Hématologie Niveau 1 - Vebio · des GR) Les techniques: automates de type QBC (Quantitative Buffy...

HématologieNiveau 1

Alexandra Briend-Marchal

Patricia Crosse

Laboratoire Vebio

www.vebio.fr

Plan

• Pré-requis techniques

• La physiologie: hématopoïèse, rôle des hématies, rôle des leucocytes

• L’examen d’un frottis sanguin: morphologie des hématies et des leucocytes

• Application: quelques cas cliniques

• Questions à choix multiples

Les techniques: prise du sang, réalisation et lecture d’un frottis

sanguin

Les techniques: prise de sang

Les techniques: prise de sang

• Tube propre (ne pas contaminer le prélèvement)

• EDTA (bouchon violet) non périmé

• Agiter doucement par retournements successifs

• Réaliser un frottis sanguin

Les techniques: réalisation d’un frottis sanguin

Impossible d’afficher l’image.

Frottis sanguins inexploitables et exploitable


inexploitablescorrect

Frottis trop épais


Superposition des hématies

Lecture d’un frottis sanguin

Zone de lecture d’un frottis sanguin:2ème tiers vers la queue de frottis

Si trop proche de la base: hématies superposées et formule leucocytaire modifiée (plus de lympho, moins de neutro)

Si trop proche de la queue de frottis: sur-estimationde certains leucocytes (éosino et mono)

Le microhematocrit centrifugé, HCT

• Micro centrifuger un tube capillaire à grande vitesse (13 000 g)

• Le plasma est en haut

• La couche intermédiaire est constituée de leucocytes et de plaquettes

• Les hématies sont en bas


Plasma ictérique

Plasma lipémique

Plasma hémolysé

Les techniques: automates à variation d’impédance

Compteurs de cellules par variation d'impédance (de type Coulter Counter)

• Comptage dans 2 cuves séparées:

- 1 pour les hématies et les plaquettes

- 1 pour les leucocytes

• Les cellules passent à travers une ouverture créant une différence de potentiel électrique entre deux électrodes

• La variation d’impédance est fonction du volume de la particule, ce qui permet de classer chacune des cellules



• Les numérations érythrocytaire, leucocytaire et plaquettaire sont réalisées

• Le VGM est mesuré

• Une formule leucocytaire approximative est déterminée (par classification des GB en fonction de leur taille)

• L’hémoglobinémie est mesurée par spectrophotométrie après lyse des GR.


Valeurs mesurées:

• Numération des GR

• VGM (volume globulaire moyen)

• Hémoglobinémie

• Numération des plaquettes

• VPM (volume plaquettaire moyen)

• Numération des GB et formule approximative

Valeurs calculées:

• Hématocrite: RBC X MCV

• TCMH (taux corpusculaire moyen en hémoglobine): Hgb / nbre de GR

• CCMH (concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine): Hgb / Hématocrite

• RDW (Indice de variation de la taille des GR)

Les techniques: automates de type QBC (Quantitative Buffy Coat)

Compteurs de cellules par analyse du buffy coat

• Tube capillaire spécial contenant un cylindre de matière plastique (flotteur).

• Lors de la centrifugation, la couche leuco-plaquettaire s’étend le long du flotteur.

• La fluorescence est utilisée pour différencier les couches de cellules.

• L'épaisseur de la couche de chaque type de cellule est corrélée avec sa concentration.


Compteurs de cellules par analyse du buffy coat

Valeurs mesurées:

• Hématocrite

• CCMH (concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine): Hgb / Hématocrite

• Plaquettocrite

• Fibrinogène

• Buffy coat

Valeurs calculées:

• HGB

Numération des réticulocytes

• Coloration spéciale des ARN rémanent dans les réticulocytes colorés en bleu foncé par Bleu de Crésyl Brillant

• Comptage des cellules colorées (% des cellules non colorées au total)

• Interprétation de la numération absolue des réticulocytes seulement


Réticulocytes

Physiopathologie: l’hématopoïèse et le rôle des différentes populations cellulaires

Hématopoïèse

L’academie de Dijon

Hématopoïèse

Erythropoïèse

• L'hématopoïèse se déroule, après la naissance dans la moelle des os

• L’érythropoïétine agit sur les CFU-E (colonyforming unit - erythocyte) qui répond en se divisant ou en se différenciant en proérythroblastes

• L'érythropoïétine est produite par le rein, en réponse à une hypoxie

Erythropoïèse: Moelle Osseuse

Erythroblastes acidophile

Erythroblaste polychromatophile

Erythroblastebasophile

Proérythroblaste

Myélopoïèse

• La myélopoïèse se déroule principalement après la naissance dans la moelle osseuse

