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  • EXERCICES DE GENETIQUE

    ET DE GENETIQUE MOLECULAIRE

    PARTIE II

    Ces exercices dapplications de cours ont pour but de prsenter les principales notions de la gntique fondamentale. Ils sont proposs avec un corrig. Quelques mots cls indiquent les points abords par chaque sujet. Dystrophie rtinienne 2 Pedigree, diagnostic prnatal, RFLP, clonage de gne par hybridation Glycosylation 10 Pedigree chez lhomme et modle levure, mtabolisme, Maladie de Wilson 19 Modle levure pour cette maladie, activits dallles humains chez la levure vecteur de recombinaison,analyse molculaire Mtabolisme de la levure :ILV 31 Test de complmentation fonctionnelle, analyse de sgrgations Biosynthse du tryptophane chez la levure 39 Voie mtabolique,complmentation, rversion, clonage Biosynthse de ladnine chez les eucaryotes 44 Test de complmentation, recombinaison, clonage fonctionnel Biosynthse de larginine 51 De la levure lhomme, Test de complmentation, sgrgation, recombinaison, clonage fonctionnel Monique MASSELOT Gntique Universit P. et M. Curie, Paris.

  • 2

    Dystrophie rtinienne

    Dans tout lexercice, on considrera que les maladies sont monogniques (il suffit dune mutation dans un seul gne pour dterminer le phnotype atteint). Les effets du dficit alimentaire en vitamine A sur lil humain sont bien connus. Ils se traduisent par une kratinisation et une perte de transparence cornenne une scheresse oculaire et une incapacit voir dans la pnombre. Un tableau clinique semblable d cette fois la dgnrescence des photorcepteurs (cnes et btonnets) se produit en cas danomalies gntiques du mtabolisme oculaire de la vitamine A. Ce mtabolisme nest effectu que dans lpithlium pigmentaire de la rtine. 1) Une dystrophie rtinienne svre ds les premires annes, voluant rapidement vers une ccit entre 20 et 30 ans est en rapport avec une atteinte des cnes et des btonnets. Cette affection rare (

  • 3

    Bibliographie Maw, M.A. et al (1997) Mutation of the gene encoding cellular retinaldehyde-binding protein in autosomal recessive retinitis pigmentosa. Nature Genetics 17 pp198-200 Gu, S. et al (1997) Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics 17 pp194-197 Ribeaudeau, F. et al (1997) In vivo adenovirus-mediated gene transfer to newborn rat retinal pigment epithelial cells. C.R.Acad.Sci.Paris III 320 pp523-532 Nicoletti, A. et al (1995) Molecular characterization of the human gene encoding an abundant 61 kDa protein specific to the retinal pigment epithelium. Hum. Mol. Genet. 4 pp 641-649 Hamel, C.P. et F. Marlhens (1998) Des mutations des gnes contrlant le mtabolisme des rtinodes 11-cis responsables de dystrophies rtiniennes svres. Med/Sci 14 pp754-757

  • 4

    Figure 1

    Pdigree de la famille A

    I 1 2

    III 2 1

    3 II 2 1 4 5 6

    4 5 6IV 1 2 3

    V 3 2 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12

    VI 1 2

    Sain

    Homme

    Femme

    Atteint

  • 5

    Figure 2 Pdigree de la famille B avec, dans certains rectangles, les haplotypes obtenus pour D1S1665 (ligne suprieure) et D15S116 (ligne infrieure).

    3 11 2

    1 2

    II 1 2 3 4

    92 31 1

    10

    5 5 3 2

    III

    I

    IV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 3

    1 1 2 3 1 1

    2 31 1

    3 1 1 1

    2 11 1

    2 13 3

    3 13 1

    3 3 1 2

    2 1 3 1

    3 12 3

    3 1 : haplotype pour D1S1665 2 1 : haplotype pour D15S116

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    Corrig: Dystrophie rtinienne

    1) Dans cette famille, les enfants atteints de rtinite sont ns dunions consanguines. Cela laisse souponner une rcessivit de la rtinite devant ltat sain. En effet, la consanguinit favorise lhomozygotie chez les descendants de telles unions pour une forme alllique dun gne hrite dun anctre commun. Si cet allle confre un phnotype altr, ces homozygotes prsentent ce phnotype. De plus on voit plusieurs enfants atteints ns dun couple de parents non atteints. La raret de lvnement mutationnel rend trs improbable une telle fratrie. Il faut donc en rendre compte en admettant que chacun des deux parent est un porteur sain, ce qui confirme la rcessivit du phnotype Rtinite devant le phnotype sain.

    Le couple IV-3 x IV-4 prsente trois enfants atteints dont une fille et deux garons. Deux hypothses sont envisageables pour le gne impliqu : soit autosomique, soit sur lX. Examinons les rsultats prvisibles dans chaque hypothse. Localisation autosomique du gne

    Mre 2n 1a

    a + [saine]x Pre 2n 1a

    a + [sain]

    2 types de gamtes 2 types de gamtes a+ a1 a+

    ++

    aa fetg[sain]

    1aa + fetg[sain]

    a1 1a

    a + fetg[sain] 11

    aa fetg[R]

    Dans ce cas, filles (f) et garons (g) peuvent tre atteints

    Localisation du gne sur lX

    Mre 2n 1a

    a + [saine]x Pre 2n +a [sain]

    2 types de gamtes 2 types de gamtes a+ a+

    ++

    aa f[saine]

    +a g[sain]

    a1 1a

    a + f[saine] 1a g[R]

    Dans cette hypothse et avec ce type de couple, il ne peut y avoir que des garons (g) atteint

  • 7

    Puisque ce couple a, entre autre, une fille atteinte, le gne impliqu ne peut tre quautosomique. Conclusion : dterminisme rcessif autosomique de la maladie. 2) Le dterminisme gntique dans la famille B est du mme type rcessif autosomique que dans la famille A. Les arguments sont les mmes.

