HPTLC: vers la connaissance d’extraits végétaux d ... · ” Phytochimie approfondie ou...
-
Upload
hoangthuan -
Category
Documents
-
view
213 -
download
0
Transcript of HPTLC: vers la connaissance d’extraits végétaux d ... · ” Phytochimie approfondie ou...
HPTLC: vers la connaissance moléculaire d’extraits végétaux d’application cosmétique
Sylvie DarnaultCCCM – 23 Octobre 2008 -Lyon
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
2
1 – LE DEPARTEMENT I NNOVATI ON ACTI FS ET LA PHYTOCHI MI E
2 - LA DI VERSI TE POUR UN CHOI X DE MATI ERES VEGETALES
3 - METHODOLOGI E PAR HPTLC3a - Phytochimie Globale3b - Phytochimie Approfondie
4 – APPLI CATI ON A QUELQUES ACTI FS DEVELOPPES
5 – SUPPORT AU DEVELOPPEMENT
6 – I MPLI CATI ON ET AVENI R DE L’HPTLC AU DI A
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
PLAN
3
Missions
” Recherche d’actifs à partir de végétaux” Valorisation de plantes
Connaissance moléculaire
Connaissance des activités biologiques Mise en forme d’un extrait pour formulation future
Outils” Bibliographiques (connaissance ethnobotanique), chromatographiques,
d’extraction et à visée biologique.
1 - Le Département I nnovation Actifs
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
4
Département I nnovation Actifs
Extraction
Extrait standard
CriblageBiologique
Activité potentielleen cosmétique
Procédé d’extractionRendement, couleur, odeur,
solubilité
Criblage PhytochimiqueHPTLCHPTLC (isocratique, AMD,
densitométrie,…), HPLC,GC..
Marqueurs potentiels
phytochimiqueset/ou biologiques
Purification
Identification de Molécules/Marqueurs biologiquesHPLC, OPLC,
Partage L/L, HPLC prép., GC, GC/MS…
Procédé industriel
Ingrédient actif
EthnobotaniqueSélection plantesÉcorces, feuilles, fleurs, graines,…
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
5
La Phytochimie
Missions:” Sur les extraits végétaux
Mettre en évidence des molécules caractéristiques Orienter vers des marqueurs spécifiques et/ou biologiques Assurer un suivi de développement pour valider un procédé d’obtention de l’extrait final Etudier la stabilité des extraits via les marqueurs trouvés et identifiés
Méthode:” Screening Phytochimique ou approche globale
Etablir une cartographie moléculaire des extraits étudiés Rechercher différentes familles chimiques pour évaluer leur présence ou absence
” Phytochimie approfondie ou recherche d’identification structurale Rechercher des caractéristiques spécifiques aux familles et/ou composés propres
aux extraits Développement de techniques analytiques complémentaires
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
6
2 – Biodiversité végétale et moléculaire
DiversitDiversit éévvééggéétaletale
FougFougèèresres
AlguesAlgues
MoussesMousses......
fleur
s
feui
lles
écor
ces
frui
tsgr
aine
s
raci
nes
totu
m
Partie de la plante Biodiversitémoléculaire
Lipides…
VVééggéétaux taux supsupéérieursrieurs
ArbresArbres
bour
geon
s
Glucides
Acides Aminés
Composés colorés
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
Lipides…
Terpénoïdes…
Polyphénols
Composés colorés
7
3 - Outil de Connaissance de l’approche globaleH
P T
L C
H P
T L
C
O Hex/diethyl ether/formic ac.60 : 30 : 0.2
PhenolicCompounds
n Extracts 6 ou 8 standards
ACN/H O/HCOOH50 : 50 : 5
Neu + PEG
VANILLNE HCl
Folin-Ciocalteu
Iodine / HCl
Dragendorff
Molich
Ninhydrin
MolybdenumBlue
Visible + Rf
Chlorosulfonicacid
Amino acids/ Peptides
Carbohydrates/ Heterosides
Primary Metabolites
Phospholipids
Pigments Chlorophylls, Carotenoids
Triglycerides/FFA
Secondary Metabolites
Alkaloïdsexcept puric base
Alkaloïds
Triterpenoids
Phytosterols
Flavonoids
Phenolic acids
Condensed tannins
Hydrolysable tannins
Anthocyanins
UV 365 nm Visible + Rf
Anisaldehyde
without elution
Sampling Points
Primulin +Chlorosulfonic acid
+ Rf
Silice
10 Extracts 6 ou 8 standards
½Î
Silice
Silice
C18
15 : 20 : 15 : 1EtOAc /PrOH -1/H O/CH3COOH2
CHCl /MeOH/H90 : 20 : 1.5
23
2
Triterpenoids / SterolsFree fatty acids/
Alkans / AlkensGlycolipids
Triglycerids
FeCl 3 SterolsFolin-Ciocalteu + UV (254 nm,
366 nm)
