Identification des champignons

33
Identification des champignons

Transcript of Identification des champignons

Page 1: Identification des champignons

Identification des champignons

Page 2: Identification des champignons

Identification champignons

Isolement des moisissures

•La plupart des milieux naturels air, sol, eau et matières premières

alimentaires peuvent servir de matériel de départ pour l’isolement des

moisissures.

• Ces échantillons naturels contiennent aussi plusieurs espèces bactériennes

et des levures.

• L’élimination des ces microorganismes pour l’isolement sélectif des

champignons filamenteux est réalisé en combinant le traitement des milieux

de cultures par un antibiotique avec le choix et le contrôle des conditions de

culture.

Page 3: Identification des champignons

Identification champignons

Isolement des moisissures

1. Milieux de culture

• De très nombreux milieux sont utilisables pour la culture des champignons,

certains sont très spécifiques d’un groupe d’espèces, d’autres permettent la

culture de très nombreuses espèces.

• L’aspect cultural des moisissures peut considérablement changer d’un milieu

à l’autre.

• Quelques exemples de milieux de culture: PDA, Sabouraud, Malt agar …..

Page 4: Identification des champignons

Identification champignons

Isolement des moisissures

1. Milieux de culture

Composition milieu PDA (Potato Dextrose Agar)

200g de pomme de terre ; 15g de Dextrose; 20g d’agar; 1L d’eau

distillée

Composition milieu Malt agar

10g Malt; 15g agar ; 1L d’eau distillée

Composition milieu Sabouraud

10g peptone; 20g de glucose; 15g d’agar; 1L d’eau distillée et quelques

vitamines et facteurs de croissance.

Composition milieu Czapek

3g NaNO3; 5g MgSO4,7H2O; 0.5g KCL; 0.01g FeSO4, 7H2O; 1g

K2HPO4; 30g saccharose; 15g agar ; 1L d’eau distillée

Page 5: Identification des champignons

Identification champignons

Isolement des moisissures

2. Addition des antibiotiques

• L’isolement des moisissures est réalisé le plus souvent à partir de

produits contenant, également des bactéries et des levures, donc il est

nécessaire d’employer des inhibiteurs spécifiques pour les détruire.

• L’addition d’antibiotiques aux milieux de cultures est utilisée pour

empêcher le développement des bactéries.

• Les antibiotiques utilisés sont : le chloramphénicol, la gentamycine,

l’oxytétracycline, streptomycine, colistine, novobiocine ou des

colorants (rose Bengale, cristal violet).

• En raison de leur stabilité, la gentamycine et la chloramphénicol

peuvent etres stérilisés avec le milieu et leurs larges spectres d’action

en font des antibiotiques très utilisés.

Page 6: Identification des champignons

Identification champignons

Isolement des moisissures

3. Choix des milieux de cultures sélectifs

• Ces milieux sont utilisés pour la détermination de champignons

appartenant le plus souvent à des genres difficiles à mettre en évidence en

favorisant la croissance de certains genres ou espèces facilitant ainsi leur

caractérisation.

• A titre d’exemple: Aspergillus flavus et Aspergillus Parasiticus isolés sur

milieu Aspergillus flavus et Parasiticus agar (AFPA) qui permet une

caractérisation simple par la couleur jaune orangé de l’envers des colonies.

• Milieu gélose à la créatine (CREA) permet d’identifier par leur apparence

diverses espèces d’Aspergillus, Penicillium.

Page 7: Identification des champignons

Identification champignons

• L’identification des champignons présente est une étape

primordiale.

• Pendant longtemps, cette identification a été uniquement

basée sur l’observation des caractères culturaux et

morphologiques de l’espèce.

• Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de

proposer des outils aidant à faire l’identification en prenant

aussi en compte la séquence de certains gènes d’interèts.

• L’analyse du potentiel métabolique d’une souche fongique

peut aussi apporter des éléments importants permettant

d’orienter l’identification mais aussi de mieux évaluer le risque

lié à son développement (comme la production de

mycotoxines).

