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Análisis de mutantes de inserción de ADXR

Introducción

El ciclo de vida de las plantas alterna entre una etapa haploide y otra diploide. Las

células diploides del cuerpo de la planta (esporofito) sufren meiosis dando así células

que luego sufren varias divisiones mitóticas formando estructuras especializadas

haploides (gametofito), del cual se producen las gametas sexuales. En angiospermas, el

esporofito es la generación prominente (Pagnusat, 2005). La generación de las

gametas femeninas o masculinas ocurre por medio de un proceso que se conoce como

gametogénesis y que involucra en una primera instancia meiosis y posteriormente

mitosis y diferenciación celular.

En Arabidopsis thaliana, el gametofito femenino o saco embrionario es una estructura

altamente polarizada compuesta de siete células, juega un rol fundamental en todas

las etapas del proceso reproductivo. Con el fin de conocer los genes requeridos y las

rutas involucradas en el desarrollo de este gametofito en angiospermas se han

realizado muchos estudios de mutantes gametofitos. El screening de líneas con

inserciones de T-DNA para determinar genes funcionalmente importantes para el

desarrollo del gametofito ha llevado a la identificación de varios mutantes gametofitica

en Arabidopsis. (Pagnusat 2005)

Las mutaciones gametofitica afectan aspectos del desarrollo del gametofito que

ocurren después de la meiosis, incluyendo megagametogénesis y el funcionamiento de

del gametofito maduro. Los mutantes gametofíticos son típicamente identificados

usando dos criterios: 1) Reducción del set de semillas, 2) Distorsión de la segregación

(Yadegari, 2014).

Una de las mutantes gametofitica identificadas presenta una inserción en un gen

codificante para una proteína tipo Adrenodoxina reductasa (ADXR), la cual presenta

gametofitos femeninos que arrestan su desarrollo en diferentes estadios.

En base a lo anterior el objetivo del presente trabajo se centró en caracterizar la

mutante gametofitica ADXR a partir del análisis de plantas ADXR/adxr las mismas

presentan un 38.4% de abortos y dificultades de transmisión a través del lado

materno, sugiriendo un defecto en la gametogénesis o en la función del gametofito

femenino.

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Materiales y Métodos

Material Vegetal: A partir de semillas sembradas en placas con medio ATS de

Arabidopsis thaliana wild type ecotipo Columbia (Col-0) o mutantes de inserción T-DNA

se seleccionaron cinco plantas aleatoriamente.

Preparación de ADN genómico y Genotipificación: Se realizó una extracción de ADN

genómico a partir de hojas de Arabidopsis thaliana wt y mutantes de inserción de T-

DNA utilizando el protocolo de extracción de DNA genómico (Guía TP, 2014). Se realizó

un dosaje (Abs260/280) y se determinó el genotipo de las cinco plantas (P1-P5)

mediante reacciones de PCR a partir del protocolo (Guía TP, 2014), debido a que se

utilizó la polimerasa que se utilizo fue la Taq Pegasus y no la indicada en el protocolo

se realizaron cambios en las concentraciones de los reactivos para así ajustarlo a esta

polimerasa. Se utilizó, para las PCR, extracto de DNAg como templado o Tejido tratado

(Tissue-PCR) con las siguientes combinaciones de primers:

Primers específicos del gen AT4g05450, ADXR (Fw + Rv)

Primer específico de ADXR (Rv) + primer especifico de inserto (LBB1)

Primer adxrLB, 5´ GCTTGCATATGGTGCTGAAA

Primer adxrRV, 5´ CCCGTCTTCCGATGAGATAC

Primer LBb1.3, 5’ TTTTGCCGATTTCGGAAC

Se realizó en paralelo una Tissue-PCR según indicado en la guía de trabajos Prácticos.

Extracción de RNA, se extrajo RNA total a partir de pistilos de plantas mutantes y wild

type siguiendo el método de extracción fenólica con Trizol (Guía TP, 2014).

Cuantificación del RNA, se leyó la absorbancia de las extracciones a 260nm y 280nm y

se realizó una electroforesis en gel de agarosa.

RT-PCR, se realizó la síntesis de primer hebra, cDNA, a partir del RNA extraído

utilizando dos transcriptasas reversas distintas (M-MLV e IP2) y un mix que contiene

buffer, oligodT, mezcla de dNTPs y DTT (Guía TP, 2014). Se utilizaron 3ul de la muestra

de cDNA para las reacciones de PCR cuantitativa ajustada para los ciclos 26, 30 y 34. Se

utilizándose los mismos primers específicos del gen ADXR que en el genotipado así

como primers específicos de Actina2 como control de expresión.

