Génie métabolique chez les végétaux

Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique

www.imagesdepicardie.com

Génie métabolique

Optimisation des procédés de fermentation industrielle basée sur la compréhension et la modulation de voies métaboliques

Conditions de culture Génie génétique

Définition valable pour seulement pour des aspects très restreints du génie métabolique chez les végétaux

« Champs de microbes » : utilisation industrielle de bactéries photosynthétiques par

l’entreprise Solazyme

Protéines recombinantes

Caroténoïdes

Masanaru Misawa

Production de métabolites secondaires par le biais de cultures de cellules ou de tissus

végétaux en bioréacteurs

Ex: Shikonine

Génie métabolique végétal dans le cadre de cultures en « bioréacteurs »

Génie métabolique appliqué aux « plantes entières »

Productivité Assimilation des éléments Tolérance aux stress Phytoremédiation

Qualité Augmentation des teneurs

Vitamines, Principes actifs médicamenteux, Pigments, Parfums, Arômes, Acides gras insaturés …

Diminution des teneurs Glucosinolates, Acide érucique, Arômes

indésirables, Tannins, Lignine

Points abordés dans les cours

Génie métabolique appliqué à la production de composés à usage pharmaceutique et cosmétique

Principaux métabolites secondaires utilisés dans l’industrie pharmaceutique et cosmétique

Alcaloïdes Alcaloïdes indoliques Etc..

Composés mixtes et glycosides Glycosides cardiotoniques

Composés phénoliques Flavonoïdes, quinones … etc…

Isoprénoïdes Tocopherol…etc..

Le problème de la production des métabolites IIaires

Synthèse organique Lorsqu’elle est possible…

Culture de plantes au champ Lorsqu’on la maîtrise

Culture in vitro Lorsque les molécules en valent la peine…

Synthèse organique : les plantes comme modèle

• Souvent possible, à bas prix Ex : aspirine

• Mais, ce n’est pas toujours possible…

Réaction de Kolbe

Culture de plantes aux champs

Plantes médicinales ~7000 ha en France Culture peu coûteuse

Mais, ce n’est pas toujours possible…

Exemples de plantes médicinales difficiles à cultiver

L’if

Pervenche de Madagascar

Autres organismes biologiques

Expression hétérologue de gènes de plantes chez d’autres microorganismes hôtes ?

Caractères fortement polygéniques Expression étroitement coordonnée de

plusieurs dizaines de gènes dans la synthèse d’un seul métabolite

Génie métabolique appliqué aux végétaux

Cultures in vitro pour la production de métabolites secondaires

Un dogme ancien et erroné : « les suspensions cellulaires ne produisent pas de métabolites secondaires » (1940-1970)

Une technologie récente (1975-1985) et des résultats assez peu nombreux…

Les espoirs initiaux

1956 : Pfizer inc. Dépose un brevet concernant la production de métabolites par des cultures cellulaires de plantes

Fin des années 60 : La visnagine et la diosgenine sont produites à plus

fortes concentrations dans des cultures cellulaires que dans les plantes

Ça « coince » avec les molécules les intéressantes : vinblastine, vincristine…

Un succès : la Xn de shikonine commercialisée en 1983 par Mitsui Petrochemicals

Japon : la tête de proue

Outils de fermentation industrielle Extension aux cultures végétales

70s (Japan Tobacco Inc) production de biomasse pour la confection de cigarettes (réacteurs de 20 000 L)

Meiji Seika, Nitto Denko Co : production de masse de Panax ginseng in vitro

1982 : 5ème congrès de l’IAPTC (=IAPB) au japon : nombreuses avancées dans la production de métab II, dont la shikonine par Mitsui Petrochemicals

http://homepage1.nifty.com

Lithospermum erythrorhizon (Borraginacées)

http://crop.nics.go.kr

Shikonine : 10% de la MS de la racine

Cosmétique

Phytothérapie

Cultures en bioréacteur de cellules de Lithospermum erythrozhizon

www.uni-tuebingen.de/pharmazie/abteilungen/biologie/de/shikonin.html

Trois succès durables

Shikonine Berbérine

Cultures cellulaires Saponines du ginseng

Cultures de racines à grande échelle

Un alcaloïde isoquinolique : la berbérine

Malaria Principal alcaloïde accumulé dans le

rhizome de Coptis japonica (Renonculacée)

