genetique bacterienne

of 20/20
Génétique bactérienne I) Introduction à la Génétique bactérienne et cycles des phages Les premières expériences de génétique ont eu lieu sur des microorganismes, bactéries et phages (virus bactériens), mais ce qui a été découvert est aussi appliqué aux eucaryotes. Les bactéries sont haploïdes (ADN double brin), ce qui est très utile en génie génétique car il y a correspondance entre génotype et phénotype (pas de récessivité). Espèces haploïdes = pas de phénomène de dominance ou de recessivité. Pour savoir si une mutation est artificielle on va rendre pour un temps les haploides diploides et on saura si la mutation est recessive ou dominante. Phage = Virus bactérien (bactériophages). Ce sont des parasites obligatoires : ils ne peuvent se reproduire qu’à l’intérieur d’une bactérie hôte. La plupart du temps ils vont utiliser un certain nombre de protéines de la bactérie pour assurer leur multiplication. Les bactériophages vont avoir des specificités, ils ne vont pas pouvoir infecter toutes les bactéries. Pour un bactériophage donné existent des bactéries sensibles à l’infection et des bactéries résistantes à l’infection. Ce qui definit la sensibilité ou la resistance à l’infection c’est la capacité pour le phage à faire rentrer ou non son matériel génétique dans la bactérie, et la capacité à la bactérie de répliquer ou non le matériel génétique du phage selon les protéines qu’elle contient. On les dit permissives ou non permissives. Donc avant de travailler avec une souche de bactéries on vérifie qu’elles soient sensibles et permissives. La replication des phages est leur cycle de vie. Il est composé de 3 étapes : 1 ère étape d’ ENTREE dans la bactérie, qui dépend : - De l’ adsorption, la capacité du phage à entrer en interation physique avec la bactérie par reconaissance entre les protéines du phage et protéines de la membrane bactérienne ou recepteurs. - De l’injection du matériel génétique dans la bactérie.
  • date post

    25-Dec-2015
  • Category

    Documents

  • view

    18
  • download

    11

Embed Size (px)

description

genetique bacterienne

Transcript of genetique bacterienne

  • Gntique bactrienne

    I) Introduction la Gntique bactrienne et cycles des phages

    Les premires expriences de gntique ont eu lieu sur des microorganismes, bactries et

    phages (virus bactriens), mais ce qui a t dcouvert est aussi appliqu aux eucaryotes.

    Les bactries sont haplodes (ADN double brin), ce qui est trs utile en gnie gntique car il

    y a correspondance entre gnotype et phnotype (pas de rcessivit).

    Espces haplodes = pas de phnomne de dominance ou de recessivit.

    Pour savoir si une mutation est artificielle on va rendre pour un temps les haploides diploides

    et on saura si la mutation est recessive ou dominante.

    Phage = Virus bactrien (bactriophages). Ce sont des parasites obligatoires : ils ne peuvent

    se reproduire qu lintrieur dune bactrie hte. La plupart du temps ils vont utiliser un certain nombre de protines de la bactrie pour assurer leur multiplication. Les bactriophages

    vont avoir des specificits, ils ne vont pas pouvoir infecter toutes les bactries.

    Pour un bactriophage donn existent des bactries sensibles linfection et des bactries rsistantes linfection. Ce qui definit la sensibilit ou la resistance linfection cest la capacit pour le phage faire rentrer ou non son matriel gntique dans la bactrie, et la capacit la bactrie de rpliquer

    ou non le matriel gntique du phage selon les protines quelle contient. On les dit permissives ou non permissives.

    Donc avant de travailler avec une souche de bactries on vrifie quelles soient sensibles et permissives.

    La replication des phages est leur cycle de vie.

    Il est compos de 3 tapes :

    1re

    tape d ENTREE dans la bactrie, qui dpend :

    - De l adsorption, la capacit du phage entrer en interation physique avec la bactrie par reconaissance entre les protines du phage et protines de la membrane

    bactrienne ou recepteurs.

    - De linjection du matriel gntique dans la bactrie.

  • La trs grande majorit des phages ont la structure suivante :

    Il ny a que les acides nucliques qui rentrent lintrieur dune bactrie.

