Interaction bactéries - mycorhizes
Transcript of Interaction bactéries - mycorhizes
Dissolution biologique des phosphates : Interaction bactéries - mycorhizes
Thèse
Salma Taktek
Doctorat en microbiologie agroalimentaire
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
© Salma Taktek, 2015
iii
Résumé
Une énorme partie du phosphore (P) soluble ajouté sous forme d’engrais chimiques et de
fumiers précipite dans le sol et devient non disponible aux plantes. Par ailleurs, l’utilisation
excessive des engrais chimiques n’est pas compatible avec l’agriculture moderne qui se
veut durable, ni avec l’agriculture biologique. De plus, ces pratiques ont été effectuées sans
tenir compte de la microflore présente au niveau de la mycorhizosphère ce qui conduit à
des applications pouvant être onéreuses et néfastes. En effet, les microorganismes
bénéfiques du sol, notamment les bactéries solubilisant les phosphates (BSP) et les
champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA), ont une influence importante sur la
fertilité des sols et la productivité végétale.
Une nouvelle approche basée sur le piégeage des BSP au niveau de l’hyphosphère du CMA
Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, préalablement inoculé avec des suspensions
de microorganismes telluriques, a permis d’isoler des BSP compétentes capables de
dissoudre efficacement le phosphate de roche (PR) d’origine ignée en milieu liquide. Les
travaux ont ensuite permis de prouver l’importance du synergisme entre les hyphobactéries
(Burkholderia anthina Ba8 et Rhizobium miluonense Rm3) et le mycélium extraracinaire
des CMA Ri dans l’amélioration de la solubilisation des phosphates in vitro. L’étude
approfondie des mécanismes qui pourraient être impliquées dans cette interaction montre
que les hyphobactéries, principalement la souche B. anthina Ba8, adhèrent fortement à la
surface des hyphes et aussi à celle du PR. Il est fortement probable que les interactions
décrites ainsi que les caractéristiques bénéfiques aux plantes exprimées par les BSP sont
responsables de l’amélioration de la croissance, de la nutrition phosphatée et du rendement
en matière fraîche et sèche chez le maïs cultivé en serre, coinoculé avec les BSP et les
CMA Ri et fertilisé avec le superphosphate ou le PR du Québec.
v
Abstract
Soluble phosphorus (P) fertilizers added to soil rapidly precipitate, forming sparingly
soluble phosphates, not available to plants. Furthermore, the excessive use of chemical
fertilizers to compensate soil P deficiency is not considered sustainable and it leads to
costly and potentially harmful applications. Many reports confirmed that beneficial soil
microorganisms, including phosphate-solubilizing bacteria (PSB), have a significant
influence on soil fertility and crop productivity. Indeed, PSB can also improve phosphate
rock (PR) efficiency when directly applied to soil. However, most published works on PSB
overlooked the possible interaction between PSB and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF),
which are ubiquitous in cultivated plants.
A new approach based on the trapping of PSB strongly attached to the hyphosphere of
AMF Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, previously inoculated with microbial
soil suspensions was developed to isolate relevant PSB able to mobilize P from a low
reactive igneous PR more efficiently than those directly isolated from the same rhizosphere
soil samples. An in vitro study demonstrated that the synergism between hyphobacteria
(Burkholderia anthina Ba8 and Rhizobium miluonense Rm3) and Ri hyphae highly
improved the solubilisation of PR. Our results go beyond the existing studies and showed
specific mechanisms involved on PSB-AMF interactions. Indeed, hyphobacteria, mainly B.
anthina Ba8, strongly adhere to Ri hyphal surfaces and PR particles forming a structured
biofilm. Under greenhouse conditions, the direct application of PSB and AMF Ri as
biostimulants for sustainable corn production showed that these beneficial microorganisms
improve growth and P uptake of corn fertilized with superphosphate or Quebec PR.
vii
Table des matières
Résumé .................................................................................................................................. iii
Abstract ................................................................................................................................... v
Table des matières ............................................................................................................... vii
Liste des tableaux ................................................................................................................... xi
Liste des figures .................................................................................................................. xiii
Liste des abréviations ............................................................................................................ xv
Remerciements ..................................................................................................................... xix
Avant-propos ....................................................................................................................... xxi
Chapitre 1 : Introduction et revue de littérature ......................................... 1
1.1. La vie en symbiose des plantes .................................................................................... 2
1.2. Les mycorhizes ................................................................................................................ 2
1.2.1. Généralités ............................................................................................................. 2
1.2.2. Les endomycorhizes ou mycorhizes arbusculaires ................................................ 4
1.2.3. Rôles des symbioses mycorhiziennes .................................................................... 5
1.3. Le phosphore et ses différentes formes dans le sol .......................................................... 6
1.3.1. Importance mondiale du phosphore ...................................................................... 6
1.3.2. Cycle du phosphore et ses différentes formes ....................................................... 7
1.4. Mobilisation du phosphore dans le sol ............................................................................ 9
1.4.1. La désagrégation .................................................................................................. 10
1.4.2. La solubilisation .................................................................................................. 10
1.4.3. La minéralisation ................................................................................................. 11
1.4.4. L’immobilisation ................................................................................................. 11
1.5. Les biofilms associés à la mycorhizosphère .................................................................. 12
1.5.1. Les biofilms : définition, mécanisme de formation, structure et habitats ........... 12
1.5.2. Les biofilms associés aux plantes ........................................................................ 14
1.5.2.1. Implication des mycorhizes dans la croissance des bactéries ....................... 15
1.5.2.2. Avantages écologiques des biofilms ............................................................. 19
1.6. Hypothèses et objectifs .................................................................................................. 20
1.6.1. Hypothèses .......................................................................................................... 20
1.6.2. Objectifs .............................................................................................................. 21
Chapitre 2 : Trapping of phosphate solubilizing bacteria on hyphae of
the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis DAOM
197198 .............................................................................................................. 23
Résumé .................................................................................................................................. 24
Abstract ................................................................................................................................. 25
2.1. Introduction .................................................................................................................... 26
2.2.1. Soil sampling and analyses .................................................................................. 28
2.2.2. Chemical composition and reactivity of Quebec phosphate rock ....................... 28
viii
2.2.3. Isolation of PSB strongly attached to hyphae or directly from the soil .............. 29
2.2.5. Identification of PSB ........................................................................................... 31
2.2.6. Identification of organic acids ............................................................................ 31
2.2.7. Siderophores production and organic phosphate mineralization ........................ 32
2.2.8. Phytase activity ................................................................................................... 33
2.2.9. Interaction between PSB and AMF: phosphate solubilization and pH changes . 33
2.2.10. Statistical analysis ............................................................................................. 34
2.3. Results ........................................................................................................................... 35
2.3.1. Isolation and identification of bacteria ............................................................... 35
2.3.2. Mineral phosphate solubilization ability of PSB and organic acids production . 38
2.3.3. Siderophores production and organic phosphate mineralization ........................ 43
2.3.4. PSB and AMF interaction ................................................................................... 45
2.4. Discussion ..................................................................................................................... 47
Acknowledgements .............................................................................................................. 51
References ............................................................................................................................ 52
Supplementary material ........................................................................................................ 56
Chapitre 3 : Solubilization of igneous phosphate rock by biofilm forming
mycorrhizospheric bacteria ........................................................................... 61
Résumé ................................................................................................................................. 62
Abstract ................................................................................................................................ 63
3.1. Introduction ................................................................................................................... 64
3.2. Materials and methods .................................................................................................. 65
3.2.1. Strains and mycorrhizal fungus .......................................................................... 65
3.2.2. Evaluation of bacterial biofilm formed on sparingly soluble phosphates ........... 66
3.2.2.1. Crystal violet assay ....................................................................................... 66
3.2.2.2. Exopolysaccharides assay ............................................................................ 67
3.2.2.3. Fluorescein diacetate assay .......................................................................... 67
3.2.2.4. Quebec phosphate rock solubilization under biofilm formation .................. 68
3.2.3. Fluorescent labeling and confocal laser scanning microscopy ........................... 68
3.2.4. Scanning electron microscopy ............................................................................ 69
3.2.4.1. Bacterial attachment to abiotic surface ........................................................ 69
3.2.4.2. Bacterial attachment to biotic surface .......................................................... 69
3.2.5. Statistical analysis ............................................................................................... 70
3.3. Results ........................................................................................................................... 70
3.3.1. Biofilm quantification ......................................................................................... 70
3.3.2. Phosphate solubilization under biofilm formation .............................................. 72
3.3.3. CLSM and SEM analysis .................................................................................... 75
3.4. Discussion ..................................................................................................................... 78
References ............................................................................................................................ 82
ix
Chapitre 4 : Phosphate de roche et bioinoculants pour une agriculture
durable ............................................................................................................. 87
Résumé .................................................................................................................................. 88
4.1. Introduction .................................................................................................................... 89
4.2. Matériel et méthodes ...................................................................................................... 90
4.2.1. Caractérisation des phénotypes PGPR des BSP .................................................. 90
4.2.1.1. Production de l’acide indole acétique .......................................................... 90
4.2.1.2. Détermination de l’élongation racinaire du maïs ........................................ 90
4.2.1.3. Tests de motilité ............................................................................................ 91
4.2.1.4. Tests d’antagonisme ..................................................................................... 91
4.2.1.5. Test de production de l’acide cyanhydrique (HCN) ..................................... 91
4.2.1.6. Test de production des chitinases ................................................................. 92
4.2.1.7. Analyse statistique ........................................................................................ 92
4.2.2. Essai en serre ....................................................................................................... 92
4.2.2.1. Substrat utilisé .............................................................................................. 92
4.2.2.2. Dispositif expérimental ................................................................................. 93
4.2.2.3. Paramètres mesurés ...................................................................................... 94
4.2.2.4. Analyse statistique ........................................................................................ 94
4.3. Résultats ......................................................................................................................... 95
4.3.1. Caractérisation PGPR des BSP ........................................................................... 95
4.3.2. Essai en serre ....................................................................................................... 96
4.3. Discussion .................................................................................................................... 104
Références ........................................................................................................................... 110
Matériel supplémentaire ..................................................................................................... 115
Chapitre 5 : Conclusion générale .............................................................. 119
Bibliographies ..................................................................................................................... 123
xi
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Exemples de quelques bactéries bénéfiques dans la mycorhizosphère……...15
Table 2.1. Chemical composition and reactivity of Quebec phosphate rock………...........28
Table 2.2. Genera to which belong the 51 selected PSB trapped to AMF hyphae or isolated
from the rhizosphere from 13 sampling sites.……………………………........…....36
Table 2.3. Identification of the selected PSB isolates by sequencing of the 16S rDNA…..37
Table 2.4. Organic acid production by selected PSB strongly attached to AMF hyphae
(Hyphobacteria) or isolated from the mycorrhizosphere (Rhizobacteria) on NBRIP
medium containing Quebec PR or hydroxyapatite after 7 days of incubation……..42
Table 2.5. Activity of enzymes involved in organic phosphate mineralization…………...44
Table 2.S1. Chemical characteristics of mycorrhizospheric soil samples collected from 13
sites in Quebec and used for the isolation of PSB.....………………………………56
Table 2.S2. Selection of PSB used in this study...................................................................57
Table 2.S3. Identity, siderophores production and phosphatases activity of selected
PSB............................................................................................................................58
Table 3.1. Evaluation of biofilm formation by PSB in the presence of Quebec PR or
hydroxyapatite using three different methods……………………………………...71
Table 3.2. Organic acids production by microbial biofilm forming PSB grown in microtiter
plates………………………………………………………………………………..74
Tableau 4.1. Quelques caractéristiques bénéfiques aux plantes chez les BSP…………....95
Tableau 4.2. Effet antifongique des BSP vis-à-vis de quelques champignons
pathogènes………………………………………………………………………….96
Tableau 4.3. Caractéristiques du sol de jardin utilisé……………………………………..97
Tableau 4.4. Analyse de la variance de la matière fraîche et sèche (g plant-1) et du
pourcentage de mycorhization (%) des plants de maïs fourrager (Zea mays cv.
FOCUS) fertilisés par le PR du Québec ou le SP et coinoculés avec les BSP et
Ri…………………………………………………………………………...………97
Tableau 4.5. Effet de l’inoculation avec les BSP et des différents traitements de
fertilisation avec le superphosphate (SP) ou le phosphate de roche du Québec (PR),
sur la masse fraîche et sèche des parties aériennes et le pourcentage de
xii
mycorhization des plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS) mycorhizés
avec le Ri……………………………………………………………………...……99
Tableau 4.6. Structure de la matrice obtenue à la suite de l’analyse factorielle des dix
éléments chimiques absorbés au niveau des parties aériennes des plants de maïs
fourrager..………………………………………………………………………....100
Tableau 4.7. Analyse de la variance des deux facteurs représentant les dix éléments
chimiques absorbés par les plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS)
fertilisés par le PR du Québec ou le SP et inoculés avec les BSP et Ri………......101
Tableau 4.8. Effet de l’inoculation des plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS)
avec les BSP, Ri et les différents traitements de fertilisation sur les dix éléments
chimiques absorbés par les parties aériennes………...…………………………...103
Annexe 4.1. Quelques activités bénéfiques aux plantes chez les BSP……….…………..115
Annexe 4.2. Analyse de la variance des deux facteurs représentant les dix éléments
chimiques analysés au niveau des organes aériens des plants de maïs fourrager (Zea
mays cv, FOCUS) fertilisées par la PR du Québec ou le superphosphate et inoculés
avec les BSP et Ri………………………………………………………………...117
Annexe 4.3. Effet de l’inoculation des plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS)
avec les BSP, Ri et les différents traitements de fertilisation sur les dix éléments
chimiques analysés au niveau des parties
aériennes……….....……………………………………………………………….118
xiii
Liste des figures
Figure 1.1 : Les différents types d’associations mycorhiziennes d’après (Selosse and Le
Tacon 1998) repris par (F. Halle dans le livre Aux origines des plantes, Ed. Fayard
2008)…………………………………………………………………………………3
Figure 1.2 : Morphologie des mycorhizes arbusculaires (Fortin et al. 2008)………………5
Figure 1.3 : Les cinq étapes du développement d’un biofilm sur une surface dure.
Étape 1 : attachement initial; étape 2 : attachement irréversible; étape 3 : apparition
et maturation I du biofilm; étape 4 : maturation II du biofilm; étape 5 : dispersion.
Les photomicrographies, présentées toutes à la même échelle, sont celles d’un
biofilm de Pseudomonas aeruginosa en développement (Monroe D, 2007)………12
Figure 2.1 : (A) Soluble phosphate ; (B) specific phosphate solubilization activity, LSD0.05
values: d1 = 63.98, d3 =177.78, d5 =110.80, d7 = 55.28 mg P mg-1 protein; and (C)
pH variation in the supernatant of PSB growing on NBRIP medium containing
hydroxyapatite. Phosphate solubilizing hyphobacteria are shown on the left and
rhizobacteria on the right. PSB identity is described in Table 2.3. Error bars indicate
standard deviation of means from three independent assays………………………40
Figure 2.2 : (A) Soluble phosphate; (B) specific phosphate solubilization activity LSD0.05
values: d1 = 22.75, d3 = 23.61, d5 = 27.55, d7 = 26.59 mg P mg-1 protein; and (C)
pH variation of PSB growing on NBRIP medium containing Quebec phosphate
rock. Phosphate solubilizing hyphobacteria are shown on the left and rhizobacteria
on the right. PSB identity is described in Table 2.3. Error bars indicate standard
deviation of means from three independent assays………………………………...41
Figure 2.3 : Production of siderophores by PSB in AT minimum medium after 5 days of
incubation. Means followed by the same letter are not significantly different
according to Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05). Error bars are standard
deviations of the means from three independent assays. Table 2.3 shows PSB
identity……………………………………………………………………………...43
Figure 2.4 : Soluble phosphate and pH variation in the minimal medium extract obtained
from the distal compartment containing AMF Rhizophagus irregularis (Ri), Ri plus
Rhizobium miluonense (Ri+Rm3), Ri plus Burkholderia anthina (Ri+Ba8), Ri plus
Rahnella sp. (Ri+Rs11) and Ri plus Burkholderia phenazinium (Ri+Bph12) after 6
xiv
weeks of dual incubation. Means followed by the same letter are not significantly
different according to Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05). Error bars are standard
deviations of the means from three independent assays……………………………46
Figure 3.1 : P-solubilization by PSB biofilms (A) and pH values (B) after 5 days of
incubation in liquid modified NBRIP containing 5 g L-1 Quebec PR or
hydroxyapatite in microtiter plates. Significant differences (LSD test; P ≤ 0.05) are
indicated by different letters. Bars are standard deviations of the mean
(n=12)……………………………………………………..………………………..73
Figure 3.2 : Confocal laser scanning micrograph of PSB. Figures show average projections
of CLSM images of two hyphobacteria : Rhizobium miluonense Rm3 and
Burkholderia anthina Ba8 and two rhizobacteria : Rahnella sp. Rs11 and
Burkholderia phenazinium Bph12 through FDA stained biofilms (green
fluorescence) on Quebec PR (left panel) or hydroxyapatite (right panel) after 5 days
of incubation. Scale bars (white) correspond to 20 µm, magnification 630×. The
confocal images were taken along z-sections into the scaffolds and shown as 2D
pictures composed by ZEN 2011 Software…………………………….…………..76
Figure 3.3 : Scanning electron micrograph of Burkholderia anthina Ba8 bacterial matrix
formed on Quebec PR (A) or hydroxyapatite (B) after 5 days of incubation. White
arrows indicate individual cells scattered on the surface of hydroxyapatite
particles………………………………………………………………………...…..77
Figure 3.4 : Scanning electron micrograph of Burkholderia anthina Ba8 bacterial matrix
formed on Rhizophagus irregularis (Ri) hyphae using Quebec PR as sole P source
after 6 weeks of dual culture………………………………………………….……77
xv
Liste des abréviations
AIA : Acide indole acétique
ANOVA : Analyse de la variance
BSP : Bactérie(s) solubilisant les phosphates
CMA : Champignon(s) mycorhizien(s) arbusculaire(s)
DO : Densité optique
HCN : Acide cyanhydrique
LSD : Test de différence significative minimale de Fisher
NBRIP : de l’anglais « National botanical institute’s phosphate growth medium »
P : Phosphore
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne
PGPR : de l’anglais « Plant Growth Promoting Rhizobacteria »
PR : Phosphate de roche
Ri : Rhizophagus irregularis
TSA : de l’anglais « Tryptic Soy Agar »
TSB : de l’anglais « Tryptic Soy Broth »
xvii
À la mémoire de mon grand-père, Ali.
À mon ange Rahma, envolée au Paradis.
À mon aimable famille du Canada à l’au-delà de l’Atlantique, Tunisie.
xix
Remerciements
Il y a maintenant un peu plus de quatre ans que j’ai traversé l’Atlantique pour entreprendre
le travail présenté dans cette thèse de doctorat. Arrivée à Québec, j’étais chaleureusement
accueillie par Dr. Antoun et son épouse Dina, qui m’ont aidé, guidé et fait visiter
l’université Laval et ses environs. Après tout cela, je me suis sentie très motivée avec la
certitude que les raisons qui m’avaient amenées ici étaient les bonnes. À présent, je me
rends compte que ma thèse a en effet été un voyage que j’ai commencé avec motivation,
parcouru avec enthousiasme et terminé avec certitude. Je veux donc prendre ces quelques
lignes pour remercier ceux qui ont contribués à mon avancement et qui sans leurs aides ce
travail n’aurait pas pu se réaliser.
En premier lieu, je dois remercier Dr. Hani Antoun qui a conservé sa disponibilité dont il a
fait preuve le jour de mon arrivée et qui m’a transmis son efficacité et sa rigueur
scientifique. Je l’en remercie sincèrement.
Je souhaite également remercier mon co-directeur, Dr. Yves Piché pour m’avoir transmis
ses connaissances scientifiques sur la microscopie et aussi pour m’avoir encouragé à
persévérer pour mettre ce travail sur pied.
Mes vifs remerciements s’adressent également à Dr. J.-André Fortin. Il a été un catalyseur
et une personne ressource pour le cheminement de mes travaux de doctorat. Je lui suis
redevable pour son soutien constant, son aide et sa disponibilité.
Je souhaite aussi remercier Dr. Marc St-Arnaud pour avoir accepté d’être membre de mon
comité aviseur et pour avoir été toujours prêt à partager son savoir pour me faire des
commentaires constructifs très utiles.
Merci également au Dre. Valérie Gravel pour avoir accepté d'évaluer ma thèse et aussi pour
ses corrections et commentaires pertinents.
Par ailleurs, je tiens à remercier Martin Trépanier pour son soutien, son aide et son amitié.
Sa détermination et sa bonne humeur ont été une source d'encouragement et d’appui.
Je remercie également Marie-Claude Julien pour ses conseils et son agréable amitié. Merci
aussi pour m’avoir offert l’opportunité de travailler avec elle plusieurs sessions et
d’approfondir mes connaissances en microbiologie générale.
Je tiens également à remercier mes collègues du laboratoire que j'ai côtoyé pendant ma
xx
thèse. Les anciens, Paola et Mélissa pour leur aide, encouragements et surtout leur amitié
éternelle, Antoine pour sa bonne humeur et ses bras quand j’avais besoin d’aide et Joseph
pour ses belles discussions. Les nouveaux, Vicky pour sa collaboration, Héla pour son
amitié et ses encouragements, Martine, Andrée et Amélie pour leur agréable compagnie.
J'ai également une pensée particulière pour les stagiaires Jean Sébastien, Marc Antoine,
Stéphanie et Laetitia qui ont contribué au bon déroulement de certains de mes travaux. Je
leur souhaite également beaucoup de succès dans leur carrière. Je remercie Richard Janvier
et son équipe de la plateforme de l’institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS)
pour leur aide, disponibilité et leur soutien technique lors des travaux reliés à la
microscopie. Jean Martin mérite également mes plus sincères remerciements pour son
implication dans mon travail. Mes remerciements s’adressent aussi à Gaétan Daigle pour
ses coups de main lors des analyses statistiques. Merci à tous les membres de l’Envirotron
et à l’équipe des serres pour leur aide et collaboration.
La réalisation de ce travail a été possible grâce aux subventions de recherches du Fonds de
Recherche du Québec Nature et Technologies et du Conseil de Recherches en Sciences
Naturelles et en Génie du Canada. Je remercie également les organismes suivants pour leur
appui financier sous la forme de bourses pour participer à des congrès internationaux et
avoir l’opportunité de présenter mes travaux de recherche : le centre sève, le centre de
recherche en horticulture ainsi que le centre d’étude sur la forêt.
Bien entendu, je tiens à remercier ma famille, mes proches et mes ami(e)s pour leur
inestimable soutien et leurs encouragements. Je tiens à faire des remerciements à mes
parents qui malgré les distances ont su être présents tout au long de mon doctorat. Un grand
merci à Habib, mon mari, pour son soutien moral, son temps consacré pour m’aider ainsi
que ses suggestions lors de l’élaboration de ce travail. Merci de m’avoir encouragé à
continuer de croire que je suis capable et surtout de m’avoir offert une ambiance propice à
la réussite. Finalement, une pensée particulière à Ahmed, mon garçon, pour son sourire, sa
joie de vivre et surtout pour avoir été un enfant facile me permettant ainsi de me rendre
jusqu’au terme de ce projet.
xxi
Avant-propos
Les travaux de recherche réalisés durant cette thèse ont été présentés lors de plusieurs
conférences nationales et internationales et feront l'objet de trois publications dans des
revues avec comité de lecture. Les chapitres deux et trois de cette thèse sont sous forme
d’articles scientifiques. La contribution des coauteurs est détaillée ci-dessous :
Chapitre 2 - Trapping of phosphate solubilizing bacteria on hyphae of the arbuscular
mycorrhizal fungus Glomus irregulare DAOM 197198
Salma Taktek, Martin Trépanier, Paola Magallon, Marc St-Arnaud, Yves Piché, J.-André
Fortin et Hani Antoun
La répartition des contributions des co-auteurs est la suivante : J’ai rédigé l’article sous la
direction de Dr. Antoun et Dr. Piché. J’ai également réalisé la quasi-totalité des
manipulations. Martin Trépanier a contribué à l’identification des acides organiques. Paola
Magallon a participé à l’isolement des souches solubilisant les phosphates. Marc St-Arnaud
et J.-André Fortin ont révisé et corrigé le manuscrit. Cet article est soumis à Soil Biology &
Biochemistry.
Chapitre 3 - Solubilization of igneous phosphate rock by biofilm forming
mycorrhizospheric bacteria
Salma Taktek, Marc St-Arnaud, Yves Piché, J.-André Fortin et Hani Antoun
La répartition des contributions des co-auteurs est la suivante : J’ai rédigé l’article sous la
direction de Dr. Antoun et Dr. Piché. J’ai également réalisé la totalité des manipulations.
Marc St-Arnaud et J.-André Fortin ont révisé et corrigé le manuscrit. Cet article sera
soumis à FEMS Microbiology Ecology.
Article en préparation
Can igneous phosphate rock, phosphate solubilizing bacteria and arbuscular
mycorrhizal fungi substitute chemical fertilizers?
Salma Taktek, J.-André Fortin et Hani Antoun
xxii
Conférences et symposiums
Salma Taktek, Martin Trépanier, Hani Antoun. Mycorrhiza competent bacteria for
sustainable use of phosphates in agriculture. 15th International Symposium on Microbial
Ecology, 24 - 29 août 2014, Séoul, Corée du Sud.
Salma Taktek, Yves Piché, Hani Antoun. Biofilm formation and phosphorus mobilization
by mycorrhizosphere bacteria. International Union of Microbiological Societies, 27 juillet -
1 août 2014, Montréal, Canada.
Salma Taktek, Martin Trépanier, Hani Antoun. Improving the availability of phosphorus
from a Quebec rock phosphate by using biofilm forming phosphate solubilizing bacteria
associated with Glomus irregulare. 63rd Annual Conference of the Canadian Society of
Microbiologists, 17 - 20 juin 2013, Ottawa, Canada.
Salma Taktek, Hani Antoun. Amélioration de la disponibilité du phosphore à partir de la
roche phosphatée du Québec par des bactéries solubilisant les phosphates en formant des
biofilms. Journée annuelle étudiante du centre de recherche en horticulture, 23 mai 2013,
Québec, Canada.
Salma Taktek, Martin Trépanier, Hani Antoun. Une nouvelle méthodologie d'isolement de
bactéries solubilisant les phosphates. Colloque Mycorhizes 2012, 05 octobre 2012,
Montréal, Canada.
Salma Taktek, Martin Trépanier, J.-André Fortin et Hani Antoun. Isolements,
identification et caractérisation des bactéries solubilisant les phosphates. Congrès annuel
conjoint Association Québécoise des Spécialistes en Sciences du Sol Société Canadienne
de la Science du Sol, 03 - 08 juin 2012, Lac-Beauport, Canada.
Salma Taktek, Paola Magallon, Martin Trépanier et Hani Antoun. Dissolution biologique
des phosphates : Interaction bactéries-mycorhizes. Congrès de bactériologie intégrative:
symbiose & pathogenèse, 10 - 11 novembre 2011, Québec, Canada.