Années 70 : selection d’une souche hyperproductrice de berbérine, transférée à Mitsui Biochemicals

Optimisation : culture à haute densité (optimisation de l’oxygénation et du milieu), 0.45 g /L / jour http://www48.tok2.com/home/

Production de saponines par Panax ginseng

Traitement des ulcères 5 ans de culture Destruction de la racine pour

extractionwww.01sante.com/. ../ginseng.htm.

Culture de racines en réacteur

Quelque systèmes de production à l’étude

taxol Vinblastine, Vincristine

Elly Lilly & Co Glycosides

Concurrence avec la synthèse chimique

Paclitaxel (taxol)

Écorce de Taxus brevifolia (If du pacifique)

Propriétés pharmacologiques Antimitotique tubulo-affine

Applications cancers à métastases

Cancer de l’ovaire et du sein

Culture in vitro pour la synthèse de Taxol

Taxol: traitement 1g /an 1g = 3 arbres (Taxus sp., l’If) de 150 ans

Productivité in vitro :

100-150 mg / L en deux semaines

Taxus baccata (Taxaceae)

10-désacétylbaccatine III dans les feuilles : récolte non-destructrice Précurseur d’hémisynthèse Toxotère® par Sanofi-Aventis

Catharanthus roseus (Apocynaceae)

http://www.ntbg.org/plants/plantresource

Le thé de pervanche utilisé en pharmacopée traditionnelle en Jamaïque comme antidiabétique

Années 50 :

Stimulation de la sécrétion d’insuline ??

Pas du tout mais diminution des globules blancs

Traitement des leucémies

Vinblastine et vincristine

Faible rendements …

•Vinblastine : 2-10 g (50-250 k€) / tonne de MS

•Vincristine : 0.5 g / tonne de MS

Maladie de Hodgkin

Leucémies

Les alcaloïdes de la pervenche de Madagascar

Au moins 70 alcaloïdes identifiés dont :

Dans les feuilles Vincristine et vinblastine

(anticancéreux) Dans les racines et les suspensions

cellulaires Serpentine et Ajmalicine :

(antihypertenseurs)

Production d’ajmalicine par C. roseus

Hypothèses : 800 Kg / an 260 µg ajmalicine / g MS / jour

Suspensions cellulaires : 3150 $/Kg Plantes entières : 619 $ / Kg

Source : FAO (http://www.fao.org/docrep)

Au contraire la culture de Lithospermum est longue (maturité 3-5 ans) et sensible au variations climatiques : les cultures cellulaires sont plus rentables

L’hémisynthèse

1974 Équipe de Potier (Paris)

Dimérisation de deux alcaloïdes monomeriques : catharantine et vindoline

vinorelbine (navelbineTM)

ß-methyl-digoxine (Digitalis)

Cardiotoniques Mais de nouveaux cardiotoniques de

synthèse sont apparus Les projets de production par CIV sont

tombés à l’eau

Les suspensions cellulaires sont tout de même utilisées pour réaliser les étapes finales :bioconversion

Bioconversion

Premières étapes de synthèse chimiqueFinalisation des molécules par culture in vitro

Ajout de précurseurs dans le milieu de culture : bioconversion

Amélioration

A B C

A C coût B / coût C ?B

Bioconversion 12-hydroxylation de la beta-methyl-

digitoxine digoxine

Digitalis lanata

OH

Reinhard et Alfermann 1982

Boehringer Mannheim Co : réacteurs de 4 000 L

Bioconversion des extraits végétaux

Bioconversion des extraits par fermentation lactique en réacteur

teneurs en trois ginsenosides d’interêt : X 60 Pathologies causées par Helicobacter pilorii

(ulcères)

