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MINISRTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR UNIVERSITE DE LA MANOUBA

INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)

SUPPORT DE COURS

GENETIQUE MOLECULAIRE

UE : Enzymologie/ Génétique Moléculaire

Licence Fondamentale en Sciences du vivant, Parcours : Biologie intégrative :

animale, végétale et microbienne

Niveau LF2

Elaboré par :

Dr. KHOUAJA Fattouma

Année Universitaire 2019/2020

2

Annexe 17 Unité d’Enseignement : Enzymologie/ Génétique Moléculaire

Code UE :……………

Code ECUE :……………

Plan du Cours Génétique Moléculaire Introduction Rappels sur les propriétés et l’expression de l’information génétique Chapitre 1: La définition du gène - Mutants d’auxotrophie, chaînes de biosynthèse - Relation gène-enzyme - La complémentation fonctionnelle

Chapitre 2: Les mutations - Propriétés des mutations - Notion de mutation germinale et de mutation somatique - Les agents mutagènes et leurs modes d’action

* Agents physiques * Agents chimiques

- Notion d’épigénétique - Les différents types de mutations et leurs conséquences

* Substitution * Insertion/délétion/duplication * Mutations de Répétition (microsatellites et VNTR) * Transposition

Chapitre 3: La réversion et la suppression intra et extracistronique Chapitre 4: Génomes extra-chromosomiques - Diversité des génomes mitochondriaux - Génomes chloroplastiques - Fluidité des génomes et évolution des séquences Chapitre 5: Régulation de l’expression des gènes : Opéron Lactose

- Les mutations de structure - Les mutations de régulation

Travaux Pratiques et dirigés

- Test de complémentation et test de recombinaison - Suppressions intra et extra cistronique - Régulation de l’expression des gènes

3

Figure 1 : Structure de la molécule d’ADN

Molécule d’ADN :

double hélice

1 gène : fragment

d’ADN déterminant

un caractère

héréditaire

Bases azotées

Sucre + phosphate

1 gène

4

Figure 2 : Universalité et variabilité de la structure de l’ADN

Figure 19 : Structure d’un microsatellite

5

Figure 4 : Mécanisme de la réplication semi-conservatrice de l’ADN

6

Figure 3 : Structure schématique d’un gène eucaryote et d’un opéron procaryote

7

Figure 5 : Schéma représentant la transcription de l’ADN et la maturation du transcrit primaire

(addition de la coiffe, addition de la queue poly-A et épissage) jusqu’à l’obtention de l’ARNm mature

chez les eucaryotes.

Figure 6 : La traduction chez les procaryotes (a) et les eucaryotes (b).

8

Acide aminé Abréviation Nature chimique

Alanine : Ala A Aliphatique

Arginine : Arg R Basique

Asparagine : Asn N Amide

Acide aspartique : Asp D Acide

Cystéine : Cys C Soufré

Acide glutamique : Glu E Acide

Glutamine : Gln Q Amide

Glycine : Gly G Aliphatique

Histidine : His H Basique

Isoleucine : Ile I Aliphatique

Leucine : Leu L Aliphatique

Lysine : Lys K Basique

Méthionine : Met M Soufré

Phénylalanine : Phe F Aromatique

Proline : P P Imine

Sérine : Ser S Hydroxylé

Thréonine : Thr T Hydroxylé

Tryptophane : Trp W Aromatique

Tyrosine : Tyr Y Aromatique

Valine : V V Aromatique

Tableau I : Nomenclature et nature chimique des acides aminés

Tableau II : Code génétique

9

Figure 7 : Réparation de l’ADN par recombinaison

5 5

Figure 9 : Les possibilités d’appariement pour le 5-BU C’est un analogue de T et qui peut être incorporé par erreur dans l’ADN comme une base. Il possède un atome de Br en C5 à la place de CH3.

(a) Dans son état céto normal, le 5-BU imite le comportement d’appariement de la T qu’il remplace en s’appariant avec A

(b) La présence du Br provoque une redistribution relative des e- (c’est pourquoi le 5-BU peut passer une partie de son existence dans sa forme ionisée rare). Dans cet état, il s’apparie avec la G, imitant le comportement de la C et induisant donc des mutations lors de la réplication.

Figure 8 : Appariement normal Tymine -Adénine

(a) (b)

(céto)

10

Figure 10 : Les possibilités d’appariement pour le 2-AP C’est un analogue de A et qui peut être incorporé par erreur dans l’ADN comme une base.

(a) Normalement, il s’apparie avec T (b) Dans son état protoné, il peut s’apparier avec la C.

(a) (b)

Figure 11 : Désamination oxydative de C en U sous l’action de l’acide nitreux HNO2 responsable de la transition de GC en TA. En gris : les nucléotides de l’ADN initial, entre parenthèses une molécule d’ADN normale.

HNO2 HNO2

Figure 12 : Désamination oxydative de A en H (hypoxantine) sous l’action de l’acide nitreux HNO2 responsable de la transition de TA en GC. En gris : les nucléotides de l’ADN initial, entre parenthèses une molécule d’ADN normale.

Figure 13 : le mésappariement spécifique induit par l’alkylation. L’alkylation (dans ce cas, l’éthylation due à l’EMS) de la position O-6 de la G, ainsi que la position O-4 de la T, peut conduire à un mésappariement respectivement avec la T et la G. chez les bactéries où les mutations ont été analysées plus en détail, les principales mutations détectées sont des transitions GC AT, indiquant que l’alkylation en O-6 de la G est plus sensible à la mutagénèse.

Figure 14 : Alkylation du G par le NG (Nitrosoguanidine) générant le O6-méthylguanine qui s’apparie avec T provoquant la transition GC AT

NG

O6-méthylguanine

11

Figure 15 : Exemples d’agents intercalants. (a) la structure des agents usuels proflavine, acridine orange et ICR-191. (b) Un agent intercalant se glisse entre les bases azotées empilées dans la molécule d’ADN. Cet évènement peut conduire à des additions et soustraction d’une seule paire de nucléotides.