• La myélopoïèse est régulée par les cytokines

(exemple CSF)

Myélopoïèse

Prolifération Maturation Circulation

Moelle osseuse Sang

Le rôle des hématies:apporter l’oxygène aux tissus

Le rôle des hématies

• La fonction principale des hématies et à apporter l’oxygène aux tissus

• Toute l'énergie générée par le métabolisme de l’hématie est consacrée au maintien de la forme des cellules, à la structure de la membrane, aux fonctions enzymatiques, au maintien du fer réduit, le but final étant le fait d'optimiser l'apport d'oxygène aux tissus

Le rôle des leucocytes: défendre l’organisme contre les agressions

Le rôle des neutrophiles

• Rôle dans l'immunité innée

• La fonction principale des neutrophiles est (associée à l’inflammation aiguë) de lutter contre la pénétration et le développement de l’ensemble des éléments infectieux (bactéries, virus, champignons) et non-infectieux (cellules nécrotiques, corps étrangers)

• Arrivée aux contacts des éléments étrangers, libération de substances actives, phagocytose

• Rôle dans l’immunité adaptive: immunorégulation

Migration des polynucléaires neutrophiles

1. Margination, adhérence à l'endothélium

2. Migration à travers l'endothélium

3. Migration dans les tissus interstitiels

4. Lutter contre l’infection

Le polynucléaire neutrophile

• 3 Pools:

- Circulant

- Marginé

- Tissulaire

• Un stress induit une démarginalisation et une augmentation du nombre de neutrophiles circulants.

Le rôle des lymphocytes:

• Rôle dans l'immunité innée (cellules NK)

• Rôle dans l’immunité adaptive:

Humorale: production des anti-

corps

Cellulaire: cytotoxicité ou

hypersensibilité retardée

• Recrutement des monocytes

Les lymphocytes

• Production médullaire et périphérique (ganglions lymphatiques, rate et thymus).

• Pools circulant et marginé

Le rôle des monocytes:

• Rôle dans l'immunité innée

• La fonction principale des macrophages est de lutter contre la pénétration et le développement de l’ensemble des éléments infectieux (bactéries, virus, champignons) et non-infectieux (cellules nécrotiques, corps étrangers)

• Arrivée aux contacts des éléments étrangers, libération de substances actives, phagocytose

• Rôle dans l’immunité adaptive: immunorégulation

• Rôle dans la réparation tissulaire

Les monocytes

• Taille d’un monocyte: 12-20 microns

• Appartient au (système des phagocytes mononucléés): cellules avec de nombreuses fonctions

• Monocytes circulent dans le sang, puis entrent tissus pour devenir des macrophages.

• Monocytose:

Inflammation

Glucocorticoïdes

NéoplasieMonocyte PNN

Les polynucléaires éosinophiles

• Taille: 12-15 microns

• Production dans la moelle osseuse est stimulée par les cytokines (IL5 surtout)

• Pools circulant et marginé

• Ils circulent pendant quelques heures max puis entrent dans les tissus, où ils peuvent vivre pendant des semaines.

PNN PNE

Eosinophilie

Causes:

- parasitose

- phénomène allergique

- syndrome éosinophilique

- syndrome paranéoplasique (mastocytome, autre)

Le rôle des plaquettes: assurer l’hémostase

Rôle des plaquettes

• La première fonction des plaquettes est de contribuer à réparer des brèches vasculaires et à prévenir une hémorragie, en participant à la formation des bouchons hémostatiques. Les plaquettes sont consommées dans ce processus.

• L'énergie pour les fonctions plaquettaires est dérivé de l'ATP (généré par la glycolyse aérobie et la phosphorylation oxydative)

• Les plaquettes jouent également un rôle importante dans l’inflammation

Morphologie des cellules sanguines

Les hématies

Examen des hématies

• Cellule anucléée chez mammifères (nucléée chez oiseaux, reptiles, batraciens, poissons)

• Produite par lignée érythroïdemédullaire

• Volume variable en fonction espèce

• Examen de la taille, de la forme, de la couleur

• Uniformité générale

Examen des hématies: chien

• Disques biconcaves

• Volume: 65-75 fl

Cas particuliers:

Macrocytose Caniche (VGM=80 fl)

Microcytose Akita et Shiba Inu

(VGM= 60 fl)

• Contours réguliers

• Légère pâleur centrale

Examen des hématies: chat

• Disque biconcave

• Volume: 45-55 fl

• Légère anisocytosephysiologique

• Pâleur centrale peu visible

Les leucocytes

Le polynucléaire neutrophile

• Diamètre: 10-12 microns (GR= 7 microns)

