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Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules générées en condition d’hypoxie Mémoire Christine Jobin Maîtrise en microbiologie Maître ès sciences (M.Sc.) Québec, Canada © Christine Jobin, 2016

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Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

générées en condition d’hypoxie

Mémoire

Christine Jobin

Maîtrise en microbiologie Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Christine Jobin, 2016

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Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des

cellules générées en condition d’hypoxie

Mémoire

Christine Jobin

Sous la direction de :

André Darveau, directeur de recherche Sonia Néron, co-directrice de recherche

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III

Résumé

Les transplanteurs ont actuellement trois options lorsqu’ils doivent choisir une source de

cellules pour la greffe de cellules souches hématopoïétiques soit le sang de cordon, la

moelle osseuse ou le sang périphérique mobilisé. Les cellules souches hématopoïétiques

retrouvées dans le sang des adultes sains pourraient toutefois être une autre option

intéressante pour la transplantation. Les résultats de cette présente étude, récemment

publié dans la revue Cytotherapy, montrent le potentiel des cellules CD34+ trappées dans

les chambres de leucoréduction à générer les différentes lignées cellulaires retrouvées

dans le sang. Un système de culture in vitro en milieu sans sérum et en condition

hypoxique a été mis a point. La différenciation des cellules dans l’hématopoïèse durant la

culture a été caractérisée par analyse multiparamétrique du phénotype avec SPADE.

L’expansion a généré une grande hétérogénéité populationnelle mais principalement des

progéniteurs engagés vers l’érythropoïèse et la mégacaryopoïèse.

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IV

Table des matières

RÉSUMÉ III 

TABLE DES MATIÈRES IV 

LISTE DES TABLEAUX VII 

LISTEDESFIGURES VIII 

LISTE DES ABRÉVIATIONS IX 

REMERCIEMENTS XII 

INTRODUCTION 1 

1.1.  Les cellules souches hématopoïétiques  1 

1.1.1.  Définition  1 

1.1.2.  Aperçu historique  2 

1.1.3.  Caractérisation et régulation de l'hématopoïèse  3 

1.1.3.1  Erythropoïèse  4 

1.1.3.2  Mégacaryopoïèse  5 

1.1.3.3  Myélopoïèse  6 

1.1.3.4  Lymphopoïèse  6 

1.1.4.  Transplantation  7 

1.1.4.1  Histocompatibilité  9 

1.1.5.  Sources de HSC  10 

1.1.5.1  Moelle osseuse  10 

1.1.5.2  Sang adulte périphérique mobilisé  11 

1.1.5.3  Sang de cordon ombilical  12 

1.1.5.4  Sang adulte  13 

1.1.6.  Banque de HSC et registre de donneurs  15 

1.2  Hypoxie et moelle osseuse  16 

1.2.5  Niches hématopoïétiques  18 

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V

1.2.6  HIF‐1α  21 

1.3  Thérapie cellulaire et bonnes pratiques de fabrication  22 

1.3.1  Expansion in vitro et ex vivo de HSC  24 

1.3.2  Analyse à l’échelle cellulaire (single cell analysis)  25 

2  HYPOTHÈSE 27 

3  OBJECTIFS 28 

4  MATÉRIELSETMÉTHODES 29 

4.3  Sources des cellules  29 

4.3.1  Isolation des leucocytes à partir de sang frais des chambres de leucoréduction  29 

4.3.2  Isolement des cellules souches CD34+ à partir des PBMC congelées  30 

4.4  Culture cellulaire  30 

4.4.1  Condition de culture  30 

4.4.2  Milieu de culture  30 

4.4.3  Suivi de la viabilité et de l’expansion  32 

4.4.4  Transition hypoxique  32 

4.5  Détermination du potentiel progéniteur en milieu semi‐solide  32 

4.6  Analyse phénotypique  33 

4.6.1  Anticorps et panel d’anticorps  33 

4.6.2  Marquage extracellulaire  35 

4.6.2.1  Suivi des cellules CD34 dans les échantillons  35 

4.6.2.2  Marquage des échantillons de cellules décongelées  36 

4.6.2.3  Marquage des isolats de cellules CD34+ en culture  36 

4.6.3  Acquisition et analyses des données  36 

4.6.3.1  FCS Express  37 

4.6.3.2  Spanning‐tree Progression Analysis of Density‐normalized Events  37 

4.7  Immunobuvardage de type Western  38 

4.7.1  Analyse de la protéine HIF‐1α  38 

4.8  Analyses statistiques et de corrélation  39 

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VI

5  RÉSULTATS 40 

5.3  Caractérisation des cellules multipotentes contenues dans les chambres LRS  40 

5.3.1  Quantité absolue et fréquence.  40 

5.3.2  Corrélation entre le moment du prélèvement et le contenu en cellules CD34+  41 

5.3.3  Caractérisation phénotypique des cellules CD34+  41 

5.4  Expansion ex vivo – Normoxie  45 

5.4.1  Comparaison des milieux sans sérum  45 

5.4.1.1  Expansion et viabilité  45 

5.4.1.2  Phénotype des cellules  46 

5.4.1.3  Détermination du potentiel progéniteur  49 

5.4.2  Essais avec le N‐acétyle cystéine (NAC)  51 

5.5  Mise au point de la culture en hypoxie  54 

5.5.1  Essais préliminaires  54 

5.5.2  Optimisation du milieu de culture  57 

5.5.2.1  Élimination de la composante IGF‐1  57 

5.5.2.2  Effets du GM‐CSF sur l’évolution des cellules CD34 en culture  61 

5.6  Caractérisation de l’expansion en condition d’hypoxie  65 

5.6.1  Expansion et viabilité  65 

5.6.2  Caractérisation multiparamétrique du phénotype des cellules cultivées  66 

5.7  Transition entre 21% et 8% d’oxygène  75 

5.7.1  Expression HIF‐1α  75 

6  DISCUSSION 77 

6.3  Les chambres LRS, une source réaliste de HSC  77 

6.4  Un milieu sans sérum pour mimer la niche  79 

6.5  L’hypoxie pour la culture ex vivo des cellules CD34+  81 

7  CONCLUSION 83 

8  RÉFÉRENCES 84 

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VII

Liste des tableaux

Tableau 4.1 - Liste des anticorps utilisés pour effectuer les différents marquages extracellulaires…………………………………………………………………34

Tableau 5.1 - Quantité absolue et fréquence des cellules CD34+ obtenues dans les chambres LRS lors d’une procédure de don de plaquettes……………….40

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VIII

Liste des figures

Figure 1.1 - Vue d’ensemble de l’hématopoïèse…………………………………………….4

Figure 1.2 - Modèle des niches hématopoïétiques de la moelle osseuse……………….19

Figure 4.1 - Phénotype visuel des CFU……………………………………………………..33

Figure 4.2 - Stratégie de gating adaptée du protocole ISHAGE..................................…35

Figure 4.3 - Stratégie de gating pour l’élimination des doublets, des débris et des cellules mortes…………………………………………………………………...37

Figure 5.1 - Corrélation entre l’heure de prélèvement et le contenu des chambres LRS. ……………………………………………………………………………………..41

Figure 5.2 - Caractérisation phénotypique des HSC contenus dans les chambres LRS… ……………………………………………………………………………………..44

Figure 5.3 - Culture des cellules CD34 en milieu sans sérum maison APFM et commercial Stemspan………………………………………………………….. 48

Figure 5.4 - Comparaison du phénotype obtenu après culture dans les deux milieux sans sérum……………………………………………………………………….49

Figure 5.5 - Détermination du potentiel progéniteur des cellules CD34+ fraîchement isolées et cultivées en milieu sans sérum…………………………………….51

Figure 5.6 - Expansion dans le milieu APFM en présence de NAC…………………….. 53

Figure 5.7 - Essais préliminaires pour la mise au point de la culture en condition hypoxique…………………………………………………………………………57

Figure 5.8 - Optimisation du milieu APFM par le retrait de l’IGF-1 – expansion et viabilité ……………………………………………………………………………………..58

Figure 5.9 - Optimisation du milieu APFM par le retrait de l’IGF-1 – phénotype SLAM….. ……………………………………………………………………………………..60

Figure 5.10 - Optimisation du milieu APFM par le retrait de l’IGF-1 – Phénotype de différenciation………………………………………………………………….. 61

Figure 5.11 - Optimisation du milieu de culture APFM par l’ajout de GM-CSF…………. 64

Figure 5.12 - Expansion en condition d’hypoxie………………………………………….....65

Figure 5.13 - Phénotypage multiparamétrique des cellules CD34+ cultivées en hypoxie – Panel primitif……………………………………………………………………..68

Figure 5.14 - Phénotypage multiparamétrique des cellules CD34+ cultivées en hypoxie – Panel progéniteur………………………………………………….…………….71

Figure 5.15 - Phénotypage multiparamétrique des cellules CD34+ cultivées en hypoxie – Panel différenciation…………………………………………………………….74

Figure 5.16 - Détection de l’expression de HIF-1a suite à une transition de 21% O2 à 8% O2…………………………………………………………………….……………76

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IX

Liste des abréviations

7AAD – 7-amino-Actinomycin D

ACD – Acid-citrate-dextrose

ADN – Acide Désoxyribonucléique

APFM – Animal Protein Free Medium (Milieu de culture sans protéine animale)

APS – Ammonium Persulfate

BFU-E – Burst Forming Unit- Erythroid

BMWD – Bone Marrow World Wide Donor

CD – Cluster of Differentiation

CFU – Colony Forming Unit (unité formatrice de colonie)

CFU-GEMM – CFU-Granulocyte-Erythoid-Macrophage-Megakaryocyte

CFU-GM – CFU- Granulocyte-Macrophage

CLP – Common Lymphoid Progenitor

CMP – Common Myeloid Progenitor

DTT – Dithiothréitol

ECL – Enhanced Chemiluminescence

EDTA – Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS – Fetal Bovine Serum (Sérum fétal de boeuf)

FMO – Fluorescence Minus One (Fluorescence moins un)

DMSO – Diméthylsulfoxyde

Flt-3L – FMS-Like Tyrosine Kinase 3 Ligand

GAPDH – Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase

GM-CSF – Granulocyte Macrophage – Colony Stimulating Factor

GMP – Granulocyte Macrophage Progenitor

GPA – Glycophorine A

GVHD – Graft Versus Host Disease (Maladie du greffon contre l'hôte)

HSA – Human Serum Albumin (Albumine Sérique humaine)

HLA – Human Leucocyte Antigen

HPC – Hematopoietic Progenitor Cell (Cellule progénitrice hématopoïétique)

HRE – Hypoxia Response Element

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X

HSC – Hematopoitic Stem Cell (Cellule souche hématopoïétique)

HIF – Hypoxia Inducible Factor

HSCT – HSC Transplantation

IGF1 – Insulin-Like- Growth Factor - 1

IL – Interleukine

IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium

ISHAGE – International Society For Hematotherapy And Graft Engineering

LDL – Low Density Lipid (Lipide à faible densité)

LRS – Leucoreduction System (système de leucoréduction)

MEP – Mk- Erythroid Progenitors

MFI – Median of Fluorescence Intensity (Médiane de l'intensité de fluorescence)

Mk – Mégacaryocytes

MPP – Multipotent Progenitors

NAC – N-Acetyl Cysteine

NK – Natural Killer

ODDD – Oxygen-Dependent Degradation Domain (Domaine de dégradation

dépendant à l'oxygène)

OMS – Organisation Mondiale de la Santé

BPF – Bonnes Pratiques de Fabrication

FACT – Foundation for Accreditation of Cellular Therapy

FDA – Food and Drug Administration

PAMP – Pathogen-Associated Molecular Patterns (Motifs moléculaires associés

aux pathogènes)

PBMC – Peripheral Blood Mononucleated Cell (Cellule mononuclées du sang)

PBS – Phosphate Buffer Saline

PRR – Pattern Recognition Receptor

ROS – Reactive Oxygen Species (espèces réactive d'oxygène)

SCF – Stem Cell Factor

SDS – Sodium Dodecyl Sulfate (dodécylsulfate de sodium)

SDS-PAGE – SDS- Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SPADE – Spanning Progession Analysis of Density-normalized Events

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XI

SS – StemSpan

TEMED - Tetramethylethylenediamine

TNC – Total Nucleated cell (Cellules nucléées totales)

TP – Température Pièce

TPO– Thrombopoiétine

TTBS – Tween Tris Buffer Saline

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XII

Remerciements

C’est avec l’aide et le support de personnes importantes que j’ai pu compléter mon

parcours de maîtrise. Je tiens d’abord à remercier très chaleureusement ma directrice de

recherche Dre Sonia Néron. J’ai grandement apprécié sa disponibilité et son soutien tout

au long de mon cheminement. Elle a toujours su me guider au niveau de la

compréhension et de l’interprétation de mes résultats. J’ai toujours senti sa confiance en

moi et je suis pleinement reconnaissante pour toute l’expérience que j’ai acquise grâce à

elle. Encore une fois, merci beaucoup Sonia.

Je tiens aussi à remercier l’équipe qui m’a entourée durant tout ce temps passé à Héma-

Québec. Merci à Guillaume Bonnaure. J’ai beaucoup apprécié échanger avec toi sur nos

résultats. Je te souhaite le meilleur des succès dans ta carrière. Merci à Marc Cloutier qui

m’a introduit au projet sur les CD34 du sang adulte et qui m’a appris beaucoup sur les

différentes techniques que j’ai utilisées. Également, merci à Carl Simard. Ton opinion

scientifique m’a toujours été utile pour faire avancer mon projet. Merci aussi pour tous tes

judicieux conseils sur la cytométrie en flux. Je veux aussi remercier Jennifer Lemieux.

Par ailleurs, j’aimerais aussi remercier les membres de mon comité d’encadrement, André

Darveau PhD., Josée Laganière PhD. et Julie Fradette PhD., qui m’ont encouragée et

conseillée. J’ai apprécié leur point de vue et leur intérêt pour mon projet de maîtrise.

Je tiens aussi à souligner le support financier que j’ai obtenu avec la bourse BMP

innovation. De ce fait, je remercie le CRSNG, le FQRNT et Héma-Québec.

Je termine en remerciant ma famille, mes amis et mon conjoint qui m’ont supportée dès

depuis le début et qui m’ont souvent écoutée raconter ce sur quoi je travaillais sans

toujours vraiment comprendre!

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1

Introduction

Par leur capacité à générer l'ensemble des cellules humaines, les cellules souches sont

certainement très importantes pour le corps humain. Les cellules souches embryonnaires

occupent le haut de la hiérarchie et sont à l’origine de toutes les autres. Elles sont les

cellules dites pluripotentes dû à leur capacité de générer les trois feuillets embryonnaires

et donc l’ensemble des cellules qui constituent le corps humain [1]. Leur différenciation

engendre l’apparition des cellules souches somatiques (adultes). Celles-ci comprennent,

entres autres, les cellules souches hématopoïétiques, neurales, intestinales et

mésenchymateuses. Ces cellules sont multipotentes, c’est-à-dire capables de générer un

nombre limité de cellules appartenant à un même système biologique. Par exemple, les

cellules souches hématopoïétiques génèrent le système sanguin et les cellules souches

neurales le système nerveux. Le potentiel thérapeutique des cellules souches intéresse de

plus en plus la communauté scientifique et médicale [2]. Par leur potentiel à se différencier

en cellules spécialisées, elles offrent la possibilité de guérir, voire de remplacer un

système physiologique déficient [3].

1.1. Les cellules souches hématopoïétiques

1.1.1. Définition Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont les cellules responsables de

l’hématopoïèse. L’hématopoïèse est un processus physiologique qui permet la création et

le renouvèlement de toutes les cellules du système sanguin [4]. Cette fonction biologique,

qui se déroule en permanence chez l’homme, assure le maintien d’un nombre adéquat de

cellules des différentes lignées hématopoïétiques. On estime qu’en moyenne 7x109

cellules sanguines/Kg sont produites tous les jours [5]. Les HSC sont définies par leur

capacité à se différencier en cellules sanguines spécialisées, mais aussi, par leur capacité

d’autorenouvèlement, assurant ainsi leur maintien dans l’organisme [6].

Les HSC représentent une population grandement hétérogène. En fait, il est possible de

distinguer une population plus primitive d'une autre population davantage engagée dans

l'hématopoïèse par des essais fonctionnels et une caractérisation du phénotype [7, 8].

Alors que la première population est généralement présentée comme étant les

«véritables» cellules souches, on appelle la deuxième les progéniteurs hématopoïétiques

(HPC). Les «véritables» HSC sont celles dont les capacités d'autorenouvèlement sont le

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2

plus primordial pour l'organisme. Elles vont assurer la reconstitution et le maintien à long

terme du système hématopoïétique. D'autre part, les HPC sont directement responsables

de la différenciation en cellules effectrices. Plusieurs types de HPC peuvent être

distingués en fonction de leur degré de différenciation et de leur voie de spécialisation

durant l’hématopoïèse. Ce sont elles, qui assurent le fonctionnement et la reconstitution

du système hématopoïétique à court terme.

1.1.2. Aperçu historique À ce jour, les HSC sont les cellules les plus utilisées pour la thérapie cellulaire. Leur

utilisation a débuté avec la transplantation de moelle osseuse dans les années 1950 [9].

La tristement célèbre bombe atomique de Hiroshima en 1945 a été l'élément qui a permis

aux scientifiques de comprendre la base du fonctionnement des cellules souches [10]. En

fait, il a été observé que les gens ayant été exposés aux radiations nucléaires décédaient

d'infections bénignes ou d'hémorragies. Des médecins se sont donc intéressés au

système hématopoïétique des survivants de l'explosion et ils ont constaté une déficience

en leucocytes et en plaquettes. Subséquemment, des études chez la souris ont montré

des symptômes comparables après avoir soumis ces animaux à une exposition de rayons-

x [11]. Toutefois, il s’est avéré que protéger un os ou la rate, lors de l’exposition à ces

radiations, minimisait les symptômes et la létalité. Par ailleurs, des injections d'une

suspension cellulaire de moelle osseuse provenant de souris non-irradiées réalisées sur

des souris ayant été irradiées montrait que les symptômes pouvaient être totalement

renversés [12]. C'est en 1956, qu'on a démontré que la régénération du système

hématopoïétique, qui résultait de cette procédure, n'était pas la conséquence de facteurs

extracellulaires qui assuraient la réparation des cellules endommagées mais bien

directement les cellules injectées de la moelle osseuse qui permettaient la création de

nouveaux leucocytes et de nouvelles plaquettes [13-15].

C'est en 1961 avec les travaux des canadiens James Till and Ernest McCullogh que les

HSC ont pu être réellement définies [16]. Avec des expérimentations visant à étudier la

sensibilité de la moelle osseuse aux radiations lors du traitement du cancer, ils ont pu

mettre en évidence que c'est à partir d'une cellule aux propriétés uniques que l'ensemble

du système hématopoïétique pouvait être régénéré. Ils ont démontré, avec des essais

génétiques, que c'est à partir d'une seule cellule que se formaient des colonies observées

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3

dans la rate de souris [17]. Ils ont aussi démontré que ces cellules «mères», les HSC,

possèdent des capacités d'autorenouvèlement et de différenciation en plusieurs lignées

cellulaire du sang [16].

1.1.3. Caractérisation et régulation de l'hématopoïèse Chez l'homme, les HSC sont caractérisées par la présence du marqueur de surface CD34

(Cluster of differentiation 34) [18-22]. Lorsque très primitives, elles peuvent exprimer aussi

le marqueur CD133 seul ou conjointement à CD34 [23-26]. Les HSC sont aussi

caractérisées par l'absence de marqueurs exprimés par les cellules effectrices

lymphoïdes, érythroïdes et myéloïdes (Lin-) et la présence du marqueur Thy1 (CD90), le

récepteur du SCF (Stem Cell Factor) [21, 27, 28]. D'ailleurs, le SCF est la cytokine

principale qui guide l'autorenouvèlement, la survie et la différenciation des HSC [29, 30].

Une fois engagées vers la différenciation, les HSC vont devenir des HPC et ces dernières

vont aussi exprimer le marqueur CD34, mais plus faiblement et son expression sera

perdue en cours de différenciation [18, 22, 31]. Les HPC sont généralement caractérisées

par la présence du marqueur d'activation CD38 [32] et peuvent être divisées en plusieurs

sous-populations. Les multipotent progenitors (MPP) constituent des HSC ayant été

activées. Les MPP possèdent encore leur capacité de multipotence mais elles sont prêtes

à entrer en hématopoïèse. C'est à partir du stade de MPP que la cellule effectue une

première spécialisation, soit du côté myéloïde ou du côté lymphoïde. Il en résultera alors

des common myeloid progenitors (CMP) ou des common lymphoid progenitors (CLP) [32].

La cytokine FLT-3 est impliquée dans cette spécialisation et d’ailleurs les MPP expriment

le récepteur pour FLT-3 soit, le marqueur CD135 [33]. Les CLP, caractérisés par la

présence des marqueurs de surface CD10 et CD7, assurent la génération de lymphocytes

B, lymphocytes T et des cellules NK [34]. D'autre part, les CMP permettront de générer

soit des granulocyte-monocyte progenitors (GMP), ou des megakaryocyte-

erythroid progenitors (MEP) [35, 36]. La figure 1.1, tirée de la revue de Wognum et al. [18],

permet de visualiser l’ensemble de l’hématopoïèse et les sections qui suivent décriront le

développement et la différenciation de chacune des lignées du sang.

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4

Figure 0.1 Vue d'ensemble de l'hématopoïèse [19]

1.1.3.1 Erythropoïèse

L'érythropoïèse est la partie de l'hématopoïèse qui assure la formation des globules

rouges, aussi nommés érythrocytes. L'érythropoïèse débute à partir du MEP et la

différenciation des cellules dépend grandement de l'érythropoïétine (EPO) [37, 38]. Le

burst forming unit-erythroid (BFU-E), qui peut être visualisé par des cultures en milieu

semi-solide (section 4.3 ; figure 4.1), constitue le premier stade de ce processus et se

caractérise par l’apparition du récepteur de l’EPO [39, 40]. À ce stade, la cellule est

engagée de manière irréversible vers la formation d'érythrocytes. L’expression du

récepteur de l’EPO augmentera lors du passage de BFU-E à colony forming unit-erythroid

(CFU-E), pouvant aussi être détecté en culture semi-solide. Au niveau des CFU-E,

l'expression du marqueur CD34 sera grandement diminuée alors que celle du récepteur

de la transferrine (CD71) augmentera et que le marqueur CD235a (Glycophorine A, GPA)

fera son apparition à la surface de la cellule [41-43]. Ensuite, il se produira une réduction

de la taille de la cellule ainsi qu'une condensation de la chromatine dans le noyau [44]. À

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5

ce stade, on parle alors d'érythroblaste, le pH du cytoplasme est basophile et on y

constate une accumulation d'hémoglobine. Un apport suffisant en fer est nécessaire à

création de cette hémoglobine. Le noyau continue à se condenser jusqu'à son expulsion et

le cytoplasme s'acidifie jusqu'au stade de réticulocyte. C'est directement à partir des

réticulocytes que la maturation finale pour devenir un érythrocyte va se produire. La

régénération des globules rouges peut prendre entre 20 à 59 jours [45]. Dans le sang, les

érythrocytes peuvent être distingués par leur forme circulaire aplati et biconcave [46, 47] et

l'hémoglobine leur confère une couleur rouge. Ils représentent 99% des éléments figurés

du sang [48].

1.1.3.2 Mégacaryopoïèse

La mégacaryopoïèse est la division de l'hématopoïèse qui assure la formation des

mégacaryocytes (Mk). C'est aussi à partir des MEP que va débuter la mégacaryopoïèse.

La première spécialisation s'effectue par l'obtention des cellules ayant la capacité à former

des colonies du type colony forming unit mégakaryocytes (CFU-Mk) [49, 50]. Le type CFU-

Mk est généralement associé aux marqueurs de surface CD41 et CD61 en plus de la

présence du marqueur CD34 [51]. Les cellules de type CFU-Mk passent ensuite par les

stades de promégacaryoblaste, de mégacaryoblaste puis de promégacaryocyte avant de

devenir un mégacaryocyte (Mk) mature. Le Mk mature peut être distingué par l'absence de

CD34 et l’apparition du marqueur CD42 en plus de CD41 et CD61[52]. Durant ce

processus, la cellule subira plusieurs cycles d'endomitose qui aura comme conséquence

une augmentation en taille et en nombre de copie d'ADN [53, 54]. L'endomitose se définit

comme une mitose durant laquelle l'ADN est doublé sans qu'il n’y ait division de la cellule.

Ainsi, les Mk sont dits polyploïdes puisqu’ils possèdent jusqu’à 128 copies de leurs

chromosomes. La principale cytokine responsable de la régulation de mégacaryopoïèse

est la thrombopoiétine (TPO), une glycoprotéine, qui contrôle la production, la

différenciation et la survie des Mk [55]. C'est la fragmentation du mégacaryocyte qui

mènera à la formation des plaquettes sanguines par un processus nommé thrombopoïèse

[54]. Suite à une greffe de HSC, il faut entre 50 à 100 jours pour atteindre une

reconstitution complète de plaquettes dépendamment de la source des cellules souches

[56]. Les plaquettes sanguines sont cruciales pour le processus de cicatrisation qui agit en

continue dans notre organisme, d’où la présence d'hémorragies chez les victimes de

Hiroshima [10].

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6

1.1.3.3 Myélopoïèse

La granulopoïèse et la monocytopoïèse sont généralement regroupées sous le terme

myélopoïèse qui correspond au processus physiologique responsable de la génération de

nouveaux granulocytes et monocytes [57]. La formation de ces cellules devient irréversible

dès que le CMP(common myeloid progenitors) se différenciera en un GMP (granulocyte-

monocyte progenitors) aussi nommé CFU-GM, (Colony-forming unit Granulocyte-

Monocyte ; section 4.3 ; figure 4.1) qui exprime le CD45RA [32]. À partir de ce stade, la

cellule s'orientera soit en promyélocyte pour la génération de granulocytes ou en

monoblaste pour la génération de monocytes.

Lors de la granulopoïèse, la cellule se différenciera en trois précurseurs soit les

myélocytes neutrophiliques, basophiliques ou éosinophilique. Ceux-ci permettront

ultimement la création des neutrophiles, basophiles et éosinophiles [57]. Les granulocytes

sont des leucocytes responsables de l'immunité innée et ils sont caractérisés par la

présence de granules dans leur cytoplasme. Ils sont, entre autre, impliqué dans la

phagocytose des pathogènes et la réponse allergique. En ce qui concerne la

monocytopoïèse, la cellule génèrera d'abord un promonocyte à partir du monoblaste pour

éventuellement générer un monocyte. Les monocytes sont aussi des leucocytes impliqués

dans l'immunité innée, plus précisément dans la réponse inflammatoire. C'est à partir des

monocytes que sont générés les macrophages et les cellules dendritiques [57].

Durant ces processus, le FLT-3 joue un rôle important pour les évènements en amont de

la spécialisation alors que le GM-CSF et l'IL-3 sont les principales cytokines responsables

de la régulation des évènements en aval [58, 59]. La maturation des granulocytes et des

monocytes peut être suivi par l’expression différentielle de marqueurs de surface. En fait,

les cellules vont exprimer le CD33 et le CD13 dès leur engagement dans la lignée

myéloïde alors que le CD14 apparaîtra sur les monocytes matures [58, 60, 61].

1.1.3.4 Lymphopoïèse

Les lymphocytes B, T et les cellules NK (Natural Killer) sont maintenus en quantité

suffisante dans le sang grâce à la lymphopoïèse. Bien que les trois types cellulaires soient

originaires du CLP (common lymphoid progenitors), leur développement est distinct.

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7

D’ailleurs, la régénération des cellules NK nécessite une cinquantaine de jours alors qu’il

faut entre 6 à 9 mois pour régénérer les lymphocytes T et B suite à une greffe de HSC [56,

62].

