UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER U.F.R. Sciences de la vie

THESE

en vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III

Ecole Doctorale Biologie, Santé et Biotechnologies de Toulouse

Spécialité : Physiopathologie Moléculaire, Cellulaire et intégrée

présentée et soutenue publiquement le 05 octobre 2007

par

Elise GUILLOD-MAXIMIN

SENSIBILITE AU GLUCOSE DU CERVEAU CHEZ LE RAT

Implication de l’hypothalamus

Détermination des acteurs cellulaires et moléculaires

Membres du jury :

Pr. Frances B. Pr. Hévor T. Pr. Moyse E. Dr. Lavialle M. Dr. Lorsignol A. Dr. Pénicaud L.

Président Rapporteur Rapporteur Examinatrice Examinatrice Directeur de thèse

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Remerciements Voilà, mes études s’achèvent enfin. Je dois avouer qu’une étoile devait se trouver au-dessus de ma tête le jour de ma naissance ! En effet, un petit stage de « neuro » qui m’a permis d’appréhender le monde de la recherche au sein du laboratoire du Pr. Hévor à Orléans m’amena en DEA auprès du Dr. Pénicaud, directeur de l’UMR5018. Merci Luc de m’avoir donné cette chance. Je remercie les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail, notamment Messieurs les Pr. Hévor et Moyse qui m’ont fait l’honneur d’en être les rapporteurs. Le Dr. Lorsignol s’est chargée de ma formation. De tout cœur Anne, merci pour ton encadrement. J’ai adoré ta rigueur, que ce soit à la paillasse ou au bureau. Aujourd’hui, j’utilise encore cette façon de faire et je ne pense pas en changer. Je regrette seulement de n’avoir pas pu être témoin de ton ventre rond. Grâce à Anne et Luc, j’ai pu effectuer cette thèse, continuer mes travaux et ainsi répondre aux questions qui me turlupinaient (bizarre ce mannitol…). Votre franchise et soutien sont des qualités que j’apprécie beaucoup. Je n’oublie pas le reste de l’équipe toulousaine. Son ambiance me manque et voir l’écriture de mon cher petit Alaing sur un certain colis arrivé à Orsay, m’a serré le cœur. Par peur d’oublier quelqu’un, je vais choisir la facilité en faisant un tir groupé, mais sincère, de merci à toutes les personnes qui m’ont aidée de près ou de loin, niveau manips et niveau moral. Sachez que je pense souvent à vous, à nos discussions autour du café ou le midi dans la salle de réunion. Naturellement, mes pensées se tournent aussi vers ma famille et Yvan, devenu mon mari en cours de route. Il y a longtemps, alors que j’étais collégienne, je disais à mon père que je souhaitais faire de la recherche sur les cétacés (période du film Le Grand Bleu oblige). Il m’avait alors répondu : « Tu rêves ma petite fille ! On habite à Mareau-aux-prés ! ». Eh bien tu vois Papa, j’y suis quand même arrivée ! Enfin pour les dauphins c’est râté, et le poisson ne m’a pas attirée : indigne fille de pêcheur ! Ma mère a été très importante, si ce n’est essentielle, dans le choix de ma voie. En effet, elle m’a toujours poussée à faire un travail qui me plaisait, car comme elle me le répétait souvent, rien est pire que de passer ses journées au boulot à déprimer. Or, la recherche est un métier de passion qui promet de ne pas être de tout repos ! Bien sûr, mon parcours d’étudiante n’a pas été toujours rose. Merci Yvan de m’avoir suivie partout en France, supportée mes crises de nerfs et aidée à redresser la tête dans les périodes de doutes. Et dire que tu m’as attrappée à la sortie du lycée pour ne plus me lâcher ! Finalement, l’histoire s’est achevée sur un succès au concours d’ingénieur d’études de l’INRA, ce qui m’amène aux joyeux Guillod, Aline et Roland, que je remercie chaleureusement pour leur coaching de choc ! Et me voilà parisienne !

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Les travaux présentés dans cette thèse ont fait l’objet de

Publications :

Pénicaud L, Leloup C, Lorsignol A, Alquier T, Guillod E Brain glucose sensing mechanism and glucose homeostasis Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2002, 5:539-543 Guillod-Maximin E, Lorsignol A, Alquier T, Pénicaud L Acute intracarotid glucose injection towards the brain induces specific c-fos activation in hypothalamic nuclei: involvement of astrocytes in cerebral glucose-sensing in rats Journal of Neuroendocrinology, 2004, 16:464-471 Pénicaud L, Bénani A, Fioramonti X, Alquier T, Guillod E, Lorsignol A, Leloup C Détecteurs de glucose et régulation de la prise alimentaire Cah. Nutr. Diét., 2007, 42(3) :134-138

Communications affichées :

Guillod-Maximin E, Lorsignol A, Pénicaud L (poster p369) Characterization of hypothalamic cells activated by a transient central hyperglycaemia using c-Fos 3rd Forum of European Neuroscience, Paris, Juillet 2002 Guillod-Maximin E, Lorsignol A, Pénicaud L (poster p389) Mechanism of acute cerebral hyperglycaemia-induced peripheral insulin secretion in the rat : glucokinase implication 4th Forum of European Neuroscience, Lisbonne, Portugal, Juillet 2004 Communication orale : Guillod-Maximin E Sensibilité au glucose du cerveau chez le rat IFR31 (CHU Rangueil), Toulouse, Mai 2004

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Liste des abréviations

AGL : acides gras libres

AgRP : agouti-related peptide

α-MSH : alpha-melanocyte-stimulating hormone

AMPK : AMP-activated protein kinase

BDNF : brain-derived neurotrophic factor

BHE : barrière hémato-encéphalique

BSO : buthionine sulfoximine

CART : cocaine- and amphetamine-regulated transcript

CC : cortex cérébral

CCK : cholécystokinine

CNPase : 2’, 3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase

CRH : corticotropin-releasing hormone

DAB : diaminobenzidine

Δ : différence de concentrations par rapport à la valeur basale au temps zéro

DMN : noyau hypothalamique dorsomédian

DMV : noyau dorsal moteur du vague

2-DG : 2-déoxyglucose

GABA : γ-aminobutyric acid

GE : gluco-excité

GI : gluco-inhibé

GFAP : glial fibrillary acidic protein

GFAT : glutamine fructose-6-phosphate aminotransférase

GK : glucokinase

GlcN : glucosamine

GlcNAc : N-acétylglucosamine

GLP-1 : glucagon-like peptide-1

[glucose]e : concentration extracellulaire en glucose

GLUT : transporteur de glucose

GS : glutamine synthase

H + L : heavy and light chains

IgG : immunoglobuline G

IRS : insulin receptor substrate

IVGTT : intravenous glucose-tolerance test

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JAK : Janus kinase

Kir : inwardly rectifying K+ channel

Km : constante de Michaelis

LH : hypothalamus latéral

MCH : melanin-concentrating hormone

μU : micro-unité

MSO : L-méthionine sulfoximine

NA : noyau arqué

NaCl : Chlorure de sodium

NeuN : neuronal nuclei

NGS : Normal Goat Serum

NPY : neuropeptide Y

NTS : noyau du tractus solitaire

Ob-R : récepteur à la leptine

PBS : Phosphate-Buffered Saline

PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase

PIP2 : phosphatidylinositol (4,5)-biphosphate

PIP3 : phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate

POMC : pro-opiomélanocortine

PVN : noyau hypothalamique paraventriculaire

PYY : peptide YY

SNA : système nerveux autonome

SNC : système nerveux central

SUR : sulfonylurea receptor

TRH : thyrotropin-releasing hormone

VMN : noyau hypothalamique ventromédian

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Liste des tableaux et figures

Tableau 1 : Neurotransmetteurs principaux impliqués dans la régulation de la prise alimentaire p.26 Tableau 2 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal de 18 heures de méthionine sulfoximine sur un test de tolérance au glucose p.105 Figure 1 : Illustration de l’homéostasie énergétique p.13 Figure 2 : Interactions établies entre les organes périphériques et le système nerveux central p.14 Figure 3 : Lieu de synthèse et action des principales hormones jouant sur l’homéostasie énergétique p.15 Figure 4 : Les différents effets de la leptine selon le tissu cible p.16 Figure 5 : Reflet de l’état énergétique d’un individu par sa leptinémie p.17 Figure 6 : Sécrétion de l’insuline en réponse au glucose par les cellules β du pancréas p.18 Figure 7 : Effets de l’insuline p.20 Figure 8 : Effets du système nerveux autonome sur l’homéostasie énergétique p.22 Figure 9 : Demi-coupes du cerveau d’un rat p.25 Figure 10 : Localisation des neurones hypothalamiques synthétisant les neuropeptides majeurs impliqués dans l’homéostasie énergétique p.32 Figure 11 : Intégration des signaux d’adiposité au niveau du noyau arqué p.33 Figure 12 : Modèle d’intégration GABA-ergique dans le noyau hypothalamique paraventriculaire des signaux neuropeptidergiques en provenance du noyau arqué p.35 Figure 13 : Connexions nerveuses intrahypothalamiques, impliquées dans l’homéostasie énergétique p.36 Figure 14 : Illustration de la boucle de contrôle existant entre les organes périphériques et le cerveau p.38 Figure 15 : Dialogue entre les voies de signalisation générées par la liaison de l’insuline et de la leptine à leur récepteur p.40 Figure 16 : Régulation de l’activité de l’AMPK du noyau arqué et du noyau hypothalamique paraventriculaire par les signaux hormonaux et le statut énergétique de l’organisme p.41 Figure 17 : Régulation de l’expression des neuropeptides par la leptine et l’insuline p.42

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Figure 18 : Suggestion de mécanisme de régulation des canaux potassiques ATP-dépendants par la leptine, l’insuline et l’acide oléique p.46 Figure 19 : Effets des acides gras libres indépendants des hormones p.47 Figure 20 : Mécanismes de régulation mis en place suite à l’hyperglycémie post-prandiale p.49 Figure 21 : Voie des hexosamines p.51 Figure 22 : la voie des hexosamines au carrefour des métabolismes des différents types de nutriments, au travers de l’UDP-N-acétylglucosamine p.52 Figure 23 : Détection des variations glycémiques par le système nerveux central p.53 Figure 24 : Effet du glucose sur l’activité électrique de neurones du noyau arqué p.56 Figure 25 : Effets d’une hypoglycémie sur certains neurones hypothalamiques et influence de neuropeptides sur les neurones gluco-excités p.57 Figure 26 : Fonctions principales de l’astrocyte p.58 Figure 27 : Schéma du couplage astrocyte-neurone p.59 Figure 28 : Schéma illustrant la sensibilité au glucose dans les cellules nerveuses, comprenant les deux protéines-clé, GLUT2 et GK p.64 Figure 29 : Système de perfusion pour la fixation intracardiaque/intracarotidienne p.72 Figure 30 : Variation de la glycémie et de l’insulinémie suite à l’injection intracarotidienne vers le cerveau de sérum physiologique, de D-glucose ou de L-glucose p.81 Figure 31 : Variation de l’insulinémie suite à une deuxième injection de D-glucose (10 min après la première) p.82 Figure 32 : Variation de l’insulinémie après prétraitement à l’atropine méthylnitrate ou à l’oxymétazoline, en réponse à l’injection vers le cerveau de D-glucose p.83 Figure 33 : Validation de la technique utilisant l’immunohistochimie anti-c-Fos : effet d’une injection intrapéritonéale de 2-déoxyglucose versus une injection de sérum physiologique, sur l’expression de c-Fos p.84 Figure 34 : Validation de la technique utilisant l’immunohistochimie anti-c-Fos suite à l’injection de 2-déoxyglucose : spécificité du marquage p.85 Figure 35 : Effet de l’injection de D-glucose vers le cerveau sur l’expression de c-Fos dans différentes régions hypothalamiques p.86

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Figure 36 : Caractérisation des cellules immunopositives pour c-Fos suite à l’injection de D-glucose vers le cerveau : double immunohistochimie c-Fos/marqueur cellulaire p.88 Figure 37 : Effet du glucose sur les astrocytes des noyaux arqué et hypothalamique paraventriculaire p.89 Figure 38 : Boucle de contrôle mise en place entre la détection cérébrale du glucose et la sécrétion d’insuline par le pancréas p.98 Figure 39 : Schéma hypothétique de l’action de la méthionine sulfoximine sur le couplage astrocyte-neurone p.99 Figure 40 : Variation de la quantité de glycogène dans le foie et le système nerveux central suite à un prétraitement à la méthionine sulfoximine p.101 Figure 41 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal à la méthionine sulfoximine sur l’expression de c-Fos induite par l’injection de D-glucose vers le cerveau p.102 Figure 42 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal à la méthionine sulfoximine sur la sécrétion d’insuline induite par l’injection de D-glucose vers le cerveau p.104 Figure 43 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal à la buthionine sulfoximine versus à la méthionine sulfoximine sur la sécrétion d’insuline induite par l’injection de D-glucose vers le cerveau, ainsi que sur la glycémie p.107 Figure 44 : Effet de l’injection intracarotidienne vers le cerveau de glucosamine sur la sécrétion d’insuline induite par celle simultanée de D-glucose p.113 Figure 45 : Effet de l’injection par voie intracarotidienne vers le cerveau de glucosamine sur un test de tolérance au glucose : effet sur la glycémie et sur l’insulinémie p.114 Figure 46 : Effet de l’injection intracarotidienne vers le cerveau de N-acétylglucosamine sur la sécrétion d’insuline induite par celle simultanée de D-glucose p.116 Figure 47 : Effet de l’injection intracarotidienne vers le cerveau d’alloxane au temps 0 sur la sécrétion d’insuline induite par celle simultanée de D-glucose p.117 Figure 48 : Effet d’une pré-injection par voie intracarotidienne vers le cerveau d’alloxane sur la sécrétion d’insuline induite par l’injection de D-glucose p.118 Figure 49 : Effets de la glucosamine sur la glucokinase et la voie des hexosamines, qui est aussi capable d’incorporer la N-acétylglucosamine p.121 Figure 50 : Détection d’une hyperglycémie cérébrale impliquant les astrocytes du noyau arqué et la glucokinase p.126

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Table des matières

IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN ____________________________________________________________ - 12 -

I – HOMEOSTASIE ENERGETIQUE _______________________________________________ - 13 - 1. GENERALITES ______________________________________________________________ - 13 - 2. ACTEURS HORMONAUX REGULANT L’HOMEOSTASIE ENERGETIQUE _________________ - 14 - 2.1. La leptine_______________________________________________________________ - 15 - 2.2. L’insuline _______________________________________________________________ - 18 - 3. REGULATION NERVEUSE DE L’HOMEOSTASIE ENERGETIQUE ______________________ - 21 - 3.1. Régulation par le système nerveux autonome ____________________________ - 21 - 3.2. Régulation par le système nerveux central _______________________________ - 23 - II – HYPOTHALAMUS ET METABOLISME ENERGETIQUE ____________________________ - 26 - 1. NEUROPEPTIDES PARTICULIERS_______________________________________________ - 26 - 1.1. Les neuropeptides orexigènes____________________________________________ - 27 - 1.1.1. Le neuropeptide Y (NPY) _______________________________________________ - 27 - 1.1.2. L’AgRP (Agouti-Related Peptide)________________________________________ - 28 - 1.1.3. La MCH (Melanin-Concentrating Hormone)_____________________________ - 29 - 1.1.4. Les orexines (hypocrétines) ____________________________________________ - 29 - 1.2. Les neuropeptides anorexigènes _________________________________________ - 30 - 1.2.1. L’α-MSH (alpha-melanocyte-stimulating hormone)______________________ - 30 - 1.2.2. Le CART (Cocaine- and Amphetamine-Regulated Transcript) ____________ - 30 - 2. ROLE MAJEUR DU NOYAU ARQUE______________________________________________ - 32 - 3. CONNEXIONS INTRAHYPOTHALAMIQUES ________________________________________ - 34 - 4. CONNEXIONS EXTRAHYPOTHALAMIQUES EN DIRECTION DU TRONC CEREBRAL _______ - 37 - III – SENSIBILITE HYPOTHALAMIQUE AUX INFORMATIONS METABOLIQUES ___________ - 39 - 1. SENSIBILITE AUX HORMONES _________________________________________________ - 39 - 1.1. Signalisation cérébrale de la leptine______________________________________ - 41 - 1.2. Signalisation cérébrale de l’insuline______________________________________ - 43 - 2. SENSIBILITE AUX METABOLITES _______________________________________________ - 44 - 2.1. Les acides gras__________________________________________________________ - 45 - 2.2. Le glucose______________________________________________________________ - 48 - 2.2.1. Généralités sur l’homéostasie glucidique _______________________________ - 48 - 2.2.2. Une voie annexe suivie par le glucose : la voie des hexosamines _________ - 50 - 2.2.3. L’hypothalamus, siège de la sensibilité cérébrale au glucose ____________ - 52 - 2.2.4. Acteurs cellulaires impliqués dans la détection du glucose ______________ - 55 - 2.2.5. Acteurs moléculaires __________________________________________________ - 60 - IV – NOS OBJECTIFS ET DEMARCHES SCIENTIFIQUES _____________________________ - 66 - 1. NOTRE MODELE D’HYPERGLYCEMIE CEREBRALE ________________________________ - 66 - 2. LE PROTO-ONCOGENE C-FOS _________________________________________________ - 67 - 3. OUTILS PHARMACOLOGIQUES_________________________________________________ - 67 -

MMAATTEERRIIEELLSS EETT MMEETTHHOODDEESS________________________________________________ - 69 -

V – ANIMAUX_________________________________________________________________ - 70 -

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VI – ETUDE DE L’ACTIVATION CEREBRALE _______________________________________ - 70 - 1. VALIDATION DE LA TECHNIQUE FOS : INJECTION DE 2-DEOXYGLUCOSE ____________ - 70 - 2. MICROCHIRURGIE : POSE D’UN CATHETER « A DEMEURE » DANS LA CAROTIDE _______ - 70 - 3. PROTOCOLES D’INJECTION ___________________________________________________ - 71 - 4. FIXATION INTRACAROTIDIENNE ET INTRACARDIAQUE _____________________________ - 71 - 5. IMMUNOHISTOCHIMIE C-FOS _________________________________________________ - 72 - 6. DOUBLE IMMUNOHISTOCHIMIE C-FOS / MARQUEUR CELLULAIRE__________________ - 73 - 7. QUANTIFICATION DES NOYAUX IMMUNOPOSITIFS POUR C-FOS ET DES CELLULES DOUBLEMENT IMMUNOPOSITIVES C-FOS / GFAP __________________________________ - 74 - 8. EXPRESSION DES RESULTATS_________________________________________________ - 74 - VII – ETUDE DE LA REGULATION NERVEUSE DE LA SECRETION D’INSULINE __________ - 75 - 1. MICROCHIRURGIE : POSE D’UN CATHETER DANS LA CAROTIDE_____________________ - 75 - 2. PROTOCOLES D’INJECTION ___________________________________________________ - 75 - 3. TEST DE TOLERANCE AU GLUCOSE (IVGTT) ____________________________________ - 76 - 4. PRELEVEMENTS SANGUINS ___________________________________________________ - 76 - 5. DOSAGES__________________________________________________________________ - 77 - 6. EXPRESSION DES RESULTATS_________________________________________________ - 77 - VIII – METHIONINE SULFOXIMINE : DOSAGE DU GLYCOGENE CEREBRAL_____________ - 77 - IX – ANALYSES STATISTIQUES__________________________________________________ - 78 -

RREESSUULLTTAATTSS ________________________________________________________________ - 79 -

X – CARACTERISATION DE LA SENSIBILITE AU GLUCOSE ___________________________ - 80 - 1. RESULTATS I _______________________________________________________________ - 80 - 1.1. Mise en place et validation des modèles expérimentaux ___________________ - 80 - 1.1.1. Injection(s) aiguë(s) de glucose vers le système nerveux central : effets sur la glycémie et l’insulinémie _____________________________________________________ - 80 - 1.1.2. Mise en évidence des voies nerveuses impliquées _______________________ - 82 - 1.1.3. Validation de la technique immunohistochimique dirigée contre l’antigène c-Fos _______________________________________________________________________ - 84 - 1.2. Régions hypothalamiques activées par l’injection intracarotidienne de glucose _____________________________________________________________________________ - 86 - 1.3. Types cellulaires activés _________________________________________________ - 87 - 2. DISCUSSION I ______________________________________________________________ - 89 - 2.1. Réponse hormonale périphérique ________________________________________ - 89 - 2.2. Réponse hypothalamique________________________________________________ - 92 - 2.3. Réponses cellulaires ____________________________________________________ - 95 - XI – IMPLICATION DES ASTROCYTES DANS LA SENSIBILITE AU GLUCOSE_____________ - 99 - 1. RESULTATS II _____________________________________________________________ - 100 - 1.1. Validation de l’utilisation de la méthionine sulfoximine __________________ - 100 - 1.2. Conséquences de l’arrêt du métabolisme astrocytaire des carbohydrates_______________________________________________________________- 101 - 1.2.1. sur l’activation cérébrale induite par le bolus intracarotidien de glucose - 101 - 1.2.2. sur la sécrétion d’insuline ____________________________________________ - 103 - 1.3. Spécificité de la méthionine sulfoximine_________________________________ - 105 - 1.3.1. Effet uniquement cérébral ou aussi périphérique ? ____________________ - 105 - 1.3.2. Effet spécifique à l’inhibition de la glutamine synthase ? _______________ - 106 -

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2. DISCUSSION II ____________________________________________________________ - 108 - XII – ACTEURS MOLECULAIRES IMPLIQUES DANS LA SENSIBILITE CEREBRALE AU GLUCOSE _____________________________________________________________________________- 112 - 1. RESULTATS III_____________________________________________________________ - 112 - 1.1. Etude de l’implication de la glucokinase_________________________________ - 112 - 1.1.1. Effet de la glucosamine sur la sécrétion d’insuline _____________________ - 112 - 1.1.2. Effet cérébral et non périphérique de la glucosamine __________________ - 113 - 1.1.3. Effet spécifique à l’inhibition de la glucokinase ? ______________________ - 115 - 1.2. Etude de l’implication du couple glucokinase/GLUT2____________________ - 116 - 1.2.1. Injection de l’alloxane au temps zéro __________________________________ - 116 - 1.2.2. Injection de l’alloxane au temps -10 minutes __________________________ - 117 - 2. DISCUSSION III ____________________________________________________________ - 119 -

CCOONNCCLLUUSSIIOONNSS EETT PPEERRSSPPEECCTTIIVVEESS ________________________________________ - 124 -

AARRTTIICCLLEE EETT RREEVVUUEESS PPUUBBLLIIEESS____________________________________________ - 131 -

RREEFFEERREENNCCEESS BBIIBBLLIIOOGGRRAAPPHHIIQQUUEESS _______________________________________ - 147 -

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IInnttrroodduuccttiioonn

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I – Homéostasie énergétique

1. Généralités

L’homéostasie énergétique est un état d’équilibre dynamique entre les

dépenses et les apports d’énergie, permettant le maintien de la stabilité du milieu

interne d’un organisme (Campbell NA, 1995). Les dépenses résultent

principalement de l’activité physique et du métabolisme basal, tandis que les

apports trouvent leur origine dans l’alimentation (Figure 1).

Par la tenue de cet équilibre, un individu conserve et défend un poids

corporel stable, compris dans un intervalle dont les limites inférieure et supérieure

seraient génétiquement définies. En cas d’éloignement au-dessus ou en-dessous de

cette fourchette, tout un système de régulations se met en place afin d’y revenir

(Woods SC et coll., 2004).

Figure 1 : Illustration de l’homéostasie énergétique

L’homéostasie énergétique est contrôlée et régulée à plusieurs niveaux.

Schématiquement, il existe un dialogue entre la périphérie et le système nerveux

central (SNC), faisant intervenir des signaux complémentaires et en perpétuelle

interaction, de natures hormonale, métabolique ou nerveuse (Broberger C, 2005).

Notons que cet équilibre est également sous l’influence de facteurs indépendants au

métabolisme de l’organisme comme par exemple les phénomènes sociaux, cognitifs

ou, d’une manière plus générale, l’environnement. Ils sont importants, notamment

chez l’Homme, mais difficilement contrôlables ou mesurables (Berthoud HR, 2004)

(Figure 2).

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Figure 2 : Interactions établies entre les organes périphériques et le système nerveux central (SNC) ; CCK : cholécystokinine

A court terme, c'est-à-dire sur un seul repas, l’apport énergétique est

déterminé par la taille de ce dernier et sa valeur calorique. La boucle de régulation

entre la périphérie et le SNC aboutira à un signal de satiété, issu du tractus

digestif, normalement suivi d’un arrêt de la prise alimentaire chez un individu

normorégulé (Woods SC, 2005). Mais l’homéostasie énergétique ne se mesure pas

sur un unique repas, ni même sur une journée. Elle se réalise sur une plus longue

période comptant quelques jours. Ainsi, il est nécessaire de considérer une

régulation à plus long terme mettant en jeu des phénomènes de stockage et de

mobilisation des réserves (Schwartz MW et coll., 2000).

2. Acteurs hormonaux régulant l’homéostasie énergétique

De nombreuses hormones sont impliquées dans l’homéostasie énergétique,

jouant leurs rôles régulateurs en périphérie et/ou sur le cerveau comme la ghréline,

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la cholécystokinine (CCK), le peptide YY (PYY), le glucagon-like peptide-1 (GLP-1), le

glucagon, la leptine et l’insuline (Ueno H et coll., 2005 ; Little TJ, 2005 ; McGowan

BMC et Bloom SR, 2004 ; Bojanowska E, 2005 ; Jiang G et Zhang BB, 2003 ;

Morton GJ et coll., 2006) (Figure 3).

Figure 3 : Lieu de synthèse et action des principales hormones jouant sur l’homéostasie énergétique ; AgRP : agouti related protein ; CCK : cholécystokinine ; GLP-1 : glucagon-like peptide-1 ; NPY : neuropeptide Y ; PYY : peptide YY

La leptine et l’insuline, considérées comme des signaux d’adiposité, font

l’objet des deux paragraphes suivants, consacrés à leurs effets généraux. Leurs

mécanismes d’action cérébraux sont développés dans le paragraphe III.1.

2.1. La leptine

La leptine est le produit du gène ob (« ob » pour obésité), communément

appelé « gène de l’obésité », localisé chez la souris en 1994 (Zhang Y et coll., 1994).

Il s’agit d’une cytokine de 16 kDa, secrétée principalement par le tissu adipeux et

de façon moindre par l’épithélium gastrique, le muscle squelettique ou le placenta

(Ahima RS et Osei SY, 2004).

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Le récepteur à la leptine, Ob-R, se présente sous plusieurs isoformes divisées

en trois groupes, quelque soit l’espèce considérée : secrétée, courte et longue. La

première forme ne comporte que la partie extracellulaire du récepteur et se lie à la

leptine circulante. Les isoformes courte et longue comprennent les parties

transmembranaires, extra- et intracellulaires. C’est la longueur de la partie

intracellulaire qui, alors, les différencie. Les Ob-R n’ont pas d’activité enzymatique

intrinsèque, mais la partie intracellulaire s’associe avec les Janus Kinases (JAK),

membres de la famille des tyrosine kinases. Ce mécanisme est absent avec les Ob-R

courts. Ainsi, ces derniers auraient pour fonction d’assurer le transport de la

leptine à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) (Bates SH et Myers MG Jr,

2003).

Au niveau du SNC la signalisation induite par la leptine passe par la forme

longue du récepteur, Ob-Rb, dont l’expression la plus forte a été retrouvée dans

l’hypothalamus ventromédian, tandis que la signalisation périphérique emprunte

davantage les formes courtes qui ont une localisation ubiquitaire (Bates SH et

Myers MG Jr, 2003). Grâce à ses deux récepteurs, la leptine exerce une multitude

d’effets physiologiques (Moran O et Phillip M, 2003) (Figure 4).

Figure 4 : Les différents effets de la leptine selon le tissu cible

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Son rôle dans la régulation de l’homéostasie énergétique est particulièrement

connu et étudié. En effet, les souris ob/ob, ainsi que les souris db/db (« db » pour

diabète) déficientes pour son récepteur Ob-R, sont obèses et diabétiques,

symptômes ressemblants au syndrome de l’obésité morbide rencontrée chez

l’humain, leur poids étant triple et leur masse adipeuse quintuple par rapport à des

souris sauvages soumises à un régime identique (Friedman JM et Halaas JL, 1998).

En effet, cette cytokine induit la réduction de la masse graisseuse en jouant sur le

métabolisme lipidique, diminue le contenu en triglycérides des différents tissus,

inhibe la synthèse d’insuline par les cellules β du pancréas, régule le métabolisme

du glucose et enfin, diminue la prise alimentaire (Moran O et Phillip M, 2003).

La leptinémie est proportionnelle à la masse du tissu adipeux, permettant

ainsi de refléter l’état énergétique global d’un organisme. Une augmentation de la

leptinémie induit une augmentation des dépenses et une diminution des apports

énergétiques (Friedman JM et Halaas JL, 1998) (Figure 5). Ces caractéristiques font

de la leptine un régulateur à long terme de l’homéostasie énergétique, d’autant plus

que sa concentration sanguine et l’adiposité n’augmentent pas de manière aiguë au

cours d’un repas.

Figure 5 : Reflet de l’état énergétique d’un individu par sa leptinémie

- 18 -

Toutefois, elle ne peut être utilisée dans les cas d’obésité induite par un

déséquilibre énergétique chronique, car chez ces patients est observée une

leptinorésistance. En revanche, elle s’avère efficace dans les cas d’obésité

congénitale, relativement peu fréquents, où le gène de la leptine ou celui de son

récepteur est muté.

2.2. L’insuline

Il s’agit d’une hormone quasi-exclusivement synthétisée par les cellules β du

pancréas. Une petite production cérébrale existe néanmoins même si elle prête

encore à controverse (Schwartz MW et coll., 1992 ; Banks WA, 2004).

