Evolution de l'activité antimicrobienne des isolats de …Remerciments Ce travail s’est déroulé...

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieuret de la Recherche Scientifique

Université d’Oran, Es-Sénia

Faculté des Sciences

Département de Biologie

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

Thèse Présentée parMme DJADOUNI Fatima

Pour obtenir le diplôme de Doctorat

Spécialité Microbiologie

Option Microbiologie AlimentaireIntitulée

Evolution de l'activité antimicrobienne des isolats de bactérieslactiques et détermination du spectre d'action de leurs

biopeptides vis-à-vis des germes d'altération

Devant le jury composé de :

Prof. HEDADJI M. Président Université Es-Senia Oran

Prof. KIHAL M. Directeur de thèse Université Es-Senia Oran

Prof. GUESSAS B. Examinateur Université Es-Senia Oran

Prof. KARFOUF A. Examinateur Université de Sidi Bel Abbes

Prof. ABOUNI B. Examinateur Université de Sidi Bel Abbes

Prof. MEDDAH B. Examinateur Université de Mascara

Soutenue le 04/12/2013

Remerciments

Ce travail s’est déroulé au Laboratoire de Microbiologie Appliquée du département deBiologie de l’Université Es-Senia, Oran sous la direction du Professeur Kihal Mebrouk.Je lui exprime toute ma gratitude pour leur bonne humeur, leur patience, leurencadrement, leurs conseils ainsi que pour avoir patiemment corrigé ce document et lesarticles.Je remercie vivement le Professeur de Microbiologie Hadadji M., de l’Université d’Orand’avoir accepté de présider le jury de soutenance. Mes remerciements s’adressentégalement à Monsieur Guessas B., Professeur de Microbiologie de l’Université d’Oranqui été accepté de juger ce travail en qualité de rapporteurs.

Je tiens aussi à exprimer ma profonde gratitude à Monsieur Meddah B., Professeur deBiochimie à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université de Mascara,qu’il me fait en acceptant de participer au jury de cette thèse. Par ailleurs, Je tiens àavouer sincèrement ma profonde gratitude à Monsieur Kerfouf A., Professeur deMicrobiologie de l’Université de Sidi Bel Abbes, de l’honneur qu’il me fait d’avoiraccepter de présider le jury de ma thèse.

Je remercie vivement Monsieur Abouni, Professeur de Microbiologie de l’Université deSidi Bel Abbes, qui me fait l’honneur, malgré ses importantes charges, d’accepter dejuger mes travaux de thèse en tant qu’examinateur.

J’embrasse Noémie pour son amour et pour m’avoir supporté tout au long de ce travail. Jeremercie également mon marie, c’est un plaisir de partager ma vie avec vous. Enfin, ungrand merci à mes parents qui m’ont encouragé dans toutes mes entreprises et à mafamille à qui je tiens à dédicacer ce travail.

A Mon marie

A mes deux filles Bouthayna et Salwa

A tous ceux qui m’aiment.

Table des matières

Liste des tableaux-

Liste des tableaux

Tableau Pages

Tableau 01: Propriétés des principales bactéries lactiques mésophiles (Liebefeld, 2002) 6

Tableau 02: Propriétés des principales bactéries lactiques thermophiles (Liebefeld, 2002) 6

Tableau 03: Le poids moléculaire de certains génomes de bactéries lactiques et le nombre degènes revelés (Mills, 2004)

9

Tableau 04: Les principaux caractéristiques des bactériocines produites par les bactérieslactiques (Parada et al., 2007)

14

Tableau 05: Quelques exemples de laits fermentés (Luquet et Corrieu, 2009) 24

Tableau 06: Principales fonctions des BL dans les produits laitiers (Grignon, 2003) 25

Tableau 07: Principales utilisations des BL dans les produits alimentaires (Grignon, 2003) 25

Tableau 08: La différence entre les bactériocines bactériocines et les antibiotiques etet et lesantibiotiques (Klement et al., 1990)

34

Tableau 09: Caractéristiques des substances antimicrobiennes appartenant aux bactériocinesproduites par certaines BL (Jack et al., 1995)

35

Tableau 10: Exemples de localisation des gènes producteurs de bactériocines chez certainesbactéries d’altération technologique (Jasniewski, 2008)

44

Tableau 11: Effets de certains composés chimiques sur l’activité des bactériocines(Jasniewski, 2008)

57

Tableau 12: Exemples d'une utilité mondiale de la nisine (Fleming et al., 1985) 88

Tableau 13: Plus grande activité des bactériocines utilisées comme partie de la technologie(Leistner, 2000)

89

Tableau 14: Isolement des bactéries lactiques (BL) 103

Tableau 15a: Caractéristiques physiologiques et biochimiques des BL isolées 107

Tableau 15b: Caractéristiques physiologiques et biochimiques des BL isolées 108

Tableau 15c: Caractéristiques physiologiques et biochimiques des BL isolées 109

Tableau 16: Tests d'antibiogramme de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus 113

Tableau 17: Caractéristiques biochimiques de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus 114

Liste des tableaux

Tableau 18a: Spectre d'action des BL isolées contre les bactéries pathogènes et d'altération 118

Tableau 18b: Spectre d'action des BL isolées contre les bactéries pathogènes et d'altération 119

Tableau 18c: Spectre d'action des BL isolées contre les bactéries pathogènes et d'altération 120

Tableau 19: Effet des milieux de culture (MRS, M17, et BHI agar) et la températured'incubation sur la production de la bactériocine de Lb. plantarum et Pc.pentosaceus

129

Tableau 20: Effet du pH initial du milieu de culture (MRS agar) sur la production de labactériocine de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

130

Tableau 21: Effet de sources de carbone (glucose, fructose, saccharose, galactose, maltose, etlactose) sur la production de la bactériocine de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

131

Tableau 22: Effet de sources d'azote sur la production de la bactériocine par L. plantarum etPc. pentosaceus

132

Tableau 23: Diminution du pH par les deux souches lactiques cultivées (Lb. plantarum et Pc.pentosaceus) dans le bouillon approprié (MRS liquide) pendant 72 h à 30°C àl’obscurité

133

Tableau 24a: Effet de température de stockage (+4°C) sur le pouvoir bactériocinogène de Lb.plantarum et de Pc. pentosaceus

135

Tableau 24b: Effet de température de stockage (-20°C) sur le pouvoir bactériocinogène de Lb.plantarum et de Pc. pentosaceus

136

Tableau 25: Effet des UV sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc.pentosaceus

136

Tableau 26: Effet des sels inorganiques (NaCl et KCl) sur le pouvoir bactériocinogène de Lb.plantarum et de Pc. pentosaceus

138

Tableau 27: Effet des épices sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et Pc.pentosaceus

139

Tableau 28: La concentration minimale inhibitrice (CMI) de Lb. plantarum et Pc.pentosaceus contre L. ivanovii.

141

Liste des figures

Liste des figures

Figure Pages

Figure 01: Les voies métaboliques des bactéries lactiques (Luquet et Corrieu, 2009) 13

Figure 02: Systèmes de transport et de maturation des prébactériocines de bactéries lactiques(Wandersman, 1998)

46

Figure 03: Schéma simplifié du système général de sécrétion Sec (Xie et Dalbey, 2008) 47

Figure 04: Exemple de « quorum-sensing » chez Carnobacterium maltaromaticum (Rohde etQuadri, 2006)

49

Figure 05: Comparaison morphologique de bactériophage PS3 (a) et pyocine type –R (b) de Ps.aeruginosa. La queue de bactériophage est légèrement plus grande que la particule debactériocine. Des dimensions sont montrées dans (a) (Adapté de Daw, 1989)

54

Figure 06: Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II selon (Chatterjeeet al., 2005a)

62

Figure 07: Observation microscopique de Pc. pentosaceus (A) et Lb. plantarum (B) aprèscoloration de Gram (X100)

112

Figure 08: Activité antibactérienne des souches lactiques Lb. plantarum (a) et Pc. pentosaceus(b) vis-à-vis de L. ivanovii par la méthode de spot agar sur milieu MRS à 30°C.

117

Figure 09: Evolution du nombre de L. ivanovii par la Do. 600nm après l’hydrolyse enzymatiquede la substance antibactérienne de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus. (SD ≤ 5%),

123

Figure 10: La cinétique de croissance et de la production de la bactériocine de Lb. plantarum (A)et Pc. pentosaceus (B) sur le milieu MRSm à 30°C.

125

Figure 11: Effet de la température sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc.pentosaceus (SD ≤ 5%)

134

Figure 12: Effet de pH sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc. pentosaceus(SD ≤ 5%)

134

Figure 13: Effet des solvants organiques sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et dePc. pentosaceus (SD ≤ 5%)

137

Figure 14: Electrophorèse et zymogramme de bactériocines de Lb. plantarum et Pc.pentosaceus

140

Figure 15: L’évolution du nombre de L. ivanovii au cours de la fermentation du lait cru dechèvre avec un levain de BL (Lb. plantarum et Pc. pentosaceus) respectivement à30°C.

142

Liste des abréviations


Concentrations inhibitrices :CMB (MBC) : Concentration Minimale BactéricideCMI (MIC) : Concentration Minimale InhibitriceFIC : Fraction de Concentration InhibitriceIC50 : Concentration Inhibant 50 % de la croissanceUnités :AU (UA) : Unité Arbitrairecm, mm, μm, nm : Centimètre, millimètre, micromètre, nanomètreDa, kDa, MDa : Kilo Dalton, Dalton, Mega Daltong, mg, μg : Gramme, milligramme, microgrammeIU : International unitl, ml, μl : Litre, millilitre, microlitreM, mM, μM : Mole, millimole, micromole par litremin : Minuterpm : Rotation par minutes : Secondepb, kpb : paires de bases, Kilo paires de basesPM : Poids moléculairePpm : part par millionp/v : poids/volumep/p : poids/poidsUFC (cfu) : Unité Formant Coloniev/v : volume/volume

Produits chimiques :ADH : Arginine dihydrolaseAcé : AcétoïneArg : ArginineCit : CitrateGlu : GlucoseDPH : 1,6-Diphényl-1, 3, 5-hexatrièneEDTA : Acide éthylènediamine-tétra-acétiqueEGTA : Acide éthylène glycol-bis (2-aminoéthylether) -N, N, N,N-tétra-acétique,IPTG : Isopropyl D-1-thiogalactopyranosideLp : LactoperoxydaseRm : Rouge de méthylèneTE : Tris-EDTATMA-DPH : N,N,N-Triméthyl-4-(6-phényl-1,3,5-hexatrien-1-yl) phénylammonium

ptoluenesulfonateTRIS : 2-Amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediolX2+ : Cations divalentsvp : Voges Proskauer


Techniques :HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Chromatographie Liquide Haute

Performance)

IMAC : Immobilized ion Metal Affinity Chromatography (Chromatographie d’affinité surmétal immobilisé)

PCR : Polymerase Chain ReactionRMN : Résonance Magnétique Nucléaire

RP-HPLC : Reverse Phase- High Performance Liquid ChromatographyRT-PCR : Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE : Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Souches bactériennesB. : BacillusBr. : Brebacterium

Bf. : BifidobacteriumCr. : Carnobacterium

Cl. : ClostridiumEn. : Enterococcus

E. coli : Escherichia coliK. : Klebsiella

L. : ListeriaLb. : Lactobacillus

Lc. : LactococcusLn. : Leuconostoc

Pc. : PediococcusPr. : PropionobacteriumPs. : Pseudomonas

Str. : StreptococcusS. : Staphylococcus

Sl. : SalmonellaW. : Weissella

sp. : Espècessp ou subsp : Sous-espèce

bv : Biovar


Autres abréviations :ABC : ATP Binding CassetteADN : Acide DésoxyribonucléiqueARN : Acide RibonucléiqueARNm : Acide Ribonucléique MessagerARNr : Acide Ribonucléique RibosomiqueARNt : Acide Ribonucléique TransfiraseATP : Adénosine TriphosphateATPase : ATP synthétaseAw : Activité de l'eauBL : Bactérie LactiquepH : Potentiel d'hydrogèneΔpH : Gradient de protonΔΨ : Potentiel de membraneDo : Densité optiqueDTS : Dedicated Transport SystemEPS : ExopolysaccharideFPM : Force ProtomotriceFDA : Food and Drug AdministrationFNLDN : Fénulalanine aspargine leucine aspartate valineFSIS : La Sécurité de l’alimentation et l’Inspection ServiceGRAS : Generally Recognized As SafeHo : HomofermentationHé : HétérofermentationMAP : Empaquetage Modifié de l’AtmosphèreMFP : Membrane Fusion ProteinNAD : Nicotinamide Adénosine Diphosphate HydrogénaseNADH : Nicotinamide Adénine DinucléotideNICE : Nisin-Controlled gene ExpressionLmm : Low molecular massPTS : Phosphotransferase SystemTF : Type fermentaireSec : Secretion system complexUV : Ultrat Violet

Symboles des nucléotides d’après la commission IUPAC-IUB.A : AdénineC : CytosineG : GuanineT : ThymineU : Uracile

Introduction

Introduction

1

Au fil de l’évolution, les organismes se sont dotés de systèmes de défense pour luttercontre les infections. Certains de ces systèmes reposent sur la synthèse de peptides antibactérienstels que les défensines chez les mammifères, les magainines chez les amphibiens et les cératoxineschez les insectes.

Le règne bactérien ne fait pas exception et de nombreuses bactéries ont développé ce typede stratégies pour avoir un avantage adaptatif et ainsi coloniser plus facilement leur environnement.

Les bactéries lactiques, utilisées dans de nombreux procédés alimentaires, limitent lescontaminations des aliments par les germes indésirables. Cette capacité est liée à la synthèse demolécules antibactériennes telles que des acides organiques, notamment l’acide lactique, duperoxyde d’hydrogène et des bactériocines.

Les bactériocines pourraient être des conservateurs alimentaires intéressants à l’échelleindustrielle du fait de leur thermostabilité, de leur spectre d’activité relativement étroit comprenantgénéralement le genre Listeria et de leur activité à de faibles concentrations sur une large gamme devaleur de pH.

Actuellement, seule la nisine (E234) produite par Lactococcus lactis est autorisée dans ledomaine alimentaire comme conservateur. En effet, un phénomène non négligeable freinel’utilisation des bactériocines à grande échelle : L’apparition de souches résistantes.

Pour éviter de commettre les mêmes erreurs que celles faites avec les antibiotiques, desrecherches approfondies doivent être menées sur les peptides antibactériens.

Trois grands axes de recherche sur les bactériocines ont été développés durant ces vingtdernières années. Le premier consiste en la recherche de nouvelles souches productrices, en lapurification des peptides antibactériens et en leurs caractérisations chimiques et génétiques.

De nouvelles souches et de nouvelles bactériocines sont encore décrites de nos jours. Ledeuxième axe consiste à la recherche d’applications alimentaires en utilisant soit les peptidespurifiés, soit les souches productrices.

Les principaux modèles d’aliments sont les produits laitiers, les poissons, les fruits de mer,les charcuteries et les viandes sous vide. Les dernières études dans ce domaine portent sur laphysiologie de la souche productrice dans ces matrices complexes et sur le phénomène de «quorum-sensing ».

Le dernier axe porte sur l’étude des mécanismes d’action des bactériocines, de la relationstructure/fonction, des interactions entre bactériocines et membranes artificielles, de l’immuniténaturelle et de la résistance acquise.

Le modèle le mieux caractérisé est celui de l’interaction entre la nisine et Listeriamonocytogenes. De nombreux travaux sont également réalisés sur diverses bactériocines de sous-classe IIa, dont les plus étudiées sont la pédiocine PA-1, la lactococcine A et la carnobactériocineCbn B2.

Introduction

2

Cette thèse s’inscrit dans la continuité des travaux menés au Laboratoire de MicrobiologieAppliquée du departement de Biologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran. Elle comprendcinq parties essentielles.

1. La synthèse bibliographique traite les aspects théoriques de l’évolution et les progrésréalisés sur les méthodes d’identification microbiologique. La production de substancesantibactériennes et en particulier les bactériocines ont été traités.

2. La partie matérial et méthodes décrit toutes les techniques qui se rapportent aux objectifs dece thème.

3. Les résultats représentent la partie essentielle de la thèse et sont répartis en cinq volets.

Volet 01 : Etablissement d’une banque de souches

Ce volet occupe une place centrale et principale au sein de notre laboratoire. La tacheconsiste à isoler, identifier, selon des tests phénotypiques, de nouvelles souches locales de bactérieslactiques isolées à partir de différents produits laitièrs.

Volet 02 : Screening pour la production de bactériocines

Ceci nous permettra de déterminer les souches de bactéries lactiques productrices debactériocines. La connaissance du spectre d’action de la substance inhibitrice a aussi été poursuiviepar l’utilisation de différentes méthodes microbiologiques.

Volet 03 : L’étude de facteurs physico-chimiques affectant la production de bactériocines

Ce travail nous permettra d’étudier les différentes conditions exigées pour l’obtentiond’une activité optimum de bactériocine et un rendement élevé.

Volet 04 : L’identification de la bactériocine isolée

Ce volet est contribué à la caractérisation de cette substance antimicrobienne et unemeilleure compréhension de la nature et les propriétés de la bactériocine de point de vue nourriture,sécurité, la détermination de la CIM et la CMB, et leur mode d’action contre Listeria ivanovii.

Volet 05 : La purification de la bactériocine et leur application

Les bactériocines isolées ont été partiellement purifiées et caractérisées pour déterminerleurs poids moléculaires par l’utilisation de la techniques SDS-PAGE. Le futur de ce travail peutcontribuer à l'exploration utile de ces composés dans la bioconservation des produits alimentaires.

1. La discussion analyse les différents résultats obtenus et ceci, en comparaison avec d’autrestravaux de recherche à travers le monde.

La partie des références bibliographiques rassemble une liste exhaustive des travaux derecherche se rapportant aux différents thèmes abordés dans la these.

SynthèseBibliographique

Chapitre 01Les bactéries lactiques

Chapitre 01: Les bactéries lactiques

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1. Généralités

L'un des problèmes dans l'industrie alimentaire était la contamination par les germespathogènes, qui sont frequents à cause des maladies portées par les aliments. Pendant la décenniepassée, manifestations récurrentes de diarrhée, liée à la résistance normale des agents causatifs,contribuée à son statut comme risque.

Le problème du choix des bactéries résistantes aux antibiotiques (Parada, 1980; Chopraet al., 1998; Rao, 1998; Kapil, 2005) et la demande croissante des nourritures sûres, avec moinsd'additifs chimiques, a augmenté l'intérêt en remplaçant ces composés par les produits naturels.

La biotechnologie dans le secteur de transformation alimentaire vise le choix, la productionet l'amélioration des microorganismes utiles et de leurs produits, aussi bien que leur applicationtechnique de la qualité des produits alimentaires.

L'utilisation des microorganismes non pathogènes et/ou de leurs métabolites améliorerl'hygiène du point de vue microbiologique et prolonger la durée de conservation des nourritures estdéfinie comme biopreservation (De Martinis et al., 2001).

Des propriétés antagoniques des bactéries lactiques alliées à leur histoire d'utilisation dansles produits fermentés par nourriture traditionnelle les rendent très attrayants pour être employéscomme biopreservatives (Parada, 1984; Caplice et Fitzgerald, 1999; Deraz et al., 2005; Deeganet al., 2006).

Depuis plus de 4 000 ans, les bactéries lactiques sont utilisées pour fabriquer bon nombrede produits fermentés et notamment des produits laitiers (fromages, yaourts…). La fermentationconfère aux aliments une saveur et une texture particulière, permet de mieux les conserver etapporte aussi certains bénéfices nutritionnels et de santé.

Si cette pratique était à l’origine intuitive, ses bases scientifiques sont aujourd’hui mieuxcomprises. L’évolution des connaissances conduit à la sélection et au développement de nouvellessouches de bactéries lactiques aux propriétés spécifiques.

Elles sont habituellement connues comme coffre-fort (GRAS), qui ont un rôle importantdans la conservation des nourritures et produits fermentés. Elles peuvent être employés commenormaux microbiota concurrentiel ou en tant que démarreur spécifique cultures dans des conditionscommandées (Cintas et al., 2001).

Certaines de ces bactéries produisent des substances antagoniques appelées lesbactériocines, qui dans les petit montants sont très en activité contre des gèrmes pathogènes(Allison et al., 1994; Moreno et al., 2000).

Elles forment un groupe de bactéries relativement divers, mais reliées entre elles par uncertain nombre de fonctions métaboliques et physiologiques typiques (Schleifer et Ludwig, 1995;Stiles et Holzapfel, 1997; Mayra-Makinen et Bigret, 1998; Yang, 2000).


4

D'une façon générale le groupe se compose de bactéries sous forme, de coques ou debâtonnets à Gram positives, non sporulants, et produisent l'acide lactique comme produit finalprincipal pendant la fermentation des carbohydrates (Kandler, 1983).

Les BL sont, selon la voie qu’elles empruntent pour fermenter les hexoses,homofermentaires ou hétérofermentaires. La voie de la glycolyse (Embden-Meyerhof- Parnas),ayant comme produits final pricipal l'acide lactique et le CO2 (Schleifer et Ludwig, 1995).

Cependant, quelques espèces sont considérées comme hétérofermentaires facultatifs.Concernant la fermentation des hexose, ces espèces sont homofermentaires, mais dans certainesconditions (par exemple si la source disponible de carbone est un pentose), elles induisent la voie 6-pg/pk, ayant pour résultat la fermentation hétérolactique (Axelsson, 2004; Jozala et al., 2005).

Les BL sont trouvées dans diverses niches écologiques, tel que le lait, ainsi que certainesnourritures, la bouche, les régions gastro-intestinales et urogénitales des humains et des animaux(Lopez-Diaz et al., 2000; Navarro et al., 2000; El Shafei et al., 2000; Mathara et al., 2004).

Elles constituent aussi la flore microbienne dominante responsable de la fermentation descéréales et des plantes fourragères ensilées (Carr et al., 2002; Kotelnikova et Gelfand, 2002).

Même si elles se développent dans une variété d'habitats, elles exigent des carbohydratesfermentescibles, des acides aminés, des acides gras, des sels et des vitamines pour leurs croissance(Shihata et Shah, 2000; Hammes et Hertel, 2003).

Les souches sont généralement faiblement protéolytiques et lipolytiques et exigent desacides aminés, des purines, des pyrimidines et des vitamines pour leurs croissance (Stamer, 1976;Cogan et Hill, 1993; Jay, 1996).

Les bactéries lactiques utilisées dans les fermentations laitières peuvent être divisées endeux groupes sur la base de leurs croissance optimale (Bissonnette et al., 2000).

Les bactéries mésophiles avec une température optimale de croissance entre 20°C et 30°Cet les thermophiles entre 40°C et 45°C. Alors que la majorité de souches se développent à pH 4.0-4.5, certaines sont en activité à pH 9.6 et d'autres à pH 3.2 (Jozala et al., 2005).

L'acide lactique produit peut être sous deux formes stéréoisomèriques L, ou moinsfréquemment D, ou un mélange des deux. Il convient de noter que l'acide lactique (forme D) n'estpas métabolisé par des humains et n'est pas recommandé pour les enfants à bas âge (Who, 1974).


5

2. Definition

Comme toutes les bactéries, les bactéries lactiques (BL) sont des microorganismes vivantset unicellulaires (procaryotes) très répandus dans la nature car se reproduisant rapidement (Luquetet Corrieu, 2008). On les trouve notamment dans le sol et le lait (Marteau, 2007; Makhloufi,2012).

Les BL font partie d’un grand groupe bactérien divisé en différents sous groupes selon legenre (exemple: Lactobacilles ou Lb.) et l’espèce (exemple: Lb. lactis, Lb. acidophilus, Lb.casei…). Des espèces qui peuvent encore être classées en sous espèces, variétés et souches(exemple: Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis).

Les BL peuvent avoir différentes formes: Sphériques (coques/genre Streptococcus etLactococcus…), en bâtonnets (bacilles/genres Lactobacillus) ou encore ovoïdes (Leuconostoc sp.)(Luquet et Corrieu, 2005; Gálvez et al., 2011).

Elles ont cependant toutes en commun produire l’acide lactique; c’est pourquoi elles sontclassées ensembles (Luquet et Corrieu, 2008). Chaque cellule mère peut donner naissance à 2cellules filles identiques en 30 à 90 minutes environ en fonction de l’environnement.

Les BL dites mésophiles se développent bien à 25°C-30C° et les thermophiles entre 40°Cet 44°C. On en trouve dans les litières, les fourrages, sur les mamelles et elles se retrouvent dans lelait pendant la traite où elles se multiplient rapidement; on peut ainsi en dénombrer jusqu’à 1million dans 1 ml de lait (Tab. 01 et 02).


6

Tableau 01: Propriétés des principales bactéries lactiques mésophiles (Liebefeld, 2002)

Propriétés

Espèces Lactococcus lactis ssp Leuconostoc mesenteroides ssp

lactis cremoris diacetylactis cremoris mesenteroides

Fermentation lactique homofermentation hétérofermentation

Configuration de lactate L+ D- D-

Acidité produite 45°SH 25°SH

Vitesse d’acidification rapide lente

T° de croissance*(T° d’incubation)

20- 30°C (30°C) 20- 30°C (25°C)

Fermentation du citrate non oui

Pouvoir de protéolyse faible

Légendes: D: L’isomère optique formé de l’acide lactique est de configuration D; L : L’isomère optique formé del’acide lactique est de configuration L; D+L : L’acide lactique est sous forme racémique.

Tableau 02: Propriétés des principales bactéries lactiques thermophiles (Liebefeld, 2002)

Espèces

Propriétés Str. homoferment. Lactobacilles homofermentaires Lb. hétérofacultatifs

S. salivarius ssp.thermophilus

Lb.delbrueckiissp.lactis

Lb.delbrueckii

ssp.bulgaricusLb. helveticus Lb. casei ssp. Casei

Lb. rhamnosus

Configuration delactate

L+ D- L+ et D- L+

Acidité produite 35°SH 40 - 70° SH 55 - 70° SH > 80°SH <25°SH

T° de croissance*(T° d’incubation)

30- 50°C (38°C) 20- 50°C(38°C)

20- 40/ 45°C(38°C)

Fermentation ducitrate non oui

Pouvoir de protéolyse faible moyenne forte moyenneUtilisation Fromage,

yogourtfromage Yogourt,

pâtesmidures

Spécialitésrégionales

Culturecomplémentaire pourfromage

Légendes: D: L’isomère optique formé de l’acide lactique est de configuration D; L: L’isomère optique formé del’acide lactique est de configuration L; D+L: L’acide lactique est sous forme racémique.


7

Plus généralement, les BL se retrouvent partout où il y a de fortes concentrations deglucides, de produits de dégradation des protéines, de vitamines et peu d’oxygène (Marteau, 2007).

Chez l’homme, elles sont surtout présentes dans le tube digestif. Elles peuvent resister enmilieu relativement acide (pH 4), gram-positives, anaérobies mais aérotolérantes. L’appellation BLest souvent étendue aux bifidobactéries qui ont une forme en Y (par exemple: bifides/ genreBifidobacterium) (Luquet et Corrieu, 2005; Ruiz et al., 2009).

Elles ont été également employées comme producteurs de saveur et de texture. Lesbactéries d'acide lactique incluent de divers genres principaux: Lactobacille, Lactococcus,Carnobacterium, Enterocoque, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus,Pediocoque, Streptocoque, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella. D'autres genres sont:Aerococcus, Microbactérie, propionobactérie et Bifidobacterium (Carr et al., 2002; Dortu etThonart, 2009).

Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. rhamnosus casei, Lb. bulgaricus, Lb.fermentum, Lactococcus lactis, Lc. cremoris, Bifidobacterium bifidum, Bf. infantis, Bf. Adolecentis,Bf. longum, Bf. brevé, Enterococcus faecalis, et En. faecium, sont une partie de l'espèce la pluscommune (Dellaglio et al., 1994), et certains d’enre eux sont identifiées comme probiotics (Paradaet al., 2003).

3. Taxonomie des bactéries lactiques

Historiquement, le groupe comportait les genres Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcuset Streptococcus, mais les genres principaux des BL importants en technologie agro alimentaireincluent également Aerococcus, Carnobacterium, Lactococcus, Oenococcus, Tetragenococcus,Vagococcus, Weissella et Bifidobacterium (Stiles et Holzapfel, 1997; Klein et al., 1998; Axelsson,2004).

La taxonomie bactérienne moderne basée sur les caractéristiques phénotypiques etgénotypiques a eu comme consequence la reclassification de beaucoup d’especes de BL. Lesbactéries lactiques sont un groupe phylogénétique divers avec un GC de 50% (guanine et cytosine)en leur ADN.

Le pourcentage G+C (GC%) de leur ADN donne une composition assez proche pour legenre Lactococcus (34,46%), Leuconostoc (36.43%), Pediococcus (34.42%) et Bifidobacterium(67%) alors que le genre Lactobacillus est caractérisée par une grande hétérogénéité (32.53 %)(Novel, 1993).

Excepté les bifidobactéries, tous les genres mentionnés ci-dessus appartiennent au phylumavec un contenu en G/C inferieur à 50% (Schleifer et Ludwig, 1995).

Néanmoins, ces derniers sont également considérés comme BL, en raison des propriétésphysiologiques et biochimiques semblables et du partage de certaines niches écologiquescommunes telles que la région gastrointestinale.


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Les méthodes taxonomiques modernes appliquées aux BL incluent la caractérisationphénotypique et l'analyse génotypique. Les méthodes phénotypiques employées sont l'analyse de lacomposition de la paroi (particulièrement pour les bifidobactéries), empreinte digitale de protéinepar l'analyse de toutes les protéines cytoplasmiques solubles et la mobilité électrophorétique decertaines enzymes (Kunene et al., 2000).

L'identification des bactéries lactiques au niveau moléculaire est basée sur l'analysed'homologie d'ADN comme méthode de référence (de Ley et al., 1970). Des sondes d'acidenucléique ont été développées pour plusieurs espèces de lactobacilles (Drake et al., 1996; Tilsala-Timisjarvi et Alatossava, 1997).

La classification est également possible avec des méthodes génotypiques (RAPD-PCR,ribotyping) ou d’autres techniques semblables. Elle permet une nouvelle approche phylogénétique.Le génome des bactéries lactiques varie selon le genre et selon l'espèce (1 à 5 millions de paires debase).

Cette variabilité peut servir pour différencier les groupes bactériens (tableau 03) (Bolotinet al., 2001). La determination du %GC était la première méthode basée sur l’utilisation de l’ADNdans la taxonomie bactérienne. Chez les procaryotes, le %GC varie entre 24% et 76% (Vandammeet al., 1996).

Les BL possède un % GC au dessous de 50%, cependant certaines espèces deLactobacillus ont des valeurs pouvant atteindre 55% (Axelsson, 2004). Le contenu en GC peut êtredéterminé selon le Tm, dans le cas de la dénaturation (Marmur et Doty, 1962; Xu et al., 2000) oudirectement à partir de la dégradation des nucléosides par la méthode HPLC (Mesbah et al., 1989).

La reassociation de l’ADN est la base officielle pour la délinéation d'espèce chez toutes lesbactéries. Chez quelques bactéries, la limite de 70% peut être problématique car des souchesphénotypiquement identiques, différent seulement par leurs valeurs de réassociation (Vandamme etal., 1996).

Le % GC est déterminé par la mesure de la température de fusion (Tm) de l'ADN. Enchauffant une solution d'ADN, les liaisons hydrogènes sont rompues. Parallèlement, la Do à 260 nmaugmente selon une sigmoïde.

Le point d'inflexion de la courbe détermine le Tm où 50% de l'ADN est sous forme simplebrin. Le Tm est d'autant plus élevé que le % GC est grand (Marmur et Doty, 1962).

Les méthodes d'hybridation ADN/ADN sont basées sur le fait que deux molécules d'ADNdénaturées peuvent se réassocier à condition de présenter une homologie. La renaturation estréalisée à partir d'un mélange de deux ADN dénaturés provenant de bactéries différentes.


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Tableau 03: Le poids moléculaire de certains génomes de bactéries lactiques et le nombre de gènesrevelés (Mills, 2004)

Espèces SouchesGénomes

Kpb (103) gènes

Lc. lactis subsp.cremoris SK11 2.3 2693

Ln. mesenteroides ATCC 8293 2 1882

Pc. pentosaceus ATCC 25745 2 1673

Lb. delbruecki subsp. bulgaricu BAA-365 2.3 1602

Lb. casei ATCC 334 2.5 2526

Lb. gasseri ATCC 33323 1.8 1708

Lb. brevis ATCC 367 2 1573

Sc. thermophilus LMD-9 2.1 1910

Bf. longum DJ010A 2 2122

Br.linens BL2 3 4231

Dans ces conditions, on obtient d'autant plus de duplex hétérologues que les séquencesd'ADN des microorganismes sont proches (Collins et al., 1989a).

Pour reconnaître la provenance de chaque brin d'ADN dans les hybrides, l'un des ADN estmarqué par un isotope radioactif ou par une enzyme. Pour éviter la réassociation des brins d’ADNmarqués, on travaille avec des concentrations d'ADN non marqué environ 1000-5000 fois plusimportante (Stackebrandt et Goebel, 1994).

Le degré d'homologie de deux ADN est déterminé en évaluant la fraction des génomessusceptibles de former des duplex hétérologues dans des conditions données de force ionique et detempérature (Vandamme et al., 1996).

La température optimale de réassociation de l'ADN est inférieure de 25-30°C à la valeur duTm. Deux souches appartiennent à la même espèce lorsque le pourcentage d'hybridation ADN/ADNest supérieur à 70%. En revanche un taux d’hybridation ADN/ADN se situait entre 0 et 65%indique que les souches n'appartiennent pas à la même espèce mais peuvent appartenir au mêmegenre (Stackebrandt et al., 2002).

La stabilité thermique est directement corrélée avec le pourcentage de bases non appariées.La correspondance est d'environ 1% de bases mésappariées pour un Tm de 1°C. Une valeur de 5°Ca été fixée comme seuil d'appartenance à une même espèce.

Mais pour le genre Lactobacillus, ces limites sont quelquefois dépassées (Axelsson, 2004).En plus, l’ARNr 16S offre une similitude qui a été suggérée pour être un critère dans la délinéationde l'espèce, avec une coupure de la divergence de 3%.


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Cependant, l’hybridation avec l’ARNr 16S ne devrait pas être employée comme seuleméthode dans la délinéation de l'espèce (Stackebrandt et Goebel, 1994). Les hybridationsADN/ARNr ont permis de dégager le concept de superfamille, terme proposé pour rassembler destaxons à un niveau supragénique.

L'ADN simple brin à étudier est fixé sur une membrane de nitrocellulose et est hybridéavec une sonde radioactive d'ARNr (16S ou 23S) isolée d'une souche référence (Stackebrandt etGoebel, 1994).

La stabilité des ARNr est mise à profit pour analyser les relations des bactéries au niveaude l'espèce et à des niveaux hiérarchiques plus élevés. L'ARNr 16S est le plus utilisé(Stackebrandt et Goebel, 1994).

L'ARNr 16S est utile à la classification phylogénétique et à l'identification bactériennepuisqu'il est présent chez toutes les bactéries (Collins et al., 1989 b; Collins et al., 1990). Ilcomporte des séquences conservées communes à des unités de taxons élevés et des séquencesvariables spécifiques d'espèces.

La séquence du gène codant l'ARNr 16S est connu pour environ 4000 souches et estaccessible par comparaison de bases de données (EMBL, GenBank). Les programmes FASTA etBLAST permettent de comparer une séquence nucléotidique d'une souche inconnue avec lesbanques de séquence et retiennent les séquences les plus proches (Altschul et al., 1997).

La recherche d'une séquence spécifique de l'espèce, utilisée comme sonde pour uneidentification rapide, est actuellement une voie en grande progression. Ces sondes permettentd'établir des empreintes génétiques variées caractérisant des genres, voire des espèces différentes oumême des souches d'une espèce donnée dans une population mixte, par exemple dans des milieuxnaturels (Klinj et al., 1995).

La possibilité d'analyser l'ADN par des enzymes de restriction a aussi ouvert la voie à lacomparaison directe des génomes en particulier après électrophorèse en champs pulsés (Ventura etal., 2001).

Cette technique nouvelle a permis d'accéder à la connaissance génétique du chromosome.Elle permet de mesurer sa taille et d'établir son profil de restriction. La comparaison de ces profilspermet de classer ces souches à l'intérieur de la même espèce, ou de séparer les espèces (Ventura etal., 2001).

Ces techniques modernes d’identification permettent d'établir de véritables arbresgénéalogiques entre les bactéries et aussi de reconnaître l'évolution des espèces et leur phylogénieau cours du temps (Schleifer et al., 1991).

L'espèce est l’element de base de la taxonomie bacterienne. C’est un ensemble monophylogénique et génomique de différents microorganismes qui montrent un degré élevé desimilitude globale dans beaucoup de caractéristiques indépendantes, et qui se distinguent par unepropriété phénotypique distinctive (Roselló-Mora et Amann, 2001).


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En taxonomie polyphasique, ces différentes techniques (phénotypique, génotype etphylogenetique) sont combinees pour aboutir a l’identification finale (Vandamme et al., 1996;Koort, 2006).

La définition d'espèce en bactériologie est qu'une espèce est un groupe de souchespartageant 70% ou plus d’ADN homologue (Stackebrandt et al., 2002). La taxonomiepolyphasique utilise l'information phénétique (phénotypique et génotype) et phylogénétique(Vandamme et al., 1996).

Dans la pratique, les données phénétiques sont basées sur le concept de la similitudeglobale (ressemblance), tandis que l'analyse phylogénétique est basée sur le concept de l'homologie(ayant une origine commune) (Koort, 2006).

Les cellules bactériennes peuvent contenir aussi des éléments extra chromosomiques, pluspetits, généralement libres dans le cytoplasme, appelés plasmides. Ils sont généralement formésd'une molécule d'ADN double brin circulaire, de petite taille (1 kpb à plusieurs centaines de kpb),dotés d'un système complexe de réplication indépendant de celui du chromosome (Boucher et al.,2001).

Les souches de Lc. lactis portent un nombre variable de plasmides (Kalmokoff et al.,2001; Kojic et al., 2005). Une des caractéristiques principales des souches de bactéries lactiques estque les gènes qui codent pour des caractéristiques recherchées en industrie sont souvent portés pardes plasmides (Kihal, 1996).

Ces propriétés sont le catabolisme du lactose, la production de protéinase et aussi larésistance aux bactériophages (Boucher et al., 2001). D'autres fonctions importantes dumétabolisme ont été également décrites chez les souches de lactocoques (Thompson et Collins,1989; von Wright et Sibakov, 1993).

Les données de séquençage de génomes bactériens entiers indiquent que les gènes dephage peuvent représenter jusqu'à 10% des gènes chromosomiques (Jarvis, 1984). Le rôle desphages dans l'évolution bactérienne a été spécialement étudié chez les bactéries pathogènes où ilssont à l'origine du transfert de nombreux gènes de virulence.

Le rôle de ces phages dans l'évolution des bactéries non pathogènes est, par contre, peudocumenté.

La plupart des études génétiques sur les bactéries lactiques concernent les souches utiliséesen industrie laitière (Gasson et Davies, 1984; Drouault et Corthier., 2001).

Depuis quelques années, des études se sont développées notamment sur Lactococcus,Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, et Streptococcus (Deguchi et Morishita, 1992; vonWright et Sibakov, 1993).


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Cependant, parmi les souches alimentaires, Lc. lactis est la bactérie la plus étudiée; elle estde ce fait considérée comme l’espèce modele. Lc. lactis est divisé en deux sousespèces principales:lactis et cremoris, initialement séparées sur des bases phénotypiques (Davidson et al., 1996) puis al’aide du séquençage des gènes codant pour les ARNr 16S (Salama et al., 1991; Godon et al.,1992).

Des données sont disponibles sur divers aspects du métabolisme des sucres, l’assimilationde l’azote, la biosynthèse des acides aminés et des bases, ou encore la réponse aux stress (Bandellet al., 1998).