Brevet (2003) Ginseng Science

Méthodes de production in vitro

Du prototype à la technologie industrielle

Mise au point en flacons de culture

Principes de base

La plupart des métabolites secondaires sont intracellulaires, intravacuolaires

Quantité produite = biomasse produite X concentration

Production in vitro

• Biomasse

temps

Nombrede cellules

3 semaines

Alors : dX = dtX

et ln X = (t-t0)X0

X0

Croissance exponentielle

t0

Production in vitro

• Production de métabolites

temps

Quantité de cellules Quantité de métabolitessecondaires

Découplage croissance/synthèse de Métabolites Iiaires

Production in vitro

Exemple : Production d’ajmalicine par Catharanthus en deux étapes:

L’inoculation de la phase de production avec des cellules en phase stationnaire avancée donne une productivité 4 fois supérieure

Indicateur : inoculation avec des cellules qui ont consommé tout le nitrate dans leur milieu

Schaltmann et al (1996) Biotech. Bioengineering

..

..

.

..

.

..

MG5

M9

Procédé de production de shikonine : batch en 2 étapes

Tabata et al.Mitsui Corp.

200 L9 j

750 L14 j

Filtration FiltrationAir Air

Shikonine

Inoculum

Croissance

Production

4 g/L

Culture en bioréacteurs

http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm

Passage du flacon au réacteur

Dans certains cas : diminution de la synthèse : Catharantus

Composition de la phase gazeuse: Taxus:

Baisse de O2 augmentation taxol Augmentation CO2 diminution taxol

Mirjalili (1996) Biotechnol Bioengineering

Réacteurs forte capacité

Contrôle des paramètres pH, O2, nutriments, précurseurs,

éliciteurs… Agitation, aération Qualité de lumière

•Les freins du « scale up »

•Transferts de masse gaz-liquide (oxygène)

• Sensibilité au cisaillement ( 100 t/min)

• Homogénéisation du milieu :

• Sédimentation

• Attachement

• Contact cellules-liquide

Production in vitro

Agitation mécanique

Bullage

Pales

Tambour rotatif

Wave bioreactors

http://www.wavebiotech.com

Culture d’organes

Dans plusieurs cas, les cellules indifférenciées ne produisent pas la molécule désirée: cellules de Catharanthus : pas de

vinblastine Cellules de pavot : pas de morphine

Production de saponines par le Panax ginseng : culture de racines obligatoire

Culture d’organes

Racines transformées (hairy roots) Croissance Production de molécules Stabilité génétique

Cultures de tiges feuillées

Hairy roots de Psoralea lachnostachys

Stratégies alternatives : hairy roots

La croissance

Stratégies alternatives : hairy roots

« plantes à traire »

INPL-ENSAIA, Nancy

•Cultures en hydroponie

•Solution nutritive en circuit fermé avec filtration des métabolites exsudés par les racines

E. Gontier et F. Bourgaud

Datura inoaxia :

Hyoscyamine, scopolamine (neurosédatifs)

Perméabilisation de cellules

Amélioration

Faire sortir les produits intracellulaires

Petite taille moléculaire des métabolites secondaires

perméabilisation des membranes phospholipidiques

Optimisation de la synthèse

Impact des conditions de culture sur la synthèseElicitation

Comment augmenter la synthèse?

Sélection de lignées fortement productrices

Choix de la source carbonée et ajout de précurseurs simples

Paramètres physiques et temporels de la culture

Eliciteurs biotiques ou abiotiques

Hormones

Elicitation par un facteur biotique de la synthèse de sanguinarine

Un alcaloïde isoquinoléique synthétisé dans les suspensions cellulaires d’opium

TYDC

TYDC TYDC

Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)

Con

cen

trati

on

cel lu

lai r

e e

n

san

gu

inari

ne (

mg

/ g

DW

)

Temps après élicitation (h)

Elicitation des teneurs en sanguinarine par l’extrait de Botrytis

Act

ivit

é r

ela

tive

TYD

C (

%)

Temps après élicitation (h)

Elicitation de l’activité tyrosine décarboxylase par Botrytis

Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)

L’acide Jasmonique

Un éliciteur « miracle »

Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.