Figure 16 : Structure du BET Figure 17 : Structure d’un dimère de thymine. (Seules les bases sont représentées)

Figure 18 : Notion d’épigénétique EPIMUTATIONS (Pathologie de l’épigénétique)

- Anomalies de méthylation - Anomalies de remodelage chromatinien

Exemple : Syndrome ICF (immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies) : Régions d’hétérochromatine (chr.1/16) hypométhylées à cause d’une mutation d’une DNA méthylase

- Anomalies de l’empreinte génomique Exemple : Syndrome de Beckwith-Wiedemann PraderWilli Angelman

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Tableau III : Les principaux types de mutations ponctuelles dans l’ADN et leurs conséquences fonctionnelles au niveau protéique

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Réversions

- Réversion vraie AAA (Lys) [+] directe GAA (Glu) [m] réversion AAA (Lys) [+]

- Réversion équivalente UCC (Ser) [+] directe UGC (Cys) [m] réversion AGC (Ser) [+]

CGC (Arg, basique) [+] directe CCC (Pro, non basique) [m] réversion CAC (His, basique) [pseudo-

sauvage]

Mutations suppressives intragéniques

- Décalage du cadre de lecture en sens opposé en un second site

dans le même gène

CAT CAT CAT CAT CAT CAT

(+) (-)

CAT XCA TAT CAT CAT CAT

- Mutation faux-sens en un second site Une 2ème

déformation physique qui restaure une confrontation protéique de type plus ou moins sauvage après

une 1ère

déformation.

Mutations suppressives extragéniques

- Suppressives de non-sens Un gène (codant par exemple l’ARNt de la tyrosine) subit un événement mutationnel dans la région de son

anticodon qui lui permet de reconnaître un codon non-sens mutant (UAG par exemple) et de s’aligner face à

lui, pour insérer un AA (tyrosine), ce qui permet la poursuite de la traduction.

- Suppressives de faux-sens Généralement provoquées par un changement dans l’anticodon de l’ARNt. E. coli possède un suppresseur de

faux- sens qui est un ARNt anormal portant la Gly mais qui l’insère en réponse à des codons Arg. Bien que

tous les codons de type [+] correspondant à l’Arg soient mal traduits, les mutations observées ne sont pas

létales, sans doute à cause de la faible efficacité de la substitution anormale.

- Suppressives de décalage du cadre de lecture Les exemples sont très rares. Dans un cas, un anticodon de 4 nucléotides appartenant à un ARNt unique peut

lire un codon de 4 lettres créé par l’insertion d’une paire de nucléotide.

- Suppressives par changement des conditions physiologiques Un défaut dans une voie biochimique est compensé par une autre mutation (exemple : une mutation qui

permet le transport plus efficace d’un composé produit en quantités plus petites à cause de la 1ère

mutation).

L’addition de bases change

de cadre de lecture

la délétion de base restaure le

cadre de lecture correct

Tableau VII : Les mutations suppressives et leurs conséquences fonctionnelles au niveau protéique

37

Figure 20 : Empreinte génétique par analyse de polymorphisme microsatellite

Figure 21 : VNTR : régions hypervariable entre individus

Figure 22 : Mutation des génomes par les transposons Pour réaliser leur cycle de multiplication, les transposons sont bordés par deux séquences répétées et inversées ITR (Inverted Terminal repeat) et possèdent au moins un gène codant pour une intégrase (enzyme capable de reconnaître des séquences répétées et d’induire l’intégration de la séquence du transposon dans le génome). Les transposons sont transcrits en ARN, rétrotranscrits en ADN qui s’insère dans un nouveau site du génome grâce aux séquences d’intégration ITR et au gène de l’intégrase

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Tableau IV : Nomenclature pour la description des mutations et autres variations de séquence 1- Indication de la séquence référence:

2- Code:

substitution (pour les bases) >

étendue -

autres changements sur l’allèle ;

autres transcrits/mosaïque ,

incertain ()

allèle [ ]

délétion del

duplication dup

insertion ins

inversion inv

conversion con

extension ext

codon stop X

décalage du cadre de lecture fsX

brin opposé o

translocation t

3- Type de variation/mutation:

Substitution

c.123A>G sur le cDNA, A, en position 123, est remplacé par G

p.P252R sur la proteine, proline (P) remplacée par arginine (R)

Délétion

c.546delT délétion de T en 546

c.586_591del six bases délétées

p.F508del délétion de phenylalanine (F) en 508

Duplication

c.546dupT duplication de T en 546

c.586_591dup duplication du segment 586 -> 591

p.G4_Q6dup duplication du segment à partir de glycine (G) en 4 jusqu' à glutamine (Q) en 6

Insertion

c.546_547insT insertion de T entre 546 et 547

c.1086_1087insGCGTGA insertion de GCGTGA

p.K2_L3insQS insertion de glutamine sérine entre lysine (K) en 2 et leucine (L) en 3

ADN codant c.

ADN génomique g.

ADN mitochondrial m.

ARN r.

Protéine p.

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Tableau IV (suite) : Nomenclature pour la description des mutations et autres variations de séquence Inversion

c.546_2031inv segment 546 -> 2031 inversé

Décalage cadre de lecture

p.R83SfsX15 arginine (R) est le premier acide aminé changé, c' est en position 83, cela donne une sérine (S) à la place, la taille du segment en aval est de 15, codon stop (X) inclu

Bases de données

http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html.

http://ariel.ucs.unimelb.edu.au:80/~cotton/mdi.html

40

Résumé : Les mutations

I- Les différentes mutations possibles d’un gène et leurs conséquences fonctionnelles

1- Distinction mutations perte de fonction / mutations gain de fonction :

La modification de l’information génétique portée par un gène peut avoir des conséquences fonctionnelles : une

mutation peut avoir deux types d’effet, antagoniques, en étant :

- soit une mutation de perte de fonction , par effet quantitatif (sous-expression conduisant à moins ou pas

de produit du gène) ou par effet qualitatif (un produit moins actif, voire inactif),

- soit une mutation de gain de fonction, par effet quantitatif (sur-expression conduisant à plus de produit

du gène) ou par effet qualitatif (un produit plus actif), ou par formation d’un produit muté doué d’une nouvelle

propriété physico-chimique et biologique, qui remplace l’activité antérieure ou s’ajoute à elle.

2- Distinction mutations ponctuelles / mutations non ponctuelles :

a- La mutation ponctuelle d’un gène est une modification locale de sa séquence d’ADN; elle entraîne par

conséquent une modification éventuelle de l’information génétique portée par ce gène. Cette nouvelle version du

gène constitue un allèle différent de l’allèle d’origine.

Il existe deux types de mutations ponctuelles modifiant la séquence d’un gène:

- les mutations par substitution d’une paire de base par une autre, par exemple ... CCG... modifiée en ...

