Plant Science Letters, 7 (1976) 119--125 119 © Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam -- Printed in The Netherlands

HYDROXYPROLINE ET PEROXYDASES DANS LES PAROIS CELLU- LAIRES ET LE CYTOPLASME DE TIGES DE MELONS ATTEINTS D'ANTHRACNOSE

D. MAZAU et M.T. ESQUERR~TUGAY]~ Centre de Physiologie v~g@tale, L.A. au C.N.R.S. No. 241, 118, route de Narbonne, 31077 Toulouse C~dex (France) (Re~u le 24 f6vrier 1976) (Revision revue et accept~e le 12 avril 1976)

SUMMARY

Hydroxyprol ine (Hyp) and peroxidases in the cell wall and the cytoplasm o f melon plants infected with anthracnose fungus

In the cell wall and the cytoplasm of melon plants suffering from anthrac- nose, a high increase in the hydroxyprol ine content and the peroxidase activ- ity occurs. A study of these two parameters in diseased stems during the course of infection, shows that the hydroxyprol ine enr ichment is unrelated to the stimulation of the peroxidase activity. Moreover, it appears that in the youngest parts of the stems, such proteins respond to the disease in the same way as during a senescence process.

INTRODUCTION

Depuis la d~couverte de prot~ines ~ hydroxyprol ine dans les parois cellu- laires des v6g6taux sup6rieurs [1,2], de nombreux travaux ont montr~ que divers facteurs peuvent affecter le taux de cet acide amin6. I1 s'est av6r6 par exemple que le maintien de cellules en culture [3], la formation de cals [4], le t ra i tement de plantes par l '6thyl~ne [5], les ph6nom6nes de vieillissement [6] et l ' influence de traumatismes tels que ceux engendr6s par des maladies fongiques [7] conduisent fi enrichir la paroi en hydroxyprol ine. Simultan~- ment ou s~par6ment, des observations identiques ont 6t~ faites pour les peroxydases [5,8--10].

Dans le present travail, nous envisageons l '6volution des prot~ines pari6tales et cytoplasmiques sous le rapport de leur contenu en hydroxy- proline et de leur activit~ peroxydasique au cours de l 'anthracnose du Melon (Cucumis melo L. vat. Cantaloup charentais), maladie caus~e par Colleto- trichum lagenarium (Pass.) Ell. et Halst.

Abr~viations: Hyp, hydroxyproline; TCA, acide trichloroac6tique.

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MATERIEL ET METHODES

Des plantes de Melon cultiv~es dans des conditions r~gul~es [11] sont r~parties en deux lots quand elles atteignen~ le stade 2 (2~me feuille naissante). L'un des lots est infect~ par une suspension de conidies de Colletotrichum lagenarium (3.106 conidies ~g~es de 10 jours dans 20 ml d'eau pour 24 plantes), le lot de plantes saines restant sert de t~moin.

Les organes conducteurs a~riens (hypocotyle + ~picotyle + p~tioles) des plantes t~moins (Te) et parasit~es (P) sont r$colt~s journellement ~ partir du moment de l ' infection (jour z~ro) jusqu'au terme de la maladie (7e jour).

Ob tention des fractions pari$tales et cytoplasmiques A partir des tissus plasmolys6s puis broy6s (Ultra-Turrax), les parois cel-

lulaires sont s6par6es du cytoplasme par une succession de lavages en milieu tampon phosphate (S~): 9 lavages; triton X-100 -- eau ($2): 2 et 6 lavages respectivement; et sels de sodium - -eau ($3): 8 et 4 lavages respectivement comme d6j~ d6crit [12]. Les trois milieux de lavages S~, $2 et Sa repr~sentent le cytoplasme.

Estimation de la teneur en prot$ines Dans les fractions cytoplasmiques S~, $2 et $3, dialys~es 12 h ~ 4°C contre

de l 'eau distill~e, les prot$ines sont prdcipit~es une nuit ~ 4°C en milieu TCA ~ 4 %. Apr~s centrifugation et lavages par l '$thanol et l'~ther, les pro- t~ines sont dos~es par la mdthode de Lowry et al. [13]. Les quantitds de prot~ines pr~sentes dans les preparations de patois sont dvaludes, apr~s dosage de l'azote, selon la m~thode de Lang [14], en multipliant par le coef- ficient de Kjeldahl 6.25 la quantit~ d'azote trouv~e.