Elicitation de la synthèse d’acide rosmarinique chez Lithospermum erythrorhizon

Méthyl Jasmonate

Control

Yeast Extract

Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.

Utilisation industrielle de l’acide jasmonique

Elicitation des cellules de Taxus pour la synthèse de taxol

Fin des années 90 : rendement multiplié par 100 en particulier grâce au méthyl-jasmonate

La production industrielle in vitro devenait alors envisageable

Génie génétique et génie métabolique

Stratégies moléculaires pour manipuler des voies de biosynthèse

L’outil moléculaire au service du génie métabolique

Caractérisation des voies de biosynthèse Caractérisation des principales étapes

enzymatiques Clonage des gènes correspondants Transgénèse

Surexpression de gènes homologues De gènes hétérologues (plantes,

bactéries…) RNAi

Transgenèse de lignées cellulaires ou de plantes entières

Système plante entière insatisfaisant

Système in vitro insatisfaisant

Souches cellulaires transformées

Plantes entières transformées

Capell et Christou (2004) Curr. Opin. Biotech.

Stratégie « Étape enzymatique »

Modulation de la voie synthèse de la scopolamine chez Hyoscyamus

Häkkinen et al.

Surexpression de la hyoscyamine 6-hydroxylase (H6H) et de la putrescine methyl-esterase (PMT)

Témoin racines transformées par A. rhizogenes

H6H PMT

PMT + H6H

Témoin

Zhang et al.

Stratégie « Facteurs de transcription»

Moduler l’expression de gènes codant les enzymes impliquée dans toute une chaîne de biosynthèse

Stratégie « Facteurs de Transcription »

Catharanthus

Promoteurs régulés par le facteur de

transcription ORCA3

Gantet et Memlik 2002 Trends in Pharm Sci

CONCLUSIONS

Production de métabolites 2aires

Quelques réussites en CIV De gros efforts de recherche depuis 40

ans L’espoir renouvelé par le génie

génétique CIV Plantes entières

Lecture conseillée pour approfondir les aspects « bioréacteur »

http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e00.htm#con

  PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE

Génie métabolique et horticulture

Manipulation de la voie de biosynthèse des anthocyanes

Moonshadow (Florigene)

CHS

F3’HF3’5’H

DFR DFRDFR

Expression de la DFR de maïs chez le Pétunia

1987 (Nature) Premier succès : obtention de pétunias oranges contenant de la pelargonidine

Expression hétérologue d’une DFR (dihydroflavonol réductase) de maïs

F3’H

F3’5’H

DFR de maïs DFR de pétunia

naringenine

Comment obtenir une rose bleue ?

(Pari lancé en 1840…)

Les roses sont déficientes en F3’5’-hydroxylases :

pas d’anthocyanes dérivées de la delphinidine

Surexpression de la F3’5’H

Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600

Pour améliorer la qualité du bleu….

Silencing de la DFR de rose Surexpression de la

DFR d’Iris

Surexpression de la F3’5’H de violette

F3’H

F3’5’H

Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600

Génie métabolique et plantes aromatiques

Biosynthèse du menthol

Amélioration quantitative et qualitative de l’huile essentielle de menthe par génie métabolique

mentholOH

Trichomes glandulaires chez la menthe

www.microscopix.co.uk/ plants/oils/.

Turner et Croteau (2004) Plant Phy.

Le menthol : un monoterpène

Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

IPP

Deux approches

Quantitative Modulation des activités enzymatiques

en amont de la voie de biosynthèse Qualitative

Modulation des activités enzymatiques en aval de la voie de biosynthèse

2 x acétyl CoA

Mévalonate

Mévalonate 5-diphosphate

DXPS

DXR

MCT

CMK

MECPS

2-C-Méthyl-D-erythritol-2,4-

cyclodiphosphate

Isopentényl diphosphate

Diméthylallyl diphosphate

IPPI

MDC

Pyruvate + G3P

Terpenoïdes

CytosolPlaste

Goulot d’étranglement ?