ACG... (on ne donne toujours qu’un brin, en général le brin sens, puisque l’autre est complémentaire),

- les mutations par délétion ou insertion d’une ou quelques paires de bases, par exemple ...CCG...

modifiée en ...CG... par délétion de la paire de base centrale, ou modifiée en ...CACG... par insertion

d’une paire de base entre les deux premières.

b- Les mutations non ponctuelles d’un gène correspondent soit à des déletions, notamment à l’issue de

mutations chromosomiques par CO (méiotique ou mitotique ou interphasique), soit à des insertions, notamment

de séquences rétrovirales ou de séquences de type transposon, soit à l’amplification d’une courte séquence

répétée, en général un triplet. Dans les deux premiers cas, elles conduisent principalement à des pertes de fonction

des gènes concernés, dans le troisième cas, il s’agit souvent de gain de fonction, notamment quand le triplet répété

est dans une séquence codante (maladie à triplet du type maladie de Huntington).

3- Les différents types de mutations ponctuelles du gène

a- Une mutation affectant le promoteur ne change nullement la séquence codante du gène et par conséquent la

chaîne polypeptidique spécifiée par ce gène. Mais une telle mutation peut modifier profondément le message

génétique du gène si le promoteur perd ou gagne en efficacité de transcription (zone d’initiation et

« promoteurs » cibles des protéines régulatrices). En effet le développement précis et harmonieux d’un

organisme dépend de dosages précis, dans l’espace et dans le temps, des produits des gènes et le fait qu’un

gène soit sous ou sur transcris peut avoir des conséquence extrêmes. Il suffit de rappeler que la plupart des

mutations responsables de la transformation cancéreuse des cellules sont des mutations de dérégulation d’un

ou plusieurs gènes, notamment des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire.

41

b- Mutation affectant le site de polyadénylation.

c- Mutations dans les séquences transcrites et non traduites : 5’UTR (X fragile) ou 3’UTR (dystrophie

mytonique)

d- Une mutation dans un intron peut, si c’est une mutation d’épissage, bloquer la maturation (pas d’excision

de l’intron muté) ou entraîner une excision anormale; on conçoit que l’absence de messager ou la présence

d’un messager anormal constitue une modification majeure de l’information génétique sous la forme

d’une perte de fonction du gène .

e- Les mutations de la séquence codante auront des effets très variés dépendant là encore de la nature de la

mutation et de son site dans la séquence codante:

* une mutation STOP (encore appelée non sens) résulte de l’apparition d’un triplet STOP, UAA ou UAG

ou UGA, à la place d’un codon spécifiant un acide aminé, par exemple suite à une substitution d’une paire de

base par une autre; de ce fait la synthèse peptidique (la traduction) s’arrête à ce codon STOP et le ribosome

libère une chaîne tronquée qui a peu de chance de prendre une conformation tri-dimensionnelle correcte et

active; les mutations STOP sont presque toujours des mutations de perte de fonction.

* une mutation de décalage du cadre de lecture résulte d’une délétion ou de l’insertion d’une ou deux paires

de bases. Comme la lecture par le ribosome se fait par triplets contigus, tous les triplets sont modifiés en aval

d’une telle mutation, ce qui conduit à une chaîne peptidique aberrante ; de plus le décalage du cadre de lecture

introduit généralement très vite un codon stop. Sauf cas exceptionnels, les mutation de décalage sont des

mutations de perte de fonction.

Mutation de la séquence du promoteur : effet quantitatif de sous-expression (perte de fonction) ou de surexpression (gain de fonction)

Mutation de la séquence de polyadénylation: effet quantitatif de sous expression (perte de fonction)

Mutation de la séquence 5’UTR : le plus souvent effet quantitatif de sous-expression (perte de fonction)

Mutation d’épissage : conduisant à l’absence d’excision ou une excision anormale : perte de fonction, sauf exceptions.

Mutations dans la séquence codante : - mutation STOP (non-sens) : perte de fonction, sauf exception, par arrêt prématuré de la traduction, - mutation Faux-sens : substitution d’un aa par un autre aa : selon les cas perte ou gain de fonction, - mutation de décalage du cadre de lecture par délétion ou insertion d’une ou deux paires de bases : perte de fonction sauf exception, - suppression ou addition d’un aa par déletion

ou insertion de trois paires de bases : selon les

cas perte ou gain de fonction.

Mutation de la séquence 3’UTR : perte ou gain de fonction, selon les cas.

promoteur terminateur 5’UTR 3’UTR

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* une mutation faux sens résulte de la substitution d’une paire de base par une autre de façon telle que le

nouveau codon spécifie un acide aminé différent de l’ancien; de ce fait il y a, sur la chaîne polypeptidique, une

substitution d’un acide aminé par un autre, dont l’effet va dépendre du rôle de cet acide aminé dans la

conformation de la protéine et dans son activité. Selon les cas, la substitution peut être sans effet (on parlera alors

de polymorphisme plutôt que de mutation faux sens), ou avoir un effet, en rendant la protéine plus active ou

moins active, voire inactive si l’acide aminé substitué jouait un rôle crucial dans la conformation et/ou l’activité,

rôle que ne peut plus jouer l’acide aminé substituant. Enfin, une mutation faux sens peut, parfois conférer à la

chaîne peptidique une propriété ou une activité nouvelle et constituer alors un véritable « gain de fonction ».

Remarque: ce type de gain de fonction est une des bases de l’évolution génétique sous jacente à l’évolution des espèces. Si

la fonction du gène muté est modifiée, la fonction antérieure peut être conservée si ce gène existait préalablement en deux

copies identiques, ce qui est possible car il existe un mécanisme, le crossing-over inégal, par lequel un gène peut se trouver

dupliqué en tandem sur un chromosome; c’est ainsi que se sont formées les familles des gènes et conduisant à la

synthèse des différents types d’hémoglobines. On peut alors envisager des mutations survenant sur l’une des copies du gène,

sans risque de faire perdre la fonction du gène qui reste assurée par la copie non mutée.