De plus, un grand nombre d’outils sont disponibles et permettent d’étudier et de contrôlerl’expression des genes. Recemment, le génome de la sous-espèce lactis a été entièrement séquencé(Bolotin et al., 2001).

4. Métabolisme de BL

Il existe deux principales voies de fermentation des hexoses qui sont utilisés pour classerles BL. Dans des conditions de l'excès de glucose et d'oxygène limité, les BL homofermentairescatabolisent une mole de glucose dans la voie Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pour donner deuxmoles de pyruvate.

L'équilibre Redox intracellulaire a été maintenu grâce à l'oxydation du NADH,concomitante avec la réduction de pyruvate en acide lactique. Ce processus donne deux moles ATPpar le glucose consommé (Luquet et Corrieu, 2009).

Homolactique BL comprend Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, etdu Groupe I lactobacilles. Les BL Hétérofermentaires sont utilisées la voie des pentoses phosphatesdénommé la voie phosphoketolase des pentoses. Une mole de glucose-6-phosphate a étéinitialement déshydrogénée à 6 phosphogluconate puis décarboxylation d’une mole de CO2 (Fig.01).

Le résultant des pentoses-5-phosphate est clivé en un phosphate glycéraldéhyde mole(GAP) et un phosphate acétyle taupe. GAP est ensuite métabolisé en lactate comme danshomofermentation, avec l'acétyl phosphate réduite à l'éthanol par l'intermédiaire de l'acétyl-CoA etintermédiaires acétaldéhyde (Alomar, 2007).


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Figure 01: Les voies métaboliques des bactéries lactiques (Luquet et Corrieu, 2009)

En théorie, les produits finis (y compris l'ATP) sont produites en quantité équimolaire ducatabolisme d'une mole de glucose. Obligate BL hétérofermentaires comprend Ln. œni, Weissella,et du groupe III de lactobacilles (Kihal et al., 1996; Liebefeld, 2002; Welman et Maddox, 2003;Alomar, 2009).

5. Composés antimicrobiens produits par les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques produisent divers composés tels que les acides organiques, lediacétyle, le péroxyde d'hydrogène, et/ou les bactériocine pendant les fermentations lactiques(Ouwehand, 1998; Zhennai, 2000; Oyetayo et al., 2003; Deegan et al., 2006).

Les mécanismes antimicrobiens spécifiques des bactéries lactiques exploitées dans labiopréservation des nourritures incluent la production des acides organiques, du péroxided'hydrogène, de l'anhydride carbonique, du diacétyle, des antimicrobiens à large spectre tels que lareutérine et la production de bactériocines (Tab. 04) (Saidi et al., 2002; Vermeiren et al., 2004;Schnürer et al., 2005; Saidi et al., 2007).

Les composés antimicrobiens produits par les BL peuvent empêcher la croissance desbactéries pathogènes; contaminants possibles des produits fermentés (Guessas et al., 2006).


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Tableau 04: Les principaux caractéristiques des bactériocines produites par les bactéries lactiques(Parada et al., 2007)

Espècesproductrices Bacteriocine Spectre d'action Caractéristiques

Lc. lactis subsp.lactis

Lc. lactis subsp.cremoris

Nisine

Lacticine 3147

Lactococcine B

bactéries gram positives

Clostridium sp.L. monocytogenesS. aureusStr. dysgalactiaeEn. faecalisPr. acneStr. mutans

Lactobacillus sp.

Classe I lantibiotique, 3.5 KDa, 34 acidesaminés, disponible dans le commerce.

Classe I deux composants lantibiotiques,4.2 KDa, thermostable, actif sous acide etpH physiologique.

Classe II bactériocine, approx. 5 KDa,spectre d’activité limité.

Lb. acidophilus Acidocine CH5

Lactacine F

Lactacine B

bactéries gram positivesLactobacillus

Lb. fermentumEn. faecalisLb. delbrueckiiLb. helveticus

Lb. debrweckiiLb. helveticusLb. bulgaricusLc. lactis

Classe II bactériocine, poids moléculaireélevé.

Classe II bactériocine, 6.3 KDa, 57 acidesaminés, thermostable à 120°C/15 minutes.

Classe III bactériocine, 6.3 KDa,thermostable, pH de milieu 5.0 à 6.0.

Lb. amylovorus Lactobine A Lb. acidophilusLb. debrweckii

Classe II bactériocine, 4.8 KDa, 50acides aminés, spectre d’activité limité.

Lb. casei Lactocine 705 L. monocytogenesLb. plantarum

Classe II deus composants bactériocines,33 acide aminés, 3.4 KDa.

Ln. gelidum Leucocine A Lactobacillus sp.En. faecalisL. monocytogenes

Classe II bactériocine, 3.9 KDa, 37 acidesaminés, stable à pH bas et 100°C/20minutes.

Ln.mesenteroides MesentericineY105

En. faecalisL. monocytogenes

Classe II bactériocine, 3.8 KDa, 37 acidesaminés, thermostable à 60°C/120 minuteset pH 4.5.

Pc. acidilactici Pediocine F

Pediocine PA-1

bactéries gram positives

L. monocytogenes

Class II bactériocine, 4.5 KDa, sensibleaux enzymes protéolytiques, résistantes àla chaleur et aux solvants organiques,actifs sous différents pH.

Classe II bactériocine, 6.4 KDa, 44 acidesaminés.


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Pediocine AcHbactéries gram positives etgram negatives sous stress

Classe II bactériocine, 6.4 KDa, 44 acidesaminés, large spectre d’action.

Pc. pentosaceous Pediocine A LactobacillusLactococcusLeuconostocPediococcusStaphylococcusEnterococcusListeriaClostridium

Classe II bactériocine, 2.7 KDa, sensibleaux enzymes protéolytiques, thermostableà 100°C/10 minutes.

En. faecium Enterocine A L. monocytogenesPediococcus

Classe II bactériocine, 4.8 KDa, 47 acidesamonés, thermostable.

Lb. sake Lacticine S

Sakacine P

LactobacillusLeuconostocPediococcus

L. monocytogenes

Classe I bactériocine, 3.7 KDa, actif à pH4.5 et 7.5.

Classe II bactériocine, 4.4 KDa,thermostable.

Lb. curvatus Curvacine A L. monocytogenesEn. faecalis

Classe II bactériocine, 4.3 KDa.

Lb. helveticus Helveticine J Lb. bulgaricusLc. lactis

Classe III bactériocine, 37 KDa, sensibleaux enzymes protéolytiques, spectred’activité limité, réduction d'activité à100°C/30 minutes.


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5.1. Acides organiques

L'acide lactique est le métabolite principal des BL causant la réduction du pH qui inhibebeaucoup de microorganismes (Schnürer et Magnusson, 2005).

La forme non dissociée et plus hydrophobe de l'acide se répand au-dessus de la membranedes cellules et se dissocié à l'intérieur de la cellule, libérant les ions H+ qui acidifient le cytoplasme(Piard et Desmazeaud, 1991).

En plus de l'effet du pH, l'acide non dissocié fait chuter le gradient électrochimique deproton, entraînant la bactériolyse et finalement la mort des bactéries sensibles (Eklund, 1989).

Les BL hétérofermentaires produisent en plus, de l'acide acétique qui possède un plus hautpKa que l'acide lactique et ont donc une proportion plus élevée d'acide non dissocié à un certain pHsemblable avec l'acide lactique.

Les acides acétiques et propioniques agissent l'un sur l'autre sur les membranes de cellulespour neutraliser le gradient électrochimique de proton, mais l'effet de l'acide acétique et propioniquedépend souvent de la diminution du pH provoqué par l'acide lactique (Eklund, 1989).

L'acide propionique réduit la croissance fongique, particulièrement à un pH inférieur, etaffecte les membranes fongiques aux valeurs de pH en dessous de 4.5. L'acide propionique etacétique empêchent également l’assimilation d'acides aminés (Eklund, 1989).

L'acide lactique produit pendant la croissance des BL et l'acétate de sodium contenu dansle MRS, peuvent avoir des effets antifongiques synergiques (Cabo et al., 2002).

De toute façon, les effets inhibiteurs des acides organiques tels que l'acide lactique,acétique et propionique continueront à compliquer des études sur des effets antimicrobiens des BL,à moins que d'autre purification et caractérisation rigoureuses des substances soit appliquée(Magnusson et Schnürer, 2001; Magnusson et al., 2003; Schnürer et Magnusson, 2005).

La fermentation par les BL est caracterisée par l'accumulation d’acides organiques quis’accompagne d'une réduction du pH (Podolak et al., 1996). Les niveaux et les types d'acidesorganiques produits pendant les fermentations dépendent de l'espèce, de la composition du milieu,et des conditions de croissance (Lindgren et Dobrogosz, 1990).

Le pH bas extèrne cause l'acidification du cytoplasme des cellules, alors que l'acide nondissocié étant lipophile, peut se répandre passivement à travers la membrane. L'acide non dissociéagit en effondrant le gradient électrochimique de proton, ou en changeant la perméabilité de lamembrane des cellules (Smulders et al., 1986, Earnshaw, 1992).

L'effet inhibiteur spécifique des acides organiques est généralement attribué à leur formedissociée et non dissociée. Cette forme pénètre librement dans la cellule où elle s'ionise ce quiprovoque un abaissement du pH interne et le blocage de certains mécanismes de transport (Parenteet al., 1994).


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Dans le cas de l'acide lactique, les concentrations en acide non dissocié nécessaire pourprovoquer une inhibition sont pour les levures, les Enterobacteriaceae et les Microccocaceae del'ordre 1 mM; pour les moisissures de 3 mM; et pour les Bacillaceae de 4 Mm (Baird-Parker,1980; Adams et Hall, 1988).

L'acide lactique est le métabolite principal de la fermentation des BL où il est en équilibreavec ses formes dissociée et non dissociée, et l'ampleur de la dissociation dépend du pH. pH bas,une grande quantité d'acide lactique est sous la forme non dissociée, et elle est toxique à beaucoupde bactéries, champignons et levures (Podolak et al., 1996).

Cependant, le comportement des différents micro-organismes vis-à-vis de l'acide lactiquevarient considérablement. L’acide lactique a pH 5.0, à un effet inhibiteur contre les bactériessporulantes mais il est inefficace contre les levures et les champignons (Woolford, 1975).

L'antagonisme est censé résulter de l'action des acides sur la membrane cytoplasmiquebactérienne qui interfère l'entretien du potentiel de membrane et empêche le transport actif (deVuyst et Vandamme, 1994), et peut être négocié par l'acide dissocié et non dissocié (Cherringtonet al., 1991).

Les stéréoisomères de l'acide lactique diffèrent également dans l'activité antimicrobienne,l’acide lactique L etant plus inhibiteur que l’isomere D (Benthin et Villadsen, 1995). Les bactérieshétérofermentaires produisent des quantités d'acide organique autre que l'acide lactique. Lesleuconostocs, et les lactobacilles hétérofermentaires produisent autant d'acétate que de lactate(Kandler, 1983).

L'acide acétique est fortement inhibiteur pour les nombreux microorganismes et laprésence simultanée d'acide lactique pourrait avoir un léger effet de synergie. L'acide acétiqueégalement agit en synergie avec l'acide lactique; l'acide lactique diminue le pH du milieu,augmentant de ce fait la toxicité de l'acide acétique (Adams et Hall, 1988).

Les bactéries nocives et pathogènes ne peuvent pas se développer dans un environnementacide. Ainsi le pH minimum de croissance peut varier d'une bactérie à une autre. Dans les produitsfermentés, la baisse du pH dépend de la concentration en substrat fermentescible.

Elle est limitée par le pouvoir tampon du milieu et par le pH minimum toléré par lesferments. Le pH atteint dans certains de ces produits (yaourt, pH 4; saucisson sec, pH 4.5 à 5.3)suffit à éliminer certains contaminants (Huang et al., 1986).

Les acides acétiques et propioniques produits par les BL par les voies hétérofermentaires,peuvent agir sur les membranes, et causent l'acidification intracellulaire et la dénaturation desprotéines (Huang et al., 1986).

Ils ont un effet antimicrobien plus fort que l'acide lactique dus à leurs valeurs plus élevéesde pKa (acide lactique 3.08, acide acétique 4.75, et acide propionique 4.87), et un pourcentage plusélevé d'acides non dissociés à un pH donné (Earnshaw, 1992).


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L'acide acétique est plus inhibiteur que l’acide lactique et l’acide citrique envers L.monocytogenes (Richards et al., 1995), et envers la croissance et la germination de B. cereus(Wong et Chen, 1988).

5.2. Acides gras

Dans certaines conditions, quelques lactobacilles et lactocoques possédant des activitéslipolytiques peuvent produire des quantités significatives d'acides gras, par exemple dans lafermentation du lait fermenté (Rao et al., 1984) et des saucisses sèches (Sanz et al., 1988).

L'activité antimicrobienne des acides gras a été observée depuis des années. Les acidesgras insaturés présentent une activité contre les bactéries à Gram+, et l'activité antifongique desacides gras dépend de la composition, de la concentration, et du pH du milieu (Gould, 1991).

5.3. Peroxyde d'hydrogène

En général, les bactéries lactiques sont capables de transformer l’oxygène moléculaire (O2)en super oxyde (O2*), en péroxyde (H2O2) ou en eau (H2O). Ces réactions sont catalysées par desenzymes spécifiques généralement en présence d’un substrat à oxyder. La quantité de péroxyded'hydrogène produite par les bactéries lactiques dépend en grande partie de la souche et ladisponibilité de l'oxygène (Helander et al., 1997).

Ces enzymes ont été trouvées chez des souches de Streptococcus, Lactococcus,Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus (Condon, 1987). Le péroxyde d'hydrogène est produitpar les BL en présence de l'oxygène sous l'action de la flavoprotéine oxydase du nicotinamideadénine hydroxypéroxydase dinucléotide (NADH).

L'effet antimicrobien de H2O2 peut résulter de l'oxydation des groupes sulfhydriliquescausant la dénaturation d'un certain nombre d'enzymes, et de la péroxydation des lipides demembrane; de ce fait provoque l'augmentation de la perméabilité de la membrane (Kong etDavison, 1980; Davidson et al., 1983).

H2O2 peut également agir comme précurseur pour la production de radicaux libresbactéricides tels que le superoxide (O2) et radicaux d'hydroxyle (OH) qui peuvent endommagerl'ADN (Byczkowski et Gessner, 1988; Lindgren et Dobrogosz, 1990).

Dans le lait cru, H2O2 active le système de lactopéroxydase produisant le hypothiocyanate(OSCN-, des oxyacides plus élevés (O2SCN- et O3SCN- et produits intermédiaires d'oxydation quisont inhibiteurs à une gamme étendue de bactéries à Gram+ et à Gram- (Conner, 1993). H2O2 peuts'accumuler et devenir inhibiteur pour quelques microorganismes et plus particulierement lesanaèrobies (Pruitt et al., 1986; Condon, 1987; de Vuyst et Vandamme, 1994).


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5.4. Anhydride carbonique

Il est principalement produit par les BL hétérofermentaires. Le mécanisme précis de sonaction antimicrobienne est toujours inconnu. Cependant, le CO2 peut jouer un rôle antimicrobien encréant un environnement anaérobique, qui empêche les décarboxylations enzymatiques, etl'accumulation de CO2 dans le milieu peut causer un disfonctionnement de la perméabilité (Eklund,1984).

Le CO2 peut aussi empêcher la croissance de beaucoup de microorganismes dedétérioration, particulièrement les bactéries psychrotrophes à Gram- (Hotchkiss et al., 1999). Ledegré d'inhibition par le CO2 varie considérablement selon les espèces.

Un taux de CO2 de 10% pourrait diminuer la population bactérienne de 50%, et entre 20 et50%, il a une forte activité antifongique (Lindgren et Dobrogosz, 1990).

5.5. Composants arômatiques

Certaines bactéries lactiques sont capables de produire des composés d’arômes quiparticipent aux qualités organolèptiques des fromages. La plupart des composés d’arome sont issusdu métabolisme du citrate: l’acétoine et le diacétyle sont les plus importants.

5.5.1. Diacétyle

Il est produit par des souches de Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis par lafermentation du citrate (Lindgren et Dobrogosz, 1990; Cogan et Hill, 1993). Il est responsable del'arôme et de la saveur du beurre et de quelques autres produits laitiers fermentés.

Les niveaux sensoriels acceptables du diacétyle sont de 2 à 7 μg/ml (Earnshaw, 1992).Beaucoup de bactéries lactiques comprenant des souches de Leuconostoc, Lactococcus,Pediococcus, et Lactobacillus peuvent produire le diacétyle bien que la production soit réprimée parla fermentation des hexoses (Cogan, 1986).

Son utilisation pratique en tant que conservateur est limitée. Cependant, le diacétyle peutagir synergiquement avec d'autres facteurs antimicrobiens (Jay, 1992) et contribuer aux systèmescombinés de conservation des aliments fermentés. Les bactéries à Gram- sont plus sensibles audiacétyle que les bactéries à Gram+; 200 μg/ml et 300 μg/ml respectivement.

Une concentration de 344 μg/ml a empêché la croissance des souches de Listeria,Salmonella, Yersinia, et E. coli. L'effet antimicrobien du diacétyle a été connu depuis les années 30.Il empêche la croissance des bactéries à Gram- en affectant l'utilisation de l'arginine (Jay, 1986).

Le diacétyle a été démontré pour être un antimicrobien efficace contre un éventail debactéries Gram négatives et Gram positives, bien que les bactéries lactiques soient généralementrésistantes (Gill et Halley, 2003). Les quantités de diacétyle produites par Lc. lactis subsp. Lactisbiovar. diacetylactis varient de 0.07 à 3.72 ppm (Burrow et al., 1970).


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5.5.2. Acétaldéhyde

Chez Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, l'action d'une thréonine aldolase, clive lathréonine en acétaldéhyde et en glycine. L'acétaldéhyde à une concentration de 10 à 100 ppmempêche la croissance de S. aureus, Sl. Typhimurium, et E. coli dans les produits laitiers (Piard etDesmazeaud, 1991).

Les quantités d'acétaldéhyde produites par les lactocoques oscillent entre 2.60 et 6.50mg/ml (Bottazzi et Dellaglio, 1967). La contribution de l'acétaldéhyde à la biopréservation estmineure puisque le seuil de saveur est beaucoup inférieur aux niveaux qui sont considérésnécessaires à l'inhibition des microorganismes (Kulshrestha et Marth, 1974).

5.6. Reutérine

La reutérine est produite par Lb. reuteri, une espèce hétérofermentaire dont la nicheécologique est l'appareil gastro-intestinal des humains et des animaux (Axelsson et al., 1989). Lareutérine est formée pendant la croissance anaérobique de Lb. reuteri par l'action de la glycéroldéhydratase qui catalyse la conversion du glycérol en reutérine (Talarico et al., 1988).

La reutérine est produit pendant la phase stationnaire de Lb. reuteri dans un milieucontenant du glucose et du glycérol ou du glycéraldéhyde.

Elle a été chimiquement identifié pour être le 3-hydroxypropanal (α-hydroxypropionaldéhyde), un composé fortement soluble à pH neutre qui est en équilibre avec sesformes dimères monomériques et cycliques hydratées (Talarico et Dobrogosz, 1989).

La reutérine montre un large spectre d'activité antimicrobienne contre certaines bactéries àgram+ et à gram-. Les organismes de détérioration sensibles à la reutérine comprennent Salmonella,Shigella, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida, et Trypanosoma (Axelsson et al., 1989).

D’autres composés antimicrobiens sont aussi produits par les BL. Leur grande particularitéest qu’ils possedent un petit poids molèculaire. Ils sont désignés sous l’appéllation LMM (low-molecular-mass).


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6. Intêrets des bactéries dans l’industrie agroalimentaire

Elles sont principalement utilisées en tant que starter dans les produits alimentairesfermentés où elles permettent de développer certaines caractéristiques organoleptiques etd'augmenter la durée de conservation (Abee, 1995 ; Hugenholtz et Kleerebezem, 1999).

En effet, les bactéries lactiques produisent de nombreux métabolites aux propriétésantimicrobiennes tels que les acides organiques, le péroxyde d'hydrogène, le dioxyde de carbone, lareutérine, le diacétyl et les bactériocines (Rodgers, 2001-2004; Vermeiren et al., 2004).

D'après Yvette Soustre, (2001), la production d'acide lactique est le caractère le plusexploité dans ce domaine, mais d'autres produits de métabolisme tels que le peroxyde d'hydrogèneet le diacétyle sont également des agents antimicrobiens.

Certaines bactéries lactiques sont par ailleurs susceptibles, si les conditions dedéveloppement sont favorables, de synthétiser des bactériocines. Ces molécules, de structurepeptidique, peuvent avoir une action antibactérienne spécifique vis-à-vis de tel genre ou de telleespèce.

Les bactéries lactiques sont utilisées comme culture starter (introduction dans le laitservant à la fabrication du fromage); mais aussi légumes (choucroute, olives, cornichons), alcool(vin, cidre, bière), charcuteries (jambon, saucissons), pains au levain et l’ensilage (Luquet etCorrieu, 2008; Yvette Soustre, 2009).

Les avantages sensoriels d'exopolysaccharides sont bien établis, et il existe des preuvespour les propriétés de santé qui sont attribuables à des exopolysaccharides de BL. Cependant, ilexiste une grande variation dans les structures moléculaires des exopolysaccharides et la complexitédes mécanismes par lesquels les changements physiques dans les aliments et les effets bioactifs sontprovoquées l’ensilage (Welman et Maddox, 2003; Ström, 2005).

6.1. Production des levains lactiques

Depuis les années 1980, les bactéries et les ferments lactiques sont utilisés sous formeconcentrée, congelée ou lyophilisée pour fabriquer des produits laitiers par ensemencement direct.

Ces techniques permettent de simplifier, standardiser et sécuriser les procédés defabrication, facilitant aussi les innovations. La technique dépend des souches utilisées. Les BLlyophilisées (déshydratation à très basses températures) se conservent à 6°C (Luquet et Corrieu,2008).


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6.2. La sélection des BL

D'aprés Luquet et Corrieu (2008), la sélection des BL à pour objet la fabrication deferments ou levains qui servent à ensemencer directement le lait. La plus ou moins grande capacitédes BL à produire de l’acide lactique, des arômes ou d’autres composés (sucres, acides aminés pardégradation des protéines, CO2 etc.) ainsi que leur capacité à augmenter la valeur nutritionnelleet/ou santé de l’aliment sont prises en compte.

Il y a deux façons principales d’ensemencer le lait: soit en utilisant une petite quantité deproduit issu de la précédente fermentation, soit en faisant intervenir directement des ferments.

L’introduction de nouveaux gènes par génie génétique n’est pas autorisée en alimentationhumaine mais fait l’objet de travaux de recherches dans le domaine pharmaceutique

6.3. Intérêt des bactéries lactiques

6.3.1. L’industrie laitière

Les LB donnent aux produits finis des caractéristiques spécifiques comme: le goût,l’arôme, texture qui diffèrent selon les souches ou les mélanges de souches utilisées. Ainsi, certainsproduits laitiers fermentés seront liquids (Kéfir, Koumis…).

D’autres semi-solides ou solides (yaourt, fimjrِk, villi, laben…); c’est principalementl’acide lactique qui joue sur la texture et le gout de ces produits (tableau 05). Au fur à mesure qu’ils’accumule dans le lait, le pH diminue ce qui destabilisé les micelles de caséines du lait qui finissentpar précipiter en formant un gel (Marteau, 2007; Makhloufi, 2012).

Les autres saveurs et arômes seront en fonction des souches utilisées produisant descomposés intermédiaires comme l’acétaldéhyde (arôme du yaourt), le diacétyle (goût de beurre),l’acétoïne, les lactones …..etc.

D'aprés Marteau, (2007) l’abaissement du pH (qui inhibe la croissance de la plupart desgermes non-lactiques), et la sécrétion de bactériocines peptides ou protéines (ayant une activitéantibactérienne) jouent un rôle dans la conservation des produits.

6.3.2. Dans la fabrication des yaourts

Les bactéries lactiques utilisées dans la fabrication du yaourt sont thermophiles (ellespeuvent vivre même à haute température) et de deux sortes: Str. thermophilus et Lb. bulgaricus; leyaourt est le résultat d’une symbiose (Tab. 06).

Le goût acidulé du produit est dû à cette fermentation lactique, et sa saveur caractéristiqueest liée à la production de composés arômatiques par les deux BL. La législation impose que lesferments lactiques du yaourt restent vivants dans le produit final, à raison de 10 millions pargramme (Yvette Soustre, 2009).


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6.3.3. Dans la fabrication des fromages

La fabrication du fromage se déroule en plusieurs étapes et fait l’intervenir des BL dont lesprincipales appartiennent aux genres Lactococcus, Streptococcus et Lactobacillus. Les BL facilitentaussi l’égouttage, la séparation spontanée du caillé (la partie solide) et du lactosérum (la partieliquide) (Tab. 07).

Elles protègent le caillé du fromage d’une contamination par les germes indésirables (L.monocytogenes, Salmonella, S. aureus, et les coliformes). Certaines jouent aussi un rôle durant laphase d’affinage du fait d’une activité protéolytique (elles décomposent les protéines pour donnerdes peptides dont certains actifs).

Les BL aussi créant des conditions favorables à la croissance des microorganismesd’affinage et participent au goût des fromages par la production de substances aromatiques et à leurtexture (Dib et al., 2012).


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Tableau 05: Quelques exemples de laits fermentés (Luquet et Corrieu, 2009)

Nom Pays d’origineprésumé Description ferments

Yoghourt Asie, Balkans Produit ferme ou brassé, acide,arôme caractéristique

Str. thermophilus, Lb.bulgaricus (Lb. acidophilus,Bifidobacterium ssp.)*

Lait àl’acidophilus

Etas-Unis Produit ferme, brassé ou liquide,faible arôme

Lb. acidophilus

Kéfir Caucase Boisson brassés, consistancecrémeuse, arôme et goûtcaractéristique (CO2)

Lb. acidophilus, Lc. lactis,Lc. cremoris, Lb. kefir, Lb.casei, Leuconostoc spp.,levures

Koumis Mongolie Boisson pétillante, acide, goûtrafraîchissant, arômecaractéristique

Lb. bulgaricus, Lb.acidophilus, levures

Lassi Inde Boisson laitière aigre diluée avec del’eau, consommée salée, épicée ousucrée

L actococcus spp.,Lactobacillus spp.,Leuconostoc spp., (levures)

Dahi Inde Produit ferme ou brassé, ou boissonliquide ; flaveur agréable, acide oufaiblement acide

S. thermophilus, Lb.bulgaricus, Leuconostocspp.

Leben Moyen Orient Produit ferme, brassé, goût etarôme agréable

S. thermophilus, Lb.acidophilus, Lc. lactis,levures

Filmjölk Suède Boisson brassé visqueuse, saveuracidulée

Lc. lactis, Lc. cremoris, Ln.cremoris, Lc. diacetylactis

villi Finlande Produit brassé visqueux, acidulé etgoût agréable

Lc. lactis, Lc. cremoris, Lc.diacetylactis, Lc.dextranicum, moisissure(Geotrichum candidum)


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Tableau 06: Principales fonctions des BL dans les produits laitiers (Grignon, 2003)

Fonction Produits concernés

Acidification Tous les fromages et laits fermentés, crèmes et beurres« acides »

Productions d’arômes (diacétyle, acétaldéhyde,produits de catabolisme des acides aminés……)

Production d’agents épaississants(exopolysaccharides)

Laits fermentés (yaourt), certains fromages frais

Production de gaz (CO2) Fromages (Requefort, Gouda….)Laits fermentés (akaéfir, Koumiss)

Activité probiotique certains laits fermentés

Tableau 07: Principales utilisations des BL dans les produits alimentaires (Grignon, 2003)

Produits Principles bactéries lactiques

Végétaux fermentés (choucroute, olives….) Ln. mesenteroides, Lb. plantarum, Pc. pentosoceus

Viandes ou poissons (soucisson sec…) Lb. plantarum, Lb. curvatus, Lb. sakei, Pc. acidilactici,Carnobacterium sp.

Boissons alcoolisées (certains vins…) Lb. plantarum, Oenococcus œni

Souce soja Lb. delbrueckii, Pc. soyce

Produits de boulangerie (pain ou levain) Lb. plantarum, Lb. sanfrancisco, Lb. fermentum, Lb. brevis

Probiotiques (santé humaine ou animale) Lb. acidophilus, Lb. casei

Fromages, laits fermentés, crèmes, beurres Ln. mesenteroides, Lc. lactis, Lb. helveticus, Str.thermophilus

Lb : Lactobacillus, O : Oenococcus, Ln : Leuconostoc, Pc : Pediococcus, Lc : Lactococcus, Str : Streptococcus.


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6.3.4. Formation de l’arôme et de la saveur

L’analyse bibliographique montre que trés peu de travaux ont été consacres à l’étude descomposés arômatiques volatils des aliments ou boissons amylacés et fermentés par les BL.

L’acétoine et ses derivés ainsi que certains composés comme (1-propanol, acétated’isoamyle, acétate d’éthyle, 3-méthyl-1-butanol, acétoïne), sont les principaux composés volatilsidentifiés et proviendraient de l’action des bactéries lactiques et donneraient au produit sescaractéristiques organolèptiques (Amoa-Awua et al., 1996).

Les acides oxalique, citrique, malique, lactique, fumarique et propionique ont été detèctésdurant la phase de fermentation alcoolique et leur presence pourrait être dûe à l’action des bactérieslactiques (Dje et al., 2008; Yao et al., 2009).

6.3.5. Préservation et innocuité de l’aliment

La fermentation est une méthode de conservation des aliments. Les bactéries lactiquesproduisent plusieurs composés antimicrobiens naturels, à savoir: des acides organiques (lactique,acetique, formique, phenyl-lactique, caproique), le dioxyde de carbone, le péroxyde d’hydrogène, lediacétyle, l’éthanol et les bactériocines (Messens et De Vuyst, 2002).

La production d’acides organiques au cours de la fermentation entraine une reductionimportante du pH, qui est associée à la formation de composés antimicrobiens qui détermine lastabilité microbienne des produits ainsi que l’inhibition des bactéries pathogènes et d’autresmicroorganismes.

Les travaux de Mensah et al., (1991) et ceux d’Annan-Prah et Agyeman, (1997) ontsuggère que la pâte de maïs fermentée pour la production de kenkey au Ghana pourrait constituerune importante barrière contre le developpement de bactéries pathogènes telles que Escherichiacoli, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, et Staphylococcus aureus.

Plusieurs travaux ont montre que les acides organiques produits durant la fermentation dupito au Ghana, du tchapalo en Cote d’Ivoire et du ben-saalga au Burkina-Faso, permettaient auproduit d’avoir une bonne stabilité au cours de la conservation (Tou et al., 2006 ; Dje et al., 2008;Yao et al., 2009).

L’action des bactéries lactiques au cours de la fermentation contribue aussi à l’éliminationde composés toxiques comme les glucosides cyanogenetiques du manioc (Holzapfel, 2002).

Amoa-Awua et al., (1996) ont également rapporté que les BL produisaient unedétoxification significative du manioc au cours de la production d’agbélima au Ghana.


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6.3.6. Influence sur la valeur nutritionnelle

L’action des bactéries lactiques au cours de la fermentation à aussi un impact sur la valeurnutritionnelle des produits fermentés, à travers la reduction de facteurs antinutritionnels quiaffectent la biodisponibilite des minéraux.

Recemment, les travaux de Kayode et al., (2007) ont montre que l’étape de fermentationcontribuait à une reduction significative de la teneur en phytates au cours de la production detchoukoutou.

La reduction de cette teneur (approximativement 95 %) observée, serait dûe a l’action desbactéries lactiques et de Saccharomyces cérevisiae (ajoute comme ferment au cours de lafermentation).

Parallelement à ces modifications, une meilleure solubilité du fer et une corrélation entre lasolubilité du fer et les phytates a été observe (Tou et al., 2006; Yao et al., 2009).

6.3.7. Influence sur la structure de la matrice alimentaire

L’analyse bibliographique montre que très peu de travaux ont été consacrés à l’étude del’impact de la fermentation sur la structure des produits amylacés et fermentés.

Les bactéries lactiques hétéro fermenteur seraient probablement responsables dugonflement et de la structure poreuse du Mawè par le biais d’une production de gaz (CO2) (Nago etHounhouigan, 1990).

Par exemple, la structure poreuse du Mawè est souhaitable, car elle facilite ladésintégration des particules au cours de la préparation d’un autre produit dérivé l’Aklui (bouilliesemi-liquide parsemée de grumeaux).

La fermentation du manioc pour la production d’Agbelima permettrait au produit d’avoir àla foi son gout et sa texture caractéristique (Amoa-Awua et Jakobsen, 1995; Yao et al., 2009).

6.3.8. Utilisation des bactéries lactiques comme cultures starters

6.3.8.1. Définition et critères de sélection

Les cultures starters peuvent être définies comme des préparations microbiennesconcentrées constituées un ou plusieurs microorganismes viables, se caractérisant par des propriétésphysiologiques et métaboliques particulières et capables d’induire les changements désirent dans lesubstrat (Stiles et Holzapfel, 1997; Sanni et al., 2002; Kostinek et al., 2005; Oguntoyinbo, 2007).


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L’introduction de cultures starters de bactéries lactiques au cours de la fermentation doittenir compte des critères d’amélioration du procédé de transformation et de la qualité des produits àtravers :

v Une accélération des activités métaboliques (acidification ou production d’alcool);v L’amélioration et le controle du procéssus de fermentation;v La formation des caractéristiques organolèptiques desires;v Une amélioration de la sécurité et la reduction des risques sanitaires et toxicologiques.v Selon ce dernier, la selection des souches doit aussi tenir compte des intéractions possibles

dans des cultures mixtes, de leur comportement dans des conditions définies et sur la matièrepremière.

Toujours selon le même auteur, d’autres facteurs peuvent aussi intervenir, notamment:

· La compétitivité, la viabilité et la survie;· L’antagonisme avec les agents pathogènes et la flore d’altération;· Le taux de production d’acide ou d’alcool;· Les modifications organolèptiques;· Les métabolites primaires de la fermentation;· La dégradation des facteurs antinutritionnels;· La detoxification et les propriétés probiotiques.

6.3.8.2. Préparation et conservation

La majeure partie des bactéries lactiques utilisées comme cultures starters dans les produitsfermentés de l’Afrique de l’Ouest sont introduites au cours de la fermentation sous la forme d’unesuspension fraiche de cellules.

En général, l’inoculum est obtenu après 24 h de croissance (bouillon de Man RogosaSharp) d’une colonie isolée sur milieu gélosé, centrifugation et suspension (dilution) dans unesolution salée stérile pour obtenir la concentration recherchée.

La conservation de ces suspensions microbiennes, dans un état actif, sur de longuespériodes est une étape cruciale pour une pratique uniforme de la fermentation (Okafor et al., 1999;Yao et al., 2009).


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7. Interaction des BL avec d’autres microorganismes

Les bactéries lactiques et les lévures sont les microorganismes dominants généralementrencontres dans la plupart des produits fermentés à base de céreales et de manioc en Afrique del’Ouest (Oyewole, 2000; Kayode et al., 2007).

Le developpement des bactéries lactiques pourrait etre stimulé par la présence de composésazotés solubles et de facteurs (vitamines B, CO2, pyruvate, propionate, succinate, acétate) produitspar les lévures (Leroi et Pidoux, 1993).

De plus, l’environnement acide crée par les bactéries lactiques favoriserait la croissancedes lévures. Ainsi l’alcool produit par la lévure, les acides produits par les bactéries et l’anaèrobioseinduite par la fermentation, permettraient de supprimer les champignons filamenteux et les bactériesassociées à la déterioration des aliments (Mensah et al., 1991).

Une production de 03% d’alcool et d’acides organiques (lactique, acétique, formique) aprésinoculation de cultures pures de Candida sp., Geotrichum candidum, et Lactobacillus sp. au coursde la production de pito au Nigéria a été demontrée (Ekundayo, 1969).

Chapitre 02Les bactériocines

Chapitre 02: Les Bactériocines

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1. Historique des bactériocines

Les bactériocines sont des substances de nature protéique possédant des propriétésantigéniques et élaborée par certaines souches microbiennes ayant la capacité de tuer d'autressouches de ces mêmes germes.

Parmi ces substances, les colicines ont été les premières découvertes par Gratia en 1925,qu’il a été observé que E. coli produite en milieu liquide une substance stable à température élevéeet possède également une activité inhibitrice sur la croissance des autres microorganismes de mêmeplan taxonomique.

En 1928, Rogers a rapporté pour la première fois une substance antimicrobienne produitepar Lc. lactis ssp. lactis autre que les acides organiques et le peroxyde d'hydrogène. Cette substancea été identifiée plus tard par Hirsch (1951), qui a démontré sa nature protéique et l'a nommée"nisine".

En 1952, Jacob et ces collaborateurs proposèrent le terme plus général de bactériocine àces substances. Ce terme a été utilisé à l'origine pour désigner toute protéine à activitéantimicrobienne de type "colicine", caractérisée par une activité létale, et un spectre d'actionrestreint à des bactéries étroitement apparentées.

Depuis la découverte des bactériocines, la plupart des études établies dans ce domaine ontété décrits (Fredericq, 1957 et 1963), les méthodes de base de détections, de dosage et de typagedes bactériocines ont été établis.

D'autres études sur la biologie moléculaire, la biosynthèse, la libération, et le mode d'actiondes bactériocines ont été réalisées (Lakey et al., 1993).

Ces données conduisent à une utilisation intéressante des bactériocines comme outilbiochimique en physiologie cellulaire (Becker et al., 1993). La survenue d'interactions antagonistesentre les bactéries a été signalée par Pasteur et Joubert à la fin du 19ème siècle.

De même, l'action inhibitrice exercée par Staphylococcus sp., contre Corynebacteriumdiphyteriae a également été observée. Cette découverte a conduit à l'emploi des isolats destaphylocoques dans le traitement de la diphtérie (Jack et al., 1995; Florey, 1996).

Les bactériocines ont acquis une nouvelle attentinon en particulier dans l'épidémiologie desinfections nosocomiales (Lebek et al., 1993).

1.1. Système de défense microbien

Les microorganismes possedent un groupe extraordinaire de système de défense microbienpour maintenir leurs existences ou leurs niches écologiques (Nissen-Meyer et Nes, 1997) contredes concurrents ou des infections (Riley et Wertz, 2002).


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Les systèmes de défense microbiens comprennent les antibiotiques classiques à largespectre et sous-produits métaboliques tels que les acides lactique, les agents lytiques comme leslysozymes, et les exotoxines protéiques (James et al., 1991).

La production des peptides antimicrobiens, c’est une première barrière de défensemicrobien, ainsi qu'une partie de l'immunité innée trouvée dans une variété d'espèces (Cleveland etal., 2001).

Ces peptides ont un effet direct sur les microorganismes, par exemple déstabiliser lamembrane bactérienne, virale ou fongique ou d'agir sur d'autres cibles, ils semblent être largementimpliqués dans l'orchestration des réponses immunitaires innées et inflammatoires (Hancock etdiamants, 2000a).

Peptides antimicrobiens sont une caractéristique universelle des systèmes de défensepratiquement dans toutes les formes de vie, avec des représentants dans des organismes allant desbactéries aux plantes, d'invertébrés aux vertébrés, y compris les mammifères (Mattick et Hirsch,1947).

Les bactériocines sont censés être produites par plusieurs ou la plupart des bactéries(Klaenhammer, 1988), et sont généralement extrêmement puissant par rapport à la plupart de leurshomologues eucaryotes.

Leurs activités soit à spectre large ou étroit, capable de cibler les bactéries de la mêmeespèce ou de genres différents. Les bactériocines sont présents dans prèsque toutes les espèces debactéries étudiées à ce jour, et au sein d'une espèce ou des centaines de différents types debactériocines sont produites (Riley et Gordon, 1992).