La fonction générale de l’insuline est le contrôle strict de la glycémie, ses

effets hypoglycémiants s’opposant à ceux du glucagon, qui lui est synthétisé par les

cellules α (Jiang G et Zhang BB, 2003). Dans le plasma, elle circule sous forme

libre, non liée à une « protéine de transport » (Baulieu EE et Kelly PA, 1990). Les

mécanismes impliqués dans la sécrétion d’insuline induite par le glucose sont bien

documentés (Doyle ME et Egan JM, 2003) (Figure 6).

Figure 6 : Sécrétion de l’insuline en réponse au glucose par les cellules β du pancréas

- 19 -

Les cellules β expriment un transporteur au glucose particulier, GLUT2 (cf. §

III-2.2.5), dont les caractéristiques biochimiques permettent un passage de cet

hexose dans la cellule de manière proportionnelle à sa concentration environnante.

Cette propriété aboutit à un équilibre de la concentration en glucose de part et

d’autre de la membrane cytoplasmique. En d’autres termes, la concentration

intracellulaire en glucose reflète la concentration extracellulaire. Cet hexose est

ensuite rapidement phosphorylé en glucose-6-phosphate par la glucokinase (GK ;

cf. § III-2.2.5) qui détermine le niveau de glycolyse et ainsi la quantité de pyruvate

qui entrera dans la mitochondrie pour emprunter le cycle de Krebs. Cette

succession de réactions enzymatiques conduit à une augmentation du rapport

ATP/ADP dans le cytoplasme, ce qui induit la fermeture de canaux potassiques

sensibles à l’ATP. Celle-ci engendre alors une dépolarisation membranaire et

l’ouverture de canaux calciques sensibles au voltage. L’augmentation de la

concentration intracellulaire en ions Ca2+ qui en résulte, provoque la fusion, à la

membrane plasmique, des vésicules contenant l’insuline et par-là même son

exocytose. De plus, l’ATP agit également directement sur ces vésicules en favorisant

leur migration vers la membrane cellulaire.

Il existe aussi une régulation nerveuse de cette sécrétion, mise en jeu avant

même l’ingestion des aliments, indépendante d’une variation de la glycémie,

nommée « phase céphalique ». En dehors de celle-ci, la sécrétion d’insuline en

réponse à une hyperglycémie est typiquement biphasique chez des individus sains

(Del Prato S, 2003). L’hormone est rapidement libérée et sa concentration maximale

quelques minutes seulement après l’absorption de glucose par voie orale ou son

injection par voie intraveineuse. Cette sécrétion initiale ne dure qu’une dizaine de

minutes et est suivie d’une autre plus soutenue, se prolongeant pendant plusieurs

heures, jusqu’à ce que la glycémie revienne à une valeur basale (5 mM, soit 1g/L).

Environ 3% du contenu en insuline des cellules β sont libérés lors de la phase

précoce de sécrétion, tandis que 20% le sont lors de la seconde phase.

Le récepteur à l’insuline est ubiquitaire, localisé dans la quasi-totalité des

tissus des mammifères. Ceux l’exprimant le plus sont le tissu adipeux, le foie et les

muscles, c’est-à-dire les tissus dits insulino-sensibles (Cheatham B et Kahn CR,

1995). Il est constitué de deux sous-unités α extracellulaires et de deux autres β

transmembranaires possédant une activité tyrosine kinase intrinsèque (Van

Obberghen et coll., 2001). Son activation, par liaison de l’hormone, induit la

phosphorylation de résidus tyrosines de divers substrats cellulaires, comme les

- 20 -

protéines de la famille des IRS (Insulin Receptor Substrate) ou des SHC (Src-

Homology-Collagen). Ce mécanisme est suivi par différentes cascades de

signalisation qui se traduiront par différents effets physiologiques.

Figure 7 : Effets de l’insuline

L’insuline assure de multiples fonctions (Figure 7), mais constitue surtout

un facteur anabolique primordial dans le maintien de l’homéostasie énergétique, au

point que des souris totalement déficientes en son récepteur meurent peu de temps

après leur naissance de cétoacidose et d’un dysfonctionnement métabolique (Van

Obberghen et coll., 2001). Elle assure le maintien des normoglycémie et

normolipidémie. Cette hormone intervient à plusieurs niveaux, d’où son

importance. D’une manière générale, l’insuline favorise l’utilisation du glucose par

les tissus dits insulino-sensibles. Elle augmente ainsi le transport du glucose dans

les cellules musculaires et adipocytaires en induisant la translocation du

transporteur au glucose, GLUT4, vers la membrane (Chang L et coll., 2004). Au

- 21 -

niveau du foie, l’insuline inhibe la glycogénolyse et la gluconéogenèse, tout en

stimulant la glycogenèse, cette activation s’observant également dans le muscle

strié. Dans le foie et le tissu adipeux, elle augmente la lipogenèse, en diminuant

dans le même temps la lipolyse (Baulieu EE et Kelly PA, 1990).

A ces effets périphériques s’ajoutent des effets centraux parmi lesquels une

inhibition de la prise alimentaire et du poids corporel (Stockhorst U et coll., 2004).

Les mécanismes mis en jeu font l’objet du paragraphe III-1.2.

3. Régulation nerveuse de l’homéostasie énergétique

Le système endocrinien n’est pas seul à réguler la balance énergétique. Un

autre système est primordial pour assurer cette tâche : le système nerveux,

autonome (SNA) et central (SNC). Leur implication sera traitée séparément bien

qu’ils soient indissociables puisque le SNA véhicule les informations provenant du

SNC vers la périphérie et vice versa.

3.1. Régulation par le système nerveux autonome

Le SNA contrôle les fonctions végétatives d’un organisme. Il est constitué des

systèmes nerveux para- et orthosympathique, distincts au niveau de l’anatomie, de

la physiologie et de la neurochimie. Généralement, leurs effets sont antagonistes et

complémentaires sur un organe-cible, impliquant comme neuromédiateurs

l’acétylcholine pour les fibres parasympathiques et la noradrénaline pour les fibres

orthosympathiques (appelées plus simplement sympathiques) (Campbell NA, 1995)

(Figure 8).

Par rapport à l’homéostasie énergétique, l’augmentation du tonus

parasympathique induit le stockage du glucose et des acides gras libres (AGL), alors

que celle de l’orthosympathique induit la mobilisation de ces composés à partir des

tissus de réserves (Scheurink AJW et Nolan LJ, 1996). D’un autre côté, des

variations dans les apports énergétiques provoquent des changements d’activité du

SNA. En effet, l’absence d’apports lipidiques provoque une activation du système

orthosympathique alors qu’un épisode hypoglycémique engendre celle du système

parasympathique.

Deux organes fondamentaux dans la régulation du métabolisme sont le

pancréas et le foie. Or, ils montrent une riche innervation par le SNA. Au niveau du

pancréas, à la fois les cellules α et β sont sous la dépendance de ce contrôle :

l’activation des nerfs splanchniques induit une augmentation de la sécrétion de

- 22 -

glucagon et celle du nerf vague stimule la libération d’insuline (Nonogaki K, 2000).

Ainsi, suite à une vagotomie ou à l’administration d’atropine (antagoniste des

récepteurs à acétylcholine), la première phase de sécrétion d’insuline n’apparaît

plus suite à l’injection de glucose ce qui illustre l’existence du contrôle

parasympathique sur les îlots de Langerhans et son implication lors de l’apparition

d’une hyperglycémie (Scheurink AJW et Nolan LJ, 1996). Le foie, quant à lui, se

trouve sous la régulation du SNA à la fois de manière directe et indirecte : directe

grâce à l’innervation des hépatocytes, indirecte par l’effet de l’insuline sécrétée sous

l’influence du système parasympathique (Nonogaki K, 2000). L’innervation

sympathique peut induire la libération de glucose dans la circulation sanguine,

mais ce mécanisme semble mineur en comparaison à l’action hormonale (via le

glucagon) stimulant la glycogénolyse ou la gluconéogenèse. De l’autre côté, l’action

directe du système parasympathique sur le foie est requise pour que l’insuline

conduise à une capture du glucose efficace (Püschel GP, 2004).

Figure 8 : Effets du système nerveux autonome sur l’homéostasie énergétique

- 23 -

Les autres organes sous l’influence du SNA sont les muscles squelettiques et

le tissu adipeux. Au niveau des adipocytes, les fibres orthosympathiques stimulent

la lipolyse et la libération des AGL, tandis que les parasympathiques jouent sur la

capture du glucose en augmentant la sensibilité à l’insuline (Fliers E et coll., 2003).

Au niveau des cellules musculaires, le système sympathique active la capture de

glucose et la glycogénolyse (Nonogaki K, 2000).

3.2. Régulation par le système nerveux central

L’implication du SNC, et plus particulièrement de certaines régions

cérébrales, dans le contrôle de l’homéostasie énergétique a été découverte par le

biais d’observations cliniques datant d’un siècle (Elmquist JK, 1999). Des patients

souffrant du syndrome de Fröhlich montrent, en plus des tumeurs hypophysaires,

des dépôts de graisses sous-cutanés importants. Or, Aschner démontra en 1912

que ce phénotype est dû à des dommages de l’hypothalamus et non à ceux de

l’hypophyse per se puisque des chiens privés de cette glande ne développent pas

d’obésité. C’est en 1940 que Hetherington et Ranson établirent que l’hypothalamus

régulait la prise alimentaire et le poids corporel, grâce à des expériences de lésions

électrolytiques bilatérales de sa partie ventromédiane : elles provoquent une

augmentation de l’adiposité aboutissant à un doublement du poids. Par ailleurs ces

chercheurs notèrent une diminution de la prise alimentaire lorsque la région de

l’hypothalamus latéral était lésée. Ces données aboutirent à la théorie d’un « centre

de la faim », désignant la région hypothalamique latérale (LH), et d’un « centre de la

satiété », correspondant au noyau hypothalamique ventromédian (VMN).

Depuis, des modèles expérimentaux d’obésité ont été mis au point par

traitement pharmacologique provoquant des lésions cérébrales plus ou moins

spécifiques et certains phénotypes observés furent reliés à des lésions cérébrales

données. Ainsi l’acide kaïnique induit une hypophagie liée à la lésion du LH

(Elmquist JK, 1999). Des rats rendus diabétiques par injection de streptozotocine

ou des souris rendues obèses par injection périnatale de monosodium de

glutamate, montrent des modifications du noyau arqué (NA) et de l’éminence

médiane sous-jacente, caractérisées par une dégénérescence des neurones, une

hypotrophie des tanycytes et des changements axonaux (Bestetti G et Rossi GL,

1980). Des souris recevant de l’aurothioglucose développent en plus des lésions

dans le VMN (Sanchis-Segura C et Aragon CMG, 2002). Enfin, le bipiperidyl

provoque des lésions dans le VMN et le noyau du tractus solitaire (NTS), également

associées à une obésité sévère (Laughton W et Powley TL, 1981).

- 24 -

L’hypothalamus contrôle l’activité des systèmes nerveux para- et

orthosympathiques par l’intermédiaire de projections sur le tronc cérébral, au

niveau du NTS, des noyaux moteurs du vague, et de la médulla ventrolatérale. Il en

découle que des lésions du diencéphale engendrent des modifications de l’activité

du SNA (Pénicaud L et coll., 1996). Ceci est illustré par le fait que la lésion du VMN

de souris ou de rats (entraînant le développement d’une obésité) se caractérise par

une augmentation du tonus parasympathique et une diminution de

l’orthosympathique. Il est intéressant de constater que ces altérations apparaissent

également chez des animaux dont l’obésité est de nature génétique. Elles

aboutissent en particulier à une sécrétion excessive d’insuline par le pancréas et

donc à une hyperinsulinémie.

Ces différentes données montrent que le SNC, et plus spécifiquement

certaines régions hypothalamiques que sont le VMN, le NA et le LH, régulent

l’homéostasie énergétique en contrôlant la prise alimentaire et le fonctionnement du

SNA, via d’importants relais au niveau du tronc cérébral (Figure 9). Ultérieurement,

nous verrons que les noyaux hypothalamiques paraventriculaire (PVN) et

dorsomédian (DMN) sont également importants dans ces contrôles.

- 25 -

Figure 9 : Demi-coupes du cerveau d’un rat, l’une située à 1,8 mm et l’autre à 3,3 mm en arrière du bregma (point repère utilisé en stéréotaxie, où se rejoignent les 4 plaques crâniennes). Sont indiquées les régions hypothalamiques impliquées dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. 3V : troisième ventricule ; DMN : noyau hypothalamique dorsomédian ; LH : hypothalamus latéral ; NA : noyau arqué ; PVN : noyau hypothalamique paraventriculaire ; VMN : noyau hypothalamique ventromédian.

- 26 -

II – Hypothalamus et métabolisme énergétique

1. Neuropeptides particuliers

Les cellules hypothalamiques expriment et secrètent un certain nombre de

neurotransmetteurs permettant de « traduire » l’information de nature métabolique.

Les neurotransmetteurs non peptidiques tels que le glutamate, la dopamine, la

sérotonine ou le GABA, prennent part à ces mécanismes mais de manière non

spécifique, intervenant également dans d’autres grandes fonctions physiologiques.

Les prochains paragraphes ne traiteront que des neuropeptides dont le rôle majeur

concerne la régulation du métabolisme énergétique. Les uns sont qualifiés

d’orexigènes car mis en jeu dans des conditions de déficit énergétique. Leur

synthèse et libération entraînent ainsi une stimulation de la prise alimentaire ainsi

qu’une diminution des dépenses énergétiques. Les autres sont qualifiés

d’anorexigènes : leur libération est activée lors d’apports énergétiques importants et

s’accompagne d’une inhibition de la prise alimentaire et/ou une stimulation des

dépenses énergétiques (Dupin H et coll., 1992 ; Kalra SP et coll., 1999) (Tableau 1).

Tableau 1 : Neurotransmetteurs principaux impliqués dans la régulation de la prise alimentaire. Ceux notés en italique ne seront pas traités dans les paragraphes suivants. AgRP: agouti-related protein ; α-MSH: alpha-melanocyte-stimulating hormone ; CART: cocaine- and amphetamine-regulated transcript ; CRH: Corticotropin-Releasing Hormone ; GABA: γ-aminobutyric acid ; MCH: melanin-concentrating hormone ; NPY: neuropeptide Y ; TRH: thyrotropin-releasing hormone.

- 27 -

1.1. Les neuropeptides orexigènes

1.1.1. Le neuropeptide Y (NPY)

Le plus connu pour son rôle dans le contrôle de l’homéostasie énergétique est

le NPY. C’est un neurotransmetteur appartenant à la famille des polypeptides

pancréatiques, largement distribué dans le SNC. Au niveau hypothalamique, les

neurones à NPY proviennent essentiellement du NA, mais il en existe aussi

quelques uns éparpillés dans le LH, l’aire préoptique, les noyaux péri- et

paraventriculaires ainsi que dans le DMN (Fetissov SO et coll., 2004). Son action

passe par sa liaison à des récepteurs de type « 7 domaines transmembranaires ». A

ce jour, ils sont au nombre de six, nommés Y1 à Y6. Les récepteurs Y1, Y2 et Y5,

présentent une meilleure affinité pour le NPY et semblent être davantage impliqués

dans le contrôle de la prise alimentaire (Ramos EJB et coll., 2005).

Différents travaux de recherches ont montré que l’injection de NPY dans

l’hypothalamus stimule la prise alimentaire, diminue les dépenses énergétiques et

induit la lipogenèse dans le foie et le tissu adipeux. Ainsi l’apport chronique de NPY

aboutit à une prise de poids de part son action anabolique, parallèlement à la mise

en place d’une insulinorésistance (Schwartz MW et coll., 2000). De plus, injecté

spécifiquement dans le PVN, ce neuropeptide empêche la libération d’insuline et de

glucagon, diminue la thermogenèse et bloque l’activité du système nerveux

sympathique (Currie PJ, 2003).

Les concentrations hypothalamiques en NPY reflètent le statut énergétique de

l’organisme. En effet, la synthèse de ses ARNm et sa libération augmentent avec le

jeûne, tandis qu’elles diminuent avec la prise alimentaire (Wynne K et coll., 2005).

Donc, comme le montre l’augmentation des concentrations en NPY, ces voies

nerveuses sont activées lorsque le statut énergétique est négatif, par exemple en

période de jeûne, de lactation ou de déficience insulinémique chez les diabétiques

(Frankish HM et coll., 1995). Enfin, ces cellules sont stimulées par une baisse des

concentrations circulantes de la leptine et insuline, ces hormones inhibant aussi

directement l’expression du NPY (Williams G et coll., 2004).

Néanmoins, lorsqu’on analyse les modèles animaux d’obésité, on observe

certaines contradictions. Les souris obèses ob/ob montrent une augmentation de

l’activité des neurones à NPY, tandis que dans le cas d’une obésité induite par un

régime cette activité semble réduite (Williams G et coll., 2004). Par ailleurs, les

souris ayant une délétion du gène codant pour le NPY ne présente ni surpoids ni

augmentation de l’adiposité, ce qui suggère des phénomènes de redondance des

- 28 -

systèmes impliqués dans le contrôle de la balance énergétique (Wynne K et coll.,

2005).

1.1.2. L’AgRP (Agouti-Related Peptide)

Au niveau du SNC, ce neuropeptide est exprimé dans l’hypothalamus bien

qu’une petite production ait été mise en évidence dans le noyau subthalamique

(Stütz AM et coll., 2005). Lorsque l’on parle du système orexigène, il est

généralement mentionné le couple NPY/AgRP. En effet, 90% des neurones à NPY du

NA synthétisent et libèrent l’AgRP qui est aussi capable de stimuler la prise

alimentaire. Ce neuropeptide exerce son effet antagonisme direct de l’α-MSH (alpha-

Melanocyte-Stimulating Hormone ; cf. § II-1.2.1), neuropeptide anorexigène, sur les

récepteurs aux mélanocortines de type MC3-MC4. La stimulation des neurones

coexprimant l’AgRP et le NPY aboutit donc à une hyperphagie en stimulant d’une

part les récepteurs à NPY et en inhibant d’autre part les récepteurs aux

mélanocortines (Broberger C et coll., 1998).

Les mécanismes d’action impliqués dans l’effet orexigène de l’AgRP ne sont

pas totalement élucidés. Une seule injection intracérébroventriculaire est capable

d’induire une hyperphagie encore visible après 7 jours (Stütz AM et coll., 2005). Par

ailleurs, l’AgRP induit une diminution des dépenses énergétiques, notamment de la

thermogenèse, probablement en freinant l’influx nerveux sympathique.

Les souris transgéniques surexprimant l’AgRP sont hyperphagiques, obèses,

diabétiques et ont une hyperplasie du pancréas (Stütz AM et coll., 2005). En

revanche, l’invalidation de ce gène génère un phénotype normal suggérant la mise

en place de mécanismes compensateurs, comme pour le NPY. On observe la même

chose pour les rongeurs ayant une double délétion AgRP/NPY. Cependant, une

approche par ARN d’interférence au niveau hypothalamique, conduit à une

diminution du métabolisme et du poids corporel sans modification de la prise

alimentaire, suggérant une augmentation des dépenses énergétiques.

Chez l’Homme, une augmentation de la concentration en AgRP est observée

chez les individus obèses. De manière très intéressante, différentes mutations d’un

seul nucléotide du gène codant pour ce neuropeptide ont été décrites et sont

caractérisées par une résistance à l’obésité au sein d’un environnement favorable à

ce phénotype métabolique (Stütz AM et coll., 2005).

- 29 -

1.1.3. La MCH (Melanin-Concentrating Hormone)

La MCH est synthétisée par les neurones magnocellulaires du LH et de la

zona incerta.

L’injection de ce neurotransmetteur à des animaux induit une hyperphagie et

à long-terme une obésité, tandis que la délétion de son gène aboutit à un phénotype

inverse (hypophagie, diminution de la masse adipeuse et augmentation du

métabolisme). Il semblerait que la MCH agisse davantage sur le contrôle des

dépenses énergétiques. En effet, l’activation de ses voies neuronales stimule

l’adiposité, augmente la lipogenèse dans le foie et le tissu adipeux tout en

diminuant la thermogenèse (Angelopoulos N et coll., 2005 ; Williams G et coll.,

2004).

1.1.4. Les orexines (hypocrétines)

Les orexines sont au nombre de deux, l’orexine A et l’orexine B, dérivant d’un

précurseur commun, la prépro-orexine. Les neurones à orexine, peu nombreux,

sont entremêlés aux neurones à MCH dans le LH mais constituent bien une

population distincte, aux très nombreuses projections (bulbes olfactifs, cortex,

tronc cérébral, thalamus, hypothalamus…). D’autres neurones à orexines sont

présents au niveau de l’aire périfornicale et du DMN (Williams G et coll., 2004 ;

Kirchgessner AL, 2002).

L’injection intracérébroventriculaire ou spécifiquement dans le LH d’orexines

stimule la prise alimentaire. D’autre part, des souris dont le gène codant pour la

prépro-orexine est invalidé, sont narcoleptiques et hypophagiques (Kirchgessner AL,

2002). A l’heure actuelle, on pense donc que l’effet principal des orexines se situe

au niveau du contrôle des rythmes éveil/sommeil et que l’effet orexigène ne serait

que secondaire. Cette stimulation, à court-terme, de la prise alimentaire

nécessiterait l’activation des neurones à NPY du NA (Williams G et coll., 2004).

Néanmoins, les neurones à orexines répondent à différents signaux métaboliques.

Notamment, la concentration en ARNm de la prépro-orexine augmente après un

épisode de jeûne ou en réponse à une hypoglycémie induite par l’injection

d’insuline, ce qui mène à penser que ces neurones sont activés dans des conditions

de faim (Kirchgessner AL, 2002).

- 30 -

1.2. Les neuropeptides anorexigènes

1.2.1. L’α-MSH (alpha-melanocyte-stimulating hormone)

L’α-MSH est le principal neuropeptide anorexigène. Il est produit par clivage

d’un gros précurseur polypeptidique, la pro-opiomélanocortine (POMC). Deux

classes de peptides sont générées à partir de la POMC : les mélanocortines (α-MSH,

γ-MSH, β-MSH, ACTH) et les β-endorphines (Pritchard LE et coll., 2002). La délétion

du gène de la POMC entraîne le développement d’une obésité sévère accompagnée

d’insuffisance surrénalienne et d’anomalie de pigmentation (Yaswen L et coll.,

1999). La mutation avec perte des deux allèles est à l’origine du même phénotype

chez l’être humain (Krude H et coll., 1998 ; Pritchard LE et coll., 2002).

Les neurones à POMC du NA constituent la population la plus importante

du SNC. Néanmoins, certains sont aussi retrouvés au niveau de l’hippocampe et du

NTS (Zheng H et coll., 2005). Les neurones à POMC du NA, comme les neurones à

NPY/AgRP, projettent majoritairement vers le PVN et le LH.

L’implication de l’α-MSH, et plus généralement du système aux

mélanocortines, dans la régulation du métabolisme, a émergé après l’identification

de ses récepteurs : les récepteurs MC3-R et MC4-R. Des souris invalidées pour le

récepteur MC4-R sont hyperphagiques et développent une obésité sévère (Weide K

et coll., 2003). Différentes mutations du gène de ce récepteur sont désormais

associées au développement d’une obésité chez l’enfant (Tao YX et Segaloff DL,

2003). L’ensemble des études menées dans ce domaine suggère que le système à α-

MSH induit un tonus anorexigène permanent via le récepteur MC4-R. Ainsi une

stimulation de la prise alimentaire résulterait davantage de la suppression d’un

tonus satiétogène, notamment par l’intermédiaire du système à AgRP. Néanmoins,

l’injection cérébrale d’α-MSH est capable de diminuer la prise alimentaire et le poids

corporel (Ramos EJB et coll., 2005). De plus, elle augmente l’activité du SNA

sympathique et les dépenses énergétiques, plus particulièrement la thermogenèse

(Wynne K et coll., 2005).

1.2.2. Le CART (Cocaine- and Amphetamine-Regulated Transcript)

Dans le NA, ce peptide est retrouvé dans la majorité des neurones à POMC.

Ainsi, comme dans le système orexigène où l’on a les « neurones à NPY/AgRP », le

système anorexigène du NA est constitué de « neurones à POMC/CART »

(Angelopoulos N et coll., 2005). En revanche, dans le DMN et le LH, ce peptide

colocalise avec la MCH, neuropeptide orexigène. Ce peptide est également présent

dans les VMN, PVN et NTS. Au niveau du NTS, les neurones à CART expriment un

- 31 -

récepteur à la CCK, suggérant leur implication dans le mécanisme de satiété induit

par cette hormone. Les recherches concernant ce neuropeptide ne sont pas encore

bien développées et à ce jour, on ne connaît toujours pas son récepteur (Hunter RG

et coll., 2004).

L’injection intracérébroventriculaire chronique de CART induit une

diminution de la prise alimentaire parallèle à une perte de poids et à une

diminution des insulinémie et leptinémie. Toutefois, une injection réalisée au sein

de différentes régions de l’hypothalamus (PVN, DMN, VMN, NA, LH) montre des

résultats inverses sur l’ingestion de nourriture (Hunter RG et coll., 2004).

Enfin, des souris dont le gène codant pour CART est invalidé, auxquelles on

présente une alimentation hypercalorique riche en graisses, montrent une

hyperphagie, une augmentation du poids corporel et de la masse adipeuse par

rapport aux souris sauvages. Par ailleurs, quelques études réalisées chez des

humains révèlent un lien entre certains cas d’obésité et un polymorphisme du gène

CART (Hunter RG et coll., 2004).

- 32 -

La Figure 10 récapitule les zones hypthalamiques où se déroule la synthèse

majeure des différents neuropeptides mentionnés.

Figure 10 : Localisation des neurones hypothalamiques synthétisant les neuropeptides majeurs impliqués dans l’homéostasie énergétique. Les orexigènes sont en bleu et les anorexigènes en rouge. 3V: troisième ventricule ; AgRP: agouti-related protein ; CART: cocaine- and amphetamine-regulated transcript ; DMN: noyau hypothalamique dorsomédian ; em: éminence médiane ; fx: fornix ; LH: hypothalamus latéral ; MCH: melanin-concentrating hormone ; NA: noyau arqué ; NPY: neuropeptide Y ; POMC: pro-opiomélanocortine ; PVN: noyau hypothalamique paraventriculaire ; VMN: noyau hypothalamique ventromédian.

2. Rôle majeur du noyau arqué

Le NA est une région hypothalamique essentielle pour le contrôle de la

balance énergétique du fait 1) de la coexistence de deux populations neuronales

aux effets antagonistes et complémentaires, NPY/AgRP d’une part, POMC/CART

d’autre part, mais aussi 2) de la présence des récepteurs liant des hormones clés,

en particulier la leptine et l’insuline (cf. § III-1).

- 33 -

De plus, le NA possède des particularités anatomiques stratégiques pour un

tel rôle. En effet, il est situé à proximité du troisième ventricule et juste au-dessus

de l’éminence médiane. Il se trouve donc à l’interface entre le liquide céphalo-

rachidien et la circulation sanguine. De plus, l’endothélium vasculaire au niveau de

l’éminence médiane présente la particularité d’être fenestré. Il n’y aurait donc pas

de réelle barrière hémato-encéphalique (BHE) protégeant le NA et les échanges entre

le compartiment sanguin et le parenchyme nerveux y seraient facilités (Kalra SP et

coll., 1999).

Grâce à ces caractéristiques, les cellules nerveuses du NA peuvent

rapidement détecter des variations de concentrations plasmatiques hormonales ou

de paramètres métaboliques et ajuster, suite à des cascades de signalisation

intracellulaires, la libération des neurotransmetteurs. Ainsi, le NA joue un rôle

d’intégrateur métabolique (Niswender KD et coll., 2004) (Figure 11).

Figure 11 : Intégration des signaux d’adiposité au niveau du noyau arqué (NA). 3V : troisième ventricule ; AgRP: agouti-related protein ; em: éminence médiane ; insr: récepteur à l’insuline ; lepr: récepteur à la leptine ; NPY: neuropeptide Y ; POMC: pro-opiomélanocortine ; Schéma modifié à partir de Niswender KD et coll., 2004.

- 34 -

Lorsque l’adiposité augmente, l’insulinémie et la leptinémie s’élèvent, et les

signaux d’adiposité arrivant au niveau du NA s’intensifient. Il en résulte une

inhibition des neurones à NPY/AgRP, corrélée à une diminution de l’expression

et/ou de la libération de ces deux neurotransmetteurs, ainsi qu’une activation des

neurones à POMC, corrélée à une augmentation de la libération d’α-MSH par ces

neurones. Ces mécanismes coordonnés aboutissent à une réduction de la prise

alimentaire. La situation inverse se déroule dans le cas d’une diminution de la

masse adipeuse (Morton GJ et coll., 2006).

3. Connexions intrahypothalamiques

Au fur et à mesure des expériences de colocalisations, de traçages rétro-

et/ou antérogrades, d’activations nerveuses, la cartographie des circuits

intrahypothalamiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie énergétique se

dessine de plus en plus précise.

Comme mentionné dans le paragraphe précédent, de part ses

caractéristiques, le NA est une région cérébrale clé pour capter en premier les

signaux périphériques en relation avec le métabolisme. L’activité de ces neurones

influence celle des neurones dits « de second ordre », se situant dans d’autres aires

hypothalamiques (Wynne K et coll., 2005) (Figure 11). Les terminaisons nerveuses

orexigènes et anorexigènes du NA s’étendent vers la plupart des régions

hypothalamiques comme les noyaux VMN, DMN, PVN, la région périfornicale, le LH

et le noyau suprachiasmatique (Kalra SP et coll., 1999 ; Bouret SG et Simerly RB,

2004 ; Yi CX et coll., 2006). Quelques projections de neurones à NPY du NA sont

courtes et locales, se terminant sur les neurones à POMC voisins. Lorsque les

premiers sont activés par de la leptine, du NPY et du GABA sont libérés. Ces deux

neurotransmetteurs exercent un effet général inhibiteur, il en résulte donc une

diminution de l’activité des neurones adjacents à POMC (Cowley MA et coll., 2001).

