphatiques.

Il peut se disséminer dans les vaisseaux sanguins loco-régionaux.

La métastase à distance peut viser le foie, le diaphragme, les poumons, la plèvre, le côlon, l'intestin grêle, la rate, le péritoine, les reins, les glandes surrénales et les os.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

3300 Nouveaux cas, 3200 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.99

Cancer de la peau - mélanome

Dissémination lymphatique Dissémination hématogène Métastases (dissémination à distance)

Les mélanomes peuvent s'étendre à tout le corps à travers le système lymphatique.

Les mélanomes peuvent s'étendre à tout le corps à travers le sang.

Les sites de métastases les plus communs sont le cerveau, la moelle épinière, les ganglions lymphatiques, les poumons et le foie.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 pour le mélanome il y aura :

3900 Nouveaux cas, 840 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.22

186

Cancer du poumon

Envahissement local Dissémination lymphatique

Dissémination hématogène

Métastases (dissémination à

distance)

La propagation locale peut se produire si la tumeur traverse la plèvre viscérale (enveloppe externe du poumon) pour envahir la paroi thoracique ou le diaphragme. Si la tumeur est située au milieu de la poitrine, elle peut toucher directement les ganglions lymphatiques hilaires également situés au milieu de la poitrine.

Le type de cellule cancéreuse et le siège de la tumeur dans les poumons détermine le trajet emprunté par les cellules dans le système lymphatique. Les ganglions lymphatiques les plus souvent touchés par cette migration sont situés dans le hile, le médiastin et autour de la trachée. Cependant, les conduits lymphatiques sus-claviculaires, cervicaux et abdominaux peuvent eux aussi devenir des voies de dissémination.

Le cancer du poumon peut donner lieu à des métastases étendues quand les cellules cancéreuses se disséminent dans la circulation sanguine. Quand les cellules tumorales passent dans le sang circulant dans les poumons, elles peuvent être transportées dans les vaisseaux pulmonaires jusqu'au cœur et de là, partout dans l'organisme.

Le cancer du poumon à petites cellules peut se disséminer dans virtuellement n'importe quel organe du corps, mais les métastases se trouvent plus souvent dans les os, le foie, le système nerveux central, les ganglions lymphatiques, la plèvre, les tissus sous-cutanés et les surrénales.

Le cancer du poumon non à petites cellules peut s'étendre directement à la plèvre, à la paroi thoracique, au diaphragme et aux ganglions lymphatiques, tandis que les cellules cancéreuses disséminées par voie sanguine s'installent souvent dans les os, le foie, les surrénales, le cœur (péricarde) et le cerveau.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

21100 Nouveaux cas, 18800 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.89

187

Cancer de la prostate

Envahissement local Dissémination lymphatique Dissémination hématogène

Certaines tumeurs peuvent demeurer limitées à la prostate en se développant vers l'intérieur et en bloquant l'urètre.

D'autres tumeurs pourront percer la paroi de la prostate et se propager localement - envahissant le tissu des régions avoisinantes, comme les vésicules séminales, les structures de soutien, la vessie et l'urètre. Le rectum est séparé de la prostate par une membrane résistante (le fascia de Denonviller) qui le protège d'un envahissement par le cancer.

Le cancer de la prostate peut se propager aux ganglions lymphatiques situés dans la région immédiate ou aux ganglions plus éloignés dans la région pelvienne, comme les ganglions sacrés, les ganglions iliaques externes et les ganglions lombaires. Lorsque le cancer atteint les ganglions lymphatiques, il peut continuer à se disséminer aux os, particulièrement à la colonne vertébrale, les hanches, les côtes, les jambes et les bras.

Le cancer de la prostate peut aussi se propager par voie sanguine vers des organes situés à distance, comme les poumons, le foie et les reins.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

18800 Nouveaux cas, 4200 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.22

188

Cancer du rein

Envahissement local Dissémination lymphatique

Dissémination hématogène

Métastases (dissémination à

distance)

L'hypernéphrome tend à envahir l'intérieur du rein. Il peut s'étendre à la veine rénale et, parfois, à la veine cave. Il peut également franchir la capsule rénale et envahir la graisse périrénale (couche de graisse qui enveloppe le rein). Enfin, il peut toucher des structures voisines comme les glandes surrénales.

Les cellules tumorales peuvent également envahir les ganglions lymphatiques abdominaux qui drainent le rein.