1
Chapitre 1 :
Introduction et revue de littérature
2
1.1. La vie en symbiose des plantes
Dans la nature, la symbiose végétale représente le mode de vie de l’ensemble des
organismes. Au cours des dernières années, une multitude de travaux ont clairement
démontré l’intérêt scientifique et pratique de ces symbioses pour l’ensemble des végétaux
(Fortin et al. 2008). Plus que 90 % des végétaux vivent de façons symbiotiques. Il s’agit
d’une association durable entre deux ou plusieurs êtres vivants hétérospécifiques et dont
chacun tire bénéfice. Les symbiotes s’aident mutuellement à se nourrir, se protéger ou se
reproduire.
Au niveau des sols, les sites privilégiés de multiplication des microorganismes sont la
rhizosphère et la mycorhizosphère, zones très riches en nutriments exsudés par les racines
et/ou par le mycélium (sucres, acides aminés, acides gras, facteurs de croissance…)
(Bonfante and Anca 2009).
1.2. Les mycorhizes
1.2.1. Généralités
La majorité des plantes supérieures terrestres vivent en étroite symbiose avec les
champignons. Il s’agit d’un phénomène fondamental et universel qui s’élabore au niveau du
système racinaire des plantes vasculaires et des bryophytes. Les organes résultant de cette
association sont appelés mycorhizes. D’origine gréco-latine, le terme mycorhize (« mukês »
pour champignon et « rhiza » pour racine) décrit de nombreuses et diverses associations
racine-champignon. Actuellement, on définit donc les mycorhizes comme étant des
associations symbiotiques contractées par les racines des végétaux avec certains
champignons du sol. On les trouve dans de nombreux environnements et leur succès
écologique reflète une forte diversité des capacités génétiques et physiologiques des
champignons endophytes (Bonfante and Anca 2009).
Environ 6000 espèces dans le Glomeromycotina, Ascomycotina et Basidiomycotina ont été
enregistrées comme mycorhiziennes. Les symbioses mycorhiziennes (353 - 462 Millions
d’années) ont joué un rôle crucial dans l’évolution des plantes terrestres, bien que quelques
groupes (Chenopodiaceae, Caryophyllaceae, Brassicaceae, Urticaceae) se soient
3
affranchis tardivement de toute relation avec des champignons symbiotiques (Simon et al.
1993; Selosse and Le Tacon 1998).
L’association racine-champignon est basée sur des profits réciproques et des échanges
bilatéraux d’éléments nécessaires au bon développement des deux partenaires. Les
symbioses mycorhiziennes jouent un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dans
les écosystèmes terrestres : en effet, les champignons, grâce à leur structure mycélienne,
fournissent des éléments minéraux et de l’eau à la plante, en échange de squelettes carbonés
issus de la photosynthèse.
Figure 1.1 : Les différents types d’associations mycorhiziennes d’après (Selosse and Le
Tacon 1998) repris par (F. Halle dans le livre Aux origines des plantes, Ed. Fayard 2008).
Les différents types de mycorhizes (Figure 1.1) existant se distinguent à la fois par les
groupes taxonomiques des partenaires symbiotiques impliqués et par les structures typiques
formées par la symbiose. La position taxonomique de la plante et des partenaires fongiques
définit les types de mycorhizes. Ainsi, les structures générées par l’association
mycorhizienne peuvent être classées sur la base de critères écologiques, morphologiques et
physiologiques. On distingue plusieurs types de mycorhizes : les endomycorhizes, les
ectomycorhizes, et les ectendomycorhizes, ainsi que les mycorhizes arbutoïdes,
4
monotropoïdes et orchidoïdes. Dans la partie qui suit, nous nous intéresserons
particulièrement aux endomycorhizes arbusculaires constituant le type de mycorhizes le
plus ancien et ayant coévolué semble-t-il avec les plantes terrestres depuis 460 millions
d’années (Redecker et al. 2000; Simon et al. 1993).
1.2.2. Les endomycorhizes ou mycorhizes arbusculaires
Les mycorhizes arbusculaires (MA) constituent la symbiose végétale la plus répandue et la
plus ancienne dans la nature, du fait de leur ubiquité et du nombre élevé d’espèces
végétales concernées (400 000 espèces connues) (Smith and Read 1997; Garbaye 2013).
On rencontre le mutualisme endomycorhizien communément chez les plantes herbacées
mais aussi chez un grand nombre d’espèces ligneuses. À ce jour, on dénombre environ 250
espèces de champignons distribuées dans quatre ordres, onze familles et dix-sept genres,
capables de former ce type de mycorhizes. Ils appartiennent tous aux gloméromycètes
(anciennement appelées Glomales) et ne peuvent être cultivés axéniquement. Ce sont des
mycosymbiotes obligatoires dont le cycle biologique dans le sol repose entièrement sur la
présence de racines vivantes de la plante hôte.
Les gloméromycètes développent un réseau de filaments mycéliens de type siphonné ou
cénotique (Figure 1.2). À ce jour, aucune forme de reproduction sexuée n’a encore été
décrite chez les gloméromycètes. Ils se propagent d’une façon végétative principalement
via la formation de grosses spores généralement sphériques de 40 à 500 µm de diamètre
comportant quelques milliers de noyaux (Fortin et al. 2008).
Les mycorhizes arbusculaires se caractérisent par l’absence du manteau fongique autour de
la racine. Au contact de la cellule racinaire, l’hyphe forme un appressorium. Le mycélium
pénètre dans les cellules racinaires, franchit les parois et repousse le plasmalemme des
cellules hôtes sans le traverser (Figure 1.2). Les hyphes passent ensuite de cellule à cellule
en direction apicale et progressent également dans les espaces intercellulaires. Dans les
cellules corticales, le champignon développe des arbuscules et dans la plupart des cas, des
vésicules.
5
Figure 1.2 : Morphologie des mycorhizes arbusculaires (Fortin et al. 2008).
1.2.3. Rôles des symbioses mycorhiziennes
Read (1991) a écrit qu’indépendamment du type de mycorhizes, si la symbiose
mycorhizienne est autant répandue dans le monde végétal, c’est parce qu’elle est bénéfique
à la plante sous plusieurs aspects. En effet, les champignons mycorhiziens ont un effet
fertilisant et jouent un rôle dans la stabilité du sol (formation d’agrégats). Grâce à leur
réseau mycélien extraracinaire qui prospecte l’environnement en trois dimensions, les
champignons mycorhiziens fournissent aux plantes l’eau et les nutriments à quantité
limitante ou à faible mobilité dans le sol. Et enfin, ils ont un effet protecteur contre les
organismes pathogènes et contre les stress hydriques.
Par ailleurs, le mycélium extraracinaire des champignons mycorhiziens arbusculaires
(CMA) peut avoir des relations directes ou indirectes avec les différents organismes du sol.
En effet, ces mycorhizes sont capables de modifier la physiologie de la plante hôte et
l’exsudation racinaire d’où leur action indirecte sur les organismes de la mycorhizosphère
lesquels, dans certains cas peuvent être étroitement liés aux hyphes permettant ainsi un
échange métabolique direct (Johansson et al. 2004). Les communautés bactériennes
associées à la mycorhizosphère sont les plus concernées par l’action des mycorhizes
6
arbusculaires. Une section détaillée sera donc dédiée ultérieurement à l’étude de
l’interaction entre les bactéries et les mycorhizes.
1.3. Le phosphore et ses différentes formes dans le sol
Le phosphore (P) est l’un des éléments importants sur terre. En effet, il s’agit de l’élément
essentiel du métabolisme énergétique de toutes les formes de vie. Le P est indispensable
pour les cellules vivantes vu qu’il est un composant principal de l’ADN, de l’ARN, de
l’ATP et des phospholipides (composant majeur des membranes cellulaires). Il est
conséquemment impliqué dans la division cellulaire, la transmission de l’information
génétique, le transfert et le stockage d’énergie et aussi dans le système photosynthétique.
Toutes ces propriétés font de cet élément l’un des trois macronutriments nécessaires pour la
croissance et le développement des plantes (avec l’azote (N) et le potassium (K)),
généralement présents dans les engrais chimiques (Liu and Chen 2008).
Le P contrôle de nombreux processus biogéochimiques se produisant dans la biosphère.
Pour comprendre l’interaction entre le P, les processus biogéochimiques et d’autres
distributions élémentaires, il est nécessaire de comprendre la distribution du P sur la surface
terrestre et les processus contrôlant sa distribution (Liu and Chen 2008).
1.3.1. Importance mondiale du phosphore
L’évolution des plantes terrestres a été associée à des activités volcaniques au cours de la
période de l'Ordovicien (il y a 450 millions d’années) (Parnell and Foster 2012). Une étude
récente a démontré la présence de teneurs assez importantes de P2O5 (allant jusqu’à 0.17 %)
dans des cendres volcaniques en provenance du Japon et des Philippines (Shoji and
Takahashi 2002). Des expériences réalisées avec ces cendres (utilisées comme substrat) ont
prouvé leur importance en tant que source de P pour la croissance des plantes (Joergensen
and Castillo 2001). Par conséquent, on en déduit que la teneur en apatite ignée provenant
des cendres volcaniques au niveau de la croûte terrestre a adéquatement permis la
croissance et le développement des plantes au fil des siècles.
De nos jours, l’agriculture dépend essentiellement de l’apport régulier d’engrais phosphaté.
Cet apport indispensable en P fait de cette ressource non renouvelable un produit non
7
substituable. L’institut d’études géologiques des États-Unis (USGS) s’avère le seul
organisme fournissant des informations sur l’état de ‘santé’ des ressources naturelles dont
nous dépendons. D’après l’USGS, les ressources terrestres de P seront complètement
épuisées dans 50 à 100 ans et la production mondiale du P connaîtra un pic dans les années
à venir (approximativement en 2030) (Cordell et al. 2009).
Le Maroc, la Chine et les États-Unis sont les trois principaux producteurs de phosphate de
roche dans le monde. Ils détiennent plus que 80 % des gisements exploitables constitués de
réserves et ressources potentielles mais à durée de vie limitée. Ces gisements se répartissent
en deux groupes suivant leur origine géologique : les gisements ignés qui résultent de
l’intrusion du magma dans les roches cristallines (dépôts volcaniques) et ceux
sédimentaires qui tiennent leur origine des innombrables débris d’animaux marins.
Le Canada est pourvu de quelques gisements de phosphate : au Québec, en Ontario, au
Nouveau Brunswick et dans la partie du sud de la zone frontalière Alberta – Colombie-
Britannique (USGS, World phosphate deposit). On y trouve quelques mines de roches
phosphatées notamment Arianne phosphate Inc. qui se consacre au développement d’un
projet minier au Québec (Lac à Paul). Les réserves minérales de ce gisement sont d’environ
472 millions de tonnes avec une durée de vie d’environ 26 ans.
L’exploitation minière produit un phosphate brut qui ne convient qu’exceptionnellement à
un emploi immédiat comme engrais phosphaté. Généralement, pour obtenir un produit
marchand ou phosphate naturel, des procédés d’épierrage, criblage, concassage, broyage,
séchage, flottation et calcination s’avèrent indispensables.
Dans ce travail, l’étude du potentiel d’utilisation de l’apatite d’Arianne comme fertilisant
en agriculture pourrait remédier aux énormes pertes énergétiques et aux impacts
environnementaux majeurs (tel que l’accumulation du gypse) générés par les procédés
d’extraction, transformation et livraison à longues distances des phosphates.
1.3.2. Cycle du phosphore et ses différentes formes
La disponibilité du P influe fortement sur le processus par lequel les organismes
photosynthétiques fixent le carbone inorganique au niveau de la biomasse cellulaire. Par
8
conséquent, la connaissance du cycle du P est très importante pour la compréhension du
bilan global du carbone ainsi que les différents cycles biogéochimiques.
La flore microbienne du sol a un rôle essentiel dans le cycle du P, car elle établit un lien
entre le réservoir de P dans l’environnement vivant et non vivant. Certains
microorganismes facilitent, en effet, l’altération, la minéralisation, et la solubilisation des
différentes formes de P, rendant l’orthophosphate à la disposition des communautés
microbiennes et végétales. Cependant, ces microorganismes contribuent également à
l’immobilisation du P, un processus qui diminue la biodisponibilité du P en convertissant
les formes solubles réactives du P en formes insolubles. Le mécanisme de participation
microbienne dans ces processus varie d’un mécanisme passif à un mécanisme très actif.
Le cycle du P englobe de nombreux réservoirs environnementaux vivants ou non vivants
ainsi que différentes voies de transport. En suivant le mouvement du P dans
l’environnement, l’interaction entre le processus physique et biologique devient apparente.
En effet, en plus d’agir comme des réservoirs de P dans l’environnement, les
microorganismes contribuent à la transformation du P dans les autres réservoirs, comme
dans le sol ou dans les environnements aquatiques environnants.
Le P est un élément peu mobile dans le sol (Holford 1997). Certaines formes de P sont
insolubles ou ont une solubilité modérée. Dans la nature, le P existe sous forme
d’orthophosphate (PO43-) plutôt que sous sa forme élémentaire puisqu’il réagit facilement
avec l’oxygène. Au niveau du sol, les deux principales formes d’ions phosphatés sont le
H2PO4- (condition acide) et le HPO4
2- (condition alcaline) (Busman et al. 2002).
Le P du sol n’a aucun effet toxique direct sur les humains ou les animaux, mais il peut
causer l’eutrophisation des eaux de surface. Ce phénomène désigne un état de déséquilibre
caractérisé par une suraccumulation de nutriments minéraux (essentiellement, l’azote sous
forme de nitrates ou nitrites et/ou le phosphore sous forme phosphate) au niveau des
écosystèmes aquatiques conduisant ainsi à la prolifération excessive d’organismes
autotrophes notamment les cyanobactéries et les algues (Correll 1998). Ces organismes ont
une haute productivité et des taux respiratoires élevés conduisant à l’anoxie (réduction de
l’O2 dissous et biodisponible dans le milieu) d’où la dégradation du milieu aquatique et la
réduction de la biodiversité.
9
Comme indiqué plus haut, l’utilisation irrationnelle des engrais chimiques en agriculture est
souvent ciblée comme la cause principale des teneurs élevées en P au niveau des cours
d’eau et des eaux souterraines. Plusieurs remèdes sont proposés afin d’atténuer
l’eutrophisation en particulier la réduction des apports agricoles tout en privilégiant les
engrais écologiques comme le phosphate naturel.
Dans la croûte terrestre, l’abondance du P est de 0.04 à 0.12%, dont la majeure partie est
sous sa forme inorganique minérale phosphatée et d’autres composés contenant du P
organique. C’est sous cette forme que les groupements anioniques du phosphate forment
des complexes tétraédriques en se liant à des cations, substituant ainsi l’arsénate (AsO43-)
ou le vanadanate (VO43-) dans la structure cristalline. L’apatite est la forme la plus
abondante du phosphate minéral, comprenant l’hydroxyapatite, le fluorapatite et le
chlorapatite. Ces trois formes d’apatite ont presque la même structure cristalline, mais
diffèrent dans leurs proportions relatives d’hydroxyde, de fluorure et de chlorure, chacun
étant nommé pour l’anion qui est le plus abondant dans le minéral (Mackey and Paytan
2009).
Dans les sols, le P inorganique est généralement associé à d’autres composés comme le Ca,
Fe et Al dont chacun a des caractéristiques de solubilité unique qui détermine la
disponibilité des phosphates pour la plante.
Il faut noter que la mobilité et la biodisponibilité des phosphates dans les sols sont
principalement limitées par l’adsorption (c’est-à-dire l’adhésion physique ou les liaisons
des ions phosphates sur les surfaces d’autres molécules) et l’importance de la flore
microbienne qui va transformer le P sous sa forme organique.
1.4. Mobilisation du phosphore dans le sol
Bien que le contenu en P total (inorganique et organique) des sols ne dépasse généralement
pas les 0.12%, seulement 0.1% de ce P total existe sous la forme inorganique soluble
facilement assimilable par les plantes (Goldstein 1994). Quant au P organique, sa
contribution au P total, peut dépasser les 50% dans certains sols. Il peut exister sous
plusieurs formes comme les phytates et polyphosphates faiblement biodisponibles et
formant des complexes avec des cations, à l’origine de certaines limitations en minéraux
importants pour la nutrition des plantes (Dalal 1977).
10
La déficience en P soluble limite la productivité végétale de plusieurs sols agricoles de
manière universelle (Arcand and Schneider 2006). Cependant la protection de
l’environnement exige l’utilisation de pratiques durables de gestion, faisant usage de peu
d’intrants chimiques. Par ailleurs, l’application de fertilisants s’effectue toujours sans tenir
compte des mycorhizes et de la microflore présente au niveau de la mycorhizosphère, ce
qui conduit à des applications excessives et souvent néfastes. Ainsi, une énorme quantité de
P est immobilisée dans les sols, ce qui présente un risque potentiel pour l’environnement si
ce sol est transféré par érosion dans les cours d’eau.
Dans cette partie nous nous intéresserons à détailler les différents procédés induits de
transformation des phosphates comme la désagrégation, la solubilisation, la minéralisation
et l’immobilisation. La composition chimique des minéraux phosphatés dépend de l’ion ou
des ions présents au moment de la transformation.
1.4.1. La désagrégation
Dans la nature, certaines roches phosphatées s’altèrent suite à de nombreux processus
écologiques. Les processus d’altération sont classés en deux principales catégories : la
désagrégation mécanique et chimique.
Dans la désagrégation mécanique, des procédés physiques (incluant l’expansion thermique,
la pression, l’action hydraulique, la formation de cristaux de sel, le gel et le dégel…)
peuvent causer une détérioration ou encore une fragmentation du matériel rocheux sans
modifier sa composition chimique.
En revanche, la désagrégation chimique (incluant divers produits chimiques) cause
l’altération de la roche phosphatée en modifiant la structure chimique des minéraux à partir
desquels la roche phosphatée est faite. Le processus de l’altération chimique comprend la
dissolution, l’hydrolyse, l’hydratation et l’oxydoréduction (Mackey and Paytan 2009).
1.4.2. La solubilisation
La solubilisation microbienne du phosphate joue un rôle important dans la conversion du P
insoluble en P soluble. En effet, il a été démontré que certains microorganismes du sol sont
impliqués dans la solubilisation des phosphates insolubles. Ces microorganismes
bénéficient directement du P biodisponible nécessaire pour leur croissance. De même,
11
d’autres organismes sont en mesure de profiter du P solubilisé, tels que les champignons et
les plantes supérieures.
Notons que ces microorganismes produisent des acides organiques et relâchent des protons,
qui à travers leurs groupements carboxyliques, chélatent les cations fixés aux phosphates
insolubles ce qui permet de les convertir en formes solubles (mono et dibasiques) (Mackey
and Paytan 2009).
1.4.3. La minéralisation
Dans le sol, les plantes et les détritus animaux constituent un énorme réservoir de P
organique qui est généralement indisponible pour la plupart des organismes vivants. Pour
devenir biodisponible, le P contenu dans la matière organique doit tout d’abord être
minéralisé en phosphate.
Le processus de minéralisation, au cours duquel les complexes de P organique sont
convertis en minéraux phosphatés, est un processus modulé grâce à l’activité de certaines
enzymes microbiennes, notamment les phosphatases qui sont classées en fonction du type
des groupements carbonés liés aux phosphates qu’elles clivent.
Les phosphatases ont des exigences spécifiques vis-à-vis de certains substrats. Les
catégories les plus courantes des phosphatases microbiennes contribuant à la minéralisation
du P comprennent les phosphomonoestérases, les phosphodiestérases, les nucléases, et les
nucléotidases, ainsi que les phytases (Mackey and Paytan 2009).
1.4.4. L’immobilisation
Lors du processus de l’immobilisation, le P labile est séquestré et retiré de l’environnement
pour une période de temps.
Les procédés d’immobilisation peuvent être regroupés en deux catégories : La première
catégorie, l’immobilisation transitoire ou l’assimilation cellulaire, comprend tous les
processus de séquestration du P dans les cellules vivantes microbiennes et est rapidement
réversible à la mort cellulaire. La deuxième catégorie appelée la formation de minéraux
phosphatés, englobe les processus de minéralisation influencé par l’activité microbienne
qui génèrent des minéraux contenant du P : il s’agit de la phosphogénèse (Mackey and
Paytan 2009).
12
Les bactéries, champignons, micro-algues, protozoaires représentent la majorité de la
biomasse vivante sur Terre. La plupart d’entre eux sont organisés en biofilms et sont très
utiles à l’équilibre de notre planète.
1.5. Les biofilms associés à la mycorhizosphère
1.5.1. Les biofilms : définition, mécanisme de formation, structure et habitats
Les biofilms constituent l’ensemble des microorganismes (plus que 90 %) capables de
s’attacher à certaines surfaces et former des communautés microbiennes (un mode de vie
privilégié) plus ou moins complexes et symbiotiques. Ces microorganismes, qui adhérent
entre eux et à une surface, sont marqués par la sécrétion d’une matrice adhésive,
protectrice, extracellulaire et composée de polymères (Donlan and Costerton 2002).
Figure 1.3 : Les cinq étapes du développement d’un biofilm sur une surface dure.
Étape 1 : attachement initial; étape 2 : attachement irréversible; étape 3 : apparition et
maturation I du biofilm; étape 4 : maturation II du biofilm; étape 5 : dispersion. Les
photomicrographies, présentées toutes à la même échelle, sont celles d’un biofilm de
Pseudomonas aeruginosa en développement (Monroe D, 2007).
Dans la nature, chaque niche de biofilm est colonisée par un microbiote complexe adapté
aux conditions de son microhabitat local (pH, température, oxygène et nutriments). Il s’agit
en effet, d’un système ouvert et dynamique, au niveau duquel des échanges et des
13
migrations de populations affectent continuellement son organisation. D’autres acteurs
extérieurs peuvent également venir ponctuellement sculpter cette architecture.
Généralement, les microorganismes forment des biofilms de la même manière, quelle que
soit la nature de l’écosystème où ils vivent. Le cycle de développement d’un biofilm
comporte cinq étapes qui peuvent se répéter indéfiniment. Ces étapes sont résumées dans la
Figure 1.3.
La formation des biofilms est un perpétuel recommencement depuis l’adhésion des
bactéries pionnières à une surface, la construction du biofilm, l’édification de sa structure
tridimensionnelle (ou maturation) jusqu'à la dispersion et la libération de cellules
spécialisées de la dissolution du biofilm. Les observations microscopiques effectuées sur
des biofilms matures en utilisant la microscopie électronique à balayage montrent que ces
derniers possèdent une structure hétérogène de cellules microbiennes organisées en
monocouches à la surface.
Habituellement, on trouve les biofilms sur des substrats solides immergés ou exposés à une
solution aqueuse. Ils se composent de nombreuses espèces de bactéries et d’archées vivants
dans une matrice de polymères complexes. La matrice du biofilm contient des éléments
synthétisés par des organismes qu’elle abrite (protéines, lipides, ADN, ARN, ...), elle est
également constituée de polysaccharides et d’une importante proportion d’eau, elle assure
la protection des cellules et facilite la communication entre elles par des signaux
physicochimiques.
Dans un biofilm mature, les cellules produisent des messagers chimiques sous la forme de
petites molécules médiatrices appelées aussi autoinducteurs. Ces molécules diffusibles
activent l’expression de certains gènes codant pour une panoplie de fonctions essentielles,
et ce en fonction de leur concentration elle-même reflétée par la densité de la population
bactérienne du biofilm. Il s’agit en fait d’un mode de signalisation bactérien nommé le
« Quorum Sensing » définit comme étant un processus très complexe faisant partie d’un
réseau global de régulation de gènes intégrant divers signaux externes en vue de favoriser
l’adaptation des bactéries aux conditions environnementales. Ceci implique que les
bactéries formant le biofilm sont capables de percevoir les différents paramètres du milieu
et exprimer les fonctions régulées adéquatement au type d’environnement rencontré.
14
1.5.2. Les biofilms associés aux plantes
Le processus de la rhizodéposition (rejet de matières organiques des racines) et celui de la
décomposition de la matière organique fraîche (agglomérat de molécules organisées d’une
certaine manière) ont permis de développer les sols et de faire de la mycorhizosphère une
niche écologique assez riche. La composition et la structure des constituants des sols
représentent une véritable mine énergétique et structurante ce qui confère aux sols une
meilleure disponibilité en nutriments facilement assimilables. Ces constituants représentent
un stock de matières carbonées favorisant ainsi la stabilité de la structure du sol et le
développement à long terme de l’activité microbiologique. Les microorganismes, dont la
quasi-totalité sont hétérotrophes, ont développé des mécanismes pour en tirer profit (Davey
and O'Toole 2000). Par exemple, certains microorganismes bénéfiques du sol vivent en
symbiose étroite avec les racines des plantes, allant jusqu’à former des structures
spécialisées et complexes comme les mycorhizes, les nodules et les biofilms. Ces modes de
vie permettront à la fois d’améliorer la croissance microbienne et végétale. Dans un
biofilm, les mucus bactériens, communément appelés matrice d’exopolysaccharides,
permettent d’agglutiner diverses substances (fibres végétales, cristaux de roche et débris
d’animaux) et de former par conséquent des microcavités assurant la protection des
bactéries ainsi que le transport de l’eau et des nutriments. Dans la mycorhizosphère, les
biofilms possèdent diverses particularités intéressantes en agriculture à savoir
l’amélioration des échanges sol/plante, la synergie avec d’autres microorganismes du sol, la
protection contre les pathogènes… (Tableau 1.1).
15
Tableau 1.1. Exemples de quelques bactéries bénéfiques dans la mycorhizosphère.
Organismes
bénéfiques
Plantes Mycorhization Fonctions Références
Pseudomonas
alcaligenes
Medicago
sativa cv.
Aohan
Rhizophagus
irregularis
Minéralisation des
phosphates, Amélioration de
la biomasse végétale.
(Zhang et al.
2014)
Bacillus subtilis Lactuca sativa
cv. Cherry
Glomus
intraradices
Bénéfique à la croissance et
nutrition des plantes.
(Kohler et al.
2007)
Azotobacter
chroococcum,
Bacillus
megaterium and
Bacillus
mucilaginous
Zea mays Glomus
mosseae ou
Glomus
intraradices
Bénéfique à la croissance
nutrition et mycorhization
des plantes.
Biofertilisants.
(Wu et al.
2005)
Pseudomonas
fluorescens
8569r
Nicotiana
tabacum
Rhizophagus
intraradices
Bénéfique à la croissance et
nutrition des plantes
(Cosme and
Wurst 2013)
Bacillus subtilis Solanum
tuberosum
Glomus
etunicatum ou
Glomus
fistulosum
Bénéfique à la croissance
des micropropagules
(Vosátka and
Gryndler
2000)
Rhizobium
leguminosarum
bv. viciae
Vicia faba L. Acaulospora
laevis, Glomus
geosporum,
Glomus
mosseae et
Scutellospora
armeniaca
Amélioration de la tolérance
des plantes au stress alcalin.
Amélioration de la
croissance, la nutrition, la
nodulation et la
mycorhization.
Biofertilisant.
(Abd-Alla et
al. 2014)
Brevibacillus
brevis
Trifolium
repens L.
Glomus
mosseae
Phytoremédiation &
réduction de l’acquisition du
nickel.
(Vivas et al.
2006)
Pseudomonas
fluorescens
Lycopersicum
esculentu &
Allium porrum
Glomus
mosseae
Bio-contrôle. (Edwards et
al. 1998)
1.5.2.1. Implication des mycorhizes dans la croissance des bactéries
Diverses études ont rapporté l’influence des populations bactériennes présentes dans le sol
sur la colonisation du système racinaire des plantes par les champignons mycorhiziens. En
revanche, l’influence directe du mycélium extraracinaire des champignons mycorhiziens
sur la croissance bactérienne et la composition des communautés n’est toujours pas très
bien comprise.
