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genetique bacterienne

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  • Gntique bactrienne

    I) Introduction la Gntique bactrienne et cycles des phages

    Les premires expriences de gntique ont eu lieu sur des microorganismes, bactries et

    phages (virus bactriens), mais ce qui a t dcouvert est aussi appliqu aux eucaryotes.

    Les bactries sont haplodes (ADN double brin), ce qui est trs utile en gnie gntique car il

    y a correspondance entre gnotype et phnotype (pas de rcessivit).

    Espces haplodes = pas de phnomne de dominance ou de recessivit.

    Pour savoir si une mutation est artificielle on va rendre pour un temps les haploides diploides

    et on saura si la mutation est recessive ou dominante.

    Phage = Virus bactrien (bactriophages). Ce sont des parasites obligatoires : ils ne peuvent

    se reproduire qu lintrieur dune bactrie hte. La plupart du temps ils vont utiliser un certain nombre de protines de la bactrie pour assurer leur multiplication. Les bactriophages

    vont avoir des specificits, ils ne vont pas pouvoir infecter toutes les bactries.

    Pour un bactriophage donn existent des bactries sensibles linfection et des bactries rsistantes linfection. Ce qui definit la sensibilit ou la resistance linfection cest la capacit pour le phage faire rentrer ou non son matriel gntique dans la bactrie, et la capacit la bactrie de rpliquer

    ou non le matriel gntique du phage selon les protines quelle contient. On les dit permissives ou non permissives.

    Donc avant de travailler avec une souche de bactries on vrifie quelles soient sensibles et permissives.

    La replication des phages est leur cycle de vie.

    Il est compos de 3 tapes :

    1re

    tape d ENTREE dans la bactrie, qui dpend :

    - De l adsorption, la capacit du phage entrer en interation physique avec la bactrie par reconaissance entre les protines du phage et protines de la membrane

    bactrienne ou recepteurs.

    - De linjection du matriel gntique dans la bactrie.

  • La trs grande majorit des phages ont la structure suivante :

    Il ny a que les acides nucliques qui rentrent lintrieur dune bactrie.

  • 2e tape de MULTIPLICATION : Rplication du matriel gntique (nombre variable de

    nouveaux gnomes, il peut tre repliqu de 10 100 fois). Cest la phase prcoce. Ensuite on a synthse des protines de la capside et leur assemblage. Cest la phase tardive.

    3e tape de PRODUCTION : Destruction des membranes bactriennes. Cest la lyse et sortie

    des phages. Le nombre de phages produits va l encore tre variable selon lespce : cest le burst size .

    Lensemble de ces 3 tapes est appel cycle de lyse. Lensemble des phages capables de faire ce cycle et uniquement ce cycle sont appels phages virulents ou lytiques. On les appelle

    aussi phages transmission horizontale.

    Phages temprs = aprs leur entre dans la bactrie ils font un choix :

    - Lyse. - Intgration du gnome du phage dans le gnome bactrien. Dans ce cas la bactrie est

    appele bactrie lysogne. Elle devient non-permissible. On dit quelle est immune, protge de la lyse. Cette immunit est due une protine code par le phage intgr,

    la protne C1 ou rpresseur. Une bactrie lysogne aprs sa replication donnera

    deux bactries lysognes.

    Le phage va donc protger les bactries infectes pendant une priode de disette, et lorsque

    les bactries seront en prolifrations il va lancer la lyse. Cet tat de lysognie nest donc pas un phnomne permanent. Il est possible de revenir un cycle de lyse partir dune bactrie lysogne.

    Soit cest un retour spontann, soit il y a induction volontaire grce une exposition aux UV.

    BILAN : - Les phages sont des parasites.

    - Il existe 2 grandes familles de phages :

    - Phages virulents ou lytiques.

    - Phages tmprs.

  • II) Etude quantitative

    Pour visualiser les phages on va utiliser la technique de la plage de lyse. Cela nous permettra

    de dnombrer des phages et de voir leur phnotype.

    Pour cela on va procder linfection. Ensuite on va raliser des dilutions et mlanger les bactries infectes avec des bactries en excs appelles bactries indicatrices. On mlange

    le tout avec de la glose et on ltale sur une bote de ptri.

    Entre ltalement et lobservation sest pass une nuit de culture. A la surface de la bote seront rparties alatoirement les bactries infectes et les bactries

    indicatrices. La gelose va se solidifier. Les bactres indicatrices vont recouvrir la totalit de la

    surface de la bote et former ainsi un tapis bactrien. A chaque endroit o la bactrie infecte

    est tombe sur la bote la lyse se produit.

    Le seul endroit o ce tapis bactrien sera interrompu sera lendroit o les bactries initialement infectes seront tombes et auront produit des phages et infect les bactries

    indicatrices. Ces trous sont appels plages de lyse.