Dans le cas des lymphocytes B, la cellule passera par les stades de cellule pro B, pré B et

B immature avant d'être un lymphocyte B mature [63]. Le marqueur CD19 permet

d’identifier toutes les populations de lymphocytes B. Ce sont ces cellules qui suite à leur

activation pourront produire des anticorps dans le cadre de la réponse immunitaire (revue

dans [64]). En ce qui concerne les cellules NK, leur maturation passe par le stade de

précurseur NK et NK immature avant d'être une cellule NK effectrice [65]. Le marqueur de

surface CD56 est généralement utilisé pour identifier ces cellules. Les cellules NK sont

responsables de tuer les cellules tumorales ou les cellules infectées par des

microorganismes en plus d’orienter la réponse des lymphocytes par la sécrétion de

messagers [65].

À la différence de l'ensemble des autres cellules hématopoïétiques, le développement des

lymphocytes T s'effectue principalement dans le thymus et non dans la moelle osseuse

[66]. Pour assurer la génération de lymphocytes T, le CLP deviendra un thymocyte, positif

pour le marqueur de surface CD3, qui pourra par la suite débuter sa maturation par le

réarrangement de son récepteur en fonction de l’environnement du soi (revue dans [67]).

L'évolution des lymphocytes T dans la lymphopoïèse est caractérisée par l’apparition des

marqueurs CD4 et CD8. Initialement, les thymocytes ne vont exprimer aucun de ces deux

marqueurs. Ils vont ensuite passer au stade de doubles positifs CD4+CD8+ pour

finalement perdre l'un ou l'autre des deux marqueurs afin de devenir un T auxiliaire

(CD4+) ou un T cytotoxique (CD8+) [68].

1.1.4. Transplantation Récipiendaire du prix Nobel de médecine en 1990, Edward Donnall Thomas a été un

pionnier dans le domaine de la transplantation de HSC [9]. Ce dernier a réalisé la

première greffe de moelle osseuse au milieu des années 1950 sur des patients atteints de

leucémie. La transplantation de HSC (HSCT) consiste à donner de façon intraveineuse

des HSC à un patient dont le système hématopoïétique est déficient ou a été endommagé

ou détruit par des traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie. Selon l'Organisation

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8

Mondiale de la Santé (OMS), plus de 50 000 transplantations de HSC sont effectuées

annuellement dans le monde et ce nombre serait en augmentation constante [69]. Cette

transplantation est principalement utilisée dans les cas de cancer du sang tel que des

leucémies ou des myélomes multiples. Néanmoins, plusieurs cancers non-hématologiques

peuvent aussi avoir recourent à la HSCT tout comme, divers cas d'anémies et de maladies

congénitales ou auto-immunes [6, 70, 71].

La greffe de HSC peut être autologue ou allogénique [72]. Dans le cas d'une greffe

autologue, les HSC transplantées proviennent directement du patient qui subira

l'intervention. Cette situation requiert de récupérer les HSC avant le traitement pour

ensuite les cryopréserver. Le patient peut alors être soumis à de fortes doses de

chimiothérapie et de radiothérapie qui vont détruire les cellules à division rapide donc, les

cellules cancéreuses et les cellules de la moelle osseuse [73]. Ce traitement permet

d’éradiquer les cellules malades et génère en même temps un effet immunosuppresseur

qui peut faciliter la greffe des HSC. Les HSC du patient lui sont ensuite redonnées pour

assurer la repopulation des lignées hématopoïétiques. Bien que cette intervention

présente peu de toxicité et aucun risque de rejet de la greffe, il demeure que les chances

de rechute sont importantes étant donné qu'il est possible que des cellules malades soient

toujours présentes ou que des cellules souches elles-mêmes soit déficientes. En date de

2012, 60% des HSCT étaient de type autologue [73].

Les greffes allogéniques sont des transplantations pour lesquelles les cellules souches

proviennent d'un donneur génétiquement différent du receveur [74]. Les HSC sont parfois

cryopréservées entre le prélèvement et la greffe ou peuvent être transplantées

directement au patient ayant reçu son traitement de chimiothérapie ou de radiothérapie.

De façon générale, les greffes allogéniques occasionnent moins de rechutes dû au fait

que les cellules souches transplantées sont toutes saines et que le système immunitaire

du donneur peut aussi combattre les cellules endommagées ou cancéreuses du patient

[73]. Toutefois, une telle intervention allogénique demande que les cellules du donneur et

celle du receveur soient caractérisées par une histocompatibilité très importante afin

d’éviter les rejets (voir section 1.1.2.1). Les greffes allogéniques peuvent être apparentées

ou non-apparentées [74]. Les greffes apparentées font référence à des associations

donneur-receveur qui ont un lien de parenté. Les plus grandes chances d’obtenir une

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9

excellente compatibilité sont avec les frères et sœurs, bien que qu'elles soient seulement

de 25%. Dans les cas de greffes non-apparentées, les donneurs sont recherchés dans les

registres de cellules souches qui se trouvent un peu partout dans le monde (voir section

1.1.4). Néanmoins les chances d'avoir un donneur compatible dans le grand public sont de

1 sur 500000 [75]. Selon un rapport de 2010, 55% des greffes de HSC allogéniques

étaient apparentées contre 45% qui ne l’étaient pas [74].

1.1.4.1 Histocompatibilité

Le système HLA (human leukocyte antigen) correspond aux antigènes présents à la

surface de quasiment toutes les cellules nucléées incluant des globules blancs [76]. Les

antigènes du système HLA sont directement impliqués dans la reconnaissance du soi et

du non-soi par le système immunitaire. Le système HLA est très complexe et comprends 8

gènes connus chez l’homme à ce jour : HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-

DM, HLA-DO et HLA-DP [77]. Chacun de ses gènes peut cependant exprimer plusieurs

dizaines, voir centaines d’allèles différents. Les transplanteurs s’intéressent plus

particulièrement à 8 allèles du système HLA pour établir l’histocompatibilité entre un

donneur et un receveur pour la greffe de HSC, soit deux allèles pour le HLA-A, B, C et DR.

Idéalement les transplanteurs tentent de trouver un match de 8/8 en fonction de ces

allèles. Toutefois, des greffes sont souvent faites avec des matchs de 6/8 ou de 7/8

malgré un plus grand risque de complications et de rejet [75, 78].

La complication la plus importante suite à un manque d’histocompatibilité est la GVHD

(Graft versus host disease). Il est possible que les cellules du greffon s’attaquent aux

cellules de l’hôte et causent de l’inflammation. La réaction de GVHD est dite aigüe si elle

survient dans les 100 premiers jours suivant la greffe et elle est associée avec une

morbidité et une mortalité très élevée [79]. Si la GVHD survient après les 100 premiers

jours de la greffe on parle alors de GVHD chronique [80]. La survie à long terme est

grandement affectée et le risque de cancer gastro-intestinal est augmenté. La GVHD peut

être traité par des corticostéroïdes ou des immunosuppresseurs [6]. Actuellement,

plusieurs études visent à contrer la GVHD par l’utilisation de cellules T régulatrices et de

cellules mésenchymateuses afin de moduler à la baisse la réponse immunitaire (revue

dans [81])

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10

1.1.5. Sources de HSC Quand vient le temps de choisir la source de HSC pour leur patient, les transplanteurs ont

trois possibilités : la moelle osseuse, le sang de cordon et le sang périphérique d’adulte

mobilisé. Bien que les trois sources puissent reconstituer le système hématopoïétique,

leurs propriétés cellulaires et biologiques sont fondamentalement différentes. Ainsi, la

source de HSC peut avoir un impact sur le résultat de la greffe [72]. Plusieurs études

suggèrent que le sang d’adulte non-mobilisé pourrait s’ajouter aux trois sources actuelles

[82, 83].

1.1.5.1 Moelle osseuse

Dans la moelle osseuse, les HSC résident dans un environnement spécialisé qu'on

appelle la niche hématopoïétique (section 1.2) [84]. La grande majorité de l'hématopoïèse

se déroule dans la moelle osseuse ce qui en fait un tissu très riche en HSC. Tel que

mentionné plus haut, la découverte des HSC a été faite suite à la transplantation de

moelle osseuse et a constitué, par le fait même, la première source de HSC. Néanmoins

son utilisation est en forte baisse depuis déjà quelques années [85]. La procédure de

prélèvement de la moelle osseuse est très invasive et incommodante pour le donneur [10].

La récolte s'effectue sous anesthésie générale et une longue aiguille est insérée dans l'os

de la hanche où la moelle osseuse est aspirée. Plusieurs incisions sont requises pour

prélever de 1 à 1,5 litre de moelle [86]. Environ 25% de l'ensemble de la moelle du

donneur est prélevée mais ce volume est régénéré en l'espace de quelques semaines.

Une période de rétablissement d'environ une semaine peut être requise pour le donneur

qui souffrira de douleur très intense au bas du dos [87]. Au moment de la transplantation,

la dose visée pour le receveur se situe autour de 3x106 CD34/Kg [88].

La greffe de moelle osseuse implique aussi des considérations logistiques importantes

pour le receveur. En fait, suite au lancement de la recherche d'un donneur, un minimum

de deux mois est généralement requis avant la transplantation afin de trouver une

histocompatibilité adéquate [89]. De plus, une fois un donneur potentiel trouvé, des tests

de maladies infectieuses doivent être effectués. Cet intervalle de temps est crucial pour le

donneur dont la situation médicale est critique. En outre, le patient doit subir un

conditionnement avant la greffe ce qui requiert une excellente coordination entre le don et

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11

la transplantation, d'autant plus que durant cette période le donneur peut retirer son

consentement à tous moment ou devenir inapte au don.

Néanmoins quand l’aspect logistique de la greffe se déroule bien, la moelle osseuse est

une source qui offre une grande quantité de HSC et la prise de greffe est généralement

rapide [70, 86]. De plus, un avantage dans le cas de greffe allogénique de moelle osseuse

est la disponibilité potentielle du donneur s’il y a un besoin pour une deuxième greffe.

1.1.5.2 Sang adulte périphérique mobilisé

L'utilisation du sang périphérique comme source de HSC a été introduite en 1981. On

estime que le sang adulte comporte environ 18 fois moins de cellules CD34+ que la

moelle osseuse. Toutefois, la mobilisation est une procédure qui permet d'augmenter

jusqu'à 15 fois la quantité de cellules CD34+ circulant, passant de plus ou moins 3.8 x109

CD34/litre à 61x109 CD34/litre [86]. La mobilisation des HSC du donneur est réalisée par

un traitement pharmacologique avec des facteurs de croissance hématopoïétique.

Généralement, on utilise le G-CSF, administré à raison de 10 à 15 µg/Kg durant 4 à 5

jours. Des études cliniques ont même été réalisées avec le FLT-3L et le SCF mais sans

résultats suffisamment concluants [70]. Suite au traitement pharmacologique, le sang du

donneur est récupéré par aphérèse. Une procédure d’aphérèse dure habituellement 4h à

5h durant laquelle de 10 à 20 litres de sang sont traités. Jusqu’à 3 procédures, répartie sur

autant de jours peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment de cellules pour la

greffe, soit 8x106 CD34+/Kg. [90].Généralement, autant de cellules CD34 peuvent être

récupérées que lors d'un prélèvement de moelle osseuse.

Bien qu'elle ne soit pas aussi invasive pour le donneur que le don de moelle osseuse, la

procédure de prélèvement de cellules souches périphériques mobilisées engendre des

douleurs dans les os chez 80% des donneurs et des maux de tête sévères dans 50% des

cas [91]. Un élément important à considérer lors du prélèvement de sang mobilisé est les

effets à long terme du traitement avec les facteurs de croissance sur le donneur. Peu de

résultats ont été obtenus à cet effet. Néanmoins, une étude de suivi longitudinale sur 8290

dons allogéniques de sang périphérique mobilisé a montré des effets sur la formule

sanguine [91]. De 1 à 2 ans sont requis pour le rétablissement du compte de leucocytes

qui est significativement diminué après la collection. Le compte de neutrophiles est lui

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12

aussi diminué de manière significative suite au don et n’a pas pu être rétabli durant la

période de suivi de 5 ans. Une autre étude effectuée sur 6768 dons de cellules souches

mobilisées a confirmé les deux précédentes observations [92]. Elle a aussi révélé une

baisse du compte de plaquettes et des niveaux d’hémoglobine jusqu'à 3 ans après la

procédure. Dans les deux études, aucun impact sur l’incidence de maladies

hématopoïétiques (cancers, anémies) n’a pu être observé sur un suivi maximal de 7 ans.

À court terme, la mobilisation des HSC dans le sang périphérique peut causée quelques

effets secondaires sérieux pouvant menacer la vie (revue dans [91]). L’administration de

G-CSF engendre de façon générale un élargissement de la rate asymptomatique dans la

majorité des donneurs. Toutefois, six cas ont été rapportés dans la littérature de rupture

de la rate mortelle suite à une mobilisation au G-CSF à des doses entre 10 à 20 µg/Kg

[91]. Certains troubles pulmonaires sérieux ont aussi été notés mais à une très faible

fréquence d’incidence. Une augmentation de l’activation des facteurs de coagulation a été

rapportée dans quelques cas et associée à des thromboses veineuses [91]. Par ailleurs,

les mêmes considérations logistiques que pour le don de moelle osseuse sont aussi à

considérer pour la coordination entre le don et la transplantation.

1.1.5.3 Sang de cordon ombilical

L’utilisation du sang de cordon pour la greffe de HSC est de plus en plus populaire. Son

utilisation remonte à la fin des années 1980 alors que le Dr. Pablo Rubinstein utilisa le

sang retenu dans le cordon ombilical pour traiter un patient atteint de l’anémie de Fanconi

[93]. Le sang retrouvé dans le cordon ombilical est très riche en cellules souches CD34+.

La récolte du sang de cordon est relativement simple et non-incommodante pour la mère

et le bébé. Le sang de cordon peut être cryopréservé plusieurs années et plusieurs

banques publiques et privées de sang de cordon sont en opération dans le monde (voir

section 1.1.4). Un élément négatif de cette source de HCS est que la quantité de HSC qui

est récupérée des unités de sang de cordon est relativement faible dû au faible volume de

sang qui s’y trouve. À la banque de cellules souches d’Héma-Québec, seulement 24% des

unités de sang de cordons récupérés répondent aux critères de sélection et sont mis en

banque. Ces critères de sélections sont l’obtention d’un volume de sang de cordon plus

grand que 85 mL et un nombre total de cellules nucléées (TNC) plus grand que 1,5x109

cellules pour les dons caucasiens et plus grand ou égal à 1,1x 109 pour les dons non-

caucasiens. La cible de CD34+ récupérées par unité, avec ces critères, est de 1 à 8x106

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13

cellules. Compte tenu qu'il faut environ 2x105 CD34/Kg pour le receveur lors de la greffe

[94] quand on utilise le sang de cordon, cette source est principalement utilisée chez les

enfants de moins de 40 Kg [95].

Lors de la transplantation, le temps de prise de greffe est généralement plus long qu'avec

les autres sources de cellules souches [7]. Cette différence serait causée par le fait que

les HSC qui se trouvent dans le sang de cordon sont davantage des cellules très

primitives assurant une reconstitution du système hématopoïétique à long terme. La

génération de progéniteurs et de cellules effectrices est donc plus longue. Toutefois, il a

été observé que le risque de GVHD est plus faible avec le sang de cordon qu'avec les

autres sources [80] et le traitement pour en réduire les effets est plus facile. Par ailleurs, la

compatibilité HLA entre le donneur et le receveur est moins restrictive avec le sang de

cordon; de très bonnes reprises de greffes peuvent être obtenues lorsque l’appariement

HLA est de 4/6 [78]. Ainsi, la probabilité de trouver un donneur de sang de cordon est plus

élevée dans le cas de dons allogéniques. Il est encore difficile d'expliquer ce qui rend

possible une reconstitution hématopoïétique avec une faible histocompatibilité mais il

semblerait que les antigènes HLA soient encore immatures lors de la récolte du sang de

cordon [96].

1.1.5.4 Sang adulte

La présence de HSC dans le sang adulte est connue depuis plusieurs années. En fait, il a

déjà été montré qu'entre 0.01% et 0.06% des leucocytes en circulation dans le sang des

adultes en santé sont des HSC CD34+ [97, 98]. Bien qu'il soit encore difficile de

comprendre pourquoi les HSC quittent la moelle osseuse pour entrer en circulation avant

de s'être différenciés, des études proposent que le cycle circadien puisse y jouer un rôle.

Un groupe a en fait démontré que le nombre de HSC en circulation n'est ni stable et ni

aléatoire, mais suit les oscillations du cycle circadien [99]. Cette observation serait causée

par le système nerveux sympathique qui influence l'expression et l'activation de certains

récepteurs sur les cellules stromales de la moelle osseuse. Le récepteur adrénergique β3

et le CXCL12 qui font parti de ces récepteurs sont connus pour influencer le homing des

HSC dans la moelle osseuse [100]. Chez l'homme, les HSC seraient relâchées de la niche

durant la nuit et atteignent une concentration maximale en circulation durant la nuit pour

ensuite chuter au courant de la journée. Cependant, l'inverse a été observé chez la souris

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14

plus active la nuit [101]. Ces données suggèrent donc que la niche hématopoïétique se

régénère de façon journalière durant la période de repos de l'espèce et explique donc la

présence de cellules CD34+ en circulation. Ce phénomène pourrait aussi avoir un impact

sur la récolte de HSC dans le sang mobilisé des adultes.

Par ailleurs, la présence des HSC dans la circulation sanguine pourrait avoir une

importance immunologique. En fait, les HSC circulantes pourraient avoir un rôle de

surveillance dans les tissus non-lymphoïdes [102]. Les HSC possèdent elles-mêmes des

PPR (Pattern recognition receptors) et sont capables de répondre aux PAMP (Pathogen-

associated molecular pattern) [103]. Les HSC sont d'ailleurs rapidement mobilisées dans

un tissu touché par une infection ou de l'inflammation via les signaux de différentes

cytokines telles que IL-6, G-CSF, SDF-1, CXCR4 et MMP-9 [104-106]. Une étude stipule

que, en absence d'infection, les HSC circulantes contribueraient au maintien des cellules

hématopoïétiques spécialisées patrouillant les tissus périphériques et que durant l'infection

ces HSC seraient une source rapide et hautement spécialisée de cellules effectrices

pouvant se différencier et proliférer localement [107]. L'hématopoïèse extramédullaire, à

l'extérieur de la moelle osseuse, est connue depuis longtemps en situation pathologique.

Cependant, de plus en plus d’évidences pointent vers un phénomène physiologique

normal [108].

Avec la présence de plus en plus documentée des HSC CD34+ en circulation, les

nombreux dispositifs de leucoréduction de sang, qui sont des procédures de routine dans

les banques de sang, pourraient devenir des sources intéressantes de cellules souches.

Plusieurs études ont établi que le contenu en HSC correspond à environ 5x105 CD34 par

unité de produit filtré [83, 109-111]. D'ailleurs, en 2007, notre équipe a démontré que les

chambres de leucoréduction (LRS) des appareils Trima-Cobe, servant au don de

plaquettes par aphérèse, pouvaient contenir entre 0.1% et 0.7% de cellules CD34+, soit

1x106 à 4x106 HSC par unité [112]. Bien que la quantité de HSC soit faible, cette source

présente tout de même un potentiel pour des applications en thérapie cellulaire et ce

principe a déjà été appuyé par la communauté scientifique transfusionnelle [113, 114].

L'abondance des systèmes de leucoréduction dans les banques de sang présente un

avantage majeur quant à la recherche d'un donneur compatible, d'autant plus que ces

donneurs peuvent être déjà typés pour les antigènes majeurs du complexe HLA.

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15

Seulement pour le centre de prélèvement Globule Laurier à Québec, on parle d'environ

15000 dons par aphérèse pour l’année 2013-2014 [115]. De plus, étant donné que les

donneurs de plaquettes reviennent régulièrement, pour une fréquence maximale de 1 don

aux 2 semaines, les chambres LRS pourraient être cumulées pour un même donneur afin

d’augmenter le nombre total de cellules CD34.

Malgré cette possibilité, l'utilisation des chambres LRS comme source de HSC est jusqu'à

ce jour très peu exploitée étant donné la faible quantité de cellules CD34+ récupérable. De

plus, beaucoup des questions demeurent sans réponse; une seule étude a montré que

ces cellules peuvent être placées en expansion afin d'en augmenter le nombre [63]. Cette

étude établissait des conditions d'expansion et vérifiait leur capacité à former des CFU

dans les conditions classiques de culture cellulaire soit en présence d’oxygène à 21%.

1.1.6. Banque de HSC et registre de donneurs Conséquemment à l’utilisation grandissante du sang de cordon comme source de cellules

souches dans les années 1990 et 2000, des banques publiques de sang de cordon se

sont mises en place. Ces banques sont généralement responsables de la collecte, du

traitement et de la congélation des échantillons. Elles effectuent aussi différents tests sur

les sangs de cordon tels que le typage HLA ou la détection de maladies infectieuses. Ces

banques sont régulées par différents organismes réglementaires tel que Santé Canada,

Food and Drugs Administration (FDA), American Association of Blood Banks (AABB) ou

Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT). La toute première banque

publique à voir le jour a été celle du New York Blood Center en 1992 [116]. Cette banque

est d’ailleurs aujourd’hui la plus importante en nombre d’unités avec environ 50,000

unités. On compte maintenant plus de 140 banques publiques de sang de cordon

réparties dans plus de 30 pays [117]. À celles-ci viennent s’ajouter une vingtaine de

banques privées qui permettent la conservation d’unités de sang de cordon pour usage

exclusif aux donneurs ou à sa famille proche [117].

Au Québec, c’est Héma-Québec qui est responsable de gérer la banque publique de sang

cordon depuis 2004. À ce jour, la banque d’Héma-Québec comprenait plus de 9500 unités

de sang de cordons congelées. Elle fait partie du Bone Marrow Donors Worldwide

(BMWD), un regroupement de 49 banques de sang de cordon à travers le monde qui rend

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accessible à la communauté internationale ces unités de sang de cordon [118]. La banque

publique de sang de cordon d’Héma-Québec se classait au 11ième rang mondial en 2013-

2014 comme exportateur de sang de cordon [119]. En 2013-2014, Héma-Québec avait

livré 28 unités de sang de cordons pour des personnes en attente de greffes de cellules

souches, dont 19 à l’international et neuf au Canada. Les standards de Héma-Québec en

termes de qualification des unités de sang de cordon pour la mise en banque sont parmi

les plus élevés et leurs unités démontrent un excellent potentiel à la prise de greffe.

En plus du sang de cordon, BMDW regroupe 71 registres de donneurs de cellules

souches (www.BMDW.org). Ces registres, dont fait aussi partie Héma-Québec, incluent

des donneurs potentiels de cellules souches non-apparentés qui ont été phénotypés pour

le HLA. En cas de compatibilité avec un receveur, un don de moelle osseuse ou de

cellules souches périphériques mobilisées sera envisagé. Héma-Québec a mis sur pied

son registre de donneurs de cellules souches non apparentés en 1989. Au Canada, on

compte 320 000 personnes inscrites dans un registre de donneurs de cellules souches

non-apparentées [120]. À l’échelle mondiale, on parle de plus de 25000000 donneurs

inscrits sur les différents registres (www.BMDW.org).

1.2 Hypoxie et moelle osseuse

Le dioxygène, O2, représente 21% de la composition atmosphérique assurant ainsi la

survie des organismes aérobiques [121]. L'O2 est essentiel à la respiration aérobique via

les mitochondries. Il agit comme accepteur primaire d'électron durant la phosphorylation

oxydative qui permet la production d'ATP par les mitochondries [122]. Par ailleurs, le fort

potentiel d'oxydo-réduction de l'O2 l'entraine à oxyder des macromolécules générant ainsi

des réactifs intermédiaires nommés reactive oxygen species (ROS). L'accumulation de

ROS dans la cellule peut être toxique en induisant, par exemple, des dommages à l'ADN

ou l'apoptose de la cellule [122]. Alors que 90 à 95% de l'O2 du corps humain assure la

respiration mitochondriale, le 5 à 10% résiduel peut être dissout dans les tissus et

influencer le microenvironnement cellulaire en agissant comme transducteur de signal

[123]. La tension en oxygène dans les tissus est beaucoup plus faible que le 21% de

l'atmosphère. Dans les artères, la concentration se situe autour de 13% alors que dans les

veines elle se situe entre 5 à 10% [124]. La concentration en oxygène dans les tissus

oscille entre 1 à 8% [123].

Page 29: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

17

Plusieurs études utilisent le terme normoxie lorsque les concentrations en O2 sont de 21%

tandis qu’elles réfèrent généralement à toutes les concentrations d'O2 plus faibles à des

conditions dites hypoxiques [123, 125-127]. Cependant ceci est peu représentatif de la

physiologie des tissus puisque les conditions hypoxiques reflètent un environnement

normal pour les cellules. Conséquemment, une concentration en O2 de 21% est plutôt

hyperoxique pour les tissus et les concentrations plus faibles devraient préférablement

être dites physioxiques ou physiologiques [123]. Bien que ce concept récent soit tout à fait

rationnel, nos travaux rapporteront toutefois le terme hypoxie pour désigner les

concentrations en O2 plus faibles que 21%.

Les études montrent que les HSC résident dans la moelle osseuse où certaines régions

montrent moins de 1% d'O2 alors que la plus haute concentration mesurée est de 7% [84,

128, 129]. L'hypoxie fait partie intégrante de l’environnement des HSC et il en est ainsi

pour la majorité des autres types de cellules souches. Considérant ce fait, le groupe de

Ivanovic a émis la théorie du paradigme évolutionnaire des cellules souches [130, 131].

En fait, au début de la vie sur Terre, il y a 4 millions d'années, l'oxygène n'était pas présent

et les organismes étaient exclusivement anaérobiques. L'apparition de l'O2 sur la Terre

remonte à 2,3 millions d'années menant à l'extinction massive des organismes

anaérobiques et à l'adaptation pour la vie aérobique.

« Le paradigme évolutionnaire des cellules souches suggère que les cellules

souches ont des propriétés similaires aux eucaryotes primitifs anaérobiques.

Ce qui signifie que maintenir un état anaérobique dans lequel la faible

disponibilité et demande en énergie résultent au maintien exclusif des

fonctions vitales, soit la survie et le renouvèlement. Ainsi, seulement les

régions les plus ancestrales du génome assurant les fonctions physiologiques

vitales sont activées tandis que toutes les autres fonctions acquises au cours

de l'évolution demeurent dans un état de quiescence. (traduit de [123]). »

D'ailleurs, il a été montré que pour des cellules CD34+ de sang mobilisé et de sang de

cordon, l'exposition à de faibles concentrations de O2 et des fortes concentrations en CO2

favorisaient et amélioraient leurs fonctions de cellules souches et progéniteurs [132, 133].

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18

Malgré l'importance flagrante de la concentration en O2 dans le microenvironnement

cellulaire in vivo, ce paramètre est souvent négligé dans les systèmes de culture in vitro.

Les paramètres physico-chimiques sont souvent ajustés, par défaut, à 37ºC, 5% CO2,

21% O2, 95 à 98% d'humidité relative et un pH autour de 7,5. Bien que ces paramètres

peuvent être corrects pour certaines populations cellulaires, d'autres populations, dont les

cellules souches requièrent un environnement plus spécialisé.