4- Les mutations non ponctuelles d’un gène et leurs conséquences:

a- Les triplets répétés:

Il s’agit d’une classe de mutations tout à fait particulière, dont l’existence et les effets pathologiques n’ont été

observés que chez l’homme (pour l’instant). Dans tous les cas il s’agit d’une séquence d’un triplet répété dont la

taille (le nombre de répétitions du triplet), bien que stable à la réplication, peut parfois subir des variations; au

delà d’un certain multiple, une instabilité réplicative importante est susceptible de faire apparaitre brutalement

une séquence répétée de grande taille (phénomène d’expansion) ayant un effet pathogène. Cet effet pathogène

est dominant dans toutes les maladies dites « à triplets » exceptée la maladie de Friedrich, le cas des maladies

liées à l’X étant plus complexe, du fait de l’intéraction entre l’effet pathogène et l’inactivation de l’X, dans le

sexe féminin.

Selon les cas la séquence répétée est située dans la séquence 5’UTR, entre le promoteur et la séquence codante

(syndrome de l’X-fragile: la mutation pathogène entraîne l’extinction du gène), dans la séquence codante

(maladie de Huntington, ataxies spino-cérebelleuses: l’expansion du CAG entraine l’expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine sur la protéine), dans la partie 3’ non codante du RNA-m (dystrophie myotonique: effet

pathologique en cours d’étude), dans un intron (maladie de Friedrich: l’expansion du GAA provoque l’extinction

du gène par blocage de la transcription, ce qui explique le caractère récessif de son effet). Les « maladies à

triplets » sont détaillées dans le tableau plus loin.

Ces mutations sont des mutations « dynamiques » à l’origine du phénomène d’«anticipation génique ».

b- Les insertions d’élements mobiles, comme les rétrovirus, peuvent inactiver un gène ou déréguler son

expression selon leur site d’insertion; c’est pourquoi certains virus comme le HBV peuvent induire des tumeurs

dans le tissu hépatique infecté.

c-Les macromutations résultent d’accidents majeurs de la réplication ou de la recombinaison par crossing-

over conduisant, selon les cas, à des déletions d’un ou plusieurs gènes, parfois à leur duplication (crossing-over

inégal), et aux diverses anomalies de structures des chromosomes (translocations, inversions, déletions,

duplication, fusions centriques).

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Les maladies à triplets

1- Localisation, taille normale, prémutée (intermédiaire) et pathologique des triplets répétés:

maladie localisation triplet taille

normale

taille

prémutée

taille

pathogène

effet

pathologique

X-fragile 5’UR CGG 6-52 59-230 230-2000 inactivation du gène par

hyperméthylation induite du

promoteur et

absence de transcription

Maladie de Huntington séquence

codante

CAG 10-34 36-39 40-121 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

Ataxie spinocérebelleuse

type 1: SCA1

séquence

codante

CAG 6-39 40-81 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

SCA2 séquence

codante

CAG 14-31 34-59 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

SCA3

(Machado-Joseph)

séquence

codante

CAG 13-44 60-84 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

SCA6 séquence

codante

CAG 4-18 21-28 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

SCA7 séquence

codante

CAG 7-17 38-130 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

DRPLA séquence

codante

CAG 7-25 49-75 expansion toxique d’un

domaine poly-glutamine

Dystrophie myotonique séquence 3’

non codante

3’UTR

CTG 5-37 50-80 80-1000 interaction toxique avec

protéines de liaison aux

messagers

Ataxie de Freidrich séquence

intronique

GAA 6-29 34-40 200-900 bloque la transcription

donc l’expression du gène

(effet récessif)

2- Anticipation génique dans l’atrophie dentato-rubro-pallido-luysienne (DRPLA) :

âge de début: 60

ans

âge de début: 60

ans

âge de début: 20

ans

âge de début: 7 ans

taille du CAG: 65

44

Figure 23 : Protocole suivi par Beadle & Tatum (1940) pour la création de simples mutants d’auxotrophie chez le champignon Neurospora L’addition d’arginine au milieu minimum restaure la croissance chez un mutant arg- Rappel du cycle de vie : C’est un champignon mycelien pluriarticulé, chaque article contient un noyau haploïde. Sur un même mycélium se différencient des organes mâles = conidies et des organes femelles = ascogone. Si le mycélium reste isolé, il n’y aura pas de fructification sous forme de périthèces car la fertilisation nécessite la rencontre de deux mycéliums de types sexuels différents. Par contre, si on confronte 2 mycéliums, il y aura dans certains cas fructification. Au fait, la fertilité de ce champignon dépend d’un facteur génétique dit signe sexuel symbolisé par A et a la confrontation de 2 mycéliums n’est fertile que si l’un est issu d’une spore A et l’autre d’une spore a : on parle de signes compatibles. il y aura production de sacs dits périthèces. Un périthèce contient des poches dits asques. Ces asques renferment chacun 8 spores haploïdes. En condition favorables, les périthèces éclatent et les asques libèrent les spores qui vont germer pour redonner le mycélium de départ dont les noyaux sont haploïdes.

45

Tableau V: La croissance des mutants arg en réponse à différents métabolites. Mm+Métabolites

Mutant Ornithine Citrulline Arginine

arg-1 + + +

arg-2 - + +

arg-3 - - +

+ = croissance, -= absence de croissance.

Croissance des mutants arg-1 sur Mm enrichi en ornithine, citruline et arginine Croissance des mutants arg-2 sur Mm enrichi en citruline et arginine mais pas d’ornithine Croissance des mutants arg-1 sur Mm enrichi en arginine seulement Les mutants auxotrophes pour l’arginine poussent sur des Mm additionnés d’un des intermédiaires ou précurseurs de la chaîne de biosynthèse de l’arginine. Tableau VI: La croissance des mutants en réponse à différents métabolites. Mm+Métabolites

Mutant Ornithine Citrulline Arginine

a + + + b - + +

c - - +

d - + +

e + + +

f - - +

+ = croissance, -= absence de croissance.

Figure 24 : La structure chimique de l’arginine et de composés apparentés : la citruline et l’ornithine. Beadle et Tatum (1940) ont montré que différents mutants de Neurospora auxotrophes pour l’Arg sont capables de croitre sur Mm + Citruline ou + ornithine au lieu d’arginine

46

Mutant A Mutant B Mutant C

Figure 25 : Origine moléculaire de la complémentation génétique chez les diploïdes. Trois mutants blancs phénotypiquement identiques (A, B et C) sont croisés 2 à 2 pour former des hétérozygotes dont les phénotypes révèlent ou non une complémentation (seuls 2 des 3 croisements sont représentés ici). Si les 2 mutations se trouvent dans des gènes différents (cas de B et C) alors la complémentation aboutit au bon déroulement de la voie biochimique (dont le produit final est un pigment bleu dans cet exemple). Si les mutations se trouvent dans le même gène (cas de A et B), il n’y a pas de complémentation car la voie biochimique est bloquée au niveau de l’étape contrôlée par ce gène et les intermédiaires de cette voie biochimique sont incolores (blancs).