1.2. Ecologie

Sur une base évolutive, la capacité de synthétiser une ou plusieurs bactériocines à été unecaractéristique très avantageuse pour la survie, la prolifération d'un organisme ou leur éliminationdans leur niche écologique, où la concurrence peut être très intense étant donné la diversité desespèces et la croissance rapide de bactéries (Chen et Hoover, 2003).

Les bactériocines jouent un rôle fondamental dans la dynamique de la populationbactérienne, même si le degré d'interaction entre bactériocine est complexe au niveau écologique etévolutif des populations mixtes (tels que les biofilms), que beaucoup reste encore inconnue.

Les bactériocines servent comme anti-concurrents qui permettent l'invasion d'une soucheen une communauté microbienne établie. Elles peuvent également jouées un rôle défensif et d'agirpour interdir l'invasion des autres souches ou espèces dans un écosystème occupé ou de limiter laprogression des cellules voisines.


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Riley, (1998) a noté que la présence des bactériocines dans les milieux naturels, tels queLb. plantarum dans les fermentations d’olive vert, E. coli dans la conjonctive de porcs et Str.mutans dans la cavité buccale de l'homme, ont indiqué que l'avantage compétitif est sensiblementaccrue pour les cellules productrices de bactériocines contre les bactéries sensibles dans les mêmesenvironnements.

Riley et Gordon, (1999) indiquent que la plupart de modélisations écologiques desbactériocines a été réalisé avec les colicines (bactériocines produites par E. coli et montrant uneactivité contre d'autres souches d’E. coli très proches des membres de la famille desEnterobacteriaceae) qui sont produites généralement dans des conditions stréssantes telles quel'appauvrissement en éléments nutritifs ou la surpopulation.

1.3. Production de peptides antimicrobiens

1.3.1. Définition de la bactériocine

Contrairement aux antibiotiques classiques, les bactériocines sont synthétisées par voieribosomique, généralement par les bactéries gram positif appartenant au groupe des bactérieslactiques. Elles peuvent subir ou non, des modifications post-traductionnelles avant d’être excrétéesdans le milieu extracellulaire.

Leur spectre d’action antibactérien, généralement étroit comprend souvent des souchesappartenant à la même espèce que la souche productrice. Cette dernière produite une protéined’immunité pour se protéger des effets délétères de la bactériocine qu’elle produit (Jack et al.,1995).

Antibiotiques désigné toutes les substances provenant de microorganismes, animaux,plantes qui ont les propriétés suivantes:

i) L'activité létale ou inhibitrice contre les espèces microbiennes; ii) la capacité à prévenirl'apparition de la résistance microbienne; iii) l'absence d'effets indésirables de l'hôte, et iv) lastabilité chimique (Amato Neto et al., 1994; Abrahan et al., 1996).

De manière générale, les antibiotiques peuvent être définies comme des agentsd'intervention considérable sur la croissance et/ou les activités microbiennes (Trabulsi et al., 2002).

Il comprend: i) d'endommager la paroi cellulaire; ii) la déstabilisation de la membranecytoplasmique; iii) modifier la structure des acides nucléiques; iv) l'action de l'inhiber enzymatique;v) des actions antimétaboliques et vi) agissant sur la synthèse d'acide nucléique (Pelczar et al.,1980).

Selon Tagg et al., (1976), les bactériocines sont définis comme des composés protéiquesqui tuent les bactéries étroitement apparentées. Cette définition est vrai pour la majorité desbactériocines; mais progressivement, il est devenu évident que certaines bactériocines aussi ont uneactivité bactéricide contre les espèces qui sont plus éloignés.


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Les bactériocines sont des molécules plus abondantes et diversifiées avec une activitéantimicrobienne produit par genres bactériens différents, y compris Gram-positives et Gramnégatives (Riley, 1998).

Les bactériocines ont été définis comme des substances bactériennes avec une capacitéd'inhiber même à faibles concentrations la multiplication des bactéries similaires sur le plantaxonomique (Brock, 1995).

Les bactériocines forment un groupe hétérogène avec leurs poids moléculaire, spectreantibactérien, la stabilité chimique, et leur mode d'action (De Vuyst et Vandame, 1994).

Montville et Kaiser, (1993) suggère que la définition de bactériocines devrait être fondéeque sur deux conditions essentielles, à savoir leur nature protéique et l'absence de létalité pour lescellules productrices.

Ces auteurs ont confirmé que peu de protéines antimicrobiennes correspondent à ladéfinition classique proposée par Tagg et al., (1976).

Les bactériocines ont été désignées comme les antibiotiques (tab. 08 et 09) par définition,et se différenciés des antibiotiques sur la base de la synthèse, le mode d'action antimicrobien, lespectre d’action, la toxicité, les mécanismes de résistance, les applications et les effets cliniques(Davis, 1999; Chen et Hoover 2003).


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Tableau 08: La différence entre les bactériocines bactériocines et les antibiotiques (Klement et al.,1990).

Caractéristique bactériocines AntibiotiquesApplication Aliments Clinique

Synthèse Ribosomique Métabolite secondaire

Activité Spectre étroit Spectre variable

Immunité de cellule hôte Oui Non

Mécanisme d’action sur lacellule cible

affecter la composition demembrane de cellules

selon le mode de l'action

Conditions d'interaction Parfois accouplement desmolécules

Cible de spécifie

Mode d'action La plupart du tempsformation de pore

Membrane de cellules ou ciblesintracellulaires

Effets de Toxicité Aucun connu Oui


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Tableau 09: Caractéristiques des substances antimicrobiennes appartenant aux bactériocinesproduites par certaines BL (Jack et al., 1995).

Peptide antimicrobien La massemoléculaire

(KDa)

Acidesaminés

Microorganisme producteur

LantibiotiquesActagardineAncivenineCinnamycineDuramycineEpidermineGallidermineLanthiopeptineMersacidineNisinePep5Subtiline

CystibiotiquesPediocine AcH/PA1Leucocine A/UAL 187Mésentéricine Y 105Sakacine ASakacine PLactacine FCarnobactériocine ACarnobactériocineBM1Carnobactériocine B2Cereine 7/8

ThiolbiotiquesLactococcine B

Non cysteineLactococcine B

Lactococcine Ma

Lactococcine Na

Lactococcine Gαa

Lactococcine Gβa

1.92.02.02.02.02.02.01.83.43.53.3

4.63.93.84.34.45.65.14.54.94.9

5.3

5.8

4.34.44.34.1

1919191922221919343432

44373741435753434856

47

54

48473935

Actinoplanes spp.Streptomyces spp.Str. cinnamoneusStr. cinnamoneusS. epidermidisS. gallinarumStreptoverticullum cinnamoneumBacillus sp.Lc. lactisS. epidermidisB. subtilis

Pc. acidilactici H/PAC 1.0Ln. gelidum UAL 187Ln. mesenteroides Y 105Lb. sake LB 706Lb. sake LTH 674Lb. acidophilus 11088Cr. piscicola LV 17 ACr. piscicola LV 17 BCr. piscicola LV 17 BB. cereus Bc7

Lc. lactis subsp. cremoris 9 B4

Lc. lactis subsp. cremoris 9 B4Lc. lactis subsp. cremoris LMG 2130Lc.lactis subsp. lactis bv,diacetylactis WM4Lc. lactis subsp. cremoris 9 B4Lc. lactis s ubsp. cremoris 9 B4Lc. lactis s ubsp. lactis LMG 2081Lc. lactis s ubsp. lactis LMG 2081

a Ces deux paires de peptides agissent synergiquement.


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1.3.2. Les peptides antimicrobiens des eucaryotes

Chez les plantes, les peptides antimicrobiens jouent un rôle important et fondamental dansla défense contre l'infection par les bactéries et les champignons (Jensen et al., 2006).

Par exemple, les défensines végétales font preuve d'une activité antibactérienne etantifongique in vitro (Terras et al., 1992). Compatible avec le rôle défensif, on les trouve dans lesfeuilles, les fleurs, les graines et les tubercules.

Peptides antimicrobiens ont été également isolés à partir d'invertébrés et de vertebras, ycompris les poissons, les amphibiens, et les mammifères, ce qui indique que même en présenced'une réponse immunitaire adaptative, ces peptides ont un rôle important dans la défense de l'hôte.

Glandes de la peau des amphibiens se sont révélées être une source riche de peptidesantimicrobiens comme magainins (Zasloff, 1987), qui améliore l’activité perméabilisante de lamembrane contre les bactéries Gram positif et Gram négatif, les champignons, les levures et lesvirus.

D’autres peptides antimicrobiens comme les cathélicidines chez les vertébrés (Ganz, 2003)et la histatine dans la salive de l'homme et les primates sont principalement dirigées contre lesagents fongiques pathogèns (Tsai et Bobek, 1998).

1.3.3. Peptides antimicrobiens des bactéries

Peptides antimicrobiens ont été détectées dans les eubactéries et les archéobactéries(Torreblanca et al., 1995).

D'après Klaenhammer (1988), 99% de toutes les bactéries à au moins un peptideantimicrobien et les microbes investir beaucoup d'énergie dans la production et d'élaboration de cesmécanismes antimicrobiens.

Diverses conditions environnementales, y compris le pH, la température, l'aération, laconcentration en sucre, la capacité tampon du milieu, et le temps d'incubation, affecter la productionde bactériocines (Lewus, 1991).

L'état physiologique de la souche sensible à une grande influence sur sa sensibilité àl’action létale des peptides antimicrobiens (Tagg et al., 1976).

1.3.3.1. Les bactériocines des bactéries Gram positif

Les bactériocines sont censés être produits par plusieurs ou la plupart des bactéries et sontgénéralement extrêmement puissant par rapport à la plupart de leurs homologues eucaryotes(Klaenhammer, 1988).


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Les peptides de membranes les plus concernées qui sont actives sont celles produites parles bactéries Gram positif (Oscáriz et Pisabarro, 2001).

Mais il est maintenant sûr de dire que les bactériocines produites par les bactéries Gram-positif sont le groupe le plus étudié et utilisé dans les applications alimentaires (Schillinger et al.,1996).

La plupart sont synthétisées sous forme prepeptides dans lequel le peptide de tête estenlevée pour former la bactériocine biologiquement actives. De cette manière, il rassemble à ungrand nombre des peptides antimicrobiens produits par les eucaryotes (Jon Nissen et Ingolf, 1997).

Les bactériocines les plus étudiés sont ceux produits par les bactéries lactiques (BL), dontsakacines semblent être les plus uniques (Jack et al., 1995), et les lantibiotiques, qui contiennentdes résidus d'acides aminés modifiés (Oscáriz et Pisabarro, 2001).

1.3.3.2. Les bactériocines des bactéries Gram négatif

La famille bactériocine comprend une diversité de protéines en termes de taille, moded'action, et de mécanismes d'immunité. Beaucoup de bactériocines isolées de bactéries Gram-négatif semblent avoir été créés par recombinaison entre les bactériocines existants (Braun et al.,1994).

Le bactériocine le plus étudié c’est la colicine produite par E. coli qui cause la mort de lacellule cible par la formation des pores dans la membrane cellulaire, et inactivé la nucléase ADN,ARNr, et ARNt dans la cellule (James et al., 1996).

Toutes les bactériocines produites par les bactéries gram-négatif, sont de grosses protéinesde taille varie de 449 à 629 acides amines (Pugsley et Oudega, 1987). Permet ces bactériocines, lespyocines produites par Ps. aeruginosa (Sano et al., 1993).

D’autres bactériocines prochent de la famille colicines, celles de Serratia marcesens, qui setrouve sur les plasmides et les chromosomes (Ferrer et al., 1996). Le N-terminal (> 25% desprotéines) est responsable de la translocation de la protéine dans la cellule cible, le reste de laprotéine tuant la région d’immunité.

1.3.4. Peptides antimicrobien des archeobactéries

Archéobactéries, ont leurs propres familles distinctes de bactériocines qui a été connu sousle nom d'archaeocines. Le seul membre de la famille est l’halocine produite par les halobactéries(Cheung et al., 1997; Shand et al., 1998).

Halocine S8, est un peptide hydrophobe court de 36 acides aminés, et de poids moléculairede 34 kDa (Price et Shand, 2000).


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Halocine S8 est codé sur un mégaplasmide et est extrêmement robuste, il peut êtredessalée, bouillie, soumis à des solvants organiques, et stockés à 4ºC pendant de longues périodessans perdre l'activité.

Archaeocines sont produites en phase stationnaire. Lorsque les éliments nutritifs sontlimitées, les cellules productrices lyse les cellules sensibles et enrichir le contenu en nutriments del'environnement local.

Que les protéines stables, elles restent dans l'environnement assez longtemps pour réduirela concurrence au cours des phases ultérieures de flux de nutriments.

La stabilité de halocines contribuer à expliquer la diversité des espèces dans les milieuxfréquentés par hypersalins halobactéries (Shand et al., 1998).

1.4. Nomenclature

La nomenclature des bactériocines en général est une notion subjective car elle est baséesur l'ajout du suffixe «cin» pour le genre ou l'espèce, nom pour désigner l'activitébactériocinogènes.

Alors que certains bactériocines reçoivent leur dénomination fondée sur l'espèce(plantaricine, sakacine, caseicine) ou le nom du genre (lactococcine, lactocine, pédiocine) dumicroorganisme producteur (de Lima et Filho, 2005).

Autres bactériocines produites par différentes espèces Lactococcus appeléesgénériquement lactostrepcine, la nisine et diplococcine. Sequential lettres placées dans l'ordre de ladécouverte sont utilisés après le nom de la bactériocine pour la différentiation de celles produitespar des souches différentes de la même espèce, tels que lactacine F qui se réfère à la bactériocinesixième signalé pour une espèce Lactobacillus (Tagg et al., 1976; Kozar et al., 1978,Klaenhammer, 1988; Montville et Kaiser, 1993).

Selon Tagg et al., (1976), la procédure la plus adéquate serait de faire appel bacteriocin-like substances inhibitrices (BLIS) ou des substances antimicrobiennes qui ne sont toujours pascomplètement caractérisées, et des bactériocines à ceux montrant une nature protéique et une actionbactéricide.

Pour une description plus précise d'une bactériocine, en plus de sa dénomination usuelle, lenom de la souche de producteur doit être ajouté (McCormick et Savage, 1983; Montville etWinkowski, 1997).


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1.5. Classification

Il existe plusieurs classifications. La première a été fondée sur les spectres d’action(Klaenhammer, 1988). Les connaissances acquises ont permis de créer une classification reposantsur les structures et les mécanismes d’action des bactériocines (Klaenhammer, 1993).

Cette dernière a été modifiée par l’ajout de sous-classes et est actuellement utilisée (Nes etal., 1996; Diop et al., 2008). Cette classification se décompose en quatre classes distinctes:

- Classe I: il s’agit de peptides de taille réduite (< 5 kDa) contenant des acides aminesinhabituels obtenus par modifications post-traductionnelles. L’un de ces acides aminescaractéristiques est la lanthionine; c’est pourquoi les bactériocines appartenant à la classe I sontappelées lantibiotiques pour “lanthionine containing antibiotics”.

La nisine est la bactériocine de la classe I la plus étudiée. La structure de ces bactériocinesdiffère selon la localisation des ponts établis entre les acides aminés inhabituels (Tossi et al., 2002).

Il existe deux types de lantibiotiques selon leur structure. Les lantibiotiques de type Aregroupent les peptides linéaires, comme la nisine A, qui forme des pores dans la membrane de lacellule cible (Buchman et al., 1988).

Les lantibiotiques de type B regroupent les bactériocines globulaires, dont la plus connueest la mersacidine. Le mécanisme d’action de cette bactériocine, tout comme celui de la nisine, estfondé sur la liaison avec le lipide II, non pour former un pore, mais pour inhiber la synthèse de laparoi, notamment la transpeptidation, ou de certaines phospholipases (Hsu et al., 2003).

Certains lantibiotiques n’appartiennent ni au type A ni au type B, comme la mutacine II(Woodruff et al., 1998). C’est un peptide de petite taille (3245 Da) qui contient une β-méthyllanthionine ainsi que deux lanthionines en plus d’un acide aminé didéshydrogéné.

Ce lantiobiotique, de par sa petite taille, ne peut pas former de pore au sein de la bicouchelipidique de la cellule cible (Chikindas et al., 1995a). Ces peptides antibactériens agissent sur lepotentiel de membrane (ΔΨ) ainsi que sur le gradient de pH (ΔpH).

De plus, ce peptide inhibe partiellement le transport de certains acides aminés (2-α-aminoisobutyrate et glutamate). Enfin, la mutacine II provoque la disparition du pool intracellulaireen ATP en inhibant l’ATP synthétase (Chikindas et al., 1995a).

Des lantibiotiques à deux composants, comme la plantaricine W (α et β) (Holo et al., 2001)ou la lacticine 3147 (A1 et A2) (Dougherty et al., 1998), ont été mis en évidence augmentant ainsila complexité de cette classification.


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- Classe II: cette classe regroupe les petites bactériocines (<10 kDa) thermostables et nesubissant pas de modification post-traductionnelle; cependant elles sont généralement synthétiséessous forme d’un prépeptide qui sera maturé lors de son excrétion dans le milieu extracellulaire.

Le site du clivage protéolytique du peptide leader s’effectue généralement au niveau d’undoublet de glycine. Le mécanisme d’action de ces bactériocines est principalement fondé sur laperméabilisation de la membrane de la cellule cible.

Les bactériocines peuvent interagir avec cette dernière. En effet, ces peptides sonthydrophobes, cationiques et adoptent une structure secondaire en hélice α en milieu apolaire(Fregeau Gallagher et al., 1997; Wang et al., 1999; Sprules et al., 2004a).

Cette catégorie contient plus de 50 bactériocines; avec l’acquisition de nouvellesconnaissances, trois sous-classes ont été introduites:

- Sous-classe IIa ou «pediocin-like»: les bactériocines de cette sous-classe ressemblentd’un point de vue structural à la pédiocine qui fut la première bactériocine de ce groupe à êtredécrite.

Ces bactériocines ont deux particularités, la première est la présence d’une séquence N-terminale conservée YYGNGVCCVWGAI (Ennahar et al., 2000b), la deuxième est la présenced’une activité anti-Listeria sp.

Les carnobactériocines BM1 et B2 font partie de cette sous-classe (Quadri et al., 1994)ainsi que la mésentéricine Y105 (ou mésentérocine 52A) (Héchard et al., 1992; Revol-Junelles etal., 1996b).

- Sous-classe IIb: ce groupe correspond à des bactériocines possédant deux composants.L’activité optimale dépend de l’action conjuguée des deux peptides. Ils peuvent être actifsindividuellement mais une synergie d’action est observée lorsqu’ils sont associés, comme parexemple pour l’entérocine L50A/L50B (Cintas et al., 1998).

Ces peptides peuvent également être inactifs individuellement ; seul un mélange des deuxcomposants permet d’observer une activité antibactérienne, comme c’est le cas pour la plantaricineJK (Diep et al., 1996).

- Sous-classe IIc: cette catégorie était initialement réservée aux bactériocines activées parréduction de groupements thiols (“Thiol-activated”) (Klaenhammer, 1993), comme la lactococcineB (Venema et al., 1993). Cependant, la réduction d’un groupement thiol ne semble pasindispensable à son activité antibactérienne.

D’autres auteurs (Nes et al., 1996) ont proposé de dédier cette sous-classe auxbactériocines de la classe II excrétées par le système général d’excrétion (le système sec), car lesautres bactériocines de la classe II sont excrétées par des systèmes spécifiques type ABC “ATPBinding Cassette”.


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Deux exemples ont été décrits, l’acidocine B (Leer et al., 1995) et la divergicine A(Worobo et al., 1995). Cependant, des bactériocines de la sous-classe IIa, sécrétées par le systèmesec, ont été décrites, comme l’entérocine P (Cintas et al., 1998). Ces découvertes remettent enquestion l’existence de cette sous-classe.

Finalement, la sous-classe IIc regroupe les bactériocines de la classe II ne pouvant pas êtreclassés ni dans la sous-classe IIa ni dans la IIb (Héchard et al., 2002). La mésentérocine 52B(mésentéricine B105) en fait partie (Revol-Junelles et al., 1996b; Héchard et al., 1999).

Récemment une bactériocine circulaire de 60 résidus d’acides aminés a été découverte. Ils’agit de la carnocycline A produite par Cr. maltaromaticum UAL307 (Martin-Visscher et al.,2008b).

Des bactériocines présentant cette spécificité structurale ont déjà été décrites comme lagassericine A, la circularine A (Kemperman et al., 2003; Kawai et al., 2004) et l’entérocine AS-48(Maqueda et al., 2008).

Dans ce travail, des souches appartenant aux genres Carnobacterium et Leuconostoc ontété utilisées. Ces deux genres bactériens produisent de nombreuses bactériocines appartenant auxdifférentes classes citées précédemment.

- Classe III: cette classe regroupe les bactériocines de haut poids moléculaire (> 30 kDa)qui possèdent une activité antimicrobienne. Ces protéines, contrairement aux peptides de la classeII, ne sont pas thermostables.

L’entérolysine A, synthétisée par En. faecalis, appartient à cette classe et présente uneactivité anti-Listeria sp. (Nilsen et al., 2003; Nigutova et al., 2008).

Cette protéine possède dans sa région N-terminale une activité « endopeptidase-like ». Deplus, sa région C-terminale est similaire au gène de lyse de bactériophages (A2, T4). Une délétiondes 58 derniers résidus d’acides aminés entraîne une perte totale de son activité.

Le mécanisme d’action de cette bactériocine repose sur une activité muralytiquepermettant la dégradation de la paroi de la cellule cible (Nilsen et al., 2003).

- Classe IV: cette dernière classe regroupe les protéines couplées à une partie nonprotéique (lipide, oligosaccharide). Cette classe est très peu représentée voire éliminée (Drider etal., 2006). Ln. paramesenteroides OX produit une molécule antimicrobienne, la leucocine S,appartenant à cette classe.

Cette protéine de haut poids moléculaire, thermosensible, perd totalement son activité vis-à-vis de Lb. sakei en présence d’α- amylase, enzyme dégradant les glucides complexes. Unprétraitement de la souche cible avec cette même enzyme n’affecte pas l’activité de la leucocineS.


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Par conséquent, l’α-amylase agit directement sur la bactériocine et non sur un récepteurpotentiel présent sur la souche sensible (Lewus et al., 1992). Sa nature glycoprotéique a étéconfirmée lors d’une SDS-PAGE suivie d’une coloration au bleu Alcian.

Face à la complexité et à l’hétérogénéité de cette classification, certains auteurs ontproposé d’établir des classifications selon le genre producteur ; une classification pour lesbactériocines produites par le genre Enterococcus est ainsi disponible (Franz et al., 2007).

2. Eléments génétiques du locus

La localisation des gènes de bactériocines de la classe II peut être chromosomique, commedans le cas de la carnobactériocine BM1 (Quadri et al., 1994) ou plasmidique comme pour lacarnobactériocine Cbn B2 et la mésentéricine Y105 (Héchard et al., 1992).

Les gènes impliqués dans la production des bactériocines sont généralement organisés sousforme d’opéron. Les gènes de structure et le gène d’immunité sont généralement co-transcrits saufquand ces derniers sont disjoints, comme dans le système carnobactériocine A (Franz et al., 2000).

Les éléments nécessaires au transport de la bactériocine sont généralement trouvés sur unautre locus. De plus, un troisième locus peut être identifié. Ce dernier code un système detransduction du signal (Tab. 10).

Ce système à deux ou trois composants permet l’induction de la production du peptideantimicrobien (Ennahar et al., 2000b; Diep et al., 2002; Eijsink et al., 2002). Dans de nombreuxloci de bactériocines de la classe II, la présence de gènes de régulation a pu être mise en évidence(Eijsink et al., 2002).

3. La production des bactériocines

Toutes les bactériocines sont produites par voie ribosomale dans le cytoplasme de lacellule productrice. Elles sont toujours synthétisées sous forme d’une molécule très peu active.

Le peptide « signal » ou « leader », présent dans cette molécule, permet la sécrétion de labactériocine dans le milieu extérieur (Jasniewski, 2008).

3.1. Sécrétion des bactériocines

Les bactériocines de la sous-classe IIa, comme toutes les bactériocines, sont synthétiséessous forme d’un précurseur appelé prébactériocine ou préprobactériocine pour les lantibiotiques.

Ce prépeptide est maturé pendant ou immédiatement après sa sécrétion dans le milieuextracellulaire. Par conséquent, c’est la prébactériocine qui est reconnue par le transporteur


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Généralement, les bactériocines de la classe II, produites par des bactéries lactiques, sontexcrétées par un transporteur spécifique dit de type I. Il existe quelques bactériocines sécrétées parle système général de sécrétion sec (dit de type II), qui n’est pas spécifique aux bactériocines.

Les éléments nécessaires au transporteur de type II sont codés par des gènes situés dansl’opéron commun avec le gène de la bactériocine. Il est cependant possible que les gènes dutransporteur se situent dans un opéron adjacent.

Pour résumer, deux à trois partenaires sont impliqués dans la sécrétion de la bactériocine :le peptide leader, le transporteur (de type ABC ATP Binding Cassette ou du système général desécrétion sec) et éventuellement un facteur accessoire associé à ce transporteur (Jasniewski, 2008).

Tableau 10 : Exemples de localisation des gènes producteurs de bactériocines chez certaines bactéries d’altération technologique (Jasniewski, 2008).

Souches productrices Bactériocines (classe) GènesTaille

prébactériocine/bactériocine

Localisationdes gènes

Numérod’assession Références

Cr.maltaromaticum Carnobactériocine A(IIc)

CarnobactériocineBM1 (IIa)

Carnobactériocine B2(IIa)

cbnA

cbnBM1

cbnB2

71/53

61/43

66/48

Plasmide

Chromosome

Plasmide

P38578

P38579

P38580

Worobo et al., 1994

Cr. divergens Divercine V41 (IIa) dvn41 66/43 Chromosome CAA11804 Metivier et al., 1998

Pc. acidilactici Pédiocine PA-1 (IIa) pedA 62/44 Plasmide P29430 Marugg et al., 1992

Ln.mesenteroides Mésentéricine Y105(IIa)

mesY 2 61/37 Plasmide P38577 Héchard et al., 1992

En. faecium Entérocine P (IIa) entP 7 71/44 Chromosome AAC45870 Cintas et al., 1998

Lb. curvatus Sakacine P (IIa) sppA 61/43 Chromosome AAY44078 Cocolin et Rantsiou, 2007


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- Le peptide leader

Le peptide leader est indispensable pour la sécrétion de la bactériocine ; de plus, l’activitéréduite du précurseur protège la bactérie contre l’action de sa propre bactériocine (Nes et al., 1996).

Pour les lantibiotiques, le peptide leader pourrait être impliqué dans la maturation desprobactériocines en leur conférant une conformation propice afin de faciliter la création des acidesaminés rares.

Toutefois, les peptides leaders ne sont jamais modifiés même lorsqu’ils possèdent desrésidus sérine et thréonine (Weil et al., 1990). Le peptide leader est clivé pendant ouimmédiatement après la sécrétion, ce qui permet la libération de la bactériocine active dans lemilieu extracellulaire.

Il existe deux grandes familles de peptides leaders, le type « FNLDV »(phénylalanineasparagine-leucine-aspartate-valine) rencontré chez certaines bactériocines de laclasse I, dont la nisine, et le type « GG » (pour double glycine) commun aux bactériocines de laclasse II et à certains lantibiotiques.

L’étape de protéolyse est réalisée par une protéase spécifique pour les peptides leaders detype « FNLDV » ou directement par le transporteur ABC pour les peptides leaders de type « GG ».

Les peptides leaders de type « FNLDV » sont généralement hydrophiles. Des résiduschargés sont fortement conservés dans la séquence consensus, comme l’aspartate (McAuliffe et al.,2001).

- Transporteur de type ABC

Le gène de structure code une prébactériocine; celle-ci est reconnue par un transporteur;spécifique formé grâce aux produits de deux gènes. Le premier code un transporteur ABC, ledeuxième un facteur accessoire.

Les bactériocines, quelle que soit leur classe d’appartenance, sont généralement secrétéespar des transporteurs de type ABC (McAuliffe et al., 2001). Ce transport actif permet de lessecréter dans le milieu extérieur via l’hydrolyse d’ATP (Fig. 02).

Ces transporteurs sont composés de quatre sous-unités identiques deux à deux. Concernantle transporteur des bactériocines de la classe II, il peut parfois être accompagné de un ou de deuxfacteurs accessoires, quelquefois appelés MFP pour «Membrane Fusion Protein». La fonctionexacte de la MFP reste encore à déterminer (McAuliffe et al., 2001).


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Figure 02 : Systèmes de transport et de maturation des prébactériocines de bactéries lactiques (Wandersman,1998)

(A): avec un peptide leader de type « GG »; (B): avec un peptide leader de type « FNLDV »Pase: peptidase clivant le peptide leader.

- Transport par le système général de sécrétion

Certaines bactériocines, appartenant à la classe II, notamment la divergicine A (Worobo etal., 1995), l’acidocine B (Leer et al., 1995) ou l’entérocine P (Cintas et al., 1997) sont sécrétées viale système général de sécrétion (Secretion system complex, Sec).

La translocase consiste en SecYEG, composé de protéines formant un pore de transport(jaune), complexé avec l’ATPase SecA (rouge), fournissant l’énergie. SecYEG peut s’associer avecle groupe auxiliaire de protéines SecDFYajC et YidC (vert). SecA, SecY et SecDFYajC sontconnus pour former des oligomères, mais leurs états oligomériques dans l’holoenzyme n'ont pasencore été déterminés (Fig. 03).

Lors du processus de sécrétion, les pré-protéines (ligne orange épaisse) à sécréter sontsynthétisées avec un peptide signal (rectangle orange). Deux voies sont possibles (phase 1): dans lapremière, les pré-protéines en cours de biosynthèse par le ribosome sont acheminées sur latranslocase, via le SRP (bleu) (signal recognition particle) lié au ribosome; il s’agit alors detranslocation co-traductionnelle (Wandersman, 1998; Xie et al., 2008; Jasniewski, 2008).

Ceci se produit généralement pour des protéines membranaires ou comportant un peptidesignal très hydrophobe. Dans la deuxième voie, l’acheminement vers la translocase peut se dérouleraprès la traduction quasi complète de la protéine ; il s’agit dans ce cas de translocation co- ou post-traductionnelle.


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Dans cette voie, SecB, une protéine chaperone tétramérique (rose) prend en charge laprotéine à sécréter. Cette voie est empruntée par les protéines devant êtresécrétées. FtsY (rose) etSecA agissent respectivement comme des récepteurs pour SRP et SecB (Wandersman, 1998; Xieet al., 2008; Jasniewski, 2008).

Les deux itinéraires fusionnent ensuite au niveau de SecYEG/FtsY ou du complexe avecSecYEG/SecA (étape 1). Certaines pré-protéines acheminées par SRP vers SecYEG sont troppolaires ; dans ce cas, SecA est également recrutée. Par souci de simplicité, SecYEG est présentésans sous-unité auxiliaire. Les pré-protéines sont transférées par SecYEG (phase 2).

Elles sont structurées lors de la traversée de la membrane cytoplasmique via SecYEG ousont directement intégrées dans la bicouche lipidique après le clivage du peptide signal par lepeptide signal peptidase (SPase I; magenta) (phase 3).

Le clivage du peptide signal des lipoprotéines nécessite une autre peptidase, SPase II (nonmontré).

L’énergie du système est fournie par la fixation d’ATP sur SecA qui présente une activitéATPase et par la force protomotrice (ΔΨ et ΔpH) dont les composants ne figurent pas sur le schéma(Wandersman, 1998; Xie et al., 2008; Jasniewski, 2008).

Figure 03: Schéma simplifié du système général de sécrétion Sec (Xie et Dalbey, 2008)


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3.2. Régulation de l’expression

L’induction de la production repose sur un mécanisme d’évaluation de la densité de lapopulation productrice ou « quorum-sensing », la molécule inductrice étant soit unpeptidephéromone soit la bactériocine elle-même.

Ce phénomène a été mis en évidence chez Cr. maltaromaticum (Gursky et al., 2006;Rohde et al., 2006; van Belkum et al., 2007) et chez En. faecium (Cotter et al., 2005).

Les carnobactériocines BM1 (Cbn BM1) et B2 (Cbn B2) sont produites respectivement àpartir du chromosome bactérien et du plasmide pCP40. Après l’étape de traduction, les deuxprébactériocines sont sécrétées par un même transporteur ABC, CbnT associé à CbnD (Rohde etal., 2006; Jasniewski, 2008).

Les deux prébactériocines sont maturées lors du transport réalisé par ce complexe et lepeptide signal (CbnS) est clivé. Les deux carnobactériocines alors actives, présentes dans le milieuextérieur, peuvent se fixer sur un « senseur », la protéine kinase CbnK. Le peptide signal présentdans le cytoplasme peut également interagir avec ce « senseur ».

Les protéines kinases, activées par les bactériocines ou le peptide signal, recrutent etphosphorylent la protéine régulatrice CbnR. Cette dernière, étant phosphorylée, peut se fixer sur lesopérateurs des opérons et recruter l’ARN polymérase pour augmenter l’expression des gènes codantces bactériocines (Rohde et al., 2006; Jasniewski, 2008).

Bien qu’il existe des bactériocines de la classe II qui ont une activité de phéromone, laprésence d’un peptide d’induction est très fréquente. Ce peptide présente des caractéristiquesphysico-chimiques très proches de celles des bactériocines. Il peut agir à des concentrations trèsfaibles, de l’ordre de 10-17 μM (Cotter et al., 2005).

Dans le cas de l’entérocine A, produite par En. faecium (O'Keeffe et al., 1999), labactériocine ne joue pas le rôle de la phéromone. La production de l’entérocine A implique unsystème à trois composantes (Cotter et al., 2005).

Le gène codant la bactériocine (entérocine A, EntA) et celui codant le facteur d’induction(entérocine F, EntF) sont co-transcrits à partir du promoteur Pent. Ces deux protéines sont alorstransportées par un transporteur putatif de type ABC (EntT) couplé à une protéine accessoire (EntD)(Fig. 04).

Comme pour les autres bactériocines, les deux autres composantes du système sont unehistidine kinase fixée dans la membrane (EntK) qui détecte le peptide inducteur extracellulaire(EntF) et une protéine régulatrice intracytoplasmique (EntR) (Rohde et al., 2006; Jasniewski,2008).

La transduction du signal est réalisée par la phosphorylation d’EntR par EntK. Une foisphosphorylée, EntR active le promoteur Pent permettant ainsi d’augmenter l’expression de l’opéronde l’entérocine A.


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Chez Lb. plantarum C11, la plantaricine A induit sa propre production ainsi que celle dedeux autres bactériocines, les plantaricines EF et JK (Diep et al., 1996). L’inducteur est toujoursreconnu par un système composé de deux entités, une histidine kinase membranaire et un régulateurde la réponse cytoplasmique (Cotter et al., 2005).

Généralement, l’inducteur est un peptide spécifique ce dernier n’est pas modifié et estsynthétisé sous la forme d’un prépeptide avec un peptide leader contenant le motif «GG». Lepeptide-phéromone est maturé puis sécrété par le même transporteur que celui de labactériocine dumême locus. Outre la plantaricine A, les peptides-phéromones sont dépourvus d’activitéantibactérienne (Rohde et al., 2006; Jasniewski, 2008).

Figure 04: Exemple de « quorum-sensing » chez Carnobacterium maltaromaticum (Rohde et Quadri, 2006)

3. 3. Immunité

Le mécanisme d’action des protéines d’immunité des bactériocines de la classe II n’est pasencore entièrement élucidé. Il existe peu d’informations sur ce sujet. Cependant, il semble que lesprotéines d’immunité des bactériocines de la sous-classe IIa soient essentiellement cytoplasmiques(Eijsink et al., 2002), tandis que celles des bactériocines de la sous-classe IIb pourraient êtrelocalisées dans la membrane plasmique grâce à des segments transmembranaires (Allison et al.,1996; Cintas et al., 2001).

La protéine d’immunité MesH d’une bactériocine de la sous-classe IIc, la mésentéricineB105, présente des segments transmembranaires. Cette localisation membranaire suggère uneinteraction directe entre la bactériocine et sa protéine d’immunité, mais aucun résultat expérimentalne le prouve.


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Les structures tridimensionnelles de la carnobactériocine B2 et de sa protéine d’immunité(ImB2) ont été élucidées par RMN (Sprules et al., 2004a; Sprules et al., 2004b). Aucuneinteraction directe n’a pu être révélée entre ces deux structures par modélisation moléculaire.

L’établissement d’un pont salin entre la carnobactériocine B2 (Glu24) et sa protéined’immunité (Arg95) a été mis en évidence par simulations dynamiques moléculaires dans unenvironnement lipidique pour la bactériocine et un environnement aqueux pour la protéined’immunité (Soliman et al., 2007).

A l’interface, la carnobactériocine B2 attire la protéine d’immunité ImB2 au sein de labicouche via l’établissement de liaisons ioniques. Cependant, la protéine d’immunité ne peut paspénétrer seule dans la membrane cytoplasmique afin de prévenir l’action de la bactériocine.

La structure de la protéine d’immunité PisI a été déterminée par résonance magnétiquenucléaire (Martin-Visscher et al., 2008a). Cette protéine de 98 acides aminés a une structureglobulaire en milieu aqueux et présente quatre hélices α anti-parallèles.

Comparativement aux protéines d’immunité déjà connues (ImB2 et EntA-im), PisI est plusgrande et possède une partie N-terminale plus flexible et une partie C-terminale plus courte. Danscette étude, aucune interaction directe entre la protéine d’immunité PisI et sa bactériocine(piscicoline 126) n’a été mise en évidence.

Le mécanisme de l’immunité contre la lactococcine a mettrait en jeu un récepteurindispensable pour l’activité de cette bactériocine. La protéine d’immunité LciA interagirait avec cerécepteur et inhiberait ainsi l’action toxique de la lactococcine (Venema et al., 1994).

Dans certains cas, les protéines d’immunité n’interagissent pas directement avec leurbactériocine mais probablement via un récepteur de cette dernière (Dalet et al., 2000; Dalet et al.,2001).

Cependant, le mécanisme de l’immunité est loin d’être interprété dans sa globalité. Uneétude comparative des protéines d’immunité des bactériocines de la sous-classe IIa a été réalisée(Fimland et al., 2002a).

La fonctionnalité de la protéine d’immunité est souche-dépendante. Certaines de cesprotéines expriment une forte spécificité d’immunité tandis que d’autres permettent une immunitécroisée contre d’autres bactériocines de la sous-classe IIa.

Ces résultats suggèrent également que le degré d’interaction, direct ou indirect, entre laprotéine d’immunité et la bactériocine dépend de la partie C-terminale du peptide, or c’est cettepartie qui serait responsable de la spécificité de la bactériocine (Fimland et al., 1996).

Tous ces résultats contradictoires tendent à prouver la grande complexité du mécanismed’immunité ; ce dernier serait variable en fonction de la souche productrice et du couplebactériocine/protéine d’immunité mis en jeu.


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4. Spectre d’activité

Les bactériocines des bactéries lactiques exercent leur activité létale uniquement sur lesbactéries à Gram positif en provoquant ou non leur lyse cellulaire. Le spectre d’activité estgénéralement plus large que celui des colicines produites principalement par des souches d’E. coli(Cascales et al., 2007) ou des microcines produites essentiellement par la famille desEnterobacteriaceae. Le spectre d’activité des bactériocines de la sous-classe IIa est variable. Il estplus ou moins large mais touche essentiellement des bactéries phylogénétiquement proches de lasouche productrice (Duquesne et al., 2007).

Dans tous les cas, le genre Listeria est inhibé. Il comprend également des bactérieslactiques et d’autres bactéries à Gram positif, en particulier des espèces pathogènes ou indésirablescomme S. aureus, Clostridium sp., Bacillus sp., et Micrococcus sp., par exemple, lescarnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2, ainsi mésentérocine 52A. Les bactériocines des autresclasses sont généralement connues pour posséder un spectre d’activité étroit, limité à la mêmeespèce ou à des bactéries phylogénétiquement proches de la souche productrice (Alomar, 2007;Izquierdo, 2009; Makhloufi, 2012).