1.2.5 Niches hématopoïétiques Outre les traits génétiques intrinsèques des HSC, les interactions cellules-cellules et les

signaux biochimiques de l'environnement sont grandement impliqués dans les fonctions

des HSC. L'hypothèse que le comportement et le nombre de HSC sont régulés par un

environnement physique spécialisé dans la moelle osseuse, nommé niche, a été d'abord

élaboré par Schofield en 1978 [134]. La niche se définit comme une structure anatomique

et fonctionnelle qui assure une balance entre la survie, l'autorenouvèlement et la

différenciation des HSC. Les études visant à comprendre la composition et la localisation

des niches sont très abondantes mais aussi controversées. Plusieurs modèles de niches

ont été définis (revue dans [5]). Alors que certains parlent d’une seule niche

hématopoïétique assurant la quiescence, la prolifération et la différenciation des HSC, la

plupart des auteurs favorisent l’hypothèse de deux niches hématopoïétiques soit une pour

la quiescence et l’autorenouvèlement des HSC et une autre pour la prolifération et la

différenciation des HSC. La figure 1.2 présente le modèle des deux niches [135]. Par

ailleurs, il semblerait que les HSC, et donc les niches, se localisent préférentiellement

dans la cavité trabéculaire de l’os [136]

Page 31: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

19

Figure 0.2 Modèle des niches hématopoïétiques de la moelle osseuse [136]

Les HSC quiescentes sont davantage retrouvées près de la surface de l’os dans la niche

endostéale. Cette niche présente un environnement très peu abondant en O2, soit oscillant

autour de 1%. Dans cette niche, l’oxygénation est très faible puisque la distance avec les

vaisseaux sanguins est généralement assez grande et la vélocité du sang dans les

vaisseaux sanguins à proximité est faible [137]. Cet environnement fortement hypoxique

favorise le maintien des fonctions de reconstitution à long terme des HSC en plus d’inhiber

la différenciation des cellules. Dans la niche endostéale, les HSC sont en contact étroit

avec les ostéoblastes de la structure osseuse. Par la sécrétion de différents signaux, dont

l’ostéoponin, les ostéoblastes semblent être un élément important pour le maintien des

fonctions primitives des HSC [138]. Plusieurs études avec des systèmes in vitro de co-

culture d’ostéoblastes et de HSC ont démontré l’importance des ostéoclastes pour la

survie des HSC en les maintenant dans un état de quiescence. L’injection de la lignée

cellulaire d’ostéoblaste KUSA-A1 chez la souris s’est avéré stimuler la formation osseuse,

et augmenter le nombre des HSC [139]. Dans le même ordre d’idée, les ostéoclastes sont

importants pour la création du microenvironnement. Des modèles de souris

ostéoporotiques (déficiente pour la résorption osseuse) ont montré une baisse du nombre

de HPC [140]. Une forte concentration en calcium est normalement retrouvée à proximité

de la surface osseuse dû à la résorption osseuse par les ostéoclastes. La localisation et

les fonctions spécifiques des HSC primitives semblent être dépendants de l’expression

d’un récepteur sensible au calcium [141]. D’autres composants cellulaires tels que les

cellules mésenchymateuses (MSC) exprimant la nestine, les T régulateurs et les

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20

macrophages sont aussi présents dans la niche endostéale des HSC pour les maintenir

dans un état de quiescence [142].

Les HSC activées et les HPC (hematopoietic progenitor cells) sont, pour leur part,

retrouvées à proximité des vaisseaux sanguins dans la moelle osseuse. On parle

généralement de niches périvasculaires ou sinusoïdales pour définir cet environnement.

La concentration en oxygène qui y est retrouvée se situe entre 5 à 8% [127]. Les cellules

sont plus actives métaboliquement et cette concentration physiologique d’oxygène assure

l’apport nécessaire en énergie aux HPC situées dans cette niche. Parmi les composants

cellulaires de la niche périvasculaire, les péricytes CD146+ sont essentiels pour la survie

des progéniteurs [143]. Un modèle de co-culture avec les péricytes CD146+ s’est d’ailleurs

avéré capable de générer des cellules assurant une reconstitution hématopoïétique chez

la souris. Les MSC nestin + se trouve aussi dans la niche périvasculaire. Ils y seraient en

plus grande abondance que dans la niche endostéale. De plus, comme mentionné plus

haut (1.1.3.4), le système nerveux sympathique est impliqué dans la régulation de

l’expression du CXCL12 ce qui a un effet sur la mobilisation et le homing des HSC dans la

niche périvasculaire [101].

Plusieurs molécules assurent une communication entre l’environnement des niches et les

HSC soit, N-cadhérine, SCF, V-CAM1, TPO et Ang-1. Ces éléments sont importants dans

la régulation des HSC dans la moelle osseuse [144]. Le facteur de transcription VEGF,

responsable de la néovasculogenèse, est aussi un élément de régulation important de la

niche périvasculaire. Sa présence maintient une différenciation cellulaire finement régulée

alors que son absence stimule très (trop) fortement la différenciation [84]. Les deux

principales voies de signalisation impliquées dans la réponse aux stimuli de ces molécules

par les HSC sont la voie Notch et la voie WNT [145].

Finalement, les adipocytes sont aussi des composantes importantes de la niche.

L’adipogenèse aurait un effet négatif sur les fonctions hématopoïétiques [146]. Aussi, avec

le vieillissement, la moelle osseuse rouge, où se trouvent les niches et où se déroule

l’hématopoïèse, est de plus en plus remplacée par la moelle osseuse jaune, le réservoir

de cellules adipeuses [147]. Le réservoir de HSC dans la moelle osseuse se voit ainsi

réduit au détriment des adipocytes.

Page 33: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

21

1.2.6 HIF-1α Le facteur de transcription Hypoxia Inducible Factor 1 a été découvert en 1992 par

Semenza et al [148]. Cette équipe travaillait sur l’expression du gène de l’érythropoïétine

(EPO) en réponse à l’hypoxie. Il s’est avéré que le promoteur du gène de l’EPO comprend

un élément de réponse à l’hypoxie (HRE) dans sa région 3’. HIF-1, un hétérodimère

composé des sous unités α et β, a été démontré comme étant la protéine capable de se

lier à cette séquence HRE d’ADN en condition hypoxique. Un environnement faible en

oxygène entraine une surexpression de l’EPO et, conséquemment, une augmentation de

l’hématocrite, le pourcentage de globules rouges dans le sang. Cette adaptation

physiologique assure une oxygénation adéquate des tissus malgré une disponibilité

réduite d’oxygène (revue dans [149, 150]).

HIF-1α est la sous-unité de la protéine inductible par l’hypoxie alors que HIF-1β est

présente constitutivement dans la cellule [149]. Ces deux protéines contiennent des motifs

structuraux identiques permettant leur dimérisation ainsi que leur liaison à l’ADN. La sous-

unité α possède aussi un oxygen-depend degradation domain (ODDD) qui permet de

moduler sa stabilité en fonction de l’oxygène disponible [149]. En fait, l’expression et la

synthèse de HIF-1α ne sont pas influencées par la présence d’oxygène et se déroulent en

continu dans la majorité des cellules humaines. Cependant, en présence d’oxygène, HIF-

1α est rapidement dégradée, empêchant alors son accumulation. Cette dégradation est

dépendante de l’ODDD qui, en présence d’oxygène est hydroxylé, reconnu par une

ubiquitine ligase et dégradé par le protéasome. En absence d’oxygène, le ODDD est

phosphorylé et transloqué au noyau où HIF-1α peut se dimériser avec HIF-1β et se lier au

HRE [149]. La détection de HIF-1α augmente de façon exponentielle lors d’une dose

réponse décroissante à l’oxygène. Cependant, la demi-vie de HIF-1α est d’environ 5

minutes, ce qui rend la protéine très difficile à détecter en condition d’oxygène

atmosphérique [151].

Plusieurs centaines de gènes ont, à ce jour, sont influencés par l’expression de HIF-1α

[84]. Ces gènes sont, entre autres, impliqués dans le métabolisme du glucose,

l’angiogenèse, la prolifération et la survie cellulaire. Chez les HSC qui se trouvent dans un

environnement faible en oxygène, HIF-1 est un élément de régulation important. Un

modèle murin a montré que l’expression de HIF-1α contribuait à maintenir les cellules

dans un état de quiescence [152]. Les HSC quiescentes qui se trouvent dans la niche

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endostéale possèdent peu de mitochondries et favorisent la glycolyse à la respiration

anaérobique, ce qui est aussi finement régulé par HIF-1α. L’expression de HIF-1α protège

les HSC du stress oxydatif mais ne semble pas être influencée par la progression dans le

cycle cellulaire. Les HSC activées et les progéniteurs expriment moins fortement HIF-1α

car les ROS générés par le stress oxydatif stimulent la différenciation et la prolifération des

cellules (revue dans [149, 150]). Il a été postulé que l’état physiologique d’hypoxie des

HSC pourrait être régulé par des mécanismes cellulaires spécifiques et non par le niveau

d’oxygénation des tissus puisqu’une étude a montré que l’expression de HIF-1α ne semble

pas dépendante de la localisation des HSC dans la moelle osseuse [153]. D’ailleurs, une

étude avec des cellules CD34+ mobilisées et incubées durant plusieurs heures en

conditions atmosphériques a montré qu’elles conservaient leur expression de HIF-1α

[154].

1.3 Thérapie cellulaire et bonnes pratiques de fabrication

La médecine laisse de plus en plus de place à la biologie au détriment de la chimie. On

trouve «des solutions biologiques aux problèmes biologiques» [1]. Cette transition offre

davantage de possibilités pour des traitements personnalisés et par conséquent, offre un

meilleur pronostic pour les patients. Alors que le début de la biologie moléculaire dans le

domaine pharmaceutique remonte au développement de l'insuline recombinante dans les

années 1980 [155], la biologie cellulaire est présente depuis déjà plusieurs décennies

mais l'utilisation de son plein potentiel est très récent. En fait, la thérapie cellulaire se

définit comme l'injection de cellules vivantes chez un patient dans le but de restaurer une

fonction biologique (www.asgct.org). Plus de 600 études cliniques impliquant des produits

de thérapie cellulaire sont actuellement en cours dans le monde, elles peuvent être

consultées sur le site de www.clinicaltrials.gov.

La transfusion de sang, maintenant devenue une intervention de routine, a été le premier

exemple de thérapie cellulaire. La transplantation de moelle osseuse et de sang de cordon

sont aussi des exemples de thérapies cellulaires maintenant approuvées par les agences

réglementaires pharmaceutiques. Plus récemment, la thérapie cellulaire explore de

nouveaux types de cellules et de nouvelles stratégies qui incluent l'isolement et l’extraction

de cellules pour le transfert d'une sous-population cellulaire précise, la reprogrammation

des cellules ou encore l'expansion ex vivo du nombre de cellules avant l’injection [3].

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23

Toutes ces nouvelles thérapies doivent se conformer à des normes de bonnes pratiques

de fabrication pour la production de matériels cellulaires, cependant ces normes sont

complexes, souvent calquées sur celles des médicaments et ne sont pas encore bien

établies en ce qui concerne les produits cellulaires établies [156]. Néanmoins, il est clair

que l'introduction d'éléments xénogènes dans le processus de fabrication est à éviter pour

faciliter l’approbation d’un produit cellulaire par les instances réglementaires [157, 158].

La culture cellulaire constitue de plus en plus un passage obligé en thérapie cellulaire peu

importe la stratégie thérapeutique visée. Le milieu de culture utilisé permet de reproduire

le microenvironnement in vivo des cellules en respectant les paramètres physicochimiques

tels que les nutriments, le pH et l’osmolarité. Les milieux de culture de base assurent le

maintien de ces paramètres, mais requièrent d’être enrichis en facteurs solubles d’origine

sérique pour permettre la croissance et/ou la différenciation des cellules en culture. Dans

un cadre de recherche, le sérum d'origine bovine est le supplément le plus utilisé en

culture cellulaire [159]. Cependant, la composition du sérum bovin est chimiquement

indéfinie et peut même contenir des toxines ou des agents infectieux comme le prion

[160]. De plus dans un cadre de thérapie cellulaire chez l'humain, les protéines animales

peuvent être immunoréactives et causer des réactions secondaires indésirables [161].

La nécessité de trouver une alternative au sérum bovin est donc évidente. L'option de

remplacer le sérum bovin par du sérum humain a été étudiée [162]. Il demeure néanmoins

que la composition du sérum humain est chimiquement indéfinie et est très variable entre

les lots, ce qui est non-souhaitable dans un contexte réglementaire. L'option la plus

exploitée est de remplacer le sérum par un mélange chimiquement défini de composantes

biologiques. Des compagnies commercialisent des milieux exempts de xénogènes telles

que StemCell Technologies avec le StemSpan et le X-Vivo. Toutefois, la composition

détaillée demeure difficile à obtenir de la part du manufacturier et ne peut donc pas être

modulée en fonction de nos besoins. De ce côté, les travaux de notre équipe ont permis

d'optimiser, un milieu de culture sans protéine animale entièrement défini qui pourra être

bonifié pour la culture des cellules souches [163-165].

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1.3.1 Expansion in vitro et ex vivo de HSC Depuis une vingtaine d'années, la communauté scientifique se questionne sur la capacité

de cultiver des HSC ex vivo dans le laboratoire afin d’en augmenter la quantité et la qualité

[166]. Beaucoup d'efforts ont été investis en ce sens dans les deux dernières décennies

pour permettre un transfert de cette technologie en thérapie cellulaire. Cependant,

l'expansion de HSC et le succès d'une greffe avec des HSC modifiées par la culture ex

vivo requièrent plusieurs considérations pour devenir une thérapie cellulaire.

La principale difficulté rencontrée avec la culture de HSC est la perte de la multipotence

due à la différenciation des cellules lors de leur expansion. En général, la culture de HSC

permet de générer beaucoup de progéniteurs et de précurseurs hématopoïétiques qui

assurent une prise de greffe à court terme seulement alors que les HSC primitives,

assurant le réservoir de HSC et la prise de greffe à long terme, sont perdues [167]. Les

travaux pour minimiser la perte des cellules multipotentes touchent absolument tous les

paramètres de la culture dont, le milieu de culture, la combinaison et la concentration des

cytokines, la co-culture avec d’autres types de cellules, la température, le niveau

d’oxygène et de dioxyde de carbone. Les types de systèmes de culture stationnaire ou en

bioréacteur, la pureté de la population cellulaire initiale et la qualité des cellules sont tout

aussi importants.

Malgré beaucoup d’efforts pour en améliorer tous les paramètres, il demeure que les

études satisfaisantes sont difficiles à obtenir. C'est pourquoi les études cliniques avec des

produits d'expansion de HSC se montrent jusqu'à maintenant peu convaincantes (revue

dans [167]). Cependant, des récent travaux de l'équipe de Dr Guy Sauvageau ont permis

montrer l'efficacité d'une petite molécule, UM171, à maintenir les HSC primitives en

culture [168]. UM171, une aryl hydroxylase, s'est montré efficace pour l'expansion de

cellules CD34+CD45RA-CD38- du sang de cordon. Des essais cliniques sont

présentement en cours chez 25 patients dans quatre centres hospitaliers du Canada. En

plus d'augmenter considérablement le nombre d'unités de sang de cordon admissibles à

la mise en banque, cette molécule pourrait révolutionner le traitement de la leucémie et

d'autres maladies du sang.

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25

1.3.2 Analyse à l’échelle cellulaire (single cell analysis) Le single-cell analysis se définit comme étant l’étude individuelle des cellules provenant

d’un ensemble [169, 170]. Cette méthode d’analyse se veut plus représentative des tissus

multicellulaires dont les cellules peuvent présenter une grande hétérogénéité

populationnelle. En fait, le comportement particulier d’une sous-population peut être

restreint à un faible nombre de cellules et donc difficile à déceler lorsqu’une population est

étudiée dans son ensemble. De plus, lors d’une analyse globale le résultat représente une

moyenne de l’ensemble et la variation à l’intérieur même de la population n’est pas

considérée. Le single cell analysis assure de considérer individuellement chaque cellule.

Actuellement, ce type d’analyse se reflète surtout dans des méthodes complexes telles

que la microscopie à haute résolution ou la quantification d’ARN en cellules isolées.

En thérapie cellulaire, l’application des bonnes pratiques de fabrication (BPF) est

essentielle. Un critère très important des BPF pour la relâche du produit est l’identification

du produit [171]. Ces tests d’identification sont généralement faits par cytométrie en flux

où l’expression de marqueurs précis est attendu sur un pourcentage défini de cellules

[156]. Typiquement, les normes demandent de confirmer qu’un marqueur cible est présent

sur plus de 90% des cellules pour en assurer la pureté. Les analyses de cytométrie

peuvent cibler plusieurs paramètres, permettent d’identifier très spécifiquement les cellules

et de visualiser leur hétérogénéité. Par exemple, il est possible de faire des analyses

permettant l’acquisition simultanée de 8 paramètres fluorescents en plus de la taille et de

la granularité pour chaque cellule, générant ainsi des centaines de milliers de données

pour une seule analyse. L’analyse de ces données de cytométrie en flux s’effectue grâce à

des logiciels, qui la plupart du temps, représentent chaque cellule en fonction de l’intensité

dans un diagramme en 2-D (XY) en utilisant seulement deux marqueurs à la fois. C’est

alors l’opérateur qui doit rechercher par des analyses séquentielles et hiérarchiques les

sous-populations dans l’ensemble des données. Par exemple, pour une analyse

comportant 8 marqueurs un total de 256 diagrammes peut-être générés. L’analyse d’une

grande quantité de données requiert beaucoup de temps, implique une stratégie d’analyse

qui dépend grandement de l’utilisateur et rend difficile ou impossible l’identification de

populations cellulaires rares ou inattendues. Ces éléments pourraient d’ailleurs être à

considérer lors de développement de méthodes d’analyses applicables dans un contexte

BPF. Afin de pallier cette difficulté, des outils d’analyses des données de cytométrie en

single-cell peuvent être utilisés.

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Cytobank est une plateforme permettant «l’organisation, l’analyse et la visualisation de

single cell data obtenu par cytométrie en flux et par cytométrie de masse

(www.cytobank.org). Parmi les outils d’analyse disponibles via cytobank.org, SPADE

(Spanning Progression-tree Analysis of Density normalized Events) permet de regrouper

en nœud les cellules ayant des phénotypes semblables et les relient ensemble sous forme

d’arbre [172]. Pour ce faire SPADE utilise une équation de prévision de la densité locale et

l’algorithme de Boruvka. SPADE élimine le biais d’analyse engendré par l’utilisateur et

permet de visualiser tous les paramètres en un coup d’œil. De plus, l’outil SPADE permet

de voir des populations cellulaires rares non soupçonnées et de comparer rapidement des

marqueurs entre différentes conditions. SPADE se rapproche de l’analyse des données en

single-cell comparativement à l’analyse classique, mais étant donné qu’il regroupe

ensemble les cellules semblables, une véritable résolution en single-cell n’est pas

obtenue. Chaque population cellulaire déterminée en nœud par le logiciel est analysée

comme un tout.

viSNE, le plus récent logiciel ajouté à la plateforme de Cytobank, permet d’améliorer la

résolution en single-cell pour les analyses des données de cytométrie en flux [173]. viSNE

procède à un échantillonnage proportionnel des évènements et crée une cartographie en

deux dimensions de l’ensemble des cellules selon l’algorithme t-SNE (t-Distributed

Stochastic Neighbor Embedding, pour plus de détail sur l’algorithme voir [174]). Les

paramètres T-SNE1 et T-SNE2 permettent de représenter les cellules selon leur

disposition spatiale entre elles et un paramètre de couleur permet la visualisation de

l’expression des marqueurs. Comme chaque évènement représente une cellule, une

véritable analyse en single-cell est possible. De plus, tout comme SPADE, la détection de

populations cellulaires rares est facile, le biais d’analyse de l’utilisateur est éliminé et la

visualisation s’effectue en un coup d’œil.

Par leur résolution d’analyse fine et précise, SPADE et viSNE sont des outils qui

permettent de suivre avec précision l’évolution des populations cellulaires et qui pourraient

s’avérer très utiles pour l’identification d’un produit dans un contexte BPF de thérapie

cellulaire.

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2 Hypothèse

Face à la croissance exponentielle de l’utilisation de la thérapie cellulaire dans la

médecine moderne, nous croyons que les cellules souches et progéniteurs du sang

d’adultes en santé et non-mobilisés représentent un potentiel fort intéressant et très

accessible pour la transplantation. Nous suggérons ainsi qu’il est possible de mettre au

point un système de culture permettant l’expansion de ces cellules en reproduisant le

microenvironnement hypoxique de la moelle osseuse.

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3 Objectifs

Quatre grands objectifs sont fixés pour ce projet:

A. Caractériser les contenus en cellules souches et progéniteurs des chambres LRS

Déterminer la capacité de formation de colonies en milieu semi-solide

(Methocult)

Effectuer le profilage des phénotypes par cytométrie en flux

B. Améliorer la composition du milieu animal-free protein medium (APFM) et le

cocktail de cytokines pour favoriser l’expansion de progéniteurs diversifiés :

Retirer les composantes favorisant la lignée érythroïde

Ajouter des éléments favorisant les monocytes et les granulocytes

C. Évaluer l’impact du microenvironnement hypoxique sur les cellules

Déterminer l’effet du niveau d’oxygène sur la viabilité et l’expansion

Mesurer la capacité des cellules à répondre aux conditions hypoxiques

D. Caractériser la différenciation en progéniteurs suite à l’expansion ex vivo via

différentes analyses fonctionnelles :

Déterminer la capacité de formation de colonies en milieu semi-solide

(Methocult)

Effectuer le profilage des phénotypes par cytométrie en flux avec analyse

multiparamétrique grâce au logiciel Spanning Tree progression analysis of

density-normalized events (SPADE)

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4 Matériels et méthodes

4.3 Sources des cellules

4.3.1 Isolation des leucocytes à partir de sang frais des chambres de

leucoréduction

L’approbation par le comité d’éthique d’Héma-Québec a été obtenue pour la réalisation de

ce projet. Tous les participants à cette étude sont des sujets adultes en bonne santé.

Chacun d’eux a signifié son accord pour la participation à ce projet en apposant sa

signature sur un formulaire de consentement éclairé avant chaque prélèvement d’un

échantillon de sang.

Ces échantillons de sang ont tous été prélevés lors des dons de plaquettes. Cette

procédure, nommée thrombaphérèse, effectue directement la leucoréduction du produit

sanguin grâce au système Trima Accel (Gambro BCT, Lakewood, CO, É.-U.) Les cellules

mononuclées (PBMC) sont retenues dans les chambres de leucoréduction (chambre LRS)

et c’est à partir du contenu de ces chambres que les PBMC sont isolées. Entre le

prélèvement et l’isolement, les chambres sont conservées à TP et le délai de traitement

n’a jamais excédé 6h. Ces chambres renferment approximativement 800x106 cellules et

contiennent les proportions normales des grandes populations sanguines [112].

Afin de récupérer les PBMC, les chambres LRS ont été vidées de leur contenu avec une

solution de rinçage composée de PBS-glucose-ACD (PBS(Phosphate Buffer Saline) : 10

mM K2PO4 et 136 mM NaCl, pH 7,4 (Invitrogen, Burlington, ON, Canada); 8 g/L glucose

(Sigma-Aldrich Inc, Oakville, ON, Canada); ACD (anticoagulant-citrate-dextrose) : 10%

(v/v) (Baxter Healthcare Corp, Deerfield, IL, É-U)). La suspension de PBMC a été déposée

sur un coussin de Ficoll-Hypaque (GE HealthCare Biosciences, Baie-d’Urfé, QC, Canada)

et a été centrifugée pendant 8 minutes à 1000g sans frein. L’interface composée des

PBMC a ensuite été récupérée, lavée avec la solution de rinçage et le culot cellulaire a été

remis en suspension à une densité cellulaire de 100x106 cellules/mL dans du milieu de

congélation composé à 50 % d’IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium, Life

Technologies, Burlington, ON, Canada), 40 % de FBS (fetal bovine serum, Life

Technologies) et à 10 % de DMSO (diméthysulfoxyde, Sigma-Aldrich). Les PBMC ont

ensuite été congelées à -80°C durant environ 18 heures dans un système de congélation

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CoolCell LX (Biocision, Mill Valley, CA, É.-U.) permettant une diminution contrôlée de la

température à raison de -1°C par minute, puis transférées dans l’azote liquide.

4.3.2 Isolement des cellules souches CD34+ à partir des PBMC congelées Les PBMC ont été rapidement décongelées dans un bain-marie à 37°C jusqu’à une

consistance à moitié fondue (aspect slushy) et déposées dans une solution froide de

tampon PBS additionné de 50% FBS. La suspension cellulaire a ensuite été centrifugée à

233 x g pendant 6 minutes. Les cellules ont été mises en suspension dans un tampon

PBS contenant 1 mM EDTA (Fischer Scientific, ON, Canada) et entre 1% à 4% d’albumine

humaine(HSA) (CSL-Behring/Héma-Québec, QC, Canada), à une densité de

5 x 107 cellules/ml. Les cellules souches CD34+ ont été isolées par sélection positive en

utilisant la trousse EasySep (Human CD34 Positive Selection) (StemCell Technologies,

Vancouver, CB, Canada) selon les instructions du manufacturier. Les cellules souches

CD34+ avaient une pureté égale ou supérieure à 90%, déterminée par des analyses de

cytométrie en flux (section 4.2.4).

4.4 Culture cellulaire

4.4.1 Condition de culture Les cellules CD34+ ont été cultivées à une densité cellulaire variant entre 40 000 à

100 000 cellules/ml. Les cultures se sont déroulées sur une période de 7 à 12 jours dans

un environnement à 37°C et 5% de CO2. Deux principales conditions de concentration en

oxygène ont été étudiées soit une condition de normoxie à 21% O2 et une condition en

hypoxie à 8% O2 (Incubateur Heracell 150i, Thermo Scientific). Certains essais ont été

réalisés à 3% O2. Un ajustement de la densité cellulaire et un renouvèlement du milieu de

culture ont été effectués au minimum à tous les 4 jours. Les cellules ont été mises en

culture dans des plateaux de 24 puits ou de 6 puits (BD Falcon) ou dans des flacons T25

(Corning, NY, É-U), dépendamment du volume de culture. Les essais dans un

environnement à faible adhérence ont été réalisés dans les plateaux 6 puits Ultra-low

attachment (Corning).

4.4.2 Milieu de culture Les cellules CD34+ ont été cultivées dans un milieu défini exempt de protéines animales

(APFM, Animal protein free medium). Ce dernier est composé d’IMDM additionné de

10 μg/ml d’insuline (Life Technologies), de 20 µg/ml LDL (StemCell Technologies), de

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31

200 µg/ml d’holotransferrine (BD, Mississauga, ON, Canada), de 250 μg/ml de HSA, de

100 μM de Trolox (Sigma-Aldrich), et de 0,125% d’un mélange lipidique défini (LP-1,

(Sigma-Aldrich). Les composantes du LP-1 sont les suivantes : 2 μg/ml d’acide

arachidonique, 10 μg/ml des acides linoléique, linolénique, myristique, oléique, palmitique

et stéarique, 220 μg/ml cholestérol, 2,2 mg/ml Tween-80, 70 μg/ml d’acétate de tocophérol

et 100 mg/ml d’acide pluronique F-68. Toutes les composantes du milieu sont d’origines

humaines ou recombinantes. Lorsque spécifié, le facteur de croissance insulin-like long

R3 humain recombinant (Sigma-Aldrich) a été utilisé à une concentration de 15 ng/mL. Ce

milieu a été supplémenté de cytokines au cours des cultures cellulaires : SCF à 10 ng/ml,

Flt-3L à 25 ng/ml, TPO à 30 ng/ml, IL-6 à 20 ng/ml et de lL-3 à 20 ng/ml (Tous de

Peprotech, Rocky Hill, NJ, États-Unis). Des essais avec du GM-CSF (Peprotech) à

10ng/ml ont aussi été réalisés, ainsi qu’avec du N-acétylcystéine (NAC, (Sigma-Aldrich)) à

une concentration de 10 mM.

Le milieu de culture maison APFM a été comparé avec un milieu sans sérum commercial.

Il s’agit du milieu StemSpan-ACF de StemCell Technologies, subséquemment nommé

StemSpanTM dans le texte. La composition exacte de ce milieu n’est pas divulguée par le

manufacturier, nous savons seulement qu’il ne contient que des protéines recombinantes

et des composants synthétiques. Le même mélange de cytokines que pour le milieu

APFM était ajouté à ce milieu.

