Hémogramme automatisé

Pentra 120 Retic Horiba-ABX

Pentra 60 Horiba-ABX

CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories

Coulter HMX Beckman Coulter

LH 1500 Series Automation Beckman Coulter

CELL-DYN WorkCell Abbott

Laboratories

Intérêt

• Cadence d’analyse

40-150 échantillons /heure en 18 paramètres

• Exactitude des résultats (2% à 5%)

• Contrôle qualité intégré aux manipulations

• morphologiques: approche descriptive

normalisée multicritère

taille

aspect du noyau

aspect du cytoplasme

• chimiques

• analytiques

Le résultat de la formule dépend de critères:

Chargement du tube

Perçage du tube et

prélèvement

Segmentation

des aliquotes

1- Mesure par impédance

Principe de la mesure par impédance

• Le passage de cellules en suspension dans

un liquide conducteur à travers un orifice

modifie la résistance électrique entre deux

électrodes ( principe Coulter).

• Cette variation d’impédance est enregistrée

sous forme d’impulsions

La variation d'impédanceElectrode interne

Electrode

externe

Flux de diluant

Vide régulé

Temps

U

Milieu électrolyte

très conducteur

Micro-orifice

60 à 100 µm

Le nombre d ’impulsions

enregistré correspond au

passage des cellules

La hauteur des impulsions est

proportionnelle au volume de

la cellule détectée d’où

identification

Une cellule coupe le champ électrique

* diminution de la conductivité

* augmentation de la résistance électrique

Le tri des impulsions (pulse

edit)

Les impulsions générées sont

triées de façon à ne garder que

celles correspondant à un

passage standard

Le flux de balayage ( sweep flow)

un flux de diluant balaie l ’arrière des

orifices, empêchant les cellules de

retourner dans la zone de détection et

de perturber l ’analyse ( surtout pour

les plaquettes)

La correction de coïncidence

• Lorsque deux cellules traversent

simultanément l’orifice, elles ne génèrent

qu’une seule impulsion de forte intensité :

c’est le passage en coïncidence.

• la fréquence de coïncidence est une loi

statistiquement prévisible

• la correction est effectuée automatiquement

par l’analyseur.

La distribution

Les cellules sont classées en fonction de leur volume dans

différents canaux, ce qui permet la construction des

histogrammes érythrocytaire et plaquettaire

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

N

O

MB

R

E

volume

Un nombre élevé de canaux traduit avec précision la réalité.

* trop faible : ne rend pas compte de la répartition volumétrique vraie

* trop élevé : chaque cellule devient unique

Lkc et Erc 256

Plt 64

4 canaux

8 canaux

16 canaux

Application : les numérations

• Numération des érythrocytes

• Numération des thrombocytes

• Numération des leucocytes

Numération des Globules Rouges

• Comptage et mesure du volume à partir

d'une suspension cellulaire.

• Toute particule d'un volume supérieur à

36 fl est comptée comme un globule

rouge.

• Les impulsions sont triées pour retenir

celles correspondant au passage standard.

• Le résultat est assujeti à une correction

dite "correction de coïncidence".

Electrode interne

Electrode

externe

Flux de diluant

Vide réguléBac de comptage des Rouges/Plt

Analyse érythrocytaire: 7 paramètres

Dilution 1/6250 triple comptage

Mesure entre 24 et 360 fL en 256 canaux

la plage 24 - 36 fL représente les interférences

VGM

Indice de distribution érythrocytaire

• Coefficient de variation calculé à partir de la

courbe érythrocytaire.

• Donne l’étalement de la distribution autour de la

valeur moyenne

• modérément élevé: anisocytose

• indices très élevés: anomalies importantes

( double population, schizocytes, drépanocytes)

L'IDC est une valeur statistique correspondant au CV % calculé

sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose.

50 100 200 100 20050 50 100 200

IDC Normal< 15,5%

IDC Elevé 18 %

IDC très Elevé35 %

L'IDC ou IDR ou RDW

Numération des Plaquettes

Comptage et mesure du volume à partir d'une suspension cellulaire.

Les particules de volumes compris entre 2 et 20 fl sont comptées en tant que plaquette.

Le flux de balayage chasse les GR qui pourraient créer des impulsions parasites dans la zone sensible.