Dosage de l'hydroxyproline Apr~s hydrolyse acide des prot~ines cytoplasmiques (pr~cipit~es par le

TCA) et des parois cellulaires par l'acide chlorhydrique 6 M pendant 18 h 100°C darts les proportions 1 p/0.4 v, l 'hydroxyproline est dos~e par la m~thode de Kivirikko et al. [15]. Dans ces conditions, il a ~t~ vSrifid que l 'hydroxyproline n'est pas affect~e par la r~action de Maillard (condensation oses-acides amines).

Activit~ peroxydasique L'activit~ peroxydasique des fractions cytoplasmiques $1, $2 et $3 est

d~termin~e ~ 30°C selon un protocole inspir~ de celui de Ponting et Josslyn [16] ~ l'aide de solutions de guaiacol 40 mM et d'H202 50 mM r~alisdes dans le tampon phosphate pH 6.0. Pour cela, les deux substrats et la prdparation enzymatique sont m~langSs dans les proportions: guaiacol 4 vol., H202 4 vol., $1 0.1 vol., $2 ou $3 0.5 vol. Le d~veloppement de la coloration est suivi pen- dant 5 rain au spectrophotom~tre ~ 470 rim. L'activit~ est exprim~e en terme

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de variation d'absorption (A) par min et pax organe ou par mg de prot~ines. L'activit~ peroxydasique like ~ la paroi est ddtermin~e sur le culot obtenu

en fin d'extraction ~ partir de 10 organes auquel sont ajout~s 60 ml de chacun des substrats pr4c~demment d~crits (conditions pr~alablement ~tablies pour assurer la saturation de l 'enzyme par les substrats). Apr~s 90 sec de r~action on filtre sur verre frittd G3 (30 sec). Diffdrentes dilutions du filtrat sont aussitSt pr~par~es dans du tampon phosphate pH 6.0 (volume final 8 ml) et leur absorption d~termin~e au colorim~tre ~ 470 nm. A partir de la relation lin~aire ~tablie entre les dilutions et les A correspondantes on retient comme unit~ d'enzyme la dilution relative ~ la A 0.5 par organe, par mg de paroi, ou par mg de prot~ines pour un temps de rdaction de 1 min.

RESULTATS ET DISCUSSION

La comparaison des organes conducteurs a6riens d'une plante saine et d'une plante parasit~e montre, au terme de la maladie, un enrichissement notable des parois ceUulaires en prot~ines et en hydroxyproline ainsi qu'une stimulation de l'activit6 peroxydasique (Tableau I).

TABLEAU I

PROTEINES (mg), HYDROXYPROLINE (~g) ET ACTIVITE PEROXYDASIQUE DANS LES PAROIS CELLULAIRES ISOLEES DES ORGANES CONDUCTEURS AERIENS D'UNE PLANTE

Prot~ines Hyp Activit~ peroxydasique

Plante saine: Te 0.2 6.3' 0.2 Plante infect~e: P 0.6 52.0 0.8

Si on consid~re s~par~ment diff~rents organes de cet ensemble, c'est-~-dire hypocotyle d'une part, ~picoty! e etp~tioles d'autre part, on constate une relation certaine entre l'~ge des tissus et la r~ponse de ces diff~rents param~tres

la maladie (Tableau II). Ainsi, c~est dans les organes les plus jeunes (~picotyle + p~tioles) que la teneur en hydroxyproline et l'activit~ peroxydasique, naturellement faibles ~ partir de plantes saines, sont relativement les plus affect~es. I1 faut noter par ailleurs que les n~croses sont toujours plus intenses au niveau de l'~picotyle et des p~tioles.

