Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in

DrosophilaParsa Kasemi-Esfarjani, et al ;

Science 287, 1837 (2000)

Plan• Introduction : visée de l’article• Etablissement des lignées polyGln, modèles de

la maladie de Huntington– Description de la méthode– Résultats

• Suppression de la dégénérescence– Description de la méthode– Résultats

• Conclusion

INTRODUCTIONVisée de l’article

Introduction

• Chorée de Huntington : présente des agrégats de polyglutamine

• Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie

• Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype

• Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain

DESCRIPTION DE LA MÉTHODEDescription et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln

Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln

• Lignées comportant des polyCAG– 20 répétitions : lignée 20Q– 127 répétitions : lignée 127Q

• Après traduction des ARNm on aura des polyglutamines de ces 2 types

• Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux

Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques

Lignées UAS-polyCAG

5’ 3’

Poly CAG Promoteur UAS HA

Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

• Insertion d’un élément P contenant :– Promoteur UAS– Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions)– Séquence codant pour un épitope de

l’hémagglutinine (HA)

Lignée GMR-Gal4

• Insertion d’un élément P contenant : – Promoteur GMR– Séquence Gal4 codant pour la protéine GAL4

5’ 3’

GAL 4 Promoteur GMR

Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

Croisement des 2 lignées

• Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique)

• Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil.

• Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4

5’ 3’Poly CAGUAS HA

5’ 3’GAL 4GMR

Facteur de transcription spécifique de l’œil

Transcription de GAL4

Protéine Gal4

ARNm Gal4

Traduction de l’ARNm Gal4

Induction de la transcription

Induction de la transcription

Poly CAG HAARNm

Transcription

Traduction

Polyglutamine avec épitope HA

RÉSULTATSElaboration des lignées transgéniques poly-Gln

Phénotypes obtenus

• Lignées 20Q : [sauvage]• Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines]

Elaboration des lignées transgéniques : Conclusion

Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODECriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs

Création des lignées transgéniques à testée

• 7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes)

• Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes.

• Croisement avec les lignées 127 Q

RÉSULTATSCriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs

Lignées intéressantes

Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve :• 29 lignées « Enhancer »• 30 lignées « Suppresseur »

• On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220

Techniques utilisées pour mettre en évidence les phénotypes

• Microscopie photonique– Aspect extérieur– Immunohistologie

• Microscopie électronique à balayage

Immunofluorescence

• Anticorps secondaire flanqué de l’IPTC

• DAPI : marquage des noyaux

Résultats

LES LIGNÉES SUPPRESSEURS

EU 3500EU 3220

Lignée EU 3500

Lignée EU 3500

• Code pour HDJ1 : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain

• Domaine J en NH2 terminal (jonction)

Lignée EU 3220

EU 3220

• Code pour DTPR2 : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2)

• Domaine J en COOH terminal

Implication du Domaine J dans la suppression de la toxicité

Conclusion

• Ce type de criblage permet de trouver les gènes suppresseurs de la toxicité

• Agrégats empêchés mais le gène PolyCAG n’est pas réprimé

• Prochaine étape : empêcher ce phénotype plus en amont : répression directe des gènes responsables des agrégats