A la fois les neurones à NPY et ceux à POMC projettent vers le PVN. Grâce à

ses travaux d’immunohistochimie et d’électrophysiologie, Michael A. Cowley et ses

collaborateurs ont pu établir un modèle d’intégration dans le PVN de signaux en

provenance du NA. Au niveau du PVN, les neurones à NPY et à POMC projetteraient

sur la même population de neurones cibles, à savoir des neurones GABA-ergiques.

Ces derniers contrôleraient l’activité de neurones anorexigènes à ocytocine, CRH

(corticotropin-releasing hormone) ou TRH (thyrotropin-releasing hormone)

(Cowley MA et coll., 1999 ; Schwartz MW et coll., 2000) (Figure 12).

- 35 -

Figure 12 : Modèle d’intégration GABA-ergique dans le noyau hypothalamique paraventriculaire (PVN) des signaux neuropeptidergiques en provenance du noyau arqué (NA). 3V: troisième ventricule ; AGRP: agouti-related protein ; α-MSH: alpha-melanocyte-stimulating hormone ; GABA: γ-aminobutyric acid ; GABAAR: récepteur au GABA ; MC4-R: récepteur à mélanocortine ; NPY-R: récepteur au NPY ; NPY: neuropeptide Y ; POMC: pro-opiomélanocortine ; Schéma modifié à partir de Cowley MA et coll., 1999.

Les neurones à NPY et à POMC du NA projettent également vers la région

périfornicale ainsi que le LH. Leur activité influence de manière opposée celles des

neurones à MCH et orexines (Schwartz MW et coll., 2000). De plus, il existe des

connexions réciproques, les neurones à orexines du LH innervant et activant, les

cellules à NPY du NA.

Le VMN, qui constitue une région cérébrale cruciale dans la régulation de

l’homéostasie énergétique, reçoit aussi des projections nerveuses à NPY/AgRP et

POMC du NA (Guan XM et coll., 1998). A ce niveau est synthétisé le BDNF (Brain-

Derived Neurotrophic Factor) dont l’expression est modulée par le statut

énergétique de l’organisme ou par des agonistes aux mélanocortines, suggérant un

relais de l’information en provenance des neurones à POMC (Xu B et coll., 2003).

Des projections nerveuses du VMN aboutissent ensuite dans le DMN (Wynne K et

coll., 2005).

- 36 -

Les connexions hypothalamiques entre le VMN et le DMN sont réciproques.

Ce dernier reçoit aussi des terminaisons nerveuses à NPY/AgRP trouvant leur

origine dans le NA et des efférences en partent en direction du PVN. Ce noyau

hypothalamique possède quelques neurones à NPY (Kalra SP et coll., 1999).

Ainsi, il existe un réseau riche de connexions intrahypothalamiques

relativement complexe, illustré par la figure 13.

Figure 13 : Connexions nerveuses intrahypothalamiques, impliquées dans l’homéostasie énergétique. Les neuropeptides orexigènes sont en bleu et les anorexigènes en rouge. 3V: troisième ventricule ; AgRP: agouti-related protein ; CART: cocaine- and amphetamine-regulated transcript ; CRH: Corticotropin-Releasing Hormone ; DMN: noyau hypothalamique dorsomédian ; em: éminence médiane ; fx: fornix ; LH: hypothalamus latéral ; MCH: melanin-concentrating hormone ; NA: noyau arqué ; NPY: neuropeptide Y ; NTS: noyau du tractus solitaire ; POMC: pro-opiomélanocortine ; PVN: noyau hypothalamique paraventriculaire ; TRH: thyrotropin-releasing hormone ; VMN: noyau hypothalamique ventromédian.

- 37 -

4. Connexions extrahypothalamiques en direction du tronc cérébral

L’hypothalamus est en relation avec d’autres grandes régions cérébrales,

indirectement liées à l’homéostasie énergétique, responsables des choix

alimentaires faisant référence à la mémoire ou à des phénomènes cognitifs,

gustatifs et/ou olfactifs. Il existe même des voies dites « de récompense »,

indépendantes du statut calorique, stimulant la prise alimentaire en dépit d’une

balance positive. Au contraire, d’autres aires y sont directement liées. Ce sont celles

du tronc cérébral qui permettent le relais de l’information nerveuse vers la

périphérie, refermant ainsi la boucle de rétrocontrôle, positif ou négatif, selon le

contexte énergétique de l’individu.

En ce qui concerne le tronc cérébral, il existe d’importantes connexions

réciproques entre l’hypothalamus et cette partie essentielle du SNC, en particulier

avec le NTS (Figure 13). Ce dernier reçoit les afférences du SNA parasympathique

provenant de la périphérie, dont le tractus gastro-intestinal, et se situe juste au

dessus du noyau dorsal moteur du vague (DMV), point de départ des neurones

préganglionnaires parasympathiques. De plus, tout comme le NA, le NTS est très

proche d’un organe circumventriculaire dépourvu de BHE, l’area postrema, où les

capillaires sont fenestrés. Cette caractéristique anatomique, le rend ainsi capable de

détecter lui-même des variations des concentrations plasmatiques des hormones

clés, comme l’insuline ou la leptine, d’autant plus que leurs récepteurs sont

présents. De manière intéressante, le NTS possède des neurones à POMC et

d’autres à NPY, ces derniers projetant vers le PVN. Enfin, il y a été révélée la

présence de récepteurs à mélanocortines (Wynne K et coll., 2005 ; Schwartz MW et

coll., 2000 ; Morton GJ et coll., 2006).

Par ailleurs, le VMN et le LH sont aussi reliés au NTS (Wynne K et coll.,

2005 ; Kirchgessner AL, 2002). La stimulation des neurones à orexines du LH

engendre l’activation de neurones du NTS et du DMV qui contiennent des

récepteurs pour ces neuropeptides. L’activité électrique des efférences vagales est

ainsi accrue, suggérant finalement la modulation des sécrétions et/ou de la

mobilité gastro-intestinales, en réponse à une activation des voies de transduction

NPY/AgRP et orexines/MCH. Le phénomène inverse est possible puisque des

neurones du NTS projettent vers le LH : des signaux de satiété en provenance de la

périphérie, par exemple de l’intestin ou du foie, moduleraient l’activité électrique

des neurones à orexines (Kirchgessner AL, 2002).

- 38 -

L’hypothalamus est donc le siège des contrôles de l’homéostasie énergique,

notamment grâce au NA capable d’intégrer les différents signaux hormonaux que

sont la leptinémie et l’insulinémie, et de relayer par différentes voies de

transduction les informations nerveuses qui aboutiront à un rétrocontrôle en

direction de la périphérie (Figure 14).

Figure 14 : Illustration de la boucle de contrôle existant entre les organes périphériques et le cerveau. (http://www-good.pasteur-lille.fr/accueil/presse/html/campagne-obe/Les_origines_ biologiques.htm)

Dans la prochaine partie, nous allons nous intéresser aux mécanismes de

sensibilité cérébrale aux hormones (leptine, insuline), mais aussi aux métabolites

(acides gras, glucose).

- 39 -

III – Sensibilité hypothalamique aux informations métaboliques

Ne sera traitée dans ce chapitre, que la sensibilité cérébrale directe, c'est-à-

dire par les cellules nerveuses, excluant ainsi la réception des informations

périphériques de nature métabolique relayées par le SNA. Ce mécanisme est

possible grâce à la circulation sanguine qui véhicule, de la périphérie vers le SNC,

des molécules liées au métabolisme telles que les hormones comme la leptine ou

l’insuline, et les métabolites comme les acides gras ou le glucose. Ils sont capables

d’accéder directement aux cellules cérébrales et, une fois détectés, sont à l’origine

de cascades de signalisation aboutissant à une information nerveuse. Ces composés

deviennent alors des signaux au-delà de leur rôle purement métabolique, nécessaire

au fonctionnement normal des cellules.

1. Sensibilité aux hormones

Comme nous l’avons vu précédemment la régulation endocrinienne est

primordiale pour le maintien de l’homéostasie énergétique. Or au niveau cérébral et

plus particulièrement de l’hypothalamus, sont exprimés des récepteurs spécifiques

aux hormones impliquées dans ce contrôle comme la leptine ou l’insuline. Ceux-ci

permettent la détection de leurs concentrations circulantes qui sont

proportionnelles à la masse adipeuse et donc liées à l’état énergétique de l’individu,

permettant un rétrocontrôle accordant la prise alimentaire à ces stockages d’énergie

(Figlewicz DP, 2003) (cf. § I-2.1, Figure 5).

De plus, il s’avère qu’il existe un dialogue entre ces deux signaux d’adiposité,

grâce à un croisement de leurs cascades de signalisation au niveau de la PI3K

(Phosphatidylinositol 3-Kinase) (Niswender KD et coll., 2004) (Figure 15). En se

liant à son hormone, le récepteur à l’insuline s’autophosphoryle au niveau de son

domaine intracellulaire grâce à son activité tyrosine kinase. Les protéines IRS

adhèrent alors au niveau des résidus phosphorylés, sont activées par

phosphorylation de leurs propres résidus tyrosines et de ce fait, deviennent

capables d’interagir avec la PI3K pour la stimuler. Cette enzyme catalyse la

phosphorylation du phosphatidylinositol (4,5)-biphosphate (PIP2) en

phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (PIP3), ce dernier permettant l’activation

d’enzymes telles que la PDK1 (3-Phosphoinositide-Dependent Kinase-1) et la PKB

(Protéine Kinase B). La leptine, quant à elle, en se liant à son récepteur, provoque

sa dimérisation et le recrutement de kinases JAK2, indispensables à la

- 40 -

phosphorylation de son domaine intracellulaire. Ses sites phosphorylés permettent

l’adhésion des molécules STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription-

3), alors elles-mêmes phosphorylées et activées par les JAK2, aboutissant à leur

homodimérisation essentielle pour leur fonction de régulation de la transcription de

gènes cibles. Tout comme l’insuline, la leptine serait capable d’activer la PI3K par le

biais de JAK2 qui pourrait catalyser la phosphorylation des IRS. Ce mécanisme

existerait au sein de l’hypothalamus. En particulier, il a été montré que ces deux

hormones activaient les canaux potassiques ATP-dépendants via la stimulation de

la PI3K dans certains neurones. Ce phénomène conduirait ainsi à une

hyperpolarisation et donc à une inhibition de leur activité électrique (Obici S et coll.,

2002a) (Figure 18).

Figure 15 : Dialogue entre les voies de signalisation générées par la liaison de l’insuline et de la leptine à leur récepteur. Il se réalise au niveau de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) composée des 2 sous-unités p110 et p85. IRS: insulin receptor substrate ; JAK2: Janus-activated kinase-2 ; PDK1: 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 ; PIP2: phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate ; PIP3: phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate ; PKB: protéine kinase B ; PKC: protéine kinase C ; Socs3: suppressor of cytokine signaling -3 ; Stat3: signal transducer and activator of transcription-3 ; Schéma modifié à partir de Niswender KD et coll., 2004.

En plus de la PI3K, le dialogue leptine/insuline s’établirait également au

travers d’une autre enzyme, l’AMPK (AMP-activated protein Kinase) (Kahn BB et

coll., 2005). L’activité de cette enzyme est liée à la disponibilité cellulaire en

substrats métaboliques puisqu’elle est activée allostériquement par une

augmentation du rapport AMP/ATP. D’une manière générale, son activation conduit

- 41 -

à une inhibition des mécanismes anaboliques consommateurs d’ATP et à une

stimulation des voies cataboliques productrices d’ATP, par le biais de la régulation

de l’expression ou de l’activité d’enzymes clé du métabolisme des acides gras, du

cholestérol et du glucose (Xue B et Kahn BB, 2006). En plus de ce rôle exercé en

périphérie, l’AMPK contrôle la prise alimentaire et le poids corporel en étant

impliquée, de façon opposée, dans la transduction de signaux orexigènes (ghréline,

épisode de jeûne, hypoglycémie) et anorexigènes (leptine, insuline, hyperglycémie)

au niveau hypothalamique (Figure 16).

Figure 16 : Régulation de l’activité de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) du NA (noyau arqué) et du PVN (noyau hypothalamique paraventriculaire) par les signaux hormonaux et le statut énergétique de l’organisme. Modifié à partir de Kahn BB et coll., 2005.

1.1. Signalisation cérébrale de la leptine

Dans le paragraphe I-2.1, nous avons vu que l’action majeure de la leptine se

déroulait dans le SNC via Ob-Rb, l’isoforme longue du récepteur. L’Ob-Rb est

présent un peu partout dans le SNC, mais de manière plus spécifique dans les

plexus choroïdiens, le cortex cérébral, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus et

le complexe dorsal vagal (Elmquist JK et coll., 1998 ; Funahashi et coll., 2003).

Dans ce dernier, les plus fortes concentrations sont localisées dans les noyaux

supraoptiques et périventriculaires, le PVN, le NA et le LH (Hakansson ML et coll.,

1998). Différentes études montrent que l’injection de leptine dans le SNC est plus

efficace que l’injection périphérique pour réduire la prise alimentaire et le poids

corporel. Au niveau de l’hypothalamus, ce sont les injections réalisées directement

- 42 -

dans le NA ou le VMN qui aboutissent aux effets optimaux. Enfin, si le gène codant

pour Ob-Rb est invalidé spécifiquement dans le SNC, les animaux deviennent

obèses (Sahu A, 2004).

Le contrôle de la leptine sur l’homéostasie énergétique passe

vraisemblablement par la modulation de l’expression des neuropeptides orexigènes

et anorexigènes décrits dans les chapitres précédents (Morton GJ et coll., 2006).

Cette régulation peut s’opérer directement puisque l’Ob-R est exprimé dans la

plupart de ces neurones : Ob-R colocalise avec la POMC et le NPY dans le NA, avec

la MCH et l’orexine dans le LH (Hakansson ML et coll., 1998 ; Kirchgessner AL,

2002 ; Figure 11).

Figure 17 : Régulation de l’expression des neuropeptides par la leptine et l’insuline. AgRP: agouti-related protein ; α-MSH: α-melanocyte-stimulating hormone ; MCR: récepteur aux mélanocortines. NPY: neuropeptide Y ; POMC: pro-opiomélanocortine. D’après Schwartz MW et coll., 2000.

Des travaux montrent qu’Ob-Rb, suite à la liaison de la leptine, stimule

l’expression du gène de la POMC et active, par dépolarisation, les neurones

exprimant cette prohormone (Cowley MA et coll., 2001). Ceci conduit à la libération

d’α-MSH inhibant la prise alimentaire par l’activation des récepteurs aux

- 43 -

mélanocortines. A l’inverse, la signalisation d’Ob-Rb inhibe l’expression du NPY et

de l’AgRP, neuropeptides orexigènes. Ces deux mécanismes simultanés et

coordonnés aboutissent finalement à une perte d’appétit et donc à une diminution

des apports énergétiques (Münzberg H et coll., 2005) (Figure 17). Enfin, l’injection

de leptine diminue la synthèse des ARNm de la MCH et de l’orexine A dans le LH

(Williams G et coll., 2004 ; Kirchgessner AL, 2002).

Les modèles animaux déficients en leptine (souris ob/ob) ou en récepteur

(souris db/db, rats Zucker fa/fa) confirment les données obtenues

expérimentalement. En effet, chez ces rongeurs, en condition basale, les neurones à

NPY du NA sont suractivés, et l’expression de l’AgRP est augmentée (Williams G et

coll., 2004 ; Stütz AM et coll., 2005). Ceci démontre que la leptine est un important

régulateur des neurones à NPY/AgRP et que l’inhibition de la prise alimentaire par

cette hormone se ferait via ces cellules. Cette hypothèse est renforcée par le fait que

la leptine est capable de les hyperpolariser et donc de diminuer leur activité

électrique. Par ailleurs, les rats fa/fa ou les souris ob/ob surexpriment la MCH par

rapport aux rats Zucker Fa/Fa ou aux souris à phénotype mince. Ainsi la leptine

inhiberait également cette population neuronale (Williams G et coll., 2004). Enfin, la

concentration en ARNm de la POMC est significativement plus basse chez ces

animaux obèses (Pritchard LE et coll., 2002).

1.2. Signalisation cérébrale de l’insuline

L’insuline est la première hormone dont l’implication dans le contrôle

nerveux du poids corporel a été démontrée (Schwartz MW et coll., 2000). Le

récepteur à l’insuline est exprimé un peu partout dans le SNC, avec de plus fortes

densités dans le tronc cérébral, le cervelet, le cortex, l’hippocampe et

l’hypothalamus. Dans ce dernier, il se concentre particulièrement dans le NA et de

manière plus faible dans les DMN, VMN et dans le LH (Schwartz MW et coll., 1992).

Par son action centrale, l’insuline a des effets similaires à ceux de la leptine,

impliquant probablement des mécanismes proches : elle inhibe la prise alimentaire

et augmente les dépenses énergétiques (Figure 17). Au niveau du PVN, elle diminue

la synthèse et la libération du NPY. Toutefois, il n’a pas été établi de manière

définitive que les neurones à NPY exprimaient le récepteur à l’insuline (Williams G

et coll., 2004 ; Stütz AM et coll., 2005). D’autre part, l’injection intrapéritonéale

d’insuline à des rats augmente l’expression des ARNm de la POMC dans le NA

(Pritchard LE et coll., 2002). Enfin, une diminution de 80 % de la quantité de

récepteurs à l’insuline spécifiquement dans le NA, par injection d’antisens, entraîne

- 44 -

une hyperphagie accompagnée d’une augmentation de la masse adipeuse et une

diminution de la production hépatique de glucose (Obici S et coll., 2002b).

Ainsi, l’hyperinsulinémie faisant suite à l’ingestion d’aliments induit un

rétrocontrôle négatif en partie de nature centrale afin d’empêcher un éventuel

apport d’énergie excédentaire (Figure 7).

2. Sensibilité aux métabolites

Les métabolites, dérivant de la prise alimentaire suite aux processus de

digestion et donc au métabolisme, sont des éléments essentiels à l’intégrité d’un

organisme. Ils sont classés en trois groupes : les protéines, les lipides et les

glucides. Au sein du SNC, leurs rôles consistent au maintien des structures et à

l’apport d’énergie. La respiration cellulaire est assurée essentiellement par les

lipides et glucides, les protéines ne devenant source d’énergie principale que

lorsque les autres molécules sont indisponibles.

Dans les années 50, on soupçonna l’implication des lipides et des glucides

dans d’autres processus physiologiques, donnant naissance aux théories

lipostatique et glucostatique. La première met en avant la fonction de stockage

d’énergie assurée par les adipocytes, tandis que la seconde concerne le rôle

primordial joué par le glucose dans l’ensemble du métabolisme énergétique des

cellules (Kennedy GC, 1953 ; Mayer J, 1953). Ainsi, le fait que ces métabolites

puissent eux-mêmes contrôler la balance énergétique commençait à faire son

chemin dans les esprits.

Ceci implique que ces composés soient capables de générer des cascades de

signalisation au sein de certaines cellules, en plus de leur action indirecte via la

sécrétion d’hormone. Précédemment nous avons vu qu’il existait un croisement des

voies de signalisation de la leptine et de l’insuline (Figures 15 et 16). Or, une

interaction a également été mise en évidence entre le glucose et les acides gras

grâce aux expériences de Philip Randle (Randle PJ et coll., 1963). Cette équipe de

chercheurs a montré que, sur le cœur de rat isolé, une augmentation de la

concentration des acides gras libres (AGL) dans le milieu de perfusion réduisait le

transport et l’utilisation du glucose par le myocarde. Ce concept d’interrelation

entre le métabolisme du glucose et celui des acides gras a été depuis étendu au foie

et aux cellules β du pancréas (voir § ci-dessous pour ces dernières) (Girard J, 2003).

Les molécules impliquées sont entre autres l’ATP et l’acétyl-CoA, cofacteurs générés

- 45 -

lors de l’oxydation des AGL et nécessaires à des étapes de la néoglucogenèse

hépatique.

2.1. Les acides gras

Parmi les lipides, ce sont les acides gras libres (AGL) qui tiennent le rôle de

molécule de signalisation, que ce soit en périphérie ou au niveau du SNC. Par

exemple, en plus d’être des substrats énergétiques majeurs, les AGL influencent la

sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas (Girard J, 2003). A court terme

(exposition aux AGL durant quelques heures), ils potentialisent cette libération

hormonale en réponse au glucose, alors qu’à long terme (plusieurs jours), ils

l’inhibent. Le premier mécanisme impliquerait l’augmentation de la concentration

intracellulaire d’acyl-CoA découlant de la dégradation normale des AGL. Or, cette

molécule a la capacité de stimuler directement l’exocytose, mais aussi

indirectement, via la formation de diacylglycérol, un activateur de la PKC. Quant à

l’effet inhibiteur, plusieurs hypothèses ont été formulées : inhibition de la fermeture

des canaux potassiques ATP-dépendants par les acyl-CoA, et/ou diminution de

l’expression de protéines comme le GLUT2 et la GK, et/ou effet découplant des AGL

sur la mitochondrie aboutissant à une diminution de la synthèse d’ATP (Figure 6).

En ce qui concerne la sensibilité centrale aux AGL, Loftus et ses

collaborateurs ont mis en évidence l’existence d’une relation entre lipides et

régulation de l’homéostasie énergétique (Loftus TM et coll., 2000). En effet,

l’inhibition pharmacologique de la synthèse d’acides gras à longues chaînes par le

C75 (inhibiteur de la Fatty Acid Synthase, FAS), au niveau cérébral, entraîne une

diminution de la prise alimentaire, accompagnée d’une perte de poids. De manière

intéressante, ce phénotype est corrélé à une diminution de l’expression du NPY

dans l’hypothalamus suggérant l’implication de ces neurones. Cet effet anorexigène

s’expliquerait par 1) l’accumulation de malonyl-CoA suite à l’inhibition de la FAS,

2) l’inhibition de l’entrée des acyl-CoA dans la mitochondrie due à l’excès de

malonyl-CoA et 3) l’accumulation cytosolique, secondaire, d’acyl-CoA. Cette

hypothèse selon laquelle l’accumulation d’AGL et plus particulièrement d’acyl-CoA

dans la cellule serait responsable de l’effet satiétogène des lipides a, depuis, été

étayée par différentes stratégies expérimentales (injection intracérébroventriculaire

d’AGL, injection d’un inhibiteur du transporteur aux acides gras mitochondrial).

Ces études révèlent, en plus de la diminution de la prise alimentaire, une

diminution de la production hépatique de glucose et suggèrent l’implication des

- 46 -

canaux potassiques ATP-dépendants (Obici S et coll., 2002a ; Cruciani-

Guglielmacci et coll., 2004). La figure 18 illustre cette hypothèse.

Figure 18 : Suggestion de mécanisme de régulation des canaux potassiques ATP-dépendants par la leptine, l’insuline et l’acide oléique. PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase ; SU: sulfonylurée ; SUR: sous-unité du canal potassique (SU inhibe le canal par liaison à son récepteur SUR). D’après Obici S et coll., 2002a.

Par ailleurs, l’infusion pendant 2 jours d’une solution de triglycérides dans le

SNC, potentialise la sécrétion d’insuline en réponse à une hyperglycémie, indiquant

que l’action des AGL sur les cellules β mentionnée au début de ce paragraphe,

pourrait passer au moins en partie par une détection cérébrale (Clément L et coll.,

2002). De plus, dans ce cas aussi apparaît une désensibilisation hépatique à

l’insuline, limitant ainsi la libération de glucose dans la circulation sanguine.

Plus récemment, des travaux de recherche ont permis de mettre en évidence

de manière encore plus directe l’activation cérébrale induite par les lipides. En

particulier, l’étude de cette activation par l’utilisation de l’expression du proto-

oncogène c-Fos (marqueur de l’activation des neurones, cf. § IV-2) suggère que

l’infusion d’AGL par voie intracarotidienne vers le SNC inhibe les noyaux DMN,

VMN, PVN et NA, mais stimule le LH (Cruciani-Guglielmacci C et coll., 2004). Par

ailleurs, des données d’électrophysiologie indiquent clairement qu’il existe au sein

du NA une population de neurones sensibles aux AGL : ils augmentent ou

diminuent leur activité en réponse à l’application d’acide oléique (Wang R et coll.,

2004). Cette réponse est donc différente selon la cellule enregistrée, mais aussi

selon la concentration en glucose environnant. Cela renforce l’idée d’interrelation

entre les voies mises en jeu par le glucose et les AGL, déjà mentionnée dans le cas

des organes périphériques, mais cette fois-ci dans l’hypothalamus. Enfin, au sein

de notre laboratoire, il a été mis en évidence que l’injection intracérébroventriculaire

aiguë de triglycérides conduisait à la production rapide et transitoire d’espèces

libres de l’oxygène de nature mitochondriale et ce, au sein de l’hypothalamus

- 47 -

ventral (Benani A et coll., 2007). Or, cette synthèse est nécessaire au mécanisme

d’inhibition de la prise alimentaire normalement observée dans un contexte

d’hypertriglycéridémie, mettant en lumière un des éléments indispensables de la

cascade de signalisation.

Finalement, le lien entre la sensibilité hypothalamique aux AGL et la mise en

place des mécanismes régulateurs périphériques (désensibilisation hépatique à

l’insuline) s’établirait grâce au SNA. En l’occurrence, il a été démontré que le

système orthosympathique intervenait via les adrénorécepteurs α2A (Magnan C et

coll., 1999). Afin d’éclaircir ce point, il serait nécessaire d’entreprendre des études

plus approfondies, notamment sur le tronc cérébral.

Ainsi, les lipides circulants interviennent bien dans la régulation de

l’homéostasie énergétique et ce, grâce à une détection cérébrale de leur

concentration (Figure 19).

Figure 19 : Effets des acides gras libres (AGL) indépendants des hormones. NPY: neuropeptide Y ; SNA: système nerveux autonome

- 48 -

Les lipides ne sont pas les seuls à pouvoir intervenir dans le contrôle nerveux

de l’homéostasie énergétique. Le glucose, également étudié dans le cadre de la

théorie glucostatique, fera l’objet des prochains paragraphes.

2.2. Le glucose

2.2.1. Généralités sur l’homéostasie glucidique

Ce monosaccharide circule librement dans le sang à une concentration

d’environ 5 mM soit 1 g/L. Chez les individus sains, la glycémie est maintenue de

manière stricte autour de cette valeur, grâce à des mécanismes de régulation. En

particulier, la production de glucose endogène s’adapte aux besoins énergétiques

des tissus de l’organisme, mais aussi aux apports exogènes provenant de

l’alimentation. Lorsque ceux-ci sont en excès, se mettent en place des processus de

stockage sous forme de glycogène, au niveau hépatique ou musculaire notamment,

et de triglycérides, au niveau du tissu adipeux.

Les monosaccharides tels que le glucose ou le fructose sont directement

assimilables au niveau de la muqueuse digestive. Néanmoins, l’alimentation

quotidienne n’en apporte qu’une faible quantité puisqu’elle est composée

essentiellement de glucides plus ou moins complexes nécessitant une hydrolyse par

différentes enzymes du système digestif. Le glucose est absorbé par les entérocytes

de l’intestin grâce à un transport actif assuré par les SGLT-1 (sodium-glucose

cotransporteur). Du côté basal des cellules, l’hexose est libéré dans la circulation

sanguine grâce à un transport facilité assuré par GLUT2. Les capillaires intestinaux

convergeant en direction de la veine porte hépatique, une partie du glucose est

stockée à ce niveau sous forme de glycogène dans le foie et une autre redistribuée

vers les autres organes (Burcelin R et Pénicaud L, 2003).

Suite à un repas, il apparaît une hyperglycémie dont l’amplitude est

influencée entre autres par la quantité et la nature des glucides ingérés, par les

processus digestifs et par les facteurs hormonaux (Paquot N et coll., 2003). Le

déclenchement des mécanismes de régulation implique une détection préalable des

concentrations de glucose. Les systèmes de sensibilité à ce métabolite existent à

plusieurs endroits stratégiques de l’organisme (Figure 20).

Dans un premier temps, le passage des glucides dans le système gastro-

intestinal induit la libération d’hormones. Il s’agit entre autres de la CCK, du PYY et

du GLP-1, qui possèdent un effet anorexigène de nature cérébrale (Figure 3).

- 49 -

Plus en aval, il existe un système sensible à l’hyperglycémie au niveau de la

veine hépatoportale (Burcelin R et Pénicaud L, 2003). Ce détecteur de glucose, dont

l’organisation cellulaire est encore mal connue, relaye l’information

« hyperglycémie » aux fibres afférentes de la branche hépatique du nerf vague

(Marty N et coll., 2005). Cette information est ainsi acheminée jusqu’au tronc

cérébral au niveau du NTS. Son activation par l’hyperglycémie hépatoportale

entraîne la modulation adéquate de divers processus du métabolisme énergétique :

inhibition de la prise alimentaire, stimulation de l’utilisation du glucose par les

muscles et le tissu adipeux, stimulation du stockage de l’hexose au niveau

hépatique, inhibition de la production des hormones de contre-régulation

(catécholamines, glucagon) (Russek M, 1970 ; Burcelin R et coll., 2000 ; Donovan

CM et coll., 1994).

Figure 20 : Mécanismes de régulation mis en place suite à l’hyperglycémie post-prandiale. Les glucides sont détectés au niveau de l’intestin, et le glucose au niveau de la veine hépatoportale et des cellules β du pancréas. β: cellules β du pancréas ; SNA: système nerveux autonome

Les mécanismes cellulaires découlant de la sensibilité au glucose les mieux

décrits sont ceux déclenchés au niveau des cellules β (cf. § I-2.2, figure 6).

Schématiquement, cette sensibilité est générée par la glycolyse qui débute par la

phosphorylation de l’hexose, de manière proportionnelle à sa concentration, étape

- 50 -

assurée par la GK. La libération d’insuline est déclenchée par la détection directe

du glucose circulant et potentialisée par le GLP-1 libéré par la muqueuse

intestinale.