    Puisque un marqueur polymorphe du chromosome 1 et un du chromosome 15 sont utiliss, on va pouvoir dterminer ltat parental ou recombin des gamtes qui ont donn les

    enfants atteints qui ont pour gnotype pour le gne A 11

    aa . Les enfants sains tant

    ++

    + aaou

    aa1 ne

    permettront pas de prciser. Les parents ont pour gnotype en ne regardant que le gne A et le chromosome 1, pour le

    pre [sain, 2,3] 23

    132

    1 aaou

    aa ++ et pour la mre [saine, 3,1]

    13

    131

    1 aaou

    aa ++ car on ne

    connat pas la phase des allles des deux formes (ce qui a t hrit dun mme parent) enfant gamte du

    pre si phase 1

    32

    1aa +

    si phase 2

    23

    1aa +

    gamte de la mre

    si phase 1

    31

    1aa +

    si phase 2

    13

    1aa +

    IV-1[R, 3,3)

    a1,3 P R a1, 3 P R

    IV-2[R, 2,3)

    a1, 2 R P a1, 3 P R

    IV-3[R, 2,3)

    a1, 2 R P a1, 3 P R

    IV-4[R, 3,1)

    a1, 3 P R a1, 1 R P

    IV-5[R, 2,1)

    a1, 2 R P a1, 1 R P

    Que ce soit dans la phase 1 ou 2, il y a des gamtes parentaux et recombines en quantit quivalente. On ne peut pas dire que le site du marqueur polymorphe D1S1665 soit li au gne A. Ceci permet dj dexclure le gne impliqu dans la famille A. La mme analyse avec le marqueur polymorphe du chromosome 15 donne les interprtations suivantes. Il faut remarquer que le pre napporte aucune information puisquil est [sain, 1,1] de

    gnotype 11

    1aa + . Les gamtes P et R ne peuvent donc pas tre distingus.

    enfant gamte de la mre

    si phase 1 21

    1aa + si phase 2

    12

    1aa +

    IV-1[R, 1,1) a1, 1 R P IV-2[R, 1,1) a1, 1 R P IV-3[R, 1,1) a1, 1 R P IV-4[R, 1,1) a1, 1 R P IV-5[R, 1,1) a1, 1 R P

  • 8

    On constate que dans lhypothse de la phase 2, tous les gamtes sont de type parental. Alors on ne peut exclure que le gne impliqu dans cette famille (appelons le B puisquil est diffrent du prcdent) soit proche du marqueur D15S116. Pour confirmer (ou infirmer) cela il faudrait tudier dautres marqueurs polymorphes proches si possible avec plus de formes allliques pour que les deux parents soient informatifs. 3) Les deux parents A-V-1 et B-IV-4 tous deux atteints sont chacun homozygotes pour lallle dficient du gne impliqu dans leur famille respective. Ils ne donnent quun seul type de gamtes. Le pre (famille A) apporte un gamte a1 b+ et la mre (famille B) un gamte a+ b1. Lorganisme diplode rsultant de lunion de ces deux gamtes aura donc une copie intacte de chaque gne. Puisque la dystrophie rtinienne est rcessive, le descendant sera donc non atteint bien que porteur. Il sagit dun test de complmentation et le croisement scrit :

    2n femme[R] ++

    bb

    aa11 x 2n homme [R]

    11

    bb

    aa

    ++

    gamte a1 b+ gamte a+ b1

    2n [sain] +

    +bb

    aa 1

    1 4) Connatre le gne en cause permet de cloner soit le gne gnomique (en plusieurs fragments sil est trop grand) ou lADNc copie de lARNm aprs pissage (en un seul fragment car de 2,7 kbp). La protine sexprimant spcifiquement dans des cellules de la rtine, on pourrait tenter de sauver la fonctionnalit de ces cellules en leur fournissant linformation qui leur manque gntiquement. Cette information doit permettre de fabriquer la protine, donc un vecteur (vecteur dexpression portant un promoteur de type eucaryote) recombin sur lADNc serait un bon candidat pour cette fonction de sauvetage. Des problmes (de maturation post transcriptionnelle, par exemple) ne sont cependant pas impossibles. Prparation de la banque dADNc

    extraction de lARN total de cellules de la rtine de cellules sauvages. Ces cellules expriment la protine recherche donc leur ARN est enrichi en ARNm pour cette protine.

    A laide dune colonne doligo dT purification des ARNm (tous ceux des cellules rtiniennes).

    Copie par la rverse transcriptase des ARNm en ADNc simple brin avec comme amorce des oligodT.

    Hydrolyse la soude de lARN matrice afin de librer le premier brin. La RT a la proprit damorcer la rplication du second brin en faisant une boucle et en recommenant la copie. Par contre comme elle na pas dactivit de relecture, les erreurs sont plus fr