Page 8: Identification des champignons

Identification morphologiques

• Pour identifier une espèce fongique, l’analyse morphologique est

indispensable.

• Elle repose sur des critères macroscopiques (aspect des colonies, de

leurs revers, exsudats, production de sclérotes …) et microscopiques

(aspect du mycélium, des spores, des phialides, des conidiophores,

des conidies…).

• Des paramètres culturaux comme la température et la vitesse de

croissance peuvent aussi être pris en compte.

• Plusieurs critères sont à prendre en considération lors de

l’identification morphologiques (macroscopiques et microscopiques).

Identification champignons

Page 9: Identification des champignons

Critères d’identification macroscopique

Sur milieu de culture, les champignons filamenteux forment

des colonies dont l’aspect peut être variable.

• Structure du thalle: les colonies peuvent apparaitre duveteuse,

laineuse, cotonneuse, veloutés, poudreuse ou granuleuse.

• Relief des colonies: les colonies peuvent être plates ou

plissées et leur consistance peut être variable (molle, friable,

élastique ou dure).

• Taille des colonies: après une période d’incubation donnée, on

peut observer de petites colonies (Cladosporium) ou au contraire

des colonies étendues, envahissantes (mucor, rhizopus).

Identification champignons

Page 10: Identification des champignons

Critères d’identification macroscopique

• Couleur des colonies : elle peut aider à identifier le genre

fongique voire même parfois à différencier les différentes

espèces au sein d’un genre. Les couleurs sont variées: blanche,

crème, jaune, orange, noire, violet, vert, bleu…les pigments

peuvent être localisés au niveau du thalle (mycélium,

conidiophores, spores …) ou diffuser dans le milieu de culture.

La couleur du revers de la colonie peut être informative.

• Structure des fructification: la présence ou l’absence au centre

de la colonie, des structures de fructification

sexuée(cléistothèces ….) ou asexué (pycnides ou acervules) est

aussi un élément important de diagnostic.

Identification champignons

Page 11: Identification des champignons

Couleur colonies

Page 12: Identification des champignons
Page 13: Identification des champignons
Page 14: Identification des champignons

Critères d’identification microscopique

l’identification microscopique est réalisé grâce à un étalement

entre lame et lamelle, ou bien en réalisant un scotch test. On utilise

le plus souvent comme liquide de montage du bleu de coton dilué

dans du lactophénol d’Amann.

Un examen généralement réalisé à l’objectif 40, est suffisant pour

mettre en évidence la plupart des élements importants de diagnose.

Identification champignons

Page 15: Identification des champignons

Critères d’identification microscopique

• Thalle: tous les champignons possèdent un appareil

végétatif constitué de filaments (hyphes) qui ensemble

forment le thalle filamenteux ou mycélium ; le thalle peut

étre siphonné ou septé.

Thalle siphonné: constitué d’éléments tubulaires peu

ou pas ramifiés, de diamètre large et irrégulier non

cloisonné (5 à 15µm), non cloisonné est caractéristique

des zygomycètes.

Thalle cloisonné: constitué de filaments de

diamètre étroits ( 2 à 5µm) et régulier, divisé par des

cloisons en articles uni ou pluricellulaire est caractéristique

des ascomycétes, basidiomycètes et deutéromycètes.

Identification champignons

Page 16: Identification des champignons

• Les spores issues de la reproduction asexuée:

l’examen des spores et de leur organisation est

une étape importante de l’identification

fongique. Elles peuvent étre endogènes ou

exogènes :

Les spores endogènes (endospores) sont

produites à l’interieur d’un sac fermé (sporange),

porté par un filament spécialisé

(sporangiophore). Ces spores que l’on observe

par exemple chez les Mucorales, sont libérées

suite à la déchirure de la paroi de sporange à

maturité.