En plus des cellules β sécrétrices d’insuline, hormone anabolique, le

pancréas possède des cellules α sécrétrices de glucagon, hormone catabolique

entrant en jeu dans le cas d’une hypoglycémie. Son action permet de protéger

l’organisme contre un déficit énergétique pouvant être dangereux, en particulier

pour le SNC. Sa cible essentielle est le foie, au niveau duquel il stimule la

glycogénolyse et la gluconéogenèse afin de libérer du glucose dans la circulation

sanguine. La libération de glucagon est contrôlée par différents mécanismes (Marty

N et coll., 2005). Premièrement, l’insuline contenue dans les îlots de Langerhans la

régule, établissant ainsi un rétrocontrôle négatif levé lors d’une hypoglycémie.

Deuxièmement, la sécrétion de glucagon est sous l’influence du SNA sympathique

dont l’activité est modulée par l’hypoglycémie via une détection préalable du glucose

au niveau de la veine hépatoportale et du SNC (hypothalamus/tronc cérébral).

Enfin, il est probable que les cellules α soient directement sensibles au glucose.

Elles sont dotées, en effet, d’une GK et d’un canal potassique ATP-dépendant

(constitué des sous-unités Kir6.2 et SUR1) comme les cellules β. Néanmoins, ce

dernier mécanisme prête encore à controverse.

Avec les catécholamines, le glucagon fait partie des hormones dites de la

« contre-régulation ». De manière très simplifiée, ces hormones sont libérées lors

d’épisodes hypoglycémiques afin de contrer la diminution de la glycémie. Elles ont

donc des effets opposés à ceux de l’insuline.

2.2.2. Une voie annexe suivie par le glucose : la voie des hexosamines

Tout le glucose disponible dans une cellule n’emprunte pas la voie de la

glycolyse : une petite partie suit la voie des hexosamines. Elle a été découverte il y a

moins de dix ans et semble prometteuse en ce qui concerne la compréhension du

contrôle de l’homéostasie énergétique. Il semble qu’elle soit, au moins en partie,

responsable de la résistance à l’insuline observée chez les diabétiques, puisque

celle-ci est corrélée à une augmentation de l’activité de cette cascade enzymatique

(Buse MG, 2006). Toutefois, il n’a jamais été mis en évidence une relation directe

entre ces deux observations.

Physiologiquement, le glucose entre dans la cellule et est immédiatement

phosphorylé en glucose-6-phosphate par une hexokinase (la GK dans les cellules β),

puis transformé en fructose-6-phosphate (Figure 21). La majeure partie emprunte

- 51 -

alors la voie de la glycolyse, tandis qu’une infime partie (1 à 3%) est prise en charge

par la glutamine fructose-6-phosphate aminotransférase (GFAT) pour donner la

glucosamine-6-phosphate, ce qui constitue la première étape (limitante) de la voie

des hexosamines (Obici S et Rossetti L, 2003).

Figure 21 : Voie des hexosamines. AGL: acides gras libres ; Fruc-6-P: fructose-6-phosphate ; GFAT: glutamine fructose-6-phosphate aminotransférase ; GK: glucokinase ; Glc-6-P: glucose-6-phosphate ; GlcN-6-P: glucosamine-6-phosphate ; GlcNAc: N-acétylglucosamine ; GLUT: transporteur au glucose ; GS: glycogène synthase ; IR: récepteur à l’insuline ; IRS: insulin receptor substrate. D’après Wells L et coll., 2003.

Cette chaîne aboutit à la synthèse d’UDP-N-acétylglucosamine qui est son

produit final, quantifiable, reflétant son niveau d’activation. Il exerce un

rétrocontrôle négatif sur la GFAT, limitant par la même l’entrée de glucose, et

permet la O-glucosamine-N-acétylation de protéines cibles, notamment de facteurs

de transcription (c-myc) ou d’enzymes (glycogène synthase), et de manière

intéressante d’IRS-1 et probablement de GLUT4 (Buse MG, 2006). Ce processus

touchant à ce transporteur au glucose, serait responsable de la résistance à

l’insuline, en favorisant sa translocation à la membrane. Par ailleurs, l’UDP-N-

acétylglucosamine permet aussi la glycosylation de certaines protéines, comme le

transporteur au glucose astrocytaire, GLUT1. Différents niveaux de glycosylation de

- 52 -

ce transporteur pourraient alors être responsables du contrôle de ses mouvements

et des variations de son affinité (Medina RA et Owen GI, 2002). Ainsi la voie des

hexosamines engendrerait la régulation de protéines intervenant dans l’homéostasie

énergétique, en particulier des GLUTs, ce qui permettrait une influence directe sur

l’entrée du glucose dans la cellule et donc sur la sensibilité à cet hexose.

L’UDP-N-acétylglucosamine représente un « carrefour » de la sensibilité des

nutriments, puisque sa concentration intracellulaire est influencée par l’état

nutritionnel de l’organisme (Obici S et Rossetti L, 2003). Elle est nécessaire et/ou

sensible au métabolisme de l’ADP/ATP (« haute énergie »), du glucose, des acides

aminés, des acides gras et des nucléotides comme le montre sa composition

chimique (Wells L et coll., 2003) (Figure 22).

Figure 22 : la voie des hexosamines au carrefour des métabolismes des différents types de nutriments, au travers de l’UDP-N-acétylglucosamine (UDP-GlcNAc). D’après Wells L et coll., 2003.

Il est probable que la voie des hexosamines soit présente au sein du SNC,

pourtant, à ce jour, aucune donnée de la littérature ne le montre clairement.

2.2.3. L’hypothalamus, siège de la sensibilité cérébrale au glucose

Le glucose est la principale source d’énergie du SNC et sa concentration au

sein de cet organe est maintenue constante de façon drastique, sa pénurie pouvant

avoir de graves conséquences. Il traverse la BHE et pénètre dans les cellules grâce

aux transporteurs de glucose, GLUT1, localisé à la membrane des cellules

endothéliales et des astrocytes, et GLUT3, localisé à la membrane des neurones.

- 53 -

Au-delà du rôle énergétique basique, cet hexose joue un rôle dans la

sensibilité aux nutriments comme nous l’avons déjà abordé, c'est-à-dire que sa

concentration sanguine renseigne à tout moment le SNC sur le statut énergétique

d’un organisme. De manière logique, ce sont les régions cérébrales impliquées dans

l’homéostasie énergétique, l’hypothalamus et le tronc cérébral avec leur équipement

moléculaire particulier (cf. § II), qui sont capables de détecter et de répondre aux

variations de glucose. Une augmentation de sa concentration au sein de ces

structures cérébrales, est le reflet d’une balance énergétique positive, et provoquera

la mise en place de processus visant à freiner les apports et à favoriser les

dépenses. A l’opposé, une diminution de cette concentration fait suite à une

hypoglycémie générale, et il s’en suivra des mécanismes inverses, c'est-à-dire des

apports favorisés et des dépenses limitées. Cette détection va permettre le

déclenchement rapide et coordonné de mécanismes de régulation (sécrétion

pancréatique, contrôle du métabolisme glucidique hépatique, etc.) (Figure 23).

Figure 23 : Détection des variations glycémiques par le système nerveux central (SNC). β: cellules β du pancréas ; DMN: noyau hypothalamique dorsomédian ; LH: hypothalamus latéral ; NA: noyau arqué ; PVN: noyau hypothalamique paraventriculaire ; VMN: noyau hypothalamique ventromédian ; SNA: système nerveux autonome

- 54 -

Une nouvelle fois, le NA occupe une place clé dans ce processus de détection,

en raison de la BHE adjacente relâchée. De ce fait, le glucose peut la traverser et

atteindre plus librement l’hypothalamus. Il semble arriver directement au sein du

VMN puisque l’injection intrapéritonéale de glucose radioactif aboutit à des

quantités élevées de radioactivité dans ce noyau. De même, l’administration

d’aurothioglucose, une forme toxique de l’hexose, provoque une vaste lésion de cette

structure (King BM, 2006). De plus, il est vraisemblable qu’au moins au niveau du

NA, les concentrations extracellulaires en glucose avoisinent les valeurs de la

glycémie, ce qui n’est pas le cas dans des structures plus profondes telles que le

striatum ou l’hippocampe (McNay EC et Gold PE, 1999).

La sensibilité de l’hypothalamus au glucose peut être observée indirectement

grâce à l’activité du SNA. Par exemple, il a été démontré que l’injection de glucose

par la carotide induisait la stimulation des nerfs sympathiques innervant le tissu

adipeux brun chez le rat. Or, elle est diminuée de 60 % lorsque le VMN est

préalablement lésé (Sakaguchi T et Bray GA, 1990). De même, au sein de notre

laboratoire, a été mise au point une injection similaire de glucose vers le cerveau, à

une dose ne modifiant pas la glycémie périphérique (9 mg/kg). Ce bolus de glucose

provoque une augmentation très rapide et transitoire de l’insulinémie mettant en

jeu l’activation du SNA parasympathique (Atef N et coll., 1995 ; Alquier T et coll.,

2003). Ce protocole révèle donc la capacité du SNC à détecter une variation de la

glycémie. La rapidité de la réponse insulinémique (1 minute) ne peut guère que

laisser suggérer l’implication de l’hypothalamus et/ou du tronc cérébral dans cette

détection, en raison de leurs relations privilégiées avec le compartiment sanguin

(absence de BHE véritable).

D’autres travaux ont cherché à mettre en évidence, de manière plus directe,

la sensibilité globale au glucose de l’hypothalamus, grâce à l’utilisation du proto-

oncogène c-fos caractéristique des cellules nerveuses activées (principe de la

technique décrit au § IV-2). Ainsi, la perfusion de glucose par la carotide pendant 1

heure vers le SNC de rats stimule les VMN, DMN et PVN (Dunn-Meynell AA et coll.,

1997). L’injection intrapéritonéale simultanée de glucose et d’insuline provoque une

augmentation de l’expression de c-Fos dans les VMN, PVN, NA et le LH (Carrasco M

et coll., 2001).

A l’inverse, l’administration de 2-déoxy-D-glucose (2-DG), un analogue du

glucose non métabolisé induisant une glucopénie cellulaire, est suivie de l’activation

- 55 -

des PVN, NA, du noyau périventriculaire et de l’aire hypothalamique antérieure

(Briski KP, 1998).

2.2.4. Acteurs cellulaires impliqués dans la détection du glucose

Il existe deux grandes populations de cellules nerveuses : les neurones,

responsables de l’activité électrique du SNC, et les cellules de soutien appelées

cellules gliales, dix à cinquante fois plus nombreuses (Campbell NA, 1995). Parmi

ces dernières, ce sont les astrocytes qui nous intéressent, car il semblerait qu’ils

puissent être impliqués dans la sensibilité du glucose par le cerveau. Ils entourent,

entre autre, les vaisseaux sanguins, participant ainsi à la BHE, et ont un rôle dans

l’apport d’énergie aux neurones.

Les neurones

C’est en 1964 qu’a été établie la preuve de l’existence de neurones sensibles

au glucose dans l’hypothalamus (Anand BK et coll., 1964). Depuis, leur

caractérisation s’est développée simultanément aux techniques, notamment grâce

au patch-clamp qui consiste en l’enregistrement direct de l’activité électrique d’une

seule cellule. Selon leur réponse à une variation de la concentration extracellulaire

au glucose ([glucose]e), les neurones sont maintenant classés en trois grands

groupes : i) les neurones non sensibles au glucose, ii) les neurones gluco-excités

(GE) dont l’activité électrique est proportionnelle à la [glucose]e et iii) les neurones

gluco-inhibés (GI) dont l’activité électrique est inversement proportionnelle à la

[glucose]e. Actuellement, les travaux de recherches visent à définir de mieux en

mieux leur équipement moléculaire (Kang L et coll., 2004) (Figure 24).

Les neurones sensibles au glucose (GE et/ou GI) ont été localisés dans les

noyaux VMN, NA, PVN, le noyau suprachiasmatique et le LH, c’est-à-dire dans des

régions impliquées dans le contrôle de l’homéostasie énergétique (Levin BE et coll.,

2002). Dans le VMN, 14 % des neurones étudiés sont GE et 3 % sont GI (Song Z et

coll., 2001). Dans le NA, 20-25 % sont GE et 10-12 % GI, et chez le rat il existe une

régionalisation de ces 2 types, avec une majorité de GE dans le NA latéral et une

majorité de GI dans le NA médian (Fioramonti X et coll., 2004 ; Wang R et coll.,

2004).

- 56 -

Figure 24 : Effet du glucose sur l’activité électrique de neurones du noyau arqué. Neurone GE: gluco-excité ; Neurone GI: gluco-inhibé. D’après Fioramonti X et coll., 2004.

Il a aussi été démontré que les neurones à NPY/AgRP du NA et ceux à

orexines du LH sont activés par un état d’hypoglycémie : l’injection aiguë de 2-DG

(600 mg/kg) augmente, 2 heures après, la quantité d’ARNm NPY/AgRP, révélée par

hybridation in situ, et l’injection aiguë d’insuline (20 UI/kg) induit, 3 heures après,

l’expression de c-Fos dans des neurones immunopositifs pour l’orexine (Sergeyev V

et coll., 2000 ; Moriguchi T et coll., 1999) (Figure 25). En revanche, les neurones à

POMC sont inhibés dans ces conditions énergétiques : leur activité électrique,

mesurée par patch-clamp, diminue lorsque la [glucose]e passe de 10 à 5 mM

(Ibrahim N et coll., 2003). Enfin, l’injection de 2-DG directement dans le SNC induit

l’augmentation de la quantité des ARNm de l’AgRP accompagnée d’une stimulation

de la prise alimentaire (Stütz AM et coll., 2005). A l’inverse, l’application de ces

neuropeptides modulent l’activité des neurones de type GE qui se montrent

immunonégatifs pour le POMC : le NPY les inhibe, tandis que l’α-MSH les active

(Wang R et coll., 2004).

- 57 -

Figure 25 : Effets d’une hypoglycémie sur certains neurones hypothalamiques et influence de neuropeptides sur les neurones GE (gluco-excités). AgRP: agouti-related protein ; α-MSH: α-melanocyte-stimulating hormone ; CART: cocaine- and amphetamine-regulated transcript LH: hypothalamus latéral ; NA: noyau arqué ; NPY: neuropeptide Y ; POMC: pro-opiomélanocortine

Les astrocytes

Le neurone est considéré comme la cellule « noble » du cerveau, étant

responsable de son activité électrique et ainsi de la conduction des informations. Il

en résulte que les autres cellules nerveuses sont moins bien étudiées. Toutefois,

depuis plusieurs dizaines d’années, on observe un développement des travaux

concernant les astrocytes. En effet, il s’avère que ces cellules auraient une vocation

bien plus importante, ne s’arrêtant pas uniquement à un rôle de soutien.

Tout d’abord, ce type particulier de cellules gliales participent à la BHE,

protégeant ainsi le SNC des intrusions ou des influx aspécifiques (protéines, ions)

afin d’y maintenir au mieux l’homéostasie (Gloor SM et coll., 2001) (Figure 26).

- 58 -

Figure 26 : Fonctions principales de l’astrocyte. D’après http://learn.genetics.utah.edu/units/addiction/reward/cells.cfm

Les astrocytes sont aussi des fournisseurs d’énergie pour les neurones qui en sont

de gros consommateurs de part leur activité quasi permanente. Pour cela, ces

cellules gliales ont la capacité de stocker du glucose sous forme de glycogène,

stocks qui seront dégradés selon les besoins (Kong J et coll., 2002). La majeure

partie de l’énergie fournie aux neurones l’est sous forme de lactate provenant de la

glycolyse astrocytaire. En effet, les neurones sont capables de le capturer et de le

transformer en pyruvate dont le catabolisme aboutira à la synthèse d’ATP (Bouzier-

Sore AK et coll., 2002) (Figure 27).

D’autre part, les astrocytes ont un rôle important dans le maintien de la

fonctionnalité des synapses et donc des circuits neuronaux, notamment en régulant

les concentrations ioniques extracellulaires en potassium (Tsacopoulos M et

Magistretti PJ, 1996). De la même façon, les neurotransmetteurs libérés sont

recyclés par l’astrocyte afin d’éviter toute excitotoxicité par accumulation dans la

fente synaptique. Or 80 à 90 % des synapses sont de nature glutamatergique, c'est-

à-dire excitatrice (Paemeleire K, 2002). Le recyclage du glutamate s’imbrique dans

- 59 -

un couplage métabolique astrocytes-neurones (Tsacopoulos M et Magistretti PJ,

1996) (Figure 27).

Figure 27 : Schéma du couplage astrocyte-neurone. La flèche A indique la condition d’activation et la flèche B la condition basale. G: protéine G ; Gln: glutamine ; GLUT: transporteur au glucose ; GS: glutamine synthase ; Lac: lactate ; PGK: phosphoglycérate kinase ; Pyr: pyruvate. Modifié à partir de Tsacopoulos M et Magistretti PJ, 1996.

Le glutamate libéré par le neurone présynaptique est capturé par les

astrocytes adjacents, grâce à un cotransport fonctionnant avec le gradient sodique.

Ce mécanisme engendre une accumulation locale de sodium dans la cellule. Ceci

entraîne alors une augmentation de l’activité de la Na+/K+ ATPase et donc de la

consommation d’ATP. Il s’ensuit une stimulation de la glycolyse astrocytaire, elle-

même entraînant une augmentation du transport de glucose via GLUT1.

Simultanément à l’ATP, est produit du lactate qui sera utilisé par les neurones

adjacents (cf. plus haut). Le glutamate est transformé en glutamine via la glutamine

synthase (GS), qui pourra être redistribuée aux neurones afin de régénérer du

glutamate.

Ces différentes données montrent clairement qu’il existe un couplage entre

les neurones et les astrocytes, les seconds étant essentiels à la survie des premiers.

- 60 -

En ce qui concerne la sensibilité centrale au glucose, des travaux suggèrent

de plus en plus que les astrocytes interviendraient directement dans ce processus.

Une idée reçue est que les neuropeptides seraient uniquement dédiés aux

neurones. Or, ils sont aussi exprimés dans les cellules gliales et il existe une

régionalisation cérébrale de cette expression. Il semblerait en particulier que les

astrocytes pourraient synthétiser du NPY, du moins in vitro, et seraient

immunopositifs pour l’AgRP au niveau du NA et à proximité de l’éminence médiane

(Ubink R et coll., 2003 ; Dunbar J et coll., 2004). La présence de ces protéines

montre qu’ils disposent d’un équipement moléculaire typique du contrôle de

l’homéostasie énergétique en général. Cette hypothèse est renforcée par le fait que

quelques unes de ces cellules nerveuses possèdent aussi le récepteur à insuline et

d’autres, localisées dans le NA, sont anatomiquement proches de neurones

sensibles à la leptine (Schwartz MW et coll., 1992 ; Young JK, 2002).

Enfin, une possible implication directe des astrocytes dans la sensibilité du

glucose a été montrée au travers d’un article, dans lequel l’interruption du couplage

astrocytes/neurones par l’inhibition de la GS, bloque l’activation du NTS

normalement observée suite à l’injection de 2-DG (Young JK et coll., 2000).

Par ailleurs, une autre population de cellules gliales est sensible au glucose,

prouvant que cette sensibilité n’est pas une caractéristique exclusive aux neurones.

En effet, des travaux montrent que des épendymocytes isolés (cellules bordant les

cavités ventriculaires) sont sensibles à des changements de la concentration

extracellulaire en glucose, ceci étant étudié en suivant les fluctuations de leur

concentration intracellulaire en calcium (Moriyama R et coll., 2004). 30% de ces

cellules gliales répondraient soit à une diminution de 10 à 2 mM, soit à une

augmentation de 10 à 20 mM de la [glucose]e. De manière surprenante, dans les

deux cas, la réponse est une augmentation de la concentration intracellulaire en

calcium suite à une entrée de calcium par des canaux voltage-dépendants. Enfin, la

majorité de ces épendymocytes sensibles au glucose expriment la GK, enzyme-clé

de la sensibilité au glucose des cellules β du pancréas (cf. I-2.2 et figure 6).

2.2.5. Acteurs moléculaires

La sensibilité au glucose est particulièrement bien connue au niveau des

cellules β. Elle est indispensable à une sécrétion adéquate d’insuline en fonction

des variations de la glycémie. Or, on peut penser que ce type de mécanisme existe

également au niveau hypothalamique, suggérant que les cellules nerveuses

- 61 -

directement impliquées possèderaient des caractéristiques similaires, notamment la

présence du canal potassique ATP-dépendant composé des sous-unités Kir6.2 et

SUR1, du transporteur au glucose GLUT2 et de l’hexokinase particulière, la

glucokinase (GK) (Pénicaud L et coll., 2002). Notre projet s’intéresse aux deux

dernières protéines.

Le canal potassique ATP-dépendant Kir6.2-SUR1

Kir6.2 (inwardly rectifying K+ channel), formé de 4 sous-unités α, constitue le

pore et se trouve associé au complexe SUR1 (sulfonylurea receptor) composé de 4

sous-unités β. Grâce à lui, les ions potassiques sortent de la cellule et sa fermeture

provoque l’accumulation de charges positives aboutissant finalement à la

dépolarisation de la membrane cytoplasmique.

La mise en évidence de son implication dans la sensibilité au glucose s’est

d’abord faite dans la cellule β du pancréas (Aguilar-Bryan L et Bryan J, 1999)

(Figure 6). Kir6.2 intervient dans la détection pancréatique de l’hyperglycémie car,

contrairement à l’autre isoforme Kir6.1, il est très sensible à l’ATP (dont la

concentration augmente avec l’augmentation de [glucose]e) qui, en se liant au pore,

induit sa fermeture (Quast U, 2000). Dans ce type cellulaire, Kir6.2 est associé à

SUR1. Ce complexe est capable de lier l’ATP, mais il possède davantage d’affinité

pour l’ADP. Cette liaison est donc favorisée lorsque le rapport ATP/ADP diminue,

c’est-à-dire lorsque la [glucose]e diminue, et elle conduit à l’ouverture du canal.

Le canal Kir6.2-SUR1 a ensuite été recherché au niveau du SNC afin de

déterminer si là aussi, sa présence était indispensable à la détection du glucose. Or

les 2 isoformses ont bien été retrouvées, notamment dans les régions cérébrales

liées à l’homéostasie énergétique suggérant un rôle cérébral similaire (Dunn-

Meynell AA et coll., 1998). Cette hypothèse est renforcée par les résultats de RT-

PCR sur cellule unique appliquée à des neurones GE du VMN et du NA, indiquant

la synthèse de leurs ARNm (Ibrahim N et coll., 2003). Par ailleurs, l’application de

sulfonylurées, molécules qui vont se lier au complexe SUR et conduire ainsi à la

fermeture du canal, qui miment donc une augmentation de la [glucose]e, active les

neurones GE du VMN (Kang L et coll., 2004).

Toutefois, des travaux menés au laboratoire indiquent qu’il existe un

mécanisme de sensibilité cérébrale au glucose pour lequel les canaux potassiques

ATP-dépendant ne sont pas requis (Fioramonti X et coll., 2004). Ces deux processus

ne semblent pas exclusifs et doivent probablement se compléter en fonction de la

[glucose]e.

- 62 -

Le transporteur au glucose GLUT2

D’une manière générale, les transporteurs au glucose GLUT sont des

protéines à 12 domaines transmembranaires, assurant le transport facilité de cet

hexose et de ses analogues non métabolisables (entre autres, le 2-DG), ainsi que du

fructose ou de l’acide ascorbique (Medina RA et Owen GI, 2002).

Dans le SNC, les principaux GLUTs assurant le transport basal du glucose

nécessaire à la vie normale des cellules sont GLUT1, présent dans les cellules

endothéliales et les astrocytes, et GLUT3, spécifiquement neuronal. Tous les deux

présentent une constante de Michaelis (Km) faible, comprise entre 1 et 3 mM, c'est-

à-dire qu’ils présentent une forte affinité pour le glucose et sont donc saturés pour

une glycémie normale de 5 mM (Thorens B, 1992). A côté de ces transporteurs

ubiquitaires, d’autres GLUTs sont présents dans le SNC de manière plus localisée,

en plus faibles densités. C’est le cas de GLUT2, qui nous intéresse.

GLUT2 a été découvert, cloné et étudié pour la première fois par l’équipe de

B. Thorens en 1988. Il a d’abord été qualifié de « transporteur au glucose du foie »

bien qu’il soit aussi localisé dans l’intestin, le rein et les cellules β des îlots de

Langerhans et le SNC. Le transport est spécifique à l’énantiomère dextrogyre du

glucose (Thorens B et coll., 1988). Il se différencie des autres GLUT par son Km élevé

(environ 20 mM), ce qui révèle une faible affinité pour le D-glucose. Celui-ci est

donc transporté de manière proportionnelle à sa concentration environnante, sans

présenter de phénomène de saturation dans les gammes physiopathologiques de

glycémie (Thorens B, 1992).

La présence de GLUT2 (ARNm et protéine) dans le SNC a été démontrée au

sein de notre laboratoire en 1994, en particulier dans les NTS, DMV, PVN, NA et le

LH, renforçant l’hypothèse de son implication dans la régulation de l’homéostasie

énergétique (Leloup C et coll., 1994). Par la suite, des expériences de colocalisation

ont indiqué que ce transporteur était exprimé à la fois par des neurones, des

oligodendrocytes (cellules formant la gaine de myéline des neurones) et des

astrocytes (Arluison M et coll., 2004). Au sein du NA, GLUT2 est retrouvé le long du

troisième ventricule dans les épendymocytes, dans quelques astrocytes, mais

également dans les tanycytes, épendymocytes spécialisés dont le corps cellulaire

forme la paroi basale du troisième ventricule et qui possèdent de longs

prolongements atteignant l’éminence médiane, constituant ainsi un lien cellulaire

- 63 -

entre le liquide céphalo-rachidien et le sang (Ngarmukos et coll., 2001 ; Young JK et

McKenzie JC, 2004 ; Garcia MA et coll., 2003).

Par la suite, il a été démontré que GLUT2 occupait une place majeure dans la

sensibilité cérébrale au glucose. En effet, l’injection d’antisens GLUT2, directement

dans le NA, bloque l’augmentation de l’insulinémie normalement induite par

l’injection aiguë de glucose par la carotide vers le SNC de rats (cf. § III-2.2.3) (Leloup

C et coll., 1998). Simultanément, un autre groupe de chercheurs a suivi une

démarche similaire, où l’injection des antisens a été réalisée, cette fois, dans le

ventricule latéral. Les rats traités présentent une diminution du poids corporel et de

la prise alimentaire basale, qui n’est plus stimulée par du 2DG (Wan HZ et coll.,

1998).

Enfin, l’importance de GLUT2 dans la régulation de la balance énergétique

s’observe au travers du phénotype des souris qui en sont privées. L’invalidation

totale de son gène est létale. Néanmoins, un phénotype viable peut être obtenu en

compensant l’absence de GLUT2 par une expression de GLUT1 au niveau des

cellules β. Bien que l’insulinémie, la leptinémie et la glycémie de ces animaux soient

normales, ces souris présentent une augmentation de la prise alimentaire ainsi

qu’une absence de régulation des neuropeptides orexigènes/anorexigènes et des

concentrations circulantes de ghréline (Bady I et coll., 2006). De plus, l’injection

intrapéritonéale de glucose (400 mg/kg) n’inhibe plus, et celle de 2-DG (150 mg/kg)

ne stimule plus, la prise alimentaire. De même, l’expression des neuropeptides

hypothalamiques NPY, AgRP, POMC, CART, n’est plus modulée par l’injection

intracérébroventriculaire de glucose (5 μl, 20 mg/ml). Finalement, l’expression

exclusivement astrocytaire de GLUT2 chez ces souris, permet de restaurer une

sécrétion de glucagon après injection intrapéritonéale ou intracérébroventriculaire

de 2-DG, ainsi qu’une activation du NTS et du DMV révélée par l’expression de c-

Fos (Marty N et coll., 2005).

Ainsi, l’ensemble de ces données suggèrent fortement que GLUT2 fait partie

intégrante des mécanismes sous tendant la sensibilité au glucose dans le SNC.

La glucokinase (GK)

Il s’agit de l’hexokinase IV responsable de la sensibilité au glucose des

cellules β. Elle possède une faible affinité pour ce sucre et en assure sa

phosphorylation. Cette étape est limitante pour la glycolyse qui précède le cycle de

Krebs, fournisseur principal d’ATP. A la différence des autres hexokinases, la GK

- 64 -

n’est pas inhibée par son produit, le glucose-6-phosphate. Cette caractéristique

fondamentale permet un degré de phosphorylation du métabolite proportionnel à

son entrée dans la cellule et de ce fait, aboutit à un niveau de synthèse d’ATP en

relation directe avec les quantités intracellulaires de glucose. Ainsi, par analogie

avec la cellule β, on peut penser que dans les cellules cérébrales sensibles au

glucose, pourvues de GK, le ratio ATP/ADP augmenterait parallèlement à la

glycémie, provoquant la fermeture de canaux potassiques dépendants de l’ATP et à

une dépolarisation membranaire (Schuit FC et coll., 2001) (Figure 28).

Figure 28 : Schéma illustrant la sensibilité au glucose dans les cellules nerveuses, comprenant les deux protéines-clé, GLUT2 et GK. Ca2+: ions calciques ; CaVm: canal calcique voltage-dépendant ; GK: glucokinase ; GLUT2: transporteur au glucose 2 ; K+: ions potassiques ; KATP: canal potassique ATP-dépendant.

Des travaux d’immunohistochimie révèlent la présence de la GK le long des

parois du canal central et des différents ventricules (latéraux, troisième et

quatrième) (Maekawa et coll., 2000). Le marquage est cytoplasmique et la majorité

des cellules positives sont des épendymocytes. Aucun signal n’est observé dans

l’area postrema ni dans le NTS. Au niveau de l’hypothalamus, seuls les

épendymocytes et quelques cellules localisées à proximité du 3ème ventricule sont

- 65 -

marquées. Ces cellules gliales possédant la GK, sont aussi positives pour GLUT2 ;

le marquage GLUT2 est alors restreint à la partie ciliaire (Maekawa et coll., 2000). Il

est important de noter que les épendymocytes du canal central sont pour la plupart

sensibles aux variations de glucose (cf. § III-2.2.4). De manière intéressante, cette

sensibilité disparaît lorsque la GK est inhibée par l’application d’alloxane, composé

employé pour bloquer cette activité enzymatique (Moriyama R et coll., 2004).