Les milieux de culture étaient toujours conservés à 4°C et ce, pour une durée maximale de

10 jours. Néanmoins, le milieu de culture a toujours été pré-équilibré aux tensions en

oxygène désirées avant de mettre les cellules en culture ou d’effectuer un renouvèlement

du milieu. Pour ce faire, le volume requis de milieu était séparé en deux et placé dans

deux flacons ventilés T75 (Corning) : un pour la condition 21% O2 et l’autre pour la

condition 8% O2. Chacun des flacons était placé dans leur incubateur respectif à 37°C et

5% CO2 pour une durée minimale de 18h. Bien que la condition à 21% O2 n’ait pas besoin

d’être pré-équilibrée dans l’incubateur puisque la pression atmosphérique d’oxygène

correspond à 21%, les deux conditions ont été traitées de la même façon pour éliminer un

biais de procédure.

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32

4.4.3 Suivi de la viabilité et de l’expansion Lors de chacun des prélèvements de cellules, des comptes cellulaires ont été réalisés en

triplicata avec un hématimètre (Hausser Scientific, Horsham, PA, É-U). Le pourcentage de

viabilité a été déterminé par exclusion au bleu de trypan 0,4% (v/v) (Gibco by Life

Technologies). Le facteur d’expansion final a été obtenu en multipliant le taux de

prolifération obtenu à chaque compte.

4.4.4 Transition hypoxique Les cultures de cellules CD34+ ont été débutées à une tension d’oxygène de 21%. Après

6 ou 7 jours, les cellules ont été divisées en deux volumes égaux et centrifugées à 233g

pendant 6 minutes. Le surnageant a été retiré et les cellules ont été remises en

suspension à une densité cellulaire variant entre 1x105 et 1x106 cellules/ml dans du milieu

frais pré-équilibré à 21% ou à 8% O2. Les cellules ont été ensuite placées dans leurs

incubateurs respectifs pour une durée de 24h ± 1h.

4.5 Détermination du potentiel progéniteur en milieu semi-solide

Le milieu Methocult Optimum H4034 (StemCell technologies) a été utilisé pour déterminer

le potentiel progéniteur des échantillons de culture. Ce milieu semi-solide est constitué de

méthylcellulose et contient toutes les cytokines requises afin de permettre aux cellules

souches progénitrices de proliférer et de former des colonies (Colony forming unit, CFU),

Chaque colonie correspondant à une cellule de départ. Quatre types de colonies peuvent

être différenciées les unes des autres par différents traits caractéristiques [175], soit les

BFU-E (Burst Forming Unit-Erythroid; progéniteur érythroïde précoce), les CFU-E (CFU-

Erythroid; progéniteur érythroïde plus engagé), les CFU-GM (CFU-Granulocytes-

Macrophages; progéniteurs myéloïdes) et les CFU-GEMM (CFU-Granulocytes-Erythroids-

Macrophages-Megakaryocytes;progéniteur multipotent) (Figure 4.1). Les cellules CD34+

fraîchement isolées et le produit d’expansion final ont donc été cultivés dans le milieu

Methocult pour un période de 14 jours à 37°C 5%CO2 et 21% O2. Pour ce faire 1000

cellules CD34+ (selon le compte manuel en triplicata) ont été placées dans 1,5 mL de

Methocult. Après avoir bien agité le mélange et laissé reposer une trentaine de minutes, le

milieu contenant les cellules a été déposé dans un pétri de 35 mm (BD Falcon). Après 14

jours, les colonies ont été énumérées avec un microscope optique à un agrandissement

200x. Les types de colonies ont pu être distingués les unes des autres selon les consignes

et représentation visuelle de Stem Cell Technologies [175, 176].

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33

Figure 4.1 Phénotype visuel des CFU

4.6 Analyse phénotypique

4.6.1 Anticorps et panel d’anticorps Le tableau 4.1 contient la liste de tous les anticorps qui ont été utilisés dans cette étude

pour effectuer les analyses de cytométrie en flux et pour identifier les cellules. Tous les

anticorps étaient des IgG monoclonaux de souris couplés à des molécules fluorescentes.

Ils ont tous été utilisés selon les instructions du manufacturier, à l’exception du marqueur

de viabilité 7-amino-actinomycin D (7AAD) qui a été utilisé à 10 μL/test afin d’en minimiser

le chevauchement sur les autres marqueurs fluorescents.

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34

Tableau 4.1 - Liste des anticorps utilisés dans les différents marquages extracellulaires

Fluorochrome Cible Clone Fournisseur

HSC MPP CMP GMP GR Mono MEP Mk Ery

FITC

CD45 HI30 Beckman low + + + + + +

CD45RA HI100 BD + + +

CD33 HIM3-4 BD + + + + low/neg

CD34 581 Beckman + + + + +

CD244 2-69 Beckman + + + +

PE

CD34 581 BD + + + + +

CD235a HIR2 BD +

CD123 6H6 eBioscience low + +

7AAD Viabilité S/O Beckman

PeCy7 CD13 WM15 BD + + + + +

CD71 OKT9 eBioscience + low

APC CD133 293C3 Miltenyi +

CD14 M5E2 BD + +

Alexa647 CD135 4G8 BD low +

APC H7 CD45 2D1 BD low + + + + + +

BV421 CD38 HIT2 BD + + + + + +

eFluor450 CD38 HB7 eBioscience + + + + + +

BV510 CD90 5E10 BD +

CD41a HIP8 BD +

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35

4.6.2 Marquage extracellulaire

4.6.2.1 Suivi des cellules CD34 dans les échantillons

Les pourcentages de cellules CD34 dans les PBMC fraîchement isolées et dans les

cultures ont été déterminés avec un protocole de « gating » inspiré du protocole de la

International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) [177](Figure

4.2). Les cellules ont été marquées avec les anticorps CD45 FITC, CD34 PE et 7AAD

directement dans le milieu de culture pour une durée de 15 minutes. Une dilution

subséquente avec du PBS a été réalisée pour atteindre un volume finale de 500 µl. Les

données ont été acquises avec l’appareil BD Accuri C6 immédiatement après le

marquage, sans lavage. L’expansion spécifique des cellules CD34+ a été déterminée en

utilisant le pourcentage de cellules positives établi avec le marquage de surface CD34 et

les valeurs de l’expansion totale.

Figure 4.2 Stratégie de gating adapté du protocole ISHAGE Les cellules CD34 des échantillons de PBMC fraîches (A), de cellules CD34 fraîchement isolées (B) et de cellules CD34 en culture (C) ont pu être suivies avec cette stratégie de gating. Le pourcentage de cellules CD34+ a été obtenu en divisant le nombre de cellules de P3 sur le nombre de cellules de R3 (PBMC) ou P2 (Cellules isolées). R2 : Cellules vivantes, R3 et P2 : Leucocytes, P1 : Cellules CD34+, R4: Cellules souches et progénitrices, P3 : Cellules souches et progénitrices (confirmation par taille et granularité)

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36

4.6.2.2 Marquage des échantillons de cellules décongelées

Les cellules ont été décongelées dans un bain-marie à 37°C puis transférées goutte à

goutte dans 12 ml d’une solution froide de PBS-glucose contenant 50% de FBS et 5 mM

EDTA. Les cellules ont été centrifugées à 233 x g pendant 6 minutes et remises en

suspension dans le milieu APFM, sans cytokines mais en présence de 5 mM EDTA. Les

cellules ont été laissées au repos pendant une heure à 37°C 5% CO2 et 21% O2. Ensuite,

les cellules ont été centrifugées à 233 x g pendant 6 minutes et remises en suspension

dans du PBS 1% BSA (Fisher Scientific) avec 5% sérum de souris (Jackson

Immunoresearch). Les combinaisons de 5 à 6 anticorps et d’un marqueur de viabilité ont

été ajoutées aux cellules pour une période de 15 à 30 minutes à TP et à l’abri de la

lumière. Les cellules ont ensuite été lavées et remises en suspension dans le PBS 1%

BSA. L’acquisition des données s’est effectuée dans un intervalle de temps maximal de 2h

suivant le marquage.

4.6.2.3 Marquage des isolats de cellules CD34+ en culture

Le protocole de marquage pour les cellules en culture a été identique au protocole de

marquage sur les PBMC décongelées pour les étapes subséquentes au repos de 1h.

4.6.3 Acquisition et analyses des données

L’acquisition des données a été effectuée avec le cytomètre en flux CyFlow ML et le

logiciel FlowMax 3.0 (Partec, Münster, Germany). Pour les marquages extracellulaires sur

les PBMC décongelées, un minimum de 400 évènements CD45lowCD34+ vivantes a été

acquis dans une région préalablement établie. Dans le cas des marquages sur les cellules

en culture, les analyses ont été réalisées sur 20 000 à 50 000 cellules vivantes. Les

doublets ont été exclus en éliminant les évènements ayant un ratio de taille largeur/aire

(FSC-W / FSC-A) trop élevé. Les débris ont aussi été exclus en délimitant une région

correspondant aux cellules. Cette région a été déterminée par la taille (FSC) et la

granularité (SSC). De plus, les cellules mortes ont aussi pu être éliminées en

sélectionnant les cellules négatives pour le 7AAD (Figure 4.3).

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37

Figure 4.3 Stratégie de gating pour l'élimination des doublets, des débris et des cellules mortes

Des billes de compensation (Compbead, BD) ont été utilisées pour éliminer le

chevauchement entre les différents fluorochromes. Les Compbeads ont été marquées

avec chacun des fluorochromes utilisés, individuellement. Elles fournissent des

populations positives et négatives distinctes dont l’émission de fluorescence dans les

canaux non-spécifiques peut être éliminée par un algorithme fourni dans le logiciel

d’analyse FSC Express.

4.6.3.1 FCS Express

Les données ont été analysées avec le logiciel FCS Express version 4 (De Novo Software,

Los Angeles, CA, É.-U.). Ce logiciel permet une analyse en deux dimensions, c’est-à-dire

de deux marqueurs à la fois et permet d’utiliser une hiérarchie de régions qui s’emboitent

afin de cibler spécifiquement les populations cellulaires. Des cellules non marquées

permettent de visualiser le niveau d’autofluorescence des cellules. Des contrôles FMO

(fluorescence minus one) sont utilisés pour distinguer les populations positives des

populations négatives et positionner les quadrants. Les contrôles FMO sont des cellules

qui ont été marquées avec tous les anticorps d’un panel sauf un, un tube FMO est donc

préparé pour chaque anticorps.

4.6.3.2 Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events

Pour l'analyse avec SPADE [172] (voir section 1.3.2 pour plus de détails), une région a été

dessinée autour des cellules vivantes avec FCS Express et sauvegarder sous un fichier

distinct de l'original. Ces fichiers de données brutes obtenus lors des analyses de

cytométrie en flux et la matrice de compensation ont été exportés à la plateforme

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38

Cytobank. Par la suite, un arbre SPADE a été construit avec l’ensemble des données. Les

arbres composés de 100 nœuds ont été construits en fonction de tous les marqueurs à

l’exception du marqueur de viabilité. Afin de situer chaque population dans l’arbre, la

médiane d’intensité de fluorescence (MFI) de chaque marqueur a été considérée.

4.7 Immunobuvardage de type Western

4.7.1 Analyse de la protéine HIF-1α Les cellules ayant subi une transition hypoxique de 24 heures tel que décrit à la section

4.2.5 ont été utilisées afin de déterminer leur contenu en protéine HIF-1α. Les cellules ont

été rapidement mises sur glace et centrifugées à 13000 x g durant 30 secondes à 4°C. Le

culot a été suspendu dans un tampon de Laemmli [178] pour procéder à la lyse cellulaire

complète. Le tampon de Laemmli est composé de Tris HCl à 62,5 mM avec 2% SDS

(EMD Millipore, Etobicoke, ON, Canada), 20% glycérol (Fisher Scientific), 0,01% de bleu

de bromophénol (Sigma-Aldrich), 50mM dithiothréitol (EMD Millipore) et un cocktail

d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Thermo-Fisher). La lyse cellulaire a été

réalisée sur glace pour une durée de 10 minutes. Les lysats ont ensuite été passés au

sonicateur avec une amplitude de 35 Hertz pendant 3 secondes. Les lysats cellulaires ont

été centrifugées à 5000 x g pendant 5 minutes puis le surnageant, contenant les

protéines, a été aliquoté et conservé à -80°C.

Le jour de l’analyse par immunobuvardage, les lysats ont été décongelés sur glace puis

placés dans un bloc chauffant à 95°C pendant 5 minutes pour permettre la dénaturation

des protéines. La séparation des protéines a été réalisée par l’électrophorèse en

conditions dénaturantes. Un gel d’entassement à 3% de polyacrylamide (Amresco, Solon,

OH, É-U) est préparé dans un tampon 65,5 mM Tris pH 6,8 contenant 0,4% (p/v) SDS,

0,04% (v/v) ammonium persulfate (APS) (Sigma-Aldrich), et 0,0016% (v/v) TEMED (GE).

Ce gel est suivi d’un gel de résolution à 8% (v/v) polyacrylamide. Il est préparé dans un

tampon 375 mM Tris pH 6,8 contenant 0,4% (p/v) SDS, 0,07% (v/v) APS (Sigma-Aldrich),

et 0,001% (v/v) TEMED(GE). La migration a été réalisée à 120 volts environ 90 minutes.

Le standard Precision plus protein unstained (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON,

Canada) et des contrôles positifs et négatifs commerciaux soit des lysats de noyaux de

COS-7 induites ou non-induites par choc hypoxique (NOVUS Laboratories, Abigdon, VA,

É-U) ont été déposés sur le gel en même temps que les échantillons. Suite à la migration,

les protéines ont été transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose Hybond ECL

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(GE) en utilisant un système de transfert humide sous agitation à 120 volts durant 1h30 à

4°C. Le tampon de transfert était composé de Tris-Glycine contenant 10% (v/v) méthanol.

Suite au transfert, la membrane a été colorée au rouge de Ponceau pour confirmer le

transfert des protéines sur la membrane puis lavée 3 fois 5 minutes sous agitation à TP

dans du tampon TTBS (Tween (Fisher Scientific) -Tris Buffer Saline). La membrane a

ensuite été bloquée dans une solution de TTBS contenant 5% (v/v) de lait écrémé

(Selection, Montréal, QC, Canada) pour une durée de 1h sous agitation à TP puis lavé tel

que décrit précédemment. Les anticorps de souris anti-HIF-1αhumain (clone 54; BD

Biosciences) anti-GAPDH (clone 6C5; Santa Cruz Biotech, Dallas, Texas, É-U.) et anti-

p84 (Clone 5E10; Abcam Inc, Toronto, ON, Canada) ont été dilués respectivement à 1/500

(0,5 μg/mL), 1/1000 (0,1 μg/mL) et 1/1000 (1 μg/mL) dans la solution de blocage et

incubés selon le cas avec la membrane pour toute la nuit à 4°C (HIF-1α) ou 1h à TP

(GAPDH et p84). La GAPDH a été utilisée comme contrôle de chargement alors que p84

a servi de contrôle de lyse nucléaire. Les membranes ont été lavées 4 fois pendant

5 minutes dans le TTBS. L’anticorps secondaire de chèvre anti-IgG Fc murin couplé à la

peroxydase a été dilué 1/10 000, puis incubé avec les membranes 1h à TP. Les

membranes ont ensuite été lavées 5 fois 5 minutes dans le TTBS. Les bandes de

protéines ont été révélées en chimioluminescence avec la trousse Amersham ECL Prime

(GE) selon les instructions du manufacturier. La détection du signal a été réalisée avec un

appareil ImageQUANT LAS 4000 (GE).Avant chaque nouvel anticorps primaire, la

membrane a été décapée à l'aide de la solution Restore Western Blot Stripping Buffer

(Pierce, Rockford, IL, USA) utilisée selon les directives du manufacturier.

4.8 Analyses statistiques et de corrélation

La distribution normale et l’égalité des variances ont été déterminées pour chaque groupe

de données et les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Graphpad

(Graphpad software, San Diego, CA) et l’établissement des corrélations entre les séries de

données a été réalisé avec le complément Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd., Leeds,

UK) dans le logiciel Excel (Microsoft, Redmond, WA).. Lorsque les tests statistiques se

sont révélés significatifs, la notation suivante a été utilisés dans les figure : *p<0,05,

**p<0,001.

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40

5 Résultats

5.3 Caractérisation des cellules multipotentes contenues dans les

chambres LRS

5.3.1 Quantité absolue et fréquence. Le contenu des chambres LRS (leucoreduction system) présente les proportions normales

des grandes populations de cellules sanguines. Des résultats précédemment obtenus par

notre équipe démontraient que les chambres LRS des appareils Trima-Cobe pouvaient

contenir entre 0.1% et 0.7% de cellules CD34+ soit 1 x 106 à 4 x 106 cellules par unité

[112]. Afin d’évaluer le contenu CD34+ de ces chambres selon un protocole normalisé,

des PBMC fraîchement isolées de 20 unités LRS ont été analysés par cytométrie en flux

avec les normes du protocole ISHAGE [179] (Tableau 5.1).

Une moyenne de 0,177% ± 0,032% de cellules CD34+ ont été trouvées dans les

chambres. Ce pourcentage représente, en moyenne, 2,05x106 cellules par unité LRS. Le

nombre total de cellules CD34+ par unité se situait entre 1,28x106 à 2,81x106 cellules. Il y

avait une faible corrélation observable entre la quantité de cellules CD45+ et CD34+ alors

que la valeur r pour la corrélation de Pearson était de 0,41. Ainsi, seulement 16,8% (r2)

des variations dans le compte des CD34+ peuvent donc être expliquées par des variations

dans le nombre de cellules CD45+ [180].

Tableau 5.1 – Quantité absolue et fréquence des cellules CD34+ obtenues dans les chambres LRS lors d’une procédure de don de plaquettes CD45+

CD34+

Cellules/mL

(x 107)

Cellules/mL

(x 104)

%

Cellules Totales

(x 106/unit) Moyenne ± SEM 1,34 ± 0,11 4,09 ± 0,73 0,177 ± 0,032 2,05 Intervalle (95%IC) 1,12 to 1,57 2,57 to 5,61 0,11 to 0,24 1,28 to 2,81 Médiane 1,26 3,40 0,144 1,70 Vingt unités LRS ont été utilisées pour isoler les PBMC. Les PBMC ont été ensuite immédiatement marquées avec des anticorps couplés à des fluorochromes pour déterminer leur contenu CD45+ et CD34+ par cytométrie en flux selon les normes ISHAGE. La viabilité était supérieure à 99% dans tous les échantillons. La valeur r de la corrélation de Pearson entre le nombre de cellules CD45+ et de cellules CD34+ était de 0,41.

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41

5.3.2 Corrélation entre le moment du prélèvement et le contenu en cellules CD34+

Étant donné que la moelle osseuse est régulée par le système nerveux central et le cycle

circadien [101], nous avons tenté de déterminer si un lien pouvait être établi entre l’heure

du prélèvement et le contenu en cellules CD34+ des échantillons afin de pouvoir optimiser

le moment des prélèvements. L’heure de signature du consentement éclairé, qui

correspond au moment du don de plaquettes et de la récupération des unités LRS, a été

obtenu pour les mêmes 20 unités LRS de la section précédente.

Pour les comptes absolus de cellules CD45+ et CD34+, de faibles corrélations négatives

de -0,27 et -0,37 respectivement ont été obtenues en fonction de l’heure du prélèvement

selon le test de corrélation de Pearson. Cependant, le pourcentage de cellules CD34+ de

l’échantillon démontre une corrélation positive mais faible de 0,38 (Figure 5.1).

Figure 5.1 Corrélation entre l'heure du prélèvement et le contenu des chambres LRS La valeur r de corrélation de Pearson a été obtenue entre l'heure de prélèvement et les différents paramètres du contenu des chambres LRS suite au marquage ISHAGE des PBMC fraîches

5.3.3 Caractérisation phénotypique des cellules CD34+ Dans le but de caractériser la source de cellules de départ des cultures cellulaires, un

phénotypage détaillé des cellules CD34+ récupérées des chambres LRS a été réalisé. Dix

échantillons de PBMC ont été décongelés et marqués avec 14 anticorps couplés à des

fluorochromes et divisés en 3 panels pour cibler les cellules souches, progéniteurs et

engagées vers la différenciation (Tableau 4.1). Chaque panel contenait un anticorps

spécifique à CD34 et un anticorps spécifique à CD45 pour cibler la population de cellules

souches et progéniteurs CD45lowCD34+. Les cellules CD45HIGHCD34+ ont été exclues de

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42

l’analyse car elles représentent majoritairement une proportion de monocytes exprimant

fortement le CD34 [181]. Ces cellules CD45HIGHCD34+ ont été analysées pour les

marqueurs de monocytes CD33+ et CD14+ et elles se sont avérées êtres positives pour

ces deux marqueurs à plus de 90% (données non-montrées).

Après décongélation, la région CD45lowCD34+ correspondait à 0.097% ± 0.013% des

PBMC, ce qui est plus faible que la fréquence des échantillons frais analysés à la section

5.1.1. Dans cette population de cellules CD45lowCD34+, 83,2% ± 2,1% étaient aussi

positives pour le marqueur CD38, indiquant que les cellules étaient dans un état

d’activation [182]. Parmi les cellules CD45lowCD34+ de faibles proportions exprimaient

CD133 (7,5%) ou CD90 (7.9%). En contraste, à l’intérieur de ces deux sous-populations

distinctes, seulement le tiers des cellules étaient positives pour le marqueur CD38, soit

34.9% et 33,5% respectivement pour les cellules CD133+ et CD90+ (Figure 5.2A). Ces

résultats permettent de constater qu’environ 5% des cellules CD34+ des chambres LRS

étaient de véritables cellules souches hématopoïétiques (HSC) capable de régénérer à

long terme tandis que les autres cellules CD34+ sont des progéniteurs multipotents (MPP)

ou engagés vers la différenciation tel que démontré par la présence du marqueur CD38

indiquant leur activation.

La caractérisation des cellules CD45lowCD34+ a été poursuivie en recherchant la présence

de marqueurs de différenciation pour les lignées hématopoïétiques (Tableau 4.1). Ces

combinaisons de marqueurs ont été utilisées dans le but de déceler la présence des

progéniteurs, soit myéloïdes communs (CMP), érythroïde et myéloïdes (MEP),

granulocytes et myéloïdes (GMP) et de cellules effectrices (Figure 5.2B). Les marqueurs

CD135 et CD123, deux étiquettes de CMP, étaient présents sur respectivement 34,8% ±

5,6% et 19,3 ± 9,5% des cellules CD45lowCD34+. De plus, 12,7% ± 6,0% de ces cellules

exprimaient le marqueur CD13 et 21,0 ± 11,5% étaient positives pour le marqueur

CD45RA. Fait à noter, ces deux marqueurs sont généralement absents des CMP mais

exprimés lors de l’engagement dans la voie GMP. Les autres marqueurs de lignées

myéloïdes tels que CD14 et CD33 étaient exprimés sur moins de 10% des cellules.

 

La molécule CD71, récepteur de la transferrine, était le marqueur de différenciation le plus

fortement exprimé sur les cellules CD45lowCD34+ avec une fréquence de 71,5% ± 11,2%

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43

montrant un biais important vers les MEP. Néanmoins, les marqueurs CD235a et CD41a,

caractéristiques des lignées érythroïdes et MK, étaient peu présents sur les cellules

CD45lowCD34+, avec entre 3% et 5% d’expression sur l’ensemble des cellules. En

situation physiologique, l’expression de ces marqueurs est retrouvée sur des cellules

avancées en différenciation [44, 51]. Dans l’ensemble, ces résultats tendent à démontrer

que les progéniteurs CD45lowCD34+ contenus dans les chambres LRS se trouvent

majoritairement à un stade CMP avec une forte tendance à pencher du côté des lignées

érythroïdes et myéloïdes (MEP).

Par ailleurs, moins de 1% (0,07% ± 0,01%) de tous les PBMC analysées étaient des

cellules CD133+CD34-, représentant ainsi une population fortement primitive [23, 26].

Dans cette très petite population, approximativement la moitié (47,8% ± 2,4%) de ces

cellules CD133+CD34- étaient aussi négatives pour le CD45 (données non-montrées). Le

potentiel de cette population n’a pas été approfondi mais elle pourrait être intéressante à

étudier davantage.

Page 56: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

44

Figure 5.2 Caractérisation phénotypique des HSC contenues dans les chambres LRS Les PBMC provenant de 10 chambres LRS ont été décongelées et placées au repos durant 1h avant d'être phénotypées par cytométrie en flux. La fréquence de chacun des marqueurs de cellules souches primitives (A) ou progénitrices (B) a été déterminée sur les cellules CD45lowCD34+

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45

5.4 Expansion ex vivo – Normoxie

5.4.1 Comparaison des milieux sans sérum

5.4.1.1 Expansion et viabilité

Les cellules CD34+ fraîchement isolées ont été mises en culture dans deux différents

milieux de culture sans sérum; le milieu maison APFM (avec IGF-1) et le milieu

commercial StemSpan. Le but de ces essais était de comparer l’efficacité de notre milieu

défini à permettre l’expansion des cellules CD34+ avec un milieu de culture commercial

développé spécifiquement pour la culture des HSC. Les cultures cellulaires ont été

réalisées avec six donneurs différents et se sont déroulées à 21% O2 sur une période de 7

jours. Bien que les cellules CD34+ se cultivent en suspension, deux types de plateaux de

cultures ont été utilisés, un plateau de plastique standard et un autre à faible adhérence,

afin d’évaluer si l’inhibition des signaux d’adhérence pouvait favoriser l’expansion [183]. La

pureté en cellules CD34+ a été confirmée par la stratégie de gating ISHAGE et était

supérieure à 90% au jour 0 dans tous les essais. La viabilité cellulaire au départ des

cultures était supérieure à 97% selon les deux techniques utilisées soit, le compte au bleu

de trypan et le marquage au 7-AAD.

La viabilité moyenne a pu être maintenue au dessus de 90% dans toutes les conditions

expérimentales jusqu’au jour 4. Toutefois, une légère baisse de la viabilité, se situant entre

79% et 84%, a été observée au jour 7 (Figure 5.3 E, F). Suite aux 7 jours de culture dans

les plateaux standards, il a été observé qu’en moyenne des taux d’expansion en milieu

maison APFM étaient de 20,2 fois et de 7,1 fois pour les cellules CD45+ et les cellules

CD34+ respectivement. En milieu Stemspan, des taux de 8,6 fois pour les cellules CD45+

et de 3,3 fois pour les cellules CD34+ ont été notés (Figure 5.3 A, B). Le taux d’expansion

pour les cellules CD45+ au jour 7 en APFM était significativement plus haut que dans le

milieu StemSpan au même jour (p=0,0468, Student t-test non-pairé); il en était de même

pour les CD34+ (p=0,0449, Student t-test non-pairé).

Les cultures dans les plateaux à faibles adhérences ont montré des courbes d’expansion

très similaires (Figure 5.3 C, D). Les taux d’expansion étaient similaires pour les cellules

CD45+ et CD34+ au jour 4, tel qu’observé d’ailleurs pour les plateaux standards, par

contre les taux d’expansion pour les cellules CD45+ augmentaient à des niveaux plus

élevés en APFM qu’en StemSpan. Néanmoins la tendance observée ne correspondait pas

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46

à une différence significative entre ces deux milieux de culture (CD45+: p=0,2679 ;

CD34+: p=0,2678, Student t-test pairé). De plus, aucune différence significative n’a pu être

démontrée entre les deux types de plateaux de culture et ce, autant pour les cellules

CD45+ que les cellules CD34+ suite à une analyse one-way-ANOVA.