16
De nombreux mécanismes de l’interaction mycélium-bactérie ont été discutés, à savoir la
translocation du carbone dans les tissus fongiques (Andrade et al. 1997; Bago et al. 2002;
Trépanier 2005), le changement de la structure du sol (Tisdall and Oades 1979), la
compétition pour les nutriments disponibles (Ravnskov et al. 1999) et les changements
physiologiques des exsudats racinaires (Söderberg et al. 2002). Mais, certaines
informations concernant la composition des exsudats fongiques des MA, et leur
disponibilité dans le sol pour le profit des communautés microbiennes n'ont pas été très
bien étudiées (Bending et al. 2006).
Filion et ses collaborateurs (1999) ont étudié l'effet des exsudats fongiques sur la croissance
de quelques souches bactériennes présentes dans le sol. Ils ont constaté que ces extraits
pourraient parfois avoir un effet antagoniste, mais dans la plupart des cas des effets
stimulants de la croissance des microorganismes, ce qui suggère que les produits exsudés
par le mycélium peuvent jouer un rôle important dans les interactions directes entre les
CMA et les autres microorganismes du sol.
D’autres chercheurs ont testé la capacité d'un certain nombre de bactéries du sol à coloniser
les hyphes des CMA mortes ou vivantes (Toljander et al. 2006). Ils ont montré que
certaines souches ont tendance à s’attacher aux hyphes vivantes tandis que d’autres
préfèrent les hyphes mortes. Ils ont conclu que certaines bactéries ont une stratégie
biotrophique, elles utilisent les exsudats libérés par les hyphes fongiques vivantes, alors que
d’autres espèces bactériennes utilisent les hyphes eux-mêmes comme substrat (Toljander et
al. 2006). Toljander et ses collaborateurs (2006) ont fini par conclure que les MA peuvent
avoir une influence sur la composition des communautés bactériennes associées à la
mycorhizosphère.
Des études in vitro ont permis aux chercheurs de démontrer que les exsudats fongiques MA
extraits à partir d’un milieu de culture de racines peuvent avoir une importance quantitative
et une influence qualitative sur les communautés bactériennes. Si le traitement des bactéries
par les exsudats fongiques in vitro a permis d’améliorer la diversité des communautés
bactériennes sans qu’il n’y ait un contact physique ‘CMA-bactérie’, on pourrait s’attendre à
une rétroaction positive résultante de l’interaction ‘mycélium-bactérie’ dans les sols,
puisque la quantité d’exsudats mycéliens dans le sol peut être stimulée par les bactéries se
trouvant sur les hyphes ce qui permet d’avoir une exsudation accrue (Toljander et al. 2007).
17
Il a été montré que les exsudats du Glomus sp. MUCL 43205 contiennent des sucres de
faibles masses moléculaires et des acides organiques, qui sont probablement métabolisés
par les bactéries. D’autres composés de hautes masses moléculaires sont aussi présents,
mais n’ont pas été identifiés, ces composés sont certainement responsables de la croissance
des bactéries du sol (Toljander et al. 2007). D’autres recherches ont été menées sur la
colonisation de Glomus sp. MUCL 43205 par Pseudomonas fluorescens, et ont montré que
certaines souches de Pseudomonas sont capables de former des biofilms sur les racines
(Lugtenberg et al. 2001). L'analyse du biofilm formé a montré qu'il se compose de bactéries
couvertes d’un matériel mucilagineux permettant l’hydratation des surfaces pour
l’ensemble de l’agrégat bactérien. C’est ce matériel mucilagineux qui facilite la
colonisation des racines et des hyphes (Bianciotto et al. 1996; Bianciotto et al. 2001;
Matthysse and McMahan 1998).
Certaines bactéries du genre Paenibacillus peuvent être intimement associées au mycélium
de Glomus intraradices (Mansfeld-Giese et al. 2002). Artursson et Jansson (2003) ont
constaté que Bacillus cereus isolée à partir du sol possède des niveaux plus élevés
d’attachement aux hyphes de Glomus dussii en comparaison avec d'autres souches
bactériennes.
Scheublin et ses collaborateurs (2010) ont prouvé que la colonisation de l’hyphosphère de
deux CMA (Glomus intraradices et Glomus proliferum) est spécifique à certains groupes
de bactéries. L’analyse des communautés bactériennes attachées ou non au mycélium
fongique a montré l’abondance d’un groupe de bactéries de la famille des
Oxalobacteraceae intimement attaché aux hyphes, suggérant ainsi la présence d’un
dialogue spécifique entre les microorganismes (Scheublin et al. 2010).
En effet, il semble que certaines bactéries sont plus spécifiques à un type particulier de MA,
qui pourrait être due à la sécrétion d'exsudats spécifiques par l’espèce fongique (Artursson
and Jansson 2003). Bacillus pabuli a la capacité d’améliorer la colonisation des racines par
les mycorhizes arbusculaires (Xavier and Germida 2003) et peut également améliorer la
croissance des plantes (Artursson et al. 2006).
La double inoculation CMA et bactéries permet d’améliorer l'utilisation du phosphate de
roche par les plantes. Ce phénomène pourrait être lié à la solubilisation du phosphate de
roche par les bactéries solubilisant les phosphates et la libération du P dont une partie sera
18
prise par le CMA et assurera son développement et l’autre sera transportée à la plante par
l’intermédiaire du réseau mycélien.
En résumé, il y aura un échange direct et réciproque mycélium-bactérie au niveau de la
mycorhizosphère permettant à la plante une meilleure croissance.
Les résultats d’une étude menée par Toro et ses collaborateurs en 1997 visant à comprendre
l'interaction entre une pratique biotechnologique (l'inoculation microbienne) et une
technologie à faibles intrants (l'application du phosphate de roche) ont démontré l'efficacité
de ces pratiques combinées à l'amélioration durable de l'apport d'éléments nutritifs pour les
plantes. Cette efficacité repose sur l'amélioration des performances des microorganismes
des sols (Toro et al. 1997).
Récemment des recherches en écologie microbienne ont révélé qu'un traitement, au niveau
du compartiment distal, avec des spores de Glomus irregulare isolées à partir d'une
rhizosphère d'Agrotis stolanifera sur des cultures in vitro de racines mycorhizées par la
même espèce fongique ont permis d'observer, par microscopie à contraste interférentiel,
une croissance bactérienne clairement visible autour des hyphes. Ces bactéries semblent
être associées au réseau mycélien (Lecomte et al. 2011).
Par ailleurs, plusieurs études ont mis en évidence le rôle éventuel du tréhalose dans les
interactions entre les bactéries et les champignons mycorhiziens. Il est notoire que lorsqu'il
est associé avec les racines des plantes, le champignon mycorhizien recevra jusqu'à 30% du
carbone total et le transforme en tréhalose (Wiemken 2007). Le tréhalose a été montré
comme pouvant être responsable de la sélection de certaines communautés bactériennes
dans la mycorhizosphère des racines des arbres dans les pépinières forestières et les
plantations (Izumi et al. 2006; Uroz et al. 2007). En outre, il a été démontré in vitro, dans le
cas des champignons ectomycorhiziens, que le tréhalose est impliqué dans la promotion de
la croissance de Pseudomonas monteilii sur les hyphes de Pisolithus albus (Duponnois and
Kisa 2006). D’autres chercheurs ont récemment observé que la souche de Pseudomonas
fluorescens BBc6R8 est capable de former un biofilm sur le mycélium de Laccaria bicolor
S238N lieu d’accumulation du tréhalose (Deveau et al. 2007).
Par conséquent, nous pouvons maintenant admettre l'hypothèse que les métabolites
fongiques tels que le tréhalose peuvent faciliter la colonisation des hyphes par les
microorganismes eux-mêmes capables de former des biofilms (Frey-Klett et al. 2007).
19
Toutes ces études fournissent de nouvelles preuves de la colonisation des hyphes de
différentes espèces de champignons mycorhiziens par les bactéries, mais certaines données
restent manquantes surtout concernant les CMA.
1.5.2.2. Avantages écologiques des biofilms
Il y a eu des spéculations sur les avantages de la formation des biofilms par rapport au
mode de vie des cellules à l’état planctonique. Bien qu’il soit difficile de tester
expérimentalement ces spéculations, des études ont été menées pour connaitre les raisons
pour lesquelles la stratégie de formation des biofilms a été adoptée par autant de microbes.
Parmi les fonctions connues des biofilms, on peut citer l’exemple de :
- La coopérativité métabolique et disponibilité des éléments nutritifs :
En effet, les canaux dispersés à travers les biofilms dans les zones entourant les
microcolonies ont été comparés à un système primitif circulatoire (Davey and O'Toole
2000). Ces canaux constituent un moyen efficace d’échange de nutriments et de métabolites
avec la phase aqueuse, d’amélioration de la disponibilité des nutriments ainsi que la
suppression de métabolites potentiellement toxiques (Costerton et al. 1995). Les
caractéristiques métaboliques des bactéries au sein d’une communauté de biofilms sont
distinctes de ceux de leurs homologues planctoniques. Il est à noter que l’architecture
complexe des biofilms prévoit la possibilité d’une coopération métabolique entre les
différentes bactéries, qui sont exposées à un éventail de différents signaux
environnementaux. Ainsi les biofilms constituent un environnement idéal pour
l’établissement de relations syntrophiques (Davey and O'Toole 2000).
Les biofilms peuvent aussi augmenter l’activité biofertilisante des organismes qui en font
partie assurant ainsi un effet positif sur la croissance et le rendement des cultures
(Seneviratne et al. 2009). Ces biofilms peuvent contenir une seule espèce microbienne ou
plusieurs. Seneviratne et al. (2009) ont décrit les études menées dans ce domaine
essentiellement dans le développement de biofilms de bactéries fixatrices d’azote et de
champignons solubilisant les phosphates (Seneviratne et al. 2009). Une co-culture in vitro
de ces deux microorganismes a révélé que les bactéries colonisent le mycélium pour former
20
des biofilms. Les résultats de cette expérience ont montré des taux plus élevés de fixation
biologique de l’azote d’une part et de production d’acides organiques d’autre part.
Des expériences en champs ont été réalisées afin de s’assurer de l’effet bénéfique de ces
biofertilisants sur des plants de riz (Oryza sativa), thé (Camellia sinensis), blé (Triticum
aestivum), et Anthurium andraeanum. Pour le riz et le thé, les résultats montrent qu’il faut
réduire d’environ 50% l’ajout d’engrais chimique tout en appliquant le biofertilisant.
Cette synthèse de la littérature nous indique que ce domaine de recherche est encore à ses
débuts, des expériences en laboratoire et sur le terrain sont nécessaires pour explorer
pleinement le potentiel de cette nouvelle approche biotechnologique à l’avenir et pour
chercher d’autres activités importantes réalisées par les bactéries comme la dissolution des
phosphates.
1.6. Hypothèses et objectifs
1.6.1. Hypothèses
Les hypothèses suivantes ont été émises dans le cadre du présent projet de recherche :
1- Les espèces bactériennes naturellement et étroitement associées à l’hyphosphère
du champignon mycorhizien arbusculaire Rhizophagus irregularis DAOM
197198 anciennement appelé Glomus irregulare sont plus susceptibles d’extraire
le phosphore à partir des différentes formes de phosphates.
2- Les bactéries solubilisant les phosphates (BSP) isolées à partir de l’hyphosphère
sont capables de former une association étroite sur la surface des hyphes de
Rhizophagus irregularis en présence de l’apatite d’origine ignée.
3- Le maïs fertilisé avec l’apatite d’origine ignée et inoculé avec des
endomycorhizes en synergie avec des BSP, étroitement associées aux hyphes et
ayant des caractéristiques bénéfiques aux plantes, aura une croissance comparable
au maïs fertilisé avec du superphosphate permettant une mise en valeur de la
combinaison « minerai, BSP et champignon mycorhizien arbusculaire ».
21
1.6.2. Objectifs
Afin de vérifier les hypothèses émises, les objectifs de ce travail sont :
1- Isoler des bactéries qui solubilisent les phosphates de roche à partir de
l’hyphosphère et de la rhizosphère et évaluer leur capacité de dissolution de
l’apatite d’origine ignée en présence ou en absence d’association avec le
mycélium du champignon mycorhizien ;
2- Étudier la structure d’attachement des BSP sur l’apatite du Québec et les hyphes
du champignon mycorhizien arbusculaire Rhizophagus irregularis ;
3- Étudier l’effet des différentes doses de l’apatite d’origine ignée ou du
superphosphate sur la croissance et la nutrition de plants de maïs inoculés avec
des CMA et des BSP étroitement associées aux hyphes.
23
Chapitre 2 :
Trapping of phosphate solubilizing bacteria on hyphae of
the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus
irregularis DAOM 197198
Salma Taktek, Martin Trépanier, Paola Magallon, Marc St-Arnaud,
Yves Piché, J.-André Fortin and Hani Antoun
24
Résumé
L’isolement des BSP, utilisées comme biofertilisants, s’est toujours effectué sans tenir
compte des mycorhizes. La plupart des méthodes d’isolement décrites dans la littérature ont
été réalisées d’une manière dite classique, soit directement à partir du sol.
Notre méthodologie était basée sur l'isolement des BSP, intimement associées aux hyphes
du CMA Ri, à partir de racines de poireaux mycorhizés inoculés avec des suspensions de
sol contenant les bactéries telluriques. Des BSP ont été isolées directement à partir des 13
échantillons de sol aux fins de comparaison.
Quatre hyphobactéries et quatre rhizobactéries ont été identifiées et étudiées. Ces BSP sont
capables de solubiliser les phosphates et de produire des acides organiques, des
sidérophores et des enzymes (phytase, phosphatase alcaline et acide).
Les hyphobactéries cultivées sur les hyphes de Ri mobilisent mieux les phosphates que les
rhizobactéries. Ce résultat concorde avec notre hypothèse de travail qui consistait à piéger
des BSP performantes sur les hyphes de Ri. Il s’agit en effet du point culminant de cette
étude.
25
Abstract
A simple method is described for trapping phosphate solubilizing bacteria (PSB) strongly
attached to the hyphae of the arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) Rhizophagus
irregularis (Ri). Bacteria were isolated from the hyphosphere of mycorrhizal leek plants
growing on Turface previously inoculated with soil suspensions obtained from the
mycorrhizosphere of mycorrhizal plants growing in agricultural settings or maple forests in
Quebec, Canada. Among the best PSB strongly attached to the hyphae of Ri, 26 isolates
belonged to Burkholderia spp. and one was identified as Rhizobium miluonense. Four
hyphobacteria exhibiting high potential of inorganic and organic P mobilization were
further compared with four equivalent rhizobacteria directly isolated from
mycorrhizospheric soils. In general, hyphobacteria were superior in mobilizing P from
hydroxyapatite and from a low reactivity igneous phosphate rock from Quebec. Release of
gluconic acid or the product of its oxidation 2-ketogluconic acid, are the main mechanisms
involved in P solubilization. In the two compartments Petri plate system, Ri extraradical
hyphal exudates, supported PSB growth and activity. In the absence of PSB Ri showed a
negligible P solubilization activity. In the presence of PSB a substantial increase in P
mobilization was observed, and superiority of hyphobacterial activity was also observed
under this system. Our results suggest that in developing a bioinoculant based on PSB, their
interaction with AMF hyphae should not be overlooked.
Keywords: Phosphate rock solubilization, Maple forest, Hyphosphere, Glomus irregulare
external hyphae.
26
2.1. Introduction
The dynamic processes that characterize relationships between plants and microbial
communities are complex. Soil microorganisms have an important influence on soil fertility
and plant growth (Andrade et al., 1997; Miransari, 2011).
Phosphorus (P) is a major essential macronutrient limiting crop yields and is required by
plants in relatively large amounts. Most soils are frequently deficient in soluble
orthophosphate (Pi), the P form directly available to plants (Richardson, 2001). Therefore,
low Pi availability limits plant growth and agricultural productivity worldwide and to
support and maintain crop production, P must be provided to plants as soluble chemical
fertilizers. However, applied P is rapidly fixed in soil and it is estimated that only 10-20%
of chemical P fertilizers are used by plants the year of application (Richardson, 2001).
Phosphate rock (PR), the cheapest P-fertilizer, was recognized as a valuable alternative for
sustainable agriculture (Reddy et al., 2002; Vassilev et al., 2001). Unfortunately, plants
respond to fertilization with PR in an erratic way, and generally yields obtained with PR are
lower than those produced with soluble phosphate fertilizers (Khasawneh and Doll, 1978).
In most natural terrestrial plant ecosystems, P is obtained from the soil with the help of
symbiotic mycorrhizal fungi (Smith and Read, 1997). The arbuscular mycorrhizal fungi
(AMF), forming the oldest and most widespread type of mycorrhizal association, are key
components of the soil microbial community, influencing water and nutrients uptake
(phosphorus, nitrogen and various micronutrients), and reducing the incidence of plant
diseases to their host (Bonfante and Anca, 2009; St-Arnaud and Vujanovic, 2007). In
addition, AMF can affect the diversity and structure of bacterial communities in the
rhizosphere (Toljander et al., 2006). The soil zone influenced by both the mycorrhizal roots
and the AMF hyphae extending into the soil from the colonized roots has been called the
mycorrhizosphere (Linderman, 1988) and is formed of two principal components: the
rhizosphere which is directly influenced by roots, and the hyphosphere, which refers only
to the soil zone surrounding individual fungal hyphae (Andrade et al., 1997, 1998). The
hyphae of AMF provide an increased area for interactions with other soil microorganisms,
especially bacteria which may in turn synergistically interact with AMF and thereby
promote plant growth (Johansson et al., 2004). AMF can only absorb phosphate ions from
27
soil solutions but are unable to extract P by themselves from PR (Antunes et al., 2007).
However, when associated with some bacteria (Villegas and Fortin, 2001) or fungi (Kucey,
1987), AMF can obtain P from PR and translocate it to their host plants.
Phosphate solubilizing bacteria (PSB) are considered to play an important role in P
mobilization. They increase soil fertility through the solubilization of inorganic phosphates
by releasing organic acids, the production of siderophores acting like chelators and the
mineralization of organic phosphates by producing phosphatases and phytases (Dobbelaere
et al., 2003; Glick, 1995; Lucy et al., 2004). PSB were already proposed as a viable
solution to resolve the problem of precipitation of soluble superphosphate fertilizers (Khan
et al., 2007; Narula et al., 2000). Mycorrhizae can affect both the numbers and the
composition of bacterial communities in the rhizosphere and hyphosphere (Linderman,
1988; Meyer and Linderman, 1986; Offre et al., 2007; Paulitz and Linderman, 1991). In
fact, qualitative and quantitative differences in bacterial communities between bulk soil and
hyphosphere suggest preferential associations between some bacterial taxa and fungal hosts
(Andrade et al., 1997, 1998). Interaction between AMF and PSB suggests mutual beneficial
effects. The nutritional dynamics of bacteria and mycorrhizal fungi may be ecologically
important. In fact, fungal exudates and other molecules could be used by bacteria as
nutrients (Bonfante and Anca, 2009). On the other hand, hyphospheric bacteria are
involved in the production of growth factors (affecting both plants and AMF), the reduction
of stress and the inhibition of antagonists and competitors (Frey-Klett et al., 2007).
In order to establish efficient tandems between AMF and soil bacteria capable of extracting
P from PR, we hypothesized that this beneficial interaction would be more effective with
PSB strongly attached to hyphae, suggesting a close association with AMF hyphae, rather
than PSB freely growing in the mycorrhizosphere or the rhizosphere referred to as
rhizobacteria.
The aim of this work is to isolate PSB closely attached to hyphae of the commercially used
AMF Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, hereafter called hyphobacteria. To
reach this aim, a novel approach is described. We also present the first conclusive evidence
that hyphospheric PSB display the ability to colonize AMF extraradical mycelium on a
minimal growth medium and mobilize phosphates more efficiently than rhizospheric
bacteria, as a result of the PSB-Ri interaction.
28
2.2. Materials and methods
2.2.1. Soil sampling and analyses
In order to isolate PSB, thirteen soil samples were collected at a depth of 10 to 30 cm, from
different sites near Quebec City, Canada (Table 2.S1). From each site, three subsamples
were collected from adjacent plants and well mixed to form a composite sample. All tools
used in soil sampling were surface disinfected using 70% ethanol and soils were placed in
sterile Whirl-Pak® sample bags, transported on ice to the laboratory, stored at 4°C and
processed within a week. Each sample was homogenized in sterile saline (0.85% NaCl,
w:v), serially diluted and used as described below.
Soil available elements were extracted by the Mehlich-3 procedure (Mehlich, 1984), and P
was determined by the vanado-molybdate method (Tandon et al., 1968). Other elements, K,
Ca, Mg, Na, Fe, Cu, Mn, Zn and Al were quantified by atomic absorption
spectrophotometry (Perkin-Elmer, model 3300, Waltham, Ma). Organic matter was
calculated by weight loss after calcination at 550°C and pH was measured in water (1:1 in
volume).
Table 2.1. Chemical composition and reactivity of Quebec phosphate rock.
P K Ca Mg Na Fe Al Cu Mn Zn
(mg g-1) (µg g-1)
Total element HNO3/HClO4 digestion
146.44 1.22 317.48 5.05 1.07 8.75 3.96 66.35 451.81 24.40
2% Formic acid extraction
4.97 0.34 9.63 0.42 0.04 0.83 0.24 3.23 32.96 3.86
2% Citric acid extraction
7.05 0.24 13.04 0.49 0.03 0.97 0.20 1.62 38.32 3.73
Values given are the mean of two independent replicate per treatment.
2.2.2. Chemical composition and reactivity of Quebec phosphate rock
Igneous PR came from a phosphate rock open-pit mine located at Lac à Paul in the
Saguenay-Lac-Saint-Jean region of Quebec, Canada and owned by Arianne Phosphate Inc.,
a Canadian mining exploration company. To determine its properties (Table 2.1), the
Quebec PR was ground (< 150 μm), digested in perchloric-nitric acids (Barnhisel and
Bertsch, 1982), and total elements (K, Ca, Mg, Na, Fe, Al, Si, Cu, Mn and Zn) were
29
analyzed as described earlier for soils. PR reactivity was measured according to Bolland
and Gilkes (1997). Briefly, 1 g of Quebec PR was extracted in 100 mL of 2% citric acid or
2% formic acid at room temperature for 1 h. The suspension was centrifuged (10000 g 10
min) and filtered (0.22 µm Millipore ® filter), and P concentration in the supernatant was
measured by the method of Fiske and Subbarow (1925) adapted to microplates as follows.
Briefly, 100 µL of a suitable dilution of the supernatant in distilled water were mixed with
100 µL trichloroacetic acid (Sigma Aldrich) 5.5% (wt/vol) and incubated for 10 min. Then,
100 µL of molybdate solution (prepared by mixing 40 mL of 1.5% (wt/vol) ammonium
molybdate in 5.5 % (vol/vol) H2SO4, with 10 mL of 2.7 % (wt/vol) FeSO4.6H2O in distilled
water), were added and the reaction mix was incubated for 15 min in the dark. The
absorbance was measured at 700 nm in a Biochrome Asys UVM340 microplate reader.
Phosphate concentration was determined using a KH2PO4 standard curve. All assays were
performed in triplicate.
2.2.3. Isolation of PSB strongly attached to hyphae or directly from the soil
Leek (Allium ampeloprasum L., Norseco Inc.) seeds were planted in 200-cells seedling flats
containing pasteurized and moistened Agro-mix substrate (Fafard, Saint-Bonaventure,
Québec, Canada), homogeneously mixed with MYKE® PRO PS3, a commercial powdered
inoculum containing bacterial-free spores of the AMF Rhizophagus irregularis DAOM
197198 (previously Glomus irregulare), to give a final concentration of 1200 spores L-1 of
substrate. MYKE® PRO PS3 was kindly supplied by PremierTech, Rivière-du-Loup,
Québec, Canada, and was produced under axenic conditions in a bioreactor. Plants were
grown for 4 weeks in a greenhouse set to 14 h diurnal temperature of 22°C and 18°C at
night. After 30 days, seedlings were transplanted into 15 cm diameter pots filled with
Turface (AthleticsTM, Profile Products, Buffalo Grove, IL). This substrate, formed by
calcined clay particles, allowed easily the separation and collection of AMF hyphae. Pots
were placed in the greenhouse, watered daily and supplied twice a week for 15 d with a
water soluble 20-2-20 (N-P-K) fertilizer diluted to a final concentration of 100 mg N L-1,
with 150 mg N L-1 for an additional 30 d, and finally with 200 mg N L-1 until the end of the
experiment. Each pot containing a two-month-old mycorrhizal plant was inoculated with 10
mL of a soil suspended in sterile saline containing bacteria (approximately 106 CFU mL-1)
30
prepared from each of the 13 soil samples. Uninoculated control plants received 10 mL of
sterile saline. The experiment was organized in a completely randomized block design with
14 treatments (13 soil samples and an uninoculated control) and 4 blocks. Plants were
harvested two months after inoculation with the soil bacteria. From each pot, a 5 g
subsample of Turface plus mycorrhizal roots was suspended in 50 mL of sterile
dechlorinated tap water. Each suspension was vortexed three times for 5 min. Floating
AMF hyphae were recovered by filtrating the supernatant using a synthetic nylon with a
mesh size of 50 µm (Dynamic Aqua Supply Ltd, Surrey B.C., Canada) and then
resuspended in 6 mL of sterile saline. The hyphae were washed three times with sterile
water (2 min per wash) to remove loosely attached bacteria, and then ground using a
Kontes Pellet Pestle (Fisher Scientific) to isolate the PSB strongly attached to the outside or
inside the AMF hyphae. Ground hyphae were resuspended in 1 mL of sterile saline solution
and serially diluted. Isolation of PSB was performed on modified National Botanical
Research Institute’s Phosphate (NBRIP) agar medium containing 5 g MgCl2.6H2O, 0.25 g
MgSO4.H2O, 0.2 g KCl, 0.1 g (NH4)2SO4, 15 g Bacto-Agar, 0.5 g yeast extract, 10 g
glucose, 2.5 g hydroxyapatite and 50 µg mL-1cycloheximide per liter at pH 7 (Nautiyal,
1999). NBRIP plates were incubated at 28°C for 2-3 d, and colonies forming a clear
solubilization halo were selected and streaked three consecutive times on the NBRIP
medium to check for the stability of the dissolution phenotype. Colonies having a stable
phenotype were recovered and stored in glycerol at -80°C.
For comparison purpose, PSB were also isolated from the rhizosphere of mycorrhizal plants
(mycorrhizosphere soil). The serially diluted soil samples were plated on modified NBRIP
medium and PSB were selected as described in the previous section.
2.2.4. Mineral phosphate solubilization assay
Selected PSB were cultivated overnight in 10% Difco Tryptic Soy Broth (TSB; BD,
Franklin Lakes, N.J. USA) on a rotary shaker (200 rpm) at 28°C. To prepare PSB
inoculum, cells were collected and washed twice in sterile saline by centrifugation for 5
min at 10 000 g and resuspended in saline to a final concentration of 106 CFU mL-1. Liquid
NBRIP medium modified by the addition of glucose (10 g L-1) and hydroxyapatite or
Quebec PR (5 g L-1) received 1 mL of inoculum. Flasks containing 100 mL of inoculated
31
media were incubated for 7 d on a rotary shaker (200 rpm at 28°C). At different time
intervals (1, 3, 5 and 7 d), 2 mL aliquots were aseptically sampled and used for the
estimation of the pH and the soluble phosphate by the modified method of Fiske and
Subbarow (1925) described earlier. To appraise growth, bacterial cells were digested at
100°C for 10 min in 1 M NaOH and protein content was determined with the Folin-phenol
reagents (Lowry et al., 1951), using bovine serum albumin (Sigma-Aldrich) as a standard.