L’inhibition du genre Listeria n’est pas exclusive aux bactériocines de la sous-classe IIa.En effet, certains peptides ont un spectre d’inhibition large avec une forte activité antagonisteenvers le genre Listeria, sans toutefois posséder la séquence consensus « YGNGV » dans leurrégion N-terminale, telles que la thermophiline (Marciset et al., 1997), l’entérocine B (Casaus etal., 1997), la curvaticine FS47 (Garver et al., 1994) ou la divergicine 750 (Holck et al., 1996).

Des bactériocines ayant des séquences proches peuvent présenter des spectres d’actiondifférents (Morency et al., 2001) ce qui laisse supposer une grande spécificité d’action ouderésistance. De plus, les concentrations minimales inhibitrices (CMI) varient considérablementd’une espèce bactérienne à l’autre et même entre souches appartenant à une même espèce(Meghrous et al., 1999; Ennahar et al., 2000a).

Il est à noter que les spectres d’inhibition des bactériocines sont le plus souvent établis àpartir de surnageants de cultures ou de préparations semi-purifiées. Ce résultat est donc représentatifde l’activité antibactérienne globale d’une souche et non de l’activité d’une seule bactériocine.C’est pour cette raison que lorsqu’une souche produit plusieurs bactériocines, l’interprétation duspectre d’inhibition est seulement possible si celui-ci est réalisé à partir de bactériocines purifiéesou synthétisées chimiquement (Parada et al., 2007; Siboukeur, 2011).

De plus, l’activité antibactérienne de la bactériocine est conditionnée par des facteursphysico-chimiques du milieu qui peuvent alors modifier le seuil de sensibilité des souches et ainsiaboutir à des spectres d’activité erronés (Meghrous et al., 1999; Ennahar et al., 2000a).

5. Caractéristiques de bactériocines

5.1. Structure protéique

Peu de travaux ont été effectués sur la structure physique de bactériocines; la nature desprotéines de bactériocines était déterminée par la dégradation par les enzymes protéolytiques et leur


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poids moléculaire a été déterminée par la diffusibilité à travers des membranes semi-perméables(Daw et Falkiner, 1993).

Ces méthodes se sont avérées utiles dans les bactériocines initiales, cationiques, neutres etanioniques dans la nature chimique, sont tous dans la fourchette de 1.9 (Actagardine) et 5.8(Lactococcine B) kDa de masse moléculaire (Oscáriz et Pisabarro, 2001).

Bien que par définition, toutes les bactériocines avez une protéine ou d'un composantpeptide qui est essentiel pour leur fonction bactéricide, certains ont été signalés sont descombinaisons de différentes protéines (Allison et al., 1994) ou sont des composés de protéines avecdes lipides ou moitiés de glucides (Lewus et al., 1992).

Différentes études ont montré que les bactériocines sont des molécules de protéines avecdes traces de glucides (moins de 1%) et le phosphore (moins de 0.1%) (Daw et Falkiner, 1993).

Les différences notables entre eux ont été reconnues pour être associés à la composition enacides aminés. Différentes séquences ou la composition de la Croix-des acides aminés ont ététrouvés parmi les molécules bactériocine variant d'une bactériocine à l'autre, même chez le mêmegroupe de bactériocines (Koebink et Braun, 1993).

Les colicines sont généralement de haute masse moléculaire (29 à 90 kDa) qui contiennentdes protéines indiquant la spécificité de fixation, translocation, ou de tuer l'activité (Pugsley,1984a).

La structure des lantibiotiques varie en fonction de la localisation de ponts établis entre lesacides aminés modifiés, ce qui permet de distinguer les types A (lantibiotiques linéaires) et B(lantibiotiques globulaires).

Le type A à une masse moléculaire inférieure à 4 kDa, ces bactériocines sontprincipalement synthétisées par Lactococcus, Lactobacillus, et Streptococcus (exemple: lesnisines).

Les lantibiotiques de type B sont des peptides de 1.8 à 2.1 kDa, ces molécules regroupentles duramycines, la mersacidine, l’actagardine, et la mutacine A (Parada et al., 2007; Lubelski etal., 2008; Jasniewski, 2008; Izquierdo, 2009; Rakshita, 2011).


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5. 2. Bacteriocinogenie et lysogénie

L'analogie entre bactériocine et la structure du bactériophage a été noté après la découvertede bactériocines (Daw et Falkiner, 1993). Les premières études menées par Gratia (1925) a établiles différences entre colicines et les bactériophages. Plus tard suite et à une enquête qui a établiecertaines connexions, en particulier entre ceux des bactériophages et colicines qui se fixent auxmêmes récepteurs (Mikkonen et al., 1994).

Les études ultrastructural ont montré une certaine analogie entre ces deux agentsbactéricides (Daw et Falkiner, 1993). Le phage a été composé de la tête et la queue polyédriquesavec étui contractiles et du noyau, ainsi que les fibres de queue. En comparaison, la figure (05)montre une ressemblance considérable de la queue du phage aux particules bactériocine.

La bactériocine semble être un phage sans tête. Fois des molécules de la bactériocine et laqueue du phage sont adsorbés par des récepteurs spécifiques de la paroi cellulaire et de tuer lesbactéries sensibles.

Dans certains cas, les récepteurs sont communes à certains des bactériocines et des queuesde phages, comme la colicine K et la queue du phage T6 ou la colicine E et phage BF23 (Ito et al.,1970).

Ces deux bactéries bactériocinogènes et les bactéries lysogènes sont à l'abri des agentsqu'ils produisent. Bacteriocinogenie et lysogénie sont les deux personnages potentiels et laproduction de bactériocines et des bactériophages est souvent favorisé par certains traitements, parexemple UV irridiation. Chaque phénomène, cependant était un processus létal pour la bactérie.

La similitude entre l'induction prophage et la synthèse bactériocine suggère qu'unmécanisme similaire est responsable de ces deux événements. De nombreux traitements quiinhibent la synthèse de l'ADN apporter induction prophage et aussi induire la synthèse debactériocines (Hardy, 1975; Boemare et al., 1992).

Les études initiales (Ito et Kageyama, 1970) mis en place les différences importantesentre les bactériocines et des bactériophages comme celui-ci est reproductible soi dans les bactériessensibles, tandis que le premier l'est pas.

Certaines études (Daw, 1989) a indiqué que les bactériophages, de dilution, feraitapparaître une diminution du nombre de plaques de phages discrets; une bactériocine, d'autre partmontrerait un amincissement diffus de la croissance devient moins marquée avec une dilutioncroissante du surnageant.


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En particulier, aucun cas n'a encore été trouvé de similitudes antigéniques entrebactériocines et les bactériophages. Même lorsque la souche bactérienne même lysogène etbactériocinogènes, pas de connexion entre les bactériocines et des bactériophages peut êtredémontrée (Daw et Falkiner, 1993).

Figure 05: Comparaison morphologique de bactériophage PS3 (a) et pyocine type –R (b) de Ps. aeruginosa. La queuede bactériophage est légèrement plus grande que la particule de bactériocine. Des dimensions sont montrées dans (a)

(Adapté de Daw, 1989)

6. Mode et mécanismes d’action

6.1. Quantification de l’activité antibactérienne

6. 1. 1. Détermination du titre en bactériocine

Le dosage des bactériocines présente plusieurs difficultés :

v La quantité de peptides (mg.ml-1) n’est proportionnelle à son activité que dans les mêmesconditions opératoires (pH, sels…) ; ainsi la majorité des auteurs expriment la quantité debactériocines en activité antimicrobienne vis-à-vis d’une souche cible (Unité Arbitraire.ml-1

ou UA.ml-1) plutôt qu’en concentration massique ou molaire;

v Les bactériocines sont produites dans des milieux complexes ce qui rend leur dosage parchromatographie (HPLC) difficile, une purification préalable étant nécessaire.

Plusieurs méthodes de dosage ont été proposées au cours de ces dernières années telles quel’utilisation de la conductance (Giraffa et al., 1990), de l’immunofluorescence (Bouksaim et al.,1998) ou du dosage du potassium (Mugochi et al., 2001; Parada et al., 2007; Jasniewski, 2008).

Cependant la méthode la plus utilisée reste celle dite des dilutions critiques (Mayr-Hasting et al., 1972). Celle-ci consiste à déterminer, contre une souche cible pré-établie, l’activitéantibactérienne de dilutions successives au demi de l’échantillon à tester.

Il existe deux méthodes microbiologiques pour déterminer l’activité, l’une en milieu solideet l’autre en milieu liquide. La première méthode en plaques de gélose, plus couramment utilisée,consiste à doser l’activité antibactérienne contre une souche cible en milieu gélosé par dépôt del’échantillon dans des puits (Schillinger et al., 1989) ou en gouttes à la surface (Fleming et al.,1975).


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Des droites de régression peuvent ensuite être construites à partir de ces résultats enmettant en relation les diamètres des zones d’inhibition de l’échantillon non dilué avec leslogarithmes des titres de l’activité antibactérienne vis-à-vis d’une souche cible (Jasniewski, 2008).

Les droites obtenues, log [bactériocines] en UA.ml-1 = f (diamètre) en mm, permettent dequantifier rapidement l’activité antibactérienne d’une suspension. Le titre de l’activitéantibactérienne, exprimé en UA.ml-1, est défini comme l’inverse de la dernière dilution donnant unezone d’inhibition du tapis bactérien (Jasniewski, 2008).

La seconde méthode en milieu liquide (Daba et al., 1991) consiste à doser l’activitéantibactérienne contre une souche cible par mélange d’une suspension de cette souche cible et del’échantillon à tester en cuves ou en microplaques.

Le titre de l’activité antibactérienne est défini comme la quantité nécessaire donnant uneinhibition de 50 % du micro-organisme cible par rapport à un témoin ensemencé dans les mêmesconditions, mais sans bactériocine. (Parada et al., 2007; Jasniewski, 2008).

La comparaison de ces deux méthodes, avec quatre bactériocines différentes, a permis demontrer que bien que la méthode en milieu liquide soit plus reproductible, la possibilité d’établirdes droites étalons à partir des diamètres d’inhibition obtenus en milieu gélosé est plus pratiquepour doser de nombreux échantillons (Parente et al., 1995).

De plus, la détermination d’une activité de type bactériocine en milieu gélosé, parutilisation d’une droite d’étalonnage, est plus précise et plus rapide que le dosage en milieu géloséen utilisant la méthode des dilutions critiques (Nunez et al., 1996).

6. .1. 2. Facteurs physico-chimiques influençant l’activité des bactériocines

Certains facteurs physico-chimiques peuvent modifier l’activité antibactérienne par actionsur la diffusion du peptide (en milieu solide) ou sur l’activité de la bactériocine (Tab. 11). Lesspectres d’inhibition sont, dans la plupart des cas, réalisés sur milieu solide par la méthode dited’antibiogramme (Jasniewski, 2008).

Cependant l’activité antibactérienne est limitée par la diffusion des bactériocines. Certainsauteurs ont mis en évidence plusieurs facteurs influençant cette diffusion : la concentration en agardans les milieux de détection est souvent diminuée pour permettre une meilleure diffusion; ainsi de15 g.l-1 initialement (Kaiser et Montville, 1993; Vignolo et al., 1995), elle est de 7 g.l-1 (Ariharaet al., 1996), voire de 6 g.l -1 (Coventry et al., 1996a).

La durée de diffusion à 4°C joue également un rôle important bien que non généralisable.Elle peut être d’une heure (Joosten et al., 1996), de 2 h (Parente et al., 1992), de 6 h (Huot et al.,1996), d’une nuit (Kaiser et al., 1993), de 18 h (Baker et al., 1996) ou être nulle (Vignolo et al.,1995; Arihara et al., 1996).

Le Tween 80 est aussi parfois ajouté au milieu gélosé (0.1 %, v/v) afin d’accroître ladiffusion de l’agent antibactérien (Joosten et al., 1996). L’influence de cinq facteurs (pH,inoculum, NaCl, agar et huile de soja) sur la diffusion de quatre bactériocines (sakacine A, sakacine


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B, pédiocine PA-1 et piscicoline 61) a été mesurée (Blom et al., 1997). Il s’est avéré que lesréponses étaient bactériocines dépendantes.

De plus, dans ce cas, il est délicat de définir si c’est la diffusion ou l’activité de labactériocine qui est modifiée. D’une manière générale, tous les éléments capables d’adsorber oud’agréger les bactériocines diminuent leur diffusion et donc leur efficacité (Liu et Hansen, 1990).

Le pH joue un rôle important dans l’activité des bactériocines de plusieurs manières. Ilmodifie la solubilité de la bactériocine: la nisine est quasi insoluble à pH neutre ou alcalin. De plus,le pH modifie la stabilité de la bactériocine, notamment lors d’un choc thermique (Liu et Hansen,1990).

Enfin, l’activité antibactérienne des « pediocin-like » est augmentée à une valeur de pHacide (inférieure ou égale à 5.0) comparativement à celle observée à pH 7.0 (Chen et al., 1997a;Chen et al., 1997b). En revanche, la bavaricine MN présente une activité optimale à un pH de 6,0(Kaiser et al., 1993).

D’une manière générale, les bactériocines de bactéries lactiques possèdent de nombreuxrésidus d’acides aminés chargés sur lesquels le pH du milieu peut avoir une grande incidence. Ceciexplique les différences d’activité observées en fonction de l’acidité (Gálvez et al., 2007;Jasniewski, 2008).

Différents facteurs modifient l’activité antibactérienne des bactériocines (Tab. 11). Il estcependant délicat de différencier les substances qui agissent sur la bactériocine de celles quiinterviennent sur la cellule cible. Il est cependant possible de déterminer plusieurs classes demolécules (Jasniewski, 2008).

Les cations divalents (Mg2+, Ca2+, Mn2+ et Ba2+) réduisent l’activité des bactériocines.L’hypothèse avancée pour expliquer ce phénomène est que ces cations s’associeraient à la paroi et àla membrane cytoplasmique anionique par des interactions électrostatiques et empêcheraient ainsi laprogression des bactériocines à travers la paroi, voire l’adsorption sur la membrane cytoplasmique(Crandall et al., 1998).

Les chélateurs comme le maltol, le maltol éthylique, le citrate, l’EDTA ou l’EGTAdéstabilisent la paroi et la membrane des bactéries cibles et facilitent ainsi l’action des bactériocines(Deegan et al., 2006; Parada et al., 2007).

L’utilisation de telles molécules ou de stress thermiques, avec des bactériocines debactéries lactiques, permet une action sur des bactéries à Gram négatif ainsi que sur des celluleseucaryotes comme les levures (Dielbandhoesing et al., 1998).

6. 2. Mode d’action

Le mode d’action des bactériocines est leur effet «macroscopique » sur une population debactéries cibles. Il est généralement admis que les bactériocines produites par des bactéries lactiquesagissent sur les cellules cibles en deux temps: adsorption de la bactériocine sur la surface cellulairesuivie d’un effet létal (Tagg et al., 1976; Bhunia et al., 1991).


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Après leur adsorption sur les bactéries sensibles, les bactériocines comme les antibiotiquespeuvent avoir trois types d’effets: (i) un effet bactériostatique, c'est-à-dire un ralentissement ou unarrêt de la croissance, sans mortalité cellulaire. Une reprise de croissance peut être observée danscertains cas après un certain temps de contact entre les bactéries et la bactériocine; (ii) un effetbactéricide ; une mort cellulaire est observée mais les bactéries gardent leur intégrité physique, caril n’y a pas de lyse; (iii) un effet bactériolytique; la mort des bactéries est principalement due à leurlyse (Houlihan et al., 2006; Jasniewski, 2008).

Tableau 11: Effets de certains composés chimiques sur l’activité des bactériocines (Jasniewski,2008).

BactériocinesFacteurs

RéférencesFavorables Défavorables

Bifidocine B, pH pH, NH4ClMgCl2, KCl, KI,

TRIS-HCl

Yildirim et al., 1999

Bovicine HC5 MgCl2, CaCl2 pH Houlihan et al., 2004Houlihan et al., 2006

Curvacine A pH, EDTA, NaCl,propyl-parabène

pH, lécithine,caséine, X2+

Gánzle et al., 1999

Nisine A/Z pH, EDTA, NaCl,propyl-parabènemaltol, EGTA

maltol éthyliquecitrate, phosphate,

activitéde l’eau (aw)

pH, lécithine,caséine, MgSO4,MgCl2, CaCl2,MnSO4, BaCl2

Gánzle et al., 1999Crandall et al., 1998Schved et al., 1996Cutter et al., 1995bCutter et al., 1995aHoulihan et al., 2004Houlihan et al., 2006Cerrutti et al., 2001

Pédiocine PA-1/AcHDTT,

pH pH, NaCl,KCl, NH4Cl,

MgCl2, TRIS-HCl,phosphate

Chikindas et al., 1993Bhunia et al., 1991

Sakacine P pH, EDTA, NaCl ,propyl-parabène

pH, lécithine,caséine, X2+

Gánzle et al., 1999

X2+ : cations divalents, DTT : dithiothréitol, EDTA : acide éthylènediamine-tétra-acétique,EGTA : acide éthylène glycol-bis,TRIS : 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol.


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L’effet observé pour une bactériocine donnée dépend souvent des conditionsexpérimentales, comme la concentration et la pureté du peptide, la souche cible, la populationcellulaire initiale ainsi que le milieu de culture. L’état physiologique des bactéries cibles joueégalement un rôle très important dans ce type d’étude (Martinez-Cuesta et al., 1997).

L’effet combiné de bactériocines a été peu étudié. Cependant, des effets synergiques ontété reportés entre la pédiocine AcH et la nisine (Hanlin et al., 1993), entre la curvaticine 13 et lanisine (Bouttefroy et al., 2000), entre la lactocine 705, l’entérocine CRL35 et la nisine (Vignolo etal., 2000).

Une synergie d’action a également été mise en évidence entre des bactériocines à deuxcomposants telles que les plantaricines JK et EF (Moll et al., 1999b). Une étude de combinaisonsde bactériocines de la classe I (nisine) et de la classe II (pédiocine AcH, lacticine 481, lactacine F etlactacine B) sur le genre Listeria a été réalisée (Mulet- Powell et al., 1998).

Les résultats de cette étude ont montré un effet synergique entre toutes les bactériocines,sauf avec la lacticine 481, et les trois autres peptides où un effet antagoniste a été obtenu. Enfin peud’études ont mis en évidence des synergies d’action entre des bactériocines produites par une mêmesouche mis à part entre les entérocines A et B produites par En. faecium T136 (Casaus et al., 1997)et entre les mésentérocines 52A et 52B produites par Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides FR52(Limonet et al., 2004b).

Dans ce dernier cas, les synergies d’action ont été étudiées en déterminant la fraction deconcentration inhibitrice (FIC, fractional inhibitory concentration). Cette technique permet dedéterminer si l’ajout d’un peptide antibactérien exerce une action synergique (FIC <1),additionnelle (FIC = 1) ou antagoniste (FIC >1) sur l’activité d’une autre bactériocine (Hall et al.,1983).

6. 3. Mécanisme d’action

Le mécanisme d’action des bactériocines est très largement étudié. Il est admis qu’il sedécompose en trois étapes. La première consiste en la fixation du peptide sur la membrane de lacellule cible. C’est durant cette étape que le peptide adopte sa conformation tridimensionnellepermettant l’expression de son activité (Parada et al., 2007; Jasniewski, 2008).

La seconde étape est l’insertion de la bactériocine dans la membrane cytoplasmique.Durant cette étape, plusieurs peptides antibactériens sont recrutés pour former un pore. La dernièreétape est la formation du pore.

Ce dernier conduit à des fuites de composés intracellulaires vitaux. Leur perte entraînedonc des effets néfastes pour la cellule, allant d’un simple ralentissement de la vitesse de croissancebactérienne à la mort cellulaire (Smaoui, 2010; Siboukeur, 2011; Makhloufi, 2012).


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6. 3 .1. Adsorption et structuration de la bactériocine

La fixation de la bactériocine sur la cellule cible constitue la première étape du mécanisme(Chen et al., 1997a) car le peptide est cationique et la membrane anionique. Des paramètresd’action du peptide antibactérien.

Cette interaction est de nature électrostatique du milieu, comme le pH, peuvent jouer surl’étape d’adsorption en modifiant les charges du peptide. La bactériocine en milieu polaire (aqueux)est totalement déstructurée (Watson et al., 2001; Sanchez-Barrena et al., 2003; Haugen et al.,2005).

Après l’adsorption, le peptide se stucture généralement en feuillet β anti-parallèle dans larégion N-terminale et en hélice α dans la région C-terminale. La spécificité d’action desbactériocines se situerait lors de cette première étape.

Plusieurs hypothèses ont été formulées: (i) il existerait un récepteur protéique qui seraitresponsable de la première interaction avec la cellule cible (Eijsink et al., 1998). Ce récepteurpermettrait la spécificité du peptide et faciliterait la formation du pore en augmentant la micro-concentration en bactériocine dans un espace donné.

Cette hypothèse provient d’une extrapolation du mécanisme d’action de peptidesantimicrobiens autres que les bactériocines produites par des bactéries lactiques. Cependant, pourles bactériocines de la sous-classe IIa, ce récepteur protéique serait une mannose perméase(Ramnath et al., 2000; Dalet et al., 2001; Gravesen et al., 2002b; Arous et al., 2004; Xue et al.,2005; Diep et al., 2007) ou un autre type de protéine membranaire (Duffes et al., 2000).

Il est à noter que ces deux hypothèses ne sont en aucune manière exclusives et qu’il estpossible que la spécificité d’action et l’activité soient dues à plusieurs de ces phénomènes.L’existence d’un récepteur a été mise en évidence grâce à un inhibiteur compétitif consistant en unfragment de bactériocine non active (Fimland et al., 1996).

Cette saturation de l’activité, due à priori à une compétition de fixation, met en avantl’hypothèse d’un récepteur spécifique. De plus, l’utilisation d’énantiomère (s) de la leucocine A neprésentant pas d’activité confirme cette hypothèse, bien qu’à concentration élevée en bactériocine,une activité non dépendante de la chiralité de la molécule ait été observée (Yan et al., 2000).

Ces résultats ne peuvent pas être généralisés. Plusieurs auteurs ont montré in vitro que laprésence d’une protéine membranaire n’était pas indispensable pour l’activité de la pédiocine PA-1(Chen et al., 1998), de la bavaricine MN (Kaiser et al., 1996), de la mésentéricine Y105 (Castanoet al., 2005), de la plantaricine A (Zhao et al., 2006) et de la nisine (van Kraaij et al., 1998; Mollet al., 1999a).

(ii) il existerait un récepteur lipidique, comprenant 25 têtes de phospholipides (Chen etal., 1997b), qui serait spécifique des bactériocines. Dans ce cas, la spécificité serait due à lacomposition de la membrane en phospholipides.


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Concernant les lantibiotiques de la classe I, comme la nisine ou la mésarcidine,l’interaction du peptide avec le lipide II a été démontrée (Wiedemann et al., 2001; Hsu et al.,2002; Breukink et al., 2003; Wiedemann et al., 2004; Christ et al., 2007).

La composition de la membrane en phospholipides joue un rôle important sur l’activité desbactériocines et notamment sur leur fixation, leur structuration et leur pénétration (Papo et Shai,2003).

En effet, la présence de phospholipides anioniques ou zwittérioniques dans la membranefacilite l’adsorption de la bactériocine, ce qui augmente son activité. Ceci a été démontré pour lamésentérocine 52A (Limonet et al., 2002; Limonet et al., 2004a), la pédiocine PA-1(Naghmouchi et al., 2007), le peptide AS-48 (Abriouel et al., 2001), la divergicine M35(Naghmouchi et al., 2006; Naghmouchi et al., 2007), la mundticine KS (Sakayori et al., 2003), laplantaricine (Zhao et al., 2006) et la nisine (Kramer et al., 2006).

6. 3. 2. Insertion de la bactériocine et formation de pores dans la cellule cible

Du fait de sa situation intermédiaire dans le mécanisme d’action, l’insertion du peptide estune étape difficile à isoler, donc à étudier. Plusieurs travaux ont cependant permis d’aboutir àcertaines conclusions:

(i) l’activité des bactériocines est souvent dépendante de la force protomotrice, commec’est le cas pour la pédiocine PA-1 dépendante des ΔΨ et ΔpH (Bruno et al., 1993; Chen et al.,1997b), la subtiline (Schuller et al., 1989), le peptide Pep5 (Kordel et al., 1988), la plantaricine C(Gonzalez et al., 1996) et la nisine (van Kraaij et al., 1998).

La force protomotrice ne semble pas indispensable dans d’autres cas, comme pourl’acidocine 8912 (Tahara et al., 1996), la lacticine F (Abee et al., 1994) ou la lactoccocine B(Venema et al., 1993).

(ii) la fluorescence d’un résidu tryptophane situé à l’extrémité de la région C-terminale, apermis de montrer que la nisine, la pédiocine PA-1 et la mésentérocine Y105 pénètrent dans lamembrane cytoplasmique (Fimland et al., 2002b; Castano et al., 2005).

La fluorescence de deux résidus tryptophane (W18 et W33) au sein d’une mêmebactériocine, la pédiocine PA-1, indique que l’un des résidus s’insère en profondeur dans lamembrane et que l’autre reste en surface (Chen et al., 1998).

Dans le cas de la mésentéricine Y105, la bactériocine ne s’insère que partiellement dans unliposome (Castano et al., 2005). Il a été montré, par méthode enzymatique et par synthèse deliposome, que la partie C-terminale de la nisine traverse la membrane pour être en contact avec lemilieu intracellulaire (van Kraaij et al., 1998).

(iii) la formation de pores dans la membrane n’est pas due à l’action d’un peptide seul. Ilexiste donc un regroupement de bactériocines dans la membrane afin de permettre la formation d’unpore (Huang, 2006).


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Trois modèles ont été établis, notamment pour la nisine : le modèle « Barrel-stave » ou endouves de tonneau (Abee, 1995; Bechinger, 1999; Shai, 1999; Brogden, 2005) et le modèle «Carpet » ou en tapis formant un pore de type « Toroidal » ou coin de serrage (Brogden, 2005)décliné en modèle « Wormhole » ou trou de ver pour les bactéries à Gram négatif (Shai, 1999;Brogden, 2005).

Le premier modèle « Barrel-stave » décrit la formation de pores ou de canauxtransmembranaires dans la membrane par assemblage des hélices α. Cette organisation se déroulede telle sorte que les parties hydrophobes des peptides interagissent avec la partie apolaire de lamembrane et que leurs parties hydrophiles soient orientées vers l’extérieur pour former un poreaqueux (Shai, 1999; Brogden, 2005).

Ce mécanisme peut se décomposer en quatre étapes (Shai, 1999): (i) les bactériocinescationiques s’adsorbent sur les têtes de phospholipides chargées négativement et se structurent enhélices α; (ii) les bactériocines se reconnaissent entre elles et s’auto-assemblent; (iii) les structureshélicoïdales hydrophobes s’insèrent dans la membrane et forment un pore; (iv) de nouvellesmolécules de bactériocines sont recrutées progressivement pour augmenter la taille du pore.

Le deuxième modèle « Carpet » décrit un mécanisme d’action où les molécules debactériocines sont toujours en contact avec les têtes de phospholipides durant la perméabilisation dela membrane. Selon ce modèle, les peptides A B C s’adsorbent sur la membrane de la cellule cibleet la recouvrent pour former un tapis (Shai, 1999; Brogden, 2005).

La formation de pores se déroule uniquement si les bactériocines sont présentes localementen grande quantité. Dans ce cas, l’action des bactériocines est possible si la membrane de la cellulecible est complètement recouverte par des peptides ou si des micro-tapis de bactériocines se formentlocalement sur la bicouche lipidique (Jasniewski, 2008).

Dans le modèle « Carpet », contrairement au modèle « Barrel-stave », les molécules debactériocines ne s’insèrent pas dans le feuillet hydrophobe de la membrane et elles n’interagissentpas entre elles au niveau de leur partie hydrophile.

De ce fait, un peptide qui obéit à ce modèle ne doit pas nécessairement adopter unestructure spécifique pour pouvoir interagir avec la membrane car les interactions entre cette dernièreet les bactériocines sont électrostatiques (Jasniewski, 2008).

Le mécanisme peut se décomposer en quatre étapes (Shai, 1999): (i) les bactériocinescationiques s’adsorbent sur les têtes de phospholipides chargées négativement; (ii) les bactériociness’alignent sur la surface de la membrane pour que leur partie hydrophile soit en contact avec lapartie polaire des phospholipides ou avec des molécules d’eau à l’interface; (iii) la rotation despeptides conduit à la réorientation des résidus hydrophobes vers la partie apolaire de lamembrane.

La quatrième étape peut aboutir à la formation d’un pore adoptant une structure « Toroidal» ou bien la courbure de la membrane provoquée par la réorientation des bactériocines aboutit à unedésintégration de la membrane suivant le modèle «Wormhole» (Jasniewski, 2008).


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Cette dernière option est probablement rencontrée lors de l’action des peptidesantibactériens sur des bactéries à Gram négatif. En effet, les pores formés permettent le passage desbactériocines à travers la membrane externe pour qu’elles puissent agir sur la membranecytoplasmique via le même mécanisme (Brogden, 2005).

Figure 06: Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II selon (Chatterjee et al., 2005a)


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6. 3. 3. Les conséquences de la présence de pores

Les conséquences immédiates de la formation de pores sont des fuites de composésintracellulaires aboutissant à une dépolarisation de la membrane cytoplasmique, à undysfonctionnement enzymatique, puis à la mort cellulaire.

Les conséquences physiologiques dues à l’action de diverses bactériocines peuvent êtreclassées en plusieurs groupes:

(i) fuites de composants intervenant dans la création de la force protomotrice. Les fuitesd’ions, et particulièrement de protons et de potassium, impliquent une modification de la forceprotomotrice (FPM) ou au moins de l’un de ces composants selon la nature de la fuite (Jasniewski,2008).

Cette diminution de la FPM a pour conséquence un dysfonctionnement de certainesenzymes membranaires FPM-dépendantes. C’est le cas du système phosphotransférase (PTS) sousl’action de la pédiocine JD (Christensen et al., 1992), de la leucocine S, et de la nisine (Waite etal., 1998a), du transport actif de certains acides aminés tels que le glutamate, la lysine et la leucinesous l’action de la mésentéricine Y105 (Maftah et al., 1993) et de l’acidocine 8912 (Tahara et al.,1996).

(ii) baisse de la concentration en ATP. Elle a été mentionnée lors de l’action de plusieursbactériocines, comme la pédiocine PA-1, la piscicocine CS526, la nisine, la pédiocine JD, laleucocine S (Waite et al., 1998a), la lactostrepcine et l’entérocine P.

Cependant, cette baisse peut être imputée dans certains cas à une fuite d’ATP (Zajdel etal., 1985) ou comme c’est le cas avec la nisine, à une déficience en phosphate inorganique due à desfuites, ou à un dysfonctionnement de la synthèse d’ATP, en raison de la chute de la FPM; (iii) fuitesde composés intracellulaires.

Dans plusieurs cas, des fuites d’acides aminés et/ou d’intermédiaires de la glycolyse,comme le phosphoénolpyruvate, ont été détectées. Ce phénomène provoque un dysfonctionnementde l’organisme cellulaire par carence en métabolites indispensables se traduisant par une diminutionvoire un arrêt des synthèses (ADN, ARN, protéines, lipides, et polysaccharides).

La spécificité des pores vis-à-vis de certains composés a également été étudiée etparticulièrement chez les souches produisant deux bactériocines. Ainsi, il s’est avéré qu’il existeune complémentarité de fuites dues aux bactériocines. En effet, les plantaricines EF et JK (sous-classe IIb) provoquent respectivement des fuites d’anions et de cations (Moll et al., 1999b).


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6. 3. 4. Méthodes pour l’étude du mécanisme d’action

L’étude du mécanisme d’action des bactériocines est délicate, car il est très rarementpossible de dissocier les trois étapes (adsorption, insertion et formation de pores). En effet, si l’undes facteurs du système est modifié (bactériocine, milieu ou cellule cible), il est difficilementpossible de déterminer sur quelle(s) étape(s) ce changement intervient (Fig. 06).

Cependant plusieurs hypothèses ont été émises et ont été partiellement vérifiées. Plusieursméthodes ont été mises au point pour étudier au mieux le mécanisme d’action des bactériocines:

(i) l’activité des bactériocines, déterminée par la méthode de l’antibiogramme, reste uneméthode très imprécise qui reflète davantage le mode que le mécanisme d’action;

(ii) la détermination des variations de la force protomotrice (ΔΨ et ΔpH) est réalisée pardes méthodes de marquage radioactif (Venema et al., 1993; Abee et al., 1994; Tahara et al., 1996;Crandall et al., 1998) ou grâce à des sondes fluorescentes (BCECF-AM pour le ΔpH et DiSC3pour le ΔΨ) (Verheul et al., 1997; Herranz et al., 2001a; Suzuki et al., 2005), éventuellementcouplées à la cytométrie en flux (Maftah et al., 1993).

Cette méthode permet de quantifier l’activité antibactérienne de manière précise ainsi queses conséquences sur la viabilité cellulaire; (iii) l’utilisation de la fluorescence des résidustryptophane présents dans la séquence primaire de certaines bactériocines. Le «quenching» defluorescence observé lorsque ce type de résidu aromatique est présent dans une membrane permetde visualiser l’insertion de la bactériocine dans la bicouche lipidique (Castano et al., 2005).

Cette technique permet d’observer les deux premières étapes du mécanisme d’action ; (iv)les dosages des fuites de carboxyfluorescéine de liposomes artificiellement chargés (Herranz et al.,2001a; Netz et al., 2002), d’ATP et de phosphate inorganique (Pantev et al., 2003; Aucher et al.,2004; Suzuki et al., 2005), de potassium (Herranz et al., 2001b; Todorov et al., 2005), decomposés organiques, comme le glucose, le phosphoénolpyruvate, le glutamate, la lysine, laproline, la leucine et l’isobutyrate, par marquage radioactif (Venema et al., 1996; Waite et al.,1998b) sont des méthodes fréquemment utilisées.

De même que les variations de la force protomotrice, ces méthodes quantifient les fuites decomposés intracellulaires dues à la formation de pores ; (v) la quantification de la chute d’activitédes protéines membranaires permet de visualiser les conséquences des fuites à plus long terme.Celles responsables de l’acheminement des nutriments dans la cellule sont étudiées en utilisant descomposés marqués ou fluorescents (Jasniewski, 2008).

Le système PTS et certaines enzymes responsables du transport de certains acides aminésont été particulièrement étudiés (Gonzalez et al., 1996; Waite et al., 1998a).

Ces méthodes analytiques sont appliquées sur un couple peptide/cible. Le peptide est leplus souvent une bactériocine qui peut être modifiée chimiquement ou génétiquement (mutagenèsedirigée).


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La cible est une cellule bactérienne sensible, un protoplaste, ou une construction artificielletelle que les liposomes ou des membranes planes; (vi) la pénétration du peptide dans la membranede la cellule cible peut être déterminée par mesure de l’anisotropie de fluorescence d’une sondeextramoléculaire apolaire (Li et al., 2002; Zhao et al., 2006).

L’étude de l’anisotropie de fluorescence d’une sonde fluorescente préalablement introduitedans la bicouche lipidique constitutive d’une biomembrane est une méthode de choix pour mesurerla fluidité de cette membrane (ou inversement sa microviscosité) (Lentz et al., 1989).

La fluidité est assimilée à la plus ou moins grande amplitude des mouvements des chaînesd’acides gras des phospholipides. En effet, lorsqu’un fluorophore intégré dans la membrane estexcité avec de la lumière linéairement polarisée, il émettra une lumière de fluorescence qui resterad’autant plus polarisée que ses mouvements sont restreints pendant la durée de vie de son état excité(Lentz et al., 1989).

Dans le cas considéré, le mouvement de la sonde est restreint par la présence des chaînesd’acides gras, autrement dit le mouvement de la sonde "épouse" celui des acides gras. Ceci estparticulièrement confirmé dans le cas des sondes de forme linéaire comme le DPH ou le TMA-DPH(Jasniewski, 2008).

Le DPH est une molécule hydrophobe, elle s’insère donc au coeur de la bicouche lipidique.En effet, le DPH s’oriente principalement parallèlement aux chaînes d’acides gras. La fluorescenceémise par la sonde reflète la compaction des chaînes d’acides gras dans la bicouche lipidique et parlà, la fluidité au coeur de la membrane (Jasniewski, 2008).

Le TMA-DPH étant chargé positivement, il s’incorpore spécifiquement dans les lipides dela couche externe de l’enveloppe cellulaire (Kuhry et al., 1983). Le TMA-DPH permet d’observerl’effet du peptide au niveau de la fluidité membranaire à la surface de la membrane cytoplasmique.

La fluidité des lipides membranaires peut, en première approche, être considérée commeinversement proportionnelle à l’anisotropie de fluorescence (Bokas et al., 2007). L’anisotropie defluorescence est reliée à la microviscosité du milieu et au temps de vie de fluorescence de la sonde.

Si cette dernière est constante, alors l’anisotropie de fluorescence reflète la rigidité de lamembrane. Pour résumer, l’anisotropie de fluorescence est une mesure de la mobilité rotatoire de lasonde.

Cette technique est applicable à toutes les bactériocines contrairement à la mesure de lafluorescence du tryptophane qui nécessite obligatoirement la présence de ce type de résiduaromatique dans la séquence du peptide (Jasniewski, 2008).

La compréhension des mécanismes d’action des bactériocines peut également être abordéeen étudiant les phénomènes liés à la résistance vis-à-vis de ces peptides antibactériens.


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7. La résistance aux bactériocines

L’étude des souches résistantes permet de mieux appréhender le mécanisme d’action deces peptides. C’est pour cette raison qu’elles ont été particulièrement étudiées par un grand nombred’auteurs.

De plus, il a été constaté l’apparition de résistance chez des souches initialement sensibleslorsqu’elles sont cultivées au contact de ces peptides. L’importance que revêt l’acquisition de cetterésistance, comme dans le cas pour des antibiotiques, a conduit à étudier les causes de cesrésistances dites induites ou acquises (Jasniewski, 2008).

Le terme de résistance est délicat à définir. Il est en effet inféodé à de nombreuxparamètres ne dépendant ni de la bactériocine, ni de la souche cible, tels que la nature du milieu deculture (liquide ou solide), sa composition (Blom et al., 1997; Galvin et al., 1999), la température,l’état physiologique de la souche.

Ainsi, les auteurs précisent-ils leur définition de la résistance en définissant un seuil desensibilité à partir duquel la souche est considérée comme résistante. Afin de comparer la sensibilitéde différentes souches vis-à-vis d’une même bactériocine, la détermination de la concentrationminimale inhibitrice (CMI) est la technique la plus employée (Jasniewski, 2008).

7. 1. Les différents types de résistants

Il existe pour les bactériocines trois types de résistants :

(i) les résistants naturels, c'està- dire les souches qui sont insensibles à une bactériocinedonnée sans adaptation particulière, par exemple Ln. citreum CIP 103405 est insensible à lamésentérocine 52A (Limonet et al., 2004a).

(ii) les résistants induits, qui sont produits lorsqu’une souche naturellement sensible à unebactériocine présente un phénotype de résistance lié à une adaptation, comme c’est probablement lecas de Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides LMA 7AR vis-à-vis de la mésentérocine 52A(Limonet et al., 2002) ou à des mutations, comme chez Lc. lactis (Guinane et al., 2007).


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Le taux de croissance des résistants induits cultivés en présence de bactériocine estidentique à celui de la souche parentale (Reckhif et al., 1994). En revanche, cultivés en absence debactériocine, les résistants induits ont une phase de latence plus longue et un taux de croissance plusfaible que celui de la souche sauvage (Duffes et al., 2000); (iii) les souches dites immunisées, c'est-à-dire celles qui produisent une protéine d’immunité simultanément à une bactériocine, cas detoutes les bactéries productrices de peptides antibactériens.