• Noyau polylobé (2 à 5 lobes)

• Cytoplasme abondant clair sans granulation

Polynucléaire éosinophile: Chien

• Diamètre: 12 microns

• Noyau bi ou trilobé

• Chien: granulations rondes, oranges, en nombre et de taille variables

Polynucléaire éosinophile: Chat

• Diamètre: 12 microns

• Bilobé le plus souvent

• Chat: granulations très nombreuses, en batonnets, oranges

Polynucléaire éosinophile: chien et chat

PNE de ChienPNE de Chat

Les polynucléaires basophiles

• Très rarement observés (très faible nombre circulants)

• Plus fréquent chez le chat que chez le chien

• Production dans la moelle osseuse est stimulée par les cytokines

Le lymphocyte

• Diamètre: 7 à 10 microns

• Noyau rond parfois encoché, cytoplasme clair très réduit

• Rôle dans l’immunité à médiation humorale

Le monocyte

• Diamètre: 15-20 microns

• Noyau massif grossièrement en U, cytoplasme abondant grisâtre et parfois vacuolisé

• Rôle dans l’immunité à médiation cellulaire

monocyte

Les plaquettes

Les plaquettes

• Plaquettes = fragments de cytoplasme de mégacaryocytes médullaires

• Rôle: hémostase primaire (formation du thrombus blanc)

• Chat: plaquettes volumineuses + amas fréquents

Plaquettes (thrombocytose sévère ici)

Les plaquettes

Plaquettes Amas de plaquettes

Macroplaquettes: Cavalier King Charles

Amas de plaquettes

• Très fréquent chez le chat physiologiquement

• Peut être le signe d’un état d’hyperagrégabilitéplaquettaire

Modifications des hématies

Modification de taille et de coleur

• Différence de taille entre les GR = anisocytose

• Différence de couleur entre les GR = polychromatophilie

Anisocytose + polychromatophilie

• Réticulocytes = plus gros et plus bleus que les GR

• Régénération des GR:

Perte de sang

Anémie hémolytique

Réticulocytes

Réticulocytose: bleu de Crésyl

• Réticulocytes possèdent résidus ARN colorés en bleu foncé par Bleu de Crésyl Brillant

• Classification de l’anémie (régénérative ou pas)

Réticulocytes

Hypochromie

• Parmi des hématies normales:

- hématies pâles

- hématies petites

- cellules cibles

• Anémie ferriprive

Annulocytes

Corps de Howell-Joly

• Résidu nucléaire, rond, très basophile

• Fréquent et physio chez chat en petit nombre

• Augmenté chez animal splénectomisé

Corps Howell-Joly

Erythroblastes circulants

Acanthocytes

• Hématies dont le membrane est déformée, comme « ondulée »

• Altération du ratio entre différents lipides membranaires (hépatopathie, défaut d’absorption intestinale des lipides)

Acanthocyte

Schizocytes

• Morceaux d’hématies de formes aléatoires

• Fragmentation mécanique (glomérulopathie, endocardite, néovascularisation tumoraleV)

Schizocytes

Corps de Heinz

• Oxydation de l’hémoglobine qui précipite sous forme d’un corpuscule rejeté à un pole de l’hématie puis à l’extérieur

• CT >> CN

• Hématies définitivement non fonctionnelle

• Traitement oxydant (paracématol..), additifs alimentaires, oignons

Corps de Heinz

Corps de Heinz

Corps de Heinz:bleu de Crésyl

Réticulocyte

Corps de Heinz

Eccentrocytes

Eccentrocytes

Sphérocytes

Sphérocytes

Parasitoses décelables sur le frottis sanguin

• CN: babesiose (dans GR), dirofilariose, hépatozoonose (dansmonocytes), anaplasmose (dans les plaquettes)

• CT: mycoplasmose (dans GR) (haemofelis, haemominutum)

Babesia sp

Babesiose(Babesia canis)

Dirofilariose(dirofilaria immitis ou repens)

Anaplasmose(anaplasma platys)

Anaplasma platys

Mycoplasmose(Mycoplasma haemofelis ou haemominutum)

Mycoplasma

Modifications des leucocytes

Jeunes Polynucléaires Neutrophiles toxiques

• Formes immatures peu lobées

• Parfois cytoplasme spumeux ou corps de Doëhle

• Infection, surtout bactérienne

Jeunes polynucléaires neutrophiles toxiques

Jeunes PNN

Corps de Doëhle

Corps de Doëhle

• Corpuscules cytoplasmiques ronds, bleutés, taille variable

• Résidus de reticulum endoplasmique lors de défaut maturation granuleux

• Observés dans infections suppurées

Corps de Doëhle

Corps de Doëhle

Neutrophilie

• Physiologique (réaction de fuite, de défense)