A

A B

B

C

C

Gène W1

Gène W1

Gène W2

Gène W2

Gène W1

Gène W1

Gène W2

Gène W2

A

B B

C

F1

47

Figure 26 : Formation et culture d’ hétérocaryons (ou dicaryons) chez Neurospora Les cellules végétatives de ce champignon normalement haploïdes peuvent fusionner, permettant la mise en contact des noyaux haploïdes des 2 souches dans le même cytoplasme, d’où l’obtention des "dicaryons" fonctionnant comme des cellules diploïdes. Si chaque souche est bloquée en un endroit différent d’une même voie métabolique (cas des mutants arg-1 et arg-2), toutes les fonctions seront assurées dans l’hétérocaryon et le champignon poussera ; en d’autres termes, il y aura complémentation. La croissance est due à la présence d’un gène de type sauvage. Les gènes arg-1 et arg-2 sont donc récessifs.

Figure 27 : Terminaison de la traduction (a). Le ribosome ne peut pas passer outre à un codon non-sens (UAG dans ce cas), parce qu’aucun ARNt n’est capable de reconnaitre ce triplet. Ceci conduit à la terminaison de la synthèse de la protéine et sa libération. Conséquences moléculaires d’une mutation qui altère l’anticodon d’un ARNt de la Tyr (b). Cet ARNt est rendu ainsi capable de lire le codon stop UAG. Suppression du codon UAG par l’ARNt modifié permettant l’élongation de la chaine (c).

48

derivative

derivative

Figure 28 : Les mutations chromosomiques I

Délétion terminale 46,XY,del (4p)

L’isochromosome du bras long du chromosome X : 46,X,i(Xq) est une anomalie fréquente dans le syndrome de Turner

Figure 29 : Délétions par une seule cassure chromosomique

46,XY,4p- : délétion

intersticielle

chromosome 13 en anneau : 46,XY,4p-

Figure 30 : Délétions par deux cassures chromosomiques

49

Figure 31 : inversion

Figure 32 : Translocation robertsonienne non réciproque Figure 34 : Translocation réciproque

Figure 33 : Descendance d’un parent porteur de translocation robertsonienne

Phénotype

normal : (46, XY) Phénotype

45,XY,rob (14 ;21)

46, XY

50

Figure 35 : Formation de gamètes aneuploïdes à la suite d’une non-disjonction lors de la première ou de

la deuxième division méiotique

Lors d’une non-disjonction méiotique, les chromosomes peuvent ne pas se séparer lors de la 1ère ou la

2ème division. Des gamètes n+1 et n-1 sont produits dans les 2 cas. Si un gamète n-1 est fécondé par un

gamète n, il se forme un zygote monosomique 2n-1 ; par contre, la fusion d’un gamète n+1 et d’un gamète

n conduit à un trisomique 2n+1.

Production de fœtus trisomiques

Production de fœtus monosomiques

monosomiqiques

Production de fœtus trisomiques

et monosomiques

Production de fœtus disomiques

Mit

ose

ré

du

ctio

nn

elle

Mit

ose

éq

uat

ion

nel

le

Mit

ose

éq

uat

ion

nel

le

Mit

ose

ré

du

ctio

nn

elle

Figure 36 : Mécanismes de triploïdie

Dygénie I ou II Diandrie

Dispermie Diplospermie I ou II

2n 2n n

n n n

n

Figure 37 : Endoréduplication L’ADN est dupliqué en boucle d’où l’augmentation de la taille des noyaux et par conséquent le volume des cellules

51

Co-répresseur

Répresseur Combinaison

ACTIVATION

Activation de

l’inhibition de la

transcription

Inhibition de

l’expression des

gènes

Ce co-répresseur = molécule inhibitrice

Co-répresseur

Répresseur Combinaison

INACTIVATION

Inactivation de

l’inhibition de la

transcription

Induction de

l’expression des

gènes

Ce co-répresseur = molécule inductrice

Figure 38 : Co-Represseur/represseur dans la régulation de la transcription

Figure 40 : Croissance bactérienne en présence

simultanée de glucose + lactose Figure 39 : Le métabolisme du lactose.

L’enzyme -galactosidase catalyse une réaction au cours de laquelle une molécule d’eau est ajoutée à la

liaison -galactoside, ce qui scinde le lactose en 2 molécules distinctes de galactose et de glucose. Le transport du lactose à l’intérieur de la cellule est assuré par l’enzyme lactose perméase.

Glucose

Galactose

Lactose

52

-

Figure 41 : Structure de l’opéron lactose 3 gènes structure contigus (5’ 3’) transcrits en un seul ARNm polycistronique traduit en 3 enzymes à

fonctions apparentées. - Le gène « lac Z » -galactosidase hydrolyse la liaison β1-4 osidique des β-galactosides. Il

s’agit d’une enzyme inductible - Le gène « lac Y » : code pour la perméase, protéine membranaire qui permet l’entrée du lactose dans la

cellule

- Le gène « lac A » : code pour le thiogalactoside transacétylase impliquée dans l’hydrolyse du lactose mais dont le rôle exact dans la régulation de l’opéron lactose est encore inconnu. Elle acétyle les β-galactosides non métabolisables qui peuvent alors être éliminés hors de la cellule par diffusion à travers la membrane plasmique

Pour métaboliser le lactose, E. coli synthétise simultanément et de façon coordonnée ces 3 enzymes Des éléments régulateurs agissant en cis :

- Un gène promoteur « P » en amont des gènes de structure : le site de l’ADN sur lequel se fixe l’ARN pol pour amorcer la transcription des gènes lac de structure. il est situé en amont

- du gène opérateur « O » qui est le site de fixation du répresseur Lac.

1 gène régulateur « lac I » agissant en trans, possédant son propre promoteur et localisé en amont de l’opéron lac et code de manière constitutive (exprimé à un taux presque constant quelque soit les conditions de croissance de la bactérie) pour la synthèse d’une protéine « répresseur » qui possède un site de liaison à l’ADN au niveau de l’opérateur et un site allostérique qui fixe le lactose ou des analogues de celui-ci. Il a plus d’affinité vis-à-vis du lactose que vis-à-vis de l’opérateur.