Pour obtenir des résistants induits, des souches bactériennes naturellement sensibles sontsoumises à un stress, à l’aide essentiellement de bactériocines. Deux méthodes sont généralementutilisées : la première consiste en des expositions successives de la souche sauvage à desconcentrations croissantes en bactériocine (cette technique est réalisable aussi bien en milieu liquideque solide) (Goulhen et al., 1998; Limonet et al., 2002).

La deuxième méthode repose sur une exposition unique mais à une concentration élevée enbactériocine (Mazzotta et al., 1997; Crandall et al., 1998). D’autres types de stress ont été utiliséscomme l’adaptation à un pH non usuel (van Schaik et al., 1999) ou à de basses températures,comme dans le cas de souches psychrotrophes (Abee et al., 1994).

Des études avec L. monocytogenes rapportent des fréquences d’apparition de résistantsinduits vis-à-vis de la nisine de 10-5 à 10-8 et vis-à-vis de bactériocines de la sous-classe IIa de 10-3 à10-6 selon les paramètres mis en oeuvre lors des cultures (souches, bactériocines, température...)(Mazzotta et al., 1997; Dykes et Hastings, 1998).

Une étude plus récente sur la fréquence d’apparition de résistants de L. monocytogenes, àla pédiocine PA-1 ou à la nisine A, a été réalisée. Elle a montré une fréquence d’apparition de 10-6

en moyenne pour une résistance à la pédiocine PA-1 et une fréquence 10-2 à 10-7 pour la nisine A.

Cette fréquence pour la résistance à la nisine A peut être diminuée à environ 5.10-8 enprésence de 6.5 % de NaCl ou à un pH de 5.5 ou après exposition à une température de 10°C. Cesstress environnementaux n’ont pas d’influence sur la fréquence d’apparition des résistants à lapédiocine PA-1 (Gravesen et al., 2002a).

Des résistants à la lactacine 3147 (un lantibiotique) avec Lc. lactis IL1403 ont été obtenusà de très faibles fréquences d’apparition, de 10-8 à 10-9 (Guinane et al., 2006).

L’obtention de mutants résistants à une bactériocine par mutagenèse dirigée est possible sila cible à muter est le récepteur de la bactériocine comme la mannose-perméase (Arous et al., 2004;Gálvez et al., 2007; Diep et al., 2007).

Il est possible de sélectionner une souche résistante à une bactériocine à partir d’unebanque de mutants obtenus par mutagenèse insertionnelle aléatoire. Des mutants de Lc. lactisIL1403 résistants aux lantibiotiques ont été obtenus à partir d’une banque réalisée par intégration duplasmide pORI19 (Guinane et al., 2007).

Il en est de même avec L. innocua résistant à la pédiocine AcH. Une banque de mutants aété créée en utilisant le transposon Tn917 (Xue et al., 2005). L’avantage des ces techniques est


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qu’elles peuvent permettre l’identification de l’acteur responsable du phénotype de résistance, parconséquent le facteur de sensibilité peut parfois en être déduit.

Des repiquages successifs de résistants induits, avec ou sans pression de sélection, ontpermis de montrer que le phénotype de résistance semble être stable. Ainsi, la résistance à la nisinede L. monocytogenes est conservée après 20 repiquages en absence du lantibiotique (Mazzotta etal., 1997), ainsi que la résistance à la divercine V41 (Duffes et al., 2000).

De même, celle de Pc. acidilactici est stable après 60 repiquages en l’absence debactériocine (Goulhen et al., 1998). Concernant la résistance vis-à-vis de bactériocines de l sous-classe IIa, cette stabilité a également été mise en évidence (Reckhif et al., 1994) ou non (Dykes etHastings, 1998).

Dans ce cas, des fréquences de réversion du phénotype de résistance en phénotype sensiblede 10-4 à 10-5 ont été mesurées. Une autre étude a montré que les résistants à la pédiocine PA-1 deL. monocytogenes sont beaucoup plus stables que ceux de la même souche à la nisine A (Gravesenet al., 2002a).

Plusieurs études ont rapporté des phénomènes de résistance croisée chez L.monocytogenes. La résistance à la nisine induit une résistance à la pédiocine PA-1 et à la leucocineS (classe IV) (Crandall et al., 1998); d’autres auteurs n’ont pas réussi à montrer une résistancecroisée entre la nisine et la pédiocine PA-1 ou la bavaricine A (Rasch et al., 1998), de même entrela nisine et la sakacine A ou l’entérocine B (Schillinger et al., 1998).

En revanche pour la même espèce bactérienne, la résistance à la mésentérocine 52A, à lacurvaticine 13 ou à la plantaricine C19, entraîne une résistance croisée vis-à-vis des deux autresbactériocines mais pas vis-à-vis de la nisine (Reckhif et al., 1994). Chez L. innocua, une résistancecroisée a été observée entre la nisine et la pédiocine AcH ou l’entérococcine EFS2 (Song et al.,1997).

En 2000, Duffes et al., ont rapporté que la résistance à la divercine V41 entraîne unerésistance aux piscicocines V1 et SF668 mais pas à la nisine. Une résistance croisée a été montréechez L. monocytogenes O57 pour la nisine et pour des bactériocines de la sous-classe IIa (pédiocinePA-1, leucocine A et carnobactériocine B2) (Gravesen et al., 2004).

Chez L. monocytogenes, l’acquisition d’une résistance pour la nisine A ou la nisine Zpermet de rendre la souche résistante à la pédiocine PA-1 et à la divergicine M35 (Naghmouchi etal., 2007).

Enfin, selon certains auteurs, la résistance à une bactériocine de la sous-classe IIa provoqueune résistance aux autres bactériocines de cette même classe (Wan et al., 1997; Dykes et Hastings,1998).

7. 2. Les caractéristiques des résistants

Le support génétique de la résistance n’a pas encore été élucidé. Cependant chez L.monocytogenes, trois gènes pbp2229, hpk1021 et lmo2487, codant respectivement une «penicillin-


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binding» protéine, une histidine kinase, et une protéine de fonction inconnue, ont été mis enévidence (Gravesen et al., 2004).

L’hypothèse d’une origine plasmidique est écartée (Ming et al., 1993). L’hypothèse d’unesimilitude entre l’immunité naturelle de la souche productrice vis-à-vis de sa propre bactériocine etcelle acquise par les souches résistantes est également écartée (Jack et al., 1995).

En outre, bien qu’il ait été mis en évidence la présence d’une nisinase chez S.thermophilus, B. cereus et B. polymyxa (Jarvis, 1967), la vitesse de réaction de cette enzyme estinférieure à celle de l’action de la nisine. La résistance n’est donc pas due à cette protéase.Actuellement, la compréhension du mécanisme de résistance porte sur les études de la membranecytoplasmique.

L’apparition d’un phénotype de résistance est très souvent liée à une modification descaractéristiques de la membrane. Le seul modèle concernant le mécanisme de résistance auxbactériocines a été proposé par Crandall et Montville en 1998 et concerne la nisino-résistance deL. monocytogenes ATCC 700302. Il implique plusieurs facteurs:

(i) la modification du peptidoglycane et la présence de cations divalents gênant laprogression des bactériocines vers la membrane cytoplasmique; (ii) la modification de la chargeélectrique de la bicouche lipidique diminuant ainsi les interactions électrostatiques entre lesbactériocines et la membrane.

(iii) la modification de la rigidité membranaire s’opposant à l’insertion des bactériocinesdans la membrane. Cependant, en 1998, Goulhen et al., ont montré que la nisino-résistance de L.monocytogenes ne provenait pas de la nonadsorption de la bactériocine sur les cellules. L’hypothèsede la modification des protéines membranaires a également été formulée.

Les différences de composition en acides gras chez les résistants induits, par rapport à lasouche parentale, sont soit non significatives soit contradictoires. Trois des quatre auteurs ayanttravaillé avec la souche L. monocytogenes Scott A ne mettent pas en relation la résistance et lacomposition de la membrane en acide gras (Verheul et al., 1997; van Schaik et al., 1999).

Un seul indique une diminution de la fluidité membranaire chez les variants résistants(Ming et al., 1993). De plus, contrairement aux autres auteurs, Mazotta et Montville (1997) ontmis en évidence, chez les variants résistants cultivés en présence de nisine, une modification de lateneur en acides gras ayant pour conséquence une augmentation de la fluidité membranaire.


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Les autres travaux, réalisés avec des souches très différentes (Goulhen et al., 1998;Chihib et al., 1999; Mazzotta et al., 1999) ne permettent pas de comparer les mécanismes derésistance. Cependant, d’une manière générale, la résistance à la nisine et/ou la présence de nisinemodifie(nt) la composition membranaire en acides gras.

Ceci tendrait à modifier la fluidité membranaire de la souche de manière à soit lui conférerune certaine résistance (Cl. botulinum, Pectinatus frisingensis, Pc. acidilactici), soit àcontrebalancer une modification de la fluidité membranaire, suite à la fixation de la nisine sur lesmembranes (L. monocytogenes).

Les résistants induits auraient une composition en phospholipides différente de celles de lasouche parentale, avec une diminution des phospholipides totaux et des phospholipides anioniques(Ming et al., 1995; Verheul et al., 1997; Crandall et al., 1998).

Des variations dans les teneurs relatives en ces différents phospholipides pourraientmodifier les interactions entre la bactériocine cationique et la membrane cytoplasmique, ainsi que lastructuration du peptide dans cet environnement différent.

D’autre part, il a été montré que des nisinorésistants adsorbent moins de nisine que leursouche parentale (Ming et al., 1995; Verheul et al., 1997). De plus, la neutralisation des chargesdes phospholipides anioniques entraînerait leur condensation. Celle-ci provoquerait une plus granderigidité membranaire qui s’opposerait à l’insertion des bactériocines dans la bicouche lipidique.

Enfin, la modification de la composition en phospholipides serait constitutive (Crandall etal., 1998). Cependant, certains auteurs ne notent pas de différence dans les teneurs enphospholipides entre les souches parentales et les résistants induits (Davies et al., 1996).

Les dernières études sur la résistance de L. monocytogenes à la leucocine A ont montré uneaugmentation du ratio en phosphatidylglycérol insaturé/saturé (Vadyvaloo et al., 2002). Concernantla résistance des bactéries à Gram négatif à la nisine, une étude a montré que le taux de lipide IIn’intervenait pas dans ce phénomène (Kramer et al., 2004).

La structure et/ou la composition de la paroi cellulaire ont été mises en cause dans lephénotype de résistance. Plusieurs modifications ont en effet été rapportées chez les mutantsinduits. Les variants présentent généralement une résistance accrue au lysozyme (Limonet et al.,2004a).

La résistance aux antibiotiques ciblant la paroi est augmentée (Crandall et al., 1998).L’hydrophobicité des cellules est modifiée (Maisnier-Patin et Richard, 1996), ainsi que leurmorphologie.

En effet, des observations de Str. thermophilus INIA 463 résistant à la nisine, parmicroscopie électronique à transmission, montrent que cette dernière possède une paroi plus épaisseque la souche parentale (Garde et al., 2004).

Les acides téïchoiques et lipotéïchoiques peuvent également être impliqués dans lephénomène de résistance aux bactériocines (Davies et al., 1996). En effet, la D-alanylation des


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acides téïchoiques chez S. pneumoniae (Kovacs et al., 2006) et des acides lipotéïchoiques chez Lc.lactis (Kramer et al., 2008) leur confèrent une résistance à la nisine.

Plusieurs auteurs ont étudié le rôle des protéines dans la résistance aux bactériocines, soitpar une étude du protéome, soit par une approche génétique, soit par une étude des ARNm(Kramer et al., 2006).

Ainsi, chez L. monocytogenes l’implication du gène rpoN a été observée dans lephénomène de résistance (Dalet et al., 2001). Ce gène code pour une protéine de 447 résidusd’acides aminés, semblable à la sous-unité σ54 d’une ARN polymérase bactérienne de B. subtilis.

Quand le facteur de transcription rpoN n’est pas exprimé chez la souche sensible, cettedernière devient résistante à la mésentéricine Y105. De plus, lorsque le gène codant ce facteur estinterrompu chez En. faecalis JH2-2, la souche devient résistante à plusieurs bactériocines de lasous-classe IIa et reste sensible à la nisine (Dalet et al., 2000; Héchard et al., 2001).

Chez un variant de L. monocytogenes résistant à la leucocine A, l’absence d’une protéineprésentant 83 % d’identité avec une mannose phosphotransférase spécifique a été mentionnée(Ramnath et al., 2000). Chez des résistants de L. monocytogenes à la pédiocine PA-1, unesurexpression de plusieurs protéines, notamment de la β-glucoside PTS a été observée (Gravesen etal., 2000).

Des différences au niveau du protéome entre L. monocytogenes et de son variant nisino-résistant ont été observées par électrophorèse bidimensionnelle (Duffes et al., 2000); ces différencesconsistent en la disparition de neuf protéines et en l’apparition de huit autres dont une flagelline etune ferritine.

Ces auteurs émettent comme hypothèse qu’il ne semble pas y avoir de relation directe entreces protéines et le phénotype de résistance, mais une dérégulation du système d’expression duepeut-être au facteur sigma. La mannose perméase interviendrait dans la résistance face à plusieursbactériocines de la sous-classe IIa chez L. monocytogenes (Gravesen et al., 2002b; Arous et al.,2004; Vadyvaloo et al., 2004b) et chez L. innocua (Xue et al., 2005).

Ces auteurs suggèrent que le mannose perméase serait le récepteur des bactériocines de lasous-classe IIa, mais cette hypothèse n’a pas été généralisée avec toutes les souches et toutes lesbactériocines étudiées.

Certains peptides antibactériens ciblent un composé intracellulaire (Brogden, 2005). Desrésistants peuvent alors apparaître en modifiant cette cible cytoplasmique; c’est le cas d’E. coliDH5α résistant à la microcine J25 qui est mutée au niveau de l’ARN polymérase, cible du peptide(Yuzenkova et al., 2002).


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8. La production et la purification des bactériocines

8. 1. Purification

La mise au point d’un protocole de purification est élaborée en fonction du degré de puretédésiré. Si le produit final est destiné à des essais d’application en conservation alimentaire, lerendement de purification sera privilégié face au degré de pureté.

En revanche, si le but est l’étude structurale de la molécule, le produit final devra présenterun haut degré de pureté imposant dans la plupart des cas un rendement de purification faible. Lapurification des bactériocines de bactéries lactiques est une tâche particulièrement difficile (DeVuyst et Leroy, 2005; De Vuyst et Leroy, 2007).

Les problèmes rencontrés sont tout d’abord liés au fait que les molécules à purifier sontsécrétées dans un milieu de culture complexe comme le milieu MRS contenant 20 g.l-1 de peptides.Pour cette raison, des auteurs ont eu recours à des milieux chimiquement définis (Barefoot et al.,1994;Carolissen-Mackay et al., 1997).

D’autres bactériocines ont tendance à s’associer entre elles ou avec d’autres espècesmoléculaires. Dans ce cas, il est nécessaire d’utiliser des agents dissociants tels que l’urée ou ledodécylsulfate de sodium (Barefoot et al., 1994).

De plus, des pertes importantes d’activité sont souvent observées pendant la purification(Henderson et al., 1992). Ces pertes peuvent être dues à des phénomènes d’adsorption irréversibledes bactériocines sur des supports non spécifiques tels que les membranes de filtration, les supportsde chromatographie ou le matériel standard de laboratoire.

Dans ce cas, l’utilisation de matériels siliconés est préconisée. La perte d’activité peut êtredue à la dégradation des peptides d’intérêt par des protéases présentes dans l’extrait brut; il est doncpréférable de pasteuriser les préparations contenant les bactériocines, en général thermostables(Piard et al., 1992).

Dans la plupart des cas, la purification des bactériocines se déroule en deux étapes. Lapremière consiste en une pré-purification par précipitation des protéines par du sulfated’ammonium, par acidification ou encore par partition différentielle dans des solvants organiques(Van den Berghe et al., 2006).

Lors d’une deuxième étape, les protéines précipitées sont solubilisées et purifiées par unesuccession de techniques plus fines incluant des chromatographies d’exclusion de taille (tamisagemoléculaire), d’échanges d’ions, d’interactions hydrophobes et liquides hautes performances enphase inverse (RP-HPLC) (Parente et al., 1999).

Les chromatographies d’échanges de cations ou d’interactions hydrophobes sont souventplus efficaces de par la nature cationique et hydrophobe des bactériocines (De Vuyst et Leroy,2007).


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Cependant, il n’existe pas de généralités et les techniques de purification utilisées sontnombreuses et variées. Un protocole commun a cependant pu être établi. Ce protocole a été utilisépour la purification de nombreuses bactériocines (Tichaczek et al., 1994; Jimenez-Diaz et al.,1995; Benoit et al., 1997; Parada et al., 2007).

Ce protocole, réadapté dans certains cas, est composé de quatre étapes : une précipitationau sulfate d’ammonium, une chromatographie échangeuse de cations, une chromatographied’interactions hydrophobes et une chromatographie en phase inverse utilisant le méthanol oul’acétonitrile comme solvant d’élution.

Une méthode rapide et spécifique de purification partielle de peptides antibactériens,fondée sur les phénomènes d’adsorption/désorption des bactériocines sur les membranes descellules productrices en fonction du pH, a également été mise au point (De Vuyst et Leroy, 2007).

Cette méthode a notamment permis d’obtenir des préparations concentrées de bactériocinespartiellement purifiées contenant peu de protéines contaminantes malgré des rendementsrelativement faibles. Ces préparations, soumises à une chromatographie liquide haute performance,permettent l’obtention de bactériocines avec un degré de purification élevé (De Vuyst et Leroy,2007).

Certains auteurs proposent des modifications à ce protocole en utilisant des supportsd’adsorption non cellulaires, comme des silices hydrophiles ou hydrophobes (Wan et al., 1996) oude silicate de calcium (Coventry et al., 1996b).

Une autre méthode de purification de bactériocines en deux étapes a été développée pourune bactériocine de la sous-classe IIa produite par Cr. divergens (Metivier et al., 2000). Lapremière étape consiste en une partition de solvant (Triton X-114) et la deuxième en unechromatographie échangeuse de cations.

Les rendements de cette méthode restent faibles, de l’ordre de 10 mg par litre de culture.Enfin, une méthode de purification en trois étapes a été mise au point pour purifier les bactériocinesde la sous-classe IIa avec un meilleur rendement (environ 60 %) (Guyonnet et al., 2000).

Dans ce protocole, la première étape de précipitation des protéines par le sulfated’ammonium est remplacée par une étape d’autoclavage (12 min,110°C) et une chromatographieéchangeuse de cations.

Les deux étapes suivantes ne diffèrent pas des autres protocoles de purification déjàdéveloppés et comportent une chromatographie d’interactions hydrophobes suivie d’unechromatographie liquide haute performance. Toutes ces méthodes permettent d’obtenir desbactériocines actives, certes avec un haut degré de pureté mais avec des rendements faibles (Dortuet Thonart, 2009; Smaoui, 2010).

8. 2. Améliorations de la production

De nombreux travaux ont visé l’optimisation de la production de la bactériocine oul’amélioration des souches productrices. Une même souche peut produire plusieurs bactériocines;


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les caractéristiques physicochimiques étant semblables entre ces divers peptides antibactériens, ilest donc difficile de les séparer les uns des autres (Jasniewski, 2008).

Certaines conditions culturales permettent de produire préférentiellement une bactériocinepar rapport à une autre. Chez Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides FR52, la températured’incubation joue un rôle important sur la production des mésentérocines 52A et 52B (Krier et al.,1998).

Si l’incubation est réalisée à 20°C, la synthèse de la mésentérocine 52A est majoritaire; enrevanche, si la température est fixée à 25°C, la production de la mésentérocine 52B est favorisée. LepH et la température ont également une influence sur la production de bactériocine par Lb. curvatusLTH 1174 (Messens et al., 2003).

Ces stratégies ne suffisent pas cependant pour améliorer le rendement de production. Or unrendement élevé de production de la protéine d’intérêt facilite les étapes de purification qui suivent.C’est pourquoi les travaux les plus récents visent à la production par modifications génétiques dessouches, voire d’utiliser l’expression hétérologue avec des espèces bactériennes totalementdifférentes de celles naturellement productrices (Jasniewski, 2008).

L’intérêt pour les systèmes de sécrétion hétérologue est non négligeable et ne s’arrête passeulement au fait de produire de grandes quantités de bactériocines. En effet, introduire les gènescodant une bactériocine et son système de sécrétion dans une souche à potentiel agro-alimentairepermettrait une meilleure protection des produits contre les flores pathogènes ou d’altération enévitant l’utilisation d’additifs (Jasniewski, 2008).

C’est le cas de la pédiocine PA-1 produite par Lc. lactis (Horn et al., 1999) ou del’acidocine A produite par Lb. casei (Kanatani et al., 1995). De même, une souche capable deproduire diverses bactériocines permettrait d’étendre le spectre d’activité vis-à-vis descontaminants.

Cependant, ces applications restent restreintes en raison de difficultés techniques et desrestrictions législatives. La production hétérologue de grande quantité de peptides s’avère pour lemoment davantage utilisée pour les études fondamentales (structure, mécanismes d’action).

Il a été démontré que les systèmes de transport dédié (DTS) à une bactériocine peuvent êtreutilisés pour la maturation et la sécrétion de bactériocines de la sous-classe IIa (Morisset et al.,2002; Horn et al., 2004).

Les constructions génétiques retenues pour la production hétérologue de bactériocines sontvariables. L’une d’entre-elles consiste en la construction d’un plasmide réunissant l’opéron codantla prébactériocine et sa protéine d’immunité associée, d’une part et l’opéron codant le DTS, d’autrepart (Jasniewski, 2008).

Ce type de construction a été utilisé pour la production de la mésentéricine Y105 par Ln.mesenteroides DSM 20484 (Biet et al., 1998) et par Lb. johnsonii (producteur de la lactacine F)(Fremaux et al., 1995) ainsi que pour la production de l’entérocine A par En. faecalis et Lc. lactis(O'Keeffe et al., 1999).


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Cette liste n’est pas exhaustive car de nombreuses études sur la production hétérologue ontété publiées (Rodriguez et al., 2003). Dans certains cas, la présence d’un peptide d’induction estindispensable pour la production (O'Keeffe et al., 1999). Un autre système de productionhétérologue repose sur l’utilisation de deux plasmides.

Le premier contient les gènes codant la prébactériocine et sa protéine d’immunité, lesecond les gènes codant le DTS. Ce système a été utilisé pour la production de la pédiocine PA-1(Horn et al., 1998). Dans certains cas, le DTS employé n’est pas celui associé naturellement à labactériocine (Martinez et al., 2000).

Différents éléments semblent influencer l’efficacité de la production hétérologue:

(i) le nombre de copies de gènes. L’utilisation de plasmide(s) à fort nombre de copiessemble être un avantage (Martinez et al., 2000); (ii) le type de promoteur utilisé : l’expression del’opéron pédiocine chez Lc. lactis n’est possible que sous le contrôle du promoteur fort P32 deLactococcus et non avec le promoteur propre de Pc. acidilactici (Chikindas et al., 1995b).

De même, la production de la pédiocine PA-1 et de la sakacine P, en utilisant le DTS de lasakacine A, n’est possible chez Lb. sakei que sous le contrôle du promoteur sakA (Axelsson et al.,1998).

La faible production de la lactacine F (bactériocine à deux composants produite par Lb.johnsonii) chez Ln. gelidum (producteur naturel de la leucocine A) et chez Cr. maltaromaticum(producteur des carnobactériocines A, B2, et BM1) est probablement attribuée à une faiblereconnaissance du promoteur par la souche hôte (Allison et al., 1995a; Allison et al., 1995b); (iii)la séquence du peptide leader (signal) est importante. En effet, cette séquence de la prébactériocinedoit être reconnue par un DTS d’une autre bactériocine.

Il semble, au moins pour les bactériocines de la sous-classe IIa, que l’efficacité de transportet de maturation d’un DTS, pour une bactériocine autre que celle qui lui est naturellement associée,est très dépendante des homologies de séquences entre les peptides leaders (Ennahar et al., 2000b).

Ainsi, une fusion entre le peptide leader de la sakacine A et la sakacine P mature a permisla sécrétion par Lb. sakei de la sakacine P via le DTS de la sakacine A; la sakacine P est aussisécrétée grâce à son propre peptide leader (Axelsson et al., 1998).

De même, la fusion du peptide leader de la lactococcine A avec la pédiocine PA-1 a permisla sécrétion de cette dernière par le DTS associé à la lactococcine A chez Lc. lactis (Horn et al.,1998; Horn et al., 1999).

Une autre explication de la faible production de la lactacine F chez Ln. gelidum et chez Cr.maltaromaticum serait un problème de reconnaissance des peptides leaders des deux peptides parles DTS de la leucocine A et des carnobactériocines (Allison et al., 1995a; Allison et al., 1995b).

Enfin, des fusions entre les séquences leaders des leucocine A, lactococcine A, colicine Vd’une part, et la divergicine mature d’autre part, ont été effectuées et exportées avec succès par les


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hôtes homologues aux peptides leaders (respectivement Ln. gelidum, Lc. Lactis, et E. coli) (vanBelkum et al., 1997).

L’expression hétérologue d’une fusion peptide leader de la leucocine A/colicine V a ététestée avec succès chez Lc. lactis, mais les rendements sont faibles. Paradoxalement, cette fusionn’a pas pu être exportée par Ln. gelidum malgré la présence du peptide leader de la leucocine A(van Belkum et al., 1997).

Les rendements de production de bactériocines (transport et/ou maturation) sont en généralinférieurs à ceux obtenus avec l’hôte naturel (Ennahar et al., 2000b), exception faite de rares casoù cette production est similaire, voire légèrement plus élevée (Axelsson et al., 1998; Horn et al.,1999).

Il est à noter qu’il est possible de produire de façon concomitante plusieurs bactériocinespar le même hôte hétérologue (Allison et al., 1995a; Allison et al., 1995b; Chikindas et al.,1995b; Horn et al., 1999; Martinez et al., 2000).

Des essais de productions hétérologues, impliquant un export des bactériocines via lesystème sec, ont été effectués. Ainsi, la phosphatase alcaline a été exportée chez E. coli en utilisantla séquence signal N-terminale de la divergicine (produite par C. divergens) (Worobo et al., 1995).

La divergicine a aussi été produite chez Cr. maltaromaticum, Cr. divergens, Lc. lactis et E.coli (Worobo et al., 1995). Des travaux ont étudié la sécrétion d’une protéine de fusion, peptideleader de la divergicine/mésentéricine Y105, par la voie sec chez E. coli, Leuconostoc sp. et chezLc. lactis (Biet et al., 1998).

Ces auteurs ont observé une production de la mésentéricine Y105 chez E. coli, mais labactériocine semble entraîner une toxicité périplasmique pour la bactérie. La prémésentéricineY105 a été également produite avec le même type de construction.

Cependant, aucune production de la bactériocine mature n’a pu être observée, bien que latranscription du plasmide semble avoir lieu chez Lc. lactis, alors que la divergicine (Worobo et al.,1995) et la carnobactériocine A (McCormick et al., 1996) ont été sécrétées par la voie sec chez lemême hôte.


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En revanche, une petite quantité de bactériocine est obtenue chez Ln. mesenteroides. Cettedifférence de production selon l’hôte est à rapprocher des résultats obtenus avec un plasmideportant l’ensemble des gènes impliqués dans la production et la sécrétion de la mésentéricine Y105.Ce plasmide permet de produire la bactériocine chez Ln. mesenteroides (Biet et al., 1998).

En revanche, aucune production n’est détectée avec ce même plasmide chez Lc. lactis(Biet et al., 1998). Dans les deux souches, la transcription du gène recombinant est visualisée, cequi permet de supposer que la différence entre les deux hôtes se situe au niveau post-transcriptionnelle.

Les auteurs ont suggéré que le peptide est dégradé ou piégé après sa synthèse chez Lc.lactis (Biet et al., 1998). La production de bactériocines, utilisant la voie générale de sécrétion sec,apparaît donc possible. Néanmoins, considérant sa faible efficacité par rapport aux systèmes DTS,elle ne peut susciter qu’un faible intérêt.

Même si les systèmes DTS semblent plus efficaces, les quantités produites restent trèsfaibles. A ceci s’ajoute la sécrétion du peptide dans un milieu de culture rendant les étapes depurification plus difficiles. Pour pallier ces problèmes, de nouveaux systèmes de surexpression ontété développés.

Ces systèmes reposent généralement sur la synthèse d’une protéine de fusion thiorédoxine-bactériocine grâce un plasmide de type pET (Novagen®). Cette protéine de fusion n’est passécrétée dans le milieu de culture ; elle s’accumule dans le cytoplasme de la bactérie productrice etsa toxicité est très faible.

Plusieurs bactériocines ont été produites avec ce type de construction telles que lapiscicoline 126 (Gibbs et al., 2004), la divercine V41 (Richard et al., 2004a) et l’entérocine P(Cuozzo et al., 2006). La protéine de fusion comportant un motif poly-histidine est aisémentpurifiée par une chromatographie d’affinité IMAC (Immobilized Metal ion AssayChromatography).

La bactériocine est clivée de la protéine porteuse soit par voie enzymatique (entérokinase)soit par voie chimique (CNBr). Après clivage, la bactériocine est purifiée par chromatographieIMAC ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC).

Bien que les rendements soient plus élevés avec cette approche, ceux-ci restent encorefaibles et sont de l’ordre de 20 mg par litre de culture. De plus, la bactériocine produite aprèsclivage peut présenter à l’extrémité N-terminale des résidus d’acides aminés additionnels, lesquelsrésultent de la façon dont ont été conçus les plasmides (Richard et al., 2004a).

D’autres types de domaines ont été fusionnés aux bactériocines afin de permettre leurpurification. Ainsi, l’entérocine A a été fusionnée à un domaine de liaison à la cellulose (Klocke etal., 2005) et la pédiocine PA-1 a quant à elle été fusionnée à la « Maltose Binding Protein » (Milleret al., 1998a).


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Certains auteurs ont tenté de produire une bactériocine sans protéine de fusion (Gutierrezet al., 2005a; Ingham et al., 2005), l’étape d’IMAC étant remplacée par uneimmunochromatographie ou par une HPLC, mais les rendements sont plus faibles que ceux obtenusavec la construction décrite précédemment.

La plupart des systèmes génétiques qui ont été développés pour l’hôte E. coli permettentune induction de la production de la protéine de fusion grâce au promoteur Lac par ajout d’uninducteur non métabolisé (« gratuit »), l’IPTG (Isopropyl-β-Thio-Galactoside).

Ce système permet de produire la protéine d’intérêt en deux étapes. Dans un premiertemps, la biomasse est produite et dans un second temps, la synthèse de la protéine est induite. Ledécouplage de ces deux étapes permet de s’affranchir d’un éventuel effet négatif de la protéinerecombinante sur la croissance et la survie bactérienne.

Dans le cas où une bactérie lactique telle que Lc. lactis est utilisée comme hôte, d’autrestypes de promoteurs peuvent être utilisés comme le NICE (Nisin-controlled gene expression system)qui peut être induit par la nisine (Mierau et al., 2005).

L’hôte utilisé lors de la production hétérologue est généralement E. coli, mais il estpossible de produire des bactériocines dans des levures, comme Pichia pastoris (Gutierrez et al.,2005b; Sanchez et al., 2008) ou Saccharomyces cerevisiae (Van Reenen et al., 2003).

Les rendements de production varient selon la levure et le plasmide utilisés mais ils sontgénéralement similaires à ceux obtenus avec un hôte bactérien. Les constructions plasmidiquesfavorisant la purification étant établies, certains auteurs se sont focalisés sur la phase de production.

Cette étape est alors réalisée dans un bioréacteur régulé soit avec un procédé discontinu(batch) soit avec un procédé semi-continu (fed-batch). Ce procédé permet d’obtenir une grandequantité de biomasse et donc une grande quantité de protéine de fusion. Les rendements obtenussont de l’ordre de 30 à 70 mg par litre de culture (Yildirim et al., 2007).

8.3. Toxicité et les considérations concernant la sécurité

Les bactériocines sont consommés depuis des siècles comme des produits de BL. Nisinereste la bactériocine commercialement la plus importante, même si d'autres bactériocines ont étécaractérisées et élaboré pour approbation et utilisation possible (Chikindas et Montville, 2002).

Une recherche exhaustive de la littérature montre que la plupart des informationsconcernant la sécurité de la nisine a recueilli plus de 35-37 ans (Claypool et al., 1966).

Brevets nisine revendiquant comme un agent antibactérien dans les denrées alimentaires,produits de soins personnels ou pour des applications médicales ne fournissent pas de donnéesnouvelles, et plutôt s'appuyer sur des informations publiées antérieurement (Blackburn et al.,1998).


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Nisine purifié ont été évalués pour effet toxicologique et a trouvé inoffensifs ou au moinsavec une toxicité très faible en utilisant des modèles de rats et de porcs de Guinée (Shtenberg etIgnatev, 1970). Son usage est approuvé comme additif alimentaire dans plus de 50 pays.

Il est probablement juste de dire que dans la plupart de ces pays, la nisine est labactériocine autorisé uniquement pour l'utiliser comme conservateurs alimentaires. Exemples deproduits alimentaires internationaux qui sont légalement modifiée avec la nisine sont les conservesde soupes (Australie), de la glace pour le stockage du poisson frais (Bulgarie), aliments pour bébés,produits de boulangerie et de la mayonnaise (République tchèque), et milk-shakes (Espagne)(Hurst et Hoover, 1993).

Toutefois, la majorité des types de produits approuvés sont les produits laitiers (enparticulier les fromages) et de conserves. Aux États-Unis, l'utilisation de la nisine productrices decultures starter n'a jamais été réglementée, comme les lactocoques sont considérés GRAS(généralement considérés comme sûrs).

La sécurité des autres bactériocines ayant des applications potentielles dans les denréesalimentaires a également été évaluée. Un autre antibiotique composé semblable avec l'approbationsimilaires comme agent de conservation est la surface composé antifongique actif, pimaricine(Henning et al., 1986).

Le pédiocine PA-1AcH a été injecté à des souris et des lapins, et immunoblotting montrequ'il est non immunogène chez l'animal (Bhunia et al., 1990). La sécurité de l'alimentation etl'Inspection Service (FSIS) du département américain de l'Agriculture (USDA) d'évaluer l'innocuitéet l'efficacité des bactériocines dans les segments des produits de base comme la viande et lesproduits avicoles.

Ainsi, selon le type de produit, la Food and Drug Administration (FDA) ou FSIS approuverl'utilisation de bactériocines roman avant toutes les applications sont autorisées (Chikindas etMontville, 2002).

9. Le conditionnement des bactériocines

Il est très difficile de conditionner les bactériocines sous une forme purifiée. Lesbactériocines semi-purifiées peuvent alors être conditionnées sous forme sèche par atomisation oulyophilisation par exemple (Parente et al., 1999). La nisine, la seule bactériocine légalementapprouvée comme additif alimentaire, est commercialisée sous une forme semi-purifiée (Dortu etThonart, 2009).


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10. Les applications de bactériocines

Les habitudes des consommateurs évoluent, ceux-ci cherchent de plus en plus des produitsalimentaires contenant un minimum de produits chimiques (Bonomo, 2000).

Le developpement de nouvelles familles d’antibiotiques qui peuvent surmonter leproblème de résistance est devenu dans le monde entier une tâche très importante en raison del'apparition de souches bactériennes résistantes.

Les bactériocines offrent des possibilities intéressantes considérables d'accomplir lesbesoins dans certains secteurs (Abee et al., 1995; Budde et al., 2003; Avila et al., 2005).

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont déjà largement utilisées parl’industrie agroalimentaire pour leurs propriétés de bioconservation (Gálvez et al., 2011).

10. 1. Domaine de la médecine humaine et vétérinaire

L’utilisation des bactériocines n'est pas restreinte au domaine alimentaire mais trouve aussides applications dans le domaine médical et médecinevétérinaire.

Daw et Fredrick (1996), ont rapporté que les bactériocines gagnent une attentionparticulière pour le traitement des infections des muqueuses causées par des bacilles à Gram négatiftels Pseudomonas, Klebsiella, et Enterobacter.

Taylor et al., (1949), ont démontré que la nisine s'est avérée efficace contre des infectionsintra-mammaires dues aux streptocoques et staphylocoques. En 1989, Broadbent a mis en évidencel'efficacité de la nisine contre les pathogènes responsables de la mammite bovine tel que S. aureus,Str. agalactiae, et Str. uberis (Broadbent et al., 1989; Sears et al., 1992).

D'autres études ont montré que la nisine pouvait être utilisée efficacement dans lestraitements des infections gastro-intestinales tel que les ulcères gastriques causés par Helicobacterpylori (Gudcr et al., 2000; Stern et al., 2006).

Puisque la nisine est stable dans des conditions acides et résiste à la pepsine, elle maintientson activité antimicrobienne dans l'estomac, et n'est inactivée que par les enzymes de la floreintestinale (Guder et al., 2000).

Tout comme la nisine, la lacticine 3147 est une autre bactériocine possédant d'excellentespropriétés pour les applications alimentaires et médicales à savoir: la stabilité à la chaleur, uneactivité sur une large gamme de pH et un large spectre d'inhibition.

Ross et al., (1999) ont rapporté que la lacticine 3147 possède une capacité à inhiberplusieurs pathogènes humains incluant les souches de S. aureus résistantes à la méthicilline, lessouches de En. faecalis résistantes à la vancomycine, et les souches de Str. pneumoniae et Str.mutans résistantes à la pénicilline.

La lacticine 3147 possède une activité bactéricide contre les pathogènes responsables de lamammite bovine tels que S. aureus et Str. dysgalactiae (Ryan et al., 1999).


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D'autres études ont mentionnée que les bactériocines peuvent être une thérapie naturellealternative aux antibiotiques. Mota-Meira et al., (2000) ont montré que la nisine A et la 20mutacine B-Ny266 (isolée de Str. mutans) ont un potentiel antibiotique en remplacement de lavancomycine et de l'oxacilline, deux antibiotiques reconnus pour causer le développement derésistance chez les souches pathogènes traités (enterococci).

Le large spectre d'activité de la mutacine B-Ny266 contre des bactéries résistantes auxantibiotiques classiques supporte le développement de cette substance à des fins thérapeutiques(Mota-Meira et al., 2000).

Wachsman et al., (2003) ont montré que l'entérocine CRL35, produite par Enterococcusfaecium CRL35, isolée de fromage, possède une activité antivirale contre le virus de l'herpès(HSV). L'inhibition du virus par l'entérocine CRL35 serait liée à la prévention de la synthèse d'uneglycoprotéine majeure impliquée dans le cycle de réplication du virus (Wachsman et al., 1999).

Récemment, Sejong et al., (2006) ont rapporté que la bactériocine produite parLactococcus sp. HY449 possède une capacité à inhiber les bactéries tel que S. aureus ATCC 65389,Str. pyogenes ATCC 21059 et Pr. acnés ATCC 6919 qui sont responsables des inflammationscutanées.

La divercine V41, une autre bactériocine de classe IIa, a récemment présenté une activitéantimicrobienne dirigée contre L. monocytogenes EGDe in vivo chez la souris (Rihakova et al.,2010).

L'application de cette bactériocine sur des sujets humains n'a causé ni des réactionsallergique cutanée ni d'irritation de la peau. De nombreuses bactériocines sont actuellement àl’étude pour être utilisées comme traitement médical (Dicks et al., 2011).

10. 2. Domaine alimentaire

C’est durant le XIXe siècle, au Danemark, que la première boisson fermentée fabriquée àpartir d’un mélange de souches bactériennes isolées à partir de lait cru a été commercialisée. Leconcept de ferment a ensuite évolué au début du XXe siècle après l’identification de quelquessouches impliquées dans la fermentation.

Grâce à leur propriétés d’acidification et de production de polysaccharides, les bactérieslactiques ont souvent été utilisées en co-cultures pour initier et/ ou améliorer la fermentation denombreux aliments comme la choucroute, les saucisses ou les olives vertes (Settanni et Corsetti,2008).