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Resultados y Discusión

Analisis del DNA genómico.

Con el fin de determinar el genotipado de las 5 plantas de Arabidopsis thaliana

se realizó una extracción de DNA genómico a partir de 2-3 hojas a cada una de las

plantas. Se midió luego la absorbancia del precipitado para determinar la

concentración cualitativa de la muestra de DNA extraída de cada planta y se realizó

también una corrida electroforética en un gel de agarosa con el fin de corroborar la

integridad del DNA (Fig. S1).

En la tabla 1 se puede observar las plantas 1, 2 y 3 tuvieron una concentración

de ADN y Absorbancias similares sin embargo a relación 260/280 para la planta 1 y 3 es

muy alta, esto indicaría que podría presentar contaminación con RNA o fenol, por otro

lado la Planta 2 presenta una buena relación de absorbancias por lo que podría

decirse que casi su totalidad corresponde a DNAg. Con respecto a la planta 4 se

mantiene la relación entre absorbancia y concentración presente en las plantas antes

mencionados pero con valores de aproximadamente la mitad de estas, sin embargo,

estos valores caen dentro del rango de error del espectrofotómetro por lo cual no

podrían tomarse como valores estimativos. Por último la planta 5 presenta una alta

absorbancia pero concentración muy baja de DNA, esto significa que en esta muestra

hay una gran cantidad de contaminante, probablemente debido a un error con la

última dilución en donde se resuspendió con un volumen mayor del indicado.

Genotipificacion de A. thaliana

Luego se procedió a verificar

la presencia del inserto de T-DNA

utilizando dos métodos diferentes análisis, PCR y Tissue-PCR. Las muestras, DNAg o

tejido tratado, se amplificaron utilizando primers específicos del gen de ADXR y del

inserto T-DNA, los productos de PCR se corrieron luego por electroforesis en gel de

agarosa para así poder determinar el genotipo de cada pl anta.

El gel correspondiente a la corrida electroforética de las reacciones de PCR y Tissue-

PCR se observa en la figura 1. El tamaño esperado para el gen de interés sin inserto

Tabla 1. Cuantificación de DNA. Se midió la Abs260 y 280 de 5ul del extracto de DNAg de cada planta. Concentración Abs260 =1 para 50 µg/ml.

Planta [DNAg](µg/µl) 260/280 OD

1 0,621 1,89 0,161

2 0,645 1,703 0,155

3 0,684 1,925 0,156

4 0,365 1,75 0,094

5 0,041 1,835 0,827

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amplificado con los primers de ADXR, LB y RB, es de aproximadamente 672 bp lo cual

demostraría un genotipo Wild Type, en cambio para la combinación primer de ADXR + primer

de T-DNA (Rv+LBB1) se esperaría un tamaño de aproximadamente 950 bp lo cual indicaría un

genotipo mutante. A partir de estos datos se pudieron determinar los genotipos de las

distintas plantas:

Planta 1 en las calles G1 y T1 se observa una banda de aproximadamente 700pb la

cual correspondería al gen sin inserción y en la calle G2 otra de 900pb

correspondiente a la inserción. Por lo tanto se podría decir que la Planta 1 es una

mutante heterocigota.

Planta 2 Se observa solo resultados en las reacciones de Tissue-PCR los cuales son

los mismos que los de la planta 1 por lo que podría decirse que esta también presenta

un genotipo mutante.

Planta 3 Debido a que no se encontraron bandas específicas en ninguna calle no se

pudo determinar el genotipo de esta planta.

Planta 4 A partir de las calles correspondientes a las reacciones de PCR se puede

determinar que esta planta presenta un genotipo wild type homocigota debido a la

presencia de una sola banda de aproximadamente 700pb en la calle G1.

Planta 5 Se determina que esta planta presenta un genotipo mutante debido a las

bandas que se observan en las calles G1 y G2 (difusa) de aproximadamente 700pb y

900pb respectivamente.

La ausencia de bandas en las respectivas

calles puede deberse a varios factores: los

Figura 1. Genotipificación por PCR con DNA de hojas o

tejido tratado. Los productos se corrieron por

electroforesis en gel de agarosa. P: Planta de A. thaliana,

G1/T1: primers de ADXR (LB + RB) G2/T2: primers de

ADXR Rv + primer de T-DNA LBB1. G PCR; T Tissue-

PCR. Pm: marcador de peso molecular. C: Control sin DNA

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primers no hibridaron correctamente en las reacciones de PCR, presencia de muestra

excedente, ya sea de hoja tratada o extracto de ADN, mal sembrado en el gel, etc.