Ces résultats permettent d’affirmer que le milieu maison APFM développé par notre

laboratoire est efficace pour soutenir la culture de cellules souches et progéniteurs CD34+

se trouvant dans les chambres LRS. La caractéristique adhérente ou non des plateaux ne

semble pas influencer l’expansion et la viabilité des cellules et c’est pourquoi les cultures

subséquentes seront réalisées en plateaux standard.

5.4.1.2 Phénotype des cellules

Suite aux 7 jours de culture, les cellules ayant subi l’expansion dans les deux milieux de

culture et uniquement les plateaux standards ont été analysées pour leur phénotype par

cytométrie en flux. Pour ces essais, les anticorps ciblant CD45, CD34, CD38, CD133 et

CD90 ont été utilisés pour comparer les cellules obtenues en fin de culture.

Environ les deux tiers, 66,3±8,9 %, des cellules cultivées en milieu APFM exprimaient

toujours le marqueur CD45 comparativement à 76,4± 11,8 % en milieu StemSpan. Parmi

ces cellules exprimant CD45 au jour 7, 16,2% ± 4,2 % et 22,0% ± 5,5 % pour APFM et

StemSpan respectivement avait conservé l’expression du marqueur CD34. Parmi les

cellules CD45+CD34+, environ 65% des cellules dans les deux conditions étaient

positives pour le marqueur CD38. Au sein de ces dernières, la fréquence de cellules

positives pour les marqueurs CD90 ou CD133 était de moins de 2% autant en milieu

APFM qu’en milieu StemSpan (Figure 5.4. Pour chacun des marqueurs analysés, aucune

différence statistiquement significative n’a pu être décelée entre les deux milieux de

culture.

Dans l’ensemble ces résultats montrent une importante différenciation des cellules

progéniteurs hématopoïétiques suite à 7 jours de culture. La diminution de la présence

des marqueurs de cellules souches soit, CD34, CD90 et CD133, indique que les cellules

étaient de plus en plus engagées vers des fonctions de cellules effectrices. La baisse de la

fréquence de cellules CD38+ pourraient indiquer une différenciation vers les lignées

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47

érythroïdes et MK [184] ou un manque de signaux d’activation pour les cellules générées

[185]. L’importante diminution du marqueur CD45 semble pour sa part indiquer une forte

orientation dans la lignée MEP [42]. Par ailleurs, la comparabilité des deux milieux pour le

phénotype confirme l’efficacité du milieu maison APFM à permettre l’expansion et la

différenciation des cellules CD34+ au même titre qu’un milieu commercial d’une

compagnie spécialisée dans le domaine des cellules souches, soit Stem Cell technologies.

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48

Figure 5.3 Culture de cellules CD34 en milieux sans sérum maison APFM (A, C, E) et commercial StemSpan (B, D, F) dans des plateaux standards (A, B) ou à faible adhérence (C, D) Les données sont représentées comme étant la moyenne ± SEM (StemSpan-CTRL n=7, APFM-CTRL n=6, StemSpan et APFM - low n=5)

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49

Figure 5.4 Comparaison du phénotype obtenu après culture avec deux milieux sans sérum Les cellules ont été cultivées durant 7 jours, soit en milieu APFM (n=6) ou SS (n=7) et caractérisées par cytométrie en flux

5.4.1.3 Détermination du potentiel progéniteur

Les cellules CD34+ fraîchement isolées ainsi que les cellules obtenues après les 7 jours

de culture de trois différents donneurs ont été cultivées en milieu semi-solide à base de

méthylcellulose contenant du sérum bovin et les facteurs solubles suivants : Stem Cell

Factor, GM-CSF, G-CSF, IL-3 et érythropoïétine (Methocult). La croissance de colonie en

milieu semi-solide s’est déroulée sur 14 jours et les colonies (colony forming unit; CFU)

ont ensuite été dénombrées.

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50

Un nombre de 1000 cellules ont été ensemencées par pétri de Methocult immédiatement

après la sélection positive des cellules CD34+ ou suite à la culture de 7 jours. En moyenne

un nombre total de 151,3 ± 16,8 colonies ont été comptées pour chaque 1000 cellules

CD34+ ensemencées (Figure 5.5A), correspondant ainsi à environ 15% des cellules qui

étaient considérées capables de reconstituer une des lignées hématopoïétiques. En fin

d’expansion, les 1000 cellules cultivées en milieu APFM ont généré 51,6 ± 9,9 colonies

lorsque cultivées dans les plateaux contrôles, comparativement à 40,5 ± 11,5 lorsque

cultivées dans les plateaux à faible adhérence. Le nombre total de CFU/1000 cellules

obtenu pour les cellules cultivées dans le milieu commercial StemSpan est très

comparable aux résultats obtenus en APFM avec 46,3±7,8 et 50,2±10,2 colonies

dénombrées pour les cellules cultivées respectivement en plateaux standard et à faible

adhérence. Dans toutes les conditions, il est donc possible de constater que moins de 5%

des cellules démontraient un potentiel de progéniteurs après la culture de 7 jours.

La fréquence des quatre types de colonies (Figure 4.1) pouvant être distingués a aussi été

analysée (Figure 5.5B). Au jour 0, pour les cellules CD34+, 14,5% des colonies étaient

des CFU-E, 66,4% des BFU-E, 12,8% des CFU-GM et 6,3% des CFU-GEMM. Les

cellules cultivées en milieu APFM dans les plateaux standard ont pour leur part généré

des colonies dont 24% étaient des CFU-E, 67,5% des BFU-E, 4,7% des CFU-GM et 3,6 %

des CFU-GEMM. Le profil de la fréquence des différents types de colonies demeure le

même pour les trois autres conditions, soit APFM en plateau à faible adhérence et

StemSpan pour les deux types de plateaux. Ces résultats démontrent que les cellules

CD34+ isolées des chambres LRS possèdent un biais initial vers la lignée érythroide. Ce

biais semble être maintenu suite à la culture puisque les colonies érythroïdes (CFU-E et

BFU-E) représentent plus de 80% de toutes les colonies

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51

Figure 5.5 Détermination du potentiel progéniteur des cellules CD34+ fraîchement isolées et cultivées en milieux sans sérum Les cellules CD34 provenant de 3 donneurs différents ont été placées en milieu Methocult suivant l'isolement par Easysep et suivant une culture de 7 jours dans les différentes conditions énumérées. Les colonies ont été dénombrées 14 jours après la mise en culture dans le milieu Methocult (A) et classées dans un des quatre types de colonies selon leur phénotype visuel (B)

5.4.2 Essais avec le N-acétyle cystéine (NAC) Les HSC se retrouvent majoritairement dans la moelle osseuse, un environnement faible

en oxygène [84]. Dans un cadre plus physiologique, les cellules CD34+ sont donc

grandement adaptées à un environnement dont la disponibilité de l’oxygène est réduite.

Conséquemment, l’impact des dommages induits par les stress oxydatifs sur ces cellules

s’avérait intéressant à étudier. Le NAC est une molécule qui peut servir de précurseur

dans le cycle du glutathion ce qui lui confère des propriétés antioxydantes [186]. Des

travaux de notre équipe ont démontré la capacité de cette molécule à inhiber STAT3, une

molécule impliquée dans la différenciation, lors de la culture de lymphocyte B dans un

milieu APFM comparable à celui utilisé dans mon projet [165]. Le NAC pourrait donc avoir

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52

des effets bénéfiques sur la survie et l’expansion des HSC tout en favorisant le maintien

du caractère primitif des cellules.

Six cultures de cellules CD34+ provenant de 6 échantillons de PBMC indépendants ont

été effectuées sur 7 jours dans le milieu APFM avec et sans NAC en condition d’oxygène

atmosphérique (21%). La concentration du NAC était de 5 mM et basée sur les travaux

reliés aux lymphocytes B. Les résultats de la figure 5.6 montrent qu’un taux d’expansion

moyen de 12,1 ± 3,4 fois a été obtenu sans addition de NAC alors qu’en présence de

NAC, un taux d’expansion moyen de 6,7 ± 1,3 a été obtenu. Néanmoins, la tendance entre

ces deux taux d’expansion n’est pas statistiquement différente avec un p=0.2469 (Student

t-test pairé). Au niveau de l’expansion des cellules CD34+, les deux conditions généraient

des taux d’expansion finaux comparables avec 4,7±1,3 et 3,3±0,9, respectivement sans

NAC et avec NAC. La viabilité n’était pas affectée ni positivement, ni négativement par le

NAC en étant supérieure à 90% tout au long de la culture. Les analyses phénotypiques

réalisées (figure 5.6C) n’ont pas permis de déceler de différences significatives. En effet,

l’analyse statistique de la fréquence des cellules caractérisées par les marqueurs CD45,

CD34, CD38, CD133 et CD90 pour les essais réalisés avec ou sans NAC donnait une

valeur de p>0,05 dans tous les cas (Student T Test pairé). De plus, ces résultats de

phénotypes étaient similaires à la caractérisation phénotypique précédemment observée

avec le milieu APFM.

Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que l’action antioxydante du NAC semble

ralentir l’expansion des cellules CD34+ du sang adulte sans que la différence soit

statistiquement significative. Toutefois, la caractérisation du phénotype de cellules

générées ne permet pas de suggérer qu’un caractère davantage primitif a pu être

maintenu. L’addition de NAC a donc été abandonnée pour la suite des expérimentations.

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53

Figure 5.6 Expansion dans le milieu APFM en présence de NAC Six cultures de cellules CD34+ ont été effectuées en présence ou en absence de 5 mM de NAC. L'expansion (A), la viabilité (B) et le phénotype (C) des cellules ont été analysés.

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54

5.5 Mise au point de la culture en hypoxie

Bien que nos essais avec les NAC pour diminuer le stress oxydatif aient eu peu d’influence

sur les cellules, un modèle de culture dans des conditions à faible niveau d’oxygène a été

établi afin de reproduire le mieux possible le microenvironnement retrouvé dans les niches

hématopoïétiques de la moelle osseuse [84].

5.5.1 Essais préliminaires Étant donné que le niveau d’oxygène dissout dans la moelle osseuse se situe entre 1 à

8% O2 [84, 123], des essais préliminaires de culture des cellules CD34+ ont été réalisés

avec 3% et 8% d’O2 et ont été comparés à la condition 21% O2, soit le niveau de O2

atmosphérique tel qu’utilisé dans nos cultures précédemment. Cet essai ayant pour but de

déterminer la concentration optimale à utiliser dans notre modèle de culture de cellules

CD34+ de sang adulte. Deux cultures, essai #1 et #2, provenant de PBMC différentes ont

donc été réalisées dans les trois conditions énumérées ci-haut dans le milieu APFM.

Les deux cultures ont été analysées séparément afin de tenir compte des variations

interindividuelles. La culture #1 a permis de visualiser une meilleure expansion totale des

cellules soit de 16,8 fois en présence de 8% O2 et de 16,3 fois en présence de 3% O2

comparativement à 11,7 fois en présence de 21% O2. L‘essai #2 a montré une expansion

supérieure uniquement pour la condition 8% O2, soit de 19,9 fois comparativement à

environ 15 fois pour 21% O2 et 3% O2 (Figure 5.7A). Cependant, la majorité des résultats

demeuraient dans la moyenne des taux d’expansion précédemment obtenue en milieu

APFM 20,2 ± 7,1 (Section 5.2.1.1) ce qui ne permettait pas de distinguer une meilleure

condition. Dans tous les cas, la viabilité cellulaire était maintenue au dessus de 85% tout

au long de la culture (Figure 5.7B. Encore une fois, aucune des conditions ne s’est

démarquée considérablement des autres, bien que la condition à 8% O2 fût celle

produisant des cellules avec la meilleure viabilité, soit de 90%, au jour 7 dans les deux

essais.

La figure 5.7 permet de visualiser les résultats de Methocult obtenus pour les cellules

cultivées durant 7 jours. Les résultats montrent quelques différences mineures entre les

conditions à faible niveau d’oxygène et la condition à 21% O2 au point de vue de la

fréquence d’apparition de chacun des types de colonies. En fait, lorsque les cellules ont

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55

été cultivées à 8% O2, elles généraient un peu plus de BFU-E et CFU-GM. De plus, si on

s’intéresse au nombre total de colonies obtenues, la condition à 8% O2 est celle qui

permet d’obtenir la plus grande proportion de colonies avec une moyenne pour les deux

essais de 69 CFU/1000 cellules contre 54 CFU/1000 cellules à 21% O2 et 53 CFU/1000

cellules à 3% O2.

Les cellules générées après 7 jours de culture ont aussi été caractérisées pour leur

phénotype CD45, CD34, CD38, CD90 et CD133. Les résultats obtenus n’ont pas permis

de déceler de différence significative à ce niveau entre les conditions (données non-

montrées); cependant la distribution des phénotypes obtenus étaient similaires aux

fréquences précédemment obtenues (section 5.1.3 et 5.2.2).

Finalement, ces deux essais préliminaires ont permis d’observer que les cultures réalisées

dans un environnement ajusté à 8% O2 donnaient des rendements légèrement supérieurs

au niveau des comptes de CFU et de la viabilité au jour 7. Sur la base des connaissances

actuelles [84, 123, 187, 188], 8% O2 est une concentration dite physiologique et constitue

un équilibre acceptable entre les niches de la moelle osseuse et la circulation sanguine

d’où proviennent les cellules CD34+ utilisées dans ce projet. Ainsi, pour les expériences

subséquentes, la condition de faible niveau d’oxygène a été un niveau d’oxygène de 8%.

Tous les essais ont aussi été réalisés en parallèle avec un niveau d’oxygène à 21% afin

de comparer notre étude à la majorité des études réalisées dans le domaine de

l’expansion des cellules souches hématopoïétiques basée sur l’oxygène de niveau

atmosphérique.

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56

Figure 5.7 Essais préliminaires pour la mise au point de la culture en condition hypoxique Deux cultures ont été effectuées sur 7 jours en milieu APFM dans trois conditions d'oxygène, soit 21%, 8% et 3% O2. L'expansion (A), la viabilité (B) et le potentiel progéniteur en milieu semi-solide (C) ont été analysés

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57

5.5.2 Optimisation du milieu de culture Dans le but d’améliorer notre modèle de culture in vitro, des tests ont été effectués pour

varier la composition du milieu APFM. Ces améliorations avaient pour but d’élargir la

diversité des progéniteurs générés en culture. Entre autre, en souhaitant augmenter le

nombre de progéniteurs granulocytes-monocytes (CFU-GM) au détriment des

progéniteurs érythroïdes (CFU-E/BFU-E) pour renverser le biais montré par les essais en

Methocult. Compte tenu du laps de temps de 14 jours avant de pouvoir obtenir les

résultats de Methocult, des analyses phénotypiques des caractères de différenciation ont

été privilégiées.

5.5.2.1 Élimination de la composante IGF-1

Suite à ces observations, les composantes du milieu de culture APFM ont été vérifiées

afin de minimiser le biais vers les progéniteurs érythroïdes. L’insulin like growth factor 1

(IGF-1) est un facteur soluble qui peut être sécrété par les cellules souches [189].

Cependant trois études ont montrés que l’IGF-1 pourrait favoriser la différenciation en

progéniteurs érythroïdes [190-192] et supportait l’importance de tester le retrait de l’IGF-1

de notre modèle de culture afin de diminuer l’influence de cette molécule vers la

spécialisation érythroïde.

5.5.2.1.1 Expansion et viabilité

Cinq cultures indépendantes ont été effectuées sur une durée de 7 à 8 jours dans un

milieu APFM avec ou sans IGF-1. Ces cultures ont de plus été réalisées en parallèle dans

une condition à 8% O2 et une condition à 21% O2. Les résultats n’ont démontré aucun

impact de l’IGF-1 au niveau de l’expansion (Figure 5.8A). À 21% O2, les résultats

montraient une expansion de 9,9 ± 3.3 fois avec IGF-1 comparativement à 7,9 ± 2,6 fois

sans IGF-1. Les résultats sont comparables en présence de 8% O2 avec une expansion

de 10,2 ± 3,9 fois pour les cellules cultivées avec IGF-1 alors que sans IGF-1 l’expansion

a été de 9,3 ± 1,9 fois. La viabilité a été maintenue supérieure à 80% tout au long des

cultures et ce pour les quatre conditions expérimentales (Figure 5.8B). Bien que la viabilité

soit meilleure à 21% O2 avec IGF-1 en fin de culture, il n’est pas possible de déceler une

différence statistiquement significative de viabilité entre les conditions de culture.

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58

5.5.2.1.1.1 Effet de la densité cellulaire sur l’expansion

Il est possible de remarquer que les taux d’expansion obtenus sont plus faibles que ceux

précédemment mesurés (Section 5.1 et 5.2). Cette diminution s’explique probablement par

le fait que la densité cellulaire à laquelle les cellules étaient cultivées pour ces essais était

plus faible que pour les essais précédents. Effectivement, les cinq cultures ont été

effectuées à une densité cellulaire de 40 000 cellules/mL pour toute la durée de la culture

dans le but d’établir des conditions de culture comparable au groupe de Ivanovic [63].

Cependant, tous les essais des sections précédentes ont été maintenus à une densité

cellulaire autour de 100 000 cellules/mL. Pour les essais subséquents, les cultures

cellulaires ont été démarrées à une densité de 100 000 cellules/mL et lors du

renouvèlement de milieu aux jours 3 ou 4, la densité cellulaire a été ajustée entre 40 000 à

50 000 cellules/mL.

Figure 5.8 Optimisation du milieu de culture APFM par le retrait de l'IGF-1 - Expansion et viabilité Cinq cultures ont été réalisées en présence ou en absence d'IGF-1 à 21% ou 8% O2. L'expansion (A) et la viabilité ont été déterminées par compte au bleu de trypan.

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59

5.5.2.1.2 Caractérisation phénotypique

Pour finaliser l’étude de l’impact de l’IGF-1 sur la différenciation, les cellules en fin de

culture ont été marquées avec deux panels d’anticorps. Le premier panel était identique à

celui précédemment utilisé pour la caractérisation et comprenait donc les anticorps ciblant

CD45, CD34, CD38, CD90 et CD133. Les distributions des cellules ont encore une fois été

similaires à celles déjà observées aux sections précédentes et n’a pas permis de

constater de différence dans l’expression de ces marqueurs sur les cellules entre les

différentes conditions à l’essai. Environ 90% des cellules se sont avérées positives pour le

CD45. Parmi les cellules CD45+, moins de 20% des cellules étaient CD34+. Parmi les

cellules CD45+CD34+, près de 80% des cellules exprimaient le CD38 alors que les

marqueurs CD90 et CD133 étaient exprimés sur moins de 5% de celles-ci (données non-

montrées).

Une deuxième série d’analyses a été réalisée afin de cibler plus spécifiquement la lignée

érythroïde. Ce panel comprenait pour sa part les anticorps ciblant CD244 et CD48 de la

famille des récepteurs SLAM ainsi que les anticorps ciblant CD13, CD14, CD235a et

CD41a qui sont des marqueurs de différenciation des différentes lignées

hématopoïétiques. La dynamique d’acquisition de l’expression des marqueurs CD244 et

CD48 [193] (Figure 5.9A) permet de suivre le statut de différenciation des cellules. En fait,

ces marqueurs ne sont pas présents sur les cellules souches, le marqueur CD244

apparait lors du passage au stade de progéniteur et le marqueur CD48 apparait pour sa

part lorsque la cellule est de plus en plus engagée en différenciation. Si la cellule se

spécialise en GMP, elle conservera ces marqueurs qui resteront également présent

jusqu’à un stade de monocytes tandis que le CD244 sera perdu si la cellule se différencie

en granulocyte. Si un CMP se spécialise en MEP, le CD244 sera perdu et il en va de

même pour le CD48 lors de la poursuite de l’érythropoïèse et de la mégacaryopoïèse.

Les résultats de la figure 5.9B montre la moyenne de la répartition des cellules dans ces

quatre quadrants pour trois cultures réalisées dans les conditions avec ou sans IGF-1 à

21% O2 et à 8% O2. Bien qu’aucune analyse statistique n’ait été réalisée, les tests

statistiques réalisés avec des n <5 étant peu fiables, il est possible de constater une

augmentation d’environ 8% de la fréquence des cellules CD244+CD48-, correspondant au

MPP, dans les conditions d’oxygène à 8%. Cette augmentation semblait s’effectuer au

détriment de la population CD244-CD48+ (baisse entre 8,5 et 10%) correspondant soit au

MEP ou au granulocyte, selon cette classification. Par ailleurs, les cellules ayant été

cultivées avec ou sans IGF-1 ne semblaient pas montrer de modifications pour

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60

l’expression des marqueurs CD244 et CD48. Dans l’ensemble, ces résultats tendent à

démontrer qu’en fin de culture, les cellules CD34+ sont préférentiellement devenues des

Mk ou des érythrocytes dans toutes les conditions, ce qui de toute façon est représentatif

de nos résultats précédents. En fait, la forte perte du CD34 déjà observée indique une

perte de la capacité de régénération à long terme des HSC, suggérant que les cellules

CD44-CD48+ variant en proportion de 34,60% à 39,17% seraient probablement des

érythrocytes ou des MK.

Figure 5.9 Optimisation du milieu de culture APFM par le retrait de l'IGF-1 - Phénotype SLAM Trois cultures ont été réalisées en présence ou en absence d'IGF-1 à 21% ou 8% O2 et caractérisées après 7 jours pour les marqueurs CD48 et CD244 de la famille des SLAM. La section A montre le suivi de l'expression des deux marqueurs selon l'évolution dans l'hématopoïèse. La section B montre la répartition des cellules après culture selon l'expression des deux marqueurs D’autre part, l’analyse des marqueurs CD13, CD14, CD235a et CD41a a révélé peu de

variations entre les conditions (Figure 5.10). Dans la condition de culture en présence de

21% O2 avec IGF-1, 42,0 ± 8,0% des cellules étaient CD13, 2,9 ± 1,7% étaient CD14+,

18,5 ± 4,5 étaient CD235a et finalement 16,8 ± 1,0 étaient CD41a. Les fréquences

observées dans les autres conditions étaient semblables, ne permettant pas de constater

un effet positif ou négatif en fonction du retrait de l’IGF-1 ou de la culture en présence

d’oxygène à 8%. Par ailleurs, l’expression de CD235a, marqueur de la lignée érythroïde,

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61

et celle de CD41a, marqueur des cellules MK, étaient détectées sur un total d’environ 35%

des cellules et montraient toujours un biais vers ces lignées.

Dans l’ensemble ces résultats montrent d’abord que le retrait de l’IGF-1 du milieu de

culture n’influence pas le comportement des cellules autant au niveau de l’expansion, de

la viabilité que du phénotype. Ces premiers essais répétés en comparant une condition

atmosphérique avec une condition hypoxique semble proposer une capacité des cellules à

demeurer davantage multipotentes en présence de faible niveau d’oxygène. Finalement,

la caractérisation phénotypique avec ce nouveau panel d’anticorps suggère une tendance

des cellules CD34+ à se différencier dans la branche MEP lors d’une culture de 7 jours ce

qui corrèle avec les résultats de CFU déjà présentés (Figure 5.5) et l’IGF-1 ne semble

cependant pas être impliqué dans ce biais.

Figure 5.10 Optimisation du milieu de culture APFM par le retrait de l'IGF-1 - Phénotype de différenciation Trois cultures ont été réalisées en présence ou en absence d'IGF-1 à 21% ou 8% O2 et caractérisées par cytométrie en flux à la fin de la culture pour les marqueurs de différenciation myéloïdes (CD13, CD14), érythroïdes (CD235a) et Mk (CD41a)

5.5.2.2 Effets du GM-CSF sur l’évolution des cellules CD34 en culture

Dans le but de diminuer le biais vers la lignée érythroïde et de favoriser les autres lignées

une dernière modification du contenu en cytokines a été testée. Le GM-CSF est une

cytokine servant de facteur de croissance pour les globules blancs [58]. Il contrôle la

production, la différenciation et les fonctions des lignées myéloïdes via la stimulation des

progéniteurs hématopoïétiques. L’ajout de cette composante dans le milieu APFM pourrait

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62

favoriser l’obtention de monocyte et granulocytes en fin de culture. Trois cultures ont été

effectuées dans le milieu APFM avec ou sans GM-CSF pour une durée de 7 à 8 jours

dans des conditions atmosphériques (21%) et hypoxiques (8%).

Aucune différence notable n’a été observée au niveau de l‘expansion en moyenne de 15

fois dans les conditions ± GM-CSF ainsi qu’à 8% et 21% d’oxygène. De même la viabilité

a été maintenue supérieure à 80% tout au long de la culture pour ces quatre conditions et

ce dans les trois cultures réalisées. Les cellules obtenues dans le cadre de ces trois séries

de culture ont été soumises à des analyses phénotypiques afin de cibler les marqueurs

CD45, CD34, CD38 et CD133. Tel qu’observé précédemment (voir figures 5.4 et 5.6.) les

analyses ont révélé une diminution de 10% à 15% des populations cellulaires CD45+, et

une faible proportion (10%) de cellules CD34+ était maintenue au bout des 7 jours de

culture. Peu de ces cellules CD34+CD45+ étaient positives pour CD133 (< que 3%).

Finalement, le marqueur CD38 était détecté sur seulement 6 à 11% de l'ensemble des

cellules, mais présent sur plus de 80% des cellules CD45+CD34+ (données non-

montrées).

Les cellules de ces trois cultures ont aussi été analysées avec un panel d’anticorps

spécifiques aux marqueurs CD45, CD45RA, CD123, CD135, CD38 et CD71. Ces

analyses ciblaient principalement l’identification des cellules au stade de CMP

(CD45+CD45RA-CD123medCD135+), MEP (CD45+CD45RA-CD123-CD135-CD71+) ou

GMP (CD45+CD45RA+CD123±CD135+). Les cellules ont d’abord été analysées en

fonction de l’expression des marqueurs CD45 et CD45RA (Figure 5.11A). Au premier plan,

aucune différence n’a été observée entre les conditions ± GM-CSF en présence de 8% ou

21% d’oxygène. La majorité des cellules, entre 77% et 85%, étaient du type

CD45+CD45RA- correspondant soit au stade MPP, CMP ou MEP. Une moyenne de 7%

de cellules était CD45+CD45RA+, ce qui correspondait au stade GMP, alors qu’entre 8%

et 15% des cellules étaient CD45-CD45RA- soit un stade avancé vers la différenciation en

érythrocytes et cellules Mk avancées. Finalement, les cellules CD45-CD45RA+

représentaient moins de 1% de l’ensemble des cellules analysées.

Les trois sous-populations majoritaires ont ensuite été analysées pour la présence des

marqueurs CD123, CD135, CD38 et CD71 (Figure 5.11B). Dans l’ensemble, les résultats

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63

ne variaient pas entre les conditions 4 conditions testées (± GM-CSF et 8% ou 21%

oxygène). Néanmoins, il est possible de constater que l’expression du CD123 est

restreinte aux cellules CD45+ (entre 18 à 51%). Le CD135 est pour sa part très faiblement

exprimé dans chaque population (≤ 4%) L’expression du marqueur CD38 est environ deux

fois plus forte dans les GMP, soit les cellules CD45+CD45RA+ (entre 22,1 et 33,8%) que

dans les autres cellules CD45+/-CD45- (entre 5,5 et 15,6%). Finalement, le récepteur de

la transferrine, CD71, est retrouvé sur approximativement la moitié des cellules pour

chacune des trois populations testées.