Des résultats d’hybridation in situ confortent aussi l’hypothèse de

l’implication de la GK, couplée à GLUT2, dans la sensibilité cérébrale au glucose,

puisque leurs ARNm sont retrouvés colocalisant au niveau de la paroi du troisième

ventricule, comme dans le cas de la protéine. Néanmoins, un marquage au niveau

du noyau supraoptique, du NA, de l’éminence médiane, des VMN, DMN, PVN et le

LH est aussi révélé (Navarro M et coll., 1996 ; Lynch RM et coll., 2000). Au sein du

NA, des neurones à NPY, à POMC et à GABA expriment la GK (Dunn-Meynell AA et

coll., 2002). Enfin, des travaux ont permis de montrer que dans le tronc cérébral,

les neurones GE et GI du DMV l’exprimaient aussi, tandis que dans

l’hypothalamus, c’est le cas pour 64 % des GE et 43 % des GI du VMN (Balfour RH

et coll., 2006 ; Kang L et coll., 2004).

Ces diverses études, bien que parfois un peu contradictoires, laissent à

penser que, comme GLUT2, la GK est bien impliquée dans la sensibilité au glucose

dans le SNC au niveau des épendymocytes, et vraisemblablement des neurones et

des astrocytes.

- 66 -

IV – Nos objectifs et démarches scientifiques

Dans les modèles intégrés, la sensibilité cérébrale au glucose est le plus

souvent envisagée dans le contexte d’une glucoprivation par l’utilisation du 2-DG,

un analogue non métabolisable du glucose (Briski KP, 1998 et 2000 ; Young JK et

coll., 2000). Lorsque l’hyperglycémie est directement étudiée, elle se trouve

généralement dans un cadre à long terme, avec une injection chronique et/ou

périphérique du monosaccharide (Dunn-Meynell AA et coll., 1997 ; Carrasco M et

coll., 2001).

Contrairement à ces travaux, notre objectif est d’étudier les mécanismes de

la sensibilité cérébrale au glucose à très court terme, afin de mettre en évidence :

1. les régions cérébrales sensibles à une hyperglycémie et donc à une

augmentation de la concentration extracellulaire en glucose

2. les types cellulaires impliqués : neurones et/ou cellules gliales

3. les acteurs moléculaires mis en jeu : GLUT2 et/ou la GK.

1. Notre modèle d’hyperglycémie cérébrale

Nous avons opté pour une injection aiguë d’une solution de glucose via la

carotide et ce, chez le rat éveillé. Pour ce faire, nous avons repris et adapté un

modèle précédemment mis en place au laboratoire qui consiste en l’insertion d’un

cathéter dans la carotide en direction du cerveau, permettant l’injection d’un bolus

de glucose (9 mg/kg soit une solution à 115 mM) sans effet sur la glycémie

périphérique mais induisant très rapidement une stimulation transitoire de la

sécrétion d’insuline (Leloup C et coll., 1998). Ce protocole avait été jusqu’alors,

utilisé sur des animaux anesthésiés.

Une difficulté majeure dans l’étude de la sensibilité au glucose in vivo, est de

différencier son effet direct de celui de l’insuline, puisqu’une hyperglycémie induit

immédiatement la libération de l’hormone pancréatique. Comme le bolus injecté ne

modifie pas la concentration en glucose périphérique, mais vraisemblablement celle

dans le SNC au vu de la dose injectée, nous pouvons dire que les effets observés

mettent en jeu une détection cérébrale d’une hyperglycémie locale, et non de

l’insuline.

Il s’agit dès lors de déterminer si, dans ce protocole, l’hypothalamus, et plus

précisément certains noyaux, sont activés suite à cette injection aiguë,

responsables de la réponse nerveuse induisant la génération d’un « pic » d’insuline.

Pour cette mise en évidence, l’expression du proto-oncogène c-fos a été utilisée.

- 67 -

2. Le proto-oncogène c-fos

Cette technique est très largement utilisée dans le domaine des

neurosciences. Nous avons commencé par la valider en reprenant un modèle décrit

dans la littérature (Briski KP et Brandt JA, 2000).

c-Fos est une protéine qui se lie à d’autres produits de gènes précoces, le

plus souvent de la famille Jun, pour former des dimères s’accrochant au domaine

de liaison AP-1 de l’ADN. Ceci permet finalement un contrôle adéquat de la

transcription suite à un signal donné. A l’état basal, l’expression de c-Fos est faible

dans l’ensemble du SNC. Elle augmente fortement suite à un stimulus et ce, de

manière spécifique dans certaines régions cérébrales, en accord avec l’agent

inducteur. La protéine peut être détectée par immunohistochimie classique et le

marquage obtenu est nucléaire. Sa concentration est maximale environ 2 h après la

stimulation et diminue ensuite (Hoffman GE et coll., 1993).

L’utilisation de cette protéine a été validée en comparant les résultats

obtenus suite à un stimulus donné avec ceux d’autres techniques déjà connues

comme celle de l’autoradiographie via le 2-DG tritié. L’avantage crucial par rapport

à cette dernière, est que l’on obtient une cartographie d’activation cérébrale de

résolution cellulaire, permettant ainsi des doubles marquages dont nous avions

besoin pour déterminer ensuite le(s) type(s) cellulaire(s) entrant en jeu (Sagar SM et

coll., 1988).

3. Outils pharmacologiques

Nous avons entrepris la caractérisation du, ou des types cellulaires activés,

par double immunohistochimie dirigée contre c-Fos et un marqueur spécifique des

neurones ou des astrocytes ou des oligodendrocytes. Comme les données de la

littérature laissent à penser que les astrocytes seraient directement impliqués dans

la détection cérébrale du glucose, notre démarche a été d’altérer le métabolisme des

carbohydrates spécifiquement dans ces cellules, suggérant l’interruption de leur

couplage métabolique avec les neurones (Young JK et coll., 2000). La méthionine

sulfoximine (MSO) a été employée à cette fin.

Enfin, selon notre hypothèse, les cellules nerveuses sensibles au glucose

mettent en jeu des mécanismes similaires à ceux des cellules β du pancréas,

notamment le couple protéique GLUT2/GK (Pénicaud L et coll., 2002). Nous avons

donc opté pour une approche pharmacologique en utilisant des inhibiteurs de la

GK, l’alloxane et la glucosamine (GlcN). L’avantage du premier est qu’il serait

- 68 -

spécifiquement transporté par GLUT2 (Elsner M et coll., 2002) (cf. § III-2.2.5). Or il

n’existe pas d’inhibiteur sélectif de ce transporteur. La GlcN est transportée

indifféremment par les transporteurs au glucose.

Notons que l’utilisation d’agents pharmacologiques pose toujours le problème

de la spécificité de l’effet observé. C’est pourquoi, une série d’expériences

supplémentaires a été réalisée afin de limiter au plus cette éventualité.

Chaque agent pharmacologique sera développé dans la partie

«Résultats/Discussion ».

- 69 -

MMaattéérriieellss eett MMéétthhooddeess

- 70 -

V – Animaux

L’ensemble des travaux a été réalisé sur des rats mâles Wistar de 300 ± 30 g

(Charles River) maintenus en élevage au service de zootechnie de l’IFR 31 dans une

pièce éclairée 12 h par jour (de 7 h à 19 h), et dont la température est maintenue

constante à 22°C. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture (régime

standard de laboratoire). Les expériences se sont déroulées sur des rats nourris.

VI – Etude de l’activation cérébrale

1. Validation de la technique Fos : injection de 2-déoxyglucose

Les mises au point des techniques de fixation intracardiaque des rats et de

l’immunohistochimie Fos ont été faites à partir du modèle de Briski KP et Brandt

JA, 2000, dans lequel du 2-déoxyglucose (2-DG), analogue du glucose non

métabolisé par les cellules, est utilisé pour mimer une glucopénie cellulaire.

Les rats éveillés ont ainsi reçu une injection intrapéritonéale de 500 μl d’une

solution de 2-DG (160 mg/ml) dilué dans du NaCl 0,9 %, tandis que les rats

contrôles ont reçu 500 μl de la solution véhicule. La fixation intracardiaque a été

effectuée 2 h après.

2. Microchirurgie : pose d’un cathéter « à demeure » dans la carotide

L’expression de c-fos peut être induite par une large palette de stimuli

incluant notamment les stress de diverses origines comme les anesthésies ou

chirurgies. C’est pourquoi les rats ont été opérés plusieurs jours avant l’injection

intracarotidienne.

Les animaux sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale de

pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids, Centravet, Lapallise). Un cathéter (0,5 x

0,9 mm, silicone, Access Technologies, Netherlands) contenant du sérum

physiologique hépariné (100 U/ml, Sigma, St Quentin Fallavier) est inséré dans

l’artère carotidienne interne gauche en direction du cerveau et maintenu en place

par plusieurs ligatures à l’aide de fils non-résorbables. L’autre extrémité du cathéter

est alors passée sous la peau pour ressortir dorsalement au niveau du cou. Des

points de suture sont réalisés et permettent notamment le maintien en place du

cathéter. Ce dernier est ensuite rempli d’une solution héparinée de

- 71 -

polyvinylpyrrodilone à 20 % (Sigma) afin d’empêcher son obstruction par

coagulation sanguine, puis son ouverture bouchée.

Jusqu’au jour de l’expérimentation, les rats sont pesés quotidiennement pour

suivre la reprise de leur poids, bon indice de leur récupération. Le cathéter est rincé

avec du sérum physiologique hépariné et à nouveau rempli avec la solution

héparinée de polyvinylpyrrodilone. Cette manière de procéder, outre le fait qu’elle

évite tout risque d’obstruction du cathéter, permet d’habituer les animaux à être

manipulés par l’expérimentateur et à recevoir une « injection » à l’état éveillé.

3. Protocoles d’injection

Ils ont lieu 4 à 7 jours après la chirurgie. Toutes les injections carotidiennes

se déroulent le matin entre 9 et 11 h lorsque la concentration cérébrale en

glycogène est relativement stable (Helary-Bernard K et coll., 2000) et directement au

service de zootechnie, afin d’éviter toute variabilité liée au stress ou au statut

métabolique de chaque animal.

Les rats éveillés reçoivent une injection (130 μl en 35 s) de glucose (9 mg/kg,

300 mOsmoles, n=11) ou de sérum physiologique (n=7) via le cathéter

intracarotidien. Ce protocole est connu pour induire, chez le rat anesthésié, une

sécrétion rapide et transitoire d’insuline de nature nerveuse, sans modification de la

glycémie périphérique (Atef N et coll., 1995).

Deux autres groupes d’animaux ont été prétraités 18 h avant, avec une

injection par voie intrapéritonéale de L-méthionine sulfoximine (MSO, 100 mg/kg,

Sigma, MSO/glucose n=12, MSO/NaCl n=9) (cf. § III-2.2.4). La concentration et la

durée du prétraitement ont été choisies pour induire une accumulation maximale

du glycogène cérébral, reflet de l’altération du métabolisme des carbohydrates dans

les astrocytes, tout en limitant l’effet convulsif de la MSO (Young JK et coll., 2000).

4. Fixation intracarotidienne et intracardiaque

Les rats sont anesthésiés avec du pentobarbital sodique 2 h après le

protocole d’injection, au moment où la concentration en protéine c-Fos est

maximale suite à un stimulus (Hoffman GE et coll., 1993).

Le cathéter carotidien est relié à une seringue (installée sur un pousse-

seringue) contenant de la solution de fixation (formaldéhyde 4 % - acide picrique

0,2 %). Suite à une laparotomie, le cœur est mis à nu et la veine cave inférieure

sectionnée afin de permettre l’évacuation du sang, puis des liquides perfusés. Très

rapidement, une aiguille, reliée à un double système de perfusion (sérum

- 72 -

physiologique hépariné et solution fixatrice) est introduite dans le ventricule

gauche. Le débit est régulé par une pompe péristaltique (200 ml/h). Pendant les 3

premières minutes, l’injection de sérum physiologique hépariné permet l’élimination

du sang. La solution de fixation est alors perfusée pendant 1 h par les 2 voies

(carotidienne et cardiaque) (Figure 29).

Figure 29 : Système de perfusion pour la fixation intracardiaque/intracarotidienne. FA : formaldéhyde.

Après décapitation, le cerveau est prélevé, postfixé toute la nuit à 4°C dans la

même solution de fixation, puis laissé en imbibition dans du tampon sucrose 20 %

(rôle cryoprotecteur) pendant au moins 3 jours à 4°C. Une tranche épaisse

contenant la région hypothalamique est alors plongée dans un produit d’enrobage

pour congélation (Cryomount, Histolab) et le tout est congelé à -90°C dans de

l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Le bloc ainsi obtenu est conservé à -80°C

jusqu’à utilisation.

5. Immunohistochimie c-Fos

Des coupes successives de 45 μm d’épaisseur situées dans la région

hypothalamique, de -0,80 mm à -3,8 mm par rapport au bregma en accord avec

- 73 -

l’atlas stéréotaxique (Paxinos G et Watson C, 1986), sont obtenues à l’aide d’un

cryostat (température de la chambre à -20°C, température du porte-objet à -15°C,

Leica, Rueil Malmaison). Elles sont immédiatement réparties dans des plaques de

24 puits contenant du PBS (Phosphate-Buffered Saline).

Une coupe sur deux est utilisée. Toutes les étapes se déroulent sous

agitation à température ambiante.

Les coupes flottantes sont tout d’abord lavées avec du PBS. L’activité des

peroxydases endogènes est ensuite neutralisée avec un traitement de 30 min dans

une solution de H2O2 0,3 % (Sigma) - PBS. Après une nouvelle série de lavages, les

sites antigéniques aspécifiques sont bloqués pendant au moins 2 h grâce à une

solution de triton 0,25 % (X100, Sigma) - NGS (Normal Goat Serum, Sigma) 3 % -

PBS. Les coupes sont mises en présence de l’anticorps primaire polyclonal anti-c-

Fos (antisérum Ab-5 de lapin dirigé contre les résidus 4 à 17 de la protéine c-Fos

humaine, Oncogene, USA) dilué à 1/10000 dans du triton 0,25 % - PBS, toute la

nuit à 4°C.

Après 4 lavages, les coupes sont plongées pendant 1 h dans une solution

d’anticorps secondaire biotinylé dirigé contre les IgG de lapin (antisérum de chèvre,

H + L, Jackson Laboratories, USA) dilué à 1/2000 dans du triton 0,25 % - PBS.

Après rinçages, elles sont alors mises à incuber pendant 1 h dans une solution de

streptavidine peroxydase (Jackson Laboratories) diluée à 1/2000 dans du triton

0,25 % - PBS. Les coupes sont une dernière fois lavées et l’activité peroxydase est

révélée grâce à une solution de diaminobenzidine/nickel ammonium sulfate (DAB-

Nickel) (Shu S et coll., 1988). La coloration est arrêtée avec de l’eau. Les coupes

sont montées sur lames silanisées, déshydratées et finalement incluses dans une

résine (Eukitt, CML).

Afin de contrôler la spécificité du marquage, l’anticorps primaire est omis à

chacune des premières coupes de cerveau (incubée alors dans du triton 0,25 % -

PBS). De plus, elle a également été vérifiée par compétition avec le peptide

immunogène (Oncogene) utilisé 100 fois plus concentré que l’anticorps.

6. Double immunohistochimie c-Fos / marqueur cellulaire

Dans le but de déterminer le ou les type(s) cellulaire(s) immunopositif(s) pour

c-Fos, des coupes ont fait l’objet d’une double immunohistochimie pour c-Fos et un

marqueur cellulaire : CNPase (2’, 3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase) pour les

- 74 -

oligodendrocytes, GFAP (glial fibrillary acidic protein) pour les astrocytes et NeuN

(neuronal nuclei) pour les neurones.

La première étape consiste en l’immunohistochimie c-Fos comme décrite

précédemment. Suite à la révélation DAB-Nickel, les coupes flottantes sont rincées

avec du PBS puis mises à incuber, toute la nuit à 4°C, dans une solution

d’anticorps primaire dirigé contre le marqueur cellulaire concerné dilué dans du

triton 0,25 % - PBS : les anticorps monoclonaux anti-CNPase ou anti-GFAP sont

dilués à 1/500 (Sigma), l’anticorps monoclonal anti-NeuN est dilué à 1/100

(Valbiotech).

Après rinçages, dans le cas des marquages CNPase ou GFAP, les coupes sont

mises en présence, pendant 1 h, d’une solution diluée à 1/500 d’anticorps

secondaires dirigés contre les IgG de souris et conjugués à la peroxydase

(antisérum d’âne, H + L, Jackson Laboratories). Dans le cas du marquage neuronal,

les coupes subissent une étape d’amplification à l’aide d’un anticorps secondaire

biotinylé dilué à 1/1000 (antisérum d’âne anti-IgG de souris, H + L, Jackson

Laboratories), puis une troisième incubation d’1 h en présence d’une solution de

streptavidine peroxydase également diluée à 1/1000. Le marquage cellulaire est

révélé par une solution de DAB et arrêté avec de l’eau. Les coupes sont alors

montées sur lames silanisées, déshydratées et incluses dans une résine.

7. Quantification des noyaux immunopositifs pour c-Fos et des cellules

doublement immunopositives c-Fos / GFAP

Les cellules immunopositives pour c-Fos ont été quantifiées sans tenir

compte des variations d’intensité de coloration nucléaire. Cette quantification a été

réalisée au niveau de différentes régions hypothalamiques d’intérêt (Noyau arqué :

NA ; Noyau hypothalamique paraventriculaire : PVN ; Noyau hypothalamique

ventromédian : VMN) et dans une région constituant un contrôle négatif (cortex

cérébral : CC, non impliqué dans l’homéostasie énergétique), en prenant 3 coupes

distantes successivement de 80 μm, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image (Biocom

Visiolab), sous microscope à transmission (Leica).

Pour les cellules doublement positives c-Fos / GFAP, la quantification s’est

faite manuellement dans le NA et le PVN.

8. Expression des résultats

Les données individuelles de chaque rat correspondent à la somme des

noyaux immunopositifs pour c-Fos comptés bilatéralement sur 3 coupes

- 75 -

successives pour une région cérébrale. Le nombre de cellules immunopositives pour

c-Fos et de cellules doublement marquées par structure est exprimé en « moyenne ±

erreur standard à la moyenne ».

VII – Etude de la régulation nerveuse de la sécrétion d’insuline

1. Microchirurgie : pose d’un cathéter dans la carotide

Les rats sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital

sodique. Un cathéter (0,5 x 1 mm, polyéthylène, Portex, Scientific Laboratory, UK)

contenant du sérum physiologique hépariné (100 U/ml, Sigma) est inséré dans

l’artère carotidienne gauche en direction du cerveau et maintenu en place par

plusieurs ligatures. Une période de récupération d’au moins 15 min avant le début

du protocole d’injection est respectée permettant la stabilisation de la glycémie.

2. Protocoles d’injection

Les injections se déroulent uniquement le matin.

Les rats reçoivent une injection (100 μl en 30 s) de D-glucose (9 mg/kg, 300

mOsmoles) ou de sérum physiologique via le cathéter intracarotidien au temps zéro

(t0). Un autre groupe de rats contrôles a reçu une injection de L-glucose (9 mg/kg,

300 mOsmoles, énantiomère du glucose non actif métaboliquement) afin de valider

la spécificité de la réponse.

Pour déterminer les voies nerveuses ou les acteurs moléculaires cérébraux

impliqués dans la détection du glucose, différents agents pharmacologiques (Sigma)

sont utilisés. Les groupes de rats témoins reçoivent une injection de NaCl 0,9 % de

même volume.

Atropine méthylnitrate : antagoniste des récepteurs muscariniques à acétylcholine,

inhibe la voie parasympathique, ne traverse pas la barrière hémato-

encéphalique (Jansson L et Hellerstrüm C, 1986) ; 5 mg/kg, 400 μl injectés par la

veine fémorale, 20 minutes avant (t-20) l’injection de glucose ou de NaCl 0,9 % à t0.

Oxymétazoline : agoniste partiel des adrénorécepteurs α2A, active la voie

orthosympathique, agoniste des récepteurs à sérotonine 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D et

agoniste/antagoniste des 5-HT1C (Magnan C et coll., 1999) ; 1000 pmol/kg, 400 μl

injectés en intrapéritonéal à t-5.

- 76 -

L-Méthionine sulfoximine (MSO) (Figure 39) : inhibiteur de la glutamine synthase

localisée spécifiquement dans les astrocytes au niveau cérébral (Young JK et coll.,

2000), ainsi que de la γ-glutamylcystéine synthétase (Cooper AJL et coll., 1976) ; 100

mg/kg, 600 μl en intrapéritonéal 18 h avant t0.

Buthionine sulfoximine (BSO) : analogue de la MSO, inhibiteur uniquement de la γ-

glutamylcystéine synthétase et environ 100 fois plus efficace que la MSO (Griffith OW

et Meister A, 1979) ; 100 mg/kg, 600 μl en intrapéritonéal 18 h avant t0.

Glucosamine (GlcN) (Figure 49): inhibiteur de la glucokinase et activateur de la voie

des hexosamines (Yoshikawa H et coll., 2002) ; 80 mg/kg, 1800 mOsmol, 125 μl

injectés en 38 s par le cathéter intracarotidien 30 s avant t0.

N-acétylglucosamine (GlcNAc) (Figure 49): activateur de la voie des hexosamines,

inhibiteur de la glucokinase moins efficace que la GlcN. Le premier effet doit donc

prédominer (Wells L et coll., 2003 ; Agius L et Stubbs M, 2000) ; 80 mg/kg, 1800

mOsmol, 125 μl injectés en 38 s par le cathéter intracarotidien 30 s avant t0.

Alloxane : inhibiteur de la glucokinase, transporté spécifiquement par le transporteur

au glucose GLUT2 (Elsner M et coll., 2002) ; 1 mg/kg, 100 μl injectés en 30 s par le

cathéter intracarotidien soit à t-10, soit à t0, seul ou simultanément au glucose.

3. Test de tolérance au glucose (IVGTT)

Des IVGTT (intravenous glucose-tolerance test) ont été réalisés afin de vérifier

que les différentes injections d’agents pharmacologiques n’affectaient pas la

capacité du pancréas à secréter de l’insuline. Ainsi, ils permettent de mettre en

évidence que notre effet est spécifiquement cérébral.

L’agent pharmacologique est injecté de la même manière que décrite

précédemment (quantité, voie d’injection et temps identiques). Au temps 0 une

solution de glucose de très forte concentration (0,8 g/kg, 250 μl) est inoculée par la

veine fémorale, induisant une hyperglycémie périphérique massive. Si les fonctions

pancréatiques sont intactes la glycémie revient à une valeur normale sous l’action

de l’insuline.

4. Prélèvements sanguins

Des échantillons de sang (environ 200 μl) ont été prélevés au bout de la

queue, aux temps t-10 minutes (t-20 si l’agent pharmacologique est injecté à ce

moment-là), t0 (juste avant l’injection de glucose), t1, t3, t5, t10, t15 et t20. Dans le

cas des IVGTT les temps étudiés sont t-10, t0, t5, t10, t15 et t20 min.

- 77 -

Le sang, récupéré dans des tubes contenant un peu d’héparine, est

immédiatement centrifugé à raison de 6000 rotations par minute. Les plasmas ainsi

obtenus sont conservés dans de la glace avant d’être stockés à –80°C.

5. Dosages

La glycémie est mesurée extemporanément à partir d’une goutte de sang

déposée sur un analyseur de glucose (Glucotrend, Roche, Meylan).

L’insuline plasmatique est dosée à l’aide d’un kit radio-immunologique dont

le principe est basé sur la compétition entre l’insuline à mesurer et de l’insuline

marquée à l’iode 125 (quantité déterminée grâce à un compteur de rayons gamma)

vis à vis d’un anticorps (Diasorin, Antony).

6. Expression des résultats

La glycémie est exprimée en millimolaires (mM), l’insulinémie en micro-unités

par millilitre (μU/ml). Les valeurs présentées correspondent aux différences (Δ) de

concentrations mesurées aux différents temps par rapport à la concentration basale

mesurée au temps zéro. Ce sont les moyennes des Δ ± l’erreur standard à la

moyenne.

VIII – Méthionine sulfoximine : dosage du glycogène cérébral

Suite au prétraitement de 18 h, l’efficacité de la MSO a été vérifiée sur

plusieurs cerveaux. En effet, cet agent pharmacologique induit une forte

accumulation de glycogène dans les astrocytes (Hevor TK et coll., 1985). C’est

pourquoi la quantité de glycogène contenu dans les cerveaux de rats ayant reçu 18

h avant le prélèvement une injection de MSO ou de NaCl a été déterminée grâce à la

méthode colorimétrique de Trinder. Pour chaque animal, le dosage est effectué en

triplet (n=4 pour chaque groupe).

Les rats anesthésiés sont décapités et leur cerveau prélevé le plus

rapidement possible avant d’être plongé dans l’azote liquide et conservé à –80°C. La

rapidité est très importante, le glycogène se dégradant vite.

Pour chaque rat, un petit morceau (30 à 50 mg) du cortex frontal est mis en

présence de 50 μl de NaOH 1 N. Les tubes sont alors mis à 55°C pendant 1 h et

agités de temps en temps. 50 μl de HCl 1 N sont ensuite ajoutés et les tubes, une

fois vortexés, sont centrifugés 15 min à 13000 rotations par minute.

- 78 -

20 μl de surnageant sont alors mis en présence soit de 40 μl

d’amyloglucosidase (enzyme dégradant le glycogène en glucose) diluée à 1/500 dans

du tampon acétate de sodium 0,2 M, pH 4,8, soit de 40 μl de tampon acétate de

sodium. Ces derniers tubes servent à mesurer la quantité de glucose « libre »

présent dans le cerveau, non stocké sous-forme de glycogène. Tous les tubes sont

mis à incuber 30 min à 55°C sous agitation. Une gamme étalon de concentrations

connues en glucose est réalisée en doublet : 0 ; 0,5 ; 1 ; 2 g/l. 700 μl de solution de

Trinder sont finalement additionnés à tous les tubes. On laisse la coloration se

développer pendant 20 min avant de mesurer les densités optiques au

spectrophotomètre à la longueur d’onde de 505 nm.

Les résultats sont exprimés en μg de glucose par mg de tissu cérébral.

Chaque triplet est moyenné avant de calculer la moyenne ± l’erreur standard à la

moyenne de chaque groupe de rats.

IX – Analyses statistiques

Les moyennes de chaque groupe de données (quantification du nombre de

noyaux immunopositifs pour c-Fos par région cérébrale, glycémie, insulinémie,

quantité de glycogène) ont été comparées à l’aide du t-test non-apparié de Student.

La différence est considérée statistiquement significative lorsque p est inférieure à

0,05.

- 79 -

RRééssuullttaattss

- 80 -

Le but de l’ensemble de ces travaux a été l’étude de l’activation

hypothalamique par une hyperglycémie centrale aiguë. Or, le SNC peut être activé

par une grande variété de stimuli, comme les anesthésiques. Etant partis d’un

modèle d’injection de glucose par la carotide vers le cerveau réalisée chez le rat

anesthésié (Atef N et coll., 1995), des mises au point ont été nécessaires pour

l’appliquer à l’animal éveillé.

Par la suite, nous avons caractérisé les aires hypothalamiques sensibles

à une injection aiguë de glucose, puis étudié l’implication de cellules

particulières, les astrocytes, dans ce mécanisme et enfin entrepris de

déterminer si certains acteurs moléculaires, le transporteur au glucose GLUT2

et la glucokinase, y jouaient un rôle. Ces trois points constitueront ainsi les

trois grandes parties de mes résultats.

X – Caractérisation de la sensibilité au glucose

1. Résultats I

1.1. Mise en place et validation des modèles expérimentaux

Dans un premier temps, il a été indispensable de mettre en place et de

reproduire les protocoles expérimentaux de base, nécessaires pour toute la suite

des travaux entrepris.

1.1.1. Injection(s) aiguë(s) de glucose vers le système nerveux central :

effets sur la glycémie et l’insulinémie

Le glucose est retrouvé dans l’alimentation et l’organisme sous l’énantiomère

dextrogyre, soit le D-glucose. Il s’agit donc de la forme métabolisable qui est

injectée.

La concentration de D-glucose injectée de manière aiguë vers le cerveau via

la carotide, 9 mg par kg de poids de l’animal, n’induit pas d’augmentation de la

glycémie périphérique, tout comme chez les rats ayant reçu du sérum physiologique

ou l’énantiomère lévogyre (Figure 30A).

En revanche, seul le D-glucose induit une augmentation rapide et transitoire

de l’insulinémie (32,2 ± 6,1 μU/ml au temps 1 minute), significativement différente

comparée à celles des animaux « NaCl » (-3,1 ± 3,4 μU/ml) ou des animaux « L-

- 81 -

glucose » (10,56 ± 11,41 μU/ml) (Figure 30B). De 3 à 15 minutes, les insulinémies

des trois groupes sont de nouveau similaires.

Figure 30 : Variation de la glycémie (mM) (A) et de l’insulinémie (μU/ml) (B) suite à l’injection intracarotidienne vers le cerveau, au temps 0, de sérum physiologique, de D-glucose ou de L-glucose. Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. *** p < 0,001.

Cette augmentation de l’insulinémie induite par le bolus de D-glucose n’est

pas modifiée par une injection, 10 minutes auparavant, de D-glucose (9 mg/kg) ou

de NaCl 0,9% (Figure 31).

B

A

- 82 -

Figure 31 : Variation de l’insulinémie suite à une deuxième injection de D-glucose (10 minutes après la première). Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne.