  • 2e tape de MULTIPLICATION : Rplication du matriel gntique (nombre variable de

    nouveaux gnomes, il peut tre repliqu de 10 100 fois). Cest la phase prcoce. Ensuite on a synthse des protines de la capside et leur assemblage. Cest la phase tardive.

    3e tape de PRODUCTION : Destruction des membranes bactriennes. Cest la lyse et sortie

    des phages. Le nombre de phages produits va l encore tre variable selon lespce : cest le burst size .

    Lensemble de ces 3 tapes est appel cycle de lyse. Lensemble des phages capables de faire ce cycle et uniquement ce cycle sont appels phages virulents ou lytiques. On les appelle

    aussi phages transmission horizontale.

    Phages temprs = aprs leur entre dans la bactrie ils font un choix :

    - Lyse. - Intgration du gnome du phage dans le gnome bactrien. Dans ce cas la bactrie est

    appele bactrie lysogne. Elle devient non-permissible. On dit quelle est immune, protge de la lyse. Cette immunit est due une protine code par le phage intgr,

    la protne C1 ou rpresseur. Une bactrie lysogne aprs sa replication donnera

    deux bactries lysognes.

    Le phage va donc protger les bactries infectes pendant une priode de disette, et lorsque

    les bactries seront en prolifrations il va lancer la lyse. Cet tat de lysognie nest donc pas un phnomne permanent. Il est possible de revenir un cycle de lyse partir dune bactrie lysogne.

    Soit cest un retour spontann, soit il y a induction volontaire grce une exposition aux UV.

    BILAN : - Les phages sont des parasites.

    - Il existe 2 grandes familles de phages :

    - Phages virulents ou lytiques.

    - Phages tmprs.

  • II) Etude quantitative

    Pour visualiser les phages on va utiliser la technique de la plage de lyse. Cela nous permettra

    de dnombrer des phages et de voir leur phnotype.

    Pour cela on va procder linfection. Ensuite on va raliser des dilutions et mlanger les bactries infectes avec des bactries en excs appelles bactries indicatrices. On mlange

    le tout avec de la glose et on ltale sur une bote de ptri.

    Entre ltalement et lobservation sest pass une nuit de culture. A la surface de la bote seront rparties alatoirement les bactries infectes et les bactries

    indicatrices. La gelose va se solidifier. Les bactres indicatrices vont recouvrir la totalit de la

    surface de la bote et former ainsi un tapis bactrien. A chaque endroit o la bactrie infecte

    est tombe sur la bote la lyse se produit.

    Le seul endroit o ce tapis bactrien sera interrompu sera lendroit o les bactries initialement infectes seront tombes et auront produit des phages et infect les bactries

    indicatrices. Ces trous sont appels plages de lyse.

    Chaque phage ayant infect une bactrie, le nombre de trous representera le nombre de phages

    prsents initialement.

    Une plage correspondra un phage si on est faible multiplicit dinfection (MOI).

    Un phage tempr faisant 10% de lysognie lysera 9 bactries sur 10. A chaque fois quil y aura des cycles dinfections sur les bactries indicatrices il y aura 10% de lysognie. Donc dans ce cas les trous ne seront pas pleins. On va avoir des lots de bactries lysognes

    entoures de phages = PLAGES TROUBLES.

    Un phage virulent ou lytique lysera 10 bactries sur 10. Les trous seront pleins = PLAGES

    CLAIRES.

  • Suivi dans le temps dun cycle dinfection

    On part dune portion de bactries en croissance o lon ajoute des phages et on se place une multiplicit dinfection de 1 (on aura autant de phages que de bactries). Selon la Loi de Poisson, quand MOI = 1 on a 66% de bactries infectes par au moins un

    phage. Si on considre que le cycle de rplication est de 20 minutes :

    Burst size (nombre de phages produits ar bactrie, invariable en fonction du nombre de phage

    qui se trouve dans une bactrie)= 100.