Les spores exogènes (conidies), retrouvées

chez les ascomycètes, basidiomycètes et

deutéromycètes, sont formées à partir d’une

cellule spécialisée (cellule conidiogène).

Critères d’identification microscopique

Identification champignons

Page 17: Identification des champignons

d’après la forme et les modalités de septation, on

distinguer 5 groupes de spores :

1. Les amérospores : spores unicellulaires de petite

taille (Penicillium et Aspergillus)

2.Les didymospores: spores bicellulaires

(Trichothecium)

3. Les phragmospores: spores pluricellulaires à cloison

transversales (Curvularia)

4. Les dictyospores: spores pluricellulaires à cloison

transversales et longtidinales (Alternaria)

5. Les scolécospores: spores étroites, effilées, souvent

incurvées et cloisonnées transversalement

(Fusarium)

Critères d’identification microscopique

Identification champignons

Page 18: Identification des champignons

Critères d’identification microscopique

Les conidies sont en général regroupés à l’extrémité

de la cellule conidiogène. L’organisation de ce

regroupement est aussi un facteur d’identification.

Les principaux types sont :

1. Grappes : Beauveria, Trichothecium

2. Masse: Botrytis

3. Tètes ou glomérules: Acremonium, Trichoderma

4. Chaines basipètes : Scopulariopsis, Aspergillus,

Penicillium

5. Chaines acropètes: Cladosporium, Alternaria

Identification champignons

Page 19: Identification des champignons

Critères d’identification microscopique

a. Regroupées à l’extrémité dilatée du

conidiophore, formant une tète (ex:

Aspergillus).

b. Regroupées en verticille au sommet

du conidiophores, formant un pinceau

(ex: Penicillium).

a. Disposées en verticille le long du

conidiophore (ex: Verticillium).

Identification champignons

Page 20: Identification des champignons

Critères d’identification microscopique

Remarque:

La présence des chlamydospores peut aider à l’identification notamment des

espèces du genre Fusarium.

Ce sont des éléments de résistance, formés à partir du filament mycélien ou à

son extrémité, ayant une paroi épaisse. Contrairement aux autres spores, les

chlamydospores ne possèdent pas de mécanismes de libération permettant

leur dissémination à maturité. Bien qu’elles puissent étre présentes chez

presque toutes les espèces lorsque les conditions défavorables.

Chlamydospores

Identification champignons

Page 21: Identification des champignons
Page 22: Identification des champignons

Identification physiologique

• L’étude de l’impact des paramètres environnementaux sur la croissance

d’une espèce fongique peut aussi apporter des éléments intéressants

d’aide à la diagnose.

• La grande capacité d’adaptation des moisissures fait que ces

paramètres ne peuvent, à eux seuls, permettre l’identification au stade

d’espèce. Cependant, ils peuvent apporter des éléments

complémentaires à une analyse morphologique.

• Les principaux paramètres pouvant influencer la croissance fongique

sont les mêmes que ceux qui influencent la croissance de tout

microorganisme.

Activité de l’eau (Aw)

pH

Présence d’oxygène

Température

Identification champignons

Page 23: Identification des champignons

Identification moléculaire

• Au cours des dernières années, les progrés de la biologie moléculaire ont

été progressivement mis à profit dans l’identification des espèces fongiques.

• Ces méthodes reposent sur l’étude des acides nucléiques (ADN et ARN).

Dans l’immense majorité des cas, l’identification moléculaire nécessite un

isolement préalable des souches (identification de souches pures et non

directement à partir d’un échantillon biologique ou alimentaire).

• Les méthodes les plus utilisées sont basées sur l’amplification par PCR

(Polymerase Chain Reaction) de certaines régions spécifiques et notamment

des Internal Transcribed Spacers (ITS) qui correspondent à des portions

d’ADN ribosomique non transcrite et fortement polymorphe en fonction des

espèces.