Electrode interne

Electrode

externe

Flux de diluant

Vide régulé

Zone sensible Flux de balayage

Analyse plaquettaire : 4 paramètres

Mesures de 2 à 20 fL réparties en 64 canaux

VMP

interférences

Les seuils sont variables, il y a toujours un risque

d ’interférence

Numération leucocytaire

Numération leucocytaire

suspension où les érythrocytes ont été lysés

dilution au 1/250

seuil de mesure 30 fL ( population décomptée à

partir de 35fL)

Remarque : le dosage de l ’hémoglobine

sur la dilution des leucocytes

méthode de Drabkin par spectrophotométrie

Lyse différentielle ou Cytolyse des leucocytes

La membrane devient semi-perméable

Le cytoplasme est libéré

La membrane se rétracte autour du noyau et des granulations

Le volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations.

La mesure de l’impédance sur cytolyse permet

d’obtenir une formule « 3 populations »

WBC,LY,MO,GR

RBC,HGB,HCT,MCV,MCH,

MCHC,RDC

PLT,PCT,MPV,PDW

24-260 fL

35-360 fL

2-20 fL

Altération des de la morphologie des GB

2- Numération des GB après lyse des GR

4- Calculs : hématocrite, CCMH, TCMH

1- Numération des GR/plaquettes et discrimination par seuil volumétrique

3- Dosage de l’hémoglobine par méthode colorimétrique

Bilan

Détermination de la formule complète

2 Analyse cytométrique tridimensionnelle

Principe de la mesure optique

• Les cellules sont analysées les unes à la suite des

autres grâce à un « gainage fluidique » (cytométrie

de flux )

• La cellule de mesure du cytomètre de flux comprend

un banc optique devant lequel passent les cellules.

• La lumière diffractée est analysée pour donner des

informations sur la taille et la densité intracellulaire

La mesure optique

SOURCECellule photoélectrique

Diluant

Diluant

Diluant

Diluant

EchantillonDiffraction lumineuse

La cellule passe individuellement devant un faisceau lumineux conventionnel (lampe halogène à vapeur de Hg ou de Xe) ou LASER (Argon, Kryton-Argon, Helium-Neon…)

Diffraction lumineuse

Petits angles = Taille(1-6 )

Grands angles = Densité intracellulaire(8-20 )

Faisceau laser

Grands angles = Densité intracellulaire

Petits angles = Taille

– Volume ou taille cellulaire

• Principe Coulter pour le volume ou mesure optique pour la taille

– Diffraction lumineuse

• Diffraction de la lumière par la cellule

– Conductivité ou Radio Fréquence (RF)

• Structure de la cellule par un courant haute fréquence

– Cytolyse

• Lyse différentielle des cellules

– Cytochimie

• Coloration de la cellule

– Marquage

• Marquage par des anticorps monoclonaux et fluorochromes

les différents paramètres utilisés pour

l’hémogramme automatisé

Impédance/Conductivité/DiffractionCoulter

1- le volume

mesure par impédance2- la diffraction laser

3- la conductivitéSimultanéité des mesures

Conductivité: analyse du noyau et de la composition

chimique du cytoplasme en enregistrant les modifications

subies par un courant haute fréquence traversant la cellules.

Diffraction : Surface,granulations

V

o

l

u

m

e

Conductivité

noyau

3 mesures physiques pour la formule complète

Analyse en 3D

Exploration

réalisée sur

plus de 8000

cellules

Analyse en 256 canaux ( 16 millions de positions unitaires)

Le scattergramme DF1 (Abbott)

Taille/Cytolyse/Cytochimie

(Activité peroxydasique) Bayer

Combinaison cytochimique

Recherche de l ’activité myéloperoxydasique

in situ (MPO)

• les lymphocytes sans peroxydase ne sont

pas colorés (-)

• les monocytes sont faiblement colorés (+)

• les granulocytes neutrophiles sont fortement

colorés (+++)

Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase)Diffraction lumineuse enregistrée sous deux angles différents (Bayer)