Les cellules ont aussi été analysées pour des marqueurs de différenciation cellulaire

CD33, CD235a, CD14, CD13 et CD41a (Figure 5.11C). Tel qu’illustré, la fréquence de ces

5 marqueurs a été déterminée séparément sur les cellules CD45+ (>85% des cellules) et

CD45- (<15% des cellules). Nos analyses ont révélé que la majorité des cellules, CD45+

ou CD45- exprimaient le marqueur CD13, suivi en importance par le marqueur CD33. Ces

deux molécules sont toutes les deux des marqueurs de CMP qui sont maintenues lors de

la différenciation vers les lignées myéloïdes. Toutefois, le marqueur de granulocytes et de

monocytes CD14 était exprimé sur moins de 1% des cellules, ce qui contredit la

différenciation vers les myéloïdes. Le marqueur érythroïde CD235a est aussi relativement

faiblement exprimé (de 6,0 à 8,6% pour les cellules CD45+ et <2% pour les cellules

CD45). Le marqueur CD41a, marqueur de la lignée des mégacaryocytes, montrait pour sa

part des variations intéressantes selon que les cellules avaient été cultivées avec ou sans

GM-SCF. En effet, la fréquence du marqueur diminue sur les cellules CD45+ en présence

de GM-CSF passant de 20,8% à 7.7% en présence de 21% d’oxygène et de 24,6% à

10.2% en présence de 8% d’oxygène. Néanmoins, les variations observées entre les trois

cultures ne permettaient pas de conclure que l’addition de GM-CSF avait un effet

significatif sur la distribution des populations.

En résumé, ces résultats révèlent peu d’impact de l’addition de GM-CSF sur la

différenciation des cellules en culture. Par conséquent, cette cytokine n’a pas été retenue

pour la composition finale du milieu APFM. Cependant, lors de ces essais, l’addition de

plusieurs panels d’anticorps permettait d’avoir une meilleure caractérisation du phénotype

des cellules en fin de culture. Une telle caractérisation s’est avérée nécessaire afin de

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64

pouvoir visualiser l’hétérogénéité des cellules en fin de culture et cette stratégie a été

conservée pour la finalisation de notre étude.

Figure 5.11 Optimisation du milieu de culture APFM par l'Ajout de GM-CSF Trois cultures ont été réalisées en présence ou en absence de GM-CSF à 21% ou 8% O2 et caractérisées par cytométrie en flux à la fin de la culture pour suivre le marqueur de GMP CD45RA (A, B) et pour suivre plusieurs marqueurs de différenciation tardifs (C)

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65

5.6 Caractérisation de l’expansion en condition d’hypoxie

À la lumière des résultats précédents, les paramètres du système de culture ont été

établis comme étant le milieu APFM en plateau standard et en présence de 8%

d’oxygène. De plus, l’IGF-1 a été retiré et le GM-CSF n’a pas été ajouté à notre cocktail de

cytokines. Des expérimentations plus robustes (n=6) ont été réalisées pour déterminer

l’influence de l’hypoxie sur les cellules CD34+ de chambres LRS lors de leur expansion in

vitro.

5.6.1 Expansion et viabilité Les cellules ont été mises en culture dans le milieu APFM, en parallèle, en présence de

8% et de 21% d’oxygène. Pour les six séries de cultures pairées, un taux d’expansion

moyen des cellules totales de 15,4 ± 4,6 fois a été observé à 8% O2, comparativement à

11,6 ± 3,5 pour les cellules cultivées à 21% O2 (Student t-test, p>0.05) (Figure 5.12A).

L’expansion des cellules CD34+ s’est avérée très faible avec un taux d’expansion plus

petit que 3 dans les deux conditions. Les mesures de la viabilité montraient des résultats

similaires pour les deux conditions au jour 4 avec une valeur moyenne de près de 90%.

Au jour 7, la viabilité baisse à 75,5 ± 3,6% en présence de 8% O2 et à 81,1 ± 5,6% en

présence de 21% d’O2 (Figure 5.12B).

Figure 5.12 Expansion en condition d'hypoxie Six cultures de cellules CD34+ ont été générées sur 7 à 8 jours en milieu APFM en condition d'oxygène atmosphérique à 21% O2 et en condition hypoxique à 8% O2. L'expansion (A) et la viabilité ont déterminées au jour 4 en fin de culture par exclusion du bleu de trypan

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66

5.6.2 Caractérisation multiparamétrique du phénotype des cellules cultivées Les cellules obtenues au jour 7 des six cultures réalisées (Figure 5.13) ont été

caractérisées pour leur connaitre leur phénotype en utilisant les panels d’anticorps ciblant

les 14 marqueurs utilisés lors de la caractérisation des cellules CD34+ purifiées à partir

des chambres LRS (Figure 5.2). L’analyse de ces données complexes a cependant été

réalisée avec deux logiciels différents : FCS express et SPADE (Section 1.3.2).

Le logiciel FCS express tel qu’utilisé à la figure 5.2, permet une analyse binaire en utilisant

deux marqueurs à la fois et en ciblant avec des séries de «gate» qui s’emboitent afin

d’analyser des populations très spécifiques, une à la fois. FCS express a permis d’obtenir

la fréquence de chacun des marqueurs dans les deux conditions. D’autre part, des

analyses multiparamétriques ont été effectuées avec le logiciel SPADE afin de générer un

arbre regroupant en nœuds les cellules ayant des caractéristiques communes. Les deux

types d’analyses ont été effectués sur les trois panels d’anticorps étudiés (Tableau 4.1).

SPADE a permis de visualiser en un seul coup d’œil l’hétérogénéité des populations.

Selon l’analyse réalisée avec FSC express, la fréquence des cellules CD45+, lorsque

cultivées en présence de 8% O2 était de 80,5% ± 4,5%, alors que 11,9% ± 1,5% exprimait

CD34 (Figure 5.13A). L'ensemble des cellules positives pour CD34 l'étaient aussi pour le

CD45. Le marqueur d'activation CD38 était présent à la surface de 24,8% ± 3,8% des

cellules cultivées à 8% O2. Finalement, les marqueurs CD90 et CD133 étaient, tel

qu’attendu très faiblement exprimés avec moins de 5% des cellules positives. Aucune

différence statistiquement significative n’a été observée lorsque les résultats ont été

comparés entre les cellules cultivées en condition d’oxygène atmosphérique et en

présence de 8% d’O2.

Ces cinq marqueurs ont aussi été analysés sur forme d’un arbre de données

multiparamétriques qui a été généré par SPADE. Lorsque l’arbre est visualisé selon

l'intensité de chaque marqueur, il est possible de voir avec l’échelle de couleur que

certaines populations cellulaires expriment plus ou moins fortement chacun des

marqueurs de surface (Figure 5.13B). Les arbres présentés à la figure 5.13B ont permis

de délimiter les différentes populations en fonction de l’expression des marqueurs. Par la

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67

suite une représentation des sous-populations est utilisée pour comparer les conditions de

culture.

Un exemple pour le marqueur CD45, il est possible de distinguer une population

CD45high (rouge-orange), CD45low (jaune-vert) et CD45neg (bleu) qui sont reportées sur

la Figure 5.13C (nuances de bleu). Il est important de noter que l'intensité d'expression de

chaque population est toujours relative à l'ensemble des cellules qui est la base de la

comparaison pour SPADE. Donc il est faux de conclure que la population bleue rayée est

négative pour le CD45, il faut en conclure que l'expression du CD45 dans cette population

est beaucoup plus faible que dans le reste des cellules. Il en va de même pour chacun des

autres marqueurs de surface analysés.

En combinant la localisation de chacun des marqueurs sur un même arbre (Figure 5.13B),

il est possible de visualiser des sous-populations par la co-expression de plusieurs

marqueurs. À la figure 5.13B, plusieurs populations co-expriment des marqueurs

simultanément. Par exemple sur cette illustration, les cellules CD34+ n'expriment pas le

CD38 une sous-population est positive pour CD90 alors qu'une autre est positive pour

CD133. Il est possible de remarquer que les cellules dont l'expression de CD45 est plus

faible ne semblent pas exprimer les marqueurs analysés avec notre panel. De plus,

l’expression du CD90 et du CD133 semble être mutuellement exclusive. L’hétérogénéité

d’un ensemble de cellules peut être facilement visualisée en une seule image.

Les fréquences des cellules positives pour chacun des marqueurs selon les données de

SPADE ont été déterminées afin de les comparer avec les données FCS express. Pour se

faire, le nombre de cellules présent dans chaque population de cellules exprimant un

marqueur a été divisé par le nombre total de cellules utilisées pour générer l'arbre. La

moyenne de 6 expériences pour les cellules cultivées pendant 7 jours en présence de 8%

O2 ou 21% O2 est présentée à la figure 5.13D. Les données obtenues pour les cellules

cultivées en présence de 8% O2 vont comme suit : CD45high 73,4% ± 6,0%, CD45low

22,4% ± 5,9%, CD45neg 4,2% ± 1,5%, CD34+ 11,4% ± 2,0%, CD90+ 2,6% ± 0,8%,

CD133+ 1,3% ± 0,3% et CD38+ 8,2% ± 2,7%. En résumé cette distribution est similaire à

celle obtenue avec les cellules cultivées en présence de 21% O2, et concordent bien avec

la répartition obtenue avec FCS express.

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68

Figure 5.13 Phénotypage multiparamétrique des cellules CD34+ cultivées en hypoxie - Panel primitif Les cellules CD34+ cultivées à 21% ou à 8% O2 pour 7 à 8 jours ont été marquées avec un panel d'anticorps permettant de caractériser les HSC primitives. L'analyse de la fréquence de chacun des marqueurs a été obtenue par la méthode d’analyse classique en 2D avec FSC Express (A). L'expression de chacun des marqueurs a ensuite été analysée avec SPADE selon l'intensité de fluorescence (B) et la fréquence de cellules se trouvant dans chacune des populations identifiées en C a été rapportée sur l'histogramme en D pour les deux conditions d'oxygène.

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69

Pour le deuxième panel d'anticorps, les cellules ont été marquées avec les anticorps

ciblant CD45, CD45RA, CD123, CD135, CD13 et CD71 afin d’étudier la répartition au sein

des populations de progéniteurs commun (CMP), de progéniteurs des granulocytes et

macrophages (GMP) et des progéniteurs de mégacaryocytes et des érythrocytes (MEP).

Les cellules analysées proviennent des mêmes six cultures indépendantes présentées

plus haut (Figure 5.13). L'analyse avec FCS express a révélé que 24,9% ± 13,2% des

cellules cultivées en présence de 8% d’O2 étaient positives pour le marqueur CD45RA

(Figure 5.14A). Dans le cas du marqueur CD123, la fréquence des cellules positives était

de 34,0% ± 8,8 alors que pour le marqueur CD135, elle était de 7,3% ± 2,4%. Finalement,

le marqueur CD13 était présent à la surface de 45,3% ± 9,1% des cellules. Encore une

fois, aucune différence significative n’a pu être décelée en comparant ces cellules avec les

cellules cultivées en condition d’oxygène atmosphérique.

Ces données de cytométrie en flux ont été analysées avec SPADE afin d’étudier la

répartition des cellules dans l’hématopoïèse. Comme décrit plus haut, l’arbre SPADE a été

d’abord visualisé pour l’intensité de fluorescence de chaque marqueur (Figure 5.14B) afin

de situer sur quelle population cellulaire les marqueurs de surfaces étaient exprimés.

Ensuite, en accord avec différentes combinaisons de marqueurs tel que décrit au tableau

4.1, trois populations majeures ont pu être distinguées. D’abord, une population

regroupant les cellules souches hématopoïétiques (HSC), les progéniteurs multipotents

(MPP) et les progéniteurs commun myéloïdes (CMP) a été caractérisée comme étant

CD45+/lowCD45RA-CD123+/lowCD135lowCD13low/-CD71-. D’autre part, les cellules

engagées dans la différenciation vers la voie des progéniteurs érythroïdes et des

mégacaryocytes (MEP) ont été identifiées comme étant

CD45lowCD45RAnegCD123negCD135negCD13low/-CD71+/low. Cette population incluait

les progéniteurs et les cellules érythroïdes et MK effectrices. Finalement, les cellules

CD45+CD45RA+CD123+/-CD135+/-C13+CD71- appartenait à la population des

progéniteurs granulocytes-monocytes (GMP), incluant aussi les cellules effectrices qui en

émergent. Une minime proportion de cellules n’a pu être identifiée car elle était négative

pour tous les marqueurs analysés.

Pour chacune de ces trois grandes populations, la moyenne de la fréquence des 6

cultures dans les deux conditions d’oxygène a été compilée à la figure 5.14C. L’analyse

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70

SPADE a permis de montrer qu’environ 60% des cellules sont inclus dans la population la

moins différenciée qui comprend les HSC, MPP et CMP. Environ 30% des cellules étaient

engagées du côté érythroïdes-Mk alors que près de 7% étaient engagées du côté de

granulocytes-monocytes. Dans l’ensemble, aucune différence significative dans la

distribution des cellules n’a été détectée entre les deux conditions d’oxygène à l’étude.

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71

Figure 5.14 Phénotypage multiparamétrique des cellules CD34+ cultivées en hypoxie - Panel progéniteur Les cellules CD34+ cultivées à 21% ou 8% O2 pour 7 à 8 jours ont été marquées avec un panel d'anticorps permettant de caractériser l'engagement des progéniteurs. L'analyse de la fréquence de chacun des marqueurs a été obtenue par la méthode d’analyse classique en 2D avec FSC Express (A). L'expression de chacun des marqueurs a ensuite été analysée avec SPADE selon l'intensité de fluorescence (B). Trois populations ont pu être distinguées selon l'intensité d'expression de chacun des marqueurs (C). La fréquence de cellules se trouvant dans chacune des populations identifiées en C a été rapportée sur les graphiques en pointe de tarte en D pour les deux conditions d'oxygène.

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72

La même stratégie d’analyse a été effectuée avec un dernier panel d’anticorps composé

des anticorps ciblant CD45, CD71, CD33, CD235a, CD41a et CD14. Cette analyse visait à

étudier l’hétérogénéité des cellules en culture engagées plus avant vers la différenciation

en condition de 8% d’O2. Une majorité de 57,3% ± 6,6% des cellules étaient positives pour

le marqueur CD71 et 50,3% ± 10,0% exprimaient le marqueur CD33 selon les analyses

avec FCS express (Figure 5.15A). Pour le marqueur de globules rouges CD235a,

l’analyse révélait une fréquence de 18,3% ± 5,2% alors que pour le marqueur de

plaquettes/MK CD41a, la fréquence était de 19,6% ± 5,3%. Moins de 4% des cellules était

positives pour le marqueur CD14. Une fois de plus les résultats obtenus à 21% d’O2 sont

similaires à ceux observés ci-haut pour 8% de O2.

Les analyses réalisées avec SPADE ont permis d’identifier, huit populations délimitées

comme suit : HSC, CMP ou GMP, granulocytes ou monocytes, MEP, érythroblastes ou

réticulocytes, mégacaryocytes, promégacaryoblastes, érythrocytes et cellules non-

identifiées (Figure 5.15C). Ces populations ont été définies selon l'expression des

marqueurs (Figure 5.15B) selon les critères du tableau 4.1 tel que décrit précédemment.

Une grande hétérogénéité a pu être observée pour les cellules cultivées et ce pour les

deux niveaux d’oxygène testés. En général, la plupart des sous-populations délimitées

étaient distribuées de façon similaire dans les deux conditions. Environ 50% des cellules

obtenues au jour 7 était classifiées dans la population CMP/GMP (Figure 5.15D). Bien que

ce panel d’anticorps ne permette pas la distinction entre ces deux populations, il est

néanmoins possible de conclure que la plupart des cellules étaient au stade de CMP étant

donné que le panel précédent (Figure 5.14) avait permis de montrer que seulement 7%

des cellules étaient spécialisés du côté des GMP. La sous-population comprenant les

réticulocytes et les érythroblastes représentait 8.5% ± 4.8% à 21% O2 et 5,4% ± 4.6% à

8% d’oxygène. Cette apparente différence entre les deux conditions ne s’est pas avérée

être statistiquement significative (p>0.05). Les MEP étaient assez abondants avec

22,5% ± 6.0% des cellules cultivées à 21% d’O2 et 13,7% ± 4.6% pour celles cultivées en

présence de 8% d’O2. Cette différence entre 21% et 8% d’O2 était statistiquement

significative (p<0.001, Student t-test pairé). Par ailleurs, la distribution des populations plus

mineures qui représentaient 2 à 3% en condition de 8% d’O2 apparaissaient moins

abondante en condition de 21% d’O2 avec 1 à 3% de l’ensemble des cellules.

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73

En résumé cette caractérisation exhaustive des cellules cultivées en présence de 8% ou

de 21% d’oxygène ne révélait pas des différences majeures. Toutefois ces données ont

permis de mettre au jour l’hétérogénéité des cellules CD34+ suite à leur culture in vitro et

de montrer que le niveau d’oxygène physiologique pouvait contribuer à en améliorer la

diversité.

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74

Figure 5.15.5 Phénotypage multiparamétrique des cellules CD34+ cultivées en hypoxie - Panel différenciation Les cellules CD34+ cultivées à 21% ou 8% O2 pour 7 à 8 jours ont été marquées avec un panel d'anticorps permettant de caractériser la différenciation dans l'hématopoïèse. L'analyse de la fréquence de chacun des marqueurs a été obtenue par la méthode d’analyse classique en 2D avec FSC Express (A). L'expression de chacun des marqueurs a ensuite été analysée avec SPADE selon l'intensité de fluorescence (B). Neuf populations ont pu être distinguées selon l'intensité d'expression de chacun des marqueurs (C). La fréquence de cellules se trouvant dans chacune des populations identifiées en C a été rapportée sur les graphiques en pointe de tarte en D pour les deux conditions d'oxygène.

*

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75

5.7 Transition entre 21% et 8% d’oxygène

Bien que les conditions de culture en présence d’oxygène à 8% semblent favoriser

l’hétérogénéité des populations générées en fin de culture, il demeure que peu de

variations ont pu être observées entre cette condition et le niveau atmosphérique de 21%

d’O2. Afin d’étudier la sensibilité des cellules à la baisse des niveaux d’oxygène auxquels

elles ont été soumises, l’expression de la protéine HIF-1α a été déterminée. Normalement,

cette protéine est accumulée en condition d’hypoxie mais elle est rapidement dégradée en

présence d’oxygène à forte concentration [150]. Pour cette expérience, des cellules

CD34+ ont été isolées de trois échantillons de PBMC indépendants et placées en culture

dans le milieu APFM à 21% d’O2 pour une durée de 6 jours puis une partie de ces cellules

ont été transférées à 8% d’O2 pour une période supplémentaire de 24h.

5.7.1 Expression HIF-1α Dans une des cultures, la quantité de cellules obtenues au jour 6 n’était pas suffisante

pour tester les deux conditions en parallèle et uniquement le transfert en présence de 8%

d’oxygène a été testé. Les deux autres cultures ont été réalisées avec les deux conditions

en parallèle. Dû à la grande instabilité de HIF-1α, les cellules ont été lysées très

rapidement (moins de 10 minutes) suite à la sortie de l’incubateur et ont été conservées

sur glace. Les extraits protéiques ont été analysés par immunobuvardage de type

Western. Les résultats présentés à la figure 5.16A montrent que la protéine HIF-1α (120

kb) n’a pas pu être détectée dans aucunes des conditions et pour les 5 échantillons de

culture. Toutefois, le contrôle positif (extrait cellulaire commercial, voir section 4.5.1)

montrait que l’essai était acceptable car l’anticorps a détecté une bande à 120 kb

correspondant à HIF-1α. De plus, la figure 5.16C montre que la lyse nucléaire s’était aussi

bien déroulée car la présence de la protéine nucléaire p84 a pu être décelée dans chacun

des échantillons testés. Des essais ont aussi été effectués afin de tenter de détecter HIF-

1α par cytométrie en flux en marquage intracellulaire avec la méthode du fluorescent cell

barcoding [194] mais ce fut aussi sans succès. Ces résultats suggèrent que la protéine

HIF ne peut pas être détectée dans nos conditions de culture ou que les conditions

utilisées ont induit sa dégradation dans le cytoplasme [195].

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76

Figure 5.16 Détection de l'expression de HIF-1α suite à une transition de 21% O2 à 8% O2

Les cellules CD34+ de 3 échantillons indépendants ont été placées en culture dans le milieu APFM pour une durée de 6 jours à 21% O2, les cellules ont ensuite été lavées et séparées en deux conditions; une à 21% O2 et l'autre à 8% O2 avec des milieux préalablement équilibrés à ces concentrations en oxygène. Les cellules ont été laissées dans ces conditions pour environ 24h avant d'être récoltées et lysées. HIF-1α (A), GAPDH, contrôle de chargement (B) et p84, contrôle de lyse nucléaire (C) ont été révélés sur la même membrane avec un décapage entre chaque anticorps.

Page 89: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

77

6 Discussion

6.3 Les chambres LRS, une source réaliste de HSC

Cette étude a montré qu’entre 2,6 à 5,6 x106 cellules CD34+ étaient présentes dans les

chambres de leucoréduction (LRS). Ce nombre n’est toutefois pas suffisant pour procéder

à une greffe de HSC pour un patient puisqu’environ 5x106 CD34/Kg sont requis avec les

dons provenant de source de cellules d’adulte [86]. Cela représente autour de 300x106

CD34+ par transplantation. Par contre, les donneurs de plaquettes des centres Globules

peuvent faire des dons à un intervalle de 14 jours. Ainsi, la collecte de plusieurs chambres

LRS générées lors des dons de plaquettes par aphérèse provenant d’un même donneur

serait possible. Les chambres LRS pourraient donc être une source de HSC suffisamment

abondante et facilement accessible. De plus, les donneurs affirment que l’utilisation des

chambres LRS est une valeur ajoutée à leur don puisque autrement, les chambres LRS

sont jetées à la fin des dons. Les chambres LRS ont aussi l’avantage d’être un

prélèvement non-invasif et de ne pas engendrer d’effets secondaires sur le donneur. Par

ailleurs, les donneurs réguliers de plaquettes sont déjà phénotypés en basse résolution

pour les antigènes HLA et pourraient donc s’ajouter au registre mondial des donneurs de

cellules souches. De plus, comme il est facile de cryopréserver des banques de cellules

mononuclées provenant des chambres LRS, plusieurs unités pourraient être cumulées sur

une période de quelques mois [196]. Finalement, puisque les donneurs de plaquettes

viennent de manière récurrente, ils peuvent être disponibles s’il y a un besoin pour une

deuxième greffe d’un même patient.

Par ailleurs, de faibles corrélations négatives ont été obtenues entre le compte de cellules

CD45+ et CD34+ et l’heure du prélèvement Ces résultats semblent être en accord avec

ceux de Mendez-Ferrer et al. [101] car ils suggèrent que la quantité de cellules CD34+

décroit lentement suite à l’exposition du participant à la lumière du jour. Il est toutefois

curieux de constater que le pourcentage de cellules CD34+ semble quant à lui augmenter

dans le temps. La baisse du nombre absolue de CD34+ pourrait être simplement une

conséquence de la baisse du nombre absolue de cellules CD45+. Le taux de

décroissance des cellules CD34+ doit être plus lent que celui des CD45+ expliquant ainsi

la faible corrélation positive entre le pourcentage de cellules CD34+ et l’heure du

prélèvement. Ces résultats permettaient de conclure que la période du matin choisie pour

la récolte des chambres LRS est la plus adéquate.

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78

Déjà, le potentiel des cellules CD34+ du sang périphérique a été montré par plusieurs

études [82, 83, 197]. Lors de cette investigation, une moyenne de 2.05 x 106 ± 0.36 x 106

cellules CD34+ a été retrouvée par chambre LRS. Dès le départ, l’étude du phénotype de

ces cellules CD34+ provenant du sang périphérique trappées dans les chambres LRS a

révélé une grande hétérogénéité cellulaire. Les cellules ont été phénotypées en fonction

des marqueurs de cellules primitives (CD34, CD38, CD133, CD90), de cellules

progénitrices (CD135 et CD123) et de cellules engagées en différenciation érythroïdes

(CD71 et CD235a), Mk (CD41a) ou myéloïdes (CD13, CD45RA et CD14). En premier

lieu, la majorité des cellules CD34+CD45low sont aussi positives pour le marqueur

d’activation CD38 indiquant déjà leur engagement vers la différenciation [32]. En fait, les

cellules CD34+ du sang récupérées dans les chambres LRS n’expriment pas beaucoup

les marqueurs de HSC primitives CD90 et CD133. L’absence de ces marqueurs suggèrent

que très peu de ces HSC seraient capables de reconstituer à long terme tout le système

hématopoïétique d’un patient.

D’un autre côté, une grande proportion de ces cellules est aussi positive pour le récepteur

de la transferrine CD71 qui est associé à la voie érythroïde. Fait à noter, les études sur

l’expression du CD71 sur les cellules CD34+ du sang sont contradictoires. Alors que

certaines études montrent qu’une faible proportion de cellules CD34+ d’environ 20%

expriment le marqueur CD71 [198, 199], une autre montre que plus de 90% de ces

cellules l’expriment si elles sont obtenues par un tri cellulaire [200]. Dans notre étude, les

proportions de CD34+CD45lowCD71+, se situant autour de 70%, se rapproche de ce qui

a été rapporté sur des cellules CD34+ triées [200]. Une expression aussi importante du

marqueur de la transferrine dans le sang laisse croire à un biais important vers la lignée

érythroïde et ce malgré la faible expression du CD235a qui apparait plus tard durant

l’érythropoïèse [41-43]. Cette observation a été confirmée par des essais fonctionnels de

culture de colonie en milieu semi-solide alors que les colonies engagées vers la lignée

érythroïde étaient prédominantes. Par ailleurs, l’expression de plusieurs autres marqueurs

tels que CD135, CD123, CD45RA, CD13 et CD33 sur 7 à 35% des cellules montre tout de

même un potentiel des cellules CD34+ trappées dans les chambres LRS pour la

génération des lignées myéloïdes [32, 58].

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79

En général, nos résultats montrent que les chambres LRS ont un potentiel intéressant

comme source de progéniteurs pour la reconstitution à court terme du système

hématopoïétique basée sur leur caractère hétérogène. Par contre, la faible présence de

HSC ayant un potentiel de régénération à long terme représente un problème important,

car pour assurer une bonne reprise de greffe, les HSC à long terme sont tout autant

nécessaires que les HSC à court terme [7]. Pour combler le manque en HSC à long terme

lors de la greffe, une proposition intéressante serait d’utiliser en complément des cellules

CD34+ ayant un fort potentiel pour la reconstitution à long terme provenant d’une autre

source. En utilisant, par exemple, les cellules HSC du sang de cordon, il pourrait être

possible d’utiliser les petites unités de sang de cordon pour greffer un adulte et de

compléter avec les CD34+ provenant des chambres LRS. Une prise de greffe rapide et

une reconstitution à court terme pourrait être assurée par les cellules des chambres LRS

alors que la reconstitution à long terme pourrait être prise en charge par les HSC du sang

de cordon [7].

6.4 Un milieu sans sérum pour mimer la niche

À la lumière de nos résultats, le cumul de deux ou même trois chambres LRS d’un même

donneur pourrait fournir entre 4 à 6 x 106 de cellules CD34+ présentant un potentiel de

régénération rapide de plusieurs lignées hématopoïétiques. Bien que cette quantité soit

insuffisante pour la greffe puisque 5 x 106 CD34+ /Kg sont normalement requis [86, 88],

cela représente tout de même une bonne quantité initiale pour l’expansion ex vivo. Dans

ce cas, une expansion de 25 à 50 fois est nécessaire pour atteindre une cible réaliste pour

la thérapie cellulaire. Cependant cette expansion doit se produire tout en conservant les

capacités de régénération du système hématopoïétique.

Ces travaux visaient aussi à adresser le défi de mettre au point un modèle de culture ex

vivo en combinant la condition physiologique d’oxygène du corps humain (8% oxygène)

avec l’utilisation d’un milieu sans sérum pour faire proliférer les cellules CD34+ trappées

dans les chambres LRS. Étant donné que la majorité des études sur les cellules souches

sont effectuées en condition d’oxygène atmosphérique, la condition à 21% d’oxygène a

été utilisée comme référence, et par besoin de comparaison aux autres études.

Page 92: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

80

En premier lieu, nos résultats montrent l’efficacité du milieu sans protéine animale

développé par notre équipe (APFM) à supporter l’expansion des cellules CD34+ du sang.