L'hypernéphrome a ceci de particulier qu'il tend à se propager d'abord par voie sanguine plutôt que par voie lymphatique. Les cellules cancéreuses sont en effet transportées par les vaisseaux sanguins qui traversent la tumeur, puis par la veine rénale, la veine cave inférieure ou ces deux vaisseaux. Les cellules cancéreuses peuvent ainsi atteindre les poumons, le foie et les os.

L'hypernéphrome s'est disséminé chez environ 25 à 30 % des patients au moment du diagnostic. Dans 1 à 3 % de ces cas, il n'aura donné lieu qu'à une seule métastase, habituellement dans le poumon.

Les métastases siègent le plus souvent dans les poumons, ganglions lymphatiques, foie, os, tissus mous, cerveau ou système nerveux central et rein controlatéral (l'autre rein)

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

4100 Nouveaux cas, 1450 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.36

Cancer du sein

Envahissement local Métastases (dissémination à distance)

Le cancer qui réapparaît dans les tissus environnants, comme la paroi thoracique, les ganglions lymphatiques sus-claviculaires ou la région du cou, est appelé envahissement régional. La récidive se manifestera le plus probablement au niveau de la cicatrice de l’incision chirurgicale initiale ou près de celle-ci.

On parle d’un cancer du sein métastatique lorsque le cancer se dissémine jusqu’à un autre organe comme les os, le poumon, le foie ou le cerveau

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003 il y aura :

21200 Nouveaux cas, 5300 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.25

189

Cancer de l’utérus

Envahissement

local

Dissémination

lymphatique

Dissémination

hématogène

Métastases

(dissémination à

distance)

L'extension directe aux organes et aux tissus entourant l'utérus peut se produire lorsque les cellules cancéreuses ont traversé la paroi utérine. Elles peuvent atteindre la vessie, le rectum, le vagin, les trompes de Fallope ou les ovaires ou bien les deux.

Les cellules cancéreuses qui se développent dans la partie supérieure de l'utérus (fond de l'utérus) ont tendance à se propager vers les vaisseaux qui drainent la région, et éventuellement se diriger jusqu'aux ganglions lymphatiques entourant l'aorte située dans la partie supérieure de l'abdomen (ganglions para-aortiques) ou logés dans le cou et près de la clavicule (ganglions sus-claviculaires). Quant aux cellules cancéreuses qui se développent dans la partie médiane ou inférieure de l'utérus, elles circulent à travers les vaisseaux lymphatiques qui se dirigent vers les ganglions lymphatiques pelviens.

Un cancer de l'utérus peut également se propager par le courant sanguin jusqu'à des emplacements éloignés. Les organes cibles sont le poumon, le foie, le cerveau et les os.

Il arrive souvent que la propagation des cellules cancéreuses se produise également par essaimage péritonéal, c'est-à-dire que la tumeur libère ces cellules qui flottent dans les cavités pelvienne et abdominale, évoluant ainsi en métastases sur presque chaque organe auxquelles elles se fixent. Les emplacements de prédilection des métastases sont la couche graisseuse qui protège les organes du bassin et de l'abdomen (épiploon), la surface de l'intestin, la vessie et le péritoine. Le liquide péritonéal repousse les cellules malignes jusqu'au diaphragme ainsi qu'en dessous de cette cloison, ce qui explique pourquoi cette région est un autre lieu commun de formation de métastases.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 1998, il y avait pour le corps de l’utérus :

3700 Nouveaux cas, 700 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.19

190

Cancer de la vessie

Envahissement local Dissémination lymphatique Dissémination hématogène

Les tumeurs se répandent localement,en traversant la paroi vésicale et en s'infiltrant directement dans les tissus graisseux adjacents (région périvésicale), dans les structures proches comme la prostate, le vagin, le côlon sigmoïde, le rectum, l'utérus et l'os pelvien. Selon sa localisation, la tumeur peut aussi obstruer les uretères, le col vésical et l'urètre prostatique.

Les tumeurs de la vessie peuvent atteindre localement les ganglions lymphatiques de la région pelvienne et, plus haut, ceux de l'abdomen.

Les cellules cancéreuses peuvent être véhiculées par la circulation sanguine et envahir les poumons, les os et le foie.