Ce protocole d’injection du D-glucose chez le rat éveillé, induit donc une

hyperglycémie uniquement centrale et non périphérique, et il est suivi d’une

augmentation rapide et transitoire de l’insulinémie périphérique. Cet effet est

spécifique au D-glucose et reproductible à 10 minutes d’intervalle.

Remarque : dorénavant, la dénomination « glucose » désignera la forme dextrogyre,

D-glucose.

1.1.2. Mise en évidence des voies nerveuses impliquées

Si on procède à l’injection par voie intraveineuse (veine fémorale) d’atropine

méthylnitrate (antagoniste des récepteurs muscariniques à l’acétylcholine) à une

concentration de 5 mg par kg de poids de l’animal, 20 minutes avant d’injecter le

glucose (injection aux caractéristiques identiques à celles décrites dans le

paragraphe ci-dessus), cette dernière ne conduit plus à l’augmentation de

l’insulinémie périphérique observée chez le groupe de rats témoins recevant comme

substance de prétraitement du sérum physiologique (Figure 32).

- 83 -

Par ailleurs, lorsque l’on injecte par voie intrapéritonéale de l’oxymétazoline

(agoniste partiel des récepteurs 2A-adrénergiques à une concentration de 1000

pmol par kg de poids de l’animal), 5 minutes avant d’injecter le glucose au temps 0,

la réponse insulinémique est toujours présente à 1 minute, bien que d’amplitude

significativement plus faible que celle observée chez le groupe de rats témoins au

même temps (22,65 ± 4,62 versus 39,33 ± 5,88 μU/ml) (Figure 32).

Figure 32 : Variation de l’insulinémie après prétraitement à l’atropine méthylnitrate ou à l’oxymétazoline, en réponse à l’injection vers le cerveau de D-glucose au temps 0. Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. * p < 0,05 ; *** p < 0,001. ip : intrapéritonéal ; iv : intraveineux.

Un traitement à l’atropine (inhibition du SNA parasympathique) bloque

totalement l’hyperinsulinémie induite par le bolus de glucose, à l’inverse de celui à

l’oxymétazoline (activation du SNA orthosympathique) qui n’entraîne qu’une

diminution de l’insulinémie.

- 84 -

1.1.3. Validation de la technique immunohistochimique dirigée contre

l’antigène c-Fos

Cette validation s’est faite à partir d’un modèle déjà connu : l’injection

intrapéritonéale de 2-déoxyglucose (2-DG), analogue du glucose non métabolisé par

les cellules, mimant ainsi une glucopénie cellulaire (Briski KP et Brandt JA, 2000).

L’injection de 2-DG (500 μl d’une solution à 160 mg/ml par voie

intrapéritonéale à des rats éveillés) provoque une forte augmentation du marquage

c-Fos dans les noyaux hypothalamiques supraoptiques et paraventriculaires

(Figure 33A et 33B), tandis que chez les animaux contrôles très peu de cellules

sont immunoréactives (Figure 33C et 33D).

Figure 33 : Validation de la technique utilisant l’immunohistochimie anti-c-Fos : effet d’une injection intrapéritonéale de 2-déoxyglucose versus une injection de sérum physiologique, sur l’expression de c-Fos dans le noyau supraoptique (respectivement A et C) et le noyau hypothalamique paraventriculaire (respectivement B et D). Barres d’échelle = 100 μm ; 3ième V : troisième ventricule.

A

B

C

D

- 85 -

La spécificité de l’immunohistochimie est démontrée par l’absence de

marquage lorsque l’anticorps primaire anti-c-Fos est 1) omis (Figure 34A) ou 2) mis

en présence du peptide immunogène en excès, celui-ci entrant en compétition avec

la protéine endogène (Figure 34B).

Figure 34 : Validation de la technique utilisant l’immunohistochimie anti-c-Fos suite à l’injection intrapéritonéale de 2-déoxyglucose : spécificité du marquage. A : avec anticorps primaire anti-c-Fos (gauche) ou sans anticorps primaire (droite), dans le cortex piriforme. B : avec anticorps primaire anti-c-Fos (gauche) ou avec anticorps primaire en présence du peptide immunogène mis en excès (droite), dans le noyau supraoptique. Barres d’échelle = 100 μm

Ces données montrent que l’activation cérébrale observée par le biais de

l’immunohistochimie c-Fos est spécifique du stimulus créé en accord avec les données

de la littérature, que les anticorps secondaires ne se lient qu’à l’anticorps primaire et

qu’enfin, ce dernier est bien spécifique de son antigène, c-Fos.

A

B

- 86 -

1.2. Régions hypothalamiques activées par l’injection intracarotidienne

de glucose

L’injection aiguë de glucose (9 mg/kg de poids corporel) vers le cerveau via

un cathéter chronique placé dans la carotide, induit une augmentation significative

du nombre de noyaux immunopositifs pour c-Fos dans le noyau arqué (NA) et le

noyau hypothalamique paraventriculaire (PVN) comparé au groupe de rats recevant

du sérum physiologique par la même voie (Figure 35A). Cette augmentation est de

38 % dans le NA (421 ± 33 versus 305 ± 52 noyaux immunopositifs comptés

bilatéralement sur 3 coupes successives) et de 82 % dans le PVN (363 ± 57 versus

200 ± 27 noyaux immunopositifs).

Figure 35 : Effet de l’injection de D-glucose vers le cerveau sur l’expression de c-Fos dans différentes régions hypothalamiques. A : quantification du nombre de noyaux immunopositifs pour c-Fos dans le noyau arqué (NA), les noyaux hypothalamiques paraventriculaire (PVN), ventromédian (VMN) et le cortex cérébral (CC ; contrôle négatif). Les résultats sont exprimés en moyenne du nombre de noyaux positifs pour c-Fos comptés bilatéralement sur 3 coupes distantes les unes des autres de 90 μm ± l’écart type à la moyenne. * p < 0.05. B : illustration d’une immunohistochimie-type au niveau du noyau arqué. Les flèches indiquent des noyaux positifs pour c-Fos. Barre d’échelle = 190 μm ; 3ième V : troisième ventricule.

A

B

- 87 -

D’un point de vue qualitatif, on peut observer au niveau du PVN, un

marquage c-Fos particulièrement présent dans la partie parvocellulaire. En

revanche, il n’existe pas de régionalisation pour le NA, ni de différence

antéropostérieure pour ces deux noyaux hypothalamiques.

La Figure 35B illustre une immunohistochimie-type au niveau du NA après

l’injection intracarotidienne de glucose ou de NaCl 0,9 %.

Dans le noyau hypothalamique ventromédian (VMN), une augmentation de

39 % (même amplitude que pour le NA) du nombre de ces noyaux positifs est

observée suite à l’injection de glucose par rapport à celle du véhicule. Toutefois,

cette différence n’est pas statistiquement significative (165 ± 24 versus 119 ± 9

noyaux immunopositifs).

Enfin, dans le cortex cérébral (CC), région prise comme contrôle négatif

insensible au glucose, aucune différence n’est observée entre les deux groupes de

rats.

L’immunohistochimie c-Fos indique que l’injection aiguë de glucose vers le

cerveau induit spécifiquement l’activation du NA et du PVN. Il apparaît une tendance

à l’activation pour le VMN.

1.3. Types cellulaires activés

Après avoir déterminé les régions sensibles au glucose, nous avons entrepris

la caractérisation des types cellulaires impliqués et ce, grâce à un double marquage

immunohistochimique pour c-Fos et un marqueur cellulaire (CNPase, GFAP ou

NeuN). Les observations se sont tout naturellement focalisées sur le PVN et le NA,

au vu des résultats précédents. La CNPase (2’, 3’-cyclic nucleotide 3’-

phosphodiesterase) est une des enzymes de synthèse de la gaine de myéline. En

conséquence, la révélation de sa présence au niveau cytoplasmique, nous permet de

visualiser le cytoplasme et le début des prolongements des oligodendrocytes. Suite à

l’injection de glucose vers le cerveau, nous n’avons observé aucune cellule

doublement positive c-Fos/CNPase (Figure 36A).

Pour la mise en évidence des neurones, plusieurs anticorps primaires ont été

testés, mais seul celui dirigé contre NeuN (neuronal nuclei) a donné des résultats

exploitables. Il s’agit d’une protéine nucléaire tout comme c-Fos (Mullen RJ et coll.,

1992). Cependant, une amplification du signal NeuN par un système avidine-biotine

révèle une coloration cytoplasmique en plus du marquage nucléaire, créant une

auréole brune de DAB autour du noyau positif pour c-Fos coloré en noir par la

- 88 -

DAB-nickel (Figure 36B). Il apparaît que les cellules doublement immunopositives

c-Fos/NeuN sont en très grand nombre.

Enfin, la GFAP (glial fibrillary acidic protein) est une protéine du

cytosquelette, spécifique des astrocytes. L’immunohistochimie dirigée contre elle

permet d’observer le phénotype en forme étoilée caractéristique de ces cellules

gliales. Le double marquage c-Fos/GFAP révèle qu’il existe quelques cellules

doublement marquées au niveau hypothalamique (Figure 36C). Celles-ci restent

néanmoins minoritaires par rapport aux cellules doublement positives c-Fos/NeuN.

Notre attention s’est portée sur les astrocytes, car selon notre hypothèse de

départ, le glucose injecté en aiguë vers le cerveau serait détecté par GLUT2. Or ce

transporteur au glucose a été préférentiellement retrouvé dans ce type cellulaire en

particulier (Leloup C et coll., 1994).

Les astrocytes immunopositifs pour c-Fos sont le plus souvent observés dans

le NA (Figure 37A) et beaucoup plus rarement dans le PVN (Figure 37B). Nous

avons procédé à la quantification des cellules doublement marquées c-Fos/GFAP

Figure 36 : Caractérisation des cellules immunopositives pour c-Fos suite à l’injection de D-glucose vers le cerveau : double immunohistochimie c-Fos/marqueur cellulaire A c-Fos / CNPase (oligodendrocytes) B c-Fos / NeuN (neurones) C c-Fos / GFAP (astrocytes)

cellules immunonégatives pour c-Fos cellules immunopositives pour c-Fos

Barres d’échelle (A) et (B) = 50 μm, (C) = 25 μm

A B

C

- 89 -

dans ces deux régions cérébrales (Figure 37C) : l’injection aiguë de glucose vers le

SNC induit une augmentation significative du nombre d’astrocytes immunopositifs

pour c-Fos dans le NA, mais pas dans le PVN.

Figure 37 : Effet du glucose sur les astrocytes des noyaux arqué (NA : A) et hypothalamique paraventriculaire (PVN : B). cellules immunonégatives pour c-Fos ; cellules immunopositives pour c-Fos ; Barres d’échelle = 30 μm. C : quantification des astrocytes positifs pour c-Fos. Les résultats sont exprimés en moyenne du nombre de cellules positives pour c-Fos et GFAP comptées bilatéralement sur 8 coupes distantes les unes des autres de 90 �m ± l’écart type à la moyenne. * p < 0.05.

L’injection aiguë de glucose vers le cerveau induit essentiellement

l’activation de neurones hypothalamiques mais aussi de quelques astrocytes. Les

astrocytes immunopositifs pour c-Fos sont significativement plus nombreux dans le

NA par rapport au groupe témoin.

2. Discussion I

2.1. Réponse hormonale périphérique

Le protocole d’injection aiguë de glucose vers le SNC de rat que nous avons

choisi a été précédemment mis en place et plusieurs fois utilisé au sein de notre

A B

C

- 90 -

laboratoire (Atef N et coll., 1995 ; Leloup C et coll., 1998 ; Alquier T et coll., 2003).

La glycémie périphérique n’est pas modifiée, mais elle doit certainement augmenter

au niveau du système sanguin cérébral et notamment au niveau du système porte

hypothalamo-hypohysaire, c'est-à-dire de l’éminence médiane. En raison de

l’absence d’une barrière hémato-encéphalique (BHE) précisément à cet endroit

(l’endothélium y est fenestré), la concentration en glucose doit très

vraisemblablement augmenter dans le parenchyme nerveux du NA. Une

quantification de cette augmentation pourrait être réalisée par microdialyse, mais

cette technique est délicate et, à l’heure actuelle, non maîtrisée pour ce noyau

hypothalamique (Darbin O et coll., 2006). Par ailleurs, la technique des

« biosenseurs » commence à se développer même si elle reste à améliorer

notamment pour doser le glucose. Il s’agit d’une électrode miniaturisée dont la

surface est recouverte par une enzyme catalysant une réaction productrice d’un

gradient électrochimique mesurable et informant alors de la concentration du

composé d’intérêt. Des variations de cette concentration peuvent ainsi être suivies

au cours du temps et sur l’animal éveillé. Dans le cas du glucose, l’enzyme

employée est la glucose oxydase (Dixon BM et coll., 2002).

Quoiqu’il en soit, notre modèle d’injection vers le SNC permet de mettre en

évidence et ce, de manière relativement simple, la sensibilité cérébrale à une

variation de la glycémie grâce à l’augmentation de l’insulinémie périphérique qui est

rapide et transitoire. Cette réponse est spécifique au D-glucose, spécificité attendue

puisque les transporteurs au glucose (GLUTs) ne prennent pas en charge le L-

glucose (Medina RA et Owen GI, 2002). L’utilisation de la forme lévogyre (Figure

30), ne provoquant pas la réponse insulinémique, montre ainsi que le résultat

obtenu avec le D-glucose est bien sélectif, ne provient pas de la détection d’un

hexose quelconque ou d’un encombrement moléculaire. A noter qu’au cours de

l’année de DEA, le D-mannitol avait été utilisé pour le groupe témoin comme dans

les travaux de l’équipe de B. Levin (Dunn-Meynell AA et coll., 1997). Cet alcool de

sucre à 6 carbones possédant le même poids moléculaire, était supposé n’avoir

aucun effet biologique central et constituait donc un bon contrôle iso-osmotique.

Or, de manière inattendue, son injection aiguë vers le cerveau induit aussi une

augmentation de l’insulinémie (résultats non montrés). Finalement, devant cette

difficulté imprévue, nous avons opté pour une solution contrôle « classique », le

sérum physiologique, tout en contrôlant l’osmolarité de la solution de glucose

injectée par la carotide (solution elle-même préparée avec du NaCl).

- 91 -

Nous avons pu également constater lors de cette première expérience, que la

réponse insulinémique persistait même après une première injection aiguë de

glucose 10 min avant celle du temps 0, avec exactement les mêmes caractéristiques

temporelles et d’intensité (Figure 31). Ceci indique, que le SNC est capable de

détecter deux augmentations successives de concentration en glucose et montre à

cet égard une haute réceptivité. Il serait néanmoins intéressant de regarder si des

stimulations répétées au cours du temps n’entraînent pas l’apparition de

phénomènes de potentialisation ou de désensibilisation.

Les résultats obtenus suite à l’inhibition des voies nerveuses

parasympathiques et à l’activation des voies nerveuses orthosympathiques (Figure

32), indiquent clairement que le lien entre le SNC qui détecte l’augmentation de la

glycémie et le pancréas qui secrète en réponse de l’insuline, est le SNA. Si l’activité

du SNA est modifiée de manière pharmacologique, la réponse au glucose est altérée.

Comme montré par d’autres équipes, on observe que le système parasympathique

stimule la sécrétion des cellules β du pancréas, tandis que le système

orthosympathique exerce une influence inhibitrice (Rohner-Jeanrenaud F et coll.,

1983). De même, chez les rats obèses Zucker qui sont hyperinsulinémiques et

insulino-résistants, l’activité basale du parasympathique est augmentée,

simultanément à une baisse de celle de l’orthosympathique, et ceci est corrélé à une

perturbation de la réponse du pancréas à l’injection de glucose, indiquant une

possible cause de leur phénotype diabétique (Atef N et coll., 1995). De plus, ces

animaux révèlent une hypersensibilité cérébrale au glucose puisque son injection

intracarotidienne à une concentration de 3 mg/kg au lieu de 9 suffit à déclencher

l’augmentation de l’insulinémie (Alquier T et coll., 2003). Enfin, il s’avère que le

dysfonctionnement de l’activité du SNA apparaît très tôt au cours du

développement de l’obésité et pourrait être une des causes principales de cette

pathologie (Pénicaud L et coll., 1996).

Ainsi, l’ensemble de ces données indiquent que le SNC détecterait une

augmentation de la concentration en glucose au niveau de l’artère carotidienne, ce qui

induirait, après un certain nombre de relais nerveux qu’il reste à déterminer, une

stimulation du système nerveux parasympathique simultanée à l’inhibition de

l’orthosympathique aboutissant finalement à l’activation des cellules β du pancréas et

à la sécrétion d’insuline (Figure 38 ).

- 92 -

2.2. Réponse hypothalamique

Afin d’étudier l’activation cérébrale conséquente à l’injection aiguë de glucose

vers le cerveau, nous avons utilisé comme outil, l’expression du proto-oncogène c-

fos, caractéristique de la stimulation des neurones. La validité de cette technique a

été démontrée grâce à la reproduction de résultats publiés à propos de l’activation

cérébrale provoquée par l’injection intrapéritonéale de 2-DG comparée à celle du

NaCl (Briski KP et Brandt JA, 2000). Ce modèle a été choisi plutôt qu’un autre, car

ce composé a un lien relativement direct avec la sensibilité au glucose qui nous

intéresse. En effet, il s’agit d’un analogue non métabolisable du glucose, mimant

une glucopénie cellulaire et donc un état d’hypoglycémie. On pouvait donc

supposer, que notre propre protocole toucherait les mêmes régions cérébrales. Nos

résultats sont en parfait accord avec ceux publiés : le 2-DG induit bien l’activation,

dans l’hypothalamus, des noyaux supraoptique et paraventriculaire (Figures 33 et

34), structures impliquées entre autre dans l’homéostasie énergétique en particulier

par l’expression de l’ocytocine, neuropeptide anorexigène, et de la présence au

niveau du PVN des neurones cibles des projections NPY et POMC issues du NA

(Briski KP et Brandt JA, 2000) (Tableau 1 et figure 13).

L’expression de c-fos est induite par une très grande variété de stimuli ce qui

sous-entend quelques précautions à respecter. En particulier, l’anesthésie ou la

chirurgie doivent être proscrites et les phénomènes de stress les plus limités

possibles (Marota JJA et coll., 1992). C’est pourquoi, contrairement aux précédents

protocoles d’injection aiguë de glucose vers le cerveau réalisés par notre équipe, le

cathéter a été placé dans la carotide des rats une semaine avant le jour de

l’expérience per se. Le fait de devoir le rincer quotidiennement a permis d’habituer

les animaux à la manipulation et à une pseudo injection à l’état de vigilance. En

effet, nos résultats montrent, que chez le groupe contrôle il n’existe que quelques

noyaux immunopositifs pour c-Fos. Cette expression peut être due à la

manipulation malgré tout, à un changement dans l’environnement imperceptible à

l’humain, ou à l’expression basale du proto-oncogène. Celle-ci ne peut être

totalement absente puisqu’il s’agit d’un facteur de transcription intervenant dans la

vie normale d’une cellule. Par rapport aux neurones, cette protéine régulerait

notamment l’expression des neurotransmetteurs ou celle de leurs enzymes de

synthèse, or les cellules nerveuses sont souvent sollicitées (Hoffman GE et coll.,

1993). Toutefois, la majorité des cellules n’exprime pas c-Fos en conditions basales

comme nous l’observons.

- 93 -

Suite à l’injection aiguë de glucose vers le SNC, nous observons une

augmentation significative du nombre de noyaux immunopositifs pour c-Fos dans

le PVN et le NA (Figure 35). Cette spécificité est démontrée par l’absence

d’augmentation du nombre de cellules exprimant c-Fos dans le cortex cérébral, pris

comme région insensible au glucose, et chez les rats recevant une solution de NaCl.

La stimulation observée est en accord avec les données de la littérature, puisque le

PVN et le NA sont bien connus pour leur implication dans la régulation de

l’homéostasie énergétique (Morton GJ et coll., 2006). De plus, ils contiennent des

neurones sensibles au glucose (Levin BE et coll., 2002).

Avec la technique utilisant c-Fos, on ne peut savoir précisément si les

noyaux hypothalamiques sont directement activés par le glucose, ou indirectement

via l’activation d’un autre noyau situé en amont. Ainsi, nos expériences ne nous

permettent pas de conclure si l’activation du NA et celle du PVN sont indépendantes

l’une de l’autre ou si l’une entraîne l’autre. Néanmoins, comme nous l’avons vu

dans l’introduction (cf. § II-2), le NA a un rôle primordial en assurant l’intégration

des signaux périphériques liés au statut énergétique de l’organisme, cette structure

étant sensible aux concentrations hormonales circulantes (leptinémie, insulinémie)

et possédant deux populations de neurones aux effets opposés mais

complémentaires orexigènes/anorexigènes (Niswender KD et coll., 2004) (Figure

11). Ainsi, il permet la transformation des signaux endocriniens ou métaboliques en

signaux électriques. En raison de l’absence de BHE au niveau de l’éminence

médiane, il ne serait pas étonnant que le NA puisse intégrer très rapidement des

variations de la glycémie et être ainsi le premier noyau hypothalamique activé par

notre bolus intracarotidien de glucose. Grâce à ses très nombreuses projections,

l’information « glucose » initiée dans le NA, va donc pouvoir être acheminée vers

d’autres régions intra et/ou extra-hypothalamiques (Morton GJ et coll., 2006). Un

grand nombre des neurones du NA émettent des prolongements en direction du

PVN, comme les neurones orexigènes et anorexigènes à NPY et à POMC (Woods SC,

2005). Bien que cela reste à démontrer, on peut donc supposer que l’activation du

PVN par notre bolus de glucose est secondaire à celle du NA.

Une partie des neurones du PVN projette vers le tronc cérébral, permettant le

relais de l’information nerveuse vers la périphérie grâce au SNA (Swanson LW et

Sawchenko PE, 1980 ; Levin BE et coll., 2002). Le contrôle de l’activité du SNA

permet en particulier la modulation de l’activité des cellules β du pancréas (Rohner-

Jeanrenaud F et coll., 1983). Ceci suggère que la stimulation, directe ou indirecte,

- 94 -

du PVN par le glucose aboutirait à la sécrétion d’insuline en périphérie grâce au

SNA, comme observée au cours de notre première série de manipulations.

Par ailleurs, on aurait pu s’attendre à l’activation d’autres régions

hypothalamiques possédant aussi des connexions nerveuses avec le NA, connues

pour leur implication dans la régulation de la balance énergétique et pour la

présence de neurones sensibles au glucose, comme le LH, le DMN ou le VMN (Levin

BE et coll., 2002 ; Kalra SP et coll., 1999). Avec notre modèle d’injection, dans le LH

et le DMN, on n’observe pas de changement particulier dans le nombre de noyaux

marqués (résultats non montrés). Dans le VMN, on peut noter une tendance à

l’augmentation (Figure 35). En terme de pourcentage, elle est de 39 % c'est-à-dire

identique à celle obtenue pour le NA. Même si on ne peut vraiment conclure sur

l’implication de ce noyau dans la sensibilité au glucose, certains travaux de

recherches la suggèrent fortement. Notamment, une perfusion intracarotidienne de

glucose d’1 h induit une augmentation du nombre de noyaux positifs pour c-Fos

dans le PVN et le VMN (Dunn-Meynell AA et coll., 1997). Cette même équipe a

démontré que ce dernier renfermait des neurones qui pouvaient être excités ou

inhibés, de manière directe ou indirecte, par une augmentation de la concentration

extracellulaire de glucose (Song Z et coll., 2001). Ainsi, comme le PVN, le VMN

pourrait être activé par une hyperglycémie de manière directe et/ou indirecte.

Par ailleurs, il est curieux de constater que le protocole de perfusion

intracarotidienne de glucose de longue durée (1 heure) mentionné plus haut, s’il

induit une augmentation de l’expression de c-Fos dans les PVN et VMN, ne le fait

pas dans le NA (Dunn-Meynell AA et coll., 1997). Cette différence de résultats avec

les nôtres provient certainement du fait qu’il s’agit d’une injection chronique et non

aiguë de glucose. On peut aussi émettre l’hypothèse que la protéine c-Fos dans le

NA a eu le temps d’être dégradée avant le sacrifice des animaux. Au vu du rôle

central de cette structure cérébrale, la demi-vie des facteurs de transcription y est

peut-être plus courte pour permettre un traitement adéquat des signaux

périphériques.

Enfin, on ne peut exclure une possible activation de structures du tronc

cérébral, comme le NTS ou l’area postrema. Comme pour les PVN et VMN, elle

pourrait être indirecte, via les fortes connexions réciproques qui existent avec

l’hypothalamus, ou directe car l’endothélium y est aussi fenestré et les neurones

possèdent un équipement moléculaire adéquat pour une fonction régulatrice de la

balance énergétique (Wynne K et coll., 2005 ; Schwartz MW et coll., 2000). De plus,

des neurones sensibles au glucose sont présents dans cette région comme le

- 95 -

démontrent des enregistrements électrophysiologiques (Himmi T et coll., 2001).

Finalement, on ne peut exclure que l’activation cérébrale que nous observons soit

due à une détection de l’augmentation de la glycémie directement au niveau de la

carotide. En effet, une telle sensibilité a déjà été décrite (Alvarez-Buylla R et de

Alvarez-Buylla ER, 1988 ; Pardal R et Lopez-Barneo J, 2002). Cependant, la

probabilité qu’elle active exactement les mêmes régions hypothalamiques est faible

d’autant plus que pour le premier article, une augmentation de la concentration en

glucose induit une diminution des influx nerveux générés par les chimiorécepteurs

(ce qui irait plutôt dans le sens d’une inhibition cérébrale), et pour le second il s’agit

de la détection d’une hypoglycémie.

Nos résultats indiquent que l’injection aiguë de glucose vers le SNC, induit

l’activation du NA, ainsi que celle du PVN, de manière directe et/ou indirecte.

L’information nerveuse pourrait alors être transmise au tronc cérébral permettant la

modulation de l’activité du SNA, aboutissant à la sécrétion d’insuline par les cellules

β du pancréas (Figure 38 ).

2.3. Réponses cellulaires

Les résultats des doubles immunohistochimies montrent que les cellules

activées par le bolus de glucose, c'est-à-dire exprimant c-Fos, sont en très grande

majorité des neurones, et quelques unes des astrocytes (Figures 36 et 37).

Le fait que des neurones soient stimulés est tout à fait logique puisque ces

cellules permettent la « traduction » de la majeure partie des signaux intrin- ou

extrinsèques en information électrique. De plus, il est clair qu’il existe une

population de neurones sensibles au glucose, c'est-à-dire de neurones dont l’activité

électrique est modifiée par une augmentation ou une diminution de sa

concentration (Levin BE et coll., 2002 ; Fioramonti X et coll., 2004). Il est

vraisemblable que les neurones du NA soient les premiers à exprimer c-Fos en

réponse à notre protocole d’injection aiguë. Une fois activés, ils doivent stimuler à

leur tour d’autres neurones auxquels ils sont connectés, ce qui aboutit à la

propagation de l’activation par le glucose. Néanmoins, certaines précautions doivent

être prises. D’une part, puisque l’expression de c-Fos n’est pas systématiquement

induite par un stimulus, il ne peut être exclu que certains neurones sensibles au

glucose ne soient pas révélés par l’expression de c-Fos (Sagar SM et coll., 1988).

D’autre part, la présence de cette protéine dans un neurone donné, ne nous permet

pas de savoir si celui-ci est de type GE ou GI (excité ou inhibé par le glucose,

- 96 -

Figure 24). En effet, elle n’est pas systématiquement associée à une activation

électrique (dépolarisation) de cette cellule (Sabatier N et coll., 2003). Enfin, on sait

que c-Fos peut former différents hétérodimères avec d’autres produits de gènes

précoces comme ceux de la famille Jun (Hoffman GE et coll., 1993). Or, selon le

couple formé, il aura un effet stimulateur ou inhibiteur sur la transcription des

gènes cibles, en particulier ceux codant pour les neuropeptides (Hoffman GE et

coll., 1993). Ceci peut laisser suggérer que les neurones marqués du NA peuvent

tout aussi bien être à POMC/CART (probablement stimulés) et à NPY/AGRP

(probablement inhibés). Toutefois, des travaux récents menés dans notre

laboratoire montrent que les neurones à POMC, du moins chez la souris, sont

négatifs pour c-Fos suite à l’injection de glucose et ne sont pas GE d’un point de

vue électrophysiologique, alors que les neurones GI expriment le NPY (Fioramonti et

coll., 2007).

De manière intéressante, nous observons quelques astrocytes positifs pour c-

Fos. Ils sont localisés dans le PVN mais surtout dans le NA. Dans ce dernier,

l’injection aiguë de glucose induit leur augmentation de façon significative par

rapport aux rats recevant le sérum physiologique. Jusqu’à présent, aucun article ne

mentionnait la capacité des cellules gliales à exprimer cette protéine en réponse à

un stimulus.

Parmi les cellules gliales, une population particulière se démarque par

rapport à la sensibilité cérébrale au glucose : les épendymocytes. En effet, dans

l’introduction (cf. § III-2.2.4) nous avons vu que la plupart possède le couple

protéique GLUT2/GK (indispensable à la sensibilité au glucose pour les cellules β

du pancréas), mais aussi qu’ils pouvaient être sensibles à des changements de la

concentration extracellulaire en glucose (Leloup C et coll., 1994 ; Maekawa et coll.,

2000 ; Moriyama R et coll., 2004). Toutefois, sur nos coupes, nous n’observons pas

d’expression de c-Fos dans ce type cellulaire. Il est possible que notre protocole

d’injection soit trop rapide pour entraîner une modification de la concentration en

glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR). En effet, les épendymocytes bordent

le troisième ventricule au niveau de l’hypothalamus et sont donc très

vraisemblablement sensibles aux variations de composition du LCR (Moriyama R et

coll., 2004).