La teneur en pro~ines des fractions cytoplasmiques S~, $2 et $3 (Tableau III) varie peu au total. Par contre, l'activit~ peroxydasique (essentiellement darts S~) est tr~s largement stimul~e tandis que l 'hydroxyproline subit aussi une augmentation, sans doute en rapport avec son accumulation subs~quente dans les parois ceUulaires. Individuellement, seule la fraction $3 pr~sente une augmentation notable de la quantit~ de prot~ines, ces demi~res ~tant tr~s

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TABLEAU II

PROTEINES, HYDROXYPROLINE ET ACTIVITE PEROXYDASIQUE DES PAROIS CELLULAIRES DE DIFFERENTS ORGANES CONDUCTEURS AERIENS DE PLANTES SAINES ET INFECTEES

Prot~ines Hyp Activit~/g patois mg/g patois mg/g patois

l hypocotyle 16.0 1.5 27.4 Te ~picot. + p&ioles 38.0 0.7 19.0

p ~ hypocotyle 87.0 11.0 76.4 ~picot. + p~tioles 90.0 9.0 146.0

TABLEAU III

PROTEINES (rag), HYDROXYPROLINE (jag) ET ACTIVITE PEROXYDASIQUE DANS LES FRACTIONS CYTOPLASMIQUES ISSUES DES ORGANES CONDUCTEURS AERIENS D'UNE PLANTE

Plante saine: Te Prot~ines Hyp Activit6 infect~e: P peroxydasique

Te 3.1 4.4 37.5 S, p 3.0 8.5 279.3

Te 0.6 0.3 0.2 $2 p 0.5 1.6 6.8

Te 0.3 -- 0.9 $3 p 0.8 8.2 7.7

Te 4.0 4.7 38.6 S, + S 2 + $3 p 4.3 18.3 293.8

riches en hydroxyprol ine. Etant donn~ son mode d 'extract ion par des sels de sodium, cet te fraction pourrait renfermer des pr~curseurs de la paroi, c'est-fi- dire des mol~ctfles d~j~ partiellement int~gr~es ~ ceUe-ci par des liaisons ioniques [ 17]. L'~lectrofocalisation des isoenzymes peroxydasiques qu'elle renferme (r&ultats non publi&) montre cependant que ces enzymes different notablement de ceUes de la paroi et sont apparent~es aux enzymes cytoplas- miques de la fraction S~.

La comparaison des activit& peroxydasiques pari&ales et cytoplasmiques n'est pas possible du fait des m~thodologies diff~rentes utilis~es pour leur mesure. Par contre, la comparaison des teneurs en hydroxyprol ine des prot~ines pari&ales (Te, 3.2 ~g Hyp pour 100/~g de prot~ines; P, 8.7/~g/100 #g) et des prot~ines cytoplasmiques (Te, 0.1 #g/100/~g; P, 0.4/~g/100/~g) montre que les prot~ines des parois sont beaucoup plus riches en hydroxy-

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proline que celles du cytoplasme tant chez la plante saine que chez la plante parasit~e.

L'~volution des prot~ines, de l 'hydroxyproline et des peroxydases au cours de la maladie, a ensuite ~t~ envisag~e dans les patois cellulaires (Tableau IV) et dans la fraction $1 (Tableau V) qui renferme la majeure partie des prot~ines cytoplasmiques.

Ces r~sultats montrent, dans les patois isol~es de plantes parasit~es, des accroissements tr~s nets des trois param~tres entre le 3e et le 7e jour de la maladie, celui de l 'hydroxyproline ~tant particuli~rement marqu~ ~ partir du 4e jour. Au niveau du cytoplasme, seule l'activit~ peroxydasique est forte- ment augmen~e.

TABLEAU IV

RAPPORT DES TENEURS EN PROTEINES, EN HYDROXYPROLINE ET DE L'ACTIVITE PEROXYDASIQUE DES PAROIS CELLULAIRES D'ORGANES DUCTEURS AERIENS D'UNE PLANTE PARASITEE PAR RAPPORT A SON TEMOIN AU COURS DU TEMPS D'INFECTION

Jours apr~s l'infection

1 2 3 4 5 6 7

~ot~ ines 1.2 0.9 1.2 1.6 2.4 2.5 3.1

Hyp 1.0 0.8 1.3 2.7 7.9 8.4 8.3

Act~it~ 0.9 0.8 1.2 1.7 2.4 3.1 3.8 peroxyd~ique

TABLEAU V

RAPPORT DES TENEURS EN PROTEINES, EN HYDROXYPROLINE ET DE L'ACTIVITE PEROXYDASIQUE DU CYTOPLASME (S,) D'ORGANES CONDUCTEURS AERIENS D'UNE PLANTE PARASITEE PAR RAPPORT A SON TEMOIN AU COURS DU TEMPS D'INFECTION

