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Brossard , Mailloux CNRHP Dec.2006 IMMUNO-HEMATOLOGIE CHEZ LA FEMME ENCEINTE Incompatibilités Foeto-Maternelles Diagnostic, Suivi, Prévention Actualités 2005-2006 40 èmes journées de Biologie Praticienne

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IMMUNO-HEMATOLOGIE CHEZ LA

FEMME ENCEINTE Incompatibilités Foeto-Maternelles

Diagnostic, Suivi, Prévention

Actualités 2005-2006

40èmes journées de

Biologie Praticienne

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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

• INDICATIONS

1- Adaptation posologique des Ig anti-D chez la femme RHD

négatif enceinte ou accouchée

2- Diagnostic étiologique d’une anémie fœtale ou néonatale, ou

d’une mort fœtale

3- Dépistage et suivi d’une HFM spontanée ou induite par des

gestes obstétricaux (amniocentèse, version par manœuvre

externe, ponction sang fœtal), indépendant du groupe rhésus

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• REACTIFS DISPONIBLES POUR LE TEST DE KLEIHAUER

- SureTech Fœtal hemoglobin , Oxytele

- Labo Moderne

- Techniques maisons (exemple : CNRHP)

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

• TEST DE KLEIHAUER : TEST DE REFERENCE Kleihauer et al , 1957

Test cytochimique sur frottis sanguin fixé à l’éthanol

- Elimination sélective de l’hémoglobine adulte sous l’action d’une solution tampon pH acide, tout en préservant le contenu en hémoglobine fœtale des hématies.

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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

• RESULTAT DU TEST DE KLEIHAUER

Erythrocytes adultes ayant

perdu Hb = formes

cellulaires fantomatiques,

sphériques , incolores

Erythrocytes avec Hb

fœtale fixant phloxine :

rose vif et réfringent

RESULTAT : 500 HF /10 000 HA : soit 250 ml de sang fœtal (gros passage)

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• INCONVENIENTS DU TEST DE KLEIHAUER (1)

Technique souvent décriée

- Technique manuelle, non standardisée, nécessitant un

personnel formé et entraîné

- Difficulté dans le décompte des cellules (grande variation

inter-individuelle)

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

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• MISE EN PLACE EXPERIMENTALE D’UN CONTRÔLE DE QUALITE DU TEST DE KLEIHAUER

Simonet et al, 2002

20 laboratoires participants

1 lame colorée (45 HF /10 000 HA)

72 opérateurs

Grande dispersion des résultats :

- Inter-laboratoire 14 122

- Inter-opérateur 0 140

Difficulté de lecture

Erreur de comptage

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

LAME

(valeur de référence : 45 HF/10000 HA)

0

1

2

3

4

5

6

14 26 44 62 86

Nom

bre

de labora

toires

-1 sd Moyenne +1 sd

Val.Réf.

110 122

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• INCONVENIENTS DU TEST DE KLEIHAUER (2)

Technique souvent décriée

- Difficultés dans l’interprétation des frottis :

Problème des hématies maternelles avec un contenu élevé en HbF

Fcells liés à la grossesse ou hémoglobinopathie

Considérés à tort comme des tests de Kleihauer positifs

Cellules ininterprétables

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

• DIFFICULTES DU KLEIHAUER

NEGATIF POSITIF

ININTERPRETABLES

ININTERPRETABLES

Réaliser un témoin positif et négatif

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• FREQUENCE DES RESULTATS ININTERPRETABLES

Septembre 2005 à Novembre 2006 :

6490 tests de Kleihauer réalisés au CNRHP

NOMBRE FREQUENCE

0 HF /10 000 HA 4899 76 %

< 1 - 273 HF/10 000 HA 1369 21 %

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

Cellules ininterprétables 222 3 %

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• ALTERNATIVE POUR LES KLEIHAUER

ININTERPRETABLES

Réalisation du test Immuno Gold Silver Staining : IGSS

Détection des globules rouges RHD+, en utilisant un anticorps IgG

anti-D et une anti-IgG marquée à l’or colloïdal (GR RHD positif

apparaissent brillants en lumière polarisée )

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

Test long et difficile

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• AUTRES TECHNIQUES DE DETECTIONS ET DE QUANTIFICATION DES HFM

- Technique des rosettes (dépistage)

- Mesure de la consommation en anti-D : (FMH Screening-test sur gel Diamed)

- Techniques de comptage par cytométrie de flux des hématies fœtales immunomarquées :

- anti-HbF

- anti-RHD

- anti-HbF et anti-anhydrase carbonique : (Fetal cell Count Kit,

distribué par Jacques Boy)

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

UNIQUEMENT FEMME RHD NEG

UNIQUEMENT FEMME RHD NEG

UNIQUEMENT FEMME RHD NEG

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• DETECTION ET QUANTIFICATION DES HFM RHD+ CHEZ LA FEMME RHD NEG PAR IMMUNOCYTOMETRIE

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

APPROCHE INTERESSANTE

Utilisation d’un compteur d’hématologie pourvu d’un canal mesurant les réticulocytes par fluorescence

Technique très simple d’Immunomarquage anti-RHD marqué FITC.

Technique validée sur le Cell-Dyn 4000 (Little et al ,2005, Clin. Lab, Haem.)

BUT DU TRAVAIL EN COURS

ADAPTATION de la TECHNIQUE sur le CELL-DYN SAPPHIRE ABBOTT

Confirmation de la Validation technique et validation sur des échantillons cliniques positifs

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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

Aspiration 1

32194

0.102% D+

Aspiration 2

31159

0.112% D+

Aspiration 3

26265 0.098% D+

Aspiration 4

29565 0.118% D+

119183 évènements

131 D+ (0.109%)

CV 8 %

EXEMPLE : Kleihauer à 10 HF/10 000 HA

RHD +

RHD -

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I- VALIDATION TECHNIQUE (gamme sang RHD- enrichi en

hématies fœtales RHD+)

Corrélation Cell-Dyn valeur trouvée / Kleihauer

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

CV = 16 % pour HFM de 24HF/10 000 HA

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

Résultat Cell-Dyn Sapphire

Résu

ltat

kle

ihau

er

r² = 0,9892

Y = 1.070 – 2.272

80 180 280 380 480 580 68080

180

280

380

480

580

680

Résultat Cell-Dyn Sapphire

Résu

ltat

kle

ihau

er

Y = 1.079 – 1.51

r² = 0,9562

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0 10 20 30 40 50 60 70 800

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Cell-Dyn sapphire

Test

de k

leih

au

er

0 50 100 150 200 2500

100

200

300 Slope 1.103 ± 0.05490

Y-intercept when X=0.0 0.3896 ± 4.879

r² 0,9735

N = 13

Cell-Dyn sapphire

Test

de k

leih

au

er

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION

II- Corrélation Celldyn Sapphire / Kleihauer sur des

échantillons cliniques positifs

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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

DETECTION ET QUANTIFICATION PERSPECTIVES

Besoin de Contrôles de qualités internes

Nécessité de Contrôles de qualités externes

Faciliter la formation à la technique de Kleihauer

(réalisation, interprétation et comptage)

Développer des techniques immunocytométriques