    Ce que lon dose dans cette exprience ce sont des centres infectieux (tout ce qui est capable de donner une plage de lyse, cest dire phages libres + bactries infectes). Si on dosait les phages on en aurait 1 million au dbut. A 1 minute on en aurait 0 car ils

    auraient intgr les bactries. On les verrait rapparatre aprs 20 minutes.

    III) Mutants de phages

    1) Obtention de mutants de phages

    Pour obtenir des mutants de phages on fait agir des agents mutagnes.

    Pour quils agissent et entranent des mutations, il faut que lADN soit entrain de se rpliquer, et donc, chez les phages, quils soient en cours dinfection.

    Aprs rcupration des phages il faudra distinguer les phages mutants des normaux.

    On fera cette distinction en observant leur phnotype.Aprs la lyse on analyse les phages issus

    de la mutagnse :

    - Certains seront non muts ou auront des mutations silencieuses : phnotype sauvage WT.

    - Dautres auront une mutation : phnotype mutant.

    Comment observer le phnotype des phages ? En observant la plage de lyse.

    Si on se place une MOI = 0,1 on aura au maximum un phage par bactrie. Aprs etalement

    sur bote de ptri on aura chaque plage de lyse qui sera le reflet du comportement dun seul phage initial.

  • - Si la plage de lyse est + grosse que la normale : ce mutant se rplique + vite que WT.

    - Si la plage de lyse est - grosse que la normale : ce mutant se rplique - vite que WT.

    - Pour un phage tempr, si on observe une des plage qui est claire, alors ce phage ne sera

    plus capable de faire de la lysognie.

    Si le mutant est totalement incapable de se rpliquer, on nobservera aucune plage de lyse. Donc on ne sera pas capable disoler ce mutant. Dans ce cas on mettra en place la recherche de mutants conditionnels (mutants molculaires qui dans certaines conditions se comportent

    en mutants et qui dans dautres feront comme sils ne ltaient pas).

    Cette anne on sintresse aux mutants conditionnels thermosensibles : dans des conditions A et B de temperatures diffrentes, ces mutants se comportent diffrement.

    - La temprature o le mutant adopte un phnotype WT est appele condition ou temprature

    permissive.

    - La temprature o le mutant adopte un phnotype de mutant est appele condition ou

    temprature restrictive.

    Pour dtecter les phages :

    - On fait ltalement en condition permissive (30C). On obtient certaines plages de lyse. - On fait une rplique de ces plages quon met en conditions restrictives (42C).

    Le mutant est dtect.

    2) Dominance / Rcessivit

    Maintenant il sagit de dterminer si ces mutants sont dominants ou recessifs. On va mettre en prsence des mutants et des WT haute MOI (= 10), de manire ce que les

    bactries contiennent les deux types de phages (tat semblable celui de la diplodie). La

    plage de lyse obtenue sur une bote avec glose molle et bactries indicatrices sera le reflet de

    la co-infection.

    Deux sortes de plages peuvent tre formes :

    - Petites plages, ou moins de plages produites ou cycle de reproduction plus long (mutant

    dominant).

    - Grandes plages (* mutant rcessif, le mutant a t aid par le WT se rpliquer aussi vite

    que lui. 50% WT 50% mutant. * mutant cis dominant, le mutant se comporte comme un mutant et nest pas aid par le sauvage, et ne lempche pas de se rpliquer. Beaucoup plus de WT que de mutant).

  • Pour faire la diffrence entre les mutants cis dominants ou rcessifs, on rcupre les phages

    prsents dans la plage de lyse, on fait une infection faible MOI, bactries indicatrices et

    glose molle, et on obtient :

    3) Test de complmentatiton

    Ce test se fait toujours entre mutants rcessifs. Avec ce test on arrive dterminer si deux

    mutants ont le mme phnotype ou pas.

    On met ensembles dans la mme bactrie deux mutants donnant a priori le mme phnotype.

    On observe ensuite si on arrive robtenir un phnotype sauvage.

    Exemple 1:

    Deux phages aux mutations rcessives donnant de petites plages :

    Phage m1 = polymrase mute (rplication entrave). Pol- et Cap+.

    Phage m2 = protines de capside mutes (difficults de survie). Pol+ et Cap-.