Neu + PEG
70 : 30 : 1
10 Extracts 6 ou 8 standards
Silice
C6H14/(C2H5)2O/CH3COOH
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
8
3a - Carte d’identité Moléculaire
( (
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
A. U.
Plante 1Famille 1)
Plante 2Famille 2)
Plante 3(Famille 3)
Profils moléculaires de plantes d’origine diverse
Sucres et dérivés
Acides aminés et dérivés
Composés polyphénoliques
Terpénoïdes
Lipides
Chlorophylles
PH
EN
OLS
PH
EN
OLS
Conditions:
Phase Stationnaire: RP18F254s - Phase Mobile: ACN/H2O/HCOOH - 50/50/5
Révélation: Neu + Peg
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
9
Un Organe, différentes plantes
Coleus aromaticus(Lamiaceae)
Embeliaribes(Myrsinaceae)
Piper betle(Piperaceae)
00.5
1
1.5
22.5
3
4A. U.
3.5 C a rb o h y d ra te s
A m in o a c id s
P o ly p h e n o lic s
T e rp e n o id s
L ip id s
C h lo ro p h y lls
Une Plante, différents organes
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
Feuilles Fruit
Carbohydrates
Amino acids
Polyphenolics
Terpenoids
Lipids
Chlorophylls
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
FEUI LLES
Embelia ribes
10SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
espèce 1(Rutaceae )
espèce 2(Rutaceae)
espèce 3(Rutaceae)
00.5
1
1.5
22.5
3
3.5
4A. U.
Chaque extrait végétal est unique…avec sa propre carte d’identité
Profils spécifiques à chaque extrait pour conditions données
(famille, genre, espèce, organe)
Même organe – même famille – même genre
ESPECE DI FFERENTE
Carbohydrates
Amino acids
Polyphenolics
Terpenoids
Lipids
Chlorophylls
11
Du screening vers l’ingrédient Actif
I ngrédient Actif pour Cosmétique” Cibler les molécules à risque
Coumarines (spectres UV,..), alcaloïdes (révélation complémentaire,..),..
” Cibler les molécules d’interférence Pour les tests biologiques (tanins, polymères,…)
Cas de détection par le screening” Statut sur le devenir de l’extrait abandon?” Elimination de ces composés par obtention d’un autre extrait?
” Permet anticipation d’un procédé pour l’ingrédient final
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
12
But: 1ères orientations et hypothèses d’identifications de marqueurs à partir d’extraits et de fractions
” HPTLC – AMD
” HPLC/DAD
” GC et GC/MS
” (RMN)
3b – Phytochimie ApprofondieSur une famille d’intérêt
Autres conditions (élution, révélation, Gradient automatisé,…)Densitométrie (spectres UV-Visible, Recherche de molécules par longueur d’onde,1ères estimations quantitatives)
Confirmation des informations obtenues pardensitométrieMise au point de méthode analytique et Quantification (étalon choisi)
Analyse de génines natives et/ou après hydrolyseAnalyse de marqueurs spécifiques(acides gras, terpènes, …)
Confirmation des hypothèses structuralesdes marqueurs spécifiques
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
13
I ntérêt de la densitométrie et AMD
HPTLC HPTLC –– C 18C 18
Éluant : ACN/H2O/HCOOH:
40/60/5
Révélateur :
Neu + Peg – 366 nm
AMD AMD –– DiolDiol
Éluant :gradient optimisépour phénols
Révélateur :Neu + Peg – 366 nm
Densitogramme natif
à 250 nmSpectre UV extrait Spectre UV extrait
dd’’un picun pic
Densitogramme natif
à 250 nm
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
14
Autre exemple d’application AMD
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
Complémentarités de techniques
Heptane/ éther - (30/ 70) (v/ v) - silice
permet de voir les terpènes et AG
Extrait Aa TMS
Extrait Aa :
GC/FID
Gradient AMD optimisé - silice
permet de séparer alcènes et esters de stérols
Spectre EI d’Aframodial
GC/MS
15
4 - Leontopodium alpinum développé au DI A
HPTLC HPTLC –– C 18C 18
Éluant: ACN/H2O/HCOOH:
40/60/5
Révélateur:
Neu + Peg – 366 nm
OH O
OH
OH
O
OH
OHOO
OH
OH
O
O
O
O
O
OH
OHO
CH3
DensitogrammeDensitogramme natif natif àà 330 nm330 nm Spectre UV extrait dSpectre UV extrait d’’un pic/un pic/ éétalontalon
Structure identifiStructure identifiééee
Acide chlorogénique
Marqueur extrait
Acide Léontopodique
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08+ HPLC, purification solide liquide (SPE)
16
Anogeissus leiocarpus développé au DI A
min5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25
mAU
0
20
40
60
80
100
DAD1 A, Sig=360,4 Ref=off (030326\037-0102.D)
8.4
52
11.