Site de régulation

-galactosidase

Gènes de structure

Perméase

Transacétylase

Protéine répresseur

Opéron lactose

53

En absence du lactose : opéron lactose réprimé par régulation négative (OF)

En présence du lactose : opéron lactose induit par régulation négative (ON)

ARN pol bloquée car « O » occupé par le répresseur pas de transcription

X X X

Figure 42 : La régulation de l’opéron lactose en absence de lactose. En absence de lactose (ou un analogue), le répresseur est sous sa forme active. Il se fixe spécifiquement sur l’opérateur et bloque l’accès de l’ARNpol au site d’initiation de la transcription. Les gènes de structure de l’opéron lactose sont réprimés les enzymes nécessaires au métabolisme du lactose ne sont pas synthétisées car inutiles en absence de lactose. Ainsi, il y a régulation négative de la transcription des gènes de l’opéron lactose.

Ré

pre

sseu

r

fon

ctio

nn

el

Complexe

répresseur-lactose

incapable de se

fixer sur l’ « O »

Transcription

Figure 43 : La régulation de l’opéron lactose en présence de lactose. En présence de lactose (ou un analogue), le gène régulateur « lac I » continue à synthétiser le « répresseur » qui, dans ce cas au lieu de se fixer à l’ « O », va s’associer au lactose présent dans le milieu (car le « répresseur » a une plus grande affinité avec l’inducteur lactose qu’avec l’opérateur). La protéine répresseur va subir une transition allostérique (changement de forme) provoquant le changement du site de liaison à l’ADN, ce qui abaisse l’affinité du répresseur pour l’opérateur. De ce fait, l’ARN pol peut se fixer sur le promoteur libre et peut atteindre le site d’initiation de la transcription puisque le site opérateur est libéré. La production des enzymes nécessaires au métabolisme du lactose est donc dépendante de la présence du substrat. Ainsi, il y a induction de la transcription des gènes de l’opéron lactose par la présence du lactose ou analogues inducteurs.

Lac +

Lac +

54

Figure 44 : Le contrôle de l’opéron lac par les catabolites. L’opéron est inductible à son rendement maximum par le lactose lorsque l’AMPc et CAP forment un complexe.

(a) En présence d’une concentration élevée de glucose, un produit de dégradation du glucose inhibe l’enzyme adénylate cyclase empêchant la conversion de l’ATP en AMPc

(b) En présence d’une concentration faible en glucose, il n’y a pas de produit de dégradation, l’adénylate cyclase est alors active et de l’AMPc est formé.

(c) Lorsque le milieu contient de l’AMPc, celui-ci agit comme un effecteur allostérique et forme un complexe avec le CAP

(d) Le complexe AMPc-CAP agit comme un activateur de la transcription de l’opéron lac en se fixant à une région située à l’intérieur du promoteur de lac

(CAP = protéine activatrice des catabolites ; AMPc = adénosine monophosphate cyclique).

Figure 47: Diploïde partiel stable I- O+ Z+ // I+ O+ Z+ I+ produit un répresseur fonctionnel qui peut se fixer sur l’opérateur du plasmide et sur le chromosome bactérien. En

présence d’IPTG (inducteur), la -galactosidase est synthétisée donc l’allèle I+ est dominant sur l’allèle I- et [lac+] est inductible. La mutation lac Z- donne une protéine inactive. C’est un changement dans la séquence en acide aminé. Il n’y a qu’une copie de l’ADN de l’opéron lactose dans une bactérie. Si on introduit un plasmide avec un opéron lactose, l’inducteur IPTG pourra se lier au répresseur et l’inactiver mais il ne sera pas métabolisé par la galactosidase. C’est un inducteur gratuit.

55

En présence du mélange lactose + glucose : Répression catabolique : régulation

positive par le complexe CAP (ou CRP) – AMPc

Figure 45 : La répression catabolique de l’opéron lactose en présence simultanée de lactose + glucose. En présence simultanée du lactose + glucose, le répresseur est inactivé par le lactose, le site opérateur de l’opéron est donc libre et les gènes pourraient être transcrits. Or, tant que du glucose est présent, la bactérie va le métaboliser préférentiellement : elle n'a donc pas besoin des enzymes nécessaires au métabolisme du lactose. Ceci implique l'existence d'un autre mécanisme de régulation que l'on appelle la répression catabolique transcription lente. Ce n'est que lorsque la concentration en glucose diminue que le métabolisme du lactose devient nécessaire. Un signal de carence alimentaire est alors déclenché sous forme d’une augmentation du taux d’AMPc (Adénosine 5’monophosphate cyclique, c’est un second messager intracellulaire

qui est formé par l’adénylate cyclase). Cet AMPc forme un complexe avec la protéine CAP (Catabolite gene Activator Protein, ou CRP : AMPc Receptor Protein) qui contrôle l’initiation de la transcription des gènes du catabolisme permettant l’utilisation d’autres molécules nutritives quand le glucose est absent. Ce complexe se lie à l’ADN en amont du site de fixation de l’ARN polymérase. L’interaction du complexe CAP-AMPc va agir comme un inducteur ou activateur et augmenter l’affinité de l’ARN polymérase pour le promoteur de l’opéron. Cette régulation positive peut permettre d'augmenter d’un facteur 50 la transcription de l'opéron lactose. transcription rapide. On comprend alors qu'en présence de glucose, il n'y a pas de complexes CAP-AMPc disponibles : le niveau de transcription de l'opéron lactose est donc très faible. la protéine CAP est un activateur de l’opéron lactose.

56

Figure 46 : Le contrôle négatif et positif de l’opéron lac respectivement par le répresseur lac et la protéine activatrice des catabolites (CAP).

(a) En l’absence de lactose comme inducteur, le répresseur lac peut se fixer à l’opérateur, indépendamment de la concentration d’AMPc et de la présence de CAP, la production d’ARNm est réprimée.

(b) Lorsqu’il y a du lactose pour se fixer au répresseur, celui-ci est incapable de se lier à l’opérateur et seules de petites quantités d’ARNm sont produites, car la présence de glucose maintient une faible concentration d’AMPc. Le complexe AMPc-CAP ne se forme donc pas et de ce fait ne se fixe pas au promoteur.