• Associé à une augmentation des glucocorticoidescirculants (origine médicamenteuse ou hypercorticisme spontané)

• Inflammatoire

• Tumorale

Les lymphocytes

• Lymphocytose

Physiologique

Inflammation chronique

Néoplasie

Hypocorticisme

• Lymphopénie

Glucocorticoïdes

Inflammation aïgue

Perte de lymphocytes (épanchement chyleux)

Hypoplasie lymphoïde (immunosuppression)

Lymphocytes activés

• Plus grands, cytoplasme plus abondant et plus basophile

• Parfois quelques grains cytoplasmiques rougeâtres

Lymphocyte activé

Cas cliniques

Cas 1: Chat Sacré de Birmanie 1 ans


• HCT: 10%

• HGB: 4 g/dL

• VGM: 55 fl

• Réticulocytes: 138 320/µL

• Plaquettes: 331 000/µL

• Neutrophiles: 38 260/µL

• Coombs: Positif


• LIGNÉE ROUGE : Anisocytose et polychromatophilie ++.

• LIGNEE PLAQUETTAIRE : Pas d'anomalies morphologiques notées.

• LIGNEE BLANCHE : Absence d'anomalie morphologique sur les différentes populations leucocytaires observées.


• Conclusion: anémie périphéique et Coombs +

- Evoque une anémie à médiation immune

- Un éventuel foyer de saignement ne peut pas être exlu

Cas 2: Chien épagneul breton 14 ans


• HCT: 28%

• HGB: 9 g/dL

• VGM: 65 fl



• Leucocytes: 4 820/µL



• LIGNÉE ROUGE: Pas d'anisocytose ni de polychromatophilie.

• LIGNEE PLAQUETTAIRE: Macroplaquettes

• LIGNEE BLANCHE: Absence d'anomalie morphologique sur les différentes populations leucocytaires

observées.


Conclusion:

Anémie non régénérative modérée compatible avec:

-une inflammation chronique

-une hypoplasie médullaire

-une insuffisance rénale chronique

-une perte de sang chronique (parasitisme interne ou externe

sévère? ulcère digestif?...)


Prochaine étapes:

1. Cherchez un foyer inflammatoire chronique

2. Myélogramme

Cas 3: Chien cocker 12 ans


• HCT: 25%

• HGB: 8,5 g/L

• VGM: 73 fl





• LIGNÉE ROUGE : Anisocytose et polychromatophilie ++

Sphérocytes +

• LIGNEE PLAQUETTAIRE : Pas d'anomalies morphologiques notées.

• LIGNEE BLANCHE : Absence d'anomalie morphologique sur les différentes populations leucocytaires observées.


Conclusion:

Anémie périphérique compatible avec:

- une anémie à médiation immune

- un éventuel foyer de saignement


Prochaines étapes:

• Un test de Coombs

• Une biochimie

• Historique d’intoxication médicamenteuse ou de transfusion?

Alexandra Briend-MarchalDocteur VétérinaireDiplômée du Collège Européende Pathologie Clinique VétérinaireD.U. Cyto-Hématologie HumaineC.E.S. Hémato-Biochimie Vétérinaire

Stéphanie Lafarge-BeurletDocteur VétérinaireD.U. Cyto-Hématologie HumaineMaster de CancérologieDoctorat de Science

Patricia CrosseDocteur VétérinaireDiplômée du Collège Américainde Pathologie Vétériniaire, option Biologie CliniqueAncienne consultante au Royal College de Londres

Expertise, Disponibilité, Indépendance, Qualité

ACTIVITÉSBiologie vétérinaireRecherche et développement cliniques, en interne et en partenariats (publics et privés)Formation continue vétérinaire (articles, conférences, cours, stages ...)

ENGAGEMENTSAffilié à un contrôle qualité externe internationalMatériel de pointe et méthodes validées pour la biologie vétérinaireExpertise, disponibilité et indépendance des biologistes vétérinairesAgrément par le Collège Européen de Biologie Clinique pour la formation de résidents

SERVICESRésultats disponibles sur internet (espace personnalisé et sécurisé)Transport simple et rapide à un coût minimalFourniture de matériel de prélèvement et de kits d’envoi aux normes P650Organisation de cessions de formation continue en biologie clinique (ouvrant droit à des points de formation)

Laboratoire Vebio Biologie Vétérinaire

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94117 Arcueil cedex

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