Identification champignons

Page 24: Identification des champignons

• Pour l’étude des espèces proches phylogénétiquement, il peut

étre utile d’ajouter l’étude de la séquence d’autres gènes comme

par exemple: la béta tubuline, la calmoduline, ou le mating type

factor ..

• En fonction des genres fongiques, les gènes cibles pour

l’identification d’espèce peuvent varier.

• Ces outils moléculaires sont utiles pour confirmer ou préciser

l’identification des espèces morphologiquement très proches, voire

caractériser de nouvelles espèces.

Identification moléculaire

Identification champignons

Page 25: Identification des champignons

Identification moléculaire

Identification champignons

Page 26: Identification des champignons

Identification moléculaire

Identification champignons

Page 27: Identification des champignons

Identification moléculaire

• Si les techniques classiques d’observations sont longues

imprécises et nécessitent l’expertise d’un mycologue, les

techniques de biologie moléculaire permettent d’obtenir une

identification fiable et représentent la référence en matière

d’identification.

• Cependant, de nouvelles méthodes d’identifications ont émergé

des dernières années, notamment les méthodes spectrales, qui

pourraient être appliquées à l’identification haut débit et peu

couteuse des champignons filamenteux. Ces méthodes

comprennent la spectrométrie de masse MALDI TOF et les

spectroscopies.

Identification champignons

Page 28: Identification des champignons

Identification moléculaire

Spectrométrie de masse MALDI TOF

• La spectrométrie de masse est utilisée en chimie depuis de

nombreuses années mais sa première application à l’identification

bactérienne remonte à 1975.

• La spectrométrie de masse « Matrix Assisted Laser Desorption

Lonisation Time Of Flight = MALDI TOF » est une technique couplant

une source d’ionisation laser assistée par une matrice et un analyseur à

temps de vol.

• Le principe se base sur l’ionisation des protéines fongiques par un

rayon laser et la création des pics caractéristiques (spectre). À partir

d’une base de données de spectres, le logiciel associé recherche la

correspondance à l’espèce de champignon selon un indice de fiabilité

entre les deux spectres.

.

Identification champignons

Page 29: Identification des champignons

Identification moléculaire

Spectrométrie de masse MALDI TOF

• L’instrument est composé de trois éléments fonctionnels :

Une source d’ionisation pour transférer les ions moléculaires de

l’échantillon dans l’analyseur.

Un analyseur de masse pour séparer les ions en fonction de leur ratio

masse / charge.

Un détecteur.

.

Identification champignons

Page 30: Identification des champignons

Identification moléculaire

Page 31: Identification des champignons

Identification moléculaire

Spectrométrie de masse MALDI TOF

• La plupart des microorganismes peuvent étre analysés sans lyse

cellulaire préalable car l’exposition à l’acidité de la matrice permet

de lyser les cellules.

• Cependant, certains organismes comme les champignons

filamenteux ayant une paroi épaisse et résistante, il est préférable

de passer par une étape d’extraction avant l’analyse par

spectrométrie de masse.

Identification champignons

Page 32: Identification des champignons

Identification moléculaire

Spectrométrie de masse MALDI TOF

• La matrice va absorber l’énergie du laser conduisant à la désorption des

échantillons qui sont ainsi ionisés et propulsés dans l’analyseur TOF, un

tube de métal sous vide, dans lequel les ions vont être séparés en

fonction de leur ratio m/z, avant d’atteindre le détecteur..

• Chaque pic du spectre de masse correspondra ainsi à un rapport m/z et

la hauteur du pic sera proportionnelle au nombre d’ions de même m/z

ayant atteint le détecteur.

• La spectrométrie de masse MALDI TOF est une technique rapide,

répétable et peu couteuse en terme de cout d’analyse par échantillon, et

elle permet de générer es spectres de masse caractéristiques via la

détection des protéines ribosomales dont l’expression est abondante,

constante et bien conservée d’une espèce à l’autre, ce qui en fait une

candidate idéale pour l’identification microbienne.

Identification champignons

Page 33: Identification des champignons

Identification moléculaire