    On les introduit dans la mme bactrie. Si on obtient nouveau des phages WT, on dit que

    ces deux phages sont capables de complmenter.

    Donc pour avoir une plage de lyse de taille correcte, on a besoin de deux phages appartenant

    deux groupes diffrents.

    Concrtement, on ralise une co-infection entre m1 et m2 (entre mutants pris 2 2) haute

    MOI. On rajoute des bactries indicatrices et de la gelose quon tale : - Phnotype WT Les deux mutants complmentent et appartiennent des groupes

    diffrents.

    - Phnotype mutant Les deux mutants appartiennent au mme groupe et ne complmentent pas.

    Les conditions doivent obligatoirement tre restrictives.

    1 2 3 4 5

    1 mutant WT mutant WT ?

    2 WT mutant WT ? ?

    3 mutant WT mutant ? ?

    4 WT ? ? mutant ?

    5 ? ? ? ? mutant

    1 et 3 appartiennent au mme groupe. 1 et 2 appartienent des groupes diffrents, ainsi que 2 et 3, 1 et 4.

  • Exemple 2:

    Les phages mutants de la lysognie (transmission horizontale, voir dbut du cours).

    Les phages temprs muts sont incapables de sintgrer dans le gnome bactrien : plages claires alors que le WT fait des plages troubles.

    On effectue une co-infection haute MOI, et selon les rsultats on saura si le mutant est

    dominant (plages claires) ou pas.

    Si on obtient des plages troubles, on peut avoir des bactries ayant ingr le phage WT et le

    phage mutant sil sagit de mutants rcessifs, ou il y aura uniquement des bactries contenant le gne du phage WT si le mutant est cis dominant.

    On rcupre donc les bactries lysognes des plages de lyse, et par traitement aux UVs (qui

    inactive le rpresseur C1 et permet au phage de se multiplier nouveau), on induit un

    nouveau cycle de lyse. On dilue les phages ainsi obtenus, et on ralise une infection basse

    MOI (avec glose et bactries indicatrices).

    100% plages troubles = cis dominant. 50% claires et 50% troubles = rcessif.

    BILAN : - Mutants (conditionnels ou non).

    - Test de dominance/rcessivit par rapport au WT.

    - Mutants rcessifs capables ou non de complmenter.

    - Si capable de complmenter 2 groupes diffrents. - Si incapable de complmenter mme groupe de complmentation.

    Ces dcouvertes et analyses ont permis de dterminer toutes les voies de rgulation chez les

    Eucaryotes.

    4) Les mutations des voies de synthse et de dgradation

    Si des bactries de souches diffrentes sont incapables de synthtiser de larginine on ne peut en conclure quelles ont la mme mutation, car la mutation aurait pu intervenir diffrentes tapes de la synthse de larginine :

    Bact Eab- Ne fabrique pas Arg [Arg-].

    Bact Ebc- Ne fabrique pas Arg [Arg-].

    Bact Ecarg- Ne fabrique pas Arg [Arg-].

    On doit fournir de larginine ces bactries.

    En mlangeant les gnomes de deux de ces bactries (elles deviendraient diplodes), elles

    pourraient synthtiser de larginine. Elles sont capables de complmenter pour la synthse de larginine. Elles nappartiennent pas au mme groupe de mutants, elles ne sont pas mutes sur la mme gne.

    Donc si on peut dfinir deux groupes, il y a au moins deux gnes impliqus dans la synthse

    de larginine.

  • Le nombre de groupes de complmentation indique le nombre minimum de gnes impliqus

    dans la ralisation dune fonction.

    Ces tests de complmentation se font toujours entre mutants recessifs.

    Si on tudie une fonction de dgradation, la dgradation du lactose par exemple :

    Les mutants [lac-] peuvent tre ElacA

    -, Elacab

    - ou Elacbc

    -.

    On doit leur donner tout sauf du lactose.

    Mais sinon le mecanisme reste le mme.

    Sur un mode de synthse, la synthse se fait au non.