(c) Lorsque le répresseur est inactivé par le lactose et que la concentration d’AMPc est élevée (à cause de l’absence de glucose), l’AMPc se fixe à CAP. Le complexe AMPc-CAP peut alors se fixer au promoteur. Ainsi, l’opéron lac est activé et de grandes quantités d’ARNm sont produites.

57

Génotype Phénotype

I+ O+ Z+ sauvage (inductible)

I+ O+ Z- non inductible

I+ Oc Z+ constitutif

I- O+ Z+ constitutif

Tableau IX : les principaux «croisements» réalisés par complémentation. Les génotypes et les phénotypes résultants sont ceux des diploïdes partiels génotype phénotype

Interprétation

I+ O+ Z- ----------- I+ O+ Z+

sauvage (inductible)

La présence de β-galactosidase chez un diploïde partiel Z-/Z+ indique qu’une complémentation est possible. L’allèle Z+ de la cellule donneuse est exprimé dans le cytoplasme de la cellule receveuse (l’allèle sauvage Z+ est dominant par rapport à l’allèle muté Z-).

I+ O+ Z- ----------- I- O+ Z+

sauvage (inductible)

La présence de l’allèle I+ (dans le contexte O+) rétablit le contrôle normal (inductible) de l’expression du gène lacZ. On peut en conclure que ce gène est exprimé en une protéine capable d’agir sur le fonctionnement de l’opéron : Cette protéine (produit du gène lacI) étant le répresseur de la transcription lorsque l’inducteur est absent (l’induction serait en fait une levée de la répression).

I+ O+ Z- ----------- I+ Oc Z+

constitutif Les résultats obtenus avec les diploïdes partiels O+/Oc sont très différents, il n’y a pas complémentation, donc la mutation Oc domine O+.

Tableau VIII : Les caractéristiques phénotypiques des mutants utilisés par rapport au phénotype sauvage.

58

Mutation de l’opérateur Oc

Tableau X: Synthèse de β-Galactosidase et de perméase chez des souches mutantes pour l’opérateur, haploïdes et diploïdes hétérozygotes. Ce tableau montre les conséquences des différentes combinaisons de mutations, dans les états induits

et non induits, sur la production de la -galactosidase et de la perméase.

β-Galactosidase (Z) Perméase (Y)

Souche Génotype Non induite

Induite Non induite

Induite Conclusion

1 O+Z+Y+ - + - + Le type sauvage est inductible 2 O+Z+Y+/F’O+Z-Y+ - + - + La mutation Z+ > Z- 3 OcZ+Y+ + + + + La mutation Oc est constitutive 4 O+Z-Y+/F’OcZ+Y- + + - + L’opérateur agit en cis et Oc > O+ Les bactéries ont été cultivées en présence de glycérol (en absence de glucose) avec ou sans IPTG (inducteur). La présence ou l’absence d’enzyme est indiquée par un signe + ou – respectivement. Toutes les souches sont I

+.

Figure 48 : Mutation Oc Le répresseur ne peut pas se fixer à l’opérateur déformé. La transcription a lieu librement même sans inducteur

5’ P

Répresseur correct

Figure 49 : Diploïde partiel I+ Oc Z+ … // I+ O+ Z+ • l'allèle Oc est dominant sur l'allèle O+ • ces bactéries sont de phénotype *lac+constitutif+.

59

Mutation du répresseur lac I-

Tableau XI : Synthèse de β-Galactosidase et de perméase chez des souches haploïdes et diploïdes hétérozygotes portant les allèles I+ et I-. Ce tableau montre les conséquences des différentes combinaisons de mutations, dans les états induits

et non induits, sur la production de la -galactosidase et de la perméase.

β-Galactosidase (Z) Perméase (Y)

Souche Génotype Non induite Induite Non induite Induite Conclusion 1 I+Z+Y+ - + - + I+ est inductible 2 I-Z+Y+ + + + + I- est constitutive 3 I+Z-Y+/F’I-Z+Y+ - + - + I+ est dominante sur I- 4 I-Z-Y+/F’I+Z+Y- - + - + I+ agit en trans Les bactéries ont été cultivées en présence de glycérol (en absence de glucose) et induites par l’IPTG (inducteur). La présence ou l’absence d’enzyme est indiquée par un signe + ou – respectivement. Toutes les souches sont O+

Les tests réalisés avec les allèles I+ et I- montrent que I+ est dominant en trans sur les allèles I-.

Facteur F'

Chromosome bactérien

Figure 50 : Mutation I- Le répresseur muté ne peut pas se fixer à l’opérateur. La transcription a lieu librement même sans inducteur

Répresseur muté

P 5’

Figure 51 : Diploïde partiel I- O +Z+ … // I+ O+ Z+ • l'allèle I+ est dominant sur l'allèle I- • ces bactéries sont de phénotype *lac+ inductible+.

60

Mutation du répresseur lac Is Tableau XII: Synthèse de β-Galactosidase et de perméase chez des souches de type sauvage et des souches portant différents allèles du gène I.

β-Galactosidase (Z) Perméase (Y)

Souche Génotype Non induite Induite Non induite Induite Conclusion 1 I+Z+Y+ - + - + I+ est inductible 2 IsZ+Y+ - - - - Is est toujours réprimée 3 IsZ+Y+/F’I+Z+Y+ - - - - Is est dominante sur I+ Les bactéries ont été cultivées en présence de glycérol (en absence de glucose) et induites par l’IPTG (inducteur). La présence de l’enzyme est indiquée par un signe + et son absence ou une concentration très faible d’enzyme par un signe -. Toutes les souches sont O+

Chromosome bactérien

Facteur F'

Figure 52 : Diploïde partiel Is O +Z+ … // I+ O+ Z+ • l'allèle Is est dominant sur l'allèle I+ • ces bactéries sont de phénotype *lac-non-inductible].

61

Figure 63 : Principe de l’amplification enzymatique de l’ADN par PCR - Dénaturation de l’ADN à 90-95°C pour séparer les 2 brins - Hybridation de chaque brin avec une amorce spécifique (50 à 60°C qui dépend du % en GC). La

température d’hybridation Ta doit être < de 5°C de la température de demi-dénaturation Tm pour un oligonucléotide < 30 nt. La Tm est estimée en utilisant la relation suivante : Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) Les 2 oligonucléotides font ~ 15-25nt et doivent avoir des Ta voisines.