257
14.
345
17.
149
24.
369
O
O
O
H
H
4’’
O
H C3
O
O
O
O
O
O
O
CH3
HO
H
3
4
5 6
7
2
1 1’
2’ 3’
4’
5’6’
7’
1’’2’’
3’’
5’’
H
H5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000rt2
100
%
22.002
42.045
Scan EI+ TIC
1.01e7RT
FIV(1)2
40.6 min
75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500m/z0
100
%
73.21
414.30
75.20214.81
384.24354.22
474.40
475.42
760FR1A 1062 (41.907) Cm (1061:1063-1053) Scan EI+ 8.66e4
GC/MS
8.1673.459
21.752
20.83518.418
17.33516.585
25.08527.294 29.877
38.086
(min)
207.40192.23
184.6577.19 315.24
244.24
444.36
477.43
Restek: RTX 65 TGHe: 2.5 ml/min - T°inj 300°CT°: 80°C >320°CEI+: 70eV
[M +•
]
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
HPLC
Acide 3,3 ’-di-O-methyl-ellagique-4-ß-xylopyranoside
17
5 - Support au DéveloppementAframomum Aframomum angustifoliumangustifolium
Screening d’échantillons issus de différents procédés d’extractiondans un domaine ‘Apolaire’
Conditions: Silice – Heptane/Ether éthylique – 30/70 – v/v
Révélation: lecture sous 254 nm Révélation: Anisaldéhyde - visible
Légende:
1 – MGDG 10 - Marubiin
2 – Fraction Heptane 05/10 11 - 05/05
3 – Squalène 12 - Thymol
4 – β sitostérol/cholestérol palmitate 13 - Hécogénine
5 – 05/11 14 - 05/27
6 – Sclaréol 15 – α amyrine
7 – acide ursolique 16 - β ecdysone
8 – 05/04 17 - 04/347
9 – C18:3 18 - Tristéarine
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
Marqueur commun et majoritaire
Structure caractéristique identifiée par GC/MS
Moléculeavec insaturation (254 nm)
Labdane diterpène(proche de l’étalon marubiin)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
18
Support au Développement
Screening d’échantillons issus de différents procédés d’extraction
KniphofiaKniphofia uvariauvaria
Conditions: Silice – Heptane/Ether éthylique – 30/70 – v/v
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
Deux Marqueurs communs –différenciation en terme de
concentration
Différenciation moléculaire plus spécifique pour deux extraits
Investigations spectrales via la densitométrie en cours
19
6 - I mplication et avenir de l’HPTLC au DI A
I mplication” Obtention d’une cartographie globale d’un grand nombre de familles moléculaires” Mise en évidence rapide de molécules (à risques, d’interférence)” Connaissance de l’environnement moléculaire de la famille d’intérêt pour élaborer un
procédé” Contribution à l’identification structurale des molécules d’intérêt
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
Recherche de marqueurs phytochimiques et biologiques
” Permet un suivi des marqueurs et profil caractéristique d’un extrait au cours d’un développement
” Traçabilité matière (origine plante, lieu , temps de récolte,…)
Reproductibilité résultats biologiques et validation matière végétale
Choix des lots de matières premières, analyse des premiers pilotes,…
Mise en valeur justifiée au sein de LVMH
Avenir” HPTLC: Outil de RechercheRecherche ET outil de DDééveloppementveloppement” Traçabilité matière à développer” Travail en couplage?” Détection par bioluminescence?
20
Merci de votre attentionMerci de votre attentionMerci de votre attentionMerci de votre attention
SDARNAULT - CCCM – 23/10/08
Plumeria acutifolia