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Instruções Básicas para Aquisição de Dados Criação: 28/11/06 Revisão: 26/09/07 JC

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Atenção: Estas instruções são para uma análise básica. Maiores detalhes devem ser obtidos através dos manuais ou através da tecla F1 (Help) no programa GC-Solution. Como outros programas para Windows, o GC-Solution possui um sistema de ajuda associado ao ponteiro do mouse para botões do programa. Basta deixar o mouse parado sobre o botão que aparecerá o nome do mesmo. Além desse, na janela principal canto inferior lado esquerdo existe uma barra de ajuda. Esta funciona tanto para os botões quanto para os menus. Outra característica é que uma mesma função pode ser acessada através de vários menus e teclas de atalho. Escolha aquele que lhe for mais prático. Esta seqüência foi elaborada tendo como base a versão 2.3 do GC-Solution; podem surgir algumas discrepâncias com versões anteriores. O detector usado foi o FID. Para outros detectores, verifique o manual do software e do detector para ajustar seus parâmetros. Apenas a janela Instrument Parameters, no menu Method sofrerá alteração. O melhor aproveitamento dar-se-á se o usuário repetir os processos aqui descritos. Assim, quando houver necessidade de explanações sobre outras funções do software ele já estará a par dos procedimentos básicos.

Antes de iniciar os procedimentos para qualquer análise, alguns itens devem estar disponíveis: a)Gases: conectados e com a pressão ajustada. b)Coluna: instalada no sistema c)Padrões/Amostras: preparados estando disponíveis para injeção.

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Visão Geral do Software 1) Clique duas vezes (botão esquerdo do mouse) no ícone GC-Solution.

2) A opção “Administration” permite acessar as opções: - System Policy (gerenciamento do sistema) - User Administration (criar usuários e definir privilégios). - Log Browser (visualizar os Logs gerados pelo sistema). - Data Reg. Settings (somente ativado o Class-Agent estiver instalado, opcional).

2) A opção “Operation” permite acessar as opções: - Analysis (método de aquisição e aquisição de dados) - Offline Editor (permite editar e criar um método offline) - Postrun (visualizar e trabalhar com os dados obtidos)

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Procedimento para ligar o sistema 1) Abrir os gases 2) Ligar o GC (e o CBM se houver). 3) Ligar o computador e o monitor (se ainda não estiver ligado). 4) Entrar no programa GC-Solution. 5) Selecionar "Instrument 1". 6) Entrar com o usuário e a senha. Esperar o programa carregar e o GC

(CBM) apitar.

Procedimento para desligar o sistema 1) Esfriar a coluna e detectores. 2) Fechar a janela “Instrument 1” e esperar o GC apitar. 3) Desligar o GC. 4) Fechar o programa GC-Solution. 5) Fechar o Windows. 6) Desligar o computador e o monitor. 7) Fechar os gases

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PARA EFETUAR ANÁLISE (INSTRUMENT 1) CRIAÇÃO/ALTERAÇÃO DE UM MÉTODO Selecione inicialmente a pasta de trabalho (File > Select Project(Folder)) para evitar confusões futuras em relação onde os arquivos foram salvos. Salve os arquivos de método junto com os arquivos de cromatograma e batch.

Quando se entra no programa ele sempre carrega o último método usado. Entrar em File e escolher método ou criar um novo. Criando um novo método: File>New Method File Carregando um método já existente: File>Open Method File.

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Clique em Instrument Parameters. Em seguida clique em Advanced uma janela com as seguintes fichas abrirá: SPL Column FID General

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Column, programar os parâmetros: Temperature do forno (isotérmico ou a inicial de uma programação) Equilibration Time: tempo para homogeneizar a temperatura do forno depois de atingida a temperatura inicial. Column Information: indica a coluna selecionada, para alterar e/ou cadastrar nova coluna, clique em “Set...” Column Oven Temperature Program: programação de temperatura do forno (se houver). SPL, programar os parâmetros: Temperature do injetor Injection Mode: Split, Splitless ou Direct Flow Control Mode: Pressure ou Linear Velocity (só p/série 20) Pressure / Column Flow / Linear Velocity: entre com apenas um dos parâmetros, os outros são calculados automaticamente. OBS. As dimensões da coluna entram no calculo. Total Flow: para trabalhar com fluxo total programe o Split Ratio = -1, se for utilizar taxa de split o fluxo total é calculado automaticamente. Purge Flow: usualmente 3 ml/min Split Ratio: -1 se for trabalhar com fluxo total Nesta tela também é possível preparar uma programação de pressão e do fluxo da purga do septo.