Expresión de ADXR

Extracción y análisis de RNA

Luego, con el fin de determinar el nivel de expresión de las distintas plantas, se

procedió a realizar una RT-PCR a partir de RNA. Se realizó entonces una extracción de

RNA total con Trizol a partir de pistilos de cada una de las plantas según el protocolo

indicado (Guía de TP, 2014). Se continuó con una cuantificación de RNA de cada

extracción a una ABS. 260/280 con el fin de determinar la cantidad necesaria para la

síntesis de primer hebra y a su vez se realizó una corrida electroforética para evaluar la

integridad de la muestra, verificar que el RNA extraído no se encuentre degrado, y

para corroborar su dosaje.

En la tabla 2 se muestran los valores obtenidos de la cuantificación de RNA, en

base a estos se puede determinar que las extracciones de las plantas 4 y 5 presenta

una buena pureza debido a que la relación 260/280 es cercana a 2, sin embargo la

concentración presente en la muestra de la planta 4 es muy baja. En el caso de las

plantas 1 2 y 3 la relación Abs. 260/280 obtenida fue baja lo cual indicaría que podría

haber contaminación con proteínas o DNA, las plantas 1 y 2 presentan a su vez una

Tabla 2. Cuantificación de RNA. Se midió la Abs260 y 280 de 6ul de la solución de extracción de RNA de cada planta. Concentración Abs260 =1 para 40ug/ml.

Figura 2. Análisis de RNA. Se corrieron por electroforesis 2ug del extracto RNA de cada planta en gel de agarosa. P: Planta de A. thaliana

Grupo [RNA](µg/µl) 260/280 OD

1 0,36 1,65 0,094

2 0,62 1,56 0,173

3 1,061 1,49 0,28

4 0,17 1,9 0,25

5 1,004 1,86 0,284

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baja concentración de RNA lo cual concuerda con la relación Abs260/280, pero en la

planta 3 se ve una buena concentración de muestra de RNA.

En la corrida electroforética de la extracción de RNA total de las distintas

plantas (figura 2), se pueden observar dos bandas marcadas correspondientes a RNAr

28 y 18S, en las plantas 1, 2 y 5, lo cual me indicaría que no hay degradación del RNA.

En las plantas 3 y 4 las bandas son muy difusas, esto podría deberse a degradación de

RNA o contaminación alta con DNAg. A su vez se cabe destacar las bandas presentes

en la parte de arriba de las calles lo cual podría corresponder también a contaminación

por DNAg.

Análisis de expresión por RT-PCR

Se continuó a partir de las muestras de RNA con una dilución de 1:2 y luego con

la síntesis de primer hebra según lo indicado en el protocolo (Guía TP, 2014),

obteniéndose el cDNA el cual se utilizó luego en reacciones de PCR semicuantitativa.

Para esta reacción se utilizaron los primers específicos del gen ADXR así como también

primers de ACTINA2 para control de expresión, en reacciones separadas. Se analizaron

las reacciones procedentes a los ciclos 20, 30 y 34 en un gel de agarosa para poder

estar dentro la fase exponencial de la amplificación para el análisis de expresión. La

banda esperadas para los amplicones de ACTINA2 es de aproximadamente 690pb y

para los amplicones de ADXR alrededor de 300pb.

En la figura 3 se observan las reacciones de RT-PCR para las 5 plantas distintas.

En la planta 1 se observan bandas de aproximadamente 800-900 bp ya sea en la calle

de actina o de ADXR correspondientes a los ciclos 30 y 34 y se ve que estas aumenta en

por cada ciclo. Dado que el peso esperado para la actina es de 690pb y para el gen de

300pb, se determina que estos productos son inespecíficos y no brindan la información

deseada. En las plantas 2, 3 y 4 no se ven bandas claras que puedan determinar alguna

expresión. Por último con respecto a la planta 5 solo se observan bandas en los ciclos

30 y 34 de el gen ADXR, de nuevo la banda es de aproximadamente 800-900pb lo cual

no corresponde al gen en estudio.

Por ende se podría decir que el análisis de expresión realizado por RT-PCR presentó

resultados inespecíficos.

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Debido a estos resultados inconclusos se repitió la RT-PCR siguiendo el mismo

protocolo anterior con una modificación, el templado se diluyó 1:5 para disminuir la

posible contaminación con DNA genómico (figura S2). Para las plantas 1, 2 3 y 4 no se

observó banda y en el gel correspondiente a la planta 5 se obtuvo un resultado similar

al anterior. Una de las hipótesis por lo cual se cree que fallaron las primeras dos RT-

PCR es que la enzima transcriptasa reversa (MLMV) no estaba funcionando

óptimamente, por lo tanto se realizaron dos nuevas reacciones de RT-PCR, en la cada

síntesis de primer hebra se utilizaron dos transcriptasas reversas distintas (MLMV e

IP2). Luego se tomaron 2µl de los productos cDNA y se procedió con las reacciones de

PCR semicuantitativa.