2.2.5. Identification of PSB
PSB exhibiting high phosphate dissolution activity in solid and liquid media were further
investigated, but were first identified by amplifying and sequencing the 16S rDNA. The
gene encoding the 16S rRNA was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using
eubacterial universal primers fD1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) and rP2 (5’-
ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’) (Weisburg et al., 1991). The PCR mix consisted of
deoxynucleotides at 200 mM each, 0.25 mM of each primer, 2.5 mM MgCl2, 1× PCR
buffer and 0.2 U of Taq DNA polymerase (5 Prime GmbH). A suspension of cells in
MilliQ water, coming from a fresh colony grown on 10% Tryptic Soy Agar (TSA; Difco),
was used as target DNA. The following PCR conditions were used: 95°C for 3 min,
followed by 30 cycles of 95°C for 30 sec, 46°C for 30 sec and 72°C for 2 min, and a final
extension step at 72°C for 10 min. The PCR products were purified and sequenced (CHUL
Research Center, Québec City, Québec, Canada). The nucleotide sequences were compared
using the BlastN program, and the closest match of known phylogenetic affiliation was
used to assign the isolated strains to specific taxonomic groups.
2.2.6. Identification of organic acids
For the analysis of organic acids, bacterial cultures were filtered through 0.2 µm filter
(Millipore®) and 10 µL of filtrates were injected in a Waters HPLC system (Pump Model
996). Organic acid separation was carried out on ICSep ICE-ION-300 column (7.8 × 300
mm) (Transgenomic) with 8.5 mM H2SO4 as mobile phase (0.4 mL min-1). Organic acids
were detected with a photodiode array detector (Waters model 600) at 210 nm and
identified by comparison to standards purchased from Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario,
Canada).
32
2.2.7. Siderophores production and organic phosphate mineralization
A completely randomized block design with three replicates was used in all tests. Each
experiment was also repeated three times.
Production of siderophores was determined using the Chrome Azurol Sulphonate (CAS)
liquid assay (Shelley, 1994) with the following modifications. Bacteria were grown on
liquid AT minimal medium free of Fe containing per L: 10.9 g, KH2PO4; 160 mg,
MgSO4.7H2O; 10 mg, CaCl2 . 2 H2O; 2 mg, MnCl2.4 H2O; 1 g, (NH4)2SO4 and 2 g, glucose
(Charest et al., 2005). To test the effect of inorganic Fe on bacterial growth, AT medium
was supplemented with filter sterilized Fe stock solution (10 mM of FeSO4 .7H2O in
distilled H2O) to obtain the required tested concentration. The cultures were grown to
stationary phase at 28°C on a rotary shaker (200 rpm). The assays were carried out based
on the competition for iron between the ferric complexes of the indicator dye CAS and the
siderophores produced by PSB. Siderophores, which have higher affinity for Fe+3 than the
dye CAS, can remove the iron, resulting in a change of dye color from blue to orange. The
absorbance was read at 630 nm for the loss of blue color. The following equation was used
to calculate the activity recorded in percentage siderophore units calculated as [(Ar – As) ×
Ar-1) × 100] (Shelley, 1994), where Ar is defined as absorbance of reference (uninoculated
media with CAS solution) and As is absorbance of test (supernatant with CAS solution).
To assess the phosphatase activity, PSB were grown to the stationary phase in 25 mL TSB
broth at 28°C on a rotary shaker (200 rpm). Cells from 2 mL aliquots culture were collected
and washed in sterile saline by centrifugation (10000 g, 10 min), and resuspended in 500
L of Tris buffer (pH 7). Cells were sonicated eight times on ice for 5 sec. Acid and
alkaline phosphatase activities were determined in cell free extracts in 96 well microplates
as described in the Sigma-Aldrich acid phosphatase assay kit (St. Louis, Mo; catalog #
CS0740), modified as described below. For enzymes measurement, the reaction mixture
contained 50 µL of enzyme extract, and 50 µL of substrate solution containing 0.05 M
citrate buffer with 5.5 mM of 4-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich) at pH 4.8 for acid
phosphatase, or 50 µL of 0.05 M glycine buffer with 0.01% MgCl2.6H2O and 5.5 mM of 4-
nitrophenyl phosphate at pH 10.5 for alkaline phosphatase. The reaction mixture was
maintained at 37°C for 10 min under shaking condition (60 rpm) and then the reactions
were stopped by adding 200 μL of stop solution (0.5 M NaOH). The amount of p-
33
nitrophenol liberated by acid or alkaline phosphatase from 4-nitrophenyl phosphate was
measured at 405 nm. For both acid and alkaline phosphatase, a blank (50 μL of 0.05 M
citrate buffer or 0.05 M glycine buffer with 0.01% MgCl2. 6H2O instead of enzyme extract)
was run in parallel to account for the 4-nitrophenyl phosphate that will hydrolyze
spontaneously during the incubation. A standard containing 300 μL of 0.05 μmol mL-1 of p-
nitrophenol solution (Sigma-Aldrich) was also quantified at 405 nm. One unit (U) of acid
or alkaline phosphatase catalyzes one µmol of 4-nitrophenyl phosphate per min at pH 4.8
for acid phosphatase or at pH 10.5 for alkaline phosphatase at 37°C. The specific activity
(U mg-1 protein) was determined by measuring the amount of total soluble protein in the
enzymatic extract using Lowry method (Lowry et al., 1951). For each enzyme three
different assays were performed, involving each three different measurements.
2.2.8. Phytase activity
For phytase measurement, PSB were grown in modified NBRIP liquid medium
supplemented with 5 g L-1 wheat bran as sole P source, for 5 d at 28°C and 200 rpm. At the
end of the culture, the crude supernatant (2 mL) obtained after centrifugation at 6300 g for
15 min was used to determine the phytase activity (Farhat et al., 2008). The reaction
mixture was incubated at 55°C for 30 min. The absorbance was measured at 415 nm and
the released inorganic phosphate was quantified using KH2PO4 as standard. One phytase
unit was defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 µmol of inorganic
phosphate from phytic acid per minute under the optimal reaction conditions. The specific
activity (U mg-1) was determined by measuring total soluble protein in the enzymatic
extract (Lowry et al., 1951). Three different assays were performed, involving each three
different measurements.
2.2.9. Interaction between PSB and AMF: phosphate solubilization and pH changes
Maintenance of the Agrobacterium rhizogenes transformed chicory (Cichorium intybus)
roots cultured with Ri DAOM 197198 was performed in a minimal growth medium (Bécard
and Fortin, 1988). Our experimental setup consisted of a two-compartment Petri plate
system that allows the study of the interaction between Ri extraradical hyphae and PSB
without interferences from the host roots (St-Arnaud et al., 1995). A proximal compartment
34
contained a minimal medium containing the following (mg L-1): 80 KNO3, 731 MgSO4 .
7H2O, 65 KCl, 4.8 KH2PO4, 288 Ca(NO3)2 . 4H2O, 8 NaFeEDTA, 0.75 KI, 6 MnCl2 .
4H2O, 2.65 ZnSO4 . 7H2O, 1.5 H2BO3, 0.13 CuSO4 . 5H2O, 0.0024 Na2MoO4 . 2H2O, 3
glycine, 0.1 thiamine hydrochloride, 0.1 pyridoxine hydrochloride, 0.5 nicotinic acid, 50
myo-inositol, and 10000 sucrose. A distal compartment contained the following (mg L-1):
80 KNO3, 731 MgSO4 . 7H2O, 65 KCl, 4.8 KH2PO4, 288 Ca(NO3)2 . 4H2O, 8 NaFeEDTA,
0.75 KI, 6 MnCl2 . 4H2O, 2.65 ZnSO4 . 7H2O, 1.5 H2BO3, 0.13 CuSO4 . 5H2O, 0.0024
Na2MoO4 . 2H2O and 2500 of hydroxyapatite or Quebec PR. The pH of each compartment
was adjusted to 5.5 and 0.4% of phytagel (Sigma-Aldrich) was added as the gelifying agent
before sterilization at 121°C for 20 min. Mycorrhizal chicory roots were transferred in the
proximal compartment and incubated for 3 weeks at 28°C. Inocula of four selected PSB:
Rhizobium miluonense (Rm3), Burkholderia anthina (Ba8), Rahnella sp. (Rs11) and
Burkholderia phenazinium (Bph12) were prepared from an overnight shake culture in 10%
TSB at 28°C. Cultures were washed twice with sterile saline and resuspended to give a
bacterial suspension of 108 CFU mL-1. The distal compartment, where only the extraradical
AMF mycelium was allowed to grow, received 10 μL of the bacterial suspension. An
uninoculated treatment was run in parallel as control and received 10 μL sterile saline. All
treatments were replicated five times and the Petri dishes were incubated at 28°C.
The amount of soluble P and pH changes in the distal Petri compartments was assessed as
described by Villegas and Fortin (2002) with few modifications: six weeks after bacterial
inoculation (9 weeks after the beginning of the experiment), the gelified medium was
removed, frozen at -20°C for 24 h, thawed at room temperature and then centrifuged at
10000 g for 30 min. Supernatant soluble P content and pH were measured as described
above.
2.2.10. Statistical analysis
Data were tested for normality and variance homogeneity, and acid phosphatase, phytase
and P-solubilization data were ln transformed to normalize skewed distributions. Analysis
of variance was performed using the general linear model in SAS version 9.2 (SAS
Institute). Means were compared using the Fisher’s protected least significant difference
(LSD) method at P ≤ 0.05.
35
2.3. Results
2.3.1. Isolation and identification of bacteria
A total of 941 bacterial isolates were retained for their ability to produce 15 to 35 mm
diameter P-solubilization clarification zones around colonies, on the modified NBRIP
medium containing hydroxyapatite as a sole P source. There was 541 bacterial isolates
obtained from hyphospheres and 400 from rhizospheres (Table 2.S2). Only 25% of PSB
isolates showed a stable phosphate solubilization phenotype after 3 consecutive subcultures
on solid modified NBRIP containing hydroxyapatite, while only 13% were able to
solubilize hydroxyapatite in liquid modified NBRIP (Table 2.S2). Based on their ability to
mobilize more than 50 mg P L-1 from hydroxyapatite in liquid medium after 7 d of
incubation, 51 PSB (Table 2.S2), were selected and identified (Table 2.2).
The best eight PSB (four from the hyphosphere and four from the rhizosphere) were
identified to Fermicutes and to α-, β- and γ- Proteobacteria (Table 2.3 and 2.S3).
Hyphobacteria were identified as Rhizobium miluonense (Rm3), Burkholderia anthina
(Ba8), and Burkholderia sp. (Bs9 and Bs13), while rhizobacteria belong to Dyella japonica
(Dj1), Bacillus pumilus (Bp3), Rahnella sp. (Rs11) and Burkholderia phenazinium
(Bph12).
36
Table 2.2. Origin of the 51 selected PSB trapped to AMF hyphae or isolated from the
mycorrhizosphere of the soils used in this study.
Genera Number of bacteria retained from
AMF hyphae
(Hyphobacteria)
Mycorrhizosphere
(Rhizobacteria)
Loosely attached Strongly attached
α-Proteobacteria
Rhizobium
0 1 0
β-Proteobacteria
Burkholderia
7 26 5
γ-Proteobacteria
Rahnella 0 0 4
Pseudomonas 0 0 2
Ewingella 0 0 2
Dyella 0 0 1
Erwinia 0 0 1
Actinobacteria
Leifsonia
1 0 0
Firmicutes
Bacillus
0 0 1
Total 8 27 16
37
Table 2.3. Identification of the selected PSB isolates by sequencing of the 16S rDNA.
Isolate #
(strain name)
Length of
16S rDNA
gene
sequenced
GenBank
Accession
no.
Closest match
Strain % Gene
identity
PSB strongly attached to AMF hyphae (Hyphobacteria)
3.1 (Rm3) 1293 KC241902 Rhizobium miluonense CC-B-L1 99
8.1 (Ba8) 1377 KC241903 Burkholderia anthina R7-112 100
9.1 (Bs9) 931 KC241904 Burkholderia sp.1 IT1 100
13.2 (Bs13) 1351 KC241905 Burkholderia sp.2 IT1 99
PSB from the mycorrhizosphere (Rhizobacteria)
1.39 (Dj1) 1366 KC241898 Dyella japonica NBRC 104185 99
3.10 (Bp3) 1066 KC241899 Bacillus pumilus R71 100
11.39 (Rs11) 985 KC241900 Rahnella sp.WMR15 99
12.21 (Bph12) 949 KC241901 Burkholderia phenazinium A 1 99
38
2.3.2. Mineral phosphate solubilization ability of PSB and organic acids production
The soluble-P concentration in the medium containing hydroxyapatite ranged between 96
(Bp3) and 183 (Ba8) mg P L-1 after 7 d (Fig. 2.1A). In general after 7 d, hyphobacteria
mobilized more P from hydroxyapatite than rhizobacteria. In fact, 3 out of the 4 studied
hyphobacteria exhibited a soluble P concentration in the medium higher than 177 mg P L-1
while with rhizobacteria, the highest soluble P concentration was observed with Rahnella
sp. Rs11 (Fig. 2.1A) with a value of 175 mg P L-1. No soluble-P and no decrease in the pH
were observed in the uninoculated controls.
The specific P-solubilization on NBRIP medium was determined by dividing the total P-in
the supernatant by the total protein concentration of the bacterial cells. Rhizobacteria
Rahnella sp. Rs11 showed the highest specific P-solubilization (1500 mg P mg-1 protein)
after 3 d and hyphobacteria Burkholderia anthina Ba8 (1498 mg P mg-1 protein) after 5 d
incubation. Specific P-solubilization activity decreased after 7 d indicating an important
immobilization of soluble P by PSB (Fig. 2.1B). As observed with P-solubilization,
hyphobacteria exhibited significantly higher specific P-solubilization than rhizobacteria on
NBRIP-hydroxyapatite medium (Fig. 2.1B).
Phosphate solubilization in liquid NBRIP-hydroxyapatite medium was accompanied by a
significant drop in pH. In fact, after 1 d, the pH decreased significantly from 7 to 4.3 and
3.8 with rhizobacteria Rs 11 and Bph12, respectively (Fig. 2.1C). With the four tested
hyphobacteria the pH dropped from 7 to 3.7.
Chemical analysis of Quebec PR, obtained from Arianne Phosphates Inc., showed a total P
content of 146 mg g-1 (Table 2.1). The solubility of P from Quebec PR in 2% formic or
citric acid was respectively 5 mg g-1 and 7 mg g-1 indicating a very low reactivity.
The soluble-P concentration in the medium containing Quebec PR ranged between 3.5 and
19.6 mg P L-1 after 7 d (Fig. 2.2A). After 3 d, the rhizobacteria B. phenazinium Bph12
mobilised the highest amount of P (22.4 mg P L-1). Hyphobacteria Bs9 and Ba8 were the
second best Quebec PR solubilizers (14.5 and 13.7 mg P L-1, respectively) after 7 d of
incubation, while rhizobacteria Dyella japonica Dj1 showed the lowest soluble P in the
supernatant (3.5 mg P L-1). The maximum P-specific solubilization was recorded with
rhizobacteria Bph12 (195.1 mg P mg-1 protein) followed by hyphobacteria Ba8 (120.5 mg P
39
mg-1 protein) after 3 d of incubation (Fig. 2.2B). Dj1 was the least efficient PSB with a
maximum of 29.6 mg P mg-1 protein reached after 1 d of incubation (Fig. 2.2B). Quebec
PR solubilization was also accompanied by a substantial decrease in culture media pH from
7 to 3 after 7 d of incubation (Fig. 2.2C).
Three different organic acids, gluconic acid, 2-ketogluconic acid and pyruvic acid, were
shown to be produced by the isolates (Table 2.4). After 7 days incubation the supernatant of
Burkholderia sp. isolates (Bs9 and Bs13) grown on NBRIP-hydroxyapatite contained the
highest organic acid concentrations (Table 2.4). B. anthina Ba8 and Burkholderia sp. Bs9
and Bs13 mostly produced 2-ketogluconic acid. Bacillus pumilis Bp3 and Burkholderia
phenazinium Bph12 produced only gluconic acid. Rahnella sp. Rs11 and Rhizobium
miluonense Rm3 produced both gluconic acid and 2-ketogluconic acid. Dyella japonica
produced only pyruvic acid.
On NBRIP-Quebec PR medium, all rhizobacteria except Dyella japonica Dj1 produced
only gluconic acid, although hyphobacteria produced mainly gluconic and 2-ketogluconic
acids (Table 2.4). The highest production of gluconic acid was by B. phenazinium Bph12.
Burkholderia sp.1 Bs9 was the highest 2-ketogluconic acid producer.
40
Figure 2.1 : (A) Soluble phosphate; (B) specific phosphate solubilization activity, LSD0.05
values: d1 = 63.98, d3 =177.78, d5 =110.80, d7 = 55.28 mg P mg-1 protein; and (C) pH
variation in the supernatant of PSB growing on NBRIP medium containing hydroxyapatite.
Phosphate solubilizing hyphobacteria are shown on the left and rhizobacteria on the right.
PSB identity is described in Table 2.3. Error bars indicate standard deviation of means from
three independent assays.
41
Figure 2.2 : (A) Soluble phosphate; (B) specific phosphate solubilization activity LSD0.05
values: d1 = 22.75, d3 = 23.61, d5 = 27.55, d7 = 26.59 mg P mg-1 protein; and (C) pH
variation of PSB growing on NBRIP medium containing Quebec phosphate rock.
Phosphate solubilizing hyphobacteria are shown on the left and rhizobacteria on the right.
PSB identity is described in Table 2.3. Error bars indicate standard deviation of means from
three independent assays.
42
Table 2.4. Organic acid production by selected PSB strongly attached to AMF hyphae
(Hyphobacteria) or isolated from the mycorrhizosphere (Rhizobacteria) on NBRIP medium
containing Quebec PR or hydroxyapatite after 7 days of incubation.
PSB
Strain*
Organic acids mg L-1
Hydroxyapatite Quebec PR
Gluconic acid 2-Ketogluconic
acid
Pyruvic
acid
Gluconic
acid
2-
Ketogluconic
acid
Hyphobacteria
Rm3 1564.3b±323.7 897.6d±214.7 2.8d±3.2 294.1b±43.7 235b±14.4
Ba8 - 3642.5b±258.1 18.5cd±13.1 269.2b±96.9 225.6b±11.1
Bs9 152.1c±37.9 4345.2a±153.2 118.1b±6.6 305.4b±19.6 298.9a±18.9
Bs13 - 3855.3b±265.1 34.7c±21.6 200.9c±54.5 158.4c±0.4
Rhizobacteria
Dj1 - - 454.9a±17.6 - -
Bp3 1963.3b±232.1 - - 350.9b±45.6 -
Rs11 2883a±365.6 2270.2c±160.4 17cd±7.7 204.3b±27.3 -
Bph12 3359.5a±222.7 - - 1437.7a±54.6 -
*PSB identity can be found in Table 2.3. Values are means ±standard deviations of three
independent assays. For each P source, in each column means followed by the same letter
are not significantly different according to the Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05). -: not
detected.
43
2.3.3. Siderophores production and organic phosphate mineralization
All tested PSB produced siderophores (Fig. 2.3). The highest production was exhibited by
Burkholderia isolates: B. phenazinium Bph12 (63.6%), Burkholderia sp.2 BS13 (62.7%)
and Burkholderia sp.1 Bs9 (48.7%). Bacillus pumilus Bp3 and Dyella japonica Dj1 showed
the lowest siderophores production with 3.5% and 4%, respectively.
Important acid phosphatase activities were detected in all PSB tested except Bp3 (Table
2.5). Marked alkaline phosphatase activity was observed with PSB Rm3, Bs9 and RS11
while Bp3 showed very low activity. Phytase activity was detected in all PSB selected and
ranged from 28 to 86 mU mg-1 protein (Table 2.5).
Figure 2.3 : Production of siderophores by PSB hyphobacteria (Rm3, Ba8, Bs9, and Bs13)
and rhizobacteria (Dj1, Bp3, Rs11, and Bph12) in AT minimum medium after 5 days of
incubation. Means followed by the same letter are not significantly different according to
Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05). Error bars are standard deviations of the means from
three independent assays. Table 2.3 shows PSB identity.
44
Table 2.5. Activity of enzymes involved in organic phosphate mineralization.
PSB Strain* Enzyme activity mU mg-1 protein
Acid phosphatase Alkaline phosphatase Phytase
Hyphobacteria
Rm3 439.56b±9.75 370.71b±8.91 205.47a±164.45
Ba8 360.21bc±9.75 NA 27.97c±13.49
Bs9 387.87bc±66 237.18c±45.32 32.12bc±7.05
Bs13 326.06bcd±177.87 NA 31.13bc±10.25
Rhizobacteria
Dj1 284.54cd±26.22 NA 85.88ab±43.11
Bp3 NA 5.31d±4.52 69.97abc±44.64
Rs11 752.76a±4.85 749.45a±3.62 54.43bc±45.30
Bph12 234.55d±75.00 NA 44.38bc±8.14
*PSB identity can be found in Table 2.3. Values are means ±standard deviations of three
independent assays. In each column, means followed by the same letter are not significantly
different according to the Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05). NA: no activity detected.
For phosphatases one unit (U) is the amount of enzyme catalyzing one µmol of 4-
nitrophenyl phosphate per min at 37°C. One unit (U) phytase releases 1 µmol of inorganic
phosphate from phytic acid per minute at 55°C.
45
2.3.4. PSB and AMF interaction
Two hyphobacteria (R. miluonense Rm3 and B. anthina Ba8) and two rhizobacteria
(Rahnella sp. Rs11 and B. phenazinium Bph12) were selected to study their interaction with
AMF, based on their high P-solubilization and mineralization activities and siderophores
production. The selected strains were unable to grow alone on the minimal growth medium
of the distal compartment containing hydroxyapatite or Quebec PR without any carbon
source or growth factors and thus no P-solubilization levels were detected. After 6 weeks of
dual culture with Ri mycelium, the amount of solubilized-P was significantly (P ≤ 0.05)
increased compared with the AMF mycelium alone (Fig. 2.4A).
With Quebec PR or hydroxyapatite as sole P source, B. anthina Ba8 in association with Ri
was the best P-solubilizer (1.84 and 3.51 mg P L-1, respectively) followed by R. miluonense
Rm3 (1.16 and 3.06 mg P L-1, respectively). Lower P-solubilization levels were detected
with Rahnella sp. Rs11 (0.88 and 2.72 mg P L-1) and B. phenazinium Bph12 (0.77 and 2.75
mg P L-1) in the presence of the AMF mycelium with Quebec PR and hydroxyapatite,
respectively. Rhizophagus irregularis (control) was barely able to solubilize phosphate.
The pH of distal medium was initially adjusted to 5.5 and after 6 weeks of dual culture, B.
anthina Ba8 produced the highest drop in pH (5.38 and 5.01 with Quebec PR and
hydroxyapatite) (Fig. 2.4B). Rahnella sp. Rs11 caused little pH change (5.48 and 5.29 with
Quebec PR and hydroxyapatite). The pH of the distal media containing only Ri hyphae did
not change. In the uninoculated treatment no soluble-P and no decrease in the pH were
observed.
46
Figure 2.4 : Soluble phosphate and pH variation in the minimal medium extract obtained
from the distal compartment containing hyphae of AMF Rhizophagus irregularis (Ri), Ri
plus hyphobacteria Rhizobium miluonense (Rm3) or Burkholderia anthina (Ba8); Ri plus
rhizobacteria Rahnella sp. (Rs11) or Burkholderia phenazinium (Bph12) after 6 weeks of
dual incubation. For each P-source means followed by the same letter (capital for
hydroxyapatite or lowercase for Quebec PR) are not significantly different according to
Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05). Error bars are standard deviations of the means from
three independent assays.
47
2.4. Discussion
Many genera of PSB showed a good potential to be used as biofertilizers for the
improvement of plant P nutrition, because they mobilize P from sparingly inorganic and
organic P sources in soil (Calvo et al., 2014). Several reports also highlighted the
importance of beneficial interaction between PSB and AMF in P mobilization and
improvement of uptake by plants (Calvo et al., 2014; Sharma et al., 2013). However,
although AMF symbiosis with plants is ubiquitous, its interaction with PSB was overlooked
during the development of biofertilizers (Calvo et al., 2014; Sharma et al., 2013), and this
might explain in part the variability of the results obtained during inoculation trials (Sharma
et al., 2013). In fact, it was clearly demonstrated that strains of bacteria exhibit different
attachment patterns according to the AMF species involved (Toljander et al., 2006). Since
AMF hyphae is an important interface for the signalling and exchange of metabolites with
bacteria (Toljander et al., 2006), and as mycelial exudates significantly influence the
composition of bacterial communities (Toljander et al., 2007), we hypothesized that hyphae
competent PSB would be more effective to colonize the hyphosphere and would mobilize
more P from PR than loosely attached PSB. Investigation of AMF hyphosphere in vivo
requires the construction of elaborate compartmentalized plant growth systems (Mansfeld-
Giese et al., 2002; Zhang et al., 2014). The use of T-DNA-transformed Daucus carota roots
in two-compartment plates (St-Arnaud et al., 1995) proved to be a very useful in vitro tool
to study bacterial attachments, however it has some limitations like the failure of
production of enough fungal material in the liquid compartment as observed by Scheublin
et al. (2010).
In this work, we developed a new simple method, inspired from the one described by
Staddon et al. (2003), using mycorrhizal leek plants growing on Turface, which allowed the
isolation of PSB from the hyphosphere. PSB strongly attached were obtained after
sequential washing of Ri hyphae in saline to remove loosely attached bacteria. In this
system, bacterial attachment to Ri hyphae is then a consequence of natural AMF-PSB
interactions and mycorrhiza exudation patterns, without a priori assumptions on the
specific species involved. Using this method we isolated respectively 310 and 231 loosely
and strongly attached PSB from the hyphae of Ri DAOM 197198 obtained from leek plants
inoculated with suspensions from each of the 13 mycorrhizospheric soils studied (Table
48
S2). As P-solubilization phenotype disappears in subcultures of PSB (Rodríguez and Fraga,
1999) probably because of their inability to produce pyrroloquinoline quinone (PQQ), the
cofactor required by glucose dehydrogenase (GDH) to produce gluconic acid (Antoun,
2012), only 81 loosely and 47 strongly attached hyphobacteria retained the phenotype.
Finally 8 loosely and 27 strongly attached bacteria were further investigated because of
their high capacity to solubilize hydroxyapatite in liquid medium (Table 2.2). Similarly and
for comparison purpose, out of the 400 rhizobacteria isolated from soils, 16 were retained
for their high P mobilizing ability in liquid medium (Table 2.2). These results suggest that
in addition to the mycorrhizosphere and the rhizosphere, Ri DAOM 197198 hyphae are
important ecological niches for bacteria and they harbor many potent PSB.