- Extension ou élongation de ces amorces par l’ADN pol (70°C)

Figure 64 : Conception d’amorces pour ISSR polymorphisme

62

Figure 65 : Principe de la technique d’hybridation Southern blot Cette technique peut être réalisée sur des produits PCR amplifiés ou sur des produits d’ADN digérés par des enzymes de restriction.

PCR ou digestion par des

enzymes de restriction

63

Figure 66 : Analyse du polymorphisme par RFLP Se base sur l’utilisation du couple enzyme/sonde pour détecter une mutation qui supprime ou crée un site de restriction Les étapes de la technique RFLP Extraction de l’ADN des différents génotypes à analyser Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction à des sites de restriction (ou PCR dans le cas d’une PCR/RFLP) Séparation des fragments engendrés selon leur taille par électrophorèse sur gel d’agarose pour séparer les fragments de restriction. La révélation au BET ne permet pas de distinguer individuellement les fragments car ils sont trop nombreux (traînée de coloration le long de la piste de migration = smeer), en plus il est impossible de repérer les fragments homologues. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des sondes moléculaires. D’où le Transfert selon Southern Hybridation moléculaire par des sondes ADN marquées (radioactives ou fluorescentes) Révélation par Autoradiographie.

64

Figure 67 : Analyse du polymorphisme par RAPD Le principe de cette technique repose sur le calcul de la probabilité de répartition aléatoire de courtes séquences de taille et de composition déterminée dans un génome donné. Ce polymorphisme de séquence est révélé en utilisant des amorces aléatoires (arbitraires) de 9-10nt avec un % de GC entre 45 et 65% (car si les amorces sont très riches en GC, on risque d’amplifier des séquences répétées qui sont riches en GC) et qui vont se fixer au hasard à différents endroits du génome. Le fragment d’ADN est amplifié si les 2 sites d'hybridation sont suffisamment proches (distance < à 3Kb l’une de l’autre sur des brins opposés). Le résultat de ces amplifications est une série de bandes de tailles variables séparées et analysées par électrophorèse. Une variabilité dans la séquence des sites entre individus sera détectée par un polymorphisme du nombre et de longueur des fragments d'ADN amplifiés.

Figure 68 : Révélation du polymorphisme par le marqueur AFLP Le principe se base sur le couple enzyme/amorce : c’est une amplification PCR d’ADN digéré par des enzymes de restriction révélation d’un polymorphisme de longueur des fragments amplifiés, séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et colorés au nitrate d’argent.

65

(a)

(b) (c)

5’

3’

Sen

s d

e s

ynth

èse

= s

en

s d

e le

ctu

re d

u b

rin

né

osy

nth

éti

sé q

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st c

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Sen

s d

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u b

rin

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nth

éti

sé

Haut poids

moléculaire

faible poids

moléculaire

Amorce ADN simple brin

Longueur de l’ADN synthétisé

Figure 69 : Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP (suite page suivante)

66

(d)

(e)

Figure 69 (suite): Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP. (a) Structure d’un ddNTP.

Cette technique consiste à la synthèse in vitro du brin d’ADN complémentaire à l’un des 2 brins de l’ADN que l’on désire séquencer. Elle repose sur l’utilisation dans le milieu réactionnel (contenant les dNTPs, une amorce marquée et une ADN polymérase) de nucléotides de synthèse modifiés et analogues structuraux de nucléotides: les didésoxyribonucléosides triphosphates (ddNTPs) dépourvus du groupement OH (fonction alcool) en 3’ nécessaire pour former une liaison avec le nucléotide triphosphate suivant. Une fois incorporé dans la chaîne en cours d’élongation, le ddNTP provoque l’arrêt de la synthèse de l’ADN à partir de leur incorporation c’est un inhibiteur de la réplication.

(b) Etapes du séquençage selon Sanger Quatre réactions sont préparées à partir d’une matrice d’ADN simple brin (la séquence recherchée) et une fraction d’amorce marquée. Chaque tube reçoit une petite quantité d’un ddNTP différent (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), ainsi que les 4 dNTPs normaux. Un ddNTP sera incorporé au hasard à des sites distincts selon la synthèse ayant lieu dans le tube à essai. Donc tous les tubes contiendront un mélange d’ADN de tailles différentes (correspondant chacune au site d’incorporation du ddNTP spécifique du tube, et donc de l’arrêt de croissance de la chaîne d’ADN) en fonction du point d’arrêt de la polymérisation et qui seront terminés par l’une des 4 bases possibles de l’ADN.

(c) Autoradiogramme d’un gel de séquençage Les fragments tronqués sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (pouvant séparer 2 fragments d’ADN dont la longueur ne diffère que d’un nucléotide) et visualisés par autoradiographie (marquage radioactif de la sonde par fluorescence). L’autoradiogramme contient donc 4 colonnes pour les résultats obtenus dans les 4 tubes (les plus petits fragments migrent toujours le plus vite). La lecture de l’autoradiogramme se fait du bas vers le haut dans le sens 5’ 3’ pour le brin complémentaire (radioactif ou fluorescent). Il suffit d’en déduire la séquence du brin matriciel par complémentarité dans le sens 3’ 5’ puis de l’écrire dans le sens conventionnel 5’ 3’.

(d) Principe du Séquençage automatisé de l’ADN à l’aide des 4 ddNTPs marqués à des fluorochromes différents

Actuellement, le séquençage est devenu automatisé : « séquençage automatique » qui présente le même principe sauf qu’au lieu de marquer les fragments d’ADN par des amorces radioactives, les machines de séquençage les plus récentes marquent les 4 types de ddNTP par des fluorochromes de couleur différentes spécifiques pour chaque type de nucléotide (ddTTP-ROX (rouge), ddATP-JOE (vert), ddGTP-TAMRA (noir) et ddCTP-5-FAM (bleu)). Les produits de la réaction sont déposés sur un gel d’électrophorèse : gel de séquence et les données de séquence sont enregistrées au cours de l’électrophorèse grâce à un rayon laser qui capte la fluorescence émise par chacun des 4 fluorochromes au cours de la migration des fragments d’ADN. L’information est ainsi enregistrée et interprétée dans la banque de données de l’ordinateur. Les réactions peuvent ainsi se dérouler dans le même tube

(e) Enregistrement obtenu à partir d’un séquenceur automatique : Electrophérogramme de séquençage Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu'à 1000 pb pour les appareils les plus performants

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