Figura 3. Análisis de expresión por RT-PCR del gen ADXR. Se corrieron los productos de RT-PCR de los ciclos 26, 30 y 34 de ADXR (X) y de Actina (A). Pm: peso molecular, C: control sin cDNA; A: Control de expresión Actina2; X: expresión de ADXR, P, Planta de A. thaliana; Nº de Ciclos 26, 30,34

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En la figura 4, correspondiente al gel de la tercera RT-PCR, se ve que en las

reacciones con las distintas enzimas hay presencia de bandas en ambos casos, lo cual

indicaría que la transcriptasa reversa no falló. En las calles correspondiente a la

amplificación con los primers de ADXR se pueden observar bandas de

aproximadamente 300pb las cuales corresponderían a los amplicones del gen

especifico, demostrando así que las mutantes heterocigotas presentan expresión de

ADXR. Con respecto a los controles con actina solo se observa la banda

correspondiente a aproximadamente 690pb en la última calle de la planta 5

correspondiente a la enzima IP2, que los amplicones de actina no estén presente en las

calles correspondientes podría deberse a que los primers correspondientes a ACTINA2

no hibridaron correctamente con el gen de actina.

Conclusión

El análisis de genotipificación de las plantas ADXR/adxr determinó que las plantas

1, 2 y 5 eran mutantes, la 4 wild type pero la planta 3 no se pudo determinar su

genotipo. Si bien no se obtuvieron resultados en todas las reacciones de PCR o Tissue,

estos fueron suficientes para determinar el genotipo de cada planta pero no para

comparar la efectividad de los distintos procedimientos.

Los primeros dos análisis de expresión realizados mediante RT-PCR presentaron

resultados dudosos los cuales podrían deberse a diversos factores:

RNA degradado u oxidado

Que el RNA no haya sido limpiado totalmente de Trizol por ende quedan

fenoles que interfieren en la reacción

Figura 4. Análisis de expresión por RT-PCR de ADXR. Se corrieron los productos de RT-PCR del ciclo 35 de ADXR (X) y de Actina (A). Pm: peso molecular, A: Control de expresión Actina2; X: expresión de ADXR, P1-5, Planta de A. thaliana; MLV, IP2, transcriptasas reversa.

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Contaminación con DNA genómico.

No se haya mantenido el templado de RNA en frío, formándose así estructuras

secundarias.

A partir de la tercer RT-PCR se pueden ver los amplicones correspondientes al gen

(300pb), lo cual indicaría que no hubo falla en la enzima transcriptasa reversa, sin

embargo no se observó expresión del gen Housekeeping, actina, lo cual podría indicar

algún tipo de falla con los primers de actina. A partir de estas PCRs se puede

determinar que el gen es expresado en plantas mutantes ADXR/adxr, pero como las

dos últimas reacciones de PCR se hicieron a partir de dos plantas mutantes no se pudo

hacer una valoración comparativa entre mutante y Wild Type. A su vez como no se

obtuvo expresión de Actina tampoco se pudo realizar un análisis sobre la expresión

relativa de ADXR con respecto a la actina.

Teniendo en cuenta la cantidad de resultados inespecíficos se recomienda,

entonces, repetir los procedimientos evitando errores en los pasos claves de la RT-PCR,

así como utilizar DNasa para eliminar la contaminación con DNA genómico en las

muestras de RNA extraído.

Bibliografía

1) Drews G. N., Koltunow A. M. G. (2011). The Female Gametophyte. The

Arabidopsis book.

2) Guía de Trabajos Prácticos, Biología Molecular II, 2014.

3) Pagnussat G. C., Yu H., Ngo Q. A., Rajani S., Mayalagu S., Johnson C. S., Capron

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5) Yadegari R., Drews G. N. (2004). Female Gametophyte Development. The Plant

Cell, Vol. 16, S133-S141.

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Figuras Suplementarias

RT-PCR

Fig. S2. Análisis de expresión por RT-PCR, Se corrieron los productos de RT-PCR de los ciclos 26, 30 y 34 de ADXR (X) y de Actina (A). Pm: peso molecular, C: control sin cDNA; A: Control de expresión Actina2; X: expresión de ADXR P1-5: Planta de A. thaliana; Nº de Ciclos 26, 30,34

Fig. S1. Análisis de DNA. Corrida electroforética de 2µl de extracto de DNAg en gel de agarosa, 20µ para P5. P1-5: Planta de A. thaliana