BACTÉRIOLOGIE DES EAUX

planI. Les méthode générales de prélèvement

et analysesII. Dénombrement des germes témoignant

d’une pollution fécale:II.1 Coliformes totauxII.2 Coliformes fécauxII.3 Streptocoques fécauxII.4 Clostridium sulfito-réducteursII.5 BactériophageIII. Recherche et dénobrement des germes

pathogènesIV. Principaux maladies à transmission

hydrique

INTRODUCTION L’objectif de l’analyse bactériologiqued’une eaux n’est pas d’effectuer un inventairede toutes les espèces présentes, mais derechercher soit celle qui sont susceptibles d’etrepathogènes, soit celles qui sont indicatrices decontamination fécales. L’analyse débute par l’acte de prélèvement quidoit mettre en œuvre des méthodes assurantl’absence de contamination et la surviebactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodesgénérales d’examen bactériologique des eaux suiviesdes recherches de bactéries indicatrices de pollutionet d’éfficacitée de traitement puis des bactériesspécifiques pathogènes

I.I méthodes de prélèvement

Matériel de prélèvement : flacon en verre (borosilicaté de préférence)

de 250 à 1000 ml. flacon en plastique à usage unique stérilisés

par le fabriquant.Appareils de prélèvement :

Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en cas de prélèvement d‘eau un puits, au centre d’un cours d’eau, en profondeur dans un lac, on doit utiliser des appareils tel que le plongeur et la canne à prélèvement.

plongeur Canne à prélèvement

En fonction de la nature des eaux analysées et celle des micro-organismes recherchés, les normes fixent des conditions à respecter (volume de l’échantillon, agent neutralisant, qualité du matériel d’échantillonnage…..)

L’objectif est d’obtenir un échantillon aussi représentatif que possible de l’eau à examiner, sans contaminer ni modifié l’échantillon.

Des précautions doivent être prises à trois niveau:

Le matériel de prélèvement Le mode de prélèvementLe transport la conservation des échantillon

Mode de prélèvement

Méthodes générales de dénombrement

en milieu solide En milieu liquide

Méthode par incorporation

Méthode par étalement

Méthode par filtration

Méthode de détermination du

nombre le plus probable (PPN)

Méthodes en milieu solide

Méthode par incorporation:

Principe:L’échantillon d’eau à analyser est mélanger au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi une à T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées.

Mode opératoire

.

1) volume d'eau à ensemencer ( 1 ml)

3)faire un mouvement de rotation

2) Incorporer le milieu en surfusion

Incuber

Faire le dénombrement

méthode par étalement

Principe:L’échantillon d’eau à analyser est

étaler à laSurface d’un milieu gélose sans traced’humidité: après incubation, les

colonies quise développent à la surface sontdénombrées.

Mode opératoire

Etaleur stérile (râteau)

Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml

Incuber

Dénombrer les colonies développer à la surface

Méthode par filtration

Principe:L’échantillon d’eau à analyser est filtré

àTravers une membrane qui retient les

microorganisme. La membrane est ensuite

placéesur un milieu gélosé. Durant

l’incubation, descolonies se forment à la surface de lamembrane

Mode opératoire

Technique de dénombrement en milieu liquide

Principe générale:Les prise d’essais de l’échantillon d’eau ou de sesDilution sont incorporées dans un milieu liquide

conçuPour permettre la croissance d’un micro-

organismeou de groupe de microorganismes. la croissance

setraduit par l’apparition d’un trouble du milieu et,éventuellement, une modification visible ( virage

d’unindicateur de pH coloré)

Méthode du nombre le plus probable

Principe: Cette méthode est une estimation statistique dunombre de micro-organisme supposés distribués dansl’eau de manière parfaitement aléatoire. L’estimationde la densité bactérienne est obtenue parapplication du principe de vraisemblance, à partir deréponses positives observées pour une ou plusieursdilution successives de la suspension bactérienneoriginelle. Il s’agit d’une méthode quantique et nonpas énumératif.

Mode opératoire On ensemence des dilutions successives de l’eau

à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en micro plaque).

On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-organisme.

Il doit être tenu compte que si l’absence de culture correspond à l’absence de micro-organisme, plus d’un micro-organisme peut être responsable d’une culture positive.

Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance).

Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécaleNotion d’indicateur comme l’origine de la plupart des micro-organismespathogènes véhiculés par l’eau est fécale,le principe du contrôle de la qualité de l’eau reposesur la démonstration que l’eau distribuée ne contientpas de germes provenant de contamination fécale.Pour cela, on recherche des indicateurs de contaminationfécale, appelés aussi germes témoins de contaminationfécale. On parle également d’indicateurs de traitement

quipermettent d’évaluer l’efficacité des différents

traitementsDe potabilisation mis en œuvre vis-à-vis de différentsgermes.

Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature :

Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et l’apparition d’infection dans une population.

Ecologique : il doit être spécifique d’une contamination fécale : systématiquement rencontré lorsqu’il y a présence de féces d’animaux à sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollués. Il doit être sensible : il doit être mis en évidence dans l’eau lorsque des pathogènes sont présents, et ce en grand nombre.

Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans l’eau.

Technique : il doit être facile et rapide à détecter, et ce, à moindre cout.

Dénombrement des micro-organismes revivifiables

Définition:On entend par microorganismes : Bactéries,

Levures,Moisissures se développant en aérobiose,

lorsque l’essaiest effectué selon la méthode spécifiée.Le principe consiste à mettre en évidence les

bactéries Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les

germes spécifiques de l’eau. Et celles qui se développent à 37°C favorisant

ainsi les germes issus de l’homme et des animaux à sang chaud.

dans les milieux de très bonne qualité microbiologique pour contrôler une possible contamination bactérienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrôlées.

Dans l’usine de potabilisation, il permet de contrôler l’efficacité des différentes étapes du traitement.

dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne après la station de traitement peut être le signe d’une multiplication bactérienne dans le réseau ou d’une intrusion de bactéries à l’intérieur de celui-ci.

Dans les réservoirs et châteaux d’eau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualité de l’eau et sur la reviviscence des germes

Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux

Définitions:Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non

sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C.

Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes d’origine fécale stricte :

Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia.

Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena.

Intérêt: la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C :intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une contamination fécale surecoliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe l’existence quasi certaine de la contamination fécale.La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux.

Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux ou entérocoque

Définition : bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes,formant des chainettes, non sporulées,

catalasenégative, possédant l’antigène D, cultivant enanaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capablesd’hydrolyser l’esculine en présence de bile.Ils se répartissent en deux genres : streptococcus et enterococcus.

Intérêt: les entéroques sont plus résistant que les

coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau plus ancienne.

La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale d’une eau.

Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés.

Recherche et dénombrement des spores des bactéries sulfito-

réductrices et clostridium sulfito-réducteurs

Définitions:Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices :formes de résistance de micro-organismes sedéveloppant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou48h en gélose viande foie et donnant des coloniestypiques réduisant le sulfite de sodium.

Spores de clostridium sulfitoréducteurs : mêmedéfinition que la précédente pour des bacilles à

Grampositif, ne possédant pas de catalase et ayantl’aspect morphologique des clostridium.

Intérêt: ils ne sont pas tous des indicateurs de

contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste.

L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection.

Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium.

III. Méthode de recherche et Dénombrement des germes témoignant d’une pollution

fécale:analyse technique Volume

de PE Milieu utilisé

T d’incubation

confirmation

µ-organismerevivifiables

Incorporation en milieu liquide

1 ml Gélose à l’extrait de levure

37° OU 20° C -

Coliformes totaux

filtration 100 ml Gélose lactosée au TTC

37° C Colonies typiqueOX-

Coliformes fécaux

filtration 100 ml Gélose lactosée au TTC

44° C Colonies typique

StreptocoqueDu Gr D

filtration 100 ml Gélose Slanetz et bartley

37° C Colonies typiques +Litsky

Colistridiums sulfito-réducteurs

Incorporation en milieu solide

20 ml Gélose tryptome sulfite à la D- cyclosérine

37 ° C Colomies typique

IV. Recherche des bactéries pathogènesIV.1 Recherche de salmonellaDéfinition:

Des bacille Gram négatifs (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48

h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir.

Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques.

Méthode de recherche

Pré-enrichissement

Enrichissement primaire

Enrichissement secondaire

Lecture et interprétation : Repérer les colonies caractéristiques. Faire une identification biochimique

basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC…

Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de référence.

Recherche de vibrion cholérique

Définition: Bacille Gram négatif droits ou

incurvés, Très mobiles, Oxydase (+), AAF, Fermentant le glucose sans

production de gaz ni d'H2S, Hautement pathogènes.

Méthode de recherche

Recherche de Staphylocoques à coagulase positive :

Définition: Cocci à Gram (+) Isolées ou en grappes de raisin, Catalase (+) et coagulase (+) (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un

milieu sélectif Chapman au mannitol.

L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée.

Méthode de recherche

Recherche de Pseudomonas aérogénosa

Définition: Un bacille Gram négatif Oxydase (+) Capable de produire de l’ammoniac

à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est

également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.

 

Méthode de recherche

Critères microbiologiques d’une eau potable

Les principales maladies à transmission hydrique