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En plus de la propriété de bioconservation, plusieurs propriétés ont été attribuées auxbactéries productrices de bactériocines telles que la diminution des gaz dus à la fermentation ainsiqu’à l’amélioration du goût et de la qualité du produit fini.

Grâce à leur activité protéolytique et leuGrâce à leur activité protéolytique et leuracidification importante du milieu, les bactéries productrices de bactériocines sont utilisées soitpour initier la fermentation soit pour jouer le rôle d’adjuvant en présence d’une bactérie initiatricede fermentation (Gálvez et al., 2011).

10. 2.1. Conservation de produits laitiers

Biopréservation se réfère à l'utilisation de microorganismes antagonistes ou de leursproduits métaboliques d'inhiber ou de détruire les micro-organismes indésirables dans les alimentspour améliorer la sécurité alimentaire et de prolonger la durée de conservation (Schillinger et al.,1996).

Bactériocines, produit par BL, mai être considérés comme agents de conservation naturelsou biopreservatives qui répondent à ces exigences. Trois approches sont couramment utilisées dansl'application de bactériocines pour Biopréservation d'aliments:

1) L'inoculation des aliments avec BL car la capacité du BL de croître et de produire desbactériocines dans les produits est cruciale pour sa réussite.

2) Ajout de bactériocines purifiée ou semi-purifiés comme conservateurs alimentaires.

3) Utilisation d'un produit préalablement fermenté avec une souche productrice de bactériocinecomme ingrédient dans la transformation alimentaire.

Nisine bactériocine était le premier à être isolé et approuvé pour utilisation dans lesaliments. En 1988, la FDA a approuvé son utilisation comme biopreservative pour une gammeétroite de produits alimentaires, y compris les produits d'oeufs pasteurisés. Aujourd'hui, la nisine estacceptée comme un agent de conservation des aliments sains de plus de 50 pays (Tab. 12).

La nisine possède de nombreuses applications et est approuvé pour utilisation dans diversaliments dans le monde. L. monocytogenes a été la cause documentée d'un certain nombre de foyersliés aux produits laitiers, tels que le lait pasteurisé (Fleming et al., 1985) et le fromage (James etal., 1985), et la nisine a été montré efficace contre L. monocytogenes dans les les produits laitiers.

La nisine est aussi ajoutés aux fromages fondus pasteurisés, se propage à empêcher lacroissance de spores de Clostridium, comme le Cl. tyrobutyricum (Schillinger et al., 1996).


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10.2. 2. Conservation des produits carnés

La présence de L. monocytogenes et sa capacité à croître à des températures deréfrigération et des conditions anaérobies en font une menace pour la sécurité des aliments. Elle estconsidérée comme un problème majeur de sécurité alimentaire, car il peut causer des maladiesgraves et de décès (Ryser et Marth, 1999).

Elle a été détectée dans une variété d'aliments et impliqué dans plusieurs épidémiesd'origine alimentaire, telles que les francs de la dinde. De nombreuses études ont été menées pourcontrôler L. monocytogenes dans les produits carnés car elle a été commune au sein d'abattage et deconditionnement de viande, et elle a été isolée à partir de viandes crues et cuites (Ryser et Marth,1999).

Nisine utilisée en combinaison avec de l'acide lactique a montré un effet accru en tant queconservateur d'inhiber les organismes Gram négatif (Ariyapitipun et al., 1999; Ariyapitipun etal., 2000). Murray et Richard, (1997) ont évalué l'activité de la nisine antilisterial pédiocine ACHet à la décontamination de pièces artificiellement contaminés de viande de porc crue.

Lauková et al., (1999) ont examiné l'efficacité de l’entérocine CCM 4231 dans le contrôlede la contamination de saucisson sec fermenté par L. monocytogenes. En outre, sakacine K, unebactériocine produite par Lb. saké CTC494 a été trouvée pour inhiber la croissance de L. innocuadans les échantillons de poitrine de volaille cuit et la viande d’hachée de porc crue.

Des résultats prometteurs dans la conservation des viandes fraîches ont été obtenus enutilisant pédiocine PA-1 produite par Pc. acidilactici ce qui réduit immédiatement le nombred'organismes cibles (Nielsen et al., 1990).

10. 2. 3. Conservation de produits de pêche

L'efficacité des bactériocines pour contrôler la croissance de L. monocytogenes dans lesous-vide saumon fumé à froid a été démontrée par plusieurs chercheurs.

Katla et al., (2001) ont étudié l'inhibition de L. monocytogenes dans le fumé à froid parl’utilisation de la sakacin P.

L'effet inhibiteur de la nisine en combinaison avec du dioxyde de carbone et à bassetempérature sur la survie de L. monocytogenes dans le saumon fumé à froid a également été étudié(Nilsson et al., 1997).

Afin d'améliorer la durée de conservation, de crevettes en saumure sont généralementélaborés avec l'adjonction d'acides sorbique et benzoïque. Préoccupations concernant l'utilisation deces acides organiques ont amené les chercheurs à explorer le potentiel de l'utilisation debactériocines pour leur conservation.

L'efficacité de la nisine Z, carnocine UI49, et une préparation de bavaricine A surl'extension de durée de conservation des crevettes en saumure a été évalué par Einarsson etLauzon (1995).


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Bien que le rôle antimicrobien des bactériocines a été reconnue, il est encore utilisé un peudans la conservation des aliments (de Souza et al., 2005).

10. 2. 4. Les bactériocines et les films d'emballage

Incorporation des bactériocines dans les films d'emballage pour contrôler l'altération desaliments et des organismes pathogènes a été un domaine de recherche active de la dernièredécennie.

Film d’emballage antimicrobien empêche la croissance microbienne sur la surface desaliments par contact direct du paquet avec la surface des aliments, tels que les viandes et lesfromages (Chen et Hoover, 2003).

Pour cette raison, le film d’emballage antimicrobien doit communiquer avec la surface dela nourriture de sorte que les bactériocines peuvent diffuser à la surface.

La libération progressive des bactériocines à partir d'un film d'emballage à la surface desaliments ont un avantage sur d'imprégnation l’aliment avec bactériocines.

Dans le processus de cette dernière, l'activité antimicrobienne être perdu ou réduit enraison de l'inactivation des bactériocines par les composants alimentaires ou à la dilution inférieureà la concentration active due à la migration dans les aliments (Appendini et Hotchkiss, 2002).

Deux méthodes ont été utilisées pour préparer les films d'emballage avec des bactériocines.L'une consiste à incorporer des bactériocines directement dans les polymères. Les exemplescomprennent l'incorporation de la nisine dans des films protéiques biodégradables (Padgett et al.,1998).

Une autre méthode pour intégrer les bactériocines dans des films d'emballages consiste àenduire ou adsorber les bactériocines de polymères aux surfaces.

Les exemples incluent la nisine/ revêtements méthylcellulose pour les films enpolyéthylène et revêtements nisine pour la volaille, l'adsorption de la nisine sur le polyéthylène,éthylène acétate de vinyle, le polypropylène, polyamide, polyester, acrylique, et le chlorure depolyvinyle (Appendini et Hotchkiss, 2002).


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10. 3. Domaine de la technologie alimentaire

Le tableau 11 montre que les bactériocines ont souvent des synergies avec d'autrestraitements, et peut être utilisé pour améliorer la sécurité des aliments. Par exemple, l'application dechamp électrique pulsé (PEF), se qui augmente la perméabilité des membranes cellulaires, a étéutilisé en association avec la nisine, qui peut également agir au niveau de la membrane cellulaire(Leistner, 2000; Terebiznik et al., 2000).

L'efficacité de la nisine contre les bactéries Gram négatives était généralement faible; lacroissance des bactéries pathogènes Gram négatives telles que E. coli O157: H7 et Salmonella(Stevens et al., 1991) peut également être contrôlé au début par les chélatants de métaux tels quel'EDTA qui sont utilisés en combinaison avec la nisine (Zhang et Mustapha, 1999). EDTAperturbe la membrane externe et permettant la pénétration de la nisine (Abee et al., 1995).

10.4. Domaine agricole

La protection des plantes contre les microorganismes phytopathogènes ainsi que lapréservation des semences, sont les objets de l’exploitation des bactériocines en agriculture. Dansce cas, les substances antibactériennes et substances antifongiques seront associées afin de luttercontre les ravageurs phytopathogènes (Paik et al., 1997).

10.5. La combinaison des bactériocines avec d’autres agents

La combinaison des bactériocines avec d’autres traitements de conservation chimique ouphysique donne des résultats prometteurs pour la conservation des aliments.

Les molécules chimiques peuvent être des acides organiques, le nitrite, le chlorure desodium, l’éthanol, des huiles essentielles (l’impact sur les propriétés organoleptiques doit êtresoigneusement évalué) ou des agents chélatants tel que l’EDTA, le phosphate trisodique, le citrate.

Ces agents chélatants permettent de séquestrer les ions magnésium des lipopolysaccharidesde la membrane externe des bactéries Gram négatives permettant aux bactériocines d’atteindre lamembrane interne, siège de leur activité (Dortu et Thonart, 2009).

Les traitements physiques peuvent être des traitements thermiques, le stockage sousatmosphère contrôlé, l’application de champs électriques ou l’application des hautes pressions(Rodgers, 2004; Deegan et al., 2006; Gálvez et al., 2007).

D’autre part, l’utilisation d’inhibiteurs de protéases ou de protéines de soja a été suggéréeafin de prévenir la dégradation des bactériocines par les protéases présentes dans le produit àconserver (Kouakou et Thonart, 2011).


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10.6. Limite d'utilisation des bactériocines

De nombreux travaux ont souligné l'importance de l'utilisation des bactériocines ou desouches bactériocinogènes en tant qu'additifs alimentaires. Cependant, de nombreux facteurspeuvent réduire l'efficacité des bactériocines contre les bactéries indésirables et les pathogènes pourl'homme (Muriana et al., 1996).

En fait, les cellules sensibles n'ont pas toutes les mêmes concentrations minimalesinhibitrices (CMI), pour une bactériocine donnée. Ensuite, les bactériocines produites par lesbactéries à Gram positif n'ont pas d'action bactéricide contre les bactéries à Gram négatif et contretoutes les bactéries à Gram positif responsables d'altérations dans les aliments ou des pathogènespour l'homme.

L'application de ces bactériocines pour contrôler le développement de la flore indésirableest souvent limitée aussi par la perte de l'activité anti-microbienne au cours du stockage du produit(Muarry et Richard, 1997).

Toutefois, il semblerait que les activités protéolytiques des carnobactéries elles-mêmes, oucelles présentes dans la matrice alimentaire, représentent les principaux facteurs limitant l'activitéanti-Listeria des bactériocines produites in situ par les cultures de carnobactéries (Duffes et al.,1999; Nilsson et al., 1999).

Un des paramètres pouvant affecter l'efficacité des bactériocines est l'activité de l'eau (aw).Ainsi, une Aw élevée favorise l'activité des enzymes protéolytiques mais aussi la croissance depathogènes tel que L. monocytogenes (Aasen et al., 2003).

Daeschel et al., (1991) ont montré que l'activité biologique de la plupart des bactériocinesest modifiée voire annulée après dégradation par des enzymes protéolytiques non spécifiques, aprèsoxydation, après interactions avec des métaux lourds, après une agitation excessive ou unedécongélation.

Degnan et al., (1993) ont montré que 90 % de l'activité de la pédiocine dans un systèmealimentaire est conservée si la bactériocine est protégée par une encapsulation dans des liposomes.Les bactériocines sont des peptides amphiphiles capables de s'absorber aux macromolécules de lamatrice alimentaire.

Ces propriétés peuvent limiter leur utilisation comme agents de conservation. Aasen et al.,(2003) ont étudié l'effet de l'intéraction de la sakacine P et de la nisine avec les différentscomposants de la matrice alimentaire pour évaluer l'activité antimicrobienne de ces bactériocinesdans la matrice alimentaire.

Il en ressort qu'une faible teneur en lipides du produit n'as pas d'influence sur l'activité dela bactériocine, qui aura aussi une propriété émulsifiante leur permettant d'adhérer à l'interfaceeau/lipide (Bani-Jaber et al., 2000).


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Davis et al., (1999) ont montré qu'une augmentation en teneur des lipides réduit l'activitébiologique des bactériocines dans la matrice alimentaire. Murray et Richard, (1997) ont rapportéque les bactériocines peuvent être adsorbées aux protéines (80 %) présentes dans la matricealimentaire par des interactions ioniques ou hydrophobes ce qui réduira le taux de bactériocine libreajouté.

L'addition de la caséine réduit l'activité de la sakacine P, de la curvacine et de la nisinedans les milieux synthétiques (MRS) (Gânzle et al., 1999). Muriana et al., (1996) ont montré queles interactions entre les composants de l'aliment (gras, autres additifs) et la bactériocine diminuentsa solubilité et son activité.

Ces peptides antimicrobiens peuvent être répartie de façon hétérogène dans la matricealimentaire et se sépare entre les composants alimentaires polaires et non polaires (Muriana et al.,1996). Enfin, la limite la plus contraignante pour les applications des bactériocines en industriealimentaire réside dans le développement de variants résistants.

Ainsi, pour une espèce bactérienne particulière, les phénomènes de résistance des souchessensibles peuvent exister naturellement ou résulter d'une exposition répétée aux bactériocines. Demême, l'emploi de souches de bactéries lactiques bactériocinogènes, impliquées dans le procédé detransformation de l'aliment, peut être inefficace si l'environnement ne fournit pas les conditionspropices à la croissance et à la production des peptides anti-microbiens (Jasniewski, 2008).


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Tableau 12: Exemples d'une utilité mondiale de la nisine (Fleming et al., 1985).

Pays Nourriture en laquelle la nisineest autorisée

Niveau maximum(IU/g) *

Argentine Fromage traité. 500

Australie Fromage, fromage traité, tomatesen boîte.

Aucune limite

La Belgique Fromage. 100

La Chypre Fromages, fromage pointillé,légumes en boîte.

Aucune limite

EU E234 peut également être marquéen tant que "préservatif normal".

Change selon le produitet l'Etat membre.

France Fromage traité. Aucune limite

Italie Fromage 500

Mexique La nisine est un additif autorisé. 500

Hollandes Fromage d'usine, fromage traité,poudre de fromage.

800

Pérou La nisine est un additif autorisé. Aucune limite

Russie Fromage traité diabétique,légumes en boîte.

8000

R-U Fromage, nourritures en boîte,crème coagulée.

Aucune limite

USA Diffusions fondues pasteuriséesde fromage.

10.000

* Unité internationale par gramme.


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Tableau 13: Plus grande activité des bactériocines utilisées comme partie de la technologie(Leistner, 2000).

Bactériocine Autres facteurs Effet

Nisine A

PediocineAcH

Nisine A

Nisine A

PediocineAcH

Nisine

Nisine

Nisine

Nisine

PediocineAcH

N2, CO2, bassetemperature

Pressionhydrostatique ethaute temperature

Lait lactoperoxydase(LP) et la bassetempérature

Gel d'alginate deCalicium

Diacetate de sodium

Esters d'acide gras desaccharose

Anhydridecarbonique

Champ électriquepulsé

Empaquetage modifiéde l'atmosphère(MAP)

Émulsifiant (Tween80) ou encapsulationde pediocin dans lesliposomes.

Effet on L. monocytogenes: augmentation dans laphase de latence (400 IU/ml); inhibition de lacroissance (1250 IU/ml).

La combinaison de la pression (345 MPa), de latempérature (50ºC) et de la bactériocine agitsynergiquement entraînant la réduction de viabilité de S. aureus, L. monocytogenes, E. coli O157:H7, Lb.saké, Ln. mesenteroides.

La nisine produite par Lc. lactis gèresynergistiquement avec LP dans la réduction de L.monocytogenes.

la nisine Gel-immobilisée est livrée plus efficacementque la nisine pure et supprime la croissance de Br.thermosphacta sur des carcasses de boeuf.

La combinaison du diacétatede sodium et depediocine fonctionne synergiquement contre L.monocytogenes à basse température.

Synergie contre L. monocytogenes, B. cereus, Lb.Plantarum et S. aureus.

Synergique utilisé contre le type sauvage de L.monocytogenes résistants à la nisine

Activité synergitique contre B. cereus.

La combinaison était plus efficace que seultraitement à empêcher la croissance de L.monocytogenes.

Pediocine AcH possède une activité listericidal plusélevée en boues de lait, graisse de beurre, ou deviande sans matières grasses si actuel sous la formeencapsulée ou agit en présence du Tween 80.

Matériels et méthodes


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Matériel biologique et les conditions de culture

1. La collection des échantillons

Les échantillons ont été rassemblés à partir des produits laitiers ; et ils sont directementtransportés au laboratoire pour l'analyse microbiologique. Ils ont été traités dans un délai de 2heures après collection, et sont immédiatement étiquetés et placés dans la glacière (+ 4°C).

2. Préparation d’échantillons

Les ensemencements sont réalisés sur milieu M17 et MRS gélosé en masse, en utilisant lesdilutions décimales obtenues à partir de la suspension mère du l’échantillon.

2.1. Les souches indicatrices utilisées et leurs origines

Les souches indicatrices utilisées dans cette étude ont été fournies par le Laboratoire de laBactériologie, Service de Microbiologie, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Universitéde Mascara.

Elles ont inclus les deux types de bactéries : Gram négatives (E. coli, Ps. aeruginosa, Sl.Paratyphimurium B, et Clostriduim sp.), et Gram positives (Str. pyogenes, S. aureus β-hιmolytique,L. ivanovii, B. megaterium ID 07817, et B. megaterium ID 07818).

2.2. La conservation des souches

La conservation des souches pures est faite selon deux formules : à court et à long terme.La conservation à court terme des souches pures est effectuée sur milieu solide incliné. Aprèscroissance à la température optimale, les cultures sont maintenues à +4°C et leur renouvellement sefait par repiquage toutes les 04 semaines.

La conservation à long terme des souches retenues est réalisée à -20°C dans une solutioncontenant 70% de lait écrémé (enrichie par 0.5 g/l d'extrait de levure et 0.5 g/l de glucose) et 30%de glycérol à 40% (Samelis et al., 1994).

3. Isolement et caractérisation des isolats bactériennes

Les milieux de culture de base utilisés pour l’isolement sont des milieux soit liquides, soitsolides par addition d’agar 1.6%. L’isolement sélectif des bactéries lactiques (BL) par culture surplusieurs milieux a été réalisé selon les méthodes décrites par la Fédération Internationale du Lait(FIL, 1996).

La composition des milieux de culture utilisés sont rassembles dans l’annexe. Le laitécrémé stérile additionné de 0.5% d’extrait de levure est utilise pour les cultures bactériennes.L’incubation des bactéries lactiques se fait à 30°C ou à 37°C sans agitation pendant 48 h.


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3. 1. Dénombrement de la flore lactique

Selon leur morphologie, les bactéries lactiques sont dénombrées sur deux milieux sélectifsdifférents: le milieu MRS agar (De Man Rogosa Sharpe, BD. Biosciences) et le milieu M17 agaradditionné d’acide nalidixique (0.04 g/l) et de glucose à 0.1 % (milieu M17 agar).

L’incubation, en raison de la microaèrophilie de cette classe bactérienne, se fait dans unejarre d’anaérobiose à 30°C pendant 24 h (Fitzsimmons et al., 1999).

3. 2. Isolement des différents genres des bactéries lactiques

Les ensemencements sont réalisés sur milieu M17 (BD. Biosciences) (Terzaghi etSandine, 1975) et MRS (De Man et al., 1960) gélosé en masse, en utilisant les dilutions décimalesobtenues à partir de la suspension mère du l’échantillon.

L’isolement des leuconostocs s’effectue sur deux milieux : milieu MSE (Mayeux et al.,1962) et MRS vancomycine (25 μg/ml). Les ensemencements ont été réalisés dans les mêmesconditions que pour les lactobacilles, les boîtes de Pétri sont incubées à 30°C pendant 4 à 5 jours(Mefteh et al., 1994).

Sur le milieu MSE, les colonies visqueuses caractéristiques des deux sous espèces de Ln.subsp. mesenteroides et dextranicum sont étudiées. Les isolats à Gram+ et catalase- sont repiquésde façon alternée sur milieu MRS liquide et solide (ou M17 liquide ou solide) jusqu’à purification.

A chaque fois, 7 à 10 colonies représentatives bien isolées sont prélevées du milieu MRSsolide (ou M17 solide) et transférées sur MRS liquide (ou M17 liquide) et vice versa.

3.3. Identification des isolats

Les analyses entamées nous permettent de classer les isolats en différents genres. Pourl’identification au niveau espèce et sous espèces, les tests biochimiques s’avèrent nécessaires etindispensables.

L'identification des coccis a été réalisée en plusieurs étapes : La croissance en présence deNaCl (4% et 6.5%) et à pH 9.6. L’habilite à croitre sur milieu M17 en présence de NaCl àdifférentes concentrations de NaCl (4% et 6.5%) et à pH de 9.6 a été observé pendant 2 à 3 joursd’incubation.

Les lactocoques ne poussent pas en présence de 6.5% de NaCl ; ce test permet de séparerles lactocoques (streptocoques lactiques), des entérocoques (streptocoques fécaux) (Devriese et al.,1993).

La thermorésistance est réalisé uniquement pour les cocci, sur MRS liquide et solide (ouM17 liquide et solide) à une température de 63.5°C pendant 30 min (Stiles et Holtzapfel, 1997;Klein et al., 1998).


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La croissance à 10°C et à 45°C a été effectuée. Le type fermentaire, par définition :l’hétérofermentation est la capacité des bactéries lactiques à produire des molécules différentes dulactate telles que le CO2, l’acétate, l’éthanol a partir de la dégradation du glucose, a été réalisé.

L’ensemencement des souches s’effectue dans un milieu liquide (M17 ou MRS) contenantau préalable une cloche de Durham (Harrigan et Mc Cance, 1976; Garvie, 1984; Schillinger etLücke, 1987).

La production du gaz dans la cloche indique que la souche est hétérofermentaire, dans lecas contraire elle est homofermentaire.

3.4. Identification des sous espèces

Les réponses enregistrées grâce aux tests décrits ci-dessus vont nous permettre :

v De séparer les lactocoques et les entérocoques;v De connaître les souches hétérofermentaires;v De caractériser les leuconostocs;v Et de déterminer les lactobacilles.

Les isolats représentatifs de la flore dominante, seront identifiés au stade espèce et sousespèce sur la base des critères d’identification comme suit: Lactococcus et Streptococcus (Schleiferet al., 1985; Samelis et al., 1994), Lactobacillus (Johnson et al., 1980; de Roissart, 1986; Klein,2001). Leuconostoc et Pediococcus (Devoyod et Poullain, 1988; Bissonnette et al., 2000).L’isolement des entérocoques a été réalisé par la méthode de (Casaus et al., 2000).

La production de l’arginine dihydrolase est observée sur le milieu M16 BPC de Thomas(1973). Les bactéries qui utilisent le lactose, vont acidifier le milieu, les colonies sont jaunes (arg-).D’autres utilisent aussi l’arginine et realcalinisent le milieu, leurs colonies sont blanches (arg+).

La fermentation de 19 sucres a été testée pour l’ensemble des isolats. Le milieu de baseutilisé est le bouillon MRS (sans le glucose et l’extrait de viande) additionné de 40 mg/l de pourprede bromocrésol comme indicateur de pH (MRS-BCP) (Tourneur, 1972; Mannu et al., 2000) etsupplémenté de 1% des carbohydrates suivants: glucose, saccharose, lactose, xylose, fructose,mannitol, sorbitol, maltose, mélibiose, tréhalose, raffinose, mannane, manose, xylitol, palmitine,méthyl-D-glucose, N- acétylglucosamine, inositol, et galactose.

Les solutions de sucres sont préparées dans 100 ml d’eau distillée à raison 30% desdifférents sucres. Ces préparations sont stérilisées par chauffage au bain Marie à 100°C pendant 10min puis conservées au réfrigérateur (Joffin et Leyral, 1996).

100 μl de la culture bactérienne 108 UFC/ml est ensemencé dans 8 ml de ce milieu. Lesconditions d’anaérobioses sont assurées par l’addition d’une couche mince d’huile de paraffinestérile a la surface du milieu de culture (Samelis et al., 1994).


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L’acidification est appréciée après 72 h d’incubation à 28°C par virage au jaune du milieu.La production d’acétoïne est détectée par la réaction de Voges Proskauer. Le milieu Clarck et Lubsensemencé est incubé à 28°C pendant trois jours. 01 ml de la culture réalisée dans le milieu Clark etLubs (Annexe I) est placé dans un tube à hémolyse. 0.5 ml du réactif vp1 et 0.5 ml du réactif vp2.

Les tubes sont soigneusement agités et ils sont laissés au repos 5 à 10 min à températureambiante. La production d’acétoïne se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface dumilieu. L’acétoïne se transforme en diacétyle sous l’action de la soude qui en présence d’oxygène secombine avec l’α-naphtol en un complexe rouge (Cogan et al., 1981).

L’utilisation du citrate en présence de glucose par les bactéries se traduit une colorationbleue sur milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980). Le milieu contient une solution deferricyanide de potassium et une solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieuinhibe la réaction entre l’ion ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui fermentent lecitrate permettent la réaction entre ces ions ; il en résulte la formation de colonies bleues (cit+) ouayant un centre bleu (après 18 h-72 h d’incubation), les colonies incapables de fermenter le citraterestent blanches (cit-).

La production de dextrane à partir de saccharose sur milieu solide MSE de Mayeux et al.,(1962) a été appliqué pour les isolats de Leuconostoc uniquement et l’utilisation du citrate surmilieu Kempler et Mc Kay (1980) pour les isolats des Streptococcus et Lactococcus.

3.5. Sensibilité des BL isolées aux antibiotiques

Les isolats de BL ont été inoculés individuellement dans MRS bouillon et incubés pendant24 h. 25 ml de MRS agar ont été mélangés avec des cultures de BL 106 UFC/ml et coulés dans desboites de pétri stériles et stockés à 4°C pour une heure pour solidifier les milieux. Les disquesd'antibiotiques ont été placés sur le milieu gélosé, les boites sont incubées à 37°C pendant 24 h. Larésistance a été définie comme l'absence de la zone d'inhibition de croissance autour des disques(Klare et al., 2005).

Les antibiotiques utilisés sont : Ceftazidine 30 µg, pefloxacine 10 µg, nitroxiline 30 µg,spiramycine 100 µg, acid pipemidic 10 µg, colistine 50 µg, neumycine 10 µg, penicilline 10 µg,amoxicitine 10 µg, gentamycine 10 µg, oxacycline 10 µg, kanamycine 30 µg, sultamethoxazole1.25 – 23.7 µg, et spiromycine 100 µg.

4. Mise en évidence des inhibitions antibactériennes

La recherche de souches bactériennes productrices de substances antimicrobiennes esteffectuée sur 141 isolats appartenant au groupe des bactéries lactiques. Elles se répartissent commesuit: Les entérocoques (cent dix sept souches), les lactobacilles (dix souches), les pediocoques(quatorze souches).


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4.1. Recherche et sélection des souches bactériennes productrices de bactériocine

Les tests généraux pour la mise en évidence d’antagonisme sont réalises sur un milieusolide. Ceci permet de détecter visuellement l’inhibition de la croissance de la bactérie considéréecomme indicatrice.

Le criblage pour la production des substances antagonistes a été réalisé dans des conditionsexcluant toute inhibition éventuelle qui pourrait être due à l’acidité ou à la production de peroxyded’hydrogène, en utilisant respectivement des milieux de culture tamponnés et la catalase. Larecherche de l’antagonisme bactérien a été réalisée par les méthodes suivantes :

4.1.1/ Détection d'activité de bactériocine utilisant la méthode de diffusion en puits (Tagget McGiven, 1971).

La méthode de diffusion en puits de Tagg et Mc Given (1971) a été appliquée. 20 ml demilieu MRS solide sont coulés dans des boîtes de Pétri. Sur cette couche, on dépose 8 ml de milieucontenant 0.8 % d'agar, et maintenu en surfusion à 45°C et ensemencé par 100 μl d'une culturefraîche de la souche indicatrice.

Après solidification, de petits cylindres (moules en acier inoxydable) d'un diamètre de 6mm vont nous permettre de confectionner des puits. 100 ml de surnageant sont déposés au niveaude chaque puits après diffusion, les boîtes sont mises à (4°C, 2 h), l'activité antimicrobienne setraduit par l'apparition de zones d'inhibition autour des puits après l’incubation à 30°C pendant 18 h.

4.1.2/ Détection d'activité de bactériocine utilisant la méthode de spot agar (Fleming et al.,1975; Schillinger et Lücke, 1987).

Les bactéries considérées comme inhibitrices sont ensemencées en touches (10 µl) à l’aidede l’inoculateur multipoint à la surface du milieu solide. Après séchage de ces touches atempérature ambiante pendant 2 h au minimum, les boites de Pétri ainsi préparées sont mis àl’étuve. Après incubation (30°C, 18 h), la sur couche, contenant la souche à tester est coulée avecune extrême délicatesse pour ne pas étaler les colonies ensemencées en touches. Aprèssolidification, les boîtes sont incubées à 30°C pendant 24 h. La formation d’un halo autour dessouches ensemencées en touches indiquera une inhibition de la souche indicatrice.

4.1.3/ Détection d'activité de bactériocine par la méthode de cinétique de croissance (lesmesures de densité optique Do), 9 ml d’aliquote de surnageant bruts de la bactériocine préparé àpartir de chaque isolat ont été mélangées à 1.0 ml de culture de la souche indicatrice (107 à 108

UFC/ml) précédemment développée en bouillon nutritif. La croissance de la souche indicatrice (L.ivanovii) a été surveillée par le spectrophotomètre à 600 nm pendant 12-18 heures (De Lima et al.,2002; Vinderola et al., 2002).

Cette méthode a été choisie pour toutes les expériences entreprises pour étudier l'activité debactériocine.


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4.2. Spectre d’activité

Après obtention des résultats sur les inhibitions bactériennes, nous avons sélectionné 24souches. Elles ont été ensemencées en touche à la surface de milieu solide. Après séchage àtempérature ambiante durant 4 h, 8 ml de gélose molle contenant 100 μl de la souche indicatrice (E.coli, Ps. aeruginosa, Sl. Paratyphimurium B, Clostriduim sp., Str. pyogenes, S. aureus β-hιmolytique, L. ivanovii, B. megaterium ID 07817 et B. megaterium ID 07818) sont coulés sur lesboites (Hosono et al., 1977).

4.3. Nature de l’agent inhibiteur

La recherche de la nature de l’agent inhibiteur a été réalisée en milieu solide et en milieuliquide. Elle est réalisée seulement pour les souches bactériennes présentant les plus grands halosd’inhibition et le plus grand spectre d’action. Cet antagonisme se traduit par la présence, dans un«tapis» de culture de la souche indicatrice, de zones d'inhibition claires autour des colonies dessouches tests ensemencées en multipoint.

Un certain nombre de tests doit donc être réalisé pour cribler les souches isolées afin de neretenir que celles produisant des substances de type bactériocine (Jack et al., 1995; Lash et al.,2005).

4.3.1. Inhibitions dues à une substance protéique

L'effet des enzymes protéolytiques sur l'activité inhibitrice des souches sélectionnées a étéréalisé à la fois sur milieu liquide et sur milieu solide. Pour s’assurer de la nature protéique dessubstances inhibitrices, nous avons utilise les enzymes protéolytiques (pepsine, trypsine, et papaïne)et non protéolytiques (α-amylase et lipase).

Les enzymes choisies pour cette étude ont été examinées selon la méthode de Bizani etBrandelli, (2002). Des enzymes protéolytiques comprenant la trypsine, la pepsine, et la papaïne ontété dissoutes en Tris-HCL de 40 ml (pH 8.2), HCl 0.002 M. (pH 7), et phosphate de sodium de 0.05M (pH 7) respectivement à une concentration finale de 1 mg/ml. D'autres enzymes telles que lalipase et α- l'amylase ont été dissoutes en phosphate de potassium de 0.1 M (pH 6), et du potassiumde 0.1 M (pH 7) respectivement à une concentration finale de 1 mg/ml.

Les filtrats stérilisés par filtration de chaque souche test et de chaque solution d'enzymesétaient mélangés (v/v), ont incubé à 30°C pendant 2 heures et après chauffage pendant 05 minutesen eau bouillante pour inactive les enzymes, les mélanges et les contrôles (filtrats sans traitementenzymatique) ont été inoculés avec L. ivanovii et l'activité antimicrobienne a été déterminée par laDo.


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5. Cinétique de croissance et de production de bactériocine

Un volume de 2% (v/v) de la souche test (Do. 600= 1.2) a été cultivée dans une fiole de250 ml contenir 100 ml MRS liquide, et a été incubée à 30°C pendant 12 h. La mesure decroissance et l’évolution de la production de la bactériocine par la souche test est suivie par lamesure de la Do chaque deux heures et la croissance de la souche indicatrice (L. ivanovii) a étésuivie par le spectrophotomètre pendant 12 heures et tester contre l’activité de la substanceantimicrobienne produite par la BL (Karmen et Bogovič, 2003).

6. Optimisation des conditions de production de bactériocine

Les conditions physiologiques influençant la production de bactériocine ont été examinées;pour notre travail, la recherche de souches bactériennes productrices de bactériocines est effectuéesur 141 isolats appartenant au groupe des bactéries lactiques suivantes: lactobacilles, entérocoques,et pediocoques.

Les bactéries Lactobacillus sp. et les Pediococcus sp. sont représentées comme dessouches productrices potentielles de bactériocine et L. ivanovii (souche indicatrice) souche surlaquelle est testée l’action inhibitrice des bactéries productrices de facteurs antibactériens. Ladétection d'activité de bactériocine a été réalisée suivant la méthode de spot agar (Schillinger etLücke, 1987). La formation d’un halo autour des souches ensemencées en touches indiquera uneinhibition de la souche indicatrice. L’activité antimicrobienne a été exprimée par le diamètre de lazone d’inhibition en mm sur milieu solide et toutes les expériences ont été faites en doubles.

6.1. Effets du milieu de culture et des températures d'incubation

Les milieux de culture tels que le MRS agar, M17 agar, et BHI agar (BD. Biosciences) ontété examinés pour que leur capacité soutienne à la production de bactériocine par les deux souchestests en conditions aérobies aux trois températures d’incubation choisies (30oC, 37oC et 45°C) et dupH 6 et 6.5 (Todorov et Dicks, 2007).

6.2. Effet du pH initial de milieu de culture

L'effet du pH initial du milieu de culture sur la production de la bactériocine étaitdéterminé. MRS agar a été ajustée pour parafer des valeurs du pH de 3.5, 4.5, 5.5, 6. 5, 7.5, 8.5, etde 9.5 avec du NaOH ou HCI de 1N et stérilisées à l'autoclave. Chaque boite de pétri a été inoculéavec les souches tests et la souche indicatrice en conditions aérobies à 37°C pendant 24 h. Deschangements du pH de la culture, et l'activité antimicrobienne ont été détectés par la méthodedécrite d’ailleurs (Ougnbanwo et al., 2003a).


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6.3. Effet de la source de carbone

L'effet des conditions culturelles et les différentes concentrations des ingrédients sur laproduction de bactériocine et de l'activité antimicrobienne de Lactobacillus sp. et Pediococcus sp.,ont été évalué utilisant une version modifiée de milieu MRS agar (MRSm), visant à préparer unmilieu meilleur marché pour la production de bactériocines. Le MRSm avec l'extrait de viande 10g/l, l'extrait de levure 5.0 g/l, et le tryptone 10 g/l choisies comme sources d'azote ont étécomplétées avec des carbohydrates monosaccharides et disaccharides ((glucose 2%, galactose 2%,fructose 4%, saccharose 4%, maltose 4%, et lactose 4%). Chaque sucre a été préparé sous forme desolution courante puis ajouté aux milieux MRSm et stérilisés pendant 15 minutes à 120°C. Les deuxsouches tests ont été inoculées et incubées pendant 24 h à 30°C et pH 6- 6.5 en conditions aérobies(Todorov et al., 2007).

6.4. Effet de la source d'azote

Les relations possibles entre la production de bactériocine et le changement de la sourced'azote ont été évaluées en modifiant la méthode conçue par Ogunbanwo et al., (2003b). Le milieude MRSm complétés avec du glucose 2 % p/v (pour Lactobacillus sp.) et 4% du maltose pourPediococcus sp. Les suppléments d'azote supplémentaires à chaque partie étaient : (tryptone, 1 %;extrait de viande, 1 %; extrait de levure, 0.5 %; sulfate d'ammonium, 0.4 %; chlorure d'ammonium,0.4 %; nitrate d'ammonium, 0.4 %; arginine, 0.4 %; acide ascorbique, 0.4 %; acide glutamique, 0.4%; et la valine, 0.4 %).

6.5. La production d’acide lactique par les bactéries lactiques isolées

Les deux souches bactériennes ont été cultivées pendant trois jours sur milieu MRS liquidedans des fioles à 30°C et à l’obscurité. Les pH initial et final sont mesurés à l’aide d’un pH mètretype Orion Research à électrode combinée.

Le titrage de l’acidité est effectué sur 10 ml de culture par une solution d’hydroxyde desodium 0.1 N à l’aide d’une burette de Mohr à robinet, en présence d’une goutte d’une solutionméthanolique de phénophtaléine à 1 % utilisée comme indicateur coloré.

L’acidité est exprimée en degré Dornic (1°D correspond à 0.1 g d’acide lactique par litrebouillon MRS) (Parente et al., 1994; Farah et al., 2004; Labioui, 2005).

7. Caractérisation physique et biochimique de la bactériocine produite

Les substances inhibitrices produites par les deux BL tests ont été caractérisées en ce quiconcerne l'effet des paramètres physiques et biochimiques sur l'activité de bactériocine. Dans tousles essais, le filtrat stérilisé par des filtres millipores de 0.22 µm, pour soumis aux différentsparamètres a été examinés pour leur activité antimicrobienne contre L. ivanovii comme décritprécédemment en suivant la méthode de la densité optique à 600 nm.


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7.1. Préparation du surnageant (filtrat).

Dans le but d’éliminer la possibilité d’un antagonisme vis-à-vis L. ivanovii par laproduction d’acides organiques, ce qui est le cas des BL en général, le surnageant d’une culture de18 heures à 30°C des souches isolées est ajusté à pH 6 (à ce pH, la croissance de L. ivanovii estoptimale).

Les filtrats ont été séparés par centrifugation au 6.000 tr/15 min à la température ambiante18°C pour enlever les cellules bactériennes viables et n'importe quelles particules insolubles. Lastérilisation du surnageant concentré est réalisée par passage à travers un filtre (Millex-GV) 0.22µm (Renner D-67125/GMBH Allemagne) de porosité. La vérification de la stérilité des surnageantsest réalisée en incubant ces derniers à 30°C pendant 24h.

Les surnageants ont été stockés dans le réfrigérateur pendant une période maximum dedeux semaines et périodiquement examiné pour le titre de bactériocine avant d'être remplacé. Lapréparation de bactériocine brute était relativement stable une fois préparée de cette manière, avecune baisse insignifiante dans le titre plus de deux semaines de stockage. Les préparations sontensemencées avec L. ivanovii. La croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densitéoptique (Schved et al., 1993).

7.2. Effet du pH et de la température sur l’activité de bactériocine

La stabilité thermique de bactériocine a été évaluée en exposant le surnageant auxdifférentes températures (Motta et al., 2004) s'étendant de 30°C à 121°C (30°C, 40°C, 50°C, 60°C,70°C, 80°C, 90°C, 100°C et 121°C pendant 15 minutes avant d'être examiné pour leur activitéantimicrobienne.

L'effet de sensibilité du pH sur l'activité de bactériocine a été examiné en ajustant lessurnageant au pH de 2 à 12 (à l'augmentation d'une unité de pH) avec du NaOH stérile 1 N ou HCl1 N. Après 1 heure d'incubation à la température ambiante (25°C), les échantillons ont été examinéspour l'activité antimicrobienne par la Do (Albano et al., 2007).