Traitement des cellules ; révélation de l'activité peroxydasique

Matrice PEROX

Cellule photoélectrique

Lentille

Miroir semi-

transparent

Miroir semi-

transparent

Lentille

Petit angle 2/3=

Taille

Grand angle 5/15=

Activité Peroxydasique

Analyse des Globules blancs

neutrophiles

lymphocytes monocytes éosinophilesLUC: grandes cellules sans peroxydase

( GL stimulés ou blastes agranuleux des LA ou GLHB des MNI)

débris cellulaires

Formule sur

7000 cellules

large unstained cells

N

E

Mo

LUC

débris

L

Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase) Canal basophiles

Traitement des cellules ; Lyse de tous les blancs sauf des Basophiles

Histogramme Basophiles

Cellule photoélectr

ique

Lentille

Miroir semi-

transparent

Miroir semi-

transparent

Lentille

Petit angle 2/3=

Taille

Grand angle 5/15=

Densité chromatinienne

Laser

DENSITE/SEGMENTATION

TAILLE

Neutrophiles

Eosinophiles

LUC

Débris

Ly

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Diagramme PEROX diagramme BASO

TAILLE

BASOS

Noyaux monolobés

Noyaux Polylobés

Mo

Taille/Cytolyse/Cytochimie

(Coloration des Eo.) Abx Horiba

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Volume

Absorbance

Bruit de

fond

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. Ly Mo+Ba

Ne

Eo

LyA

GCI

GCI Basophiles

Noyaux GB

Volume

Nombre

Histogramme Ba

Matrice LMNE

- ADN: noyau

- ARN : réticulocytes /plaquettes réticulées

- Récepteurs membranaires : CD4/CD8

3 Le marquage spécifique

Diffraction lumineuse + Marquage

ADN/ARN

Abbott

Marquage de l’ADN à l'iodure de propidium

Numération

Taille

Complexité.

Laser ARGON

7

0

90 Pol.PMT2

Lobularité

Granulations

Eosinophiles

90 Dépol.

PMT1

PMT3

Viabilité Blcs

Erythroblastes

Les noyaux nus des cellules lysées et les noyaux des cellules mortes sont marqués par l'iodure de propidium

Analyse de la fluorescence:

Marquage des noyaux accessibles

Noyaux nus

Leucocytes non viables

Leucocytes viables

Marquage fluorescent sur ARN

Numération

Taille

Complexité.

Laser ARGON

7

0

PMT2

RéticulocytesPMT1

PMT3

Filtre FL1 auto commutable

Réticulocytes

Fluorescence vs Complexité

Réticulocytes : coloration au bleu de méthylène

Mesure des réticulocytes

Pré-traitement: coloration

au BCB et décoloration de

l ’hémoglobine

Réticulocytes en %

réticulocytes en nombre absolu

volume moyen

indice de maturation

Diffraction lumineuse /FluorescenceSysmex

• cytolyse différentielle des

cellules nucléées autres que les

polynucléaires basophiles.

• Comptage des PB par

diffraction optique

• Lyse des globules rouges et des

plaquettes.

• les membranes des globules blancs

sont rendues perméables au

fluorochrome. Fixation du

fluorochrome sur l’ARN et l’ADN

cellulaires.

• Comptage par diffraction à petit angle,

grand angle et intensité de

• fluorescence (3D).

4- BilanFrançais Anglais Unités

Nb érythrocytes Erc RBC 103/mm 3 ou 1012/L

Concentration en

Hémoglobine

Hb HGB g/dL

Hématocrite Ht HCT L/L

VGM VMC MCV fL

TCMH TCMH MCH pg

CCMH CCMH MCHC L/dl de GR

Indice de distribution

érythrocytaire

IDC

IDR

RDW %

Nb plaquettes plt PLT 109/L

Volume plaquettaire moyen VMP MPV fL

Thrombocrite TCT PCT L/L

Indice de distribution

plaquettaire

IDP PDW %

Nb de leucocytes Lkc WBC 109/L

Nb de neutrophiles Ne Ne 109/L

Nb de lymphocytes Ly Ly 109/L

Nb de monocytes Mo Mo 109/L

Nb d’éosinophiles Eo Eo 109/L

Nb de basophiles Ba Ba 109/L

Les alarmes

• Les messages quantitatifs

anomalies par rapport à des valeurs seuils

• Les messages globaux

ex: données erronées

• les messages de suspicion

anomalies morphologiques, cellules immatures,

blastes, poïkilocytose, agrégats plaquettaires,

plaquettes géantes…