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  • GENETIQUE MEDICALE- tude de sgrgation, ED gntique molculaire

    20/11/2013GUIMERA Jordan L2Gntique MdicaleC. BEROUD24 pagesRelecteur n3

    Etude de sgrgation, ED gntique molculaire (haplotype, interprtation des donnes mutationnelles, notion bio-informatique, mucoviscidose)

    A. Dmarche diagnostique dans les maladies gntiques

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    PlanA. Dmarche diagnostique dans les maladies gntiquesB. Diagnostic molculaire des maladies gntiques

    --- Diagnostic direct (non trait dans ce cours)--- Diagnostic indirect

    I. DfinitionsII. PrincipeIII. Marqueurs micro-satellitesIV. Exemple

    V. V. Notion d'informativitVI. Notion de recombinaisonVII. Haplotypes

    1. Principe2. Les diffrentes tapes3. Exercices

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    Dans la dmarche diagnostique, il y a deux volets : La consultation diagnostique : interrogatoire et examen clinique

    On tudie l'histoire de la maladie Comme on est dans un contexte diagnostic, on dresse un arbre gnalogique qui permet de

    dfinir ventuellement un mode de transmission. partir des connaissances de la pathologie, on va pouvoir entreprendre un examen clinique

    cibl. Ne pas oublier l'examen clinique gnral.

    Les examens complmentaires Les analyses biologiques qui dpendent du contexte. Imagerie (IRM, Scanner ) Des examens cibls selon l'orientation entraine par le diagnostic clinique.

    Tous ces lments permettent d'tablir un diagnostic clinique.

    la fin, on lance des analyses gntiques, qui permet de confirmer le diagnostic clinique par un diagnostic gntique, si tout va bien.

    Les analyses gntiques

    Quand on parle de gntique, on pense de suite aux mutations au niveau de l'ADN, mais la premire chose raliser quand on veut faire des analyses gntiques, c'est de la cytogntique :

    En premire intention, on va faire un caryotype constitutionnel standard. Puis des examens un peu plus complets, comme du FISH (Cf. Cours)

    Plus rarement, on va avoir besoin de la gntique molculaire, o l'on diffrencie deux grandes parties: Le diagnostic direct, c'est dire qu'on recherche l'anomalie primaire dans le gne, on recherche donc la

    mutation responsable de la maladie. Le diagnostic indirect, on ne recherche pas l'anomalie, car soit on ne connait pas le gne impliqu, soit

    parce qu'on a pas identifi la mutation, on va donc utiliser des haplotypes, et on va faire une analyse de sgrgation : on va suivre un chromosome dans une famille. On doit avoir accs diffrents membres de la famille (malades et sains) pour pouvoir identifier le chromosome qui sgrge avec la maladie et qui est donc porteur du gne mut.

    B. Diagnostic molculaire des maladies gntiques

    Objectif : tablir un diagnostic prcis par l'identification de l'anomalie gntique.

    Intrt : Permet d'avoir une certitude diagnostique qui permet une prise en charge adapte et un conseil gntique pour toute la famille.

    Deux approches: Diagnostic direct : recherche de l'anomalie gntique primaire, avec l'identification des mutations

    constitutionnelles dltres Diagnostic indirect : utilisation de marqueurs informatifs (haplotypes) avec la cosgrgation d'un

    phnotype avec un allle particulier dans une famille.

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    Le diagnostic indirect est actuellement utilis surtout dans certaines situations particulires : diagnostic prnatal de certaines maladies (permet de savoir qu'on a bien des cellules de l'embryon, et

    pas de la mre) et plutt en complment de l'tude directe diagnostic pr-implantatoire (pas la possibilit de squencer tout le gnome, car on a une trop petite

    quantit de cellule, et donc on identifie d'abord le chromosome qui sgrge avec la maladie)La technique est aussi utilise pour :

    la vrification de l'identit d'un chantillon les empreintes gntiques et d'autres applications

    Pour cela, on utilise donc des marqueurs pour analyser la cosgrgation marqueur/maladie.

    Il faut donc connatre la localisation du gne morbide ou au moins connatre le chromosome, les marqueurs polymorphes localiss proximit ou dans le gne (il faut bien les choisir car s'il est trop loin, on peut se tromper cause du crossing-over, en gnral, on en prend en amont et en aval du gne tudi afin d'encadrer celui-ci avec des marqueurs microsatellites pour diminuer les erreurs).On tudie la cosgrgation familiale phnotype/marqueur.

    C'est un suivi indirect de la transmission d'une mutation dans une famille. On suit le marqueur qui se transmet en bloc avec le gne responsable de la maladie.

    On commence par le mdecin, avec l'entretien, examen... qui fait penser une maladie gntique, ce qui implique la famille, qui subit un examen indirect, et on cre un arbre gnalogique avec chaque haplotype.