The present work was not planned to study all bacteria associated with Ri hyphae, but
rather to select culturable bacteria closely attached to hyphae, having substantial ability to
mobilize P from poorly soluble phosphates. Both Gram positive and negative bacteria
include genera of PSB (Rodríguez and Fraga, 1999). We observed that Gram negative
bacteria were the dominant PSB both on the hyphae of Ri and in the rhizosphere. Except for
one Rhizobium miluonense isolate, the 26 PSB strongly attached to Ri hyphae belonged to
the genus Burkholderia. Pseudomonas, Burkholderia and Bacillus have been reported as
the most predominant species associated with AMF fungi (Bonfante and Anca, 2009), and
Burkholderia species are frequently isolated as efficient PSB (Calvo et al., 2014; Gupta et
al., 2012). However, since the last step of the method used to isolate strongly attached
bacteria involved hyphal grinding, we cannot exclude the possibility that some of the
isolates might be fungal endophytes. Thorough investigation revealed the presence of a
nonculturable endophyte related to Burkholderia in spores and hyphae of Glomus
margarita (Bonfante and Anca, 2009), however Cruz et al. (2008) isolated from surface
sterile spores of Gigaspora margarita a culturable bacterial strain closely related to
Janthinobacterium lividum (Burkholderiales) with P-solubilization trait. With the exception
of a Bacillus isolate, the 15 rhizobacteria mobilizing P retained from the 13 soils studied
were Gram negative, and about one third belonged to Burkholderia (Table 2.2). This can
explain in part the importance of Burkholderia strongly trapped on hyphae of Ri, as
observed under our experimental conditions.
49
Organic P in soil represents 50% or more of the total soil P (Richardson, 2001) and
siderophores production is closely associated to P-solubilization activity (Sharma et al.,
2013). Therefore, in addition to their high inorganic P mobilization, four hyphobacteria and
four rhizobacteria were selected on the basis of their important phosphatase activity and
siderophores production (Table 2.S3), identified (Table 2.3) and further investigated. As
expected, P was more readily mobilized from hydroxyapatite by PSB than from the Quebec
PR, because of its very low reactivity (Table 2.1). Both hyphobacteria and rhizobacteria
solubilized hydroxyapatite in a similar fashion, dropping rapidly the pH of the culture
medium after one day of incubation (Fig. 2.1C) and reaching a maximum accumulated
excess soluble P in the supernatant after seven days of incubation (Fig. 2.1A). Specific P-
solubilization (mg P mobilized per mg protein) from hydroxyapatite decreased after 5 days
incubation suggesting a decrease in solubilization activity or an important immobilization
of P by bacteria, leaving less soluble P surplus in the supernatant (Fig. 2.1B). When Quebec
PR was used as sole source of P, a rapid drop in the pH of the culture medium was also
observed after one day with all tested PSB (Fig. 2.2C) However, both solubilized P and P
specific solubilization reach rapidly a plateau indicating that the low P-solubilized is
rapidly immobilized by the growing bacteria (Fig. 2.2A and B). Gluconic acid is the major
organic acid involved in P-solubilization by bacteria (Rodríguez and Fraga, 1999),
produced by the oxidation of glucose by glucose dehydrogenase. Gluconic acid can be
further oxidized to 2-ketogluconic acid by gluconic acid dehydrogenase which can be
further transformed to pyruvic acid (Buch et al., 2010). In this work, glucose was the
carbon source used in NBRIP medium which explains the importance of gluconic and 2
ketogluconic acids detected in the supernatants of the PSBs tested (Table 2.4). With the
easily mobilized hydroxyapatite in addition to gluconic acid or 2-ketogluconic acid, all
hyphobacteria produced pyruvic acid, probably reflecting a more rapid transformation of
gluconic acid via the glucose catabolism phosphorylative pathway (Buch et al., 2010).
Among rhizobacteria, only Dj1 produced a significant amount of pyruvic acid in the
presence of hydroxyapatite (Table 2.4), and the absence of gluconic or 2-ketogluconic acid
suggests that pyruvic acid might be originating from the direct glucose oxidative pathway
(Buch et al., 2010). Quebec PR was mobilized by PSBs by producing gluconic or 2
ketogluconic, except for Dj1 for which no organic acids was detected (Table 2.4). In the
50
NBRIP medium, ammonium sulfate was used as the sole nitrogen source, and the low
amount of P mobilized from Quebec PR by Dj1 could be the results of the release of
protons associated with ammonium assimilation, as previously observed with a Penicillium
rugulosum mutant which do not produce organic acids (Reyes et al., 1999).
In addition to mineral P, soil contains a wide range of organic forms of P that may
constitute 30-50% or more of the total P in most soils (Rodríguez and Fraga, 1999). Phytic
acid is the most abundant form of organic P in soils, but it reacts with soil cations forming
sparingly soluble phytates, not available for plants. Many soil microorganisms can produce
phosphatases including phytases, able to hydrolyze organic P releasing orthophosphate the
form of P absorbed by plants (Rodríguez and Fraga, 1999). All PSBs tested except Bacillus
pumilus Bp3 produced acid phosphatase, however Bp3 produced phytase. In general, the
high level of acid phosphatase observed (Table 6) suggests that the studied PSBs selected
for their high solubilization of inorganic phosphate, mainly by the production of organic
acids, might also play a major role in organic phosphate mineralization in soils. Since
organic acids improve significantly the bioavailability of P from phytate (Giles et al.,
2014), more work is necessary to determine if the studied PSB can improve plant P uptake
from phytates.
To study the interaction between PSB and Ri extraradical hyphae and their effect on
Quebec PR solubilization, we used the two compartments plate system as previously
described by Villegas and Fortin (Villegas and Fortin, 2001, 2002). However, in this work,
no vitamins or carbon source were added in the distal compartment, and therefore all
energy source required for bacterial growth and activity is totally derived from hyphal
exudates. In fact we did not observe any bacterial growth or P-solubilization in the distal
compartment medium, in the absence of Ri hyphae. We also used nitrate as the nitrogen
source in the distal compartment to avoid solubilization by Ri hyphae resulting from
medium acidification (Villegas and Fortin, 2001). After six weeks of incubation, Ri alone
was a mediocre P-solubilizer, confirming previous observation made by Villegas and Fortin
(2002). In combination with PSB, a substantial increase in P-solubilization was observed,
and as expected, P mobilized from hydroxyapatite was more substantial than P mobilized
from low reactivity Quebec PR (Fig. 2.4). Mobilization of P by PSB from sparingly soluble
P sources was associated with a slight decrease in the pH of the medium (Fig. 2.4).
51
Hyphobacteria Burkholderia anthina Ba8 mobilized significantly more P from
hydroxyapatite or Quebec PR (Fig. 2.4). The efficiency of this PSB strain might be
explained to its ability to form important biofilms on Ri hyphae as indicated by our
preliminary observations, and this close contact between the prokaryotic PSB and the
eukaryotic AMF probably trigger interesting exchanges that merit further investigations.
This work illustrates the positive interaction taking place between PSB and AMF that show
a great potential to improve plant P nutrition. It also suggests that the close association of
hyphobacteria might be a better source to isolate efficient PSB. Because fungal species can
influence bacterial attachment to AMF hyphae (Toljander et al., 2006), and our
observations were made with only one isolate of AMF Ri DAOM 197198. Further work
performed with other genera and species of AMF is necessary to properly appraise the
potential of the selected PSB to be used in a commercial biofertilizer.
Acknowledgements
The authors are indebted to the FQRNT (Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et
les Technologies) for the financial support. We would like to thank Jean Martin for the soil
analysis and Habib Horchani for critical reading of the manuscript.
52
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56
Supplementary material
Table 2.S1. Chemical characteristics of mycorrhizospheric soil samples collected from 13 sites in Quebec and used for the isolation of
PSB.
No. Sampling
site Plant Soil pH
Soil
organic
matter
(%)
Mehlich
III P/Al
(%)
P S K Ca Mg Na Fe Al Cu Mn Zn
(g/Kg) (mg/Kg)
1 Beauport Cornus
(Dogwood) 7.48 5.7 5.9 1.2 0.3 0.65 9.10 1.65 0.11 17.15 6.9 18 185 54
2 Beauport Cornus
(Dogwood) 7.17 1.5 3.9 1.5 0.1 0.46 4.48 1.23 0.11 21.98 6.5 18 173 41
3 Beauport Staghorn
Sumac 6.60 3.1 8.1 0.8 0.1 0.34 2.71 0.89 0.08 15.24 5.2 17 141 49
4 Beauce Maple 4.16 6.1 0.04 0.3 0.2 2.06 0.54 3.05 0.09 18.96 13.8 18 479 44
5 Beauce Maple 4.61 48.6 43.7 0.9 1.2 1.58 3.15 1.04 0.06 5.40 5.5 24 869 51
6 Beauce Maple 4.85 12.5 0.2 0.5 0.3 2.54 1.14 4.16 0.21 30.96 22.1 23 477 81
7 Beauce Maize 6.83 5.4 27.8 1.3 0.3 1.81 3.81 5.89 0.11 26.13 16.4 33 603 81
8 Issoudoun Maple 4.36 26.0 3.9 0.5 0.6 3.95 2.46 2.30 0.06 13.77 15.3 22 274 53
9 Issoudoun Maple 4.50 7.3 0.3 0.4 0.2 5.32 0.70 3.53 0.07 22.91 24.6 17 208 49
10 Laurier-
station Maple 4.45 32.3 1.6 0.3 0.5 4.04 3.14 2.17 0.05 14.06 19.9 20 299 59
11 Laurier-
station Maple 4.87 10.9 0.1 0.2 0.1 5.76 2.39 3.16 0.11 20.67 29.8 16 146 55
12 Laurier-
station Maple 4.78 23.9 1.5 0.07 0.5 1.24 0.3.61 1.32 0.08 10.46 8.0 9 418 43
13 Laurier-
station Maple 4.68 9.3 0.5 0.03 0.2 1.12 0.1.49 1.50 0.07 17.70 12.9 11 270 29
57
Table 2.S2. Selection of PSB used in this study
Experimental step Isolate
Hyphosphere Rhizosphere
Loosely attached Strongly attached
PSB isolated in solid mediuma 310 231 400
PSB with stable P solubilization
phenotype
81 47 106
PSB able to solubilize P in liquid
mediumb
28 27 64
Retained and identified PSBc 8 27 16
a, b In solid and liquid NBRIP medium, hydroxyapatite was used as sole P source. c Retained PSB solubilized more than 50 mg P L-1 from hydroxyapatite in liquid NBRIP
medium.
58
Table 2.S3. Identity, siderophores production and phosphatases activity of selected PSB.
Isolate Siderophores* Phosphatases*
Hyphobacteria
Loosely attached to AMF hyphae
Burkholderia cepacia
3.1 + +
6.1 + +
6.2 + +
6.3 + -
7.2 + +
11.1 + -
Burkholderia sp.
12.1 + +
Leifsonia naganoensis
7.1 + -
Strongly attached to AMF hyphae
Rhizobium miluonense
3.1 +++ +++
Burkholderia cepacia
3.3 ++ +++
3.4 ++ -
3.5 ++ ++
3.6 + -
7.1 + +-
7.2 ++ +-
7.4 + +++
8.2 ++ ++
9.2 ++ +++
11.3 ++ -
11.4 ++ +++
11.5 ++ +++
12.2 +++ +
12.3 ++ +
12.4 ++ ++
12.5 ++ +++
13.1 + +++
Burkholderia cenocepacia
13.4 +- ++
Burkholderia anthina
8.1 +++ +++
Burkholderia sp.
1.1 ++ +-
9.1 +++ +++
59
11.7 ++ +++
11.8 ++ +++
11.9 + +
13.2 +++ +++
Burkholderia vietnamiensis
11.B15 + +
Rhizobacteria
Dyella japonica
1.39 + ++
Bacillus pumilus
3.10 + -
Rahnella sp.
11.39 ++ +++
Rahnella aquatilis
8.15 ++ +++
1.33 + +
11.43 ++ ++
Pseudomonas gingeri
6.1 ++ -
Burkholderia phenazinium
12.21 +++ +++
5.3 ++ -
9.33 ++ +++
12.2 ++ -
Burkholderia phytofirmans
4.24 ++ -
Ewingella americana
9.20 ++ +++
Pseudomonas koreensis
11.38 ++ -
Ewingella americana
11.55 ++ ++
Erwinia billingiae
13.52 ++ ++
+++: high, ++: medium, +: low. +-: detected production, -: no production.
Isolates are designated by soil number followed by isolate number after the dot. PSB retained for
further investigation are highlighted in grey.
* Siderophores and phosphatases production in solid medium were performed as described by
Schwyn and Neilands (1987)1 and Barber and Kuper (1951)2, respectively.
1 Schwyn, B., and J. B. Neilands. 1987. Universal chemical assay for the detection and
determination of siderophores. Analytical Biochem. 160:47-56. 2 Barber, M., and Kuper, S. W. A. (1951). Identification of Staphylococcus pyogenes by the
phosphatase reaction. Journal of Pathology and Bacteriology, 63 :65-68.
61
Chapitre 3 :
Solubilization of igneous phosphate rock by biofilm
forming mycorrhizospheric bacteria
Salma Taktek, Marc St-Arnaud, Yves Piché, J.-André Fortin and
Hani Antoun
62
Résumé
Généralement, la solubilisation des phosphates est stimulée par l’interaction entre les
champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) et les bactéries solubilisant les phosphates
(BSP) au niveau de l’hyphosphère. Dans le but de mieux comprendre la relation entre le
mécanisme d’adhérence des BSP aux surfaces et la dissolution biologique du phosphate de
roche (PR), on a eu recours aux techniques classiques de quantification de biofilm.
Nos résultats montrent que les hyphobactéries (Ba8 et Rm3) sont capables de produire un
biofilm sur le PR du Québec, significativement plus développé comparativement aux
rhizobactéries (Rs11 et Bph12). Par ailleurs, on a constaté que la solubilisation des
phosphates est positivement corrélée à la production de biofilm contenant le plus de
cellules vivantes, notamment avec l’hyphobactérie Ba8.
Ainsi, l’adhérence et la viabilité des cellules formant le biofilm ont été vérifiées à l’aide de
techniques de microscopie. L’importance du biofilm formé par la souche Ba8, considérée
comme étant la formatrice du biofilm le plus viable sur les particules de phosphates, a été
réalisée. Cette hyphobactérie est aussi capable de s’attacher intimement à la surface des
hyphes du CMA Rhizophagus irregularis (Ri) en présence du PR du Québec.
63
Abstract
Phosphate-solubilizing bacteria (PSB) closely attached to the hyphosphere of arbuscular
mycorrhizal fungi (AMF) Rhizophagus irregularis (Ri), are more likely to be more
successfull in extracting phosphorus (P) from igneous phosphate rock (PR) than other
loosely attached rhizobacteria. Towards a better understanding of the mechanisms involved
in the possible interactions between PSB, PR and AMF, bacterial attachment to abiotic and
biotic surfaces were studied. Biochemical assays, confocal laser scanning microscopy
(CLSM) and scanning electron microscopy (SEM) were used to observe microbial biofilm
directly on phosphate particles and Ri hyphae. Rhizobium miluonense Rm3 and
Burkholderia anthina Ba8 isolated from the hyphae of Ri produced significantly more
biofilm on PR than Rahnella sp. Rs11 and Burkholderia phenazinum Bph12 isolated from
the rhizosphere. Moreover, as indicated by the hydrolysis of the fluorescein diacetate assay,
the biofilm formed by Ba8 on a PR from Quebec or hydroxyapatite, contained substantially
more viable cells than the biofilms formed by the three other tested bacteria. In fact, the
highest P mobilized from PR or hypdroxyapatite was observed with Ba8 biofilm. CLSM
micrograph of Ba8 biofilm showed that viable cells adhere to the whole surface of
phosphate particles as compared to Rs11 and Bph12 viable cells that were scattered.
Importance of the biofilm formed by Ba8 was also confirmed by observations made by
using SEM. Likewise, high adherence of Ba8 to Ri was observed only in the presence of
Quebec PR. Synergism between PSB, PR and Ri will be relevant to the improvement of
sustainable and organic agriculture.
Keywords: Biofilm, Phosphate rock solubilization, Rhizophagus irregularis hyphae
64
3.1. Introduction
Phosphorus (P) is an important plant growth limiting nutrient, because it is required in large
amount and a large proportion of soluble P rapidly reacts with soil cations forming
sparingly soluble phosphates (Whitelaw, 2000, Richardson, 2001, Gyaneshwar et al.,
2002).
Soluble P chemical fertilizers are used to compensate for soil deficiency but their use on a
regular basis is costly and may cause potential environmental problems like eutrophication
(Carpenter, 2008). Therefore, there is an increasing demand for the development of
economical and ecofriendly technologies. Phosphate rock (PR), the cheapest P-fertilizer,
was recognized as a valuable alternative for sustainable agriculture (Vassilev et al., 2001,
Reddy et al., 2002), and it may provide a natural and effective source of phosphate
fertilizers.
Soil microorganisms play a key role in soil functional processes including organic matter
decomposition, turnover and release of P (Van der Heijden et al., 2008). Among the wide
diversity of microbial population present in soil, phosphate solubilizing bacteria (PSB) and
arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are considered as beneficial functional groups that are
able to establish a link between P reserves and plant P uptake. Indeed, PSB increase soil
available P by releasing organic acids, protons, siderophores and enzymes which are
involved in P mobilization from sparingly inorganic and organic sources (Rodríguez &
Fraga, 1999) whereas, AMF form a hyphal network to explore a greater soil volume, and
transfer soluble P to the host plant (Smith & Smith, 2011). Furthermore, Bonfante and
Anca (2009) suggested that bacteria loosely or strongly attached to AMF hyphae are
probably third partners playing a major role in the plants-mycorrhizae symbioses.
In previous work (Taktek et al., 2015), a great attention was focused on the interactions
between microorganisms in soil, especially in the mycorrhizosphere, which provides
biological surfaces for AMF and mycorrhizobacteria especially PSB (Johansson et al.,
2004, Frey-Klett et al., 2007). In this natural environment, bacteria settle on the surfaces of
roots and AM hyphae and form biofilms (Seneviratne et al., 2008). These bacterial
communities are characterized by an irreversible attachment to certain abiotic or biotic
surfaces involving distinct set of molecular mechanisms and stimuli (Donlan & Costerton,
65
2002). Microbial biofilms are involved in the geochemical cycles of most elements and
bacteria cooperate within a biofilm matrix rather than in a planktonic state (Davey &
O'Toole, 2000). Root-associated biofilms have been extensively studied and many bacterial
assemblies have plant growth promoting traits (for review see Ramey et al., 2004) while,
rhizobia-associated biofilms enhanced nutrient availability (especially N and P) to plants
(Seneviratne & Jayasinghearachchi, 2005). Moreover, it has been previously reported that it
was possible to increase the biosolubilization of PR by using multiple-species biofilm more
effectively than individual microorganisms (Jayasinghearachchi & Seneviratne, 2006).
We have recently demonstrated that PSB associated with hyphae of the AMF fungus
Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM197198 solubilized more efficiently PR than
rhizobacteria (Taktek et al., 2015). The association between AMF and soil bacteria have
important implications in agriculture by enhancing nutrients uptake namely P (Miransari,
2011). These ecofriendly and beneficial communities appear to be important essentially in
organic or sustainable managements. However, there is still a lack of information
concerning the attachment of PSB, with biofilm forming ability, to AMF hyphae. The
objectives of this research were to compare Quebec PR solubilization by microbial biofilms
formed by PSB isolates obtained from Ri hyphae or from rhizospheric soils and to describe
the biofilm structure on PR particles and Ri hyphae.
3.2. Materials and methods
3.2.1. Strains and mycorrhizal fungus
Four PSB were used in this work: Rhizobium miluonense (Rm3), Burkholderia anthina
(Ba8) isolated from the hyphosphere of the AMF Rhizophagus irregularis, and Rahnella
sp. (Rs11) and Bukholderia phenazinium (Bph12) isolated from the mycorrhizosphere
(Taktek et al., 2015). Pure spores of Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 198197,
previously Glomus irregulare, were kindly supplied by PremierTech, Rivière-du-Loup,
Quebec, Canada.
66
3.2.2. Evaluation of bacterial biofilm formed on sparingly soluble phosphates
All tests were performed in a completely randomized block design by using as sole P
source Quebec PR (Arianne Phosphate Inc., Chicoutimi, Qc, Canada) or hydroxyapatite
(Sigma-Aldrich), used as control.
3.2.2.1. Crystal violet assay
Crystal violet (CV) assay was performed by previously described method (O'Toole, 2011)
slightly modified as follows. Inocula were prepared by growing bacteria overnight on a
rotary shaker (180 rpm) at room temperature, in 25 mL of 10% tryptic soy broth (TSB;
Becton, Dickinson & Co., Franklin Lakes, N.J. USA). Cells were collected and washed
twice in 8 mL sterile saline (SS; 0.85% NaCl) by centrifugation (10000 g 5 min at 4C) and
resuspended in 8 mL SS to give more than 108 CFU mL-1. Flat bottom wells of sterile
polystyrene 96-well microtiter plates (Costar®, Corning Inc. Tewksbury, MA, USA) were
filled with 100 µL of the modified NBRIP (National Botanical Research Institute’s
Phosphate; (Nautiyal, 1999) medium containing per liter of sterile water: 5 g MgCl2 . 6H2O,
0.25 g MgSO4 . H2O, 0.2 g KCl, 0.1 g (NH4)2SO4, 10 g glucose and 5 g of Quebec PR (150
µm) or hydroxyapatite. Each well was inoculated with 10 µl of inoculum containing 106
CFU. Control wells received 10 µl SS without bacteria. After 5 d of biofilm formation at
28°C, the supernatant was removed and the wells were rinsed twice with 100 µL of SS, air-
dried for 30 min and then 100 µL of a 0.1% solution of CV in water was added. After 15
min of incubation at room temperature, the excess of CV was removed by gently washing
the plates 3 - 4 times with running tap water and then microtiter plates were turned upside
down and dried. Finally, bound CV was solubilized by adding 100 µL of 30% acetic acid in
water and microtiter plates were incubated for 15 min. The absorbance was measured at
550 nm on a Biochrom Asys UVM 340 microplate reader (Biochrom Ltd. Cambridge, UK).
All treatments were replicated nine times.
In this assay, the extent of biofilm formation was determined by applying the following
formula: BF = AB - CW, where BF is the biofilm formation, AB is the optical density
OD550nm of stained attached bacteria and CW is the OD550nm of stained background color
containing bacteria-free medium only (Kadurugamuwa et al., 2003, Naves et al., 2008).
67
3.2.2.2. Exopolysaccharides assay
For biofilm estimation by the exopolysaccharides assay, wells of flat bottom sterile
polystyrene 6-well microtiter plate (Costar ®) containing 8 mL of modified NBRIP
medium were inoculated with 1 mL of the inoculum prepared as described earlier giving for
a final bacteria suspension higher than 107 CFU mL-1. Control wells received 1 mL of SS
without bacteria. The 6-well plates were incubated at 28°C without agitation during 5 d.
Biofilm determination was done by quantifying the amount of exopolysacchrides (EPS) in
the biofilm matrix by using the method of Dubois et al. (1956) modified by Furtner et al.
(2007). Briefly, the supernatant was removed and the wells were rinsed twice with SS, then
4.42 mL of a mixture of 0.23% (v:v) formaldehyde (Sigma-Aldrich) in SS were added. The
plates were agitated at 80 rpm on a rotatory shaker at room temperature and then incubated
for 1 h at 4°C. After incubation, 1.76 mL of a 1 M solution of NaOH was added and the
mixtures were incubated at room temperature for 10 min. Eppendorf ® tube containing 1.5
mL of each sample were centrifuged at 10 000 g at 4°C for 1 min, then 800 μL of the
supernatant were recovered in a glass tube and mixed with 800 μL of a 5% phenol solution
(v:v), then 4 mL of 96.9% (v/v) H2SO4 was rapidly added. The mixture was cooled in ice
for 20 min and OD448nm was determined. All treatments were replicated four times. The
amount of EPS was determined using a standard curve (0 - 0.2 mg L-1) of D-glucose
(Sigma-Aldrich).
3.2.2.3. Fluorescein diacetate assay
Culture conditions were done as previously described in CV assay section. After 5 d of
adhesion, the supernatant was removed and the wells were rinsed with 100 µL of 0.1M
MOPS (3-(N-morpholino)propansulfonic acid) buffer. One Liter MOPS buffer contains
20.9 g MOPS and 5.6 g NaCl, pH 7.00.
Fluorescein diacetate (FDA) was dissolved in acetone at a concentration of 10 mg mL-1 and
this stock solution was stored at -20°C. Starting from the stock solution, a 1:50 FDA
working solution in MOPS buffer was freshly prepared before each assay. MOPS buffer
(100 μL) was added to each rinsed well, followed by the addition of 100 μL FDA working
solution. Plates were incubated in the dark at 37°C and fluorescence was measured after 30
68
min at 490 nm. All treatments were replicated four times. Standard curve was determined
using fluorescein sodium salt in acetone (Peeters et al., 2008).
3.2.2.4. Quebec phosphate rock solubilization under biofilm formation
Cultures were prepared as described previously in 6-wells microtiter plate (Costar®) (see
exopolysaccharides assay section). After 5 d of incubation at 28°C without agitation on
modified NBRIP, an aliquot was removed from each well in order to determine the amount
of soluble P, pH and organic acids produced (Taktek et al., 2015). To measure organic
acids, the remaining supernatant from the bacterial cultures were filtered through 0.2 µm
filter (Millipore) and 10 µL of filtrates were separated on a Waters HPLC system (Pump
Model 996) using a ICSep ICE-ION-300 column (300 x 7.8 mm) with an isocratic solvent
(8.5 mM H2SO4) at a flow of 0.4 mL min-1 (Taktek et al., 2015).
3.2.3. Fluorescent labeling and confocal laser scanning microscopy
The bacterial suspension was prepared as described in CV assay section. Then 10 mL
modified NBRIP medium containing 5 g L-1 of Quebec PR or hydroxyapatite were
inoculated with 106 CFU mL-1 of bacterial suspensions. Cultures were performed on
borosilicate microscope slides (25 × 75 × 1 mm) (Fisher Scientific) placed in Petri dishes at
28°C without shaking. After 5 d, the microscope slides were rinsed with SS to remove non-
adherent bacteria and then stained with FDA vital staining (excitation/emission: 495/517
nm). FDA emits green fluorescence and is used to identify living bacteria with intact
membrane. Working solution of FDA was prepared according to Markiw (1992); briefly,
20 μL of FDA stock solution (5 mg mL-1 dissolved in acetone) were diluted with 4.2 mL of
distilled water before use. Fifty microliters of freshly diluted FDA solution were combined
with adherent bacteria on phosphate particles and then left in dark for 15 min at 4°C.
Microscope slides were examined using a Zeiss confocal laser scanning microscope
(CLSM) and images acquisition were proceeded by using a LSM software ZEN 2011
interface using a 63 × oil immersion objective with 512 × 512 resolution. All images in the
figures are representative of what was observed in at least 5 regions of three independent
experiments. Fluorescence intensity of each image at the green channel was expected to be
directly proportionate to viable bacteria.
69
3.2.4. Scanning electron microscopy
All treatments were replicated three times.
3.2.4.1. Bacterial attachment to abiotic surface
Biofilms of B. anthina Ba8 developed on the surface of phosphate particles, as described
above, were fixed with 2.5% (v:v) glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer pH
7.3 for 24 h at room temperature. They were then washed three times with sodium
cacodylate buffer for 30 min, treated with 1% osmium tetroxide in sodium cacodylate
buffer for 90 min and washed again with sodium cocodylate buffer. The samples were
subsequently dehydrated with a series of ethanol solutions, 50, 70, 95 and 100% (10 min
each), treated twice with 100% ethanol for 40 min and 10 min and then treated twice with
hexamethyldisilazane for 30 min. Samples were air dried, coated with gold and viewed
under a JEOL 6360LV scanning electron microscope (SEM) (Tokyo, Japon) in high
vacuum mode at 25 kV.