    Sur un mode de dgradation les choses sont diffrentes. On doit faire attention au milieu : si

    on a du glucose et du lactose, la bactries fait un choix : elles commence tout dabord dgrader le glucose (cot nergtique moindre). Du coup elle ne synthtise pas les enzymes

    ncessaires la dgradation du lactose.

    Dans un milieu uniquement compos de glucose la bactrie nexprime pas non plus les enzymes dgradant le lactose.

    Ce sont des phnomnes de rgulation transcriptionnelle des gnes codants pour les protines

    de dgradation du lactose. Ces gnes sont rprims en prsence de glucose. Donc ils sont

    gnralement sous forme rprime.

    Opron : Ensemble de gnes ncessaires la ralisation dune fonction.

    Ces gnes sont controls par un promoteur. Il ne fonctionne pas sil y a un rpresseur I fix dessus, cod par un gne I. Donc les polymrases ne peuvent venir transcrire cette rgion.

    Si on rajoute du lactose celui ci pige le rpresseur, et du coup on a transcription de lopron.

  • Les systmes doprons seront toujours des systmes de gnes dont lexpression est coordonnes sous le contrle dactivateurs et de rpresseurs.

    * Si une bactrie est [lac-] elle est mute sur un des gnes exprimant une enzyme ncessaire

    la dgradation du lactose.

    * Une mutation dans le gne du represseur qui va modifier ses AA qui normalement sont

    reconnus par le lactose empchera linhibition du rpresseur. Alors la bactrie sera phnotypiquement [lac

    -]. Cest la mutation IS.

    * Une mutation sur les AA du rpresseur lempchant de reconnatre lADN rendra impossible sa fixation. Il reste phnotypiquement [lac

    +] mais nest plus rgul. Cest un mutant I

    -.

    * Si la rgion dADN reconnue par le rpresseur (rgion oprateur) est mute, il ne sy fixera plus est sera phnotypiquement [lac

    +] non rgul. Cest un mutant Oc (oprateur constitutif).

    5) Cration de bactries diplodes

    On va crer des bactries partiellement diplodes car il ny a pas la place dans une bactrie pour 2 gnomes entiers. Il existe 3 techniques :

    - CONJUGUAISON : Certaines bactries ont un facteur F+ qui peut coder pour des protines

    qui peuvent former un poil et par cet intermdiaire crent un pont cytoplasmique qui permet le

    passage dune copie de la F+ la F-. On utilise cette capacit transmettre du matriel gntique pour fabriquer des

  • Les pisomes peuvent sintgrer dans le chromosome bactrien puis sexciser des chromosomes parfaitement ou imparfaitement :

    Animation sur http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_microbio-

    bacterialconjugation.htm

    - TRANSDUCTION RESTREINTE : Lorsquune bactrie fait de la lysognie elle est capable dintgrer le phage dans son chromosome bactrien. Par un phnomne dinduction on peut faire revenir le phage dans un cycle de lyse. Et dans ce cas l il y a excision du gnome du

    phage. Si elle est parfaite on recupre un cycle de lyse classique.

    Si elle est imparfaite, on se retrouve avec un gnome de phage qui aura emport un bout de

    gnome bactrien. Mais un phage ne peut emporter dans sa capside quune quantit de matriel gntique donn. Donc il laissera forcment une partie du gnome de la bactrie. Ce

    phage est apell phage dfectif. Il sera capable dinfecter une autre bactrie mais sera incapable de la lyser.

  • Lorsquun phage dfectif rinfecte une bactrie, ltat diplode partiel est maintenu aprs intgration. Cette intgration peut se faire par recombinaison entre les deux gnes X, ou par

    recombinaison entre gnome de phages (temprs).

    Le cas le plus frquent est la transduction lysogne parfaite. Il y a autant de transductions

    restreintes diffrentes quil y a de phages diffrents.

    - TRANSFORMATION : utilise un plasmide portant le gne X qui va rentrer dans la bactrie

    qui deviendra diplode pour ce gne X.

    Dans les deux premires techniques on na pas intervenir. Les bactries font le travail seules. La troisime technique implique un invertissement de la part du manipulateur.