Cette efficacité était d’ailleurs similaire à celle observée avec un milieu sans sérum

commercial, spécialement conçu pour la culture des cellules souches. Une expansion de 3

à 7 fois du nombre de cellules CD34+ a pu être obtenue dans les deux milieux après 7

jours de culture. De plus, le nombre total de cellules CD45+ a été augmenté jusqu’à un

maximum de 20 fois. Ces résultats justifient l’utilisation du milieu APFM pour cultiver les

cellules CD34+ des chambres LRS. De plus, le milieu sans sérum maison donne la

possibilité de modifier au besoin chacune des composantes alors que la composition du

milieu commercial n’est pas divulguée et que les composantes ne peuvent donc pas être

modifiées. Cet avantage offre la possibilité de recréer plus facilement un environnement

adapté à nos besoins qui peut mimer la niche hématopoïétique aux différentes étapes de

différenciation des HSC.

Les résultats d’expansion des cellules CD34+ des chambres LRS tendent à montrer que le

biais vers la lignée érythroïde a été conservé autant dans le milieu de culture maison

(APFM) que dans le milieu commercial selon les essais de caractérisation des

progéniteurs (Methocult). Conséquemment, des essais ont été faits pour tenter de

diminuer le biais érythroïde via la manipulation des composantes du milieu APFM. Le

retrait de l’IGF-1, connu pour stimuler l’érythropoïèse [190-192], n’a pas influencé le

comportement des cellules CD34+ à favoriser la branche MEP. Aucune différence n’a été

observée lors de la différenciation selon une caractérisation des phénotypes avec les

marqueurs de la famille SLAM, CD48 et CD244. Autant les cellules cultivées en présence

qu’en absence de l’IGF-1 ont générées entre 10 à 20% de cellules exprimant CD235a

et/ou CD41a contre moins de 2% pour le CD14. D’autre part, l’ajout de GM-CSF, cytokine

principale de la myélopoïèse [58], n’a pas permis d’augmenter la génération de cellules

myéloïdes en culture. Le milieu APFM supplémenté ou non avec du GM-CSF a produit

principalement des cellules CD45+CD45RA-CD71+, phénotype associé aux MEP. Aucune

augmentation de la proportion de cellules CD33+, CD13+ ou CD14+ n’a pas pu être

observée avec l’ajout de GM-CSF, ce qui était pourtant attendu.

Ces observations montrent que le biais érythroïde est intrinsèque aux cellules et non

dépendant des constituants du milieu de culture. Un biais menant à favoriser la

différenciation érythroïde par les cellules souches a déjà été observé dans les HSC de la

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moelle osseuse de souris déficiente en Mi-2β, une protéine permettant le remodelage de

la chromatine [201]. Il est donc plausible de croire que des modifications épigénétiques

pourraient se produire lors de la migration des HSC vers la circulation sanguine pour

favoriser la génération d’érythrocytes qui représente 45% du sang total et environ 99%

des éléments cellulaires du système sanguin [48]. Avec cette modification génétique, le

maintien d’un nombre suffisant de globules rouges pourrait ainsi être facilité via

l’érythropoïèse extra-médullaire tel que démontré dans cette étude.

6.5 L’hypoxie pour la culture ex vivo des cellules CD34+

Durant nos travaux, les cultures des cellules ont été effectuées afin de comparer une

condition d’oxygène atmosphérique (environ 21% O2) à une condition d’oxygène se

rapprochant des conditions physiologiques d’oxygène retrouvées dans les niches

périvasculaires, soit 8% O2 [84]. Pour mimer cette dernière condition, les cellules ont été

incubées dans un incubateur à CO2 permettant de contrôler le niveau d’oxygène de

l’environnement de culture. Afin de maintenir un équilibre gazeux le plus constant possible

dans les cultures cellulaires, le milieu de culture utilisé en condition hypoxique a toujours

été pré-incubé à 8% O2 environ 24h avant les changements de milieux afin que l’oxygène

dissout dans le milieu soit équilibré avec l’environnement gazeux [202, 203]. De plus, le

temps de manipulation des cellules à l’extérieur de l’incubateur a toujours été réduit au

minimum (< 30 min.) pour éviter d’exposer les cellules et les milieux de culture aux

conditions atmosphériques et d’affecter l’équilibre gazeux. Néanmoins, malgré ces

précautions, il est important de souligner que toutes les manipulations des cellules

mononuclées et la préparation des cellules souches avant la mise en culture ont été

réalisées en conditions atmosphériques. Il est donc possible que ces étapes de

manipulation des cellules ait induit un choc hyperoxique provoquant un changement

irréversible dans les cellules en culture tel que récemment rapporté par Mantel et

Broxmeyer [204, 205]. Les travaux de cette équipe ont montré qu’une exposition de 60

minutes des HSC à des concentrations élevées d’oxygène induirait une différenciation

irréversible vers les lignées de progéniteurs et avait un impact négatif sur le potentiel de

régénération à long-terme. Cet effet négatif d’une exposition à l’air ambiant pourrait

expliquer l’absence de différence flagrante entre les essais réalisé a 21% versus 8% O2,

autant au niveau de la viabilité de l’expansion que du phénotype. D’autant plus que l’ajout

d’un antioxydant au milieu de culture, le NAC, lors des cultures en condition

atmosphérique n’a pas eu d’influence sur les cellules.

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82

De plus, dans le but d’évaluer la capacité des cellules CD34+ à répondre à leur

environnement faible en oxygène, l’expression de la protéine HIF-1α a été mesurée

puisque c’est un marqueur important pour les cellules subissant l’hypoxie [84]. Dans ces

essais, la protéine HIF-1ne fut pas détectée en condition d’oxygène physiologique (8%

O2). Ces résultats suggèrent que la protéine HIF-1 ne peut pas être détectée dans nos

conditions de culture parce que la concentration en oxygène n’est pas assez proche des

conditions de la moelle osseuse (< 5%) [152]. Bien que toujours exprimée, la protéine aura

été rapidement dégradée dans nos conditions étant donnée la concentration trop élevée

de 8% O2 [151]. HIF-1α devrait être détectable à des concentrations plus faibles que 3%

O2 [195]. Cela signifie que la condition d’oxygène physiologique utilisée dans cette étude

n’est pas assez faible pour activer les voies de signalisation de l’hypoxie. Le métabolisme

des cellules à 21% et à 8% étaient possiblement les mêmes et la respiration anaérobique

n’a probablement pas été utilisée par les cellules cultivées à 8% O2.

Néanmoins, la fine caractérisation multiparamétrique du phénotype des cellules réalisée

avec SPADE a permis d’observer une légère tendance à générer une plus grande

hétérogénéité dans les populations de progéniteurs et de cellules effectrices en présence

de 8% de O2. Les arbres SPADE ont permis de représenter l’évolution des cellules CD34+

dans l’hématopoïèse en groupant hiérarchiquement les cellules selon leur phénotype. En

utilisant cette représentation, la condition d’oxygène physiologique a permis d’observer

une différence quant à l’engagement des cellules vers la population de MEP. L’outil

SPADE a aussi permis de visualiser que les cellules cultivées à 8% d’O2 généraient moins

de Mk et d’érythrocytes comparativement aux cellules cultivées à 21% O2. Bien que cette

étude ne permette pas de conclure quant à la capacité fonctionnelle de régénération

hématopoïétique des cellules et que l’expansion des cellules CD34+ ne soit pas suffisante

pour la thérapie, la génération d’une meilleure diversité des populations par un

environnement à 8% O2 est très intéressante pour d’éventuelles applications cliniques.

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83

7 Conclusion

Cette étude a permis de montrer que les cellules CD34+ du sang adulte présentent une

grande hétérogénéité des progéniteurs pour la reconstitution hématopoïétique et ce,

même après la culture dans un milieu sans sérum. De plus, nos données indiquent qu’une

concentration d’oxygène se rapprochant des conditions physiologiques de la moelle

osseuse et des niches hématopoïétiques contribue à préserver une meilleure

hétérogénéité des populations cellulaires. Cette étude supporte le fait que les cellules

CD34+ présentes dans les systèmes de leucoréduction sont un modèle valable pour

l’étude des HSC pour la thérapie cellulaire. Les résultats de cette étude ont d’ailleurs été

publiés récemment dans la revue Cytotherapy [206].

Cette étude est un premier pas et il entendu que davantage de données doivent être

accumulées afin de montrer leur capacité de prise de greffes dans des modèles murins

appropriés tel que les souris immunodéficientes NOD/SCID/gamma [207]. De plus, pour

atteindre des niveaux thérapeutiques avec les CD34+ du sang adulte, une expansion plus

importante est clairement nécessairement puisque environ 8x106 CD34+/Kg pourrait être

nécessaire pour la greffe alors que les quantités finales de cellules CD34 obtenues dans

cette étude sont de l'ordre de 10x106. Le défi majeur avec la culture des cellules souches

est certainement de maintenir l’autorenouvèlement des cellules les plus primitives qui sont

très facilement engagées de façon irréversibles vers la différenciation. Cependant, la

nouvelle molécule UM171 de l’équipe de Dr Sauvageau qui permet le maintien des HSC à

long terme dans le sang de cordon [168] pourrait permettre l’utilisation des chambres LRS

comme source de cellules CD34+ pour la transplantation. Il faut bien entendu tenir compte

que l’utilisation des CD34+ dérivées des chambres LRS requiert des manipulations ex vivo

complexes comparativement au sang de cordon, à la moelle osseuse et au sang mobilisé

couramment utilisés pour les applications cliniques. Quoiqu’il en soit, ces cellules

pourraient un jour être considérées comme une alternative future dans le domaine de la

thérapie cellulaire [82, 83, 109].

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8 Références

1. Nadig, R.R., Stem cell therapy - Hype or hope? A review. J Conserv Dent, 2009. 12(4): p. 131-8.

2. Yamanaka, S., Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell, 2012. 10(6): p. 678-84.

3. Larijani, B., E.N. Esfahani, P. Amini, B. Nikbin, K. Alimoghaddam, S. Amiri, R. Malekzadeh, N.M. Yazdi, M. Ghodsi, Y. Dowlati, M.A. Sahraian, and A. Ghavamzadeh, Stem cell therapy in treatment of different diseases. Acta Med Iran, 2012. 50(2): p. 79-96.

4. Ema, K., and Nakauchi, Principles of Hematopoietic Stem Cell Biology, in Hematopoietic Stem Cell Biology, M. Kondo, Editor. 2010, Humana Press.

5. Purton, L.E. and Scadden, D.T., The hematopoietic stem cell niche (November 15, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/10.3824/stembook.1.28.1, http://www.stembook.org.

6. Copelan, E.A., Hematopoietic stem-cell transplantation. N Engl J Med, 2006. 354(17): p. 1813-26.

7. Miller, P.H., D.J. Knapp, and C.J. Eaves, Heterogeneity in hematopoietic stem cell populations: implications for transplantation. Curr Opin Hematol, 2013. 20(4): p. 257-64.

8. Nygren, J.M., D. Bryder, and S.E. Jacobsen, Prolonged cell cycle transit is a defining and developmentally conserved hemopoietic stem cell property. J Immunol, 2006. 177(1): p. 201-8.

9. Appelbaum, F.R., Retrospective. E. Donnall Thomas (1920-2012). Science, 2012. 338(6111): p. 1163.

10. Domen, J., Wagers, A. and Weissman, I.L. (2006) Regenerative Medicine Bone Marrow (Hematopoietic) Stem Cells. National Institute of Health, 2, 14-28.

11. Jacobsen, L., E. Marks, E. Gastonn, and R. Zirkle, Effect of spleen protection on mortality following X-irradiation. J Lab Clin Med, 1949. 34: p. 1538-1543.

12. Lorenz, E., E. Uphoff, T. Reid, and E. Shelton, Modification of acute irradiation injury in mice and guinea pigs by bone marrow injection. Radiology, 1951. 58: p. 863-877.

13. Gengozian, N., I. Urso, C. Congdon, A. Conger, and T. Makinodan, Thymus specificity in lethally irradiated mice treated with rat bone marrow. Proc Soc Exp Biol Med, 1957. 96: p. 714-720.

14. Nowell, P.C., L.J. Cole, J.G. Habermeyer, and P.L. Roan, Growth and continued function of rat marrow cells in x-radiated mice. Cancer Res, 1956. 16(3): p. 258-61.

15. Ford, C.E., J.L. Hamerton, D.W. Barnes, and J.F. Loutit, Cytological identification of radiation-chimaeras. Nature, 1956. 177(4506): p. 452-4.

16. Becker, A.J., C.E. McCullogh, and J.E. Till, Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature, 1963. 197: p. 452-4.

17. Till, J.E. and C.E. McCullogh, A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res, 1961. 14: p. 213-22.

18. Wognum, A. and S. Szilvassy, Mini Review - Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, StemCellsTechnologies, Editor. 2013. p. 1-8.

19. Calloni, R., E.A. Cordero, J.A. Henriques, and D. Bonatto, Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells. Stem Cells Dev, 2013. 22(9): p. 1455-76.

Page 97: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

85

20. Osawa, M., K. Hanada, H. Hamada, and H. Nakauchi, Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science, 1996. 273(5272): p. 242-5.

21. Humeau, L., F. Bardin, C. Maroc, T. Alario, R. Galindo, P. Mannoni, and C. Chabannon, Phenotypic, molecular, and functional characterization of human peripheral blood CD34+/THY1+ cells. Blood, 1996. 87(3): p. 949-55.

22. Majeti, R., C.Y. Park, and I.L. Weissman, Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell, 2007. 1(6): p. 635-45.

23. Hess, D.A., L. Wirthlin, T.P. Craft, P.E. Herrbrich, S.A. Hohm, R. Lahey, W.C. Eades, M.H. Creer, and J.A. Nolta, Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood, 2006. 107(5): p. 2162-9.

24. Roy, S., M. Tripathy, N. Mathur, A. Jain, and A. Mukhopadhyay, Hypoxia improves expansion potential of human cord blood-derived hematopoietic stem cells and marrow repopulation efficiency. Eur J Haematol, 2012. 88(5): p. 396-405.

25. Wognum, A.W., A.C. Eaves, and T.E. Thomas, Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Arch Med Res, 2003. 34(6): p. 461-75.

26. Babovic, S. and C.J. Eaves, Hierarchical organization of fetal and adult hematopoietic stem cells. Exp Cell Res, 2014. 329(2): p. 185-91.

27. Uchida, N. and I.L. Weissman, Searching for hematopoietic stem cells: evidence that Thy-1.1lo Lin- Sca-1+ cells are the only stem cells in C57BL/Ka-Thy-1.1 bone marrow. J Exp Med, 1992. 175(1): p. 175-84.

28. Spangrude, G.J., S. Heimfeld, and I.L. Weissman, Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science, 1988. 241(4861): p. 58-62.

29. Geissler, E.N., M. Liao, J.D. Brook, F.H. Martin, K.M. Zsebo, D.E. Housman, and S.J. Galli, Stem cell factor (SCF), a novel hematopoietic growth factor and ligand for c-kit tyrosine kinase receptor, maps on human chromosome 12 between 12q14.3 and 12qter. Somat Cell Mol Genet, 1991. 17(2): p. 207-14.

30. Nervi, B., D.C. Link, and J.F. DiPersio, Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization. J Cell Biochem, 2006. 99(3): p. 690-705.

31. Doulatov, S., F. Notta, E. Laurenti, and J.E. Dick, Hematopoiesis: a human perspective. Cell Stem Cell, 2012. 10(2): p. 120-36.

32. Wang, W., J. Shook, M. Edinger, N. Warner, and C. Bush-Donovan, Multiparametric Immunophenotyping of Human Hematopoietic Stem Cells and Progenitor Cells by Flow Cytometry. BD Biosciences, San Jose, Ca, 2012.

33. Lai, A.Y., S.M. Lin, and M. Kondo, Heterogeneity of Flt3-expressing multipotent progenitors in mouse bone marrow. J Immunol, 2005. 175(8): p. 5016-23.

34. Hao, Q.L., J. Zhu, M.A. Price, K.J. Payne, L.W. Barsky, and G.M. Crooks, Identification of a novel, human multilymphoid progenitor in cord blood. Blood, 2001. 97(12): p. 3683-90.

35. Manz, M.G., T. Miyamoto, K. Akashi, and I.L. Weissman, Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(18): p. 11872-7.

36. Doulatov, S., F. Notta, K. Eppert, L.T. Nguyen, P.S. Ohashi, and J.E. Dick, Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nat Immunol, 2010. 11(7): p. 585-93.

37. Tounkara, F.K., N. Dumont, S. Fournier, L. Boyer, P. Nadeau, and N. Pineault, Mild hyperthermia promotes and accelerates development and maturation of erythroid cells. Stem Cells Dev, 2012. 21(17): p. 3197-208.

Page 98: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

86

38. Singh, V.K., A. Saini, K. Tsuji, P.B. Sharma, and R. Chandra, Manufacturing blood ex vivo: a futuristic approach to deal with the supply and safety concerns. Front Cell Dev Biol, 2014. 2: p. 26.

39. Wu, H., X. Liu, R. Jaenisch, and H.F. Lodish, Generation of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor. Cell, 1995. 83(1): p. 59-67.

40. Stopka, T., J.H. Zivny, P. Stopkova, J.F. Prchal, and J.T. Prchal, Human hematopoietic progenitors express erythropoietin. Blood, 1998. 91(10): p. 3766-72.

41. Marsee, D.K., G.S. Pinkus, and H. Yu, CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol, 2010. 134(3): p. 429-35.

42. Peschel, C., G. Konwalinka, D. Geissler, H. Braunsteiner, and W. Knapp, Changes of the phenotype of erythroid progenitor cells (BFU-E, CFU-E) and their progenies during early steps of differentiation. Br J Haematol, 1987. 65(2): p. 131-5.

43. Ziegler, B.L., R. Muller, M. Valtieri, C.P. Lamping, C.A. Thomas, M. Gabbianelli, C. Giesert, H.J. Buhring, L. Kanz, and C. Peschle, Unicellular-unilineage erythropoietic cultures: molecular analysis of regulatory gene expression at sibling cell level. Blood, 1999. 93(10): p. 3355-68.

44. An, X. and N. Mohandas, Erythroblastic islands, terminal erythroid differentiation and reticulocyte maturation. Int J Hematol, 2011. 93(2): p. 139-43.

45. Pottgiesser, T., W. Specker, M. Umhau, H.H. Dickhuth, K. Roecker, and Y.O. Schumacher, Recovery of hemoglobin mass after blood donation. Transfusion, 2008. 48(7): p. 1390-7.

46. Hollan, S., Molecular structure and function of erythrocyte blood group antigens. Haematologia (Budap), 2000. 30(4): p. 237-52.

47. Hamasaki, N. and M. Yamamoto, Red blood cell function and blood storage. Vox Sang, 2000. 79(4): p. 191-7.

48. Alberts, B., Molecular biology of the cell. 5th ed. 2008, New York: Garland Science. xxxiii, 1268, [90] p.

49. Liu, X.L., J.Y. Yuan, J.W. Zhang, X.H. Zhang, and R.X. Wang, Differential gene expression in human hematopoietic stem cells specified toward erythroid, megakaryocytic, and granulocytic lineage. J Leukoc Biol, 2007. 82(4): p. 986-1002.

50. Szalai, G., A.C. LaRue, and D.K. Watson, Molecular mechanisms of megakaryopoiesis. Cell Mol Life Sci, 2006. 63(21): p. 2460-76.

51. Pineault, N., A. Robert, V. Cortin, and L. Boyer, Ex vivo differentiation of cord blood stem cells into megakaryocytes and platelets. Methods Mol Biol, 2013. 946: p. 205-24.

52. Wen, Q., B. Goldenson, and J.D. Crispino, Normal and malignant megakaryopoiesis. Expert Rev Mol Med, 2011. 13: p. e32.

53. Nurden, A.T. and P. Nurden, Increasing the platelet count in chronic ITP. Lancet, 2008. 371(9610): p. 362-4.

54. Schulze, H. and R.A. Shivdasani, Mechanisms of thrombopoiesis. J Thromb Haemost, 2005. 3(8): p. 1717-24.

55. Cortin, V., A. Garnier, N. Pineault, R. Lemieux, L. Boyer, and C. Proulx, Efficient in vitro megakaryocyte maturation using cytokine cocktails optimized by statistical experimental design. Exp Hematol, 2005. 33(10): p. 1182-91.

56. Danby, R. and V. Rocha, Improving Engraftment and Immune Reconstitution in Umbilical Cord Blood Transplantation. Front Immunol, 2014. 5: p. 68.

57. Manz, M.G. and S. Boettcher, Emergency granulopoiesis. Nat Rev Immunol, 2014. 14(5): p. 302-14.

Page 99: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

87

58. Taussig, D.C., D.J. Pearce, C. Simpson, A.Z. Rohatiner, T.A. Lister, G. Kelly, J.L. Luongo, G.A. Danet-Desnoyers, and D. Bonnet, Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers: implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia. Blood, 2005. 106(13): p. 4086-92.

59. Mead, A.J., S. Kharazi, D. Atkinson, I. Macaulay, C. Pecquet, S. Loughran, M. Lutteropp, P. Woll, O. Chowdhury, S. Luc, N. Buza-Vidas, H. Ferry, S.A. Clark, N. Goardon, P. Vyas, S.N. Constantinescu, E. Sitnicka, C. Nerlov, and S.E. Jacobsen, FLT3-ITDs instruct a myeloid differentiation and transformation bias in lymphomyeloid multipotent progenitors. Cell Rep, 2013. 3(6): p. 1766-76.

60. Gaipa, G., E. Coustan-Smith, E. Todisco, O. Maglia, A. Biondi, and D. Campana, Characterization of CD34+, CD13+, CD33- cells, a rare subset of immature human hematopoietic cells. Haematologica, 2002. 87(4): p. 347-56.

61. Akel, S., C. Petrow-Sadowski, M.J. Laughlin, and F.W. Ruscetti, Neutralization of autocrine transforming growth factor-beta in human cord blood CD34(+)CD38(-)Lin(-) cells promotes stem-cell-factor-mediated erythropoietin-independent early erythroid progenitor development and reduces terminal differentiation. Stem Cells, 2003. 21(5): p. 557-67.

62. Merindol, N., E. Charrier, M. Duval, and H. Soudeyns, Complementary and contrasting roles of NK cells and T cells in pediatric umbilical cord blood transplantation. J Leukoc Biol, 2011. 90(1): p. 49-60.

63. !!! INVALID CITATION !!! . 64. Nutt, S.L., P.D. Hodgkin, D.M. Tarlinton, and L.M. Corcoran, The generation of

antibody-secreting plasma cells. Nat Rev Immunol, 2015. 15(3): p. 160-71. 65. Yu, J., A.G. Freud, and M.A. Caligiuri, Location and cellular stages of natural killer

cell development. Trends Immunol, 2013. 34(12): p. 573-82. 66. Koch, U. and F. Radtke, Mechanisms of T cell development and transformation.

Annu Rev Cell Dev Biol, 2011. 27: p. 539-62. 67. Politikos, I. and V.A. Boussiotis, The role of the thymus in T-cell immune

reconstitution after umbilical cord blood transplantation. Blood, 2014. 124(22): p. 3201-11.

68. Maecker, H.T., J.P. McCoy, and R. Nussenblatt, Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat Rev Immunol, 2012. 12(3): p. 191-200.

69. OMS, Haematopoietic Stem Cell Transplantation HSCtx, in http://www.who.int/transplantation/hsctx/en/. Consulté le 06-10-2014.

70. Jansen, J., S. Hanks, J.M. Thompson, M.J. Dugan, and L.P. Akard, Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. J Cell Mol Med, 2005. 9(1): p. 37-50.

71. Gratwohl, A. and H. Baldomero, European survey on clinical use of cord blood for hematopoietic and non-hematopoietic indications. Transfus Apher Sci, 2010. 42(3): p. 265-75.

72. Chevallier, P., N. Robillard, M. Illiaquer, J. Esbelin, M. Mohty, C. Bodin-Bressollette, T. Guillaume, V. Stocco, F. Auffray, S. Derenne, L. Planche, M.C. Bene, and B.M. Imbert-Marcille, Characterization of various blood and graft sources: a prospective series. Transfusion, 2013. 53(9): p. 2020-6.

73. Passweg, J.R., J. Halter, C. Bucher, S. Gerull, D. Heim, A. Rovo, A. Buser, M. Stern, and A. Tichelli, Hematopoietic stem cell transplantation: a review and recommendations for follow-up care for the general practitioner. Swiss Med Wkly, 2012. 142: p. w13696.

74. Gratwohl, A., H. Baldomero, M. Aljurf, M.C. Pasquini, L.F. Bouzas, A. Yoshimi, J. Szer, J. Lipton, A. Schwendener, M. Gratwohl, K. Frauendorfer, D. Niederwieser,

Page 100: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

88

M. Horowitz, and Y. Kodera, Hematopoietic stem cell transplantation: a global perspective. JAMA, 2010. 303(16): p. 1617-24.

75. BeTheMatch, Finding a Donor, in http://bethematch.org/for-patients-and-families/finding-a-donor/hla-matching/. Consulté le 05-02-2015.

76. Choo, S.Y., The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications. Yonsei Med J, 2007. 48(1): p. 11-23.

77. Howell, W.M., V. Carter, and B. Clark, The HLA system: immunobiology, HLA typing, antibody screening and crossmatching techniques. J Clin Pathol, 2010. 63(5): p. 387-90.

78. Kekre, N. and J.H. Antin, Hematopoietic stem cell transplantation donor sources in the 21st century: choosing the ideal donor when a perfect match does not exist. Blood, 2014. 124(3): p. 334-43.

79. Goker, H., I.C. Haznedaroglu, and N.J. Chao, Acute graft-vs-host disease: pathobiology and management. Exp Hematol, 2001. 29(3): p. 259-77.

80. Lee, S.J., G. Vogelsang, and M.E. Flowers, Chronic graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant, 2003. 9(4): p. 215-33.

81. Kim, E.J., N. Kim, and S.G. Cho, The potential use of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation. Exp Mol Med, 2013. 45: p. e2.

82. Brunet de la Grange, P., M. Vlaski, P. Duchez, J. Chevaleyre, V. Lapostolle, J.M. Boiron, V. Praloran, and Z. Ivanovic, Long-term repopulating hematopoietic stem cells and "side population" in human steady state peripheral blood. Stem Cell Res, 2013. 11(1): p. 625-33.

83. Peytour, Y., A. Villacreces, J. Chevaleyre, Z. Ivanovic, and V. Praloran, Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy? Stem Cell Res, 2013. 11(2): p. 736-42.

84. Eliasson, P. and J.I. Jonsson, The hematopoietic stem cell niche: low in oxygen but a nice place to be. J Cell Physiol, 2010. 222(1): p. 17-22.

85. Oran, B. and E. Shpall, Umbilical cord blood transplantation: a maturing technology. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2012. 2012: p. 215-22.

86. Korbling, M. and P. Anderlini, Peripheral blood stem cell versus bone marrow allotransplantation: does the source of hematopoietic stem cells matter? Blood, 2001. 98(10): p. 2900-8.

87. Jones, K., Resources guide for stem cells transplant, N.B.M.T. Link, Editor. 2006: Southfield,MI.

88. Bittencourt, H., V. Rocha, S. Chevret, G. Socie, H. Esperou, A. Devergie, L. Dal Cortivo, J.P. Marolleau, F. Garnier, P. Ribaud, and E. Gluckman, Association of CD34 cell dose with hematopoietic recovery, infections, and other outcomes after HLA-identical sibling bone marrow transplantation. Blood, 2002. 99(8): p. 2726-33.

89. National Cord Blood Program, N.Y.B.C., Comparison Between Bone Marrow or Peripheral Blood Stem Cells and Cord Blood Donated for Transplantation in http://www.nationalcordbloodprogram.org/qa/comparison.html. Consulté le 10-02-2015.