Au niveau du NA, les épendymocytes présentent certaines particularités : on

parle alors de tanycytes. Leurs corps cellulaires bordent la base du troisième

ventricule, tandis que de longs prolongements atteignent l’éminence médiane et le

- 97 -

lit capillaire du système porte, ce qui forme un lien entre ces deux zones. Par ces

caractéristiques anatomiques, ils sont en contact permanent à la fois avec le LCR et

le sang, et sont donc à même de pouvoir détecter une modification de la

concentration en glucose dans ces deux compartiments. Cela rappelle curieusement

le mécanisme de sensibilité au glucose présente au niveau de la veine hépatoportale

dont le principe est basé sur une différence de concentration glucidique entre la

veine porte et l’artère hépatique (Burcelin R et Pénicaud L, 2003) (cf. § III-2.2.1). De

plus, ces cellules gliales contiennent des protéines, la sous-unité Kir6.1 du canal

potassique dépendant de l’ATP, GLUT2 et la GK, connues pour leur implication

dans la sensibilité au glucose des cellules β du pancréas (Garcia MA et coll., 2003).

Les neurones du NA sont pour la plupart au contact de ces cellules. Ces dernières

n’expriment pas la GFAP, protéine du cytosquelette servant à identifier les

astrocytes (Garcia MA et coll., 2003). De ce fait, ils n’ont pas été comptabilisés lors

du double marquage cFos/GFAP.

Ainsi, le bolus de glucose vers le cerveau induit majoritairement l’activation

de neurones, mais aussi de quelques astrocytes, ces derniers localisés dans le NA

(Figure 38 ).

- 98 -

Figure 38 : Boucle de contrôle mise en place entre la détection cérébrale du glucose et la sécrétion d’insuline par le pancréas. renvoient aux conclusions des trois paragraphes de discussion ; β : cellules β ; NA : noyau arqué ; PVN : noyau hypothalamique paraventriculaire ; SNA : système nerveux autonome ; SNC : système nerveux central.

- 99 -

XI – Implication des astrocytes dans la sensibilité au glucose

Après avoir montré qu’un bolus de glucose vers le SNC induisait l’activation

du PVN et du NA, et que le nombre d’astrocytes stimulés était significativement plus

grand dans ce dernier noyau par rapport aux rats « contrôle », nous avons cherché

à déterminer l’implication de ce type cellulaire.

La glutamine synthase (GS) est l’enzyme qui catalyse la synthèse de

glutamine à partir du glutamate (Figures 27 et 39). Cette réaction est spécifique

des astrocytes dans le SNC. La méthionine sulfoximine (MSO), un analogue du

glutamate, inhibe cette enzyme et a déjà été utilisée par d’autres équipes comme

inhibiteur astrocytaire (Young JK et coll., 2000).

Figure 39 : Schéma hypothétique de l’action de la méthionine sulfoximine sur le couplage astrocyte-neurone. GS : glutamine synthase ; MSO : méthionine sulfoximine.

En bloquant la GS, il est probable que la MSO empêche le recyclage du

glutamate libéré (comme neurotransmetteur) par une grande population de

neurones. En effet, une fois libéré au niveau synaptique, celui-ci est pris en charge

- 100 -

par l’astrocyte qui le transformera en glutamine, elle-même relibérée dans le milieu

extracellulaire et servant de précurseur à une nouvelle synthèse de glutamate par

les neurones glutamatergiques (Bouzier-Sore AK, et coll., 2002). Cette hypothèse

suggère donc une interruption du couplage astrocyte-neurone. Ainsi la MSO a été

utilisée dans le but de déterminer si les astrocytes étaient effectivement

primordiaux à la sensibilité neuronale au glucose.

1. Résultats II

1.1. Validation de l’utilisation de la méthionine sulfoximine

Les doses choisies ont été celles utilisées par Young et ses collaborateurs

(Young JK et coll., 2000). Un moyen de vérifier l’efficacité du protocole d’injection

(prétraitement de 18 h à 100 mg/kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale) a

été de mesurer les variations de glycogène ainsi induites et précédemment décrites

chez la souris (Hévor TK et coll., 1985). En effet, si la MSO inhibe la GS, aucune

accumulation de glutamate n’a été observée. D’après ces auteurs, le glutamate

serait converti en glucose via la gluconéogenèse. Le glucose emprunterait alors la

voie de la glycolyse et celle de la glycogenèse conduisant à une accumulation de

glycogène (Hévor TK et coll., 1985) (Figure 39).

Suite à un prétraitement de 18 h à la MSO, on observe dans le foie une

diminution de 58% (soit un facteur de 2,4) de la concentration en glucose provenant

du glycogène par rapport au groupe de rats recevant du sérum physiologique (2,38

± 1,21 versus 5,71 ± 1,24 μg/mg de tissu) (Figure 40A).

En revanche, cette même injection est suivie dans le cortex cérébral d’une

augmentation de 414% (soit un facteur de 4) de la concentration en glucose

provenant du glycogène par rapport au groupe de rats témoins (0,41 ± 0,18 versus

0,10 ± 0,03 μg/mg de tissu) (Figure 40B).

Néanmoins, ces variations ne sont pas statistiquement significatives, mais

ces fortes tendances observées vont dans les mêmes sens que ceux décrits par

l’équipe du Pr. Hévor (Hévor TK et coll., 1985).

- 101 -

Figure 40 : Variation de la quantité de glycogène dans le foie (A) et le système nerveux central (B) suite à un prétraitement intrapéritonéal à la méthionine sulfoximine (MSO). Les résultats sont exprimés en moyennes ± l’écart type à la moyenne (n=4 pour les deux groupes).

La MSO, injectée selon notre protocole, donne bien les résultats escomptés

en accord avec la figure 39, à savoir une accumulation de glycogène cérébral.

1.2. Conséquences de l’arrêt du métabolisme astrocytaire des

carbohydrates :

1.2.1. sur l’activation cérébrale induite par le bolus intracarotidien de

glucose

Suite à un prétraitement de 18 h à la MSO par voie intrapéritonéale, nous

avons procédé à l’injection intracarotidienne de glucose selon notre modèle et à la

quantification des noyaux immunopositifs pour c-Fos dans les mêmes régions

cérébrales que précédemment (cf. § X-1.2, figure 35A) (Figure 41).

B

A

- 102 -

Figure 41 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal (ip) à la méthionine sulfoximine (MSO) sur l’expression de c-Fos induite par l’injection de D-glucose vers le cerveau : quantification du nombre de noyaux immunopositifs pour c-Fos dans le noyau arqué (NA), les noyaux hypothalamiques paraventriculaire (PVN), ventromédian (VMN) et le cortex cérébral (CC ; contrôle négatif). Les résultats sont exprimés en moyennes du nombre de noyaux positifs pour c-Fos comptés bilatéralement sur trois coupes ± l’écart type à la moyenne. * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,005 ; NS : non significatif (p > 0,05).

Au niveau du NA, on peut observer que les rats recevant un prétraitement à

la MSO avant l’injection de glucose par la carotide ne montrent plus d’augmentation

du nombre de noyaux immunopositifs pour c-Fos contrairement à ce qui avait été

observé pour les rats non prétraités (263 ± 26 versus 421 ± 33 noyaux

immunopositifs) (Figure 41A barres rouge et jaune). Notons que le prétraitement à

la MSO en lui-même n’a pas d’effet sur l’expression de c-Fos dans cette région

hypothalamique : il n’existe pas de différence significative entre les deux groupes de

rats recevant du sérum physiologique vers le cerveau au temps 0, avec ou sans

prétraitement à la MSO (305 ± 52 versus 256 ± 34 noyaux immunopositifs) (Figure

41A barres grise et rose).

Dans le PVN, le prétraitement à la MSO ne modifie pas le nombre de noyaux

immunopositifs pour c-Fos quantifiés après l’injection de glucose (439 ± 55 versus

B A

- 103 -

363 ± 57 noyaux immunopositifs). En revanche, il l’augmente de manière

significative dans le VMN (239 ± 24 versus 165 ± 24 noyaux immunopositifs)

(Figure 41B barres rouge et jaune). Cependant, dans ces deux régions

hypothalamiques ainsi que dans le CC, l’injection intrapéritonéale de MSO,

précédant l’injection intracarotidienne de NaCl 0,9% induit l’expression de c-Fos de

manière significative par rapport au groupe ne recevant que le NaCl 0,9% au temps

0 (PVN : 453 ± 68 versus 200 ± 27 ; VMN : 308 ± 47 versus 119 ± 9 ; CC : 667 ± 132

versus 299 ± 56 noyaux immunopositifs) (Figure 41B barres rose et grise).

Un prétraitement à la MSO supprime l’activation du NA normalement induite

par l’injection aiguë de glucose vers le cerveau.

1.2.2. sur la sécrétion d’insuline

L’injection aiguë de glucose vers le cerveau induit non seulement une

augmentation du nombre de noyaux immunopositifs pour c-Fos mais aussi

l’élévation de l’insulinémie périphérique de manière rapide et transitoire en 1

minute (cf. § X-1.1.1, figure 30B). Puisque le prétraitement avec la MSO supprime

l’activation cérébrale du NA (cf. § XI-1.2.1), nous avons voulu regarder ce qu’il en

était au niveau de la réponse périphérique au bolus intracarotidien de glucose.

On observe que le prétraitement en intrapéritonéal à la MSO empêche

l’apparition de l’hyperinsulinémie périphérique au temps 1 minute, normalement

induite par l’injection seule de glucose vers le cerveau (6,5 ± 4,9 versus 32,2 ± 6,1

μU/ml) (Figure 42A).

Notons que les rats prétraités à la MSO montrent une faible, mais

significative, diminution du delta glycémique au temps 1 minute par rapport aux

deux autres groupes, « NaCl » et « glucose » seul (-0,4 ± 0,09 versus 0,1 ± 0,07 et 0,1

± 0,16 mM) (Figure 42B).

- 104 -

Figure 42 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal (ip) à la méthionine sulfoximine (MSO) sur la sécrétion d’insuline induite par l’injection de D-glucose vers le cerveau au temps 0 (A), ainsi que sur la glycémie (B). Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. ** p < 0,01.

Le prétraitement à la MSO empêche l’augmentation de l’insulinémie

normalement induite par l’injection aiguë de glucose vers le cerveau.

B

A

- 105 -

1.3. Spécificité de la méthionine sulfoximine

Un problème inhérent à l’utilisation de n’importe quel agent pharmacologique

est celui de sa spécificité. C’est pourquoi nous avons mené des expérimentations

supplémentaires, afin d’invalider au mieux ce doute.

1.3.1. Effet uniquement cérébral ou aussi périphérique ?

Comme la MSO est injectée par voie intrapéritonéale, il doit être envisagé la

possibilité que l’effet observé soit aussi dû à une action directe sur le pancréas,

c'est-à-dire que celui-ci serait, en fin de compte, incapable de secréter de l’insuline

correctement. Pour résoudre ce problème, nous avons réalisé un test de tolérance

au glucose injecté par voie intraveineuse (0,8 g/kg de poids corporel) sur des

animaux traités avec la MSO.

Tableau 2 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal de 18 heures de méthionine sulfoximine (MSO) sur un test de tolérance au glucose (0,8 g/kg de poids corporel) injecté par voie intraveineuse. Les ΔG et ΔI expriment les aires sous la courbe. Les valeurs correspondent aux moyennes ± l’écart type à la moyenne. * p < 0,05.

Au temps 0, les valeurs basales des glycémie et insulinémie ne sont pas

différentes entre les rats prétraités avec du sérum physiologique et ceux prétraités

avec de la MSO (Tableau 2).

L’injection intraveineuse aiguë de la solution riche en glucose entraîne une

augmentation de la glycémie périphérique qui retourne secondairement à son

niveau basal sous l’effet de l’insuline. L’hyperglycémie, mesurée sur 30 minutes, est

significativement plus importante pour le groupe de rats prétraités à la MSO par

rapport à celle obtenue pour les rats témoins (141,6 ± 21,8 versus 87,7 ± 8,6

mM/30 min). Néanmoins, il n’y a pas de différence significative lorsqu’on regarde la

quantité d’insuline secrétée sur cette même période (810,7 ± 161,1 pour les rats

prétraités au NaCl 0,9% et 868,9 ± 216,7 μU/ml/30 min pour les rats prétraités à

la MSO).

- 106 -

Ce résultat démontre que, même avec un prétraitement à la MSO, le

pancréas est toujours capable de secréter une quantité normale d’insuline en réponse

à une hyperglycémie.

Par ailleurs, quelques expériences d’injection de MSO par voie

intracérébroventriculaire (25 μg en μl, dans le troisième ventricule, au niveau de

l’hypothalamus, 2 heures avant le bolus de glucose vers le cerveau) confortent cette

conclusion. En effet, ce prétraitement cérébral et plus court dans le temps, aboutit

à une diminution significative de l’hyperinsulinémie périphérique apparaissant au

temps 1 minute (83,5 ± 5,2 μU/ml pour les 6 rats prétraités à la MSO versus

122,57 ± 13,2 μU/ml pour les 7 rats prétraités au sérum physiologique, p=0,0182,

résultat non montré). Ainsi, la seule inhibition de la GS cérébrale suffit à observer

une perte de la sensibilité au glucose injecté vers le SNC.

1.3.2. Effet spécifique à l’inhibition de la glutamine synthase ?

Il a été décrit dans la littérature, qu’en plus d’inhiber la glutamine synthase,

la MSO inhibait aussi la γ-glutamylcystéine synthase. Cette enzyme intervient dans

la synthèse du glutathion (Cooper AJL et coll., 1976). On peut alors légitimement

s’interroger sur le fait que l’effet observé provient bien uniquement de l’interruption

du métabolisme astrocytaire des carbohydrates et non de l’inhibition de la synthèse

de glutathion ou du cycle du γ-glutamyl.

Afin d’invalider cette hypothèse nous avons procédé à un prétraitement (aux

paramètres identiques que précédemment avec la MSO) des animaux avec de la

buthionine sulfoximine (BSO) analogue de la MSO. La BSO a été décrite comme

inhibant la γ-glutamylcystéine synthase environ cent fois plus que la MSO, mais

pas la GS de manière détectable (Griffith OW et Meister A, 1979).

Contrairement à ce qui avait été observé avec le prétraitement à la MSO,

celui avec la BSO n’empêche pas l’augmentation de l’insulinémie au temps 1 min

comme observée pour le groupe de rats témoins (63,65 ± 4,75 versus 50,96 ± 4,32

versus 6,5 ± 4,90 μU/ml) (Figure 43A).

En ce qui concerne la glycémie, l’injection par voie intrapéritonéale de BSO

18 h avant l’injection aiguë de glucose vers le cerveau n’a pas d’effet : les deltas ne

sont pas différents de ceux du groupe de rats témoins prétraités au sérum

physiologique (Figure 43B).

- 107 -

Figure 43 : Effet d’un prétraitement intrapéritonéal (ip) à la buthionine sulfoximine (BSO) versus à la méthionine sulfoximine (MSO) sur la sécrétion d’insuline induite par l’injection de D-glucose vers le cerveau au temps 0 (A), ainsi que sur la glycémie (B). Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. *** p < 0,005.

Ainsi, l’effet inhibiteur de la MSO sur l’augmentation de l’insulinémie induite

par l’injection du bolus de glucose vers le cerveau est bien spécifique à l’inhibition de

la GS.

B

A

- 108 -

2. Discussion II

L’implication des astrocytes dans la sensibilité au glucose est appuyée par le

fait que ces cellules sont les seules capables, dans le SNC, de stocker cet hexose

sous forme de glycogène (Kong J et coll., 2002). Ainsi, elles doivent être à même de

pouvoir détecter des modifications de sa concentration puisqu’elles gèrent ses

réserves énergétiques. Dans le but de clarifier le rôle des astrocytes dans ce

mécanisme, nous avons utilisé un inhibiteur de la glutamine synthase (GS), enzyme

permettant la synthèse de glutamine à partir du glutamate, ceci spécifiquement

dans ce type cellulaire au niveau central (Young JK et coll., 2000). Cet inhibiteur

est la méthionine sulfoximine (MSO), précédemment utilisée par une autre équipe

pour un objectif similaire mais dans un contexte hypoglycémique (Young JK et coll.,

2000). C’est pourquoi nous avons choisi un protocole de traitement identique.

D’après le schéma du couplage métabolique qui existerait entre les astrocytes et les

neurones, l’inhibition de la GS provoquerait son interruption puisque le glutamate

ne serait plus recyclé en glutamine (Tsacopoulos M et Magistretti PJ, 1996) (Figure

39).

Une des caractéristiques phénotypiques de l’administration de MSO, est

l’accumulation de glycogène astrocytaire. Son dosage dans le SNC montre que, suite

à notre protocole d’injection consistant en un prétraitement intrapéritonéal de 18 h

à 100 mg/kg, sa concentration quadruple (Figure 40). Cette variation n’est pas

statistiquement significative, ainsi que la diminution d’un facteur de 2,5 de la

quantité de glycogène hépatique. Toutefois, ces deux tendances sont similaires à ce

qui est décrit dans la littérature que ce soit dans le sens et l’amplitude (Hévor TK et

coll., 1985). La MSO inhibant la GS, le glutamate devrait s’accumuler dans le SNC.

Or, il n’en est rien d’où l’hypothèse selon laquelle, cet acide aminé serait converti

par néoglucogenèse en glucose, lui-même utilisé pour la glycogénogenèse (Hévor TK

et coll., 1985).

Utiliser la MSO n’est pas négligeable pour l’expression de c-Fos, puisque le

glutamate est un des neurotransmetteurs majeurs du cerveau. En effet, le nombre

de cellules immunopositives pour c-Fos est très augmenté dans les noyaux PVN et

VMN par cette drogue seule (Figure 41). Néanmoins, une augmentation similaire

dans le cortex cérébral suggère que ceci n’est pas spécifique à l’hypothalamus. Par

conséquent, il nous est impossible de conclure sur le rôle des astrocytes dans la

détection du glucose au niveau du PVN.

- 109 -

Dans le NA, nos résultats indiquent que le traitement à la MSO supprime

l’augmentation du nombre de noyaux positifs pour c-Fos en réponse au bolus de

glucose. Ainsi, dans cette structure hypothalamique, le couplage métabolique entre

les astrocytes et les neurones semble être important, sinon indispensable, à la

détection d’un changement de la concentration cérébrale en glucose. Les travaux

menés par l’équipe de Bernard Thorens vont aussi dans le sens d’une implication

des astrocytes (Marty N et coll., 2005). Des souris dépourvues de GLUT2, mais dont

le gène a été réinséré spécifiquement dans ce type cellulaire, sont de nouveau

sensibles à l’injection intrapéritonéale de 2-DG (150 mg/kg), comme le montrent la

sécrétion périphérique de glucagon et l’induction de l’expression de c-Fos au niveau

du tronc cérébral.

Selon notre hypothèse, certains astrocytes seraient les « détecteurs » du

glucose, en relation directe avec les neurones adjacents qui seraient les

« effecteurs ». En raison des nombreuses jonctions communicantes qui existent

entre les astrocytes, un petit nombre d’astrocytes « détecteurs » suffirait pour

étendre l’information à l’ensemble de la population astrocytaire du NA et de là, aux

neurones sensibles au glucose.

Le couplage astrocyte-neurone peut être de différentes natures. Il pourrait

mettre en jeu une synthèse astrocytaire de composés qui seraient ensuite libérés et

agiraient sur les neurones voisins. On peut naturellement penser au glutamate,

mais aussi à l’ATP ou au lactate (Fields RD et Stevens-Graham B, 2002). En ce qui

concerne le glutamate, on sait depuis peu, que les astrocytes sont capables de le

sécréter directement par des processus d’exocytose calcium-dépendante (Fields RD

et Stevens-Graham B, 2002). Des techniques d’imagerie ont aussi permis de

montrer qu’une augmentation de la concentration intracellulaire en calcium dans

ces cellules gliales pouvait être accompagnée d’une augmentation de la

concentration extracellulaire d’ATP (Fields RD et Stevens-Graham B, 2002). Pour le

lactate, il a été démontré par électrophysiologie que son application était capable de

stimuler les neurones répondants aux variations de glucose extracellulaire (Yang XJ

et coll., 1999). Et comme nous l’avons vu dans l’introduction (figure 27), ce

composé pourrait dériver de la glycolyse astrocytaire, sa concentration étant

proportionnelle à celle du glucose entrant. Une fois dans le neurone, il est pris en

charge par la lactate déshydrogénase qui le transforme en pyruvate directement

utilisable comme source d’énergie (Tsacopoulos M et Magistretti PJ, 1996). Ceci

sous-entend que le glucose agirait non seulement directement sur les neurones

sensibles au glucose via la glycolyse et le cycle de Krebs, mais aussi indirectement

- 110 -

via le métabolisme glial (Levin BE et coll., 2002). Enfin, les astrocytes sont capables

de modifier l’organisation des synapses. Cela passerait par la libération de

particules de cholestérol qui seraient ensuite intégrées par les neurones et

aboutirait à l’augmentation du nombre de synapses (Fields RD et Stevens-Graham

B, 2002). Ainsi, on peut envisager un couplage astrocyte-neurone via les lipides

permettant la modulation de l’activité synaptique et donc, de la transmission des

signaux. Le statut énergétique de l’organisme, communiqué notamment par le biais

de la concentration en glucose, pourrait influencer ces connexions interneuronales,

aboutissant probablement à un contrôle à plus long terme de l’homéostasie

énergétique. En faveur de cette hypothèse, des travaux très récents effectués sur le

foie, indiquent que le glucose est capable de stimuler un facteur de transcription,

LXR (Liver X Receptor), protéine assurant le contrôle du métabolisme du cholestérol

(Mitro N et coll., 2007). Ainsi, LXR intégrerait les métabolismes glucidique et

lipidique. Dès lors, il serait intéressant de déterminer s’il est présent au sein du

SNC, et en particulier dans l’hypothalamus.

L’absence d’activation du NA par le bolus de glucose suite au prétraitement à

la MSO est corrélée à l’absence de réponse insulinémique qui y fait normalement

suite (Figure 42). Ce résultat suggère fortement que la détection de la variation de

la concentration en glucose impliquerait les astrocytes du NA, et que l’activation de

ce noyau hypothalamique est indispensable à la stimulation des cellules β du

pancréas. Ceci est en accord avec le rôle central joué par cette structure cérébrale

dans la régulation de l’homéostasie énergétique, en particulier au niveau de

l’intégration des signaux périphériques qu’ils soient de nature hormonale ou

métabolique (cf. § III) (Niswender KD et coll., 2004 ; Wang R et coll., 2004 ; Briski

KP, 1998). Ceci renforce aussi l’idée selon laquelle le NA serait le premier à détecter

une modification de la glycémie, et stimulerait ensuite le PVN (Wynne K et coll.,

2005).

Afin de certifier au maximum la spécificité de l’effet observé avec l’utilisation

de la MSO, nous avons procédé à des expériences contrôles. Le test de tolérance au

glucose montre que le pancréas est tout à fait capable de sécréter de l’insuline en

quantités normales 18 h après l’injection de MSO par voie intrapéritonéale (Tableau

2). Ainsi, le traitement à la MSO a bien eu un effet cérébral (absence d’activation du

NA), et non un effet périphérique (altération des cellules β). En accord avec nos

résultats, d’autres auteurs ont montré que cette molécule n’affectait pas la

sécrétion d’insuline basale ou induite par le glucose (Schneid C et coll., 2003).

- 111 -

Notons toutefois que l’hyperglycémie créée par l’administration massive de glucose

par voie intraveineuse est significativement plus prononcée pour les rats ayant reçu

la MSO par rapport à ceux ayant reçu le sérum physiologique, suggérant une

possible résistance à l’insuline. Enfin, nos résultats obtenus suite à l’injection

intracérébroventriculaire de la MSO (résultats non montrés) excluent également un

hypothétique effet périphérique puisque ce protocole ne devait toucher que la GS

centrale.

Par ailleurs, il a été décrit que la MSO inhibait une autre enzyme, la γ-

glutamylcystéine synthase, qui intervient dans la voie de synthèse du glutathion

(Cooper AJL et coll., 1976). On pouvait donc se demander si l’effet que nous

observions était bien spécifique de l’inhibition de la GS. Un analogue de la MSO, la

buthionine sulfoximine (BSO), inhibe la γ-glutamylcystéine synthase environ cent

fois plus efficacement que la MSO (Griffith OW et Meister A, 1979). Un

prétraitement à la BSO à la même concentration que la MSO, ne montre aucun effet

sur la réponse insulinémique observée (Figure 43). On peut donc en conclure que

la disparition de l’hyperinsulinémie rapide et transitoire est spécifique à l’inhibition

de la GS cérébrale par la MSO et non à un effet sur la γ-glutamylcystéine synthase.

L’ensemble de ces données montre que des astrocytes sont effectivement

sensibles à l’augmentation de la concentration en glucose au niveau du NA, et

transmettraient l’information métabolique à certains neurones. L’information

transiterait alors par différentes structures pour conduire à la modulation du SNA

permettant finalement la sécrétion d’insuline par le pancréas afin de remédier à

l’hyperglycémie sensée exister (Figure 38 ).

- 112 -

XII – Acteurs moléculaires impliqués dans la sensibilité cérébrale au glucose

Un modèle de sensibilité au glucose bien connu est celui des cellules β du

pancréas (cf. § I-2.2 et figure 6). Dans celles-ci, intervient un couple de deux

protéines : le transporteur au glucose GLUT2 et la glucokinase (GK). Notre

hypothèse, renforcée par certaines données de la littérature, est que ces deux

acteurs moléculaires rempliraient des fonctions similaires au niveau du SNC. Pour

cette étude, nous avons choisi une approche pharmacologique appliquée à la

sécrétion d’insuline induite par l’injection aiguë de glucose vers le cerveau.

1. Résultats III

1.1. Etude de l’implication de la glucokinase

En ce qui concerne l’étude de l’implication de la GK dans la sensibilité

cérébrale au glucose, nous avons choisi la glucosamine (GlcN) comme inhibiteur de

son activité (Yoshikawa H et coll., 2002).

1.1.1. Effet de la glucosamine sur la sécrétion d’insuline

La GlcN (80 mg/kg) injectée simultanément au glucose par le cathéter

intracarotidien au temps 0 n’induit pas de variation de l’insulinémie contrairement

au groupe de rats témoins recevant à la place du NaCl de même osmolarité (1800

mOsmol) en plus du glucose (-9,77 ± 4,34 versus 54,52 ± 18,56 μU/ml) (Figure 44).

- 113 -

Figure 44 : Effet de l’injection intracarotidienne vers le cerveau de glucosamine (GlcN) au temps 0 sur la sécrétion d’insuline induite par celle simultanée de D-glucose. Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. ** p < 0,01 par rapport au groupe témoin.

La GlcN supprime l’hyperinsulinémie normalement observée en réponse au

bolus de glucose vers le SNC.

1.1.2. Effet cérébral et non périphérique de la glucosamine

Comme dans le cas de l’utilisation de la MSO (cf. § XI-1.3.1.), nous avons

vérifié que l’effet de la GlcN était bien dû à une action uniquement centrale et non à

une action globale, c'est-à-dire également périphérique avec inhibition de la GK

pancréatique. Nous avons ainsi réalisé un test de tolérance au glucose à l’aide d’une

charge intraveineuse de glucose (0,8 g/kg de poids corporel) sur des animaux

recevant la GlcN par la carotide.

- 114 -

Figure 45 : Effet de l’injection par voie intracarotidienne vers le cerveau de glucosamine (GlcN) au temps 0 sur un test de tolérance au glucose injecté par voie intraveineuse : effet sur la glycémie (A) et sur l’insulinémie (B). Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. * p < 0,05 par rapport au groupe témoin. iv : injection intraveineuse.

L’injection de glucose par voie intraveineuse induit une augmentation

massive de la glycémie périphérique que ce soit pour le groupe de rats témoins avec

injection vers le cerveau de NaCl ou le groupe de rats recevant la GlcN (Figure

45A). Notons qu’au temps 20 min, l’augmentation du delta glycémique est

significativement plus importante pour le groupe GlcN (3,82 ± 0,36 versus 1,80 ±

0,8 mM pour le NaCl).

B

A

- 115 -

Cette augmentation de la glycémie périphérique est accompagnée d’une

augmentation importante de l’insulinémie et ce, pour les deux groupes de rats

(Figure 45B). Toutefois, aux temps 15 et 20 min, cette élévation est

significativement plus faible chez les rats recevant la GlcN (23,16 ± 6,03 versus

65,77 ± 15,92 à t15 et 6,59 ± 9,23 versus 52,16 ± 13,61 μU/ml à t20).

Le test de tolérance au glucose montre, qu’au moins pendant les 10

premières minutes suivant l’injection de GlcN vers le cerveau, le pancréas est tout à

fait capable de secréter l’insuline normalement.

1.1.3. Effet spécifique à l’inhibition de la glucokinase ?

La GlcN peut néanmoins avoir un effet autre que celui d’inhiber la GK : elle

est en effet capable d’activer la voie des hexosamines (cf. § III-2.2.2, figure 21)

(Yoshikawa H et coll., 2002). Dans le but de déterminer de quel effet proviennent

nos observations, nous avons procédé à l’injection de N-acétylglucosamine (GlcNAc)

aux mêmes caractéristiques que celle de la GlcN. La GlcNAc a été décrite comme

activant la voie des hexosamines mais en inhibant la GK de manière beaucoup

moins efficace que la GlcN (Wells L et coll., 2003). Donc dans ce cas-là, c’est l’effet

« activation de la voie des hexosamines » qui prédomine.

Contrairement à la GlcN, l’injection de GlcNAc à la même dose (80 mg/kg)

vers le cerveau (simultanément au glucose) ne supprime pas la réponse

insulinémique induite par le glucose au temps 1 min (GlcN + glucose : -9,77 ±

4,34 ; GlcNAc + glucose : 46,90 ± 6,23 ; NaCl + glucose : 54.52 ± 18,56 μU/ml)

(Figure 46). Et même, de manière surprenante, si on injecte la GlcNAc

simultanément à du sérum physiologique au temps 0, on observe également au

temps 1 min une augmentation de l’insulinémie (29,94 ± 6,57 μU/ml) (Figure 46).