    A laide de ces trois techniques et plus particulirement de la conjuguaison et de la transduction restreinte, on va pouvoir dterminer si les mutants sont recessifs, dominants, ou

    cis dominants. Et parmi les recessif on va pouvoir dterminer le nombre de groupes diffrents

    et ainsi savoir le nombre de gnes impliqus dans la fonction tudie.

    BILAN : - Isoler mutants.

    - Caractriser mutants rcessifs.

    - Tests de complmentation entre mutants recessifs.

    Nombre de groupes Nombre minimum de gnes impliqus dans une fonction.

    - Techniques : Chez le phage faire une coinfection haute MOI (mutants 2 2) : analyse phnotypique.

    Chez des bactries diplodes partielles stables : * Conjuguaison F. * Transduction restreinte (Phages temprs).

    * Transformation aprs clonage du gne dintrt.

  • IV) Cartographie gntique

    1) Principe

    Recombinaison par change de matriel gntique entre rgions homologues, par exemple

    entre 2 chromosomes identiques lors de la mose.

    On va tudier une relation entre la probabilit quun venement de recombinaison se produise, et la distance qui spare les deux points concerns.

    Crossing-over (c.o.) : croisement entre deux brins de chromosome et recombinaison.

    Plus A et B sont proches, plus la frquence de recombinaison est faible.

    Plus deux mutations sont proches, plus la frquence de recombinaison est faible.

    Donc on ne va tre capable de visualiser une recombinaison que sil y a une diffrence entre ce qui existe avant et aprs la recombinaison.

  • Un vnement de recombinaison peut produire 2 recombinants.

    Statistiquement, entre A et C, il va se produire autant de nombre de paire que de nombre

    impaire de crossing-over, car A et C sont si loin, que les formes recombines vont apparaitre

    autant de fois que les formes parentales.

    On obtient des mutants non-lis gntiquement : les formes recombines sont statistiquement

    autant prsentes que les formes parentales.

    Si deux mutations sont trs loignes, la frquence des recombinants obtenus est de 50 %. Il ny a pas de liaison gntique entre ces mutations.

    Si la frquence de recombinaison est infrieure 50%, on considre quil y a une liaison gntique.

    On a tablit une rgle entre le nombre de recombinants et la distance qui spare les deux

    sites : On dfinit un cMo (centiMorgan) = 1% de recombinant.

    Si A et B sont spars par 1 cMo, et si B et C sont spars par 2,5 cMo :

    On va faire un test 3 points :

  • Lorsque le simple mutant est localis au milieu dun double mutant, lobtention dun phnotype WT est difficile.

    Donc par exemple :

    AB + C = 100 [WT]

    AC + B = 1 [WT]

    B est au milieu.

    AB + C = 100 [WT]

    AC + B = 60 [WT]

    A est au milieu. Si ces rsultats sont obtenus sur 10 000 descendants, alors la distance gntique :

    2x100/10 000 = 2% = 2cMo.

    2) Technique de recombinaison chez le phage

    1re

    tape : Coinfection haute MOI. Elimination de lexcedant de phages. On attend que la lyse se produise.

    On va avoir des gnomes de phages ensembles dans certaines bactries. Dans un petit nombre

    de cas ces phages vont changer leur matriel gntique. Parmi les descendants on va pouvoir

    mettre en vidence des phages de type parentaux et de type recombins.

    2me

    tape : Dilution. Infection basse MOI. On veut voir le phenotype donc on va rajouter

    des bactries indicatrices et de la glose Analyse des plages.

    Exemple :

    Phage M1 petites plages

    Phage M2 petites plages

    Coinfection M1M2 lyse Phages M1 : petites plages. Phages M2 : petites plages. Phages WT : [WT]. Phages M1M2 : petites plages.

    Total des descendants = Total des plages.

  • Plages WT = [WT] = recombinants.

    2x(nombre de plages WT)/(nombre total de plage) = distance en cMo.

    Exemple :

    M1 petites plages

    M2 plages bleues

    Coinfection M1M2 lyse Phages M1 : petites plages. Phages M2 : plages bleues. Phages WT : [WT]. Phages M1M2 : petites bleues.

    X / nb total = distance gntique en cMo.