Jours apr~s l'infection

1 2 3 4 5 6 7

Prot~ines 0.9

Hyp 1.1

Activit6 0.8

peroxydasique

1.1 1.2 1.0 1.2 1.1 0.8

1.6 1.0 1.6 1.7 1.6 1.7

1.0 1.5 5.5 5.4 8.9 7.4

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Par contre, si l 'on consid~re l'~volution de l 'hydroxyproline et de l'activit~ peroxydasique d ' l mg de prot~ines de patois (Fig. 1) on constate, au 7e jour de la maladie, que la quantit~ d 'hydroxyproline est pass~e de 32/~g pour I m g de prot~ines (Te) fi 87 #g pour I m g (P) alors que l 'activitdperoxydasique a peu vari~. Pour le cytoplasme ($1), c'est l'inverse qui se produit (Fig. 2), l'activitd peroxydasique ~tant 10 fois plus importante chez la plante malade que chez la plante saine. Ainsi, bien que les deux param~tres, hydroxyproline et activit~ peroxydasique, ~voluent au cours de la maladie dans le m~me sens, il ne semble pas que l 'enrichissement en hydroxyproline, ddjfi caract~risd par ailleurs comme ~tant, dans la paroi cellulaire, le fait d'arabinosides fi hydroxy- proline [12], soit d5 ~ des prot~ines type peroxydases.

0.5

1 Activitb ~ Te I~ i Hyp pg ~eroxydasique ~ p __&__ Ii

J ao Apparition des £/

sympt6mes £ /

/ 1

I q lO I

' ~ 7 1 Jours ;iprJs infection

A c t i v i t 6 - ' 0 " Te --A -- Hyp DS [ broxydnsique -~ p --A-- /

/

Y • ,,/ !'

0,5 I

i i i ~ ~ 7

Jours apr~s infection

Fig. 1. Hydroxyproline et activit~ peroxydasique par mg de prot~ines de patois au cours de la maladie.

Fig. 2. Hydroxyproline et activit~ peroxydasique par mg de prot6ines cytoplasmiques (S~) au cours de la maladie.

En conclusion, on constate que les parois cellulaires et le cytoplasme de plantes de Melon atteintes d'anthracnose pr~sentent, au cours de l'infection, un enrichissement en hydroxyproline et une stimulation de l'activit~ peroxy- dasique. Cependant, relativement ~ la quantit~ de prot~ines, l'~volution respective de ces deux param~tres est dissoci~e, l'accumulation de prot~ines dans la paroi paraissant ~tre surtout le fait de pro~ines ~ hydroxyproline distinctes des peroxydases. Ces r~sultats viennent appuyer les travaux de Barnett [18] et de Liu et Lamport [19], qui ne trouvent pas d 'hydroxyproline dans les peroxydases; la presence de cet acide amind dans ces enzymes avait, en effet, d 'abord ~t~ avanc~e par certains d'entre eux [20] puis reprise par Ridge et Osborne [5] et par Darimont et al. [21].

En outre, on constate que, sous le rapport de leur teneur en hydroxyproline

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et de leur activit~ peroxydasique, les patois cellulaires d 'un organe jeune pr~sentent apr~s infection les caract~ristiques d 'un organe ~g~. On peut donc penser que les ph~nom~nes de s~nescence pr~coce des plantes, souvent rap- por t , s dans le cas des maladies, se r6percutent no tamment au niveau de cer- taines prot~ines de la paroi cellulaire.

RESUME

Dans les plantes de Melon atteintes d'anthracnose, la teneur en hydroxy- proline et l'activit~ peroxydasique des prot~ines pari~tales et cytoplasmiques sont for tement augment~es. N~anmoins, l '~volution de ces deux param~tres au cours de la maladie montre que l 'enrichissement en hydroxyproline n'est pas le fait de prot~ines type peroxydases. On note enfin dans les parois d'organes jeunes, une r~ponse ~ la maladie semblable ~ celle observ~e lots des ph~nom~nes de s~nescence.

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