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FID programar os parâmetros:. Temperature: do detector. Sampling Rate: Taxa de amostragem, ou seja, intervalo de tempo em que é feita uma aquisição de sinal, para precisão no cálculo de área é necessário pelo menos 20 pontos em um pico. Stop Time: tempo de aquisição de sinal, pode estar vinculado a programação do forno (Link Oven Program and Acquisition Time), função acessada pelo botão direito do mouse. Delay Time: atraso no início da aquisição de sinal, usado quando não se quer o inicio do cromatograma. Makeup / H2 / Air Flow: para instrumentos dotados de controle automático, o valor padrão é adequado para uso com coluna capilar. Flow Program: para instrumentos dotados de controle automático, pode-se alterar os fluxos durante a análise, só utilizado em casos especiais. General Ready Check: marque os parâmetros que devem ser verificados para o instrumento entrar no estado de “Ready”. Prerun Program: programa que será executado antes da corrida Time Program: programa de tempo onde se pode alterar parâmetros do GC durante a corrida, a principal aplicação é o acionamento de válvulas. Auto Flame On: acendimento automático da chama após o “Ready” Após ajustar os parâmetros nas fichas clicar File>Save Method File e salvar o método. Clique em para transferir as informações do método para o GC.

Clique em para ativar o instrumento, será iniciado o controle dos gases e o aquecimento. Importante: o gás de arraste já deverá estar passando pela coluna neste momento, pode ser ativado na janela “Instrument Monitor”. Para prolongar a vida útil da coluna, só inicie o aquecimento da mesma depois de 15 minutos passando gás. Este processo pode ser automatizado com o parâmetro “Start Time” que faz parte das propriedades da configuração do GC. Sugestão: deixar o gás de arraste sempre ligado.

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Para Verificar a Linha de Base Antes de iniciar-se uma análise é necessário ver se a linha de base está estável, a linha de base é mostrada continuamente. A estabilidade da linha de base depende de vários fatores: condicionamento da coluna, estabilidade de temperatura e fluxo, pureza do gás, tipo de detector, estado da coluna, rede elétrica, interferência eletromagnética etc.

Iniciando a Aquisição de uma Análise

Análise única (uma injeção) Com a amostra pronta para ser injetada e uma linha de base satisfatória, clique em Aquisition>Sample Login. Aparecerá a seguinte janela:

Os itens Sample Name e Sample ID são campos de texto. Coloque a identificação da amostra.

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Data File: escrever o nome do arquivo que será salvo a análise. Selecione Auto Increment se desejar que o software numere automaticamente o próximo Data File. Baseline Data: escolha um arquivo de cromatograma cujo perfil será descontado do cromatograma adquirido. Data Description: escreve-se algum comentário sobre a análise. Não é obrigatório. O campo Sampler só é utilizado se existir um auto-injetor no sistema. Report: é utilizada para habilitar e selecionar o modelo de relatório para impressão logo após a análise. Advanced: ao clicar em Advanced, aparece a seção Quantitation que é utilizada para gerar pontos para uma curva de calibração e valores para quantificação. Sugestão: realize quantificação posteriormente a análise em “Postrun”.

Type: escolha o tipo de amostra que esta injetando (padrão ou amostra desconhecida). Calibration Level: só estará habilitado quando Type for Standard. Coloque o número correspondente ao ponto da curva de calibração. ISTD Amount#1: Coloque a concentração do padrão interno, caso esteja utilizando o método de quantificação com padrão interno. Dilution Factor: coloque o valor que será multiplicado na concentração obtida na quantificação. Sample Amount: quantidade de amostra, a concentração será dividida por este valor. OBS. Para deixar desabilitado, Dilution Factor e Sample Amount use o valor 1 (padrão) pois não há como desabilitar estas operações. Clicar em Aquisition>Start Single Run e aguarde o monitor de estado estar Ready (Stand By). Injetar a amostra e teclar o Start do GC para início da análise (desnecessário se tiver auto-injetor). Para parar a análise basta clicar em Aquisition>Stop. Para estender o tempo de análise clique em Aquisition >Change Stop Time.

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Após o término da análise o arquivo da análise (arquivo de dados ou arquivo do cromatograma) estará salvo e processado de acordo com os parâmetros do método utilizado. Seqüência de análises (Batch) Executar uma seqüência de análises é executar várias análises simples, uma após a outra. Para isso deve-se preparar uma tabela que representa várias janelas de Single Run colocadas linha a linha.

Na barra de tarefas Assistant Bar clique em Aparecerá a tabela de injeções que foi utilizada anteriormente. Clique em File>New Batch File para gerar uma tabela nova.

Os campos da tabela nova podem ser preenchidos manualmente ou utilizando Wizard.