    BILAN : - Relation entre recombinaison et distance gntique.

    - % de recombinants = distance gntique en cMo.

    - nb recombinant/nb total de descendants = % de recombinants.

    - Test 3 points : croisement entre double mutants et simples mutants.

    - Technique recombinaison chez le phage : coinfection haute MOI lyse analyse individuelle du gnotype de chaque phage produit en oprant une infection basse MOI.

    3) Technique de recombinaison chez la bactrie

    Placer les bactries dans un tat diplode transitoire le temps que des venements de

    recombinaison se produisent.

    Il faut que de faon transitoire on ait deux copies du mme gne, de faon ce que se

    produisent des recombinaisons, et qu la gnration suivante on obtienne des recombinants.

    Premire faon : CONJUGUAISON Hfr :

    Les bactries Hfr codent pour des poils sexuels et sont capable de reproduire le chromosome

    bactrien complet partir du site dintgration de lpisome sexuel.

    Il peut se produire un transfert de chromosome bactrien dune bactrie Hfr vers une bactrie F

    - par le pont cytoplasmique.

  • Conjuguaison : 5 minutes : A est transfr. 10 minutes : A, Z et Y sont transfrs. 60 minutes : la totalit du chromosome est transfr.

    De cette faon on peut dterminer en minute la cartographie partir dune Hfr donne. En fonction de la souche, le premier gne va tre variable, par contre le temps de transfert

    dun gne est constant. En cas de cassure on repart de lorigine, soit ici A. On apelle cette souche Hfr (A).

    On a donc 100% de chances que A soit transfer.

    99% de chances que Z soit transfr.

    98% de chances que Y soit transfr.

    :

    :

    :

    0% de chances que B soit transfr.

    Un gne rentr seul sera perdu au bout dun moment. Mais dici l on a cr une bactrie diplode transitoire, cest dire quil peut se faire une recombinaison au sein du gne A.

  • Le gne A va tre trs frquement transmis F-. Une fois transmis il peut se produire de la

    recombinaison entre A et le gne endogne.

    Chez les phages il ne faut quun crossing-over (ADN linaire)

    Mais chez les bactries il faut 2 crossing-over (ADN circulaire).

    Hfr = Haute frquence de recombinaison.

    BILAN : - Utilisation de souche Hfr

    - Recombinaison avec les gnes les plus frquement transmis (en fonction de la Hfr).

    - Recombinason doit prendre en compte la probabilit que ke gne dintrt soit transmis, et le fait quil faudra 2 crossing-over au moins en fonction des positions des diffrents mutants que lon analyse.

    Exemple :

    On veut travailler sur 2 mutations portant sur larginine : arg1- et arg2

    -.

    On veut savoir comment ca marche.

    On va travailler avec :

    - Une souche Hfr (arg1-) portant un gne (pro

    +) proximit du site de transfert (de lorigine de rplication) permettant de vrifier si le transfert de la mutation a eu lieu.

    - Une souche F- (arg2

    -) portant un gne (pro

    -) permettant la contre-selection.

  • Renseignement sur la position arg1-/origine de transfert :

    Renseignement sur la position relative arg1/arg2 :

  • Deuxime faon : TRANSDUCTION GENERALISEE :

    Elle fait appel un phage lytique ou phage transducteur (tandis que la transduction

    restreinte faisait appel un phage capable de faire de la lysognie), capable de casser le

    gnome bactrien pendant son cycle de lyse. Donc au moment de lencapsidation, il y aura soit encapsidation du gnome du phage, soit encapsidation dun morceau du gnome bactrien.

    LADN bactrien contenu dans une capside va etre inject dans une nouvelle bactrie lors dun infection ultrieure par le phage.

    On va utiliser le produit de la lyse pour faire une infection basse MOI dans bactries

    receveuses.

    Soit cest un vrai phage qui infecte les bactries receveuses et elles sont lyses. Soit cest un phage contenant un morceau dADN bactrien qui les infecte, et certaines se retrouvent dans un tat diplode transitoire.

    Le facteur limitant sera la taille de la capside.

    Donc on va avoir des renseignements sur la idstance par rapport la taille de la capside.