Selon les Statistiques canadiennes sur le cancer, en 2003, il y aura :

5000 Nouveaux cas, 1100 Mortalités et un ratio Décès/Nouveau cas de 0.31

On peut remarquer que parmi tous ces cancers, les sites préférentiels de métastases qui

reviennent fréquemment sont les os, les poumons, le foie et le cerveau. La fréquence pour

chacun de ces sites varient selon l’origine du cancer, comme le montre le tableau A-1.

191

Tableau A-1 Incidence des métastases dans les organes principaux

Selon les autopsies rapportées dans la littérature, incidence des métastases en pourcentage de tous les cas. Adapté de [177], page 101.

ANNEXE B

Curriculum Vitae

193

B CV - Curriculum Vitae

Dans cette section, on retrouve la liste de mes publications et communications présentées au

cours de mes études graduées. Les publications ont fait l’objet de chapitres de cette thèse (2 à

4), à l’exception de la publication dans Cell Stress & Chaperones 2003. J’ai contribué à cet

article en parallèle de mon projet.

B.1 Publications

Laferrière, J, Houle, F, Taher, M.M, Valerie, K, Huot, J. Transendothelial migration of colon

carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-

activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276 : 33762-33772

(2001)

Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Regulation of the metastatic process by E-Selectin and

stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38). Annals New York Academy of Science. Vol

973, p.562-572 (2002)

Masson-Gadais, B, Houle, F, Laferrière, J, Huot, J. Integrin αvβ3 requirement for VEGFR2-

mediated activation of SAPK2/p38 and for HSP90-dependent phosphorylation of focal

adhesion kinase and assembly of focal adhesions in endothelial cells activated by VEGF. Cell

Stress & Chaperones. Volume 8 (1), 37-52. (2003)

Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells

requires sequential events involving E-selectin and integrin β4. Sera soumis en 2003.

194

B.2 Communications

On retrouve ici les congrès nationaux ou internationaux où mes travaux ont été présentés.

Laferrière, J, Morin, C, Houle, F, Huot, J. E-selectin and beta4 integrin-mediated adhesion of

HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells: Impact on transendothelial migration.

Signalisation du stress cellulaire et cancer, Québec, 07/2003. Affiche. Premier prix

Laferrière, J, Houle, F, Guay, S, Kieda, C, Huot, J. Specificity of the interaction of colon

carcinoma HT-29 cells with endothelial cells conferred by adhesion molecules. IXth

International Congress of the Metastasis Research Society, Chicago, Illinois, 09/2002.

Affiche

Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Regulation of transendothelial migration of colon carcinoma

HT-29 cells by E-selectin-mediated activation of SAPK2/p38. 3rd International Conference on

Signal Transduction, Dubrovnik, Croatie, 05/2002. Affiche

Laferrière, J, Houle, F, Huot, J. Regulation of adhesion and migration of HT-29 cancer cells

on and through endothelial cells. Cell signaling, transcription and translation as therapeutic

targets, Luxembourg, 01/2002. Affiche

Laferrière, J., Houle, F. Huot, J. E-selectin-mediated adhesion of tumor cells to endothelial

cells and activation of the SAPK2/p38 pathway in the tumor cell are both required for

transendothelial migration. 5th Conference on Signaling in Normal and Cancer Cells, Banff,

Canada, 03/2001. Affiche

195

Huot, J., Laferrière, J., Houle, F. Regulation of transendothelial migration of colon

carcinoma cells by E-selectin-mediated activation of stress-activated protein kinase-2

(SAPK2/p38) in the tumor cells. Keystone Symposia, Lake Tahoe, Californie, 03/2001.

Affiche

Laferrière, J., Houle, F., Taher, M.M., Valerie, K. et Huot, J. Role of E-selectin and p38

MAP kinase in transendothelial migration of cancer cells. 91st AACR meeting, San Francisco,

04/ 2000. Affiche

Laferrière, J., Houle, F. et Huot, J. Role of E-Selectin and p38 MAP kinase in

transendothelial migration of HT-29 cancer cells. CFBS, Winnipeg, Canada, 06/1999.

Affiche

Laferrière, J., Houle, F. et Huot, J. Regulation of transendothelial migration of HT-29 cancer

cells by E-Selectin and p38 MAP kinase. MRC National Student Research Poster

Competition, Winnipeg, Canada, 06/1999. Affiche. Mention Or / Prix d’excellence

196

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