90. Korbling, M., S. Giralt, I. Khouri, N. Mirza, M. Donato, P. Anderlini, H. Fischer, M. Andreeff, J. McMannis, and R. Champlin, Donor lymphocyte apheresis for adoptive immunotherapy compared with blood stem cell apheresis. J Clin Apher, 2001. 16(2): p. 82-7.

91. Holig, K., G-CSF in Healthy Allogeneic Stem Cell Donors. Transfus Med Hemother, 2013. 40(4): p. 225-35.

92. Pulsipher, M.A., P. Chitphakdithai, B.R. Logan, B.E. Shaw, J.R. Wingard, H.M. Lazarus, E.K. Waller, M. Seftel, D.F. Stroncek, A.M. Lopez, D. Maharaj, P. Hematti, P.V. O'Donnell, A.W. Loren, S.F. Leitman, P. Anderlini, S.C. Goldstein, J.E. Levine,

Page 101: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

89

W.H. Navarro, J.P. Miller, and D.L. Confer, Acute toxicities of unrelated bone marrow versus peripheral blood stem cell donation: results of a prospective trial from the National Marrow Donor Program. Blood, 2013. 121(1): p. 197-206.

93. Ballen, K.K., E. Gluckman, and H.E. Broxmeyer, Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood, 2013. 122(4): p. 491-8.

94. Shu, Z., S. Heimfeld, and D. Gao, Hematopoietic SCT with cryopreserved grafts: adverse reactions after transplantation and cryoprotectant removal before infusion. Bone Marrow Transplant, 2014. 49(4): p. 469-76.

95. Jaime-Perez, J.C., R. Monreal-Robles, L.N. Rodriguez-Romo, C. Mancias-Guerra, J.L. Herrera-Garza, and D. Gomez-Almaguer, Evaluation of volume and total nucleated cell count as cord blood selection parameters: a receiver operating characteristic curve modeling approach. Am J Clin Pathol, 2011. 136(5): p. 721-6.

96. Stavropoulos-Giokas, C., A. Dinou, and A. Papassavas, The Role of HLA in Cord Blood Transplantation. Bone Marrow Res, 2012. 2012: p. 485160.

97. McCredie, K.B., E.M. Hersh, and E.J. Freireich, Cells capable of colony formation in the peripheral blood of man. Science, 1971. 171(3968): p. 293-4.

98. Anderlini, P. and M. Korbling, The use of mobilized peripheral blood stem cells from normal donors for allografting. Stem Cells, 1997. 15(1): p. 9-17.

99. Mendez-Ferrer, S., D. Lucas, M. Battista, and P.S. Frenette, Haematopoietic stem cell release is regulated by circadian oscillations. Nature, 2008. 452(7186): p. 442-7.

100. Jung, Y., J. Song, Y. Shiozawa, J. Wang, Z. Wang, B. Williams, A. Havens, A. Schneider, C. Ge, R.T. Franceschi, L.K. McCauley, P.H. Krebsbach, and R.S. Taichman, Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells, 2008. 26(8): p. 2042-51.

101. Mendez-Ferrer, S., A. Chow, M. Merad, and P.S. Frenette, Circadian rhythms influence hematopoietic stem cells. Curr Opin Hematol, 2009. 16(4): p. 235-42.

102. Granick, J.L., S.I. Simon, and D.L. Borjesson, Hematopoietic stem and progenitor cells as effectors in innate immunity. Bone Marrow Res, 2012. 2012: p. 165107.

103. Nagai, Y., K.P. Garrett, S. Ohta, U. Bahrun, T. Kouro, S. Akira, K. Takatsu, and P.W. Kincade, Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity, 2006. 24(6): p. 801-12.

104. Jalili, A., N. Shirvaikar, L. Marquez-Curtis, Y. Qiu, C. Korol, H. Lee, A.R. Turner, M.Z. Ratajczak, and A. Janowska-Wieczorek, Fifth complement cascade protein (C5) cleavage fragments disrupt the SDF-1/CXCR4 axis: further evidence that innate immunity orchestrates the mobilization of hematopoietic stem/progenitor cells. Exp Hematol, 2010. 38(4): p. 321-32.

105. Semerad, C.L., M.J. Christopher, F. Liu, B. Short, P.J. Simmons, I. Winkler, J.P. Levesque, J. Chappel, F.P. Ross, and D.C. Link, G-CSF potently inhibits osteoblast activity and CXCL12 mRNA expression in the bone marrow. Blood, 2005. 106(9): p. 3020-7.

106. Soderquist, B., J. Kallman, H. Holmberg, T. Vikerfors, and E. Kihlstrom, Secretion of IL-6, IL-8 and G-CSF by human endothelial cells in vitro in response to Staphylococcus aureus and staphylococcal exotoxins. APMIS, 1998. 106(12): p. 1157-64.

107. Massberg, S., P. Schaerli, I. Knezevic-Maramica, M. Kollnberger, N. Tubo, E.A. Moseman, I.V. Huff, T. Junt, A.J. Wagers, I.B. Mazo, and U.H. von Andrian, Immunosurveillance by hematopoietic progenitor cells trafficking through blood, lymph, and peripheral tissues. Cell, 2007. 131(5): p. 994-1008.

Page 102: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

90

108. Johns, J.L. and M.M. Christopher, Extramedullary hematopoiesis: a new look at the underlying stem cell niche, theories of development, and occurrence in animals. Vet Pathol, 2012. 49(3): p. 508-23.

109. Ivanovic, Z., P. Duchez, D.A. Morgan, F. Hermitte, X. Lafarge, J. Chevaleyre, V. Praloran, B. Dazey, G. Vezon, and J.M. Boiron, Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion, 2006. 46(1): p. 118-25.

110. Peytour, Y., A. Guitart, A. Villacreces, J. Chevaleyre, F. Lacombe, Z. Ivanovic, and V. Praloran, Obtaining of CD34+ cells from healthy blood donors: development of a rapid and efficient procedure using leukoreduction filters. Transfusion, 2010. 50(10): p. 2152-7.

111. Meyer, T.P., I. Zehnter, B. Hofmann, J. Zaisserer, J. Burkhart, S. Rapp, F. Weinauer, J. Schmitz, and W.E. Illert, Filter Buffy Coats (FBC): A source of peripheral blood leukocytes recovered from leukocyte depletion filters. J Immunol Methods, 2005. 307(1-2): p. 150-66.

112. NéronNeron, S., L. Thibault, N. Dussault, G. Cote, E. Ducas, N. Pineault, and A. Roy, Characterization of mononuclear cells remaining in the leukoreduction system chambers of apheresis instruments after routine platelet collection: a new source of viable human blood cells. Transfusion, 2007. 47(6): p. 1042-9.

113. Snyder, E. and J. Choate, The emergence of cellular therapy: impact on transfusion medicine. Transfusion, 2010. 50(11): p. 2301-9.

114. Snyder, E.L., Component therapy to cellular therapy and beyond- a Darwinian approach to transfusion medicine. Transfusion, 2008. 48(9): p. 2000-7.

115. Dubuc, S. and M. Germain, Rapport démographique annuel 2013-2014. Héma-Québec, 2014.

116. McKenna, D.H. and C.G. Brunstein, Umbilical cord blood: current status and future directions. Vox Sang, 2011. 100(1): p. 150-62.

117. Garcia, J., Allogeneic unrelated cord blood banking worldwide: an update. Transfus Apher Sci, 2010. 42(3): p. 257-63.

118. Héma-Québec, Communiqué de presse - La seule banque publique de sang de cordon en opération au Canada sauve de plus en plus de vies. 2013: Québec, CA.

119. Héma-Québec, Rapport Annuel 2013-2014. 2014. 120. Héma-Québec, Donneurs de cellules souches, in https://www.hema-

quebec.qc.ca/cellules-souches/donneur/index.fr.html. Consulté le 29 avril 2014. 121. Frei, R., C. Gaucher, S.W. Poulton, and D.E. Canfield, Fluctuations in Precambrian

atmospheric oxygenation recorded by chromium isotopes. Nature, 2009. 461(7261): p. 250-3.

122. Slimen, I.B., T. Najar, A. Ghram, H. Dabbebi, M. Ben Mrad, and M. Abdrabbah, Reactive oxygen species, heat stress and oxidative-induced mitochondrial damage. A review. Int J Hyperthermia, 2014. 30(7): p. 513-23.

123. Jez, M., P. Rozman, Z. Ivanovic, and T. Bas, Concise Review: The Role of Oxygen in Hematopoietic Stem Cells Physiology. J Cell Physiol, 2015. 230(9) p.1999-2005

124. Zachar, V., M. Duroux, J. Emmersen, J.G. Rasmussen, C.P. Pennisi, S. Yang, and T. Fink, Hypoxia and adipose-derived stem cell-based tissue regeneration and engineering. Expert Opin Biol Ther, 2011. 11(6): p. 775-86.

125. Mathieu, J., Z. Zhang, A. Nelson, D.A. Lamba, T.A. Reh, C. Ware, and H. Ruohola-Baker, Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells, 2013. 31(9): p. 1737-48.

126. Zhang, C.C. and H.A. Sadek, Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxid Redox Signal, 2014. 20(12): p. 1891-901.

Page 103: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

91

127. Dalloul, A., Hypoxia and visualization of the stem cell niche. Methods Mol Biol, 2013. 1035: p. 199-205.

128. Chow, D.C., L.A. Wenning, W.M. Miller, and E.T. Papoutsakis, Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. I. Krogh's model. Biophys J, 2001. 81(2): p. 675-84.

129. Harrison, J.S., P. Rameshwar, V. Chang, and P. Bandari, Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood, 2002. 99(1): p. 394.

130. Ivanovic, Z., Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J Cell Physiol, 2009. 219(2): p. 271-5.

131. Ivanovic, Z., Respect the anaerobic nature of stem cells to exploit their potential in regenerative medicine. Regen Med, 2013. 8(6): p. 677-80.

132. Jeanne, M., M. Kovacevic-Filipovic, M. Szyporta, M. Vlaski, F. Hermitte, X. Lafarge, P. Duchez, J.M. Boiron, V. Praloran, and Z. Ivanovic, Low-oxygen and high-carbon-dioxide atmosphere improves the conservation of hematopoietic progenitors in hypothermia. Transfusion, 2009. 49(8): p. 1738-46.

133. Vlaski, M., L. Negroni, M. Kovacevic-Filipovic, C. Guibert, P. Brunet de la Grange, R. Rossignol, J. Chevaleyre, P. Duchez, X. Lafarge, V. Praloran, J.M. Schmitter, and Z. Ivanovic, Hypoxia/hypercapnia-induced adaptation maintains functional capacity of cord blood stem and progenitor cells at 4 degrees C. J Cell Physiol, 2014. 229(12): p. 2153-65.

134. Schofield, R., The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells, 1978. 4(1-2): p. 7-25.

135. Lataillade, J.J., O. Pierre-Louis, H.C. Hasselbalch, G. Uzan, C. Jasmin, M.C. Martyre, and M.C. Le Bousse-Kerdiles, Does primary myelofibrosis involve a defective stem cell niche? From concept to evidence. Blood, 2008. 112(8): p. 3026-35.

136. Guezguez, B., C.J. Campbell, A.L. Boyd, F. Karanu, F.L. Casado, C. Di Cresce, T.J. Collins, Z. Shapovalova, A. Xenocostas, and M. Bhatia, Regional localization within the bone marrow influences the functional capacity of human HSCs. Cell Stem Cell, 2013. 13(2): p. 175-89.

137. Levesque, J.P. and I.G. Winkler, Hierarchy of immature hematopoietic cells related to blood flow and niche. Curr Opin Hematol, 2011. 18(4): p. 220-5.

138. Yin, T. and L. Li, The stem cell niches in bone. J Clin Invest, 2006. 116(5): p. 1195-201.

139. Nagayoshi, K., H. Ohkawa, K. Yorozu, M. Higuchi, S. Higashi, N. Kubota, H. Fukui, N. Imai, S. Gojo, J. Hata, Y. Kobayashi, and A. Umezawa, Increased mobilization of c-kit+ Sca-1+ Lin- (KSL) cells and colony-forming units in spleen (CFU-S) following de novo formation of a stem cell niche depends on dynamic, but not stable, membranous ossification. J Cell Physiol, 2006. 208(1): p. 188-94.

140. Nilsson, S.K. and I. Bertoncello, The development and establishment of hemopoiesis in fetal and newborn osteopetrotic (op/op) mice. Dev Biol, 1994. 164(2): p. 456-62.

141. Adams, G.B., K.T. Chabner, I.R. Alley, D.P. Olson, Z.M. Szczepiorkowski, M.C. Poznansky, C.H. Kos, M.R. Pollak, E.M. Brown, and D.T. Scadden, Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature, 2006. 439(7076): p. 599-603.

142. Lo Celso, C. and D.T. Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci, 2011. 124(Pt 21): p. 3529-35.

143. Levesque, J.P., A niche in a dish: pericytes support HSC. Blood, 2013. 121(15): p. 2816-8.

Page 104: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

92

144. Ehninger, A. and A. Trumpp, The bone marrow stem cell niche grows up: mesenchymal stem cells and macrophages move in. J Exp Med, 2011. 208(3): p. 421-8.

145. Bigas, A., J. Guiu, and L. Gama-Norton, Notch and Wnt signaling in the emergence of hematopoietic stem cells. Blood Cells Mol Dis, 2013. 51(4): p. 264-70.

146. Naveiras, O., V. Nardi, P.L. Wenzel, P.V. Hauschka, F. Fahey, and G.Q. Daley, Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature, 2009. 460(7252): p. 259-63.

147. Vande Berg, B.C., J. Malghem, F.E. Lecouvet, and B. Maldague, Magnetic resonance imaging of the normal bone marrow. Skeletal Radiol, 1998. 27(9): p. 471-83.

148. Semenza, G.L. and G.L. Wang, A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol, 1992. 12(12): p. 5447-54.

149. Semenza, G.L., Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell, 2012. 148(3): p. 399-408.

150. Suda, T., K. Takubo, and G.L. Semenza, Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell, 2011. 9(4): p. 298-310.

151. Page, E.L., D.A. Chan, A.J. Giaccia, M. Levine, and D.E. Richard, Hypoxia-inducible factor-1alpha stabilization in nonhypoxic conditions: role of oxidation and intracellular ascorbate depletion. Mol Biol Cell, 2008. 19(1): p. 86-94.

152. Takubo, K., N. Goda, W. Yamada, H. Iriuchishima, E. Ikeda, Y. Kubota, H. Shima, R.S. Johnson, A. Hirao, M. Suematsu, and T. Suda, Regulation of the HIF-1alpha level is essential for hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell, 2010. 7(3): p. 391-402.

153. Nombela-Arrieta, C., G. Pivarnik, B. Winkel, K.J. Canty, B. Harley, J.E. Mahoney, S.Y. Park, J. Lu, A. Protopopov, and L.E. Silberstein, Quantitative imaging of haematopoietic stem and progenitor cell localization and hypoxic status in the bone marrow microenvironment. Nat Cell Biol, 2013. 15(5): p. 533-43.

154. Piccoli, C., A. D'Aprile, M. Ripoli, R. Scrima, D. Boffoli, A. Tabilio, and N. Capitanio, The hypoxia-inducible factor is stabilized in circulating hematopoietic stem cells under normoxic conditions. FEBS Lett, 2007. 581(16): p. 3111-9.

155. The, M.J., Human insulin: DNA technology's first drug. Am J Hosp Pharm, 1989. 46(11 Suppl 2): p. S9-11.

156. Carmen, J., S.R. Burger, M. McCaman, and J.A. Rowley, Developing assays to address identity, potency, purity and safety: cell characterization in cell therapy process development. Regen Med, 2012. 7(1): p. 85-100.

157. Hesse, F. and R. Wagner, Developments and improvements in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures. Trends Biotechnol, 2000. 18(4): p. 173-80.

158. Kimmelman, J., H.E. Heslop, J. Sugarman, L. Studer, N. Benvenisty, T. Caulfield, I. Hyun, C.E. Murry, D. Sipp, and G.Q. Daley, New ISSCR guidelines: clinical translation of stem cell research. Lancet, 2016. 387(10032): p. 1979-81.

159. Brunner, D., J. Frank, H. Appl, H. Schoffl, W. Pfaller, and G. Gstraunthaler, Serum-free cell culture: the serum-free media interactive online database. Altex, 2010. 27(1): p. 53-62.

160. Yi, C.W., W.C. Xu, J. Chen, and Y. Liang, Recent progress in prion and prion-like protein aggregation. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2013. 45(6): p. 520-6.

161. Dimarakis, I. and N. Levicar, Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells, 2006. 24(5): p. 1407-8.

Page 105: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

93

162. Mannello, F. and G.A. Tonti, Concise review: no breakthroughs for human mesenchymal and embryonic stem cell culture: conditioned medium, feeder layer, or feeder-free; medium with fetal calf serum, human serum, or enriched plasma; serum-free, serum replacement nonconditioned medium, or ad hoc formula? All that glitters is not gold! Stem Cells, 2007. 25(7): p. 1603-9.

163. Néron, S., A. Roy, N. Dumont, and N. Dussault, Effective in vitro expansion of CD40-activated human B lymphocytes in a defined bovine protein-free medium. J Immunol Methods, 2011. 371(1-2): p. 61-9.

164. Pineault, N., J.F. Boucher, M.P. Cayer, L. Palmqvist, L. Boyer, R. Lemieux, and C. Proulx, Characterization of the effects and potential mechanisms leading to increased megakaryocytic differentiation under mild hyperthermia. Stem Cells Dev, 2008. 17(3): p. 483-93.

165. Gervais-Saint-Amour, C., Étude de la différenciation des lymphocytes B mémoires en milieu sans sérum : Influence du microenvironnement cellulaire, in Biochimie. 2013, Université Laval: Québec.

166. Verfaillie, C.M., Can human hematopoietic stem cells be cultured ex vivo? Stem Cells, 1994. 12(5): p. 466-76.

167. Ivanovic, Z. and J.M. Boiron, [Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells: concept and clinical benefit]. Transfus Clin Biol, 2009. 16(5-6): p. 489-500.

168. Fares, I., J. Chagraoui, Y. Gareau, S. Gingras, R. Ruel, N. Mayotte, E. Csaszar, D.J. Knapp, P. Miller, M. Ngom, S. Imren, D.C. Roy, K.L. Watts, H.P. Kiem, R. Herrington, N.N. Iscove, R.K. Humphries, C.J. Eaves, S. Cohen, A. Marinier, P.W. Zandstra, and G. Sauvageau, Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science, 2014. 345(6203): p. 1509-12.

169. Anselmetti, D., Single-cell analysis, ed. I. John Wiley & Sons. 2009. 170. Stegle, O., S.A. Teichmann, and J.C. Marioni, Computational and analytical

challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet, 2015. 16(3): p. 133-45. 171. Ouseph, S., D. Tappitake, M. Armant, R. Wesselschmidt, I. Derecho, R. Draxler, D.

Wood, and J.M. Centanni, Cellular Therapies Clinical Research Roadmap: lessons learned on how to move a cellular therapy into a clinical trial. Cytotherapy, 2015. 17(4): p. 339-43.

172. Qiu, P., E.F. Simonds, S.C. Bendall, K.D. Gibbs, Jr., R.V. Bruggner, M.D. Linderman, K. Sachs, G.P. Nolan, and S.K. Plevritis, Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol, 2011. 29(10): p. 886-91.

173. Amir el, A.D., K.L. Davis, M.D. Tadmor, E.F. Simonds, J.H. Levine, S.C. Bendall, D.K. Shenfeld, S. Krishnaswamy, G.P. Nolan, and D. Pe'er, viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol, 2013. 31(6): p. 545-52.

174. Maaten, L.J.P.v.d. and G.E. Hinton, Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research, 2008. 9(Nov): p. 2579-2605.

175. Lambie, K. and C. Eaves, Atlas of Human Hematopoietic colonies, ed. S.C. Technologies. 1995.

176. Kaufman, D.S., E.T. Hanson, R.L. Lewis, R. Auerbach, and J.A. Thomson, Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(19): p. 10716-21.

177. Sutherland, D.R., L. Anderson, M. Keeney, R. Nayar, and I. Chin-Yee, The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother, 1996. 5(3): p. 213-26.

Page 106: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

94

178. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

179. Keeney, M., I. Chin-Yee, K. Weir, J. Popma, R. Nayar, and D.R. Sutherland, Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry, 1998. 34(2): p. 61-70.

180. Taylor, R., Interpretation of the Correlation Coefficient: A Basic Review. JDMS, 1990. 6: p. 35-39.

181. van Lochem, E.G., V.H. van der Velden, H.K. Wind, J.G. te Marvelde, N.A. Westerdaal, and J.J. van Dongen, Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: reference patterns for age-related changes and disease-induced shifts. Cytometry B Clin Cytom, 2004. 60(1): p. 1-13.

182. McKenzie, J.L., O.I. Gan, M. Doedens, and J.E. Dick, Reversible cell surface expression of CD38 on CD34-positive human hematopoietic repopulating cells. Exp Hematol, 2007. 35(9): p. 1429-36.

183. Wang, Y., B.K. Chou, S. Dowey, C. He, S. Gerecht, and L. Cheng, Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem Cell Res, 2013. 11(3): p. 1103-16.

184. Bioscience, B., Human and Mouse CD Markers Hanbook. 2010: San Jose, CA. 185. Quarona, V., G. Zaccarello, A. Chillemi, E. Brunetti, V.K. Singh, E. Ferrero, A.

Funaro, A.L. Horenstein, and F. Malavasi, CD38 and CD157: Aa long journey from activation markers to multifunctional molecules. Cytometry B Clin Cytom, 2013. 84(4): p. 207-21717.

186. Dodd, S., O. Dean, D.L. Copolov, G.S. Malhi, and M. Berk, N-acetylcysteine for antioxidant therapy: pharmacology and clinical utility. Expert Opin Biol Ther, 2008. 8(12): p. 1955-62.

187. Eliasson, P., M. Rehn, P. Hammar, P. Larsson, O. Sirenko, L.A. Flippin, J. Cammenga, and J.I. Jonsson, Hypoxia mediates low cell-cycle activity and increases the proportion of long-term-reconstituting hematopoietic stem cells during in vitro culture. Exp Hematol, 2010. 38(4): p. 301-310 e2.

188. Guitart, A.V., M. Hammoud, P. Dello Sbarba, Z. Ivanovic, and V. Praloran, Slow-cycling/quiescence balance of hematopoietic stem cells is related to physiological gradient of oxygen. Exp Hematol, 2010. 38(10): p. 847-51.

189. Majka, M., A. Janowska-Wieczorek, J. Ratajczak, K. Ehrenman, Z. Pietrzkowski, M.A. Kowalska, A.M. Gewirtz, S.G. Emerson, and M.Z. Ratajczak, Numerous growth factors, cytokines, and chemokines are secreted by human CD34(+) cells, myeloblasts, erythroblasts, and megakaryoblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner. Blood, 2001. 97(10): p. 3075-85.

190. Zumkeller, W. and S. Burdach, The insulin-like growth factor system in normal and malignant hematopoietic cells. Blood, 1999. 94(11): p. 3653-7.

191. Ratajczak, J., Q. Zhang, E. Pertusini, B.S. Wojczyk, M.A. Wasik, and M.Z. Ratajczak, The role of insulin (INS) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) in regulating human erythropoiesis. Studies in vitro under serum-free conditions--comparison to other cytokines and growth factors. Leukemia, 1998. 12(3): p. 371-81.

192. Musiychuk, K., R. Sivalenka, J. Jaje, H. Bi, R. Flores, B. Shaw, R.M. Jones, T. Golovina, J. Schnipper, L. Khandker, R. Sun, C. Li, L. Kang, V. Voskinarian-Berse, X. Zhang, S. Streatfield, J. Hambor, S. Abbot, and V. Yusibov, Plant-produced human recombinant erythropoietic growth factors support erythroid differentiation in vitro. Stem Cells Dev, 2013. 22(16): p. 2326-40.

Page 107: Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude ... · Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte : Étude du microenvironnement et caractérisation des cellules

95

193. Kiel, M.J., O.H. Yilmaz, T. Iwashita, C. Terhorst, and S.J. Morrison, SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell, 2005. 121(7): p. 1109-21.

194. Krutzik, P.O. and G.P. Nolan, Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods, 2006. 3(5): p. 361-8.

195. Maxwell, P.H., M.S. Wiesener, G.W. Chang, S.C. Clifford, E.C. Vaux, M.E. Cockman, C.C. Wykoff, C.W. Pugh, E.R. Maher, and P.J. Ratcliffe, The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature, 1999. 399(6733): p. 271-5.

196. Nazarpour, R., E. Zabihi, E. Alijanpour, Z. Abedian, H. Mehdizadeh, and F. Rahimi, Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. Int J Mol Cell Med, 2012. 1(2): p. 88-93.

197. Neron, S., L. Thibault, N. Dussault, G. Cote, E. Ducas, N. Pineault, and A. Roy, Characterization of mononuclear cells remaining in the leukoreduction system chambers of apheresis instruments after routine platelet collection: a new source of viable human blood cells. Transfusion, 2007. 47(6): p. 1042-9.

198. Herbein, G., H. Sovalat, E. Wunder, M. Baerenzung, J. Bachorz, H. Lewandowski, C. Schweitzer, C. Schmitt, A. Kirn, and P. Henon, Isolation and identification of two CD34+ cell subpopulations from normal human peripheral blood. Stem Cells, 1994. 12(2): p. 187-97.

199. Bender, J.G., K.L. Unverzagt, D.E. Walker, W. Lee, D.E. Van Epps, D.H. Smith, C.C. Stewart, and L.B. To, Identification and comparison of CD34-positive cells and their subpopulations from normal peripheral blood and bone marrow using multicolor flow cytometry. Blood, 1991. 77(12): p. 2591-6.

200. Kato, K. and A. Radbruch, Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry, 1993. 14(4): p. 384-92.

201. Yoshida, T., I. Hazan, J. Zhang, S.Y. Ng, T. Naito, H.J. Snippert, E.J. Heller, X. Qi, L.N. Lawton, C.J. Williams, and K. Georgopoulos, The role of the chromatin remodeler Mi-2beta in hematopoietic stem cell self-renewal and multilineage differentiation. Genes Dev, 2008. 22(9): p. 1174-89.

202. Haque, N., M.T. Rahman, N.H. Abu Kasim, and A.M. Alabsi, Hypoxic culture conditions as a solution for mesenchymal stem cell based regenerative therapy. ScientificWorldJournal, 2013. 2013(1): p. 632972.

203. Newby, D., L. Marks, and F. Lyall, Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta, 2005. 26(4): p. 353-7.

204. Mantel, C.R., H.A. O'Leary, B.R. Chitteti, X. Huang, S. Cooper, G. Hangoc, N. Brustovetsky, E.F. Srour, M.R. Lee, S. Messina-Graham, D.M. Haas, N. Falah, R. Kapur, L.M. Pelus, N. Bardeesy, J. Fitamant, M. Ivan, K.S. Kim, and H.E. Broxmeyer, Enhancing Hematopoietic Stem Cell Transplantation Efficacy by Mitigating Oxygen Shock. Cell, 2015. 161(7): p. 1553-65.

205. Broxmeyer, H.E., H.A. O'Leary, X. Huang, and C. Mantel, The importance of hypoxia and extra physiologic oxygen shock/stress for collection and processing of stem and progenitor cells to understand true physiology/pathology of these cells ex vivo. Curr Opin Hematol, 2015. 22(4): p. 273-8.

206. Jobin, C., M. Cloutier, C. Simard, and S. Neron, Heterogeneity of in vitro-cultured CD34+ cells isolated from peripheral blood. Cytotherapy, 2015. 17(10):1472-84

207. Tanner, A., S.E. Taylor, W. Decottignies, and B.K. Berges, Humanized mice as a model to study human hematopoietic stem cell transplantation. Stem Cells Dev, 2014. 23(1): p. 76-82.