Surexpression de la 1-deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) chez la menthe poivrée

Augmentation de rendement sans changement de composition

Lignée Rendement huile (mg/g MF)

Sauvage 1.8

DXR6 2.6

DXR7 2.3

DXR8 2.4

Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

Biosynthèse du menthol

Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

Cytochromes P450 (Réticulum)

Leucoplastes Mitochondrie

Antisens sur la menthofurane synthase

lignée Oil yeald (mg/g FW)

Limonene Menthone Menthofurane Pulégone Menthol

sauvage 1.7 2.3 60.2 13.9 7.8 4.0

MFS-as 1.8 2.6 68.8 5.3 2.8 7.3

Changement de composition sans changement de rendement

Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

Génie métabolique appliqué à la foresterie

www.nazflora.org

Modification du contenu en lignine par transgenèse

Principaux constituants du bois

Lignine (25%)

(exemple de polymérisation de quelques unités G)

Cellulose (50%)

Hémicellulose (25%)

Problématique

Fabrication de papier

Ecorçage/Mise en copeaux Délignification au sulfate alcalin=procédé kraft Délignification au bisulfite (acide)

Blanchiment : Chlore, Peroxyde

Coût énergétique Impact environnemental

La lignine : un facteur majeur de difficulté dans le procédé de fabrication

Circuit fermé

Effluents

Hu et al. 1999 Nature Biotechnology

Augmenter le ratio cellulose/lignine par génie génétique

Stratégie n°1 : amélioration quantitative

Répression par stratégie antisens

Réprimer la 4CL, mais laquelle ?

Chez le peuplier : deux isoformes Quelles sont leurs spécificités de

substrat? Dans quels tissus sont-elles exprimées?

Les deux isoformes contribuent-elles à la synthèse de lignines ?

Hu et al. 1998 PNAS

Pt4CL2

Pt4CL1

Spécificités de substrat des deux isoformes de la 4-coumarate:CoA ligase

Localisation histologique de l’expression de Pt4CL1 et Pt4CL2

ÉpidermeXylème

Northern Blot

Activité GUS

Feuilles

Tiges

4CL24CL1

Hu et al. 1998 PNAS

Conclusions

La 4CL1 est impliquée dans la synthèse des monomères de la lignine

La 4CL2 est impliquée dans la synthèse d’autres composés phénoliques (métabolites secondaires)

Pour altérer la synthèse des monomères de la lignine, une stratégie « antisens » doit être ciblée sur la 4CL1

Contrôle du phénotype : quantité de lignines

Hu et al. 1999 Nature Biotechnology

Témoin Lignées transgéniques

% L

igni

n re

duct

ion

Témoin

Transgénique

Phénotype : ratio cellulose / lignine

Hu et al. 1999 Nature Biotechnology

Implications

Vitesse de croissance accrue Avantage technologique Questionnement sur les flux de gènes ?

Effets secondaires possibles de la diminution des niveaux de lignine Attaques pathogènes Décomposition du bois dans la litière

rôle de puit de carbone pour les arbres

Modifier la composition de la lignine par génie génétique

Stratégie n°2 : amélioration qualitative

Bois dur ou bois tendre ?

Lignine G Lignine S/G

Hu et al. 1999 Nature Biotechnology

La lignine : un polymère d’unités phénylpropanoïdes

Liaison moins résistante : procédé de fabrication du papier plus facile

Lorsque la position 5 est disponible pour la

polymérisation : lignine plus résistante

Approche retenue: expression de la F5H sous le contrôle d’un promoteur de la C4H spécifique des tissus du xylème

% de lignine S dans les transformants

Huntley et al (2003) J. Agric. Food Chem.

Efficacité de la mise en pâte chimicothermomécanique

Conclusions

Le génie métabolique appliqué à l’amélioration des espèces ligneuses horticoles, aromatiques ou médicinales est une approche crédible

Cette approche ouvre un champ large d’applications

Plusieurs applications sont déjà au stade de la commercialisation