    Chaque phage ayant infect une bactrie, le nombre de trous representera le nombre de phages

    prsents initialement.

    Une plage correspondra un phage si on est faible multiplicit dinfection (MOI).

    Un phage tempr faisant 10% de lysognie lysera 9 bactries sur 10. A chaque fois quil y aura des cycles dinfections sur les bactries indicatrices il y aura 10% de lysognie. Donc dans ce cas les trous ne seront pas pleins. On va avoir des lots de bactries lysognes

    entoures de phages = PLAGES TROUBLES.

    Un phage virulent ou lytique lysera 10 bactries sur 10. Les trous seront pleins = PLAGES

    CLAIRES.

  • Suivi dans le temps dun cycle dinfection

    On part dune portion de bactries en croissance o lon ajoute des phages et on se place une multiplicit dinfection de 1 (on aura autant de phages que de bactries). Selon la Loi de Poisson, quand MOI = 1 on a 66% de bactries infectes par au moins un

    phage. Si on considre que le cycle de rplication est de 20 minutes :

    Burst size (nombre de phages produits ar bactrie, invariable en fonction du nombre de phage

    qui se trouve dans une bactrie)= 100.

    Ce que lon dose dans cette exprience ce sont des centres infectieux (tout ce qui est capable de donner une plage de lyse, cest dire phages libres + bactries infectes). Si on dosait les phages on en aurait 1 million au dbut. A 1 minute on en aurait 0 car ils

    auraient intgr les bactries. On les verrait rapparatre aprs 20 minutes.

    III) Mutants de phages

    1) Obtention de mutants de phages

    Pour obtenir des mutants de phages on fait agir des agents mutagnes.

    Pour quils agissent et entranent des mutations, il faut que lADN soit entrain de se rpliquer, et donc, chez les phages, quils soient en cours dinfection.

    Aprs rcupration des phages il faudra distinguer les phages mutants des normaux.

    On fera cette distinction en observant leur phnotype.Aprs la lyse on analyse les phages issus

    de la mutagnse :

    - Certains seront non muts ou auront des mutations silencieuses : phnotype sauvage WT.

    - Dautres auront une mutation : phnotype mutant.

    Comment observer le phnotype des phages ? En observant la plage de lyse.

    Si on se place une MOI = 0,1 on aura au maximum un phage par bactrie. Aprs etalement

    sur bote de ptri on aura chaque plage de lyse qui sera le reflet du comportement dun seul phage initial.

  • - Si la plage de lyse est + grosse que la normale : ce mutant se rplique + vite que WT.

    - Si la plage de lyse est - grosse que la normale : ce mutant se rplique - vite que WT.

    - Pour un phage tempr, si on observe une des plage qui est claire, alors ce phage ne sera

    plus capable de faire de la lysognie.

    Si le mutant est totalement incapable de se rpliquer, on nobservera aucune plage de lyse. Donc on ne sera pas capable disoler ce mutant. Dans ce cas on mettra en place la recherche de mutants conditionnels (mutants molculaires qui dans certaines conditions se comportent

    en mutants et qui dans dautres feront comme sils ne ltaient pas).

    Cette anne on sintresse aux mutants conditionnels thermosensibles : dans des conditions A et B de temperatures diffrentes, ces mutants se comportent diffrement.

    - La temprature o le mutant adopte un phnotype WT est appele condition ou temprature

    permissive.

    - La temprature o le mutant adopte un phnotype de mutant est appele condition ou

    temprature restrictive.

    Pour dtecter les phages :

    - On fait ltalement en condition permissive (30C). On obtient certaines plages de lyse. - On fait une rplique de ces plages quon met en conditions restrictives (42C).

    Le mutant est dtect.

    2) Dominance / Rcessivit

    Maintenant il sagit de dterminer si ces mutants sont dominants ou recessifs. On va mettre en prsence des mutants et des WT haute MOI (= 10), de manire ce que les

    bactries contiennent les deux types de phages (tat semblable celui de la diplodie). La

    plage de lyse obtenue sur une bote avec glose molle et bactries indicatrices sera le reflet de

    la co-infection.

    Deux sortes de plages peuvent tre formes :

    - Petites plages, ou moins de plages produites ou cycle de reproduction plus long (mutant

    dominant).

    - Grandes plages (* mutant rcessif, le mutant a t aid par le WT se rpliquer aussi vite

    que lui. 50% WT 50% mutant. * mutant cis dominant, le mutant se comporte comme un mutant et nest pas aid par le sauvage, et ne lempche pas de se rpliquer. Beaucoup plus de WT que de mutant).

  • Pour faire la diffrence entre les mutants cis dominants ou rcessifs, on rcupre les phages

    prse