3.2.4.2. Bacterial attachment to biotic surface
B. anthina Ba8 bacterial cells attachment to AMF hyphae was performed in two-
compartment plates, which consist of a root-AMF compartment (proximal) and a hyphal
non-root compartment (distal) (St-Arnaud et al., 1995). Initially, Ri DAOM 197198 was
grown on root tumor-inducing plasmid T-DNA-transformed chicory (Cichorium intybus)
roots at 28°C in a minimal growth medium (Taktek et al., 2014). When extensive amount
of extraradical Ri hyphae colonized the distal compartment (after approximately 3 weeks),
a block (3.2 × 8.2 cm) was removed from the hyphal compartment and replaced with 20
mL of liquid medium containing (mg L-1): 80 KNO3, 731 MgSO4 . 7H2O, 65 KCl, 4.8
KH2PO4, 288 Ca(NO3)2 . 4H2O, 8 NaFeEDTA, 0.75 KI, 6 MnCl2 . 4H2O, 2.65 ZnSO4 .
7H2O, 1.5 H2BO3, 0.13 CuSO4 . 5H2O and 0.0024 Na2MoO4 . 2H2O. The influence of
bacterial adherence to Ri hyphae was also tested in presence of phosphate particles by
adding 2500 mg L-1 of Quebec PR (<150 µm) or hydroxyapatite to the liquid minimum
medium. When the Ri hyphae had colonized the liquid compartment (after approximately 3
weeks,), 106 CFU mL-1 of bacterial suspension were added and plates were incubated at
70
28°C for 6 weeks. Hyphae with attached bacteria were isolated, fixed (see Bacterial
attachment to abiotic surface) and observed under a JEOL 6360LV SEM (Tokyo, Japon) in
high vacuum mode at 25 kV.
3.2.5. Statistical analysis
Normality and variance homogeneity were verified for all treatments by using the MIXED
procedure (PROC MIXED) of the SAS 9.2 software. Box-Cox transformations were used
to ensure the normality assumption in a linear regression model for CV and FDA assays, P-
solubilization quantification and also for organic acids produced on NBRIP medium
containing hydroxyapatite.
3.3. Results
3.3.1. Biofilm quantification
Biofilm quantification was performed using various methods. Strains of PSB significantly
(P ≤ 0.05) influenced the importance of the biofilms formed (Table 3.1). As indicated by
the calculated BF values, the CV method suggests that PSB form comparable biofilms in
the presence of Quebec PR or hydroxyapatite. However, according to the EPS method,
which quantify a major component of the biofilm matrix, biofilms formed by PSB in the
presence of Quebec PR were about four times larger than those formed in the presence of
hydroxyapatite (Table 3.1). In addition EPS measurements indicated that in the presence of
both sources of sparingly soluble P the two PSB hyphobacteria R. miluonense Rm3 and B.
anthina Ba8 formed biofilms significantly larger than those formed by the two
rhizobacteria Rahnella sp. Rs11 and B. phenazinium Bph12 (Table 3.1). Both CV and EPS
methods revealed that the hyphobacterium Rm3 was the major biofilm producer, and in
general biofilms formation by PSB are formed according to the following pattern:
Rm3>Ba8>Bph12>Rs11.
The FDA assay quantify in biofilms PSB that are physiologically active, and both in the
presence of Quebec PR and hydroxyapatite, hyphobacterium Ba8 appeared to be the most
active followed by hyphobacterium Rm3.
71
Table 3.1. Evaluation of biofilm formation by PSB in the presence of Quebec PR or
hydroxyapatite using three different methods.
PSB Experimental biofilm assays
Crystal violet (BF) EPS (µg mL-1) FDA (µg mL-1 h-1)
Quebec PR
Hyphobacteria
Rm3 0.65a ±0.21 40.15a ±1.13 0.44c ±0.03
Ba8 0.44bc ±0.13 35.96b ±1.30 1.99a ±0.11
Rhizobacteria
Rs11 0.35c ±0.07 29.20d ±0.79 0.35d ±0.03
Bph12 0.46b ±0.10 33.35c ±1.62 0.63b ±0.03
Hydroxyapatite
Hyphobacteria
Rm3 0.43a ±0.04 11.03a ±0.73 0.51b ±0.05
Ba8 0.35b ±0.03 7.39b ±0.22 0.67a ±0.07
Rhizobacteria
Rs11 0.31c ±0.03 4.31c ±0.24 0.31d ±0.05
Bph12 0.32bc ±0.03 7.27b ±0.08 0.41c ±0.03
BF = AB - CW. BF: biofilm formation; AB: stained attached bacteria; CW: stained control
wells. EPS: exopolysaccharides; FDA: fluorescein diacetate. Values are means ±standard
deviations of three independent assays. Within columns, means followed by the same letter
are not significantly different according to the Fisher’s protected LSD test (P ≤ 0.05).
72
3.3.2. Phosphate solubilization under biofilm formation
Quebec PR and hydroxyapatite solubilization and pH decrease in microtiter plates were
determined after 5 d of incubation under static culture promoting biofilm formation (Fig.
3.1). Our results showed that B. anthina Ba8 (8.3 mg P L-1) mobilized more P from Quebec
PR as compared to B. phenazinium Bph12 (5.8 mg P L-1), R. miluonense Rm3 (4.2 mg P L-
1) and Rahnella sp. Rs11 (3.7 mg P L-1) (Fig. 3.1A). Using NBRIP-hydroxyapatite medium,
the hyphobacterium Ba8 was the best solubilizer (129.4 mg P L-1) followed by Rm3 (94.1
mg P L-1), Bph12 (66 mg P L-1) and finally Rs11 (43.7 mg P L-1) (Fig. 3.1A).
P-solubilization was accompagnied by a significant drop in pH values (Fig. 3.1B) as
compared to the uninoculated treatment (pH 7). The lowest pH value (2.8) was obtained by
the best P-solubilizer B. anthina Ba8, cultured in NBRIP-Quebec PR medium. When
hydroxyapatite was used as sole P source, the pH values ranged between (3.3 and 4.1) (Fig.
3.1B). In the uninoculated treatment no soluble-P and no decrease in the pH were observed.
Results showed the presence of two different organic acids produced by the bacterial
biofilms (gluconic acid and 2-ketogluconic acid) (Table 3.2). Using NBRIP-Quebec PR
medium, B. anthina Ba8, which presented the highest amount of solubilized-P, was the best
producer of D-gluconic acid (1172.4 mg L-1) as compared to Rm3 and Bph12. The 2-
ketogluconic acid was only produced by hyphobacteria (Rm3 and Ba8) (Table 3.2). In
NBRIP-hydroxyapatite medium, R. miluonense Rm3, B. anthina Ba8 and Rahnella sp.
Rs11 produced both D-gluconic acid and 2-ketogluconic acid. Whereas, Bph12 produced
only D-gluconic acid (Table 3.2).
73
Figure 3.1 : P-solubilization by PSB biofilms (A) and pH values (B) after 5 days of
incubation in liquid modified NBRIP containing 5 g L-1 Quebec PR or hydroxyapatite in
microtiter plates. Significant differences (LSD test; P ≤ 0.05) are indicated by different
letters. Bars are standard deviations of the mean (n=12).
74
Table 3.2. Organic acids production by microbial biofilm forming PSB grown in microtiter
plates.
PSB Organic acid (mg L-1)
Gluconic acid 2-Ketogluconic acid
Quebec RP
Rm3 277.8c ±12.3 237.7a ±5.1
Ba8 1172.4a ±26.3 226.08a ±8
Rs11 - -
Bph12 774.5b ±38.8 -
Hydroxyapatite
Rm3 364.1b ±69.1 200b ±2.7
Ba8 110.3c ±8.2 1226.7a ±22.6
Rs11 2041.9a ±200.6 210.4b ±10.1
Bph12 409.4b ±21.9 -
Values are means ±standard deviations of three independent assays. Means followed by the
same letter are not significantly different according to the Fisher’s protected LSD test (P ≤
0.05).
- : not detected
75
3.3.3. CLSM and SEM analysis
Fluorescent vital dye (FDA) was used in conjunction with CLSM to record the vitality
status of cells over phosphate particles. PSB were visualized along z-sections of confocal
images into Quebec PR and hydroxyapatite scaffolds. In Fig. 3.2, micrographs were shown
as apparent two-dimensional (2D) images composed of all z-sections made by ZEN 2011
software. Both Quebec PR and hydroxyapatite particles supported PSB attachment and
growth. B. anthina Ba8 biofilm emitted the highest level of fluorescence as compared to the
others strains (Fig. 3.2). Indeed, this hyphobacteria (Ba8) showed a biofilm comprising
large cell clusters that adhered to the whole surface of Quebec PR or hydroxyapatite. Small
clusters of cells were detected when R. miluonense Rm3 was cultured in NBRIP-Quebec
PR or -hydroxyapatite medium. For rhizobacteria (Rahnella sp. Rs11 and B. phenazinium
Bph12), it was observed that only few small colonies or single cells scattered over
phosphate particles, were already visible after 5 d of incubation (Fig. 3.2).
Since the hyphobacteria B. anthina Ba8 was the best biofilm forming bacteria on phosphate
particles, the importance of Ba8 biofilm was confirmed by using SEM after 5 d of
incubation. Representative SEM images of Ba8 growing in either NBRIP-Quebec PR or -
hydroxyapatite medium were shown in Fig. 3.3. Ba8 showed an extensive microbial growth
and colonization on Quebec PR surface as compared to hydroxyapatite surface. Cells
aggregates were held together and protected by an extracellular matrix of secreted
polymeric compound (EPS). A three-dimensional (3D) structure was then observed over
Quebec PR particles (Fig. 3.3.A). However, bacterial cells and EPS were less visible on
hydroxyapatite surfaces (Fig. 3.3.B) compared to uppermost layers of Quebec PR particles.
SEM micrographs showed that the surface of Quebec PR was regular and smooth while
those of hydroxyapatite was rough and porous.
Hyphobacterium B. anthina Ba8 was not only the best biofilm forming bacteria on
phosphate particles, but also presented an obvious attachment to Ri external mycelium that
was clearly visible when Quebec PR was used (Fig. 3.4). Micrographs showed that EPS
connected bacterial cells and small particles of Quebec PR on the surface of Ri hyphae.
76
Figure 3.2 : Confocal laser scanning micrograph of PSB. Figures show average projections
of CLSM images of two hyphobacteria : Rhizobium miluonense Rm3 and Burkholderia
anthina Ba8 and two rhizobacteria : Rahnella sp. Rs11 and Burkholderia phenazinium
Bph12 through FDA stained biofilms (green fluorescence) on Quebec PR (left panel) or
hydroxyapatite (right panel) after 5 days of incubation. Scale bars (white) correspond to 20
µm, magnification 630×. The confocal images were taken along z-sections into the
scaffolds and shown as 2D pictures composed by ZEN 2011 Software.
77
Figure 3.3 : Scanning electron micrograph of Burkholderia anthina Ba8 bacterial matrix
formed on Quebec PR (A) or hydroxyapatite (B) after 5 days of incubation. White arrows
indicate individual cells scattered on the surface of hydroxyapatite particles.
Figure 3.4 : Scanning electron micrograph of Burkholderia anthina Ba8 bacterial matrix
formed on Rhizophagus irregularis (Ri) hyphae using Quebec PR as sole P source after 6
weeks of dual culture.
78
3.4. Discussion
Biofilms constitute an important life-link in natural communities that can be exploited for
their diverse applications, namely their biological importance on promoting plant growth.
Therefore, the development of new approaches is necessary to respond to current needs in
the field of biofilm research, i.e. the comparison of the abilities of bacterial strains to
develop a biofilm, the determination of biofilm architecture on various surfaces and the
understanding of the regulatory processes governing biological activities of biofilm
forming bacteria. Various methods have been proposed to characterize and assess biofilm
in medical, industrial and environmental settings.
There is a general agreement that biofilm formation is merely defined as sticky bacterial
cells attached to surfaces whatever their structure or microbial compositions (Professor
Yves Brun, Dept of biology, Indiana university; personal communication). However, there
is no method allowing the crucial assessment of biofilm forming beneficial bacteria that
colonize the mycorrhizosphere and have a profound influence on plant growth and
productivity. In this context, we introduce a novel approach based on P-solubilization
combined with biofilm formation and AMF hyphae adherence by using biofilm forming
PSB.
Different ways based on colorimetric assay have been tested to estimate the importance of
biofilms formed in microtiter plates. They included biofilm assay (CV staining), matrix
quantification assay (EPS assay) and viability assay (FDA assay). CV staining and EPS
assay showed that Quebec PR would favour the attachment of PSB mainly R. miluonense
(Rm3) strain on its surfaces. Nevertheless, the main drawback of these two methods is the
fact that dead and inactive biomass can also be measured and they don’t properly reflect
viability (Peeters et al., 2008, Pan et al., 2010, Skogman et al., 2012). Viable cells can be
however quantified by the hydrolysis of fluorescein diacetate (FDA) designed to account
for only metabolically active cells (Borucki et al., 2003, Peeters et al., 2008). FDA
measurements, in contrast to CV and EPS assays, showed a maximum viability with
hyphospheric PSB (mainly B. anthina Ba8) growing in NBRIP-Quebec PR medium.
Consequently, one can postulate that unlike B. anthina Ba8, a part of the biomass
accumulated in R. miluonense Rm3 biofilm had a low metabolic activity.
79
All PSB were able to solubilize inorganic phosphates, to reduce pH and to release organic
acids. High level of solubilized-P was obtained with B. anthina Ba8 compared to the other
strains. Accordingly, P-solubilizing ability of biofilms was strongly correlated with cells
viability. Then, the low amounts of solubilized-P obtained with R. miluonense Rm3, B.
phenazinium Bph12 and Rahnella sp. Rs11 can be related to the presence of a high
concentration of dead or inactive cells and exopolymers, which are counted as microbial
biomass by non-vital assays. One can say that FDA assay offers a better alternative to
select the best biofilm with high P-solubilizing ability.
Previous report showed that organic acids play an important role in biofilm formation and
EPS production (Wagh et al., 2014). P-solubilizing biofilms produced organic acids mainly
gluconic acid, one of the principal acid produced by PSB (Rodriguez et al., 2004, de Werra
et al., 2009). Organic acids are responsible for releasing soluble P (Kpomblekou &
Tabatabai, 1994) required for bacterial growth and consequently biofilm and EPS
production (Mendrygal & González, 2000, Rinaudi et al., 2006, Fang et al., 2008, Wielbo
& Skorupska, 2008). Conversely, it has been reported that some rhizobacteria are able to
develop physiological mechanisms for coping with P-starvation due to low concentration of
free P in soils (Danhorn et al., 2004, Krol & Becker, 2004). Hence, it can be concluded that
PSB regulated organic acids production and P-solubilization to maintain and develop
biofilm.
CLSM technique is useful for the identification and the observation of viable biofilms.
Expectedly, strains isolated from Ri hyphosphere exhibited a high degree of fluorescence
emission, indicating the formation of the most viable biofilm. Resolution obtained by using
CLSM is well explained when comparing it with another scanning method as SEM that
gives detailed 3-D imaging. SEM observations of B. anthina Ba8 on Quebec PR surfaces
depicted the development of compact and relatively smooth structures contrary to what
occur on hydroxyapatite particles (Fig. 3.3). This could be explained by the fact that
hydroxyapatite surface might not promote biofilm development and/or lead to the
formation of exopolymeric matrix that is not enough copious or complex to resist fixation
and drying. On the basis of our observations, strong biofilm attachment on PR would have
a great impact on P-solubilization in soils. This result is in good agreement with previous
study showing that phosphate dissolution on the surface of waste rocks treated with PR was
80
intimately linked to the presence of microbial biofilms (Ueshima et al., 2004). Cells
remained attached to the rock surface through the bacterial exopolymers, which were an
integral part of the biofilms. Authors suggested that biofilms would act as a physical and
chemical barrier to limit the extend of pyrite oxidation in order to attenuate acid mine
drainage (Ueshima et al., 2004). Otherwise, biofilms can play a highly active role in the
biogeochemical cycling of phosphates by promoting the precipitation of iron phosphate
(Konhauser et al., 1994).
In soil, PSB that strongly adhere to PR surfaces can interact synergistically with other
microorganisms namely fungi. A review on interactions of bacteria with both saprophytic
and mycorrhizal fungi (UI Haq et al., 2014), illustrated that soil bacteria can adhere to
fungal cells, stimulate fungal exudates production and also form a biofilm along the fungal
hyphae. The obtained fungal-bacterial biofilms can be used for potential applications in
diverse fields (Seneviratne et al., 2008). For example, it was used as an alternative to
mobilize poorly soluble PR in order to enhance P availability and soil fertility
(Jayasinghearachchi & Seneviratne, 2006). In the current study, we demonstrate for the first
time, that B. anthina Ba8 grow well and colonize actively the surface of Ri fungal hyphae
only in the presence of Quebec PR. When Quebec PR was substituted by hydroxyapatite, B.
anthina Ba8 adherence to Ri hyphae was unsuccessful and bacterial cells were scattered.
The correlation between the presence of Quebec PR in the culture medium and the capacity
of B. anthina Ba8 to colonize Ri hyphae and to solubilize P (Taktek et al., 2014) was
striking. Quebec PR particles may be involved in the active attachment of bacteria, coupled
or not to biochemical and molecular pathways and enhanced by hyphae exudations. This
observation can be considered as an asset for sustainable technology, given that PSB could
rapidly colonize the hyphosphere of Ri, mobilize efficiently P from natural PR and
therefore promote plant growth. In line with these results, Haq et al., (2014) reviewed that
Burkholderia genus was the most abundant colonizers of fungi in soil. Burkholderia terrae,
a migration-proficient bacteria, was able to develop a biofilm on the hyphae of non-
mycorrhizal fungus Lyophyllum sp. strain Karsten leading to bacterial translocation and
growth in novel microhabitats in soil (Warmink & van Elsas, 2009, Warmink et al., 2011).
Authors suggested that the migration helper effect of B. terrae in conjunction with fungi
exert key facilitating roles for others beneficial bacteria in soil. Furthermore, bacterial
81
colonization of arbuscular mycorrhizal hyphae (Toljander et al., 2006, Scheublin et al.,
2010) and biofilm formation on ectomycorrhizal hyphae have been also described
(Nurmiaho-Lassila et al., 1997, Sarand et al., 1998). Pseudomonas isolates, belonging to
the proteobacteria phylum as Burkholderia, showed a greater attachement to hyphae than
other bacterial strains. Recently, Frey-Klett et al. (2007) demonstrated that the survival of
Pseudomonas fluorescens is significantly enhanced by the presence of the ectomycorrhizal
strain Laccaria bicolor, from which the bacterium was isolated. They observed that P.
fluorescens adheres to the hyphae of different ectomycorrhizal fungi and develop biofilm-
like structures in L. bicolor hyphae in vitro. The common feature between this last report
and the present one is the fact that bacterial strains develop a biofilm on the hyphae of
specific mycorrhizal fungi from which they were initially isolated. Accordingly, bacterial-
fungal biofilms was developed to allow better growth and colonization abilities than their
single cultures.
In conclusion, our study expands the limit of traditional quantification of biofilms by
allowing simultaneous evaluation of viable cells, P-solubilizing activity and biofilm
distribution. We demontrated that B. anthina Ba8 isolated from the hyphosphere of Ri
(Taktek et al., 2014), can strongly adhere to abiotic and biotic surfaces. To our knowledge,
this is the first report describing the visualization of metabolically active bacterial cells on
AMF hyphae in presence of Quebec PR. B. anthina - Ri interactions offer greater protection
to the biofilms’ constituants and is important for metabolic cooperation. This phenomenon,
provides a foundation for more detailed studies concerning mycorrhizosphere-associated
bacteria able to solubilize P. Further studies are needed to substantiate the importance of
these interactions on promoting in vivo plant growth.
Acknowledgements
The authors are indebted to the FQRNT (Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et
les Technologies) for the financial support. We would like to thank Jean Martin for soil
analysis, Martin Trépanier for HPLC assistance and Richard Janvier for scanning electron
microscopy assistance.
82
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87
Chapitre 4 :
Phosphate de roche et bioinoculants pour une agriculture
durable
88
Résumé
Dans ce chapitre, l’impact de l’utilisation directe d’un phosphate de roche (PR) du Québec
sur la culture en serre du maïs fourrager (Zea mays L.) en présence de bactéries solubilisant
les phosphates (BSP) agissant en synergie avec le champignon mycorhizien à arbuscules
(CMA) Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198 a été comparée à celle du
superphosphate triple (SP) dans le but de réduire l’apport en fertilisants chimiques. À l’issu
de ce travail, des résultats stimulants ont été obtenus montrant que la combinaison du PR
du Québec, des BSP et des CMA a permis d’avoir des rendements en matière fraiche et
sèche comparables à ceux obtenus avec le SP. Aussi, en présence des BSP et des CMA, on
a pu réduire de 75 % l’utilisation de SP tout en préservant les rendements de croissance et
d’absorption des nutriments chez le maïs. Ce processus compense non seulement le coût
élevé de la fabrication industrielle des engrais, mais mobilise également les fertilisants
ajoutés au sol.
89
4.1. Introduction
Le phosphore (P) est un élément essentiel pour la croissance et le développement des
plantes (Rodríguez and Fraga 1999). Toutefois, une énorme partie du P soluble appliqué
sous forme d’engrais chimique réagit rapidement avec les cations pour former des
phosphates insolubles non disponibles aux plantes engendrant ainsi une perte économique
et un problème environnemental potentiel (Khan et al. 2007).
L’application directe des PR est considérée comme une alternative en agriculture durable
(Rajan et al. 1996; Vassilev et al. 2001; Reddy et al. 2002). Par ailleurs, en raison de leur
faible efficacité agronomique (Bolland and Gilkes 1997), les PR doivent être combinés à
des microorganismes bénéfiques du sol capables de mobiliser le P à partir du phosphate
naturel. Cette flore tellurique, généralement influencée par la nature de la mycorhizosphère
et des exsudats fongiques (Toljander et al. 2007), interagit avec les champignons
mycorhiziens à arbuscules (CMA) (Johansson et al. 2004), eux même impliqués dans la
translocation du P soluble aux plantes (Smith and Read 1997) et ce grâce à un réseau
mycélien très développé.
Malgré toutes les recherches et les travaux antérieurs (Chabot et al. 1996; Rodríguez and R.
Fraga 1999; Reyes et al. 2002; Magallon Servin 2014), très peu d’inoculants à base de
microorganismes solubilisant les phosphates sont commercialisés comparativement à ceux
à base de CMA notamment la souche Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198
(anciennement Glomus irregulare) (Tiwari et al. 2004). Ceci pourrait être expliqué, en
partie, par la mauvaise compréhension de toutes les interactions qui ont lieu dans la
mycorhizosphère, notamment entre les BSP et les CMA (Chapitres 2 et 3).
Les effets bénéfiques des CMA sur la croissance, la nutrition et l’état sanitaire des plantes
sont bien connus (Fortin et al. 2008; Garbaye 2013). Le but de ce travail était donc de
vérifier si les synergismes observés entre les BSP et la mycorhize Ri (Chapitres 2 et 3)
pouvaient être mis en valeur pour : a) diminuer la précipitation des engrais chimiques
solubles; b) augmenter la réactivité d’un PR ignée du Québec.
90
4.2. Matériel et méthodes
4.2.1. Caractérisation des phénotypes PGPR des BSP
Dans cette section les phénotypes observés in vitro chez les BSP, souvent associés à l’effet
bénéfique des bactéries sur la croissance des plantes (effet PGPR, de l’anglais plant growth
promoting rhizobacteria), ont été déterminés.
4.2.1.1. Production de l’acide indole acétique
La production de l'acide indole acétique (AIA) ou des molécules apparentées a été effectuée
en utilisant la méthode de Salkowski (Gravel et al. 2007). Des suspensions bactériennes
(106 UFC mL-1) ont été inoculées sur le milieu LB (Luria-Bertani) contenant 5 mM L-
tryptophan et incubées pendant 5 jours sous agitation (200 rpm) à 28°C. La détermination
de la concentration de l’AIA a été réalisée par l’addition de 100 µL de la solution de
Salkowski (150 mL H3PO4, 250 mL eau distillée et 7,5 mL d’une solution de FeCl3. 6 H2O
à 0,5 M) (Gordon and Weber 1951) à 100 µl du surnageant de culture préalablement
centrifugé pendant 20 min à 10000 g. Après une incubation de 20 min à température
ambiante, la densité optique a été mesurée à 535 nm. La courbe standard a été réalisée à
partir des dilutions en série d’une solution d’AIA 50 µg mL-1 (Sigma-Aldrich, Oakville,
Ontario, Canada) dans le milieu LB.
4.2.1.2. Détermination de l’élongation racinaire du maïs
Les inocula bactériens ont été produits sur le milieu TSB 10% et les cellules ont été lavées
et suspendues dans une solution saline stérile pour une concentration de 106 UFC mL-1. Des
graines de maïs (Zea mays L. cv Seneca) ont été désinfectées en surface par trempage dans
l’éthanol (70 %) pendant 1 min et puis dans une solution d’hypochlorite de sodium (0,5 %)
pendant 20 min suivi par trois rinçages dans une solution saline stérile. Par la suite, les
graines ont été trempées dans les suspensions bactériennes ou dans une solution saline
stérile (témoin non inoculé) pendant 90 min. Les graines sont ensuite placées dans des plats
de Pétri (10 graines par plat) sur un papier filtre imbibé avec 2 mL de saline stérile. Après 6
jours d’incubation à l’obscurité à 21°C, le pourcentage de germination ainsi que
l’élongation racinaire ont été déterminés.
91
4.2.1.3. Tests de motilité
Des tests de motilités par les flagelles et les pilus de type IV ont été réalisés sur le milieu
TSB 50% contenant 0,3% et 1% d’agar, respectivement. Dans le cas de la motilité
flagellaire, un aliquote (1 µL) d’une culture fraîche des souches a été inoculé sur la gélose
et après 10 h d’incubation à 28°C, le diamètre de la zone d’essaimage (swarming) a été
mesuré (De Kievit et al. 2001).
Pour la motilité due aux pilus de type IV, l’inoculation des bactéries s’est faite au fond de la
gélose. Après 48 h de culture, les zones de glissement sur la surface (twitching) ont été
mesurées (De Kievit et al. 2001). Tous les tests ont été réalisés 3 fois.
4.2.1.4. Tests d’antagonisme
Les tests d’antagonisme ont été réalisés avec 3 champignons pathogènes : Botrytis cinerea
Pers., Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (FORL) Jarvis & Shoemaker (strain
304), et Rhizoctonia solani (strain 171) et un heterokonta Pythium ultimum (strain 447)
obtenus du laboratoire de diagnostic en phytoprotection (MAPAQ, Québec, Canada).