7.3. Stabilité pendant le stockage

La méthode conçue par Ogunbanwo et al., (2003a) a été employée pour étudier la stabilitéde bactériocine pendant différentes conditions de stockage. La bactériocine brute a été stockée à -20ºC et +4ºC pour l'intervalle différent du temps (30, 45, et 60 jours). L’activité antimicrobiennecontre L. ivanovii a été détectée selon la méthode de la densité optique à 600 nm.


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7.4. Effet d’irradiation UV sur l’activité de bactériocine

L'effet de la lumière UV a été étudié selon la méthode d'Ogunbanwo et al., (2003a). Desboîtes de pétri stériles contenant des surnageant brutes de bactériocine de 10 ml ont été exposées àl'irradiation UV (ampoule de Philips, longueur d'onde 340 nanomètres, 220-240 volt, 50 hertz,)située à une distance de 30 cm (Wanda et Bonita, 1991). Le temps d'exposition à la lumière UVs’est étendu de 15 à 90 mn. Ensuite chaque fois l’activité de bactériocine a été estimé Do à 600 nm.

7.5. Effet des solvants organiques sur l'activité de bactériocine

La sensibilité des bactériocines aux solvants organiques tels que l'acétone, le chloroforme,l'alcool éthylique, l'hexane, et le méthanol a été étudiée (Todorov et al., 2006). Des préparationslyophilisées de bactériocine de chaque BL ont été dissoutes individuellement dans chaquedissolvant organique à une concentration finale de 10 mg/ml.

Les échantillons ont été incubés à 30°C / 1 h, après quoi les dissolvants ont été enlevés parévaporation à la température ambiante. Le résidu sec de la phase organique a été re-suspendue dansle bouillon MRS stérile à une concentration finale de 10 mg/ml et analysé ainsi que les contrôlesnon traités (surnageants sans traitement avec solvant) pour l'activité antimicrobienne commeprécédemment mentionné.

7.6. Effet des sels inorganiques sur l'activité de bactériocine

Différentes concentrations des sels inorganiques tels que NaCl et KCl (p/v de 0, 0.5, 01, 03et 05 %) ont été examinées pour leur effet inhibiteur sur le bactériocine (Karaoğlu et al., 2003).

Les surnageants de chaque BL et la solution saline stérile de chaque sel inorganique étaientmélanges (v/v), inoculé avec la souche indicatrice et l'activité antimicrobienne était déterminée enutilisant la Do à 600 nm.

7.7. Effet des épices utilisées comme additifs sur l'activité de bactériocine

La possibilité d'augmente l'efficacité de l'activité de bactériocine en employant lesdifférentes épices qui sont employées comme additifs conservant des aliments, ont été examinésselon la méthode de Verluyten et al., (2004).

Touts les épices (poivre rouge, poivre vert, ail, pimon, et les grains de nigelle) ont étéobtenues localement et employées sans stérilisation antérieure. Les concentrations des épices ont étéchoisies pour établir les effets maximum des épices possibles.

Les épices séparément pesées en tant que poids/volume de 0.01%, ont été permises de sedissoudre dans 10 ml d'eau distillée chaude stérile et du jour au lendemain mélangées par l'agitation.


100

Des solutions d'épices ont été centrifugées et stérilisées par filtration. Le surnageant a étéstérilisé par filtration, auquel différents volumes des extraits d'épices ont été ajoutésindépendamment pour donner une concentration finale de 0.5, 01, et 03 % (v/v) alors inoculé avecL. ivanovii.

Des contrôles ont été préparés en élevant la souche indicatrice dans les solutions d'épicessans ajouter le surnageant. L'activité de bactériocine a été déterminée par la Do à 600 nm commeprécédemment mentionné.

8. Mode d'action sur des cellules cibles

8.1. Mode d'action sur les cellules cibles dans le milieu liquide

L'effet de la substance antibactérienne sur les bactéries sensibles (bactéricide oubactériostatique) est étudié selon la méthode de Toba et al., (1991). L’objectif est de connaitrel’effet de la substance antibactérienne produite par les deux souches tests. L’extrait de culture de lasouche productrice est ensemencé au 1/10 à partir d'une culture de la souche indicatrice de 18 h(correspondant à 107 à 108 UFC/ml).

Le milieu de culture MRSm additionné de 20% du surnageant de culture de la soucheproductrice est ensemencé de 100 μl d’une culture de 18 h (correspondant à 107 à 108 UFC/ml de L.ivanovii. Une stabilité de la concentration en bactéries viables démontre un effet bactériostatique,alors qu’une diminution de cette concentration indique un effet bactéricide (Albano et al., 2007).

8.2. Détermination de poids moléculaire de bactériocine

8.2.1. Purification partielle de bactériocine

8.2.1.1. Précipitation fractionnée par le sulfate d'ammonium

Les cellules des cultures productrices ont été centrifugées à 10.000 tr/15 min, à 4°C et dusulfate d'ammonium a été graduellement ajouté au surnageant pour obtenir la saturation de 45%.Après 4 heures d'agitation, protéines ont été précipités par centrifugation. Ensuite le culot estdissous dans la solution tampon de tris-HCl de 20 ml à pH 7.

Le mélange a été alors dialysé utilisant des tubes spécifiques contenant de membrane(Specra/Por) de 12 kDa (CA Etats-Unis) contre 2 litres d'eau distillée pendant 24 heures à 4°C avecau moins trois changements par jour. La préparation dialysée a été concentrée pour analyséel'activité de la bactériocine (Jiménez-Diaz et al., 1993).

8.2.1.2. Ultrafiltration

Un moyen alternatif de la purification partielle a été étudié. Le surnageant filtré (0.22 µm)a été centrifugé au 10.000 tr/30 à 45 min dans des tubes spécifiques (Vivascience, 10.000 Da).


101

Le surnageant (> 10.000 Da) et la partie aliquote inférieure (< 10.000 Da) ont étérassemblés et examinés pour l'activité antibactérienne (Jiménez-Diaz et al., 1993). La solutionobtenue est appelée la fraction I.

8.2.1.3. Gel filtration sur colonne de Séphadex G-25

La solution résultante de la deuxième étape de ultrafiltration, est chargée sur une colonne(70 × 1.5 cm) de gel filtration Sephadex G-25 équilibrée avec 20 mmol/ l du tampon phosphate desodium (pH 7). L’élution des protéines est effectuée avec le même tampon avec un débit de 30ml/h. L'activité antimicrobienne des différentes fractions recueillies a été testée contre L. ivanovii(Schöbitz et al., 1999 ; Smaoui, 2010).

Ce type de colonne sépare les molécules en fonction de leur taille: les molécules de grandetaille (protéines et peptides) sont éluées en premier avec le volume mort de la colonne et lesmolécules de petite taille (sels neutres, sels du tampon, contaminants de bas poids moléculaire),ayant un accès complet aux pores, sont éluées plu tard (avec un volume d’élution proche du volumetotal de la colonne). Cette technique peut être utilisée pour dessaler et pour éliminer descontaminants de bas poids moléculaire (Izquierdo, 2009).

8.2.2. Technique de SDS-PAGE

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Tris-tricine (SDS-PAGE) permet laséparation des peptides et des protéines en fonction de leur masse moléculaire. L’estimation de lamasse moléculaire de la bactériocine purifiée a été réalisée par SDSPAGE, gel d'acrylamide à 20%(Laemelli, 1970; Schagger et von Jagow, 1987; Smaoui, 2010).

Deux marqueurs de poids moléculaire ont été utilisés: Bovine serum albumin (E. coli 90kDa), ovalbumin (chicken egg 49 kDa), carbonicanhydrase (bovine erythrocytes 35 kDa), B-lactoglobilin (bovine milk 26 kDa), et lyzozyme (chicken egg white 19 kDa).

Le deuxième marqueur est Triosphosphate isomerase 26.625 kDa, myoglobin 16.950 kDa,α-lactalbumin 14.437 kDa, aprotinin 6.512 kDa, insulin drain oxidized 3.496 kDa and bacitracin1.423 kDa (Bio-RAD, Germany).

La migration a été réalisée à 90 volt pendant 1 h dans un tampon anode (Tris 0.2 M, pH8.9) et un tampon cathode (Tris 0.1 M, tricine 0.1 M, SDS 0.1% (p/v), pH 8.25).

Après migration, le gel a été coupé en deux parties. La partie contenant l'échantillon et lemarqueur de protéine a été traitée par une solution de bleu brillant Coomassie R-250 (Biorad) à0,25%.

La deuxième partie qui contient uniquement l'échantillon, a été lavée avec une solution à10 mmol/l de tampon phosphate (pH 7.0) pendant 4 h, puis fixée et utilisée pour la détection directede l'activité antimicrobienne contre Listeria ivanovii.


102

9. Détermination de la CMI et la CMB

La détermination de la concentration minimale inhibitrice est effectuée par l’utilisation desmicroplaques polystyrènes tests (microtestIM; 96-well microtest, USA) (Verheul et al., 1997).

125 µl du MRS était ajoutée dans chaque puits avec la bactériocine purifiée (0, 0.25, 0.5, 1,2, 4, 6, 8 mg/l) respectivement. A volume de 25 μl de la souche indicatrice (L. ivanovii) incubéedurant la nuit (107 ou 108 UFC /ml) était ajouté à chacun puits.

Les microplaques ont été incubées en conditions aérobies à 30°C pendant 3 jours.L’absorbance a été mesuré à 600nm chaque heure avec un lecteur de microplaquesspectrophotomètre.

Le blanc était le milieu seul incubé dans les mêmes conditions. La CMI (mg. l-1) a étécalculé à partir de la dilution la plus élevée montrant l'inhibition complète de la souche cible (Doégales le font du blanc).

La concentration minimale bactéricide c’est la concentration la plus faible permettant detuer les bactéries (effet bactéricide).

Les déterminations CMI et CMB ont été répétées trois fois. Les résultats sont présentés entant que le moyen de trois répétitions indépendantes.

10. Application

Le lait cru de chèvre a été chauffé à 90°C pendant 15 min et inoculé avec Lb. plantarum ouPc. pentosaceus (2 ml/100 ml) et L. ivanovii (107-108 UFC/ml) ensuite incubé à 30°C pendant 10 h,la croissance de la souche indicatrice a été mesurée chaque deux heures à Do. 600 nm.

Le nombre cellulaire de la souche indicatrice a été déterminé, 100 ml de surnageant del’échantillon a été dilué et ensemencé sur la gélose nutritive à 30°C/48h, après on dénombrés lescolonies développés (Suranjita Mitra et al., 2010).

Résultats

Résultats

103

L’ensemble de tous les résultats obtenus dans le cadre de la préparation de cette thèse sontconsignés dans huit parties: isolement et l’identification des souches BL, la production de labactériocine, la connaissance de leur spectre d’action, les facteurs physico-chimiques affectant laproduction de la bactériocine, la caractérisation de cette substance antimicrobienne et leur moded’action contre L. ivanovii, la purification et la détermination de leur poids moléculaire et enfin leurapplications.

1. Identification des souches

L’objectif principal de cette première partie est l’identification phénotypique des souchescultivables isolées à partir des différents échantillons de produits laitiers (Tab. 14).

Tableau 14: Isolement des bactéries lactiques (BL)

Les échantillons Nombred’isolats Total

Les produits laitiers

Raïbe de la vache de Mascara 12

141

Lait cru de vache de Mascara 16Lait cru de brebis de Mascara 16Lait cru de chèvre de Mascara 15Beurre de vache de Mascara 07Yaourt "Danone" 03Yaourt "Soummam" 03Fromage de cheddar 10Fromage de camembert 05Fromage fondu blanc avec l’ail 10Fromage traditionnel (الكلیلة) d’Adrar 17Fromage fondu "la vache qui ries" 07Fromage "Noble" Hollande EDAM frite 06Camembert au lait pasteurisé "Président" 07Récfort (fromage danois de Danemark) 07

La caractérisation complète pour certaines souches est effectuée sur la base de diversesréponses enregistrées aux différents tests tant microbiologiques que biochimiques.

En premier lieu, il est indispensable d’obtenir des isolats purs et en deuxième lieul’application des divers examens permettant une pré-identification qui sera par la suite affinée pouraboutir à l’espèce, et à la sous espèce dans certains cas.

Résultats

104

L’identification de l’espèce repose sur la comparaison de divers caractères phénotypiquesde la souche à étudier vis-à-vis de ceux d’une souche de référence (vanden Berg et al., 1993; Carret al., 2002; Parada et al., 2007).

La classification phénotypique utilise un faible nombre de caractères considérés commeimportants tels que la morphologie, la mise en évidence d’un caractère biochimique, l’habitat. Ellene reflète qu’un nombre réduit d’informations.

Les caractères considérés comme importants sont subjectifs et dépendent des conditionsenvironnementales (Collins et al., 1987; Klein et al., 1996; Axelsson, 2004).

Il faut garder à l’esprit que certains caractères peuvent être absents notamment chez lessouches mutantes (Mayo et al., 1990; Dykes et von Holy, 1994; Salama et al., 1995).

Pour notre étude, l’identification des souches est basée sur le schéma de différenciationutilisé pour l’identification des bactéries lactiques (Carr et al., 2002).

1.1. L’obtention des isolats purs

L'isolement des bactéries lactiques se fait à partir de boîtes de pétri contenant un nombrede colonies compris entre 50 et 100.

Les caractéristiques morphologiques et phénotypiques des colonies des souchesdéveloppées sur M17 et MRS sont notées. Cette caractérisation des souches est basée sur le manuelde Bergey’s de systématique bactériologique (Sneath et al., 1986).

Dans le but d'écarter tout ce qui ne peut pas être une bactérie lactique, la coloration deGram a été effectuée pour s'assurer qu'il n'y a aucune contamination avec les microorganismesGram-.

Après purification des isolats et l’obtention de souches pures, les isolats sont cultivés(30°C, 24 h) dans des tubes à essais contenant le milieu de culture approprié (M17 ou MRSliquide).

Le test de production de la catalase est effectué par addition de H2O2. Tous les isolatsGram négatif et catalase positive sont écartés.

La caractérisation macroscopique, permet de décrire l'aspect des colonies obtenues surmilieu solide et de retrouver les critères relatifs aux colonies des bactéries lactiques (taille,pigmentation, contour, aspect, et viscosité).

Pour les souches isolées, les colonies sont petites d'environ 1mm de diamètre, de couleurblanchâtre ou laiteuse, avec une surface lisse et un pourtour circulaire régulier.

L’observation microscopique révélé la présence de plusieurs formes et associationscellulaires, certaines ont la forme de cocci. Les cellules sont soit isolées, en paires (diplocoques), ouen chaînettes.

Résultats

105

Tandis que pour d’autres c’est la forme bâtonnet. Les formes que nous avons observéessont typiques des bactéries lactiques.

1.2. Identification phénotypique

La classification courante des bactéries lactiques repose sur l’observation des caractèresphénotypiques du genre et de l’espèce (Schleifer et al., 1987; Axelsson, 2004).

Les méthodes phénotypiques appliquées pour la caractérisation et l’identification dessouches reposent essentiellement sur:

(i) les tests biochimiques (ii), physiologiques, et (iii) les différentes températures decroissance (Buckenhüskes, 1993; Rovira et al., 1997).

L'identification classique et la caractérisation par les paramètres physiologiques etbiochimiques sont basées sur les méthodes décrites par Hastings et Holtzapfel (1987a).

Pour le genre Lactobacillus, l’emploi des méthodes énoncées par Schillinger et Lücke(1989), Samelis et al., (1994), et Carr et al., (2002) sont appliquées.

Pour les bactéries lactiques, les critères de biotypages les plus utilisés pour une taxonomiephénotypique peuvent être résumés comme suit:

- La croissance à différentes températures (15°C, 37°C et 45°C);- L'aptitude à croître en présence de 4% et 6,5% de Na Cl;

- L'aptitude à croître à pH 9.6;- La production de gaz;

- L'hydrolyse de l'arginine;- L'utilisation du citrate;- La production de dextrane à partir du saccharose;

- La production d'acétoïne à partir du glucose;- La croissance en présence de bleu de méthylène (Test de Sherman);

- La fermentation des carbohydrates.

Tous les résultats obtenus grâce à ces différents tests vont nous diriger en premier vers legenre et ensuite vers l’espèce et dans certains cas la sous-espèce et même le biovar: cas de Lc.subsp. lactis biovar. diacetylactis (Drici et al., 2009).

Nous n’avons retenu que les bactéries qui arborent les caractéristiques propres auxbactéries lactiques c’est-à-dire cellules Gram positif, catalase négative et bâtonnets asporulants(Bizzarro et al., 2000; Badis et al., 2004; Axelsson, 2004).

Pour les lactocoques, nous avons retenu uniquement les bactéries qui ne poussent pas enprésence de 6.5% de NaCl et à pH 9.6 (Mayo et al., 1990; Carr et al., 2002).

Résultats

106

1.3. Recherche de type fermentaireL'utilisation des tubes de Durham dans un milieu liquide contenant du glucose est une

méthode pratique pour la détection de la formation de gaz (Harrigan et Mc Cance, 1976; Garvie,1984; Schillinger et Lücke, 1989; Badis et al., 2004).

Le test du type fermentaire nous a permis de différencier les souches homofermentaires dessouches hétérofermentaires. La présence de gaz dans la cloche de Durham indique un métabolismehétérofermentaire (Kihal et al., 1996).

1.4. Hydrolyse de l’arginineL'hydrolyse de l'arginine est détectée par l'addition du réactif de Nessler à 1 ml d'une

culture de bouillon d'arginine après 2 à 7 jours d'incubation.

Ce test est employé principalement pour les espèces de lactocoques ou de lactobacilles, ilpermet la détection de la présence de l'ammoniaque libre qui se traduit par une couleur orange(Niven et al., 1942; Garvie, 1984; Zarour et al., 2012).

Les cocci hétérofermentaires mésophiles arginine négatif sont rattachées au genreLeuconostoc. Les souches d’Enterococcus identifiées sont toutes arginine+, ce qui va dans le sensde cette identification (Schleifer et al., 1985; Hardie et Whiley, 1995; Drici et al., 2009).

1.5. Utilisation du citrate en présence de glucoseCe test permet de différencier entre l’espèce et la sous-espèce, cas de Lc. Lactis subsp.

lactis et Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Le milieu utilisé est celui de Mafteh et al.,(1993) et Konings et Lolkema (1998).

C’est la capacité des souches à utiliser le citrate, des résultats analogues ont été trouvés surle milieu KMK qui a été employé pour la majorité des isolats. L’emploi des tests (croissance àdifférentes températures, la recherche du type fermentaire, l’hydrolyse de l’arginine, l’utilisation ducitrate en présence du glucose) nous ont permis de faire une pré-identification des souches isolées.

Les 141 isolats retenus (Tab. 15a, 15b, et 15c) ont été rattachés à 03 genres distincts etdistribués par ordre de dominance comme suit: Lactobacillus (10 isolats: 0.070%), Pediococcus (14isolats: 0.090%), et Entérococcus (117 isolats: 0.83 %).

Les bactéries du genre Enterococcus ont la même morphologie que les lactocoques. Ladifférenciation entre ces deux genres repose sur la capacité de croissance à 10°C et à 45°C.

L’habilité à croitre en milieu liquide contenant 6.5% et 9.6% NaCl, et de réduire le milieulait contenant 0.1% de bleu de méthylène que possèdent les entérocoques (Schleifer et al., 1985;Hardie et Whiley, 1995; Badis et al., 2004).

Nous avons décelé 116 souches qui ont donné, simultanément, des résultats positifs à cesdifférents tests: la thermorésistance, croissance à 10°C et à 45°C, en présence de 6.5% et 9.6%NaCl. Toutes ces caractéristiques correspondent aux traits que possèdent les entérocoques.

Résultats

107

Tableau 15a: Caractéristiques physiologiques et biochimiques des BL isolées

Code TF 45°C 10°C 37°C Cit. Acé. ADH 6.5%NaCl

9.6%NaCl

Pré-identification

LBc01 Ho + + + - - + + +

Entérococcus

LBc02 Ho + + + - - + + +LBc03 Ho + + + - - + + +LBc04 Ho + + + - - + + +LBc05 Ho + + + - - + + +LBc06 Ho + + + - - + + +LBc07 Ho + + + - - + + +LBc08 Ho + + + - - + + +LBc09 Ho + + + - - + + +LBc010 Ho + + + - - + + +LBc011 Ho + + + - - + + +LBc012 Ho + + + - - + + +LBc013 Ho + + + - - + + +LBc014 Ho + + + - - + + +LBc016 Ho + + + - - + + +LBc017 Ho + + + - - + + +LBc018 Ho + + + - - + + +LBc019 Ho + + + - - + + +LBc020 Ho + + + - - + + +LBc021 Ho + + + - - + + +LBc022 Ho + + + - - + + +LBc023 Ho + + + - - + + +LBc024 Ho + + + - - + + +LBc025 Ho + + + - - + + +LBc026 Ho + + + - - + + +LBc027 Ho + + + - - + + +LBc028 Ho + + + - - + + +LBc029 Ho + + + - - + + +LBc030 Ho + + + - - + + +LBc031 Ho + + + - - + + +LBc032 Ho + + + - - + + +LBc033 Ho + + + - - + + +LBc034 Ho + + + - - + + +LBc035 Ho + + + - - + + +LBc036 Ho + + + - - + + +LBc037 Ho + + + - - + + +LBc038 Ho + + + - - + + +LBc040 Ho + + + - - + + +LBc041 Ho + + + - - + + +LBc043 Ho + + + - - + + +LBc044 Ho + + + - - + + +LBc045 Ho + + + - - + + +LBc047 Ho + + + - - + + +LBc048 Ho + + + - - + + +LBc049 Ho + + + - - + + +LBc050 Ho + + + - - + + +LBc051 Ho + + + - - + + +LBc052 Ho + + + - - + + +LBc053 Ho + + + - - + + +LBc054 Ho + + + - - + + +LBc055 Ho + + + - - + + +

Résultats

108

Tableau 15b: Caractéristiques physiologiques et biochimiques des BL isolées


9.6%NaCl

Pré-identification

LBc056 Ho + + + - - + + +

Entérococcus

LBc057 Ho + + + - - + + +LBc058 Ho + + + - - + + +LBc059 Ho + + + - - + + +LBc060 Ho + + + - - + + +LBc061 Ho + + + - - + + +LBc062 Ho + + + - - + + +LBc063 Ho + + + - - + + +LBc064 Ho + + + - - + + +LBc065 Ho + + + - - + + +LBc066 Ho + + + - - + + +LBc067 Ho + + + - - + + +LBc068 Ho + + + - - + + +LBc069 Ho + + + - - + + +LBc070 Ho + + + - - + + +LBc071 Ho + + + - - + + +LBc072 Ho + + + - - + + +LBc073 Ho + + + - - + + +LBc076 Ho + + + - - + + +LBc077 Ho + + + - - + + +LBc078 Ho + + + - - + + +LBc079 Ho + + + - - + + +LBc080 Ho + + + - - + + +LBc081 Ho + + + - - + + +LBc082 Ho + + + - - + + +LBc083 Ho + + + - - + + +LBc084 Ho + + + - - + + +LBc085 Ho + + + - - + + +LBc086 Ho + + + - - + + +LBc087 Ho + + + - - + + +LBc088 Ho + + + - - + + +LBc090 Ho + + + - - + + +LBc091 Ho + + + - - + + +LBc092 Ho + + + - - + + +LBc093 Ho + + + - - + + +LBc096 Ho + + + - - + + +LBc097 Ho + + + - - + + +LBc098 Ho + + + - - + + +LBc0110 Ho + + + - - + + +LBc0111 Ho + + + - - + + +LBc0112 Ho + + + - - + + +LBc0113 Ho + + + - - + + +LBc0114 Ho + + + - - + + +LBc0115 Ho + + + - - + + +LBc0116 Ho + + + - - + + +LBc0117 Ho + + + - - + + +LBc0118 Ho + + + - - + + +LBc0119 Ho + + + - - + + +LBc0120 Ho + + + - - + + +

Résultats

109

Tableau 15c: Caractéristiques physiologiques et biochimiques des BL isolées


9.6%NaCl

Pré-identification

LBc0121 Ho + + + - - + + +

Entérococcus

LBc0122 Ho + + + - - + + +LBc0123 Ho + + + - - + + +LBc0124 Ho + + + - - + + +LBc0125 Ho + + + - - + + +LBc0126 Ho + + + - - + + +LBc0127 Ho + + + - - + + +LBc0128 Ho + + + - - + + +LBc0129 Ho + + + - - + + +LBc0130 Ho + + + - - + + +LBc0131 Ho + + + - - + + +LBc0132 Ho + + + - - + + +LBc0133 Ho + + + - - + + +LBc0134 Ho + + + - - + + +LBc0137 Ho + + + - - + + +LBc0138 Ho + + + - - + + +LBc0139 Ho + + + - - + + +LBbb046 Ho + nd + + - + nd nd

Lactobacillus

LBbb074 Ho + nd + + + + nd ndLBbb075 Ho + nd + + - + nd ndLBbb094 Ho + nd + - - + nd ndLBbb0100 Ho + nd + - - + nd ndLBbb0101 Ho + nd + - - + nd ndLBbb0104 Ho + nd + - - + nd ndLBbb0106 Ho + nd + - - + nd ndLBbb0136 Ho + nd + - - + nd ndLBbb0141 Ho + + + + + + + +LBdc015 Ho + nd - + + nd nd -

Pediococcus

LBdc039 Ho + nd - + - nd nd -LBdc042 Ho + nd + + - nd nd -LBdc089 Ho + nd + - + nd nd -LBdc095 Ho + nd + - - nd nd -LBdc099 Ho + nd + - - nd nd -LBdc0135 Ho + nd - - - nd nd -LBdc0140 Ho + nd + + + nd nd -LBdc0102 Ho + nd + - - nd nd -LBdc0103 Ho + nd + - - nd nd -LBdc0105 Ho + nd + + - nd nd -LBdc0107 Ho + nd + - - nd nd -LBdc0108 Ho + nd + - - nd nd -LBdc0109 Ho + nd + - - nd nd -

Légendes: TF: type fermentaire, Ho: homofermentaire, Hé: hétérofermentaire, croissance à 10°C, 37°C° et45°C; croissance à 6.5% et 9.6% de NaCl; ADH: arginine dihydrolase; Cit: citrate; Acé: acétoine; +: réactionpositive ; -: réaction negative. LBc: bactéries lactiques de forme cocci; LBbb: bactéries lactiques de forme bacillebâtonnet; LBdc: bactéries lactiques de forme diplocoque.

Résultats

110

1.6. Fermentation des carbohydrates

L’identification phénotypique des différents isolats est basée principalement sur la réponseaux différents tests microbiologiques effectués. La pré-identification est complétée par l’étude despropriétés fermentaires des souches choisies pour ce travail.

Quatorze sucres sont employés (glucose, gluconate, xylose, fructose, mannane, mannitol,maltose, lactose, mélibiose, saccharose, tréhalose, manose, xylitol, palmitine, méthyl-D-glucose, N-acétylglucosamine, raffinose, et galactose) pour identifier les souches de bactéries lactiques encours de croissance.

Les trois groupes d'isolats ont été caractérisés selon les critères biochimiques etphysiologiques décrits dans la littérature (Sharpe, 1979; Kandler et Weiss, 1986; Schillinger etLücke, 1989; Montel et al., 1991; Samelis et al., 1994; Stiles et Holzapfel, 1997; Carr et al.,2002; Badis et al., 2004; Guessas et al., 2005; Guessas et al., 2007).

L’identification est faite en confrontant les profils obtenus avec ceux des souches deréférence trouvés dans la bibliographie et dans le manuel de Bergey (Lopez et Mayo, 1994;Mathara et al., 2004; Lee et al., 2006).

1.6. 1. Genre Enterococcus

117 souches possèdent les caractères suivants: ADH+, homofermentaires, et croissance enprésence de 6.5% de NaCl, à 45°C et à pH 9.6. Ce sont les propriétés typiques du genreEnterococcus. La croissance en présence de 6.5% NaCl, à 45°C et à pH 9.6 est un signecaractéristique du genre Enterococcus (Devriese et al., 1993; Devriese et Pot, 1995).

1.6. 2. Genre Pediococcus

14 espèces de Pediococcus ont été isolées. Elles forment des colonies lisses, arrondies,cendrées ou claires sur milieu M17. Ces 14 souches sont arginine+ et se développent à 45°C. Ellesne peuvent pas appartenir au genre Lactococcus, puisqu’elles sont capables de se développer à 45°Cet pas à 10°C, ni à Str. thermophilus (arg-).

Le genre auquel ces souches peuvent appartenir est le genre Pediococcus. Les pédiocoquessont aptes à se développer à 45°C (Garvie, 1984), en plus l’observation microscopique nous apermis d’observer que ces souches se présentent sous la forme de cellules sphérique associées entétrades, caractéristique des pédiocoques.

Pc. pentosaceus et Pc. acidilactici sont les principales espèces rencontrées dans le lait(Garvie, 1986). Les deux espèces possèdent une réponse différence quant à l’utilisation del’arginine. Le premier est arg-, quant à la deuxième elle est arg+.

Dans notre cas, les 14 souches peuvent être assignées à Pc. pentosaceus. En plus, elles sedéveloppent en présence de 6.5 % NaCl (Carr et al., 2002).

Résultats

111

Par contre, la différenciation par les caractères phénotypiques n’est pas très claire entre Pc.acidilactici et Pc. pentosaceus, mais l'étude de l'homologie ADN-ADN permet leur distinction(Garvie, 1986).

La différenciation entre les espèces de Pc. acidilactici et Pc. pentosaceus, sur la base de lafermentation des sucres est difficile, ces espèces ne sont pas clairement distinguées par leurscaractères phénotypiques, mais sont différenciées par l’homologie ADN-ADN (Garvie, 1986).Néanmoins la croissance à la température de 50°C est une caractéristique de Pc. acidilactici.

1.6. 3. Genre Lactobacillus

La forme bâtonnet observé au microscope, le type de coloration Gram+, la formeasporulante des bacilles, nous ont orientés pour classer 11 isolats dans le genre Lactobacillus.

Les lactobacilles sont catalase négatif mais ils peuvent produire une pseudocatalase quandle milieu contient une concentration élevée de glucose (Carr et al., 2002).

Sur la base des différentes températures de croissance, de l’hydrolyse de l’arginine et dutype fermentaire selon le substrat employé (glucose ou gluconate), le genre Lactobacillus estsubdivisé en trois groupes.

Les bactéries homofermentaires et mésophiles font partie du groupe Streptobacterium, leshomofermentaires et thermophiles celui de Thermobacterium alors que Betabacterium renferme leshétérofermentaires et mésophiles (Collins et al., 1987; Charterïs et al., 2001; Hammes et Hertel,2003).

La différenciation entre les différentes espèces du genre Lactobacillus réposeessentiellement sur leur difficulté de fermenter les carbohydrates (Kandler et Weiss, 1986, Stiles etHolzapfel, 1997; Carr et al., 2002).

Les 11 souches obtenues sont des lactobacilles hétérofermentaires, alors les isolats de cegroupe généralement fermentent les hexoses en lactate, en acétate et/ou en éthanol et CO2. Lb.buchneri fermente le mélézitose et le melibiose (Sharpe, 1962; Kandler et Weiss, 1986).

Lb. acidophilus fermente l’amygdaline et le cellobiose, et hydrolyse l’esculine (Rogosa etal., 1953; Sharpe, 1962; Johnson et al., 1980). Tandis que Lb. delbrueckii fermente l’amygdalineet le saccharose mais pas le tréhalose, la salicine, ou le cellobiose.

Lb. delbrueckii à la différence d'autres thermobactéries ne fermentent pas le lactose ou legalactose (Sharpe, 1962; Topley, 1982). Ce groupe comprend Lb. reuteri, Lb. brevis, et Lb.fermentum.

Lb. brevis ainsi que Lb. buchneri, Lb. fermentum et Lb. parabuchneri ont été isolés du laitet des produits laitiers (Dellaglio et al., 1994). Les espèces de lactobacilles hétérofermentaires,isolées dans les viandes et incapables de croître sur milieu acétate, ont été introduites dans le genreCarnobacterium (Collins et al., 1987).

Résultats

112

(A) (B)

Figure 07: Observation microscopique de Pc. pentosaceus (A) et Lb. plantarum (B) après coloration de Gram(X100)

Conclusion

Les résultats des tests physiologiques et biochimiques ont permis d’identifier les deuxsouches choisies comme étant des souches appartenant à l’espèce Lb. plantarum (LBbb014) et Pc.pentosaceus (LBdc0103).

La caractérisation des isolats obtenus par les méthodes classiques présente beaucoup dedifficultés car des différences significatives dans les profils de fermentation des sucres ont étéobservées. Par conséquent, l’identification génotypique est indispensable pour confirmer laclassification phénotypique.

1.7. Antibiogramme de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

Lb. plantarum montre une sensibilité remarquable contre nitroxiline, spiramycine,neumycine, et la spiromycine; mais Pc. pentosaceus à une résistance au pefloxacine, nitroxiline,acid pipemidic, neumycine, oxacycline, kanamycine, amoxicitine, et la gentamycine (Tab. 16).

La majorité des BL ont une résistance contre les antibiotiques. Cette résistance a étéintrinsèque et non transmissible (Klein et al., 1998; Salminen et al., 1998).

Cependant, certains BL ont des gènes d'antibiotiques codés sur le plasmide comme montréLb. fermentum, Lb. plantarum, et Lb. reuteri (Ishiwa et Iwata, 1980; Fons et al., 1997).

Selon Naghmouchi (2007), certaines souches de BL présentent des différences au niveaude leur sensibilité à différents antibiotiques, qui justifier la modification de la composition de leursmembranes cellulaires.

L'analyse de la composition de la membrane de ces souches montre un contenu plus élevéen acide gras saturés (C16 :0 et C18 :0) et un teneur plus faible en acides gras insaturés (C18 :2 etC22 :5) comme le cas de Cr. divergens M35 (Maisner-Patin et Richard, 1996).

La divergicine M35 (peptide antimicrobien produit par une souche d'origine marine de Cr.divergens M35 à une résistance aux plusieurs antibiotiques comme l'ampicilline (Duffes et al.,2000). Tetragenococcus halophilus a été très résistante à la streptomycine que l'acide nalidixic, co-trimazine, et co-listine (Pal et al., 2005).

Résultats

113

Ben Belgacem et al., (2010) a prouvé que tous les entérocoques (isolés à partir de laviande fermentée par une méthode artisanal Tunisien) avait résistant à la rifampicine,érythromycine, ciprofloxacine et levofloxacine, mais tous étaient susceptibles de l'ampicilline,pénicilline, gentamycine et vancomycine qui sont les antibiotiques appropriés médicalement pourtraiter les infections.

Résistance à la rifampicine, érythromycine, et les quinolones, semble être largementécartés parmi des enterocoques généralement trouvé en nourritures (Perez- Pulido et al., 2006; BenOmar et al., 2008; Barbosa et al., 2009).

Les rapports précédents suggèrent également que les quinolones montrent seulement uneffet faible aux entérocoques (Peters et al., 2003). Olukoya et al., (1993) montre que 80% desLactobacilles sont (Lb. plantarum, Lb. acidophilus) résistantes à cloxacilline; d'autres BL commeLb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Leuconostoc sp., montre une résistance à la vancomycine(Shalini et Rameshwar, 2005).

Tableau 16: Tests d'antibiogramme de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

Pc. pentosaceusLb. plantarumConcentration en

µg/mlBL isolées

S 10mmR30Ceftazidine

RR10Pefloxacin

RS 5mm30Nitroxiline

S 10mmS 2mm100Spiramycine

RR10Acid pipemidic

S 8mmR50Colistine

RS 2mm10Neumycine

S 30mmR10Penicilline

RR10Amoxicitine

RR10Gentamycine

RR10Oxacycline

RR30Kanamycine

S 13mmR1.25-23.7Sultamethoxazole

S 10mmS 4mm100Spiromycine

Légendes : R : souche résistante ; S : souche sensible ; diamètre de la zone d'inhibition en mm.

Résultats

114

Tableau 17: Caractéristiques biochimiques de Lb. plantarum et Pc. pentosaceusisolats Lb. plantarum (a) Pc. pentosaceus (d)Morphologie les colonies

sont circulaires, blancheset de taille 03mm.

Forme bâtonnet en chaînes

les coloniessont arrondies, clairs

et de taille 1-2mmForme cocci isolés

Gram + +Spores - -Catalase - -Mobilité - -RM + -Indole + -

La température decroissance °C

10 + -15 + nd30 + +37 + +45 + +

pH de croissance

3.5 - +4.5 + +5.5 + +6.5 + +7.5 + +8.5 + +9.5 - +

NaCl de croissance %4 + +6.5 + +10 + nd15 + -

CO2 à partir de glucose + -CO2 à partir de gluconate + -Dextrane - -Voges proskauer + +ADH + +Hydrolyse de caseine + +Urease - -Citratase + +Hemolyse (beta) + +Reductase + -Thermorésistance à 60°C/ 30min à45°C + +Type fermentaire hétérofermentation homofermentationFermentation de : glucose,Saccharose, et lactose. + +Lait sherman (BM 1%) à 42°C + +Lait sherman (BM 3%) à 42°C - -Citrate + +Fructose + +Mannane + +Maltose + +Trehalose + +Manose + +Xylitol + +

Résultats

115

Melibiose - +Palmitine - -Raffinose + +Xylose - +Méthyl-D-glucose + +Inositol + +Sorbitol + +N- Acétylglucosamine - +Mannitol + +Galactose + +

2. Production de substances antimicrobiennes

Ce chapitre traite les méthodes qui nous ont permis de mettre en évidence les interactionsen milieu solide et liquide contre les souches pathogènes et d’altération. La détermination de lanature de l’agent inhibiteur, du mode et du spectre d’action a été aussi recherchée.

2.1. Étude de spectre d’activité

Les travaux comprennent: le screening des souches productrices de substancesantibactériennes; la détermination de la nature de l’agent inhibiteur (acide organique, peroxyded’hydrogène, phage, et/ou bactériocine); l’étude du mode d’action de la bactériocine (bactéricide oubactériostatique); le spectre d’activité (sensibilité de souches bactériennes nuisibles telle que L.ivanovii).

Tous les isolats ont été testés pour leur spectre d’activité antibactérien contre plusieursgermes d’altération (L. ivanovii, Sl. typhimurium, S. aureus β-hιmolytique, Sl. Paratyphimurium B,Str. pyogenes, E. coli, Clostridium sp., Ps. aeruginosa, B. megaterium ID07817, et B. megateriumID07818).

La méthode de spot agar est utilisée pour la détection des inhibitions; elle se traduit par laformation d’un halo autour de la souche ensemencée en touche (Schillinger et Lücke, 1989).

La lecture des résultats consiste à mesurer le rayon de l’halo d’inhibition de la soucheindicatrice ensemencée en double couche au dessus des souches inhibitrices. L’ensemble desinteractions mises en jeu et des inhibitions mises en évidence sont rassemblés dans les tableaux 18a,18b, et 18c.

Nous remarquons que les lactobacilles possèdent un spectre d’action élevé, mais lespediocoques et les entérocoques ont un spectre d’action réduit. Elles ont inhibés un nombre desouches égale ou inférieure à 05 souches.

Résultats

116

Nous constatons que la souche Lb. plantarum est l’espèce la plus inhibitrice parmi leslactobacilles; elle est responsable de 09 inhibitions contre L. ivanovii, B. megaterium ID07817, B.megaterium ID07818, Sl. typhimurium, S. aureus β-hιmolytique, Sl. paratyphimurium B, Str.pyogenes, E. coli, Clostridium sp., et Ps. aeruginosa.

Pour les entérocoques, 110 souches montrent absence d’activité, seulement 07 souchessont été inhibées par Sl. para-typhimurium B et Str. pyogenes; même nous remarquant que lespediocoques ont un spectre d’action remarquable contre les bactéries pathogènes, c’est le cas de Pc.pentosaceus qui été inhibé par cinq souches: B. megaterium ID07817, B. megaterium ID07818, Sl.typhimurium, S. aureus β-hιmolytique, Sl. Paratyphimurium B, et Str. pyogenes.