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    Principales contraintes : ncessite de connatre le gne impliqu (ou le locus) pour choisir les marqueurs utiliser (problme

    pos si il y a htrognit gntique, c'est--dire que plusieurs gnes sont responsables du mme phnotype)

    Ncessite une certitude du diagnostic clinique chez les sujets Ncessite une tude familiale Ncessite une famille informative : parfois non concluant. Mais aussi un marqueur informatif, qui

    permet par exemple de diffrencier un chromosome d'origine paternelle ou maternelle. Risque d'erreur ou d'impossibilit de conclure en cas de recombinaison, pour cela, on encadre le gne

    avec des marqueurs micro-satellites. Ce risque est d au caractre indirect. Et il faut un bon clinicien en amont !

    I. Dfinitions

    Locus : Emplacement sur un chromosome (d'un gne, d'une squence,...)

    Allle : Une ou plusieurs versions alternatives d'un mme gne, d'une mme squence d'ADN. S'applique aux mutations, aux polymorphismes, aux marqueurs gntiques, Exemples:

    Pour un gne : allle sauvage et allles muts Pour un marqueur : diffrentes tailles (allle de 8 rptitions, allle de 10 rptitions, )

    Htrozygote : Un individu est htrozygote pour un locus lorsqu'il possde deux allles diffrents ce locus.

    Homozygote : Un individu est homozygote pour un locus lorsqu'il possde deux allles identiques ce locus.

    Hmizygote : un individu est hmizygote pour un locus lorsqu'il possde un seul allle ce locus (cas du chromosome X chez l'homme).

    Gnotype : Ensemble des allles un ou plusieurs locus chez un individu.

    Haplotype : L'arrangement linaire ordonn des allles sur un chromosome.

    Les allles proches sont transmis ensemble ( en bloc ) sauf s'il y a une recombinaison miotique entre 2 locus.1Mb = 1% de recombinaison.

    II. Diagnostic molculaire indirect : principe

    Utilisation d'outils :

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    Les marqueurs gntiques anonymes (petit smiley), ils peuvent tre dans les introns, dans les exons, en aval ou en amont du gne, peu importe, l'important c'est que ce marqueur soit le plus polymorphe possible dans la population pour qu'il soit le plus informatif.

    Le marqueur idal serait trs polymorphe, distribu partout sur le gnome (quelque soit le gne que j'tudie, je le trouve), il ne doit avoir aucun impact sur le phnotype. Il faut connatre sa localisation. Il doit tre le plus proche possible du gne ou du locus morbide impliqu.Il y a la liste sur internet

    On peut avoir des marqueurs intragniques et extragniques.

    NB : Les marqueurs n'ont pas d'effet pathologique. Les marqueurs sont utiliss pour suivre indirectement la transmission d'une mutation (connue ou non) dans une famille.

    Diffrents types de marqueurs :

    Microsatellites (ou short tandem repeats/STR) Polymorphismes de rptitions (ex : CACACACACA) Rpartis uniformment dans le gnome, tous les 25 100kb Multi-allliques Les plus utiliss pour le diagnostic indirect La premire carte gntique est publi par des franais grce au gnthon !

    Single Nuclotide Polymorphism (SNP) Polymorphismes au niveau d'un nuclotide Trs abondants (1SNP/100pb) : plus de 1,5 millions de SNPs connus. Il y a donc une grande

    probabilit qu'on en trouve un proximit de la mutation. Rpartis uniformment dans le gnome Bi-allliques, il en faudra donc un grand nombre.

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    Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) Polymorphismes de restriction

    Autres : dltions, insertions ...

    III.Les marqueurs micro-satellites

    Le choix de la rgion d'intrt dpend du diagnostic clinique et des connaissances. On slectionne des marqueurs polymorphes de sorte ce qu'ils soient des marqueurs informatifs dans la famille.

    L'amplification des rgions par PCR permet d'obtenir des quantits suffisantes de squences d'intrt pour permettre leur dtection (l cellule contient environ 7 picogrammes d'ADN, 3 milliards de pb).

    L'analyse des produits amplifis permet ainsi:

    la dtection des allles (taille des produits amplifis)

    la dtermination du gnotype

    Ce sont des squences d'ADN rptes en tandem d'un motif de 2 10pb et dont la taille totale est infrieure 100 pb.

    Ils sont trs polymorphes et rpartis uniformment sur l'ensemble du gnome principalement dans les squences intergniques et intragniques (rarement dans les squences codantes) et constituent d'excellents marqueurs gntiques.

    On spare les allles en fonction de leur taille.

    On dtermine le statut de chaque individu pour le marqueur tudi :

    1 bande (ou 1 pic) si c'est un homozygote.

    2 bandes (ou 2 pics) si c'est un htrozygote (pour la plupart des individus).

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    Squenage :

    Pourquoi cette technique n'est-elle pas utilise ?

    Car o