Des disques de gélose (5 mm de diamètre) contenant les cultures fongiques actives ont été
placés à la périphérie des plats de Pétri contenant le milieu gélosé PDA (Potato dextrose
agar). Après 48 h d’incubation à 21°C, les plats de culture ont été inoculés à l’aide d’une
aiguille au centre de la gélose avec des BSP provenant d’une culture fraîche sur le milieu
TSA 10%. Les plats de Pétri ont été incubés à 21°C jusqu’à ce que le champignon incubé
en absence des BSP (plat de Pétri témoin) couvre la surface de la boite par la suite les
diamètres de la zone d’inhibition fongique autour des colonies de BPS ont été mesurés.
4.2.1.5. Test de production de l’acide cyanhydrique (HCN)
La capacité des souches sélectionnées à produire l’acide cyanhydrique (composé toxique
pour les plantes) a été vérifiée. Ainsi, chaque isolat a été inoculé sur une boîte de Pétri
contenant un milieu de culture composé en (g L-1) de : 3 TSB, 4,4 glycine, 15 agar.
Un papier filtre de 9 cm de diamètre imprégné d’une solution (de couleur orange) contenant
0,5% d’acide picrique et 2% de carbonate de sodium a été déposé sur le couvercle de
92
chaque boite de Pétri. La production du HCN (composé volatile) fait virer la couleur du
papier filtre au rouge (Lorck 1948).
4.2.1.6. Test de production des chitinases
Pour doser la production de chitinases par les souches sélectionnées, une suspension de
chitine colloïdale a été préparée comme suit : 40 g de chitine ont été dissous, sous agitation
pendant 30-50 min, dans 400 mL de HCl 6 M (Hsu and Lockwood 1975). La chitine a été
précipitée sous forme d'une suspension colloïdale en la diluant lentement avec 2 L d'eau
déminéralisée à 5-10°C. La suspension colloïdale a été ensuite filtrée et lavée jusqu'à ce que
le pH de la suspension soit d'environ 3,5. La chitine séchée (4 g) a été ajoutée comme seule
source de carbone au milieu gélosé NBRIP sans glucose (Chapitre 2). Le pH du milieu a été
ajusté à 7,8 avant autoclavage pendant 20 min à 121°C. Seules les souches qui produisent la
chitinase ont été capables de se développer sur ce milieu.
4.2.1.7. Analyse statistique
L’analyse de la variance (ANOVA) a été réalisée à l’aide du modèle général (PROC GLM)
développé dans SAS 9.2. Les moyennes ont été comparées à l’aide du test de la plus petite
différence significative (LSD) à P ≤ 0,05. La normalité et l’homogénéité de la variance ont
été vérifiées par l’analyse graphique des résidus.
4.2.2. Essai en serre
4.2.2.1. Substrat utilisé
Un sol de jardin d’une parcelle en jachère a été récolté sur le campus de l’Université Laval
(Québec, Canada) et utilisé dans cette expérience. Le pH du sol a été ajusté à 6,8 avec de
l’hydroxyde de calcium (Ca(OH)2), puis mélangé avec 15% en volume de perlite et
pasteurisé (60°C, 30 min). Les sols ont été extraits selon la procédure Mehlich-3 (1984). La
concentration du P a été déterminée par la méthode vanado-molybdate (Tandon et al. 1968)
et l’Al et les autres éléments disponibles (Mg, Ca, Zn, Mn, Cu et Fe) ont été quantifié par
spectrométrie d’absorption atomique et le K par émission (Perkin-Elmer, model 3300,
Waltham, Ma). Le pH du sol a été mesuré dans l’eau (1:1 v:v) et dans une solution tampon.
93
4.2.2.2. Dispositif expérimental
De façon aléatoire, un total de 120 unités expérimentales ont été réparties en 6 blocs
complets, incluant 3 traitements bactériens (les hyphobactéries R. miluonense Rm3 et B.
anthina Ba8, et la rhizobactérie B. phenazinium Bph12) et un témoin sans bactéries et 5
doses de fertilisants (0X, 0,25X SP, 1X SP, 1X PR du Québec et 4X PR du Québec, X étant
la dose recommandée (100 Kg de P2O5 ha-1) par le guide de fertilisation du Québec
(CRAAQ 2003) selon l’analyse du sol (Tableau 4.3). Chaque fertilisant a été bien
homogénéisé avec le substrat et la dose fertilisante 1X était de 0,35 et 0,26 g pot-1 pour le
PR du Québec et le SP, respectivement. Notons que le SP (triple superphosphate) 0-46-0
est un fertilisant chimique riche en P (46 % d’acide phosphorique assimilable P2O5) utilisé
aux fins de comparaison avec le PR du Québec d’origine ignée peu réactif (voir sa
composition chimique Tableau 2.1, Chapitre 2).
Pour tous les traitements, le sol a été homogénéisé avec une poudre PS3 contenant les
spores du CMA Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198 à raison de 800 spores par L
de substrat.
Des semences (120 graines par traitement) de maïs (Zea mays L. cv FOCUS) ont été
stérilisées en surface et mises en contact (sous agitation, 100 rpm) pendant 60 min avec une
solution contenant 4 mL d’une suspension bactérienne (108 UFC mL-1) et 40 mL d’une
solution de 1% de carboxy-méthylcellulose (CMC, Sigma-Aldrich). Les graines des
témoins ont subi le même traitement sans bactérie.
Après inoculation, trois graines ont été plantées dans des pots Kord STD de 17,8 cm de
diamètre contenant le mélange sol-perlite et recouvertes avec environ 2 cm de sol. Deux
semaines après les semis, les pots sont éclaircis pour garder un plant d’apparence uniforme
par pot.
Une deuxième inoculation a été effectuée 1 mois après les semis. Les inocula bactériens ont
été produits sur le milieu TSB 10% et les cellules ont été lavées et suspendues dans une
solution saline stérilisée. Chaque plant avait reçu 108 UFC mL-1 de la suspension
bactérienne appropriée, et une solution saline stérile a été additionnée aux plants témoins.
Les plants ont été cultivés en serre pendant deux mois à une température de 25°C le jour et
20°C la nuit, sous une photopériode de 16 h. Chaque plant avait reçu hebdomadairement
200 mL d’une solution fertilisante (14-0-14) à 200 ppm d’azote (Plant Prod).
94
4.2.2.3. Paramètres mesurés
À la récolte (2 mois après les semis), les masses fraîches et sèches des parties aériennes ont
été mesurées. Par la suite, les parties aériennes préalablement séchées à 65°C ont été
broyées (0,45 mm) et digérées selon la méthode micro-Kjeldahl et l’azote total a été
déterminé par colorimétrie (Nkonge and Ballance 1982). Le matériel végétal (0,5 g) a été
calciné à 505°C durant 16 h et les cendres ont été dissouts dans un mélange contenant 15
mL HClO4 et 5 mL HNO3 tel que décrit par Jones et Case (1990). Les autres éléments (Ca,
Na, Mg, Fe, Cu, Mn et Zn) ont été quantifiés par spectrométrie d’absorption atomique
(Perkin-Elmer, modèle 3300, Allemagne), le K par émission dans la flamme et le P par
colorimétrie (Murphy and Riley 1962).
Les racines du maïs ont été colorées et le pourcentage de mycorhization a été par la suite
déterminé (Vierheilig et al. 1998; Giovannetti and Mosse 1980).
Afin de s’assurer de la présence des BSP, des échantillons de sol ont été prélevés de la
mycorhizosphère à partir de chaque pot et des dilutions-suspensions ont été réalisées. Le
milieu sélectif NBRIP contenant 2,5 g L-1 hydroxyapatite et 50 µg mL-1 cycloheximide à
pH 7 a été utilisé pour évaluer la proportion des BSP. Pour chaque traitement bactérien, des
colonies représentatives (environ 10) ont été isolées et soumises à l’amplification des gènes
qui codent pour l’ADNr 16S et au séquençage tel que décrit au chapitre 2, afin de confirmer
l’identité des BSP.
4.2.2.4. Analyse statistique
L’effet de l’inoculation avec les BSP et de la fertilisation phosphatée (SP ou PR du
Québec) sur les différentes variables mesurées ont été étudiés. Pour analyser les masses
fraîches et sèches des parties aériennes et les pourcentages de mycorhization), la procédure
PROC MIXED dans SAS 9.2 a été utilisée afin d’ajuster le modèle à tous les paramètres
mesurés. Des transformations Box-Cox ont été effectuées au besoin afin de normaliser la
distribution des résidus. L’homogénéité de la variance a été vérifiée par l’analyse graphique
des résidus.
Des transformations log10 ont été appliquées sur les valeurs des concentrations des dix
éléments dosés, ainsi que sur le prélèvement total des éléments, afin de normaliser la
distribution des résidus puis une analyse factorielle a été réalisée.
95
4.3. Résultats
4.3.1. Caractérisation PGPR des BSP
Parmi les quatre souches étudiées au chapitre 3, les deux hyphobactéries R. miluonense
Rm3 et B. anthina Ba8 et la rhizobactérie B. phenazinium Bph12 ont été utilisées afin
d’évaluer leur aptitude à produire des caractéristiques PGPR in vitro, leur motilité via les
flagelles et les pili IV (Annexe 4.1) et aussi leur capacité à inhiber 4 champignons
pathogènes.
Tableau 4.1 : Quelques caractéristiques bénéfiques aux plantes chez les BSP.
BSP AIA
(ug mg-1 de protéines) Élongation racinaire
(cm)
Motilité
(mm)
Pili IV Flagelle
Témoin - 8,8c - -
BSP fortement attachées à l’hyphosphère
Rm3 51,8a 11,6a 4,3c 9,7b
Ba8 25,6c 9,9b 7,3a 12,7a
BSP isolées à partir de la rhizosphère
Bph12 30,2b 9,6c 5bc 4c
Dans chaque colonne, les moyennes suivies d’une lettre différente sont significativement
différentes selon un test de LSD (P ≤ 0,05).
Nos BSP sélectionnées sont capables de produire des phytohormones à savoir l’auxine et
les substances apparentées. En effet, la souche R. miluonense Rm3 est la meilleure
productrice d’AIA suivie par B. phenazinium Bph12 et B. anthina Ba8 (Tableau 4.1).
L’inoculation des graines de maïs par les BSP a un effet stimulant sur la germination. En
effet, après 1-2 jours d’incubation, la germination des graines inoculées par les BSP est plus
rapide que celle des graines non inoculées. Tous les traitements atteignent 100 % de
germination après 6 jours d’incubation. R. miluonense Rm3, la meilleure productrice d’AIA
in vitro, a augmenté de 32% l’élongation racinaire en comparaison au témoin non inoculé
suivie par B. anthina Ba8 et B. phenazinium Bph12 qui ont montré des stimulations variant
de 9,1 à 12,5%.
96
La souche B. anthina Ba8 est la plus motile comparée aux deux autres. B. phenazinium
Bph12 est considérée comme étant la bactérie la moins motile avec une zone de motilité par
les pili IV et les flagelles de 4 et 5 mm, respectivement.
En ce qui est de la capacité des bactéries à inhiber certains champignons phytopathogènes
(Tableau 4.2), nos résultats montrent que toutes les souches utilisées sont capables
d’inhiber Pythium ultimum. Par contre, seule B. phenazinium Bph12 est capable d’inhiber
les 4 champignons testés avec des zones d’inhibition variant de 21,67 à 34,67 mm.
Tableau 4.2 : Effet antifongique des BSP vis-à-vis de quelques champignons pathogènes.
BSP Zone d’inhibition (mm)
Botrytis
cineriae
Fusarium oxysporum Pythium ultimum Rhizoctonia
solani
Rm3 - - 15,00c±0,00 -
Ba8 - - 18,67b ±1,15 -
Bph12 34,67a ±0,58 33,67a ±3,21 21,67a ±1,53 33,33a ±2,08
Dans chaque colonne, les moyennes suivies d’une lettre différente sont significativement
différentes selon un test de LSD (P ≤ 0,05).
Toutes les BSP ne produisent pas d’acide cyanhydrique et sont capables de croître sur le
milieu culture contenant la chitine comme seule source de carbone.
4.3.2. Essai en serre
L’essai en serre a été réalisé en utilisant un sol de jardin pasteurisé, un substrat qui permet
un bon établissement de la colonisation racinaire des plants de maïs fourrager (Zea mays
cv. FOCUS). Ce loam acide, est considéré comme étant un sol ayant une fertilité
extrêmement faible en P et un indice de saturation en P (ISP = (P/Al) M-III) de 0,71%
(Tableau 4.3).
97
Tableau 4.3 : Caractéristiques du sol de jardin utilisé.
pH pHtampon M.O
(%)
P K Ca Mg Fe Cu Mn Zn Al
mg kg-1
5,35 6,24 4,3 9,5 133 687 66 215,1 4,8 48,5 4,3 1334
L’analyse de la variance présentée dans le tableau (Tableau 4.4) montre qu’il y a un effet
significatif de la nature et de la dose du fertilisant utilisé sur la matière fraîche, sèche et sur
la mycorhization du maïs (P ≤ 0,01). L’inoculation bactérienne affecte aussi
significativement les 3 paramètres mesurés (P ≤ 0,01). L’interaction fertilisant * inoculation
bactérienne a un effet significatif sur la matière fraîche et sèche (P ≤ 0,01) c’est à dire, les
BSP affectent ces deux variables différemment, selon le traitement de fertilisation appliqué.
Tableau 4.4 : Analyse de la variance de la matière fraîche et sèche (g plant-1) et du
pourcentage de mycorhization (%) des plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS)
fertilisés par le PR du Québec ou le SP et coinoculés avec les BSP et Ri.
Effet Variable dl Carrés moyens F
Fertilisant Matière fraîche 4 989,13** 7,05**
Matière sèche 4 130,63** 12,39**
Mycorhization 4 753,70** 6,15**
Inoculation bactérienne Matière fraîche 3 2917,30** 32,50**
Matière sèche 3 137,20** 11,83**
Mycorhization 3 2742,55** 22,87**
Fertilisant * Inoculation
bactérienne
Matière fraîche 12 245,22** 3,26**
Matière sèche 12 33,49* 3,07*
Mycorhization 12 116,95NS 3,55NS
Erreur 90
* ** différences significatives à P ≤ 0,05 et P ≤ 0,01, respectivement. NS : non significatif et
dl : degré de liberté.
Comme attendu, l’ajout de n’importe quelle dose fertilisante de SP ou 1X PR augmente
significativement (P ≤ 0,05) le rendement en matière fraîche et sèche (jusqu’à 30 %) par
rapport au témoin non inoculé et non fertilisé. Les inocula de BSP augmentent tous les
paramètres étudiés comparativement aux témoins non inoculés (Tableau 4.5). En effet, en
98
présence des BSP, les rendements en matière fraîche et sèche obtenus au niveau des
traitements fertilisés avec 0,25X SP ou 1X PR sont égaux ou meilleurs que ceux obtenus
avec les traitements non inoculés en présence de la dose recommandée en SP. L’inoculation
avec l’hyphobactérie Ba8 en présence de 1X PR augmente significativement (P ≤ 0,05) la
matière fraîche (133,9 g plant-1) et sèche (27,6 g plant-1) du maïs par rapport au traitement
non inoculé ayant reçu la dose recommandée en SP (110,8 et 22,7 g plant-1 pour la masse
fraîche et sèche, respectivement (Tableau 4.5).
Toutes les souches utilisées R. miluonense Rm3, B. anthina Ba8 et B. phenazinium Bph12
augmentent considérablement les pourcentages de colonisation racinaire par le CMA par
rapport aux témoins non inoculés avec les bactéries. On a constaté qu’avec tous les
traitements de fertilisation, l’hyphobactérie Ba8 augmente significativement le pourcentage
de mycorhization (50,7 %). Généralement, les pourcentages de mycorhizations en présence
du PR du Québec sont plus élevés comparés à ceux obtenus en présence du SP (43,5 % vs
33,6 %, respectivement). En effet, les meilleurs taux de colonisation racinaire sont obtenus
en inoculant les plants de maïs avec la souche Ba8 en présence de 1X PR (58,2 %).
99
Tableau 4.5 : Effet de l’inoculation avec les BSP et des différents traitements de
fertilisation avec le superphosphate (SP) ou le phosphate de roche du Québec (PR), sur la
masse fraîche et sèche des parties aériennes et le pourcentage de mycorhization des plants
de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS) mycorhizés avec le Ri.
Traitements Masse fraîche
(g plant-1)
Masse sèche
(g plant-1)
Mycorhization
(%) Fertilisant Inoculum
0X Témoin 85,7 17,9 27,8
Ba8 124,6 25,3 52,6
Rm3 111,0 20,5 38,6
Bph12 118,3 24,8 36,3
0,25XSP Témoin 111,1 22,9 25,8
Ba8 124,2 23,5 46,1
Rm3 125,8 26,5 38,3
Bph12 127,0 26,9 33,2
1XSP Témoin 110,8 22,7 23,3
Ba8 136,3 29,8 38,9
Rm3 131,3 28,0 37,4
Bph12 133,1 30,7 25,4
1XPR Témoin 111,2 23,2 22,2
Ba8 133,9 27,6 58,2
Rm3 114,0 24,3 39,1
Bph12 109,7 19,5 44,8
4XPR Témoin 103,4 18,3 31,9
Ba8 123,7 23,6 57,6
Rm3 116,1 22,9 47,3
Bph12 114,1 22,6 46,7
LSD0,05 7,71 2,05 6,81
LSD0,01 10,21 2,71 9,02
X étant la dose recommandée (100 Kg de P2O5 ha-1) par le guide de fertilisation du Québec
(CRAAQ 2003) selon l’analyse du sol.
Afin de simplifier l’analyse statistique de la teneur en éléments chimiques absorbés au
niveau des parties aériennes et de réduire une dizaine d’analyses en une seule, on avait
recours à une analyse factorielle qui permet de mettre en évidence la structure latente d’une
masse de données. Cette analyse a permis d’intercorréler des variables entre elles en
présence de plusieurs facteurs.
100
Une analyse rotatoire orthogonale de type Varimax a été réalisée sur les différents éléments
chimiques absorbés afin de mettre en évidence une structure simple des facteurs. Après
rotation, la matrice des poids factoriels est plus simple à analyser (Tableau 4.6). En effet, le
facteur 1 obtient des pondérations importantes uniquement sur les variables (Mg, Ca, Mn et
Fe)absorbés alors que le facteur 2 est défini par les variables (N, P, K, Zn, Cu et Na)absorbés.
Tableau 4.6 : Structure de la matrice obtenue à la suite de l’analyse factorielle des dix
éléments chimiques absorbés au niveau des parties aériennes des plants de maïs fourrager.
Éléments
chimiques
absorbés
Facteur 1 Facteur 2
Coefficients
Mg 0,92676 0,13373
Ca 0,92230 0,12636
Mn 0,85632 0,18104
Fe 0,78107 0,37110
N 0,23002 0,89593
Zn -0,20968 0,84406
Cu 0,24106 0,79979
K 0,36042 0,77733
P 0,38187 0,68062
Na 0,21595 0,28283
L’analyse de la variance réalisée sur les facteurs 1 et 2 (Tableau 4.7) montre que la nature
et la quantité du fertilisant utilisé ainsi que l’ajout d’un inoculum bactérien ont un effet
significatif (P ≤ 0,01) sur les facteurs 1 et 2 et par conséquent sur la teneur de tous les
éléments chimiques absorbés au niveau des parties aériennes. Ainsi, l’interaction double
fertilisant * inoculation bactérienne a un effet significatif sur ces deux facteurs (P ≤ 0,01 et
P ≤ 0,05, pour le facteur 1 et 2, respectivement). Ceci implique que les BSP influencent
significativement l’absorption des 10 éléments minéraux par les parties aériennes
dépendamment du traitement de fertilisation appliqué.
101
Tableau 4.7 : Analyse de la variance des deux facteurs représentant les dix éléments
chimiques absorbés par les plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS) fertilisés par le
PR du Québec ou le SP et inoculés avec les BSP et Ri.
Effet Variable df F value
Fertilisant Facteur 1 4 30,95**
Facteur 2 4 12,83**
Inoculation bactérienne Facteur 1 3 4,97**
Facteur 2 3 10,40**
Fertilisant * Inoculation bactérienne Facteur1 12 4,01**
Facteur 2 12 2,10*
Erreur 90
* ** différences significatives à P ≤ 0,05 et P ≤ 0,01, respectivement. NS : non significatif et
dl : degré de liberté.
Le tableau 4.7 présente l’effet des différents traitements sur l’absorption des éléments
minéraux par les parties aériennes des plants de maïs. Généralement, l’inoculation
bactérienne augmente significativement l’assimilation de l’azote par les plants de maïs. En
présence de n’importe quelle proportion de SP ou de PR, l’hyphobactérie Ba8 stimule le
plus l’assimilation de l’azote par la tige et les feuilles du maïs (jusqu’à 316,4 mg plant-1 en
présence de 1X PR). La fertilisation des plants avec 1X PR a permis d’avoir les meilleures
teneurs en Nabsorbé comparés à tous les autres traitements de fertilisation.
La nature du fertilisant a une influence importante sur les teneurs totales de la plante en P.
En effet, il apparait que la dose 0,25X SP est la dose optimale permettant d’avoir des
rendements en Pabsorbé meilleurs que ceux obtenus au niveau des autres traitements. Toutes
les BSP utilisées dans cet essai stimulent significativement (P ≤ 0,05) l’absorption du P par
les plants de maïs. Ba8 est la meilleure souche permettant en présence de 0,25X SP
d’atteindre le meilleur rendement en Pabsorbé (30,0 mg plant-1) (Tableau 4.8).
Les doses fertilisantes 0,25X SP, 1X PR et 4X PR stimulent l’absorption du K. Les
meilleurs rendements sont obtenus généralement au niveau des plants inoculés avec la
souche Ba8 (382,8, 376,0 et 349,2 mg plant-1 en présence de 0,25X SP, 1X PR et 4X PR,
respectivement) (Tableau 4.8).
102
En ce qui est des autres éléments chimiques, on a constaté que les meilleures teneurs en Ca,
Mg, Mn et Fe absorbés ont été obtenues suite à l’inoculation des plants de maïs avec la
souche Ba8 et leur fertilisation avec 1X SP. L’absorption du Cu et Zn a été généralement
stimulée par l’hyphobactérie Ba8, et on a constaté que la dose recommandée (1X) en PR du
Québec a permis d’avoir les meilleurs rendements d’assimilation. Par contre, il semble que
certaines combinaisons fertilisants-BSP ont diminué considérablement la teneur des parties
aériennes du maïs fourrager en éléments nutritifs assimilables (essentiellement, 0X/Rm3 et
1XPR/Bph12) (Tableau 4.8).
Dans le but de vérifier la présence des souches inoculées, un échantillon mixte de sol
attaché aux racines, représentatif de chaque traitement, a été préparé. Les résultats obtenus
montrent que l’hyphobactérie B. anthina Ba8 est la meilleure colonisatrice de la
mycorhizosphère (1,5 * 109 UFC g-1 sol sec) du maïs comparativement à R. miluonense
Rm3 (6,1 * 108 UFC g-1 sol sec) et B. phenazinium Bph12 (3,9 * 108 UFC g-1 sol sec).
À partir de chaque échantillon composite, une dizaine de bactéries, développant un halo de
clarification autour de la colonie sur le milieu NBRIP contenant l’hydroxyapatite comme
seule source de phosphate, ont été sélectionnées aléatoirement. L’ADN qui code pour
l’ARN 16S a été amplifié par PCR et séquencé. L’analyse des séquences obtenues concorde
avec chacun des inocula bactériens utilisés.
103
Tableau 4.8 : Effet de l’inoculation des plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS) avec les BSP, Ri et les différents traitements
de fertilisation sur les dix éléments chimiques absorbés par les parties aériennes.
Pour chaque élément chimique, les moyennes suivies d’une lettre différente sont significativement différentes selon un test de LSD (P
≤ 0,05).
Traitements
Fertilisant Inoculum N P K Ca Mg Na Fe Cu Mn Zn
(mg plant-1)
0X Témoin 219,7gh 17,3g 220,8g 75,6efg 34,0fg 3,3abcd 976,6ef 121,7efg 666,0fg 264,6de
Ba8 296,2bcde 24,5abcde 330,3abcde 120,6abc 45,8cde 3,1abcd 1260,0abcd 154,9abcde 992,1abcde 330,7abcd
Rm3 260,1efgh 23,6bcdef 296,5def 68,4g 34,5fg 2,6bcde 965,5ef 135,1defg 492,3h 292,2bcde
Bph12 366,0a 27,6abcd 369,5abcd 112,0bcd 47,2cde 3,1abcd 1484,8a 188,6a 927,0bcdef 365,9ab
0,25XSP Témoin 256,0defg 22,6def 321,0bcde 97,1cd 44,6de 3,3abcd 1257,7abcd 147,8abcdef 845,9bcdef 276,1cde
Ba8 308,3abcd 30,0a 382,8a 99,8cd 47,3cde 3,5abc 1292,9abcd 160,0abcde 794,4defg 346,5abcd
Rm3 289,0bcdef 28,5ab 374,8abcd 106,6bcd 47,8cde 2,4cde 1332,0abcd 163,4abcd 942,4bcde 300,4bcd
Bph12 273,9bcdefg 27,0abcd 340,4abc 110,6bcd 57,0abc 2,5bcde 1414,2abc 147,1abcdef 1063,8abcd 299,7bcd
1XSP Témoin 202,6h 21,8efg 257,1fg 108,2bcd 51,7bcd 2,2de 1161,0cde 111,8g 902,2abcdef 161,2g
Ba8 252,0defg 24,3abcde 299,2def 154,7a 65,4a 3,2abcd 1581,3a 130,4defg 1253,3a 179,8fg
Rm3 241,3fgh 27,0abcd 289,4def 141,3ab 61,4ab 3,7abc 1585,8a 138,1cdefg 1149,9ab 198,3fg
Bph12 258,7cdefg 28,4ab 319,9cde 145,2ab 65,1a 4,3a 1484,4a 140,2bcdefg 1104,0abc 210,4ef
1XPR Témoin 264,2cdefg 20,9efg 317,5bcde 105,2cd 43,8de 2,9bcde 1171,8cde 170,3abcde 1109,3abc 359,4abc
Ba8 316,4abc 26,7abcd 376,0ab 89,8def 46,4cde 3,3abc 1333,8abcd 183,6ab 886,6bcdef 406,3a
Rm3 323,7ab 24,1bcdef 333,4abcde 98,3cd 43,8de 3,2abcd 1452,4abc 173,0abc 987,9abcde 395,3a
Bph12 249,4efg 20,0fg 283,1ef 73,3ef 35,6fg 2,0e 1019,3ef 125,9defg 715,7fg 321,6abcd
4XPR Témoin 225,0gh 18,1g 260,4fg 72,2fg 32,6g 3,0bcde 946,2f 115,1fg 638,7gh 276,2cde
Ba8 311,6abcd 25,7abcde 349,2abcd 99,0cd 41,2ef 4,0ab 1430,3abc 152,8abcde 828,5bcdef 394,8a
Rm3 271,5bcdefg 20,4efg 344,7abcd 96,3cde 45,1de 3,4abc 1209,8bcde 145,8abcdef 797,0cdefg 324,7abcd
Bph12 267,0cdefg 23,6bcdef 331,7abcde 99,4cd 45,5de 4,0ab 1184,3cde 157,8abcde 769,6efg 342,8abcd
104
4.3. Discussion
Dans cette étude, R. miluonense Rm3, B. anthina Ba8 et B. phenazinium Bph12 ont été
sélectionnées pour leur capacité à mobiliser les phosphates organiques et inorganiques, leur
aptitude à produire des sidérophores ainsi que leur adhérence aux surfaces abiotiques et
biotiques.