Selon Parada et al., (2007), le spectre d’activité des bactériocines forment un groupehétérogène. Il y a deux types, l’un qui a seulement un spectre d'activité contre les espèceshomologues et le deuxième qui montre une action contre les microorganismes Gram-positives.

Des exemples de ce deuxième type est la pediocine produite par Pc. pentosaceus (DeVuyst, 1994; Moreno et al., 2006). La plantaricine 35d produite par Lb. plantarum est active contreAeromonas hydrophila (Messi et al., 2001).

Les bactériocines de BL exercent leur activité létale uniquement sur les bactéries à Grampositif en provoquant ou non leur lyse cellulaire. Le spectre d’activité est généralement plus largecontre Listeria, S. aureus, Clostridium sp., Bacillus sp., et Micrococcus sp (Vignolo, 2000;Duquesne et al., 2007; Jasniewski, 2008).

Cette résistance peut résulter probablement de modification de la composition de lamembrane bactérienne, la destruction moyenne de la bactériocine par les protéases ou les récepteursmodifiés (Martinez et De Martini, 2005).

Ce grand effet inhibiteur des lactobacilles peut avoir deux origines. La première est laproduction d’acide lactique et/ou acétique ; en effet, les lactobacilles sont connus pour une granderésistance aux pH acides (jusqu’a un pH voisin de 3.5) contrairement aux autres genres qui sontplus sensibles (Wong et Chen, 1988; Benthin et Villadsen, 1995; Podolak et al., 1996; Wilson etal., 2005).

Alors que la deuxième est que les lactobacilles produisent une autre substance inhibitriceactive sur de nombreuses espèces (Larsen et al., 1993; Avila et al., 2005) comme la bactériocineST151BR, qui est produite par Lb. pentosus ST151BR (Torodov et Dicks, 2004) et les deuxbactériocines ST28MS et ST26MS produisent par Lb. plantarum isolée a partir de mélasse(Torodov et Dicks, 2005).

Résultats

117

Conclusion

Parmi les 141 souches de bactéries lactiques, seulement deux souches présentent une forteactivité antibactérienne contre L. ivanovii avec une zone d’inhibition de plus de 10 mm. Cessouches appartiennent aux genres Lactobacillus et Pediococcus.

Figure 08: Activité antibactérienne des souches lactiques Lb. plantarum (a) et Pc. pentosaceus (b) vis-à-vis deL. ivanovii par la méthode de spot agar sur milieu MRS à 30°C.

Résultats

118

Tableau 18a: Spectre d'action des BL isolées contre les bactéries pathogènes et d'altération

BL

isolées

Sl.

S. aureus B-hém

olytique

Sl. paratyphiB Str. pyogenes

Ps.aerugenosa

E. coli

B.

megaterium

ID 07817

Clsp.

B.

megaterium

ID 07818

L. ivanoii

LBc01 - - - - - - - - - -LBc02 - - - - - - - - - -LBc03 - - - - - - - - - -LBc04 - - - - - - - - - -LBc05 - - - - - - - - - -LBc06 - - - - - - - - - -LBc07 - - - - - - - - - -LBc08 - - - - - - - - - -LBc09 - - - - - - - - - -LBc010 - - - - - - - - - -LBc011 - - - - - - - - - -LBc012 - - - - - - - - - -LBc013 - - - - - - - - - -LBc014 - - - - - - - - - -LBdc015 - - - - - - - - - -LBc016 - - - - - - - - - -LBc017 - - - - - - - - - -LBc018 - - - - - - - - - -LBc019 - - - - - - - - - -LBc020 - - - - - - - - - -LBc021 - - - - - - - - - -LBc022 - - - - - - - - - -LBc023 - - - - - - - - - -LBc024 - - - - - - - - - -LBc025 - - - - - - - - - -LBc026 - - - - - - - - - -LBc027 - - - - - - - - - -LBc028 - - - - - - - - - -LBc029 - - - - - - - - - -LBc030 - - - - - - - - - -LBc031 - - - - - - - - - -LBc032 - - - - - - - - - -LBc033 - - - - - - - - - -LBc034 - - - - - - - - - -LBc035 - - - - - - - - - -LBc036 - - - - - - - - - -LBc037 - - - - - - - - - -LBc038 - - - - - - - - - -LBdc039 - - - - - - - - - -LBc040 - - - - - - - - - -LBc041 - - - - - - - - - -LBdc042 - - - - - - - - - -LBc043 - - - - - - - - - -LBc044 - - - - - - - - - -LBc045 - - - - - - - - - -LBbb046 - - - - - - - - - -LBc047 - - - - - - - - - -

Résultats

119

Tableau 18b: Spectre d'action des BL isolées contre les bactéries pathogènes et d'altération

BL

isolées

Sl.

S. aureus B-hém

olytique

Sl. paratyphi B

Str. pyogenes

Ps. aerugenosa

E. coli

B. m

egateriumID

07817

Clsp.

B. m

egateriumID

07818

L. ivanoii

LBc048 - - - - - - - - - -LBc049 - - - - - - - - - -LBc050 - - - - - - - - - -LBc051 - - - - - - - - - -LBc520 - - - - - - - - - -LBc053 - - - - - - - - - -LBc054 - - - - - - - - - -LBc055 - - - - - - - - - -LBc056 - - - - - - - - - -LBc057 - - - - - - - - - -LBc058 - - - - - - - - - -LBc059 - - - - - - - - - -LBc060 - - - - - - - - - -LBc061 - - - - - - - - - -LBc062 - - - - - - - - - -LBc063 - - - - - - - - - -LBc064 - - - - - - - - - -LBc065 - - - - - - - - - -LBc066 - - - - - - - - - -LBc067 - - - - - - - - - -LBc068 - - - - - - - - - -LBc069 - - - - - - - - - -LBc070 - - - - - - - - - -LBc071 - - - - - - - - - -LBc072 - - - - - - - - - -LBc073 - - - - - - - - - -LBbb074 - - - - - - - - - -LBbb075 - - - - - - - - - -LBc076 - - - - - - - - - -LBc077 - - - - - - - - - -LBc078 - - - - - - - - - -LBc079 - - - - - - - - - -LBc080 - - - - - - - - - -LBc081 - - - - - - - - - -LBc082 - - - - - - - - - -LBc083 - - - - - - - - - -LBc084 - - - - - - - - - -LBc085 - - - - - - - - - -LBc086 - - - - - - - - - -LBc087 - - - - - - - - - -LBc088 - - - - - - - - - -LBdc089 - - - - + - + + + -LBc090 - - - - - - + - + -LBc091 - - - - - - + - + -LBc092 - - - - - - + - + -LBc093 - - - - - - + - + -LBbb094 - - - - - - + - + -LBdc095 - - - - - - + + + -

Résultats

120

Tableau 18c: Spectre d'action des BL isolées contre les bactéries pathogènes et d'altération

BL

isolées

Sl.

S. aureus B-hém

olytique

Sl .paratyphiB Str.pyogenes

Ps.aerugenosa

E. coli

B.

megaterium

ID 07817

Clsp.

B.

megaterium

ID 07818

L. ivanoii

LBbb096 + - - - - - + + + -LBc090 - - - - - - + - + -LBc098 - - - - - - + - + -LBdc099 + - - - - - + + - -LBbb0100 + - - - - - + + - -LBbb0101 + - - - - - + + - -LBdc0102 + - - - - - + + - -LBdc0103 + + - + - - + + + +LBbb0104 + - - - - - + + + -LBdc0105 + - - - - - + + + -LBbb0106 - - - - - - + - + -LBdc0107 + - - - - - + + + -LBdc0108 + - - - - - + + + -LBdc0109 + - - - - - + + - -LBc0110 - - - - - - + + - -LBc0111 - - - - - - - - - -LBc0112 - - - - - - - - - -LBc0113 - - - - - - - - - -LBc0114 - - - - - - - - - -LBc0115 - - - - - - - - - -LBc0116 - - - - - - - - - -LBc0117 - - - - - - - - - -LBc0118 - - - - - - - - - -LBc0119 - - - - - - - - - -LBc0120 - - - - - - - - - -LBc0121 - - - - - - - - - -LBc0122 - - - - - - - - - -LBc0123 - - - - - - - - - -LBc0124 - - - - - - - - - -LBc0125 - - - - - - - - - -LBc0126 - - - - - - - - - -LBc0127 - - - - - - - - - -LBc0128 - - - - - - - - - -LBc0129 - - - - - - - - - -LBc0130 - - - - - - - - - -LBc0131 - - - - - - - - - -LBc0132 - - - - - - - - - -LBc0133 - - - - - - - - - -LBc0134 - - - - - - - - - -LBdc0135 - - - - - - - - - -LBbb0136 - - - - - - - - - -LBc0137 - - - - - - - - - -LBc0138 - - - - - - - - - -LBc0139 - - - - - - - - - -LBdc0140 - - - - - - - - - -LBbb0141 + + + + + + + + + +

Légendes: +: présence d’activité, la zone d'inhibition (0-14); -: absence d’activité.

Résultats

121

2.2. Nature de l’agent inhibiteur

La présence d’une inhibition n’est pas due uniquement à la production de bactériocines.Cette inhibition peut avoir plusieurs origines parmi lesquelles, nous pouvons mentionner laproduction d’acides organiques, de peroxyde d’hydrogène, de phages et/ou de bactériocines(Moreno et al., 2000a; Navarro et al., 2000; Rodriguez et al., 2002; Maldonado et al., 2003;Todorov et Dicks, 2005; Guessas et al., 2005).

Pour notre travail, nous devons nous assurer la nature exacte de l’agent inhibiteur. Pourcela, des tests s’avèrent nécessaires. Ceci nous permettra de s’assurer et aussi de vérifier si lesinhibitions que nous avons obtenues sont dues ou non a l’action de substances antibactériennes typebactériocine.

Il s’avère tout d'abord de soulever le problème complexe de la définition de ces substances.En effet, les bactériocines des bactéries Gram- et Gram+, représentent un groupe hétérogène desubstances antibactériennes dont le poids moléculaire, les propriétés biochimiques, le spectred'activité et le mode d'action peuvent être très différents (Piard et Desmazeaud, 1991; Ray etDaeschel, 1994; Parente et Ricciardi, 1999; Riley et Wertz, 2002; Aslim et al., 2005; Deegan etal., 2006).

Trois critères sont indispensables pour qu'une substance antibactérienne soit définie en tantque bactériocine (Klaenhammer, 1988).

1. La présence d'une partie biologiquement active de nature protéique ;

2. Un spectre d'activité limité aux espèces taxonomiquement proches, ou occupant la mêmeniche écologique ;

3. Un mode d'action bactéricide.

Les résultats obtenus à la suite des différents tests sur milieu solide et liquide nouspermettant d’affirmer ou d’infirmer si les substances antimicrobiennes que nous avons déceléesrependent à cette définition.

2.3. Inhibition due à la production de bactériocine

Comme les bactériocines sont de nature protéique, les réponses obtenues après l’action desenzymes protéolytiques (pepsine, trypsine et papaïne) et non protéolytiques (lipase et α-amylase)nous permettra d’identifier les substances antibactériennes comme étant des bactériocines.

La nature protéique des bactériocines semble être le seul critère immuable. Cela estgénéralement démontré par l'inactivation de celles-ci par un traitement avec des protéases.

Toutefois, la bactériocine peut prendre la forme d'un complexe hétérogène incluant desgroupements lipidiques ou saccharidiques (Jimenez-Diaz et al., 1993) ou d'une combinaison deprotéines ou peptides distincts (Nissen-Meyer et al., 1992).

Résultats

122

En définitive, deux définitions sont actuellement admises:

1. Selon Konisky (1982), les bactériocines ont une nature protéique et sont inactives vis-à-vis des bactéries qui les produisent (il ne s'agit donc pas de "substances suicides").

2. Selon Klaenhammer (1988), les bactériocines ont une nature protéique, un spectred'activité limité aux espèces taxonomiquement proches, ou occupant la même nicheécologique, et un mode d'action bactéricide.

2.3.1. En milieu solide

Si l’halo d’inhibition disparait en présence de l’action d’une enzyme protéolytique, l’agentinhibiteur est de nature protéique (Callewaert et De vuyst, 2000; Aslim et al., 2005).

Mais s’il persiste après l’action des trois enzymes utilisées, il y a une forte probabilité pourque l’agent ne soit pas de nature protéique c'est-à-dire une bactériocine.

Puisque les bactériocines sont par définition des substances protéiniques, elles doivent êtresensibles au moins à une protéase (Allison et al., 1994) ou sont des composés de protéines avec deslipides ou moitiés de glucides (Lewus et al., 1992). En conséquence, la sensibilité aux enzymesprotéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation.

La perte de l'activité antimicrobienne après traitement avec des enzymes indique lasensibilité des composés actifs sécrétés par les souches mises en culture. Puisque les bactériocinessont par définition des substances protéiques, elles doivent être sensibles à au moins à une enzyme.

En conséquence, la sensibilité aux enzymes protéolytiques est le critère principal dans leurcaractérisation (Deraz et al., 2005; Todorov et Dicks, 2005; Parada et al., 2007).

Cependant, plusieurs facteurs peuvent avoir un effet sur l'activité antimicrobiennecomprenant l'interaction entre la bactériocine et les constituants des cellules ou du milieu decroissance, de la pureté et de la concentration de l'enzyme et de la technique employée pourdéterminer la sensibilité enzymatique (Nes et al., 1996).

2.3.2. En milieu liquide

La recherche des inhibitions a été entamée également en milieu liquide. Cet agentdiffusible devrait être retrouvé dans le filtrat de la souche productrice. Le but principal est deconnaitre la nature de l’agent inhibiteur.

La souche indicatrice est mise à croître dans 10 ml de milieu liquide auquel sont ajoutés10% de filtrat. La croissance de la bactérie est suivie par la mesure de la Do, ceci nous permettra deconnaître si les résultats que nous avons observés sur milieu solide se confirment ou non en milieuliquide.

Résultats

123

Les résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibition en comparaison avec la soucheindicatrice inoculée dans du MRS liquide non traité. Pour tous les temps d’incubation (0 h à 12 h),le calcul du pourcentage se fait selon la formule suivante :

Pourcentage

xn: Do de souche indicatrice inoculée dans du MRS liquide non traité, xt: Do de soucheindicatrice inoculée dans du MRS liquide traité.

Plusieurs auteurs ont relevé la différence entre les résultats obtenus sur milieu solide etmilieu liquide. Dans la majorité des cas, l’inhibition est perdue en milieu liquide et ceci peut être dûà plusieurs facteurs.

L’absence d’une activité inhibitrice des filtrats peut être due soit à une trop faibleconcentration de la substance inhibitrice, soit à la perte de l’activité après filtration (Geis, 1989).

Les deux bactériocines produisent par Lb. plantarum et Pc. pentosaceus sont inactivées partoutes les enzymes protéolytiques et non protéolytiques testées: pepsine, trypsine, papaïne, lipase, etα-amylase. Ce la peut s’expliquer par l’existence de complexes protéiques hétérogènes (Gould,1991; Herrerosa et al., 2005) pouvant regrouper des fonctions lipidiques et/ou glucidiques qui est àl'origine de l'effet anti- L. ivanovii observé (Fig. 09).

Figure 09: Evolution du nombre de L. ivanovii par la Do. 600nm après l’hydrolyse enzymatique de lasubstance antibactérienne de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus. (SD ≤ 5%),

Contrôle (sans bactériocine) ; Filtrat de Lb. plantarum ; Filtrat de Pc. pentosaceus.

Résultats

124

3. Cinétique de croissance, la production de la bactériocine, et le mode d’action

3.1. Cinétique de croissance et la production de la bactériocine

Les bactériocines sont généralement produites à la fin de la phase exponentielles et audébut de la phase stationnaire de croissance (Kouakou et Thonart, 2011).

Elles peuvent ensuite être dégradées par les protéases produites par la bactérie lactiqueproductrice ou être adsorbées à sa surface, ce qui mène à la baisse de la concentration debactériocines dans la culture (Savijoki et al., 2006).

Les facteurs influençant la production de bactériocines sont principalement la soucheproductrice, la température, le pH, la composition du milieu et la technologie de fermentationemployée.

Les figures 10A et 10B montre la cinétique de croissance et la production de la substanceprotéique de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus. La souche indicatrice employée est L. ivanovii,l’agent inhibiteur devient détectable par la méthode de la Do.

La production de ces deux bactériocines commence dés le début de la phase logarithmiquede croissance (après 2 h à 4 h), et atteint son maximum au début de la phase stationnaire (laréduction de la croissance de L. ivanovii inférieur de Do. 0.2), une diminution de l’activitéantimicrobienne est observée après 12 h d’incubation, ce qui pourrait être expliqué par la fixation dela bactériocine à l’organisme producteur.

Résultats

125

Figure 10: La cinétique de croissance et de la production de la bactériocine de Lb. plantarum (A) et Pc.Pentosaceus (B) sur le milieu MRSm à 30°C.

Lb. plantarum ; L. ivanovii ; Filtrat de Lb. plantarum + L. ivanovii ; Pc. pentosaceus ; Filtrat de Pc. pentosaceus + L. ivanovii

Résultats

126

3.2. Mode d’action

Selon la définition des bactériocines, le mode d'action des bactériocines est de typebactéricide. Le but de l'étude réalisée est de voir si la substance antibactérienne produite par lesdeux souches (Lb. plantarum et Pc. pentosaceus) a effectivement un effet bactéricide ousimplement un effet bactériostatique.

3.2.1. Le filtrat de Lb. plantarum

Lb. plantarum est ensemencée dans du MRSm liquide additionné du filtrat (20%) de l’unedes deux souches. L'évolution de la croissance est suivie par la mesure de la Do au cours du temps.Une stabilité de la concentration en bactéries viables démontre un effet bactériostatique; alorsqu’une diminution de cette concentration indique un effet bactéricide (Klaenhammer, 1988).

Après seulement 04 heure d'incubation, une très nette diminution de la concentration de lasouche indicatrice (L. ivanovii) est observée, qui initialement d’une Do de 0.3 passe à 0.2 (Fig.10A).

Au bout de 10 heures d'incubation, cette concentration est de 0.1. La substanceantibactérienne produite par Lb. plantarum présente donc un mode d'action de type bactéricide etcet effet bactéricide est relativement rapide.

La stabilisation de la population résiduelle de la souche indicatrice après 12 h d'incubations'explique sans doute par le fait que les cellules bactériennes présentent des lésions occasionnéespar le contact avec la substance antibactérienne les empêchant ainsi de se diviser (Bhunia et al.,1991).

La rapidité de l'effet bactéricide est une particularité de la majorité des bactériocines. AinsiLb. acidophilus N2, Lc. lactis CNRZ 481 et Pc. acidilactici H produisent respectivement lalactacine B (Barefoot et Klaenhammer, 1983), la lacticine 481 (Piard et al., 1990) et la pédiocineAcH (Bhunia et al., 1991) montrent un effet létal rapide.

Le fait que la population restante de la souche indicatrice arrive à se multiplier après l'effetdu facteur inhibiteur montre bien que ce dernier agit selon un dispositif en "single-hit" décrit parTagg et al. (1976) pour les bactériocines.

Les résultats obtenus montrent donc que le filtrat de Lb. plantarum contient bien unesubstance de nature bactéricide active contre plusieurs souches. En effet, l'effet bactéricide desbactériocines est généralement rapide.

Résultats

127

3.2.2. Le filtrat de Pc. pentosaceus

La substance produite par Pc. pentosaceus semble donc exercer un effet bactéricide, parcontre la pédiocine N5p (Pc. pentosaceus N5p) exerce un effet identique à celui de la substanceantibactérienne produite par Ln. mesenteroides subsp. dextranicum LNM01: stabilisation du nombrede bactéries sensibles pendant 12 h puis apparition d'un effet bactéricide progressif (Saidi et al.,2007).

L'inoculation de L. ivanovii dans le filtrat de Pc. pentosaceus entraîne une forte baisse de lapopulation bactérienne (Fig. 10B). Bien qu'une réduction de la population de la bactérie indicatricesoit notée à partir d’une 04 heure d'incubation, l'action bactéricide se poursuit jusqu'à 6 hd'incubation, la population résiduelle de L. ivanovii reste stable pendant une durée de 12 h. C’estparce que les cellules bactériennes ayant survécu à l'action de la bactériocine sont pour la plupartendommagées et ne peuvent par conséquent se multiplier rapidement (Bhunia et al., 1991).

La présence d’un système de perception chez la bactérie productrice va déclencherl’expression des gènes codants la protéine de sonde et le régulateur de réponse (Nes et Eijsink,1999; Miller et Bassler, 2001).

Cette induction provoque un signal qui va déclencher le début de la biosynthèse de labactériocine (Chandrapati et O´Sullivan, 2002). Après 10 heures d'incubation 85% de la quantitétotale de la bactériocine est produite.

Les 15% restants sont produits durant la phase stationnaire de croissance. La majorité de labactériocine est produite durant la phase exponentielle. Nos résultats rejoignent ceux trouvés dans lalittérature (De vuyst et Vandamme, 1992; De vuyst et al., 1996; Parente et al., 1997; Lejeune etal., 1998; Zamfir et al., 2000 ; Achemchem et al., 2004 ; Saidi et al., 2007).

Conclusion

Les substances antimicrobiennes produites par les deux souches bactériennes isolées desdifférents produits laitiers répondent aux critères retenus par Klaenhammer, (1988) et peuventdonc être considérées comme des bactériocines.

Tous les tests que nous avons effectuent pour la détermination de la nature de l’agentinhibiteur démontrent que Lb. plantarum et Pc. pentosaceus produisant une substanceantimicrobienne qui répond à la définition de Klaenhammer, (1988).

C’est une substance sensible a l’action des enzymes testées, possède un spectre d’actionqui comprend les bactéries Gram+, son mode d’action est bactéricide, l’inhibition est maintenue enmilieu liquide.

Lors de la caractérisation des bactériocines, des variations importantes dans les spectresd'activité sont constatées. Il est également noté que la sensibilité d'une souche dépend du genre, del'espèce et même de la sous-espèce.

Résultats

128

Ces variations de sensibilité sont dues aux caractéristiques des souches (présence ouabsence de sites récepteurs) et donc aux niveaux de lésions occasionnées par le facteur inhibiteur(Kalchayanand et al., 1992).

Certaines bactériocines dont l'effet est bactéricide dans un milieu de culture de laboratoirepeuvent montrer une action bactériostatique dans des milieux moins favorables à leur activité,comme c'est le cas dans les aliments (Pucci et al., 1988; Berry et al., 1990; Schillinger et al.,1991).

Par ailleurs, le spectre d'activité des bactériocines peut ne pas être restreint aux espècesproches taxonomiquement ou même occupantes la même niche écologique que la bactérieproductrice.

D'un point de vue pratique, le champ d'activité d'une bactériocine peut être plus ou moinslarge suivant les conditions du milieu et la concentration en substance active (Klaenhammer,1993).

La nature protéique des bactériocines semble être le seul critère immuable. Cela estgénéralement démontré par l'inactivation de celles-ci par un traitement avec des protéases.Toutefois, la bactériocine peut prendre la forme d'un complexe hétérogène incluant desgroupements lipidiques ou saccharidiques (Jimenez-Diaz et al., 1993) ou d'une combinaison deprotéines ou peptides distincts (Nissen-Meyer et al., 1992).

L'utilisation de bactéries productrices de bactériocines dans les levains pour le contrôle insitu des microorganismes pathogènes des produits laitiers et alimentaires est une des manièrespossibles d'améliorer la sécurité des aliments (Kim, 1993; Holzapfel et al., 1995; Stiles, 1996;Caplice et Fitzgerald, 1999; Hugas, 1999).

Ces substances antimicrobiennes, bactériocines sont un les plus prometteurs deconservateurs normaux produits par les bactéries lactiques (Daeschel, 1993; De vuyst etVandamme, 1994; Ray et Daeschel, 1994; Ruiz-Barba et al., 1994; Mc Mullen et Stiles, 1996).Récemment, l'utilisation de souches de Lactococcus bactériogéniques dans la production de salamiet de saucisse a été développée avec succès (Coffey et al., 1998; Scannell et al., 2001).

Résultats

129

4. Optimisation des conditions de production de bactériocine

Différents facteurs physico-chimiques modifient la production et l’activité antibactériennedes bactériocines du BL. La lecture des résultats consiste à mesurer le rayon de l’halo d’inhibitionde la souche indicatrice ensemencée en double couche au dessus des souches inhibitrices.

4. 1. Effet des facteurs exogènes (milieu de culture, pH initial, et la températured'incubation)

Trois milieux de culture sont examinés (MRS agar, BHI agar, et M17 agar). Les résultatsobtenus montrent que les deux bactériocines étudiées présentent une meilleure activitéantibactérienne contre L. ivanovii avec une zone d’inhibition de 2 à 10 mm par l'utilisation de MRSagar à pH 7.5 et 30°C. Mais aucune activité n’a été détectée avec les deux milieux de cultureemployés (Tab. 19).

Différentes valeurs du pH s'étendant de 3.5 à 9.5 ont été employées pour examiner laproduction des bactériocines par les deux souches tests.

Les résultats ont prouvé que la production optimale de la bactériocine par les deux souchesa été enregistrée dans MRS agar avec un pH initial de 7.5 où le pH final de la culture a atteint de4.73 à 5.23 respectivement (Tab. 20).

En général, les niveaux bas de l'activité de la bactériocine (45 à 65% de réduction decroissance) contre L. ivanovii ont été enregistrés quand les deux souches de BL ont été cultivéesdans MRS agar avec un pH initial de 3.5, 6.5, et 9.5.

La température et la période d'incubation sont des facteurs essentiels cela moduler lacroissance de BL et affecter de manière significative les quantité des métabolites produites (Dalié etal., 2010). Selon (Kaiser et al., 1993; Vignolo et al., 1995; Arihara et al., 1996; Coventry et al.,1996a) l’activité antibactérienne est limitée par la diffusion des bactériocines.

Tableau 19: Effet des milieux de culture (MRS, M17, et BHI agar) et la température d'incubation surla production de la bactériocine de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

BL isolées30°C 37°C 45°C

MRS M17 BHI MRS M17 BHI MRS M17 BHI

Lb. plantarum 10±1mm* - - - - - - - -

Pc. pentosaceus 2±0.5mm - - - - - - - -

*: Le diamètre de la zone d'inhibition en mm. (-) absence d’activité inhibitrice.± : Standard déviations (n=2).

Résultats

130

Certains auteurs ont mis en évidence plusieurs facteurs influençant cette diffusion: laconcentration en agar dans les milieux de détection est souvent diminuée pour permettre unemeilleure diffusion; ainsi de 15 g/l initialement, ou de 07 g/l ou de 06 g/l.

La durée de diffusion à 4°C joue également un rôle important bien que non généralisable.Elle peut être d’une heure (Joosten et al., 1996), de 2 h (Parente et al., 1992), de 6 h (Huot et al.,1996), d’une nuit (Kaiser et al., 1993), de 18 h (Baker et al., 1996) ou être nulle (Vignolo et al.,1995; Arihara et al., 1996).

Le Tween 80 est aussi parfois ajouté au milieu gélosé (0.1%, v/v) afin d’accroître ladiffusion de l’agent antibactérien (Joosten et al., 1996). L’influence de cinq facteurs (pH,inoculum, NaCl, agar et l’huile de soja) sur la diffusion de quatre bactériocines (sakacine A,sakacine B, pédiocine PA-1 et piscicoline 61) a été mesurée (Blom et al., 1997).

D’une manière générale, tous les éléments capables d’adsorber ou d’agréger lesbactériocines diminuent leur diffusion et donc leur efficacité. Le pH joue un rôle important dansl’activité des bactériocines de plusieurs manières.

Il modifie la solubilité de la bactériocine: la nisine est quasi insoluble à pH neutre oualcalin. De plus, le pH modifie la stabilité de la bactériocine, notamment lors d’un choc thermique(Liu et al., 1990).

Tableau 20: Effet du pH initial du milieu de culture (MRS agar) sur la production de la bactériocinede Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

BL isolées pH3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5

Lb. plantarum 2±0.5mm* - - 4±1mm 14±2mm - 4±0.5mm

Pc.pentosaceus - - - 1±0.5mm 10±0.5mm - -


Enfin, l’activité antibactérienne des « pediocin-like » est augmentée à une valeur de pHacide (inférieure ou égale à 5.0) comparativement à celle observée à pH 7.0 (Chen et al., 1997a;Chen et al., 1997b). En revanche, la bavaricine MN présente une activité optimale à un pH de 6.0(Kaiser et al., 1993).

D’une manière générale, les bactériocines de bactéries lactiques possèdent de nombreuxrésidus d’acides aminés chargés sur lesquels le pH du milieu peut avoir une grande incidence. Ceciexplique les différences d’activité observes en fonction de l’acidité.

Résultats

131

4.2. Sources de carbone et sources d'azote

4.2.1. Sources de carbone

Pour optimiser le rôle de MRS comme meilleur milieu pour l'activité de la bactériocine, lemilieu a été complété avec plusieurs sources de carbone telles que le lactose, le fructose, le maltose,le saccharose, et le galactose qui a remplacé le glucose.

Le milieu modifié (MRSm) a été employé dans les expériences à suivre. Généralement, lesmeilleurs résultats correspondant à l'effet inhibiteur le plus élevé sur L. ivanovii ont été obtenus enMRSm agar contenant le glucose 0.2% pour Lb. plantarum après 18 heures d'incubation à 30°C,suivies du maltose 0.4% (après 18 heures d'incubation) pour Pc. pentosaceus (Tab. 21).

Tableau 21: Effet de sources de carbone (glucose, fructose, saccharose, galactose, maltose, etlactose) sur la production de la bactériocine de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

Carbohydrates Glucose Fructose Lactose Maltose Saccharose Galactose

Lb. plantarum 20±0.5mm* - 10 ±0.5mm - - -

Pc. pentosaceus 4 ±0.5mm - - 20±0.5mm - -


4.2.2. Sources d'azote

Afin de favoriser la production de la bactériocine et l'activité antimicrobienne, quatorzesources d'azote ont été appliquées individuellement au milieu de croissance dans les concentrationséquivalentes à celle dans MRS agar.

Les résultats illustrés sur le tableau 22 ont prouvé que l'effet inhibiteur le plus élevé a étéobtenus en MRS agar complété avec acide glutamique (0.4%), et l'acétate d’ammonium (0.4%)pour Lb. plantarum après 18 heures d'incubation à 30oC.

Pour ce qui concerne le niveau d'activité des deux bactériocines produites par les deuxsouches de BL, il a été fortement influencé par la source d'azote combinée avec MRS. Mais aucuneactivité n’a été détectée avec les autres sources d’azote employé.

D’autres résultats sont obtenues par (Ogunbanwo et al., 2003) sur Lb. brevis OG1, quidonne une quantité importante de la bactériocine en présence de l’extrait de levure 3%, NaCl 1-2%,glucose 1%, et tween 80 0.5; mais l’addition de l’acétate de sodium, sulphate de magnesium,sulphate de manganèse, et phosphate de potassium réduit la production. Les même résultats sontobtenues par la mésenterocine 5 (Daba et al., 1993), la pediocine ACH (Biswas et al., 1991).

Résultats

132

Tableau 22: Effet de sources d'azote sur la production de la bactériocine par L. plantarum et Pc.pentosaceus

Lb. plantarum Pc. pentosaceusContrôle: MRS agar 10± 1mm* 4± 0.5mm*Tryptone - -Extrait de viande - -Extrait de levure - -Arginine - -Acide ascorbique - -Acide glutamique 08± 0.5mm -Valine - -Alanine - -Nitrate d’ammonium - -Sulfate d’ammonium + -Chloride d’ammonium - -Acitate d’ammonium 07± 0.5mm -Nitrate de sodium - -


Différentes expériences ont été conçues pour atteindre les meilleures conditions culturellesdisponibles qui pourraient aider dans la production des bactériocines, avec les moindres coûtséconomiques possibles et avec les méthodes les plus simples disponibles.

Car les grandes quantités de bactériocine sont nécessaires pour examiner leur efficacitépréservative dans les environnements normaux. Des conditions environnementales spécifiques, ycompris ceux trouvées en nourriture, ont été étudiées par Leroy et De Vuyst, (2003) et Mota etBradelli, (2003) pour déterminer leur effet sur la production des bactériocines.

Selon Leal Sánchez et al., (2002) et Khalil et al., (2009) changements de production debactériocine nettement lors du changement des conditions environnementales et de la productionoptima peuvent exiger une combinaison spécifique des paramètres environnementaux.

La production de la bactériocine est habituellement associée à la cinétique de métabolitesprimaires (De Vuyst et al., 1996; Moretro et al., 2000; Cladera-Olivera et al., 2004).

Cependant, leur production est enregistrée comme métabolite secondaire pour Lb.plantarum LPCO10 (Jiménez-Díaz et al., 1993), B. licheniformis 26 L-10/ 3RA (Pattnaik et al.,2001), Lc. lactis sub sp. Lactis (Cheigh et al., 2002), Lb. pentosus B96 (Delgado et al., 2005), etVibrio mediterranei 1 (Carraturo et al., 2006).

Résultats

133

4.2.3. La production d’acide lactique

Le suivi du pH et de l’acidité montre une diminution progressive du pH pour les deuxsouches isolées. La souche Lb. plantarum s’avère la plus performante par rapport Pc. pentosaceusavec 50°D d’acide lactique par 1000 ml de milieu de culture (Tab. 23).

L’abaissement du pH dans le milieu MRS liquide signifie que chacune des deux soucheslactiques possède un effet acidifiant, en produisant des acides organiques, les principaux facteursd’inhibition. La comparaison entre les résultats du pH et celui de l’acidité montre que le tauxd’acidité augmente avec la diminution du pH (Labioui et al., 2005).

Tableau 23: Diminution du pH par les deux souches lactiques cultivées (Lb. plantarum et Pc.pentosaceus) dans le bouillon approprié (MRS liquide) pendant 72 h à 30°C àl’obscurité

Souches de BL pH initial pH final Taux d’acidité °Dorning

Lb. plantarum 7.5 4.73± 0.80 48 ± 0.5

Pc. pentosaceus 7.5 5.92± 0.94 50 ± 0.5

± : Standard déviations (n=2).

5. Caractérisation physique et biochimique des bactériocines

5.1. Résistance thermique et l'effet de sensibilité du pH

La stabilité thermique de bactériocine a été évaluée en exposant le filtrat aux différentestempératures s'étendant de 0°C à 121°C pendant 15 minutes avant d'être examiné pour leur activitéantimicrobienne.

L'effet de la chaleur sur l'activité de bactériocine a été déterminé en utilisant L. ivanoviicomme souche indicatrice. Le composé inhibiteur produit par les deux isolats de BL a été considérécomme thermostable. L'activité reste constante après chauffage à 121ºC pendant 15 minutes (Fig.11).

Résultats

134

Figure 11: Effet de la température sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc. pentosaceus (SD ≤5%)

Contrôle (sans bactériocine) ; Filtrat de Lb. plantarum ; Filtrat de Pc. pentosaceus.

L'effet du pH sur l'activité des bactériocines brutes a été examiné en ajustant le filtrat surdes valeurs du pH de 2 à 12 et les échantillons ont été examinés pour l'activité antimicrobienne enmesurant la densité optique.

On observe que les deux bactériocines produite par Lb. plantarum et Pc. pentosaceusétaient stable à pH 2 à 12 après 24 heures d'exposition (Fig. 12).

Figure 12: Effet de pH sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc. pentosaceus (SD ≤ 5%)Contrôle (sans bactériocine); Filtrat de Lb. plantarum; Filtrat de Pc. pentosaceus.

Résultats

135

Les résultats ont prouvé que les bactériocines sont des peptides antibactériens qui ont unoptimum de stabilité, de solubilité et d'activité à pH acide (Klaenhamner, 1988).

Elles sont inactivées par les protéases et sont thermostables (Parada et al., 2007). Ellessont généralement thermorésistantes et supportent de grands écarts de pH (2 à 10) mais sontsensibles à l'action de la plupart des protéases.

Puisqu'elles agissent sur la membrane cellulaire, les bactériocines ne sont généralementactives que contre les bactéries à Gram positif.

Cependant, en situation de stress (pH bas, stress au froid ou à la chaleur, présence dechélateurs, absence d'ions métalliques, stress au sel...), certaines bactéries à gram négatif sontsensibles à l'action de certaines bactériocines (Labioui et al., 2010).

5.2. Stabilité pendant le stockage

La température de stockage pourra également réduire l’activité des bactériocines, qui varieen fonction de la température (Gálvez et al., 2007). L'effet du temps et de la température dustockage sur l'activité de bactériocines a été également effectué.

Les deux bactériocines ont maintenu une stabilité élevée et ont montré des valeurs élevéesde la réduction (s'étendant de 50 à 84%) à la croissance de L. ivanovii après 30 jours de stockage à+4ºC et -20°C (Tab. 24a et 24b).

Exposer de la bactériocine à de plus longues périodes de stockage (45 jours) a eu commeconséquence la diminution de l'activité de bactériocine (au moins par 10 à 20%); cependantl'activité a été presque maintenue jusqu'à pendant 90 jours de stockage.

Tableau 24a: Effet de température de stockage (+4°C) sur le pouvoir bactériocinogène de Lb.plantarum et de Pc. pentosaceus

Temps de stockage(Jours) Bactériocine de Pc. pentosaceus Bactériocine de Lb.

plantarum

15 80 ± 0.1 84 ± 0.2

30 80 ± 0.2 84 ± 0.2

45 78 ± 0.2 80 ± 0.1

60 70 ± 0.1 72 ± 0.2

90 56 ± 0.1 72 ± 0.1

*Les résultats sont exprimés par le % d’inhibition ± standard déviations (n=2). *(%) la réduction de croissance de la souche indicatrice.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Potentiel_hydrog%C3%A8ne

http://fr.wikipedia.org/wiki/Peptidase

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gram_positif

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gram_n%C3%A9gatif

Résultats

136

Tableau 24b: Effet de température de stockage (-20°C) sur le pouvoir bactériocinogène de Lb.plantarum et de Pc. pentosaceus

Temps de stockage(Jours) Bactériocine de Pc. pentosaceus Bactériocine de Lb.

plantarum

15 50 ± 0.2 80 ± 0.2

30 50 ± 0.2 75 ± 0.3

45 55 ± 0.3 70 ± 0.2

60 48 ± 0.4 72 ± 0.2

90 46 ± 0.4 72 ± 0.3


5.3. Effet des UV

La bactériocine produite par Lb. plantarum reste stable après exposer à l’UV pendant 75minutes ou l’inhibition est 32.63% à 40%; cependant, la bactériocine produisait par Pc. pentosaceusa été complètement détruite après 15 minutes (l’inhibition 04.24% - 04.96%) (Tab.25).

Tableau 25: Effet des UV sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc. pentosaceus.

Temps d’exposition(min) Bactériocine de Pc. pentosaceus Bactériocine de Lb.

plantarum

15 4.60 ± 0.2 33.08 ± 0.3

30 4.96 ± 0.2 32.72 ± 0.2

45 4.64 ± 0.4 32.63 ± 0.3

60 4.64 ± 0.3 40.00 ± 0.5

75 4.24 ± 0.2 35.89 ± 0.4


Les résultats pourrait être due à l'effet des UV sur la nature protéique de la substanceinhibitrice causant la modification et/ou changer dans la structure d'anneau des peptides, ouaffectant la fonction de la protéine (Ogunbanwo et al., 2003a).

Résultats

137

5.4. Effet des solvants organiques sur l'activité de la bactériocine

On observé que les meilleurs solvants organiques pour l'activité de la bactériocine de Lb.plantarum ont produit par l'hexane (> 50%) suivi de l'acétone et l'alcool 90%, où l'activité était(33%, 25%) respectivement.

Pour ce qui concerne Pc. pentosaceus, l'