- 116 -

Figure 46 : Effet de l’injection intracarotidienne vers le cerveau de N-acétylglucosamine (GlcNAc) au temps 0 sur la sécrétion d’insuline induite par celle simultanée de D-glucose. Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. ** p < 0,01 ; *** p < 0.001

La GlcNAc ne bloque pas l’induction de l’hyperinsulinémie par le bolus de glucose.

Donc, l’effet inhibiteur de la GlcN sur cette réponse est bien spécifique à l’inhibition de

la GK et ne fait pas intervenir son effet activateur de la voie des hexosamines.

1.2. Etude de l’implication du couple glucokinase/GLUT2

L’alloxane est un inhibiteur de la GK ayant la particularité d’être transporté

spécifiquement par GLUT2 contrairement à d’autres inhibiteurs de cette hexokinase

(Elsner M et coll., 2002). C’est pourquoi notre choix s’est porté sur celui-ci plutôt

qu’un autre, sachant qu’au moment de ces expérimentations il n’existait pas

d’agent pharmacologique spécifique à GLUT2.

1.2.1. Injection de l’alloxane au temps zéro

L’injection simultanée vers le cerveau de glucose à 9 mg/kg et d’alloxane à 1

mg/kg (dose choisie après plusieurs essais) au temps 0 est suivie, une minute

après, d’une augmentation de l’insulinémie comme observée chez les rats ne

- 117 -

recevant que du glucose. Cette augmentation se prolonge jusqu’au temps 3 minutes

(delta de 64,20 ± 23,32 à 1 min et de 52,91 ± 21,75 μU/ml à 3 min) (Figure 47).

Figure 47 : Effet de l’injection intracarotidienne vers le cerveau d’alloxane au temps 0 sur la sécrétion d’insuline induite par celle simultanée de D-glucose. Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. NS : non significatif (p > 0,05). * p < 0,05 : significativement différent par rapport à t 0.

Puisque l’alloxane est un inhibiteur de la GK dont on envisage l’implication

dans la détection cérébrale de glucose, nous nous attendions à une disparition de

l’augmentation de l’insulinémie normalement induite par l’injection de glucose vers

le cerveau comme observé après l’administration de GlcN. Or nous avons obtenu

l’inverse. C’est pourquoi nous avons testé l’effet de l’alloxane seul : on observe une

augmentation du delta insulinémique au temps 3 minutes significativement

différente comparée au temps 0 (35,44 ± 8,68 μU/ml, p=0,0065).

1.2.2. Injection de l’alloxane au temps -10 minutes

L’injection d’alloxane vers le cerveau induit en elle-même une augmentation

de l’insulinémie au temps 3 minutes (cf. § précédent et figure 47). Cet effet peut

- 118 -

masquer une possible inhibition de la réponse au glucose. Nous avons donc

procédé à l’injection de l’alloxane 10 minutes avant celle de glucose, temps au bout

duquel l’hyperinsulinémie induite par l’alloxane seul disparaît.

Deux groupes de rats témoins ont été constitués. Un premier groupe a reçu

une solution de NaCl 0,9 % par voie intracarotidienne à la place de l’alloxane. Un

deuxième groupe de rats a reçu deux injections de glucose à 10 minutes d’intervalle

afin de mimer le premier pic d’insuline induit par l’alloxane chez le groupe

alloxane/glucose.

Figure 48 : Effet d’une pré-injection par voie intracarotidienne vers le cerveau d’alloxane sur la sécrétion d’insuline induite par l’injection de D-glucose au temps 0. Les résultats sont exprimés en delta par rapport aux valeurs basales mesurées à t 0, en moyennes ± l’écart type à la moyenne. NS : non significatif par rapport aux deux autres groupes à t 1 (p > 0,05).

Comme précédemment décrit (cf. § X-1.1.1, figure 31), une première

injection de glucose 10 minutes avant celle effectuée au temps 0, n’altère pas

l’augmentation de l’insulinémie observée au temps 1 min. Cette deuxième réponse a

la même amplitude que celle produite avec le groupe de rats prétraités au NaCl 0,9

% (Figure 48).

Lorsque les rats reçoivent une injection aiguë d’alloxane vers le cerveau 10

minutes avant le bolus de glucose, on observe toujours une augmentation de

- 119 -

l’insulinémie 1 minute après celle de glucose au temps 0. Toutefois, on peut

remarquer que son amplitude tend à être plus faible, mais cette différence reste

statistiquement non significative (23,70 ± 3,27 versus 37,43 ± 6,78 μU/ml) (Figure

48).

Ces résultats indiquent que l’alloxane per se induit la libération d’insuline en

périphérie et de ce fait, ne nous permettent pas d’émettre une quelconque conclusion

sur l’implication ou non du couple GK/GLUT2.

2. Discussion III

Selon notre hypothèse de départ, la sensibilité au glucose, très bien décrite

pour les cellules β, existerait également dans le SNC et impliquerait un mécanisme

similaire (Figures 6 et 28). D’ores et déjà, quelques uns de nos résultats apportent

des éléments en sa faveur, puisqu’ils mettent en lumière des similitudes. En effet,

une modification de la concentration intracellulaire en calcium constitue un

intermédiaire entre le stimulus et l’expression de c-Fos (Chaudhuri A, 1997). Or,

dans les cellules β, l’augmentation de la concentration en glucose intracellulaire,

proportionnelle à l’hyperglycémie, induit une entrée de calcium qui permet

l’exocytose de l’insuline (Doyle ME et Egan JM, 2003). De la même manière, on peut

imaginer que si cet influx calcique existe aussi dans les cellules cérébrales sensibles

au glucose, comme le suggère l’apparition de c-Fos après l’injection aiguë de

glucose par la carotide, il peut conduire cette fois-ci à l’exocytose de

neurotransmetteurs ou de molécules de signalisation indispensables au couplage

astrocyte-neurone (glutamate, ATP, lactate). Par ailleurs, le fait que la MSO

supprime l’activation du NA corrélée à l’absence de réponse insulinémique, suggère

que ce couplage impliquerait le glutamate puisque la GS, une fois inhibée, est

incapable de le transformer en glutamine. Or, depuis quelques années, des travaux

montrent que cet acide aminé interviendrait directement dans la sécrétion

d’insuline des îlots de Langerhans (Maechler P et coll., 2002). Il proviendrait

notamment du glucose par le biais de l’α-kétoglutarate, un intermédiaire du cycle

des acides tricarboxyliques. Cette transformation est assurée par la glutamate

déshydrogénase. Par analogie, les astrocytes pourraient également utiliser le

glutamate comme signal direct pour le neurone, s’il est lui-même libèré, et/ou

indirect, s’il contrôle l’exocytose d’autres molécules de signalisation.

- 120 -

Au-delà de ces premières similitudes, nous avons voulu déterminer quel était

l’équipement moléculaire présent dans le SNC et caractéristique des cellules

sensibles au glucose, en comparaison avec les cellules β. Depuis longtemps, au

niveau du pancréas, il a été établi qu’un couple protéique remplissait largement le

rôle de « détecteur » de la concentration extracellulaire en glucose. Il est constitué

du transporteur au glucose GLUT2 et de la glucokinase (GK), le premier permettant

l’entrée de l’hexose proportionnellement à sa concentration environnante et la

seconde, sa phosphorylation également de façon proportionnelle (Doyle ME et Egan

JM, 2003).

Dans un premier temps, nous avons procédé à l’inhibition de la GK grâce à la

glucosamine (GlcN) transportée par les différents GLUTs. Son injection aiguë par la

carotide vers le SNC simultanément au glucose, supprime la réponse insulinémique

périphérique (Figure 44). Ceci suggère fortement que l’activité normale de la GK est

indispensable à la sensibilité cérébrale à cet hexose. Par ailleurs, le test de

tolérance au glucose indique que cet effet est bien spécifique à la GK cérébrale

puisque le pancréas est toujours capable de secréter normalement de l’insuline, du

moins jusqu’au temps 10 minutes, c'est-à-dire pendant la durée de la réponse

insulinémique au bolus carotidien de glucose (Figure 45).

La GlcN est largement utilisée dans l’étude de la GK, notamment dans le but

de caractériser l’activité hépatique et pancréatique en réponse à une hyperglycémie,

ou bien dans celui de définir directement le fonctionnement de l’enzyme, c'est-à-dire

de déterminer ses sites de liaison (Balkan B et Dunning BE, 1994 ; Barzilai N et

coll., 1996 ; Agius L et Stubbs M, 2000). Dans le cadre de l’étude de la sensibilité

cérébrale au glucose, la GlcN a aussi été utilisée et supprime pour partie les

réponses des neurones sensibles au glucose venant ainsi conforter nos résultats

(Yang XJ et coll., 1999 ; Dunn-Meynell AA et coll., 2002).

Au-delà de son effet inhibiteur sur la GK pour lequel elle est le plus souvent

employée, la GlcN intervient dans une autre voie métabolique, la voie des

hexosamines. Or, il semblerait que cette cascade de réactions enzymatiques jouerait

un rôle comme indicateur du statut énergétique de l’organisme (Wells L et coll.,

2003). Dans ce contexte, la GlcN peut être utilisée comme activateur de la voie des

hexosamines (Figures 21 et 49).

- 121 -

Figure 49 : Effets de la glucosamine (GlcN) sur la glucokinase (GK) et la voie des hexosamines, qui est aussi capable d’incorporer la N-acétylglucosamine (GlcNAc).

Afin de s’assurer du lieu d’action de la GlcN (inhibition de la GK versus

activation de la voie des hexosamines), nous avons utilisé la N-acétylglucosamine

(GlcNAc) qui agit plus en aval dans la voie des hexosamines en servant de substrat

à la synthèse d’UDP-GlcNAc (Wells L et coll., 2003) (Figure 49). L’injection de

GlcNAc simultanément à celle de glucose vers le cerveau, n’altère pas la réponse

insulinémique rapide et transitoire, contrairement à la GlcN (Figure 46). L’effet

inhibiteur de la GlcN sur la sensibilité cérébrale au glucose dans notre modèle,

serait donc bien dû à l’inhibition de la GK et non à l’activation de la voie des

hexosamines. Par ailleurs, nos résultats montrent que l’activation de la voie des

hexosamines, seule, induit une réponse insulinémique même si à ce stade, on ne

peut pas exclure un effet périphérique de la GlcNAc. Néanmoins, ce résultat serait

en accord avec des données de la littérature suggérant une suractivation de cette

voie métabolique dans le diabète de type II (Wells L et coll., 2003). Il nous paraît

intéressant de noter que les résultats obtenus avec la GlcNAc sont toutefois en

contradiction avec ceux de Dunn-Meynell et coll. (2002) qui montrent que la GlcNAc

inhibe les réponses des neurones GE (stimulés par le glucose) au même titre que la

GlcN. Il est probable que cette discordance soit due aux conditions expérimentales

(in vivo versus in vitro).

- 122 -

Dans un second temps, nous avons décidé d’utiliser l’alloxane qui est un

inhibiteur de la GK sélectivement transporté par GLUT2, contrairement à d’autres

inhibiteurs de cette hexokinase (Elsner M et coll., 2002). Ainsi, son emploi

permettait de confirmer l’implication de la GK et de cibler le couple, et non une

seule des deux protéines mises en jeu dans les cellules β. A notre grande surprise,

non seulement l’injection aiguë d’alloxane vers le SNC n’empêche pas la réponse

insulinémique au glucose comme le fait la GlcN, mais en plus, elle induit per se une

hyperinsulinémie rapide et transitoire (Figure 47). Si l’on compare les effets de

l’injection de glucose seul, alloxane seul et glucose plus alloxane, il apparaît un effet

additif. Ceci suggère que ces deux composés empruntent des voies de signalisation

différentes ou aux cinétiques légèrement décalées.

Il a été démontré que cette toxine, injectée dans le troisième ventricule,

provoquait la mort des tanycytes qui le bordent (Sanders NM et coll., 2004). Ceci

indique qu’elle serait bien transportée spécifiquement par GLUT2 puisque ces

cellules spécialisées l’expriment (Garcia MA et coll., 2003). Par ailleurs, dans la

plupart des travaux, l’alloxane est utilisé comme agent diabétogène par une double

action sur les cellules β provoquant leur dysfonctionnement : l’inhibition de la GK

qui altère la sécrétion d’insuline, mais aussi la cytotoxicité induite par la génération

d’espèces actives de l’oxygène (EAOs) (Elsner M et coll., 2002). L’apparition de ces

radicaux libres est suivie d’une augmentation de la concentration intracellulaire en

calcium, ce qui aboutit à la sécrétion d’insuline (Kliber A et coll., 1996). Si les

cellules hypothalamiques sensibles au glucose fonctionnent vraiment comme les

cellules β du pancréas, on peut imaginer qu’il puisse se produire, dans les cellules

possédant GLUT2, une production d’EAOs entraînant un influx calcique suite à

l’injection d’alloxane. Il s’agirait d’un phénomène analogue à celui engendré par le

bolus de glucose (cf début de ce paragraphe de discussion), aboutissant à la

modulation de l’activité du SNA et à l’augmentation de l’insulinémie périphérique

effectivement observée. Enfin, au laboratoire, il a été démontré que les EAOs

d’origine mitochondriale, produites par le métabolisme du glucose, induisaient une

réponse insulinémique et seraient nécessaires à la sensibilité cérébrale à cet hexose

(Leloup C et coll., 2006). Ainsi, il est vraisemblable que l’alloxane injecté vers le SNC

induit une réponse insulinémique via ces mêmes composés.

Finalement, si on envisage que l’alloxane puisse exercer deux effets dans les

cellules exprimant GLUT2 (inhibition de la GK et production d’EAOs), il se peut que,

peut-être en raison de la dose d’alloxane que nous avons utilisée, l’effet inhibiteur

- 123 -

sur la GK soit masqué par une forte production d’EAOs. Il serait ainsi intéressant

de regarder si la co-injection, dans la carotide, de molécules antioxydantes et

d’alloxane induit une sécrétion rapide et transitoire d’insuline, comme observée

avec l’alloxane seul. Si cette réponse insulinémique disparaît, cela suggèrera

fortement l’implication de la production d’EAOs dans la réponse induite par

l’alloxane. L’addition de molécules antioxydantes à l’alloxane devrait donc permettre

de révéler uniquement l’effet inhibiteur de ce dernier sur la GK. Dans ce cas, notre

bolus de glucose, en présence d’alloxane et d’antioxydant ne devrait plus induire de

réponse insulinémique périphérique. En accord avec ce schéma, les travaux de

l’équipe de Dunn-Meynell montrent que les réponses au glucose des neurones GE

disparaissent bien en présence d’alloxane et de catalase (Dunn-Meynell AA et coll.,

2002). Néanmoins on ne peut pas exclure que, dans nos expériences, l’absence

d’inhibition visible de la GK par l’alloxane soit due à la durée de vie très courte de

cet agent pharmacologique puisqu’on l’injecte dans la carotide et non directement

sur les cellules sensibles au glucose (Lenzen S et Panten U, 1988).

La démarche pharmacologique que nous avons suivie (utilisation de la GlcN et de

l’alloxane), associée aux données quelques fois disparates de la littérature, nous permet ainsi

de conclure à l’implication de la GK dans la sensibilité cérébrale à une hyperglycémie

transitoire. Une étude systématique du contenu en ARNm des neurones sensibles au glucose

confirme effectivement la présence de la GK dans ces cellules (Kang L et coll.,2004).

Néanmoins, cette étude ne permet pas de savoir si les astrocytes en sont pourvus, ce qui dans

notre hypothèse de couplage entre astrocytes et neurones serait pertinent.D’autre part, cette

étude montre qu’il n’y a pas de corrélation entre la présence de GLUT2 et les réponses au

glucose d’un neurone, soulevant ainsi la question du transport de glucose à l’intérieur de ce

type cellulaire et de sa disponibilité pour la GK.

- 124 -

CCoonncclluussiioonnss

eett

PPeerrssppeeccttiivveess

- 125 -

CONCLUSIONS :

Les travaux menés au cours de cette étude aboutissent à plusieurs

conclusions pouvant se résumer ainsi :

L’injection aiguë de glucose par la carotide vers le cerveau de rat se

caractérise par :

le maintien d’une glycémie périphérique stable, suggérant qu’elle

n’augmente qu’au niveau central

l’apparition rapide d’une hyperinsulinémie périphérique transitoire

une spécificité pour le D-glucose.

Cette réponse au bolus de glucose implique :

la mise en jeu du SNA qui transmet l’information du SNC vers la

périphérie : le parasympathique active, tandis que l’orthosympathique

inhibe les cellules β du pancréas

l’hypothalamus avec l’activation spécifique du NA et du PVN

majoritairement l’activation de neurones, mais aussi de quelques

astrocytes

en particulier les astrocytes du NA : leur inhibition empêche

l’apparition de l’hyperinsulinémie induite par l’injection aiguë de

glucose vers le cerveau

une enzyme essentielle, la GK.

Ainsi, l’injection aiguë de D-glucose vers le cerveau induit l’activation

spécifique de l’hypothalamus, et en particulier du NA. La sensibilité de cet hexose

met en jeu la GK et les astrocytes, ces cellules gliales activant alors les neurones

auxquels elles sont couplées. Le signal métabolique est donc transformé en signal

électrique se propageant dans le SNC. Le NA doit activer d’autres régions

cérébrales, notamment le PVN, permettant la conduction de l’information vers le

tronc cérébral où l’activité du SNA est modulée, pour finalement aboutir à la

stimulation des cellules β du pancréas. Celles-ci libèrent de l’insuline, dans le but

de diminuer l’hyperglycémie générée par le bolus de glucose.

- 126 -

Figure 50 : Détection d’une hyperglycémie cérébrale impliquant les astrocytes du noyau arqué (NA) et la glucokinase (GK). β : cellule β du pancréas, PVN : noyau hypothalamique paraventriculaire, SNA : systène nerveux autonome.

Notre modèle d’hyperglycémie cérébrale permet d’étudier la sensibilité du

cerveau au glucose de manière indépendante de l’insuline, ce qui est impossible

dans les protocoles se rapprochant du cadre physiologique où ces deux paramètres

sont indissociables (absorption de sucres par voie orale, injection de glucose

intrapéritonéale, hypoglycémie induite par l’injection d’insuline ou le jeûne). De tels

travaux mettent l’accent sur le facteur « détection du glucose », or cette sensibilité

se trouve altérée dans des modèles animaux diabétiques et/ou obèses puisqu’elle

n’aboutit pas à une sécrétion d’insuline adéquate.

- 127 -

D’après nos résultats, les composés glutamine/glutamate semblent au

carrefour de plusieurs voies métaboliques en relation avec la détection du glucose.

Ils constituent un lien entre astrocytes et neurones (Figure 27), interviennent dans

l’étape limitante de la voie des hexosamines au niveau de la GFAT (Figure 21), et

finalement le glutamate peut aboutir à la formation de glucose par néoglucogenèse

(Figure 39). Ces molécules promettent d’être moins anodines qu’elles ne le

paraissent et approfondir cette piste pourrait mener à une meilleure compréhension

des dysfonctionnements métaboliques liés au glucose.

De même, dans le but de rétablir une détection normale du glucose, on peut

imaginer le développement de molécules thérapeutiques visant à augmenter

l’activité de la GK, ce qui devrait accroître la sensibilité à cet hexose. Par

conséquent, une hyperglycémie centrale de plus faible amplitude devrait aboutir à

une sécrétion d’insuline plus importante et donc permettre une normalisation plus

rapide de la glycémie.

PERSPECTIVES :

• Etude plus approfondie des régions cérébrales activées par une

hyperglycémie

Notre protocole d’injection aiguë de glucose à 9 mg/kg par l’artère

carotidienne vers le SNC ne modifie pas la glycémie périphérique. Nous supposons

qu’elle provoque une hyperglycémie locale, en particulier au niveau du système

porte hypothalamo-hypophysaire et du NA. Pour en être certains, il serait

nécessaire de mesurer la concentration en glucose, avant et après son

administration, au sein du NA. Or, des électrodes sont en cours de mise au point,

notamment pour leur miniaturisation. A l’heure actuelle, leur taille est trop

importante, lésant le noyau cérébral d’intérêt. La surface de cette électrode est

recouverte d’une enzyme, la glucose oxydase. La réaction dont elle est responsable,

va générer un gradient électrochimique qui pourra être mesuré et qui est

directement proportionnel à la quantité de substrat, le glucose (Dixon BM et coll.,

2002). Ainsi, il sera possible de doser les concentrations de ce sucre au cours du

temps, au sein d’un seul noyau hypothalamique et même sur animal éveillé. Par

ailleurs, on pourrait également déterminer, si cette concentration augmente dans

d’autres structures telles que les noyaux hypothalamiques PVN, VMN et le LH. En

ce qui concerne la première, cela permettrait de conforter ou d’invalider notre

- 128 -

hypothèse selon laquelle le NA serait à l’origine de son activation (la stimulation

observée par le biais de c-Fos ne serait donc pas directe).

Par rapport à cette dernière question, il est possible d’y répondre grâce aux

méthodes de traçage classiques utilisées en neuroanatomie. Elles consistent en

l’injection de molécules marquées dans un noyau cérébral donné, qui vont être

prises en charge par les synapses puis transportées le long du prolongement

nerveux pour aboutir dans le corps cellulaire. Dans le cas d’un transport

rétrograde, le marquage est retrouvé dans les neurones afférents, c'est-à-dire

excitateurs (Vercelli A et coll., 2000). Ainsi, administrés dans le PVN, ces traceurs

devraient être retrouvés dans des neurones du NA exprimant c-Fos en réponse au

bolus de glucose.

A la fin de ces travaux, nous avions envisagé de compléter nos résultats

d’activation cérébrale par le biais d’une technique innovante, l’imagerie par

résonance magnétique (IRM). En effet, depuis peu il existe des appareils étudiés

spécialement pour une application sur le petit animal (Tabuchi E et coll., 2002).

Cependant, cette technologie coûteuse, demande des connaissances pointues et

n’était pas encore totalement disponible sur le site. Cette approche, si elle est

réalisable, permettrait de suivre le décours de l’activation cérébrale, « en direct »,

suite au bolus de glucose chez le rat éveillé et il serait simple d’élargir notre champ

d’intérêt au cerveau entier. Enfin, comme le sacrifice de l’animal n’est pas

nécessaire, il peut être son propre témoin.

• Implication des astrocytes

A l’occasion de la discussion de nos résultats, nous avons suggéré que le

calcium semblait intervenir dans le mécanisme de sensibilité au glucose au niveau

cérébral, comme c’est le cas au niveau du pancréas. L’imagerie calcique, appliquée

aussi bien aux neurones qu’aux astrocytes sur des tranches fraîches de cerveau,

apportera une nouvelle compréhension du processus de détection du glucose. Il est

probable que l’administration de cet hexose induit des modifications de la

concentration intracellulaire en calcium dans certaines cellules du NA, notamment

des vagues calciques au sein de cellules gliales, mécanisme engendrant la

propagation rapide d’un signal à toute une population cellulaire, ce qui pourrait

expliquer que seuls, quelques astrocytes « détecteurs de glucose » soient nécessaires

pour engendrer une réponse. Finalement, en couplant la mesure de calcium

intracellulaire et l’enregistrement électrique, il serait possible de savoir si une telle

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réponse calcique dans un astrocyte est capable d’induire une réponse électrique

donnée (de type GE par exemple) dans un neurone voisin.

En ce qui concerne les cellules gliales en général, nous sommes conscients

que l’antigène GFAP marqueur des astrocytes, ne permet pas de révéler les

tanycytes. Or il semblerait que ces cellules jouent un rôle important dans la

détection des variations de la concentration en glucose. Il nous paraît donc

important de déterminer s’ils expriment effectivement c-Fos en réponse à l’injection

aiguë de glucose, grâce à une double immunohistochimie c-Fos/vimentine,

marqueur de ces cellules, afin d’envisager une étude plus fine des mécanismes

moléculaires qui pourraient être mis en jeu dans une réponse éventuelle au glucose

de ces cellules.

• Etude de l’implication de la GK dans la réponse cérébrale à

l’hyperglycémie

Dans le cadre des traitements pharmacologiques GlcN et GlcNAc, il serait

intéressant de corréler les résultats que nous avons obtenus sur la réponse

insulinémique périphérique avec la présence (avec la GlcNAc) ou l’absence (avec la

GlcN) d’une activation de c-Fos au niveau de l’hypothalamus et plus

particulièrement du NA.

D’autre part, observer la réponse insulinémique suite à l’activation directe de

la GK par un agent pharmacologique spécifique, permettrait de renforcer

l’hypothèse de son rôle primordial dans la détection d’une hyperglycémie centrale.

Une telle injection devrait induire une augmentation de l’insulinémie au profil

identique, c'est-à-dire rapide et transitoire. Un article récent indique que deux

activateurs seraient disponibles, GKA1 et GKA2, caractérisés pour leur action sur le

métabolisme hépatique (Brocklehurst KJ et coll., 2004). Là aussi, une confirmation

des résultats pourrait être recherchée par immunohistochimie c-Fos.

Enfin, nous avons comme projet d’étudier le bagage moléculaire des

astrocytes d’intérêt. Pour ce faire, deux étapes sont nécessaires. Dans un premier

temps, il nous faut rechercher la présence, au niveau des astrocytes du NA, de la

GK. En effet, une colocalisation de l’enzyme et de la GFAP (recherchée par

immunohistochimie) renforcerait notre hypothèse de l’implication d’une GK

astrocytaire dans la sensibilité cérébrale au glucose. Ceci sera réalisé en couplant

hybridation in situ (pour la GK) et immunohistochimie (pour la GFAP).

Dans un second temps, il nous faudrait démontrer la présence de la GK

spécifiquement dans les astrocytes sensibles au glucose (c'est-à-dire activés par le

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bolus de glucose). Pour cela, il conviendrait de réaliser notre protocole expérimental

et de procéder à une double immunohistochimie c-Fos/GFAP couplée à

l’hybridation in situ GK. Dans l’éventualité où l’hybridation in situ se révèlerait être

difficile à utiliser, nous pensons à utiliser la microdissection laser après double

immunohistochimie c-Fos/GFAP. Cette technique nous permet en effet d’avoir

accès au contenu en ARNm par RT-PCR (RetroTranscriptase Polymerase Chain

Reaction) pour une cellule donnée (dans notre cas, identifiée c-Fos +/GFAP +).

L’ensemble de ces travaux montre que l’hypothalamus, en particulier le

noyau arqué, les astrocytes et la glucokinase, tiennent un rôle important, si ce n’est

indispensable, dans la sensibilité au glucose du cerveau. Les futures investigations

proposées devraient permettre de mieux comprendre encore ces mécanismes, dans le

but d’éclairer la nature des dysfonctionnements observés dans le cas de

physiopathologies.

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AArrttiiccllee eett rreevvuueess ppuubblliiééss

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- 170 -

Résumé :

Sensibilité au glucose du cerveau chez le rat : implication de l’hypothalamus,

détermination des acteurs cellulaires et moléculaires

Le contrôle de l’homéostasie énergétique met en jeu des interactions entre la

périphérie et le cerveau, de natures hormonale, métabolique et nerveuse. Notre

projet s’est porté sur la sensibilité cérébrale au glucose dans l’hypothalamus,

nécessaire au maintien de la normoglycémie. Tout d’abord, nous avons mis en

évidence l’activation spécifique de noyaux hypothalamiques grâce à l’expression de

c-Fos induite par l’injection aiguë de glucose par la carotide vers le cerveau. Nos

résultats indiquent que des neurones sont majoritairement impliqués et que la

population d’astrocytes du noyau arqué est essentielle à cette réponse cérébrale.

Enfin, la détection de l’hyperglycémie centrale fait intervenir la glucokinase, enzyme

assurant la première étape de la glycolyse par la phosphorylation du glucose.

Glucose-sensing in rat brain: involvement of the hypothalamus, determination

of cellular and molecular actors

Energy homeostasis is a well regulated mechanism that depends on

hormonal and nervous regulation. With this aim in view, central nervous system

continuously integrates hormonal and metabolic signals to elicit adaptive

responses. The present investigation aims to elucidate the mechanism of the

cerebral glucose-sensing in the hypothalamus, i.e. the ability of this cerebral area to

detect glycaemia changes. We have shown that the acute injection of glucose by the

carotid towards the brain activates specific hypothalamic nuclei as revealed by c-

Fos expression. Our results indicate that it mainly implies neurons and that

astrocytes in the arcuate nucleus are essential for this cerebral response. Finally,

glucokinase, which assumes the glucose phosphorylation in the first step of the

glycolyse, is crucial for the detection of central hyperglycaemia.

- 171 -

Thèse soutenue par Elise Guillod-Maximin

Intitulée Sensibilité au glucose du cerveau chez le rat : implication de

l’hypothalamus, détermination des acteurs cellulaires et moléculaires

Dirigée par le Dr. Luc Pénicaud

A l’Université Toulouse III – Paul Sabatier (UFR SVT)

Le 15 octobre 2007

Résumé : Le contrôle de l’homéostasie énergétique met en jeu des interactions

entre la périphérie et le cerveau, de natures hormonale, métabolique et

nerveuse. Notre projet s’est porté sur la sensibilité cérébrale au glucose dans

l’hypothalamus, nécessaire au maintien de la normoglycémie. Tout d’abord,

nous avons mis en évidence l’activation spécifique de noyaux

hypothalamiques grâce à l’expression de c-Fos induite par l’injection aiguë de

glucose par la carotide vers le cerveau. Nos résultats indiquent que des

neurones sont majoritairement impliqués et que la population d’astrocytes du

noyau arqué est essentielle à cette réponse cérébrale. Enfin, la détection de

l’hyperglycémie centrale fait intervenir la glucokinase, enzyme assurant la

première étape de la glycolyse par la phosphorylation du glucose.

Mots clés : glucose – cerveau – hypothalamus – noyau arqué – astrocyte –

glucokinase – insuline – c-Fos – méthionine sulfoximine – glucosamine – rat

Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée

Laboratoire de Neurobiologie, Plasticité Tissulaire et Métabolisme Energétique

UMR5018-CNRS, IFR31, Institut Louis Bugnard, BP 84225

31432 TOULOUSE Cedex 4