Toutes les souches sélectionnées secrètent des phytohormones appartenant à la famille des
auxines suite à une induction par un acide aminé exogène, le L-tryptophane. Les molécules
d’auxines ont un effet direct sur la plante du fait qu’elles jouent un rôle essentiel dans la
régulation de sa croissance et ses fonctions cellulaires (Glick et al. 1999). Il a été déjà décrit
que l’AIA produits par certaines bactéries de la rhizosphère comme les Pseudomonas est
impliqué dans la stimulation du développent et de l’élongation racinaire chez les plantes
(Patten and Glick 2002a; Pitts et al. 1998). Par ailleurs, la biosynthèse de concentrations
élevées en AIA par les rhizobactéries pourrait engendrer une inhibition de la croissance
racinaire (Xie et al. 1996). Dans cette étude, nos résultats montrent que les BSP stimulent la
germination et l’élongation racinaires du maïs mais les quantités d’AIA produites in vitro
ne sont pas étroitement liées à l’élongation racinaire du maïs.
En outre, les BSP présentent des caractéristiques bénéfiques aux plantes à effet indirect qui
sont reliées à leur utilisation comme moyen de lutte biologique via la production de certains
métabolites comme les antibiotiques, le HCN et les enzymes lytiques (p. ex. les chitinases)
capables d’inhiber la croissance des champignons phytopathogènes. Cet antagonisme
observé in vitro pourrait être reliée soit à une compétition entre les microorganismes pour
les nutriments in vitro, soit à la production de substances antifongiques par les BSP. En
effet, au niveau de la rhizosphère, les bactéries se développent plus vite que les
champignons et sont capables d’user les nutriments disponibles plus rapidement (Duffy
2001) d’où leur capacité à limiter ou inhiber la croissance des champignons pathogènes. De
plus, les sidérophores et les chitinases produits par les BSP pourraient être considérés
comme agents de lutte biologique. En effet, plusieurs études ont rapporté l’importance de la
production des sidérophores et d’autres métabolites secondaires comme agents de lutte
105
biologique contre certains champignons rhizopathogènes à savoir Fusarium oxysporum et
Rhizoctonia solani (O'Sullivan and O'Gara 1992; Nagarajkumar et al. 2004).
De plus, la motilité des BSP par l’intermédiaire des pili IV et des flagelles est une
caractéristique pertinente reliée à leur capacité à coloniser la mycorhizosphère (Van de
Broek et al. 1998; Turnbull et al. 2001; Czaban et al. 2007; Shelud’ko et al. 2010) et à être
par conséquent en étroite association avec les hyphes du CMA Ri.
Chez la majorité des plantes, l’ubiquité et l’importance des mycorhizes pour la croissance,
la nutrition et la protection contre les pathogènes sont bien connues et bien démontrées
(Fortin et al. 2008; Garbaye 2013). Comme le but de ce travail n’était pas de montrer l’effet
bénéfique des CMA mais plutôt leur interaction avec les BSP, chaque plant de maïs dans
tous les traitements a été inoculé avec le CMA Ri. L’importance de l’inoculation des
plantes avec les BSP dans les sols déficients en P disponible afin d’améliorer leur nutrition
phosphatée a été prouvée depuis plusieurs années (Laheurte and Berthelin 1988; Kumar and
Narula 1999; Hameeda et al. 2008). Dans cette étude, l’inoculation des graines de maïs
fourrager mycorhizé avec des BSP a significativement augmenté les rendements. L’effet
stimulateur des BSP, observé après 60 jours de culture en serre, s’est traduit par
l’augmentation de la matière foliaire fraîche et sèche, du pourcentage de mycorhization et
de l’absorption des nutriments par les parties aériennes du maïs fourrager. La technique
d’enrobage des graines par une suspension bactérienne en présence d’un biopolymère, la
CMC, assure la formation d’un film autour des graines enrichies et/ou saturées en BSP
bénéfiques aux plantes. En effet, l’immobilisation des microorganismes dans un film de
CMC leur confère une meilleure survie et une protection contre le stress environnemental
permettant ainsi de conserver leur efficacité. Bashan et ses collaborateurs (2002) avaient
recours à l’immobilisation d’une bactérie bénéfique aux plantes, Azospirillum brasilense
Cd, dans des billes d’alginates qui ont été par la suite associées aux grains de blé avant les
semis afin d’assurer une meilleure colonisation de la rhizosphère et d’éviter la compétition
entre les bactéries bénéfiques et la flore indigène du sol.
D’après la littérature, les biopolymères ne sont pas uniquement utilisés pour immobiliser
des bioinoculants bénéfiques aux plantes à la surface des semences (Chabot et al. 1996)
mais aussi dans le but de lutter contre les phytopathogènes (Anis et al. 2012; Castañeda et
al. 2014) et d’améliorer la biodisponibilité des fertilisants et des micronutriments
106
(Struminska et al. 2014). Il est aussi capital de souligner l’importance de la deuxième
inoculation des plants de maïs par les BSP appropriées, après 30 jours de culture en serre,
qui a pour rôle d’enrichir la mycorhizosphère en BSP bénéfiques.
En dépit de leurs effets immédiats sur la croissance, les engrais phosphatés solubles
présentent l’inconvénient de précipiter rapidement une fois dans le sol. Dans cette étude,
des doses différentes de SP ou de PR du Québec ont été testées dans le but de minimiser
l’apport en engrais chimiques voire les substituer par des produits naturels écologiques (PR
du Québec). Les résultats obtenus montrent que l’inoculation des plants de maïs par le
CMA Ri et les BSP, notamment la souche Ba8, a en général augmenté les rendements en
matière fraîche et sèche en présence de 0,25X ou 1X SP (Tableau 4.5). Ceci est en faveur
avec l’agriculture durable du fait qu’il est possible de réduire de 75 % l’apport en SP tout
en ayant des rendements meilleurs comparés à ceux obtenus en présence de 0,25 X SP ou
1X SP sans bioinoculant bactérien (Témoin).
Malgré que l’amendement direct des sols par les PR a commencé à la fin des années 1970,
l’application directe de ces produits naturels n’est pas largement répandue et ce pour
plusieurs raisons : les problèmes d’adaptation avec différents types de sols, l’efficacité
agronomique et la faible réactivité des PR (Rajan et al. 1996). Dans cette étude, l’utilisation
d’une PR peu réactive selon la dose recommandée (1X) en présence du CMA Ri et des BSP
a permis d’avoir des rendements, en matière fraîche et sèche, similaires à ceux obtenus avec
le SP. En effet, les BSP en association avec Ri sont capables de mobiliser le P à partir du
PR et de le rendre disponible aux plants de maïs. Ceci est en accord avec une agriculture
biologique qui permet de garantir la rentabilité économique et le respect de
l’environnement. Par ailleurs, plusieurs études ont rapportés l’effet de l’utilisation des PR
sur des cultures de maïs. En effet, dans une étude antérieure, il a été rapporté que le PR du
Maroc a permis d’augmenter la biomasse végétale et l’absorption des nutriments par des
plants de maïs fourrager inoculés par un consortium de BSP et des CMA Ri (Magallon
Servin 2014). Bien avant, Reyes et ses collaborateurs (2002) ont montré l’effet de
l’inoculation des plants de maïs par Penicillium rugulosum, un champignon solubilisant les
phosphates, combinée à l’utilisation de différentes sources de phosphates notamment les
PR sur l’augmentation des rendements en matière sèche de 3.6 à 28.6 %. L’utilisation d’une
autre souche de champignon solubilisant les phosphates, Penicillium oxalicum, comme
107
bioinoculant sur des cultures de blé et de maïs fertilisés avec du PR améliore la
disponibilité du P dans le sol et stimule ainsi la croissance et la teneur en P au niveau des
plantes (Singh and Reddy 2011). Hameeda et ses collaborateurs (2008) ont montré que les
BSP isolées à partir de composts et déchets agricoles en présence de fertilisants biologiques
à base de PR stimulent considérablement la croissance et les rendements des plants de maïs
cultivés dans les serres et au champ. Il a été aussi montré que l’efficacité du PR utilisé
comme fertilisant phosphaté pour la production agricole du maïs a été remarquablement
améliorée par l’ajout de fumiers de volailles contenant une microflore capable de
solubiliser les PR (Akande et al. 2005). Outre cela, Vassilev et ses collaborateurs (1996)
ont prouvé l’importance de l’ajout du PR à des cultures de légumineuses (Trifolium repens)
coinoculées avec un CMA Glomus deserticola, une bactérie fixatrice d’azote Rhizobium
trifoli et un champignon solubilisant les phosphates Aspergillus niger dans l’amélioration
de la biomasse végétale sèche et du contenu en P au niveau des feuilles.
Conséquemment, les PR, notamment le PR du Québec, peuvent être un bon substituant aux
fertilisants chimiques.
Le comportement et l’efficacité de chacune des souches changent d’un traitement à un
autre, selon la nature et la dose du fertilisant appliqué. L’inoculation du maïs fourrager avec
B. anthina Ba8 ou B. phenazinium Bph12 en présence de la dose recommandée (1X) en PR
du Québec ou SP a permis d’avoir les meilleurs rendements. Tel qu’observé dans d’autres
travaux, les bactéries appartenant au genre Burkholderia, appelé anciennement
Pseudomonas, augmentent considérablement la croissance et le développement de diverses
plantes (maïs, laitue) (Chabot et al. 1996; Digat et al. 1990). Certains microorganismes sont
capables de produire dans le sol des métabolites microbiens tels que les acides organiques,
les sidérophores, les enzymes et certaines hormones de croissance (l’AIA par exemple). Il a
été prouvé que ces métabolites ont un rôle très important dans la dissolution des
phosphates, la stimulation de la croissance et l’absorption du P chez les plantes (Chabot et
al. 1996; Patten and Glick 2002b; Sharma and Johri 2003).
Dans la nature, les CMA sont capables d’influencer la mycorhizosphère et d’interagir avec
les différents microorganismes du sol, notamment les bactéries (Antoun and Prévost 2005;
Artursson et al. 2006). Tel que décrit dans les chapitres précédents, les CMA sont capables
d’agir en synergie avec les BSP qui à leur tour vont adhérer intimement à la surface des
108
hyphes de Ri. Nos résultats ont montré que l’interaction BSP-mycorhizes est mieux établie
en présence du PR du Québec. Cette association favorisera donc la mobilisation du P dans
le sol qui sera acheminé aux plants via les racines et aussi via le réseau mycélien très
développé du CMA Ri. L’inoculation avec Ri combiné à des BSP en présence ou en
absence de fertilisation a provoqué une hausse des rendements des plants de maïs. Cette
amélioration est d’autant plus importante au niveau des plants traités par l’hyphobactérie
Ba8, meilleure formatrice de biofilm vivant sur les surfaces biotiques et abiotiques.
D’ailleurs, cette bactérie est la meilleure colonisatrice de la mycorhizosphère et stimule
significativement la colonisation racinaire du maïs fourrager par Ri. Certes, la
mycorhization atteint son maximum en présence du PR du Québec, un effet direct de
l’interaction Ba8-Ri-PR du Québec. Notons aussi qu’il a été rapporté que les CMA sont
capables d’améliorer la colonisation racinaire des graminées (maïs) par les bactéries du sol
(Miyauchi et al. 2008).
Dans cette étude, le P est l’élément nutritif clé qui nous permettra de juger l’efficacité de
nos BSP. En effet, tous les autres éléments ont été fournis en quantité suffisante alors qu’on
a fait en sorte de rendre, dans certains traitements, le P l’élément limitant la croissance du
maïs en fournissant des doses inférieures à celles recommandées ou en utilisant le PR du
Québec à faible réactivité. L’analyse factorielle établie sur les 10 éléments minéraux a
permis une réduction des données en les regroupant en classes (facteurs) dont les entités ont
des propriétés similaires, ce qui rend la comparaison des valeurs plus aisée. Comme les
concentrations les plus élevée de Pabsorbé au niveau des parties aériennes ont été observées
en présence des BSP quelque soit la dose et la nature du fertilisant utilisé, la mobilisation
du P par les microorganismes est le mécanisme le plus important impliqué dans
l’amélioration du P assimilable dans le sol permettant ainsi une meilleure croissance.
Généralement, les plants colonisés par les BSP absorbent mieux la plupart des éléments
nutritifs présents dans le sol. Quand le SP est utilisé comme fertilisant (1X), l’assimilation
des minéraux par les plants est améliorée en présence des BSP, notamment l’hyphobactérie
Ba8 qui a permis d’avoir les rendements les plus élevés. On remarque aussi que les
hyphobactéries (Ba8 et Rm3) augmentent significativement la concentration de la partie
foliaire en N, P, K, Mg, Na, Fe, Cu et Zn absorbés en présence du PR du Québec (1X).
Toutes ces constations pourraient être fortement liées aux interactions intimes et bénéfiques
109
BSP-Ri, impliquées ainsi dans l’amélioration de la croissance et l’assimilation des
nutriments par les plants de maïs.
Plusieurs souches bactériennes (notamment les Pseudomonas, Burkholderia et Rhizobium)
ayant un effet bénéfique aux plantes (biofertilisant ou agent de biocontrôle) sont capables
de stimuler la croissance et d’améliorer le rendement des cultures. Pseudomonas putida a
été décrite pour son effet bénéfique sur le développement des feuilles et des racines du
canola, de la laitue et de la tomate (Hall et al. 1996; Glick et al. 1997). Brown (1974) a
rapporté que Bacillus megaterium et Azotobacter chroococcum utilisée individuellement ou
en consortium augmentent le rendement du blé cultivé au champ. D’autre part, Chabot et
ses collaborateurs (1996) ont démontré qu’au champ, l’effet de l’inoculation bactérienne
par des BSP sur la laitue ou le maïs cultivés dans des sols de fertilité différente dépend
essentiellement de la disponibilité du P dans le sol. Bien avant, Kucey (1988) a rapporté
que l’inoculation par Penicillium bilaii, un champignon solubilisateur des phosphates,
favorise la croissance et l’absorption du P chez le blé cultivé au champ. Ce champignon est
capable aussi d’influencer la concentration de certains éléments chimiques par rapport au
traitement non inoculé. Cependant, les travaux de Gulden et Vessey (2000) réalisés sur des
grandes culture de pois en présence de différents niveau de P ont montré que ce même
champignon (P. bilaii) n’a aucun effet sur les masses fraîches foliaires, ni sur l’absorption
du P mais affecte plutôt la zone racinaire pilifère (accroissement des poils absorbants).
En conclusion, la combinaison tripartite BSP-Ri-PR du Québec peut être une alternative
pour stimuler la croissance et l’absorption minérale chez le maïs fourrager en faveur d’une
agriculture durable ou biologique. Cependant des essais au champ sont nécessaires afin de
confirmer les résultats observés en serre. Même si plusieurs facteurs peuvent être impliqués
dans l’amélioration des rendements de culture, les BSP utilisées dans cette étude pourraient
être bénéfiques pour d’autres cultures en serre ou au champ. Cependant, des essais
préliminaires doivent être faits au préalable afin de s’assurer de l’efficacité des
bioinoculants.
110
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115
Matériel supplémentaire
Annexe 4.1 : Quelques activités bénéfiques aux plantes chez les BSP.
Isolat
Motilité (mm) HCN IAA
Pili Flagelle
BSP hyphosphériques
BSP faiblement attachées aux hyphes
Burkholderia cepacia
3,1 17 4 - -
6,1 16,5 4 - -
6,2 16,5 4,5 - -
6,3 23 3,5 - -
7,2 20 5 - -
11,1 16 4 - ++
Burkholderia sp,
12,1 8 4 - -
Leifsonia naganoensis
7,1 34,5 4,5 - +++
BSP fortement attachées aux hyphes
Rhizobium miluonense
3,1 9,7 4,3 - +++
Burkholderia cepacia
3.3 14 4,5 - -
3.4 14 4 - +
3.5 14,5 4,5 - -
3.6 17 5 - +++
7.1 17,5 4 - +-
7.2 14 3,5 - -
7.4 20 3 - -
8.2 18 3 - +-
9.2 13,5 4 - -
11.3 11 4,5 - -
11.4 18 5 - -
11.5 12,5 5 - +-
12.2 1,35 4,5 - +-
12.3 19 3 - -
12.4 17,5 4,5 - -
12.5 15,5 4 - -
13.1 18,5 8 - ++
Burkholderia cenocepacia
13.4 7 6,5 - +-
Burkholderia anthina
8.1 7,3 12,7 - ++
Burkholderia sp,
116
1.1 7 4 - ++
9.1 9,3 10,6 - ++
11.7 7 4,5 - -
11.8 7,5 4,5 - ++
11.9 9 5 - -
13.2 5,6 7,3 - +
Burkholderia vietnamiensis
11.15 1,15 5 - +
BSP rhizosphériques
Dyella japonica
1.39 5,6 4,6 - ++
Bacillus pumilus
3.10 85 85 - -
Rahnella sp,
11.39 5,6 17 - ++
Rahnella aquatilis
8.15 64 7 - +++
1.33 29 5 - +++
11.43 27 5 - +++
Pseudomonas gingeri
6.1 85 7 - +
Burkholderia phenazinium
12.21 5 4 - ++
5.3 3 2 - +
9.33 45 30 - -
12.2 1 2 - +++
Burkholderia phytofirmans
4.24 85 4 - ++
Ewingella americana
9.20 77 8 - +++
Pseudomonas koreensis
11.38 42 30 + +++
Ewingella americana
11.55 85 6 - +++
Erwinia billingiae
13.52 10 6 - +
+++ : élevé, ++ : moyen, + : faible, +- : production détectée, - : pas de production.
Les isolats sont désignés par le numéro de référence du sol suivi par le numéro de référence
de la souche, Les BSP sélectionnées sont surlignées en gris.
117
Annexe 4.2 : Analyse de la variance des deux facteurs représentant les dix éléments
chimiques analysés au niveau des organes aériens des plants de maïs fourrager (Zea mays
cv, FOCUS) fertilisées par le PR du Québec ou le superphosphate et inoculés avec les BSP
et Ri.
Effet Variable dl F
Fertilisant Facteur I 4 27,75**
Facteur II 4 3,80**
Inoculation bactérienne Facteur I 3 0,23NS
Facteur II 3 0,75NS
Fertilisant * Inoculation bactérienne Facteur I 12 1,76NS
Facteur II 12 2,12*
Erreur 90 * ** différences significatives à P<0,05, et P<0,01, respectivement, NS : non significatif et dl
: degré de liberté.
118
Annexe 4.3 : Effet de l’inoculation des plants de maïs fourrager (Zea mays cv. FOCUS) avec les BSP, Ri et les différents traitements
de fertilisation sur les dix éléments chimiques analysés au niveau des parties aériennes.
Pour chaque élément chimique, les moyennes suivies d’une lettre différente sont significativement différentes selon un test de LSD (P
< 0,05).
Traitements
Fertilisant Inoculum N P K Ca Mg Na Fe Cu Mn Zn
% mg/Kg
0X Témoin 1,238abc 0,097bcde 1,235ef 0,419bcdef 0,192abcde 0,019ab 54,746abcd 6,786ab 37,159abc 14,814ab
Ba8 1,198bcd 0,100bcde 1,317cde 0,492ab 0,183bcde 0,013abcd 50,123d 6,220abcd 39,205abc 13,325ab
Rm3 1,262ab 0,117ab 1,455abc 0,335ef 0,167e 0,013abcd 47,800cd 6,525ab 23,903d 13,997ab
Bph12 1,512a 0,115abc 1,528ab 0,460abcd 0,197abcde 0,013abcd 62,122a 7,875a 37,365bc 14,972ab
0,25XSP Témoin 1,127bcd 0,100bcde 1,402bcde 0,427abcde 0,197abcde 0,014abcd 55,053abcd 6,583ab 37,482abc 12,123ab
Ba8 1,317ab 0,128a 1,637a 0,422abcde 0,202abc 0,016abc 55,348abcd 6,755ab 33,708bc 14,527ab
Rm3 1,107cd 0,110abcd 1,290de 0,410bcdef 0,182bcde 0,009e 51,032bcd 6,223abcd 35,718bc 11,525abc
Bph12 1,007de 0,102bcde 1,383bcde 0,412bcdef 0,209ab 0,010cde 52,357abcd 5,428bcde 39,627abc 11,142abcd
1XSP Témoin 0,888e 0,093cde 1,132fg 0,472abc 0,223a 0,010de 50,985bcd 4,860de 39,180abc 7,168e
Ba8 0,856e 0,083e 1,017g 0,527a 0,222a 0,011de 53,540abcd 4,408e 41,873ab 6,106e
Rm3 0,867e 0,095bcde 1,033g 0,505ab 0,220a 0,013abcd 56,693abcd 4,950cde 40,697abc 7,037de
Bph12 0,855e 0,093bcde 1,050g 0,475abcd 0,210ab 0,014abcd 49,008abcd 4,555e 36,347bc 7,048de
1XPR
Québec
Témoin 1,127bcd 0,090de 1,373bcde 0,449abcde 0,188abcde 0,013abcd 50,677bcd 7,168ab 47,995a 15,618ab
Ba8 1,158bcd 0,098bcde 1,372bcde 0,328f 0,168e 0,012abcd 48,973d 6,773ab 32,438c 14,827ab
Rm3 1,327ab 0,100bcde 1,370bcde 0,405abcdef 0,178bcde 0,013abcd 59,730ab 7,115a 40,758ab 16,325a
Bph12 1,317ab 0,108abcd 1,500abc 0,377def 0,182bcde 0,010cde 52,553abcd 6,732ab 35,947bc 16,937a
4XPR
Québec
Témoin 1,240bc 0,100bcde 1,418bcd 0,390cdef 0,175cde 0,015abcd 50,655bcd 6,333abc 34,183bc 14,998ab
Ba8 1,318ab 0,110abcd 1,488abcd 0,418bcdef 0,175de 0,017abc 62,065a 6,480ab 35,083bc 16,755a
Rm3 1,184bcd 0,091cde 1,507ab 0,421abcde 0,194abcd 0,016abc 52,760abcd 6,398abc 34,433bc 14,420bc
Bph12 1,190bcd 0,105bcde 1,472abc 0,440abcde 0,200abcde 0,019a 52,835abcd 7,002ab 33,263bc 15,132ab
119
Chapitre 5 :
Conclusion générale
120
La solubilisation microbienne des phosphates joue un rôle important dans la conversion du
P insoluble en P soluble. En effet, il a été démontré que certains microorganismes du sol
impliqués dans la solubilisation des phosphates peuvent améliorer la nutrition phosphatée
des plantes. Cette activité microbienne est améliorée lorsque les bactéries sont associées
aux mycorhizes ce qui conduit à une meilleure biodisponibilité du P pour les plantes.
Le but principal des travaux de recherche présentés dans cette étude était donc d’étudier le
potentiel de l’utilisation des bactéries, étroitement associées aux hyphes du CMA
Rhizophagus irregularis (Ri) et capables de mobiliser les phosphates peu solubles, sur la
croissance et la nutrition phosphatée chez le maïs.
Une approche d’isolement originale qui consiste à isoler des BSP à partir de l’hyphosphère
de plants de poireau ayant reçus des suspensions bactériennes à partir d’échantillons de sol
a été développé. Cette méthode a permis de pièger in vivo, des bactéries hypho-compétentes
qui se développent sur la surface des hyphes du CMA Ri au dépend des exsudats fongiques.
Les BSP retenues sont capables de solubiliser en milieu liquide autant l’hydroxyapatite que
le PR du Québec (peu réactif) via la production d’acides organiques et aussi de
sidérophores. Par ailleurs, les BSP isolées sont aussi capables de minéraliser les phosphates
organiques via la production de phytases et de phosphatases alcalines et acides. . La
solubilisation des phosphates in vitro par les BSP, cultivées en synergie avec les hyphes du
CMA Ri, est favorisée quand les hyphobactéries sont utilisées, notamment la souche B.
anthina Ba8.
Ce travail montre aussi que les BSP sélectionnées sont capables de former des biofilms
morts et vivants et de produire des EPS sur les particules de phosphates. Ainsi, on a
constaté que la solubilisation des phosphates par les biofilms bactériens est fortement
corrélée avec la présence de biofilm vivant formé majoritairement par l’hyphobactérie Ba8.
L’adhérence des bactéries sur la surface du PR du Québec a été observée dans un premier
temps à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser qui a montré que la souche Ba8
émettait le maximum de fluorescence. Les observations microscopiques ont permis de
constater que B. anthina Ba8 est capable de se développer sur les hyphes et d’y d’adhérer
fortement, uniquement quand le PR du Québec est utilisé comme source de phosphate. Ceci
suggère que Ba8 s’associe intimement aux hyphes, se nourrit des exsudats mycéliens et ce
121
en faveur d’une meilleure solubilisation des phosphates de roche.
Tout au long de ce travail, une question m’a souvent intriguée en examinant les
micrographies issues des observations en microscopie électronique : « S’agit-il d’une
simple adhérence aux surfaces ou d’un biofilm bactérien proprement dit ? ». J’avais donc
profité de ma participation à l’Union Internationale des Sociétés de Microbiologie 2014 à
Montréal pour en discuter avec des experts du domaine, notamment le Dr. Yves Brun,
professeur affilié au département de biologie de l’université de l’Indiana, qui m’a affirmé
qu’en pratique : « Toute adhésion des bactéries à une surface est un biofilm, qu'il soit formé
d'une seule couche de cellules ou de plusieurs et quelque soit son architecture ». À la
lumière de cette réplique, il semble plus plausible de qualifier les structures observées sur
les surfaces abiotiques et biotiques de biofilms.
Les résultats des essais d’inoculation du maïs en serres montrent qu’il y a un synergisme
significatif entre les BSP et les CMA. En effet, la co-inoculation de ces deux
microorganismes considérés comme des biostimulants potentiels augmente
significativement les rendements de tous les paramètres étudiés. En présence des BSP, on a
pu réduire l’apport en engrais chimique de 75% et obtenir des rendements considérables en
présence du PR du Québec. L’hyphobactérie Ba8 mobilise le PR du Québec peu réactif
(1X) pour donner des rendements en matière fraiche et sèche aussi efficaces que ceux
obtenus avec la dose recommandée de superphosphate. Cette souche semble aussi être la
meilleure stimulatrice de la colonisation racinaire des plants de maïs par les CMA,
particulièrement en présence du PR du Québec, et pourrait conséquemment être considérée
comme une bactérie stimulant la mycorhization « Mycorrhizas helper bacteria ».
L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse apporte des pistes intéressantes pour
l’avenir de l’agriculture durable et/ou biologique. L’interaction entre les BSP et Ri
résulterait d’un dialogue biochimique et moléculaire entre bactéries et champignons
symbiotiques, notamment en présence du PR du Québec. Ce synergisme a une influence
significative sur l’amélioration de la croissance du maïs en serre ainsi que l’absorption des
nutriments, il permettra ainsi de réduire les intrants agrochimiques voire même les
substituer par des ressources naturelles, écologique et bon marché. Enfin, il serait donc
nécessaire de vérifier l’efficacité de ces biofertilisants au champ. On pourrait s’attendre à
une efficacité équivalente chez le maïs, mais considérant que chaque espèce végétale
122
possède ses propres exigences, l’efficacité de ces bioinoculants serait possiblement variable
chez d’autres espèces. D’ailleurs, afin d’élargir le spectre des plantes qui pourraient
bénéficier de la combinaison tripartite BSP-Ri-PR, il est important de comprendre les
mécanismes impliqués dans cette interaction positive/synergisme.
123
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