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Configuração Manual Quando a tabela de injeções for preenchida manualmente os itens abaixo devem ser preenchidos linha por linha. Vial#: Digite a posição do vial da amostra que será analisada. Sample Name e Sample ID: são campos de texto. Coloque a identificação da amostra. Sample type: Selecione um tipo de amostra. “Standard” para uma amostra utilizada para criar uma curva de calibração. Na primeira amostra padrão utilizada para criar uma curva de calibração, habilite a opção “Initialize Calibration Curve”. Sugestão: realize quantificação posteriormente a análise em “Postrun”. “Unknown” para uma amostra utilizada para análise quantitativa. Method file: Selecione o arquivo de método utilizado para análise. Data File: Digite o nome para os dados que serão adquiridos. Se não for especificada a pasta do arquivo, os dados serão criados em uma pasta de projeto de referência. Level#: Selecione o nível de concentração do padrão (como no Sample Login) e das amostras QA/QC. Report output: Selecione para que o relatório de resultado de análise seja impresso automaticamente. Report Format File: Selecione o arquivo do modelo de relatório. Utilizando o “Wizard”

Clique em na barra de tarefas Assistant bar.

Aparecerá uma janela (figura a seguir) que pedirá os dados inicias para preenchimento da tabela.

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Na primeira janela preencha os seguintes campos: Batch table: selecione New (o opção Append é usada quando se quer adicionar linhas a um Batch já existente). Method File: especifique qual será o arquivo de método que será utilizado para a aquisição e processamento (ou reprocessamento) das análises. Este campo vem preenchido com o nome do método que já está aberto. Caso queira trocá-lo clicar no botão “abrindo pasta” que está ao lado. Neste caso manter o nome que está. Clique em Avançar.

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Na segunda janela preencha o campo Number of Sample Groups (numero de grupos de amostras) com o valor 1, pois, na maioria das vezes, usa-se um só grupo. Selecione Unknown se vai realizar a construção da curva de calibração posteriormente. Clique em Avançar.

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Sample Count: entre com o numero de amostras Repetition: numero de replicatas por “vial” Vial #: numero do primeiro vial ser injetado Preencha os campos Sample Name,, Sample ID e ISTD Amount se a metodologia for padrão interno Clique em Avançar.

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Data File: nome do arquivo da análise, habilite o auto-incremento.

Na quarta e ultima janela clique em Concluir. Edite se for necessário o campo Data File na tabela de injeções e salve o batch em File>Salve Batch File.

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Clique em Batch>Start e em Batch>Pause para editar a tabela, clique novamente em Pause para dar seqüência na fila. Para ajustar a altura do cromatograma para o maior pico clique com o botão direito do mouse em cima da tela do cromatograma e selecione Chromatogram Display Settings>Normalize.

Para visualizar no Post Run os valores do cromatograma que esta sendo adquirido, clique no botão SnapShot. Durante a aquisição é possível sobrepor um cromatograma já adquirido clicando em File>Open Reference Data File. Selecione o arquivo do cromatograma e o canal. Para finalizar a sobreposição clique em File>Close Reference Data File.

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ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA INTEGRAÇÃO E CURVA DE CALIBRAÇÃO Para acertar os parâmetros de integração e construir curva de calibração dos dados já obtidos entre em Postrun clicando no ícone na janela principal do programa GC-Solution. Em seguida clique no ícone Data Analysis (Assistant Bar).

Habilite a janela do Data Explorer clicando em View>Data Explorer Selecione em Project in: a pasta onde foram armazenados os dados de interesse. Clique na ficha referente aos dados (cromatogramas) e depois clique duas vezes no arquivo referente a um dos pontos da curva de calibração.

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Caso a integração não esteja conveniente, modifique os valores de Width e Slope (ficha Method - Peak Integration Parameters) até que a integração dos picos de interesse fique adequado. Clicando no ícone pode-se visualizar se a integração e utilizar outros parâmetros de integração. Ex: Integration On e OFF este parâmetros oculta a integração em determinado intervalo de tempo.

Na barra de tarefas (Assistant Bar) clique no para começar a definir os parâmetros de integração e curva de calibração. Aparecerá a seguinte janela, clique em Avançar.

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Na janela Compound Table Wizard (2) ajuste os seguintes parâmetros da curva de calibração: Quantitative Method: escolha o método Quantitativo Ex: Padrão Externo ou Interno. Calculated by: selecione se as áreas ou as alturas serão utilizadas nos cálculos quantitativos. . # of Calib. Levels: digite o número de níveis de calibração da curva. Curve Fit Type: selecione qual o tipo de equação para ajustar a curva. Zero: selecione forçar ou não a curva de calibração passar pelo zero. Weighting Method: artifícios matemáticos para melhorar a curva de calibração. Unit: digite a unidade das concentrações (campo de texto, meramente informativo). X Axis of Calib. Curve: selecione qual parâmetro estará no eixo X (Concentração ou Área/Altura). Window: os picos serão identificados no intervalo estipulado em porcentagem. Band: os picos serão identificados no intervalo estipulado em minutos. Peak Select: selecione a maneira de identificação dos picos caso dois picos estiverem no mesmo intervalo de tempo. Ex: All Peaks os picos serão identificados como um pico único, somando-se as áreas ou altura. Grouping: somente selecione se os picos vão ser quantificados em grupos.

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Correction of RT: selecione o que fazer com a variação do tempo de retenção dos picos. No Change (nada a fazer), Replace (substitui pelo novo tempo de retenção) e Average (faz a média entre o tempo de retenção novo e o velho). Após ajustar os parâmetros para o método de identificação, clique Avançar. Na janela Compound Table Wizard (3) selecione os picos de interesse, marcando na coluna Process

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Na janela Compound Table Wizard (4) digite os nomes dos picos. Selecione em Type o padrão interno (ISTD), caso esteja realizando uma análise com padrão interno. Coloque os valores das concentrações de cada nível (Conc.1, Conc.2). Em seguida clique em Concluir.

A última tela apenas confirma se devem ser salvas as modificações, no método anexo à análise.

Para salvar os parâmetros no método original, clique em e depois em

(Assistant Bar) Feche a tela, pois o arquivo da análise será utilizado na curva.

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Selecione em Project in: a pasta onde foi armazenado arquivo do batch. Clique na ficha referente ao Batch e depois clique duas vezes no arquivo referente ao Batch que possui os arquivos da curva de calibração.

Modifique as seguintes colunas no Batch: Sample Type: Selecione Standard>Initialized calibration Curve para o primeiro padrão da curva e Standard>Add calibration Level para os padrões restantes.

Level#: selecione cada corrida com o respectivo nível (concentração). Ex:

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o primeiro ponto da curva está relacionado ao Level 1.

Clique em Batch>Start para reprocessar o Batch aplicando as novas informações e construir a curva de calibração. Para visualizar a curva de calibração e os parâmetros gerados selecione em Project in: a pasta onde foi armazenado arquivo do método. Clique na ficha referente ao Método e depois clique duas vezes no arquivo referente ao método utilizado no Batch. Abrirá uma nova janela referente à curva de calibração. Nesta tela há informações sobre a curva de calibração de cada composto.

Se necessitar fazer alguma alteração nos parâmetros de integração e da curva de calibração abra um arquivo de um cromatograma da curva de calibração. Faça as alterações e clique em Save Method (Assistant

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Bar). Abra o Batch e reprocesse novamente. Abra o método e verifique se a curva está OK. É possível editar os parâmetros de identificação e concentração selecionando um arquivo de um cromatograma da curva de calibração. Clique no botão Edit e na ficha Compound Table. Modifique os parâmetros e clique View e em Save Method (Assistant Bar). Abra o Batch e o reprocesse novamente. Abra o método e verifique se a curva está OK. Em todas as análises de amostra desconhecida que forem realizados utilizando-se deste método, os picos serão identificados e automaticamente quantificados, basta reprocessar o Batch para as amostras obtidas antes da construção da curva de calibração. Para visualizar o resultado selecione em Project in: a pasta onde foram armazenados os dados de interesse. Clique na ficha referente aos dados (cromatogramas) e depois clique duas vezes no arquivo referente a um dos pontos da curva de calibração. Os resultados estarão disponíveis no campo Results.

Existem 2 maneiras para imprimir o relatório do cromatograma. 1- Impressão utilizando o Batch. Abra o Batch contendo o arquivo do cromatograma. Na coluna Report Output, selecione Print, e, em Report Format File escolha o formato de relatório que deseja aplicar. Processe o Batch, o relatório será impresso para o cromatograma selecionado.

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2- Impressão Manual. Selecione em Project in: a pasta onde estão armazenados os modelos de relatórios. Clique na ficha referente aos relatórios e depois clique duas vezes no arquivo referente ao modelo de relatório desejado. Em seguida selecione em Project in: a pasta onde foram armazenados os dados de interesse. Clique na ficha referente aos dados (cromatogramas) e depois clique e segure com o botão da esquerda do mouse no arquivo do cromatograma de interesse e arraste para cima do relatório.

Verifique se o relatório está adequado e se estiver clique em Print para imprimir.

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Reset dos Consumíveis_ Observações:

1) A opção de Reset só estará disponível para administradores. 2) Se conveniente, pode ser alterado os direitos de operadores e

desenvolvedores de método para ter acesso a esta função. Clique em Instrument / System Check . . . Na tela do System Check clique nos botões Advanced>> e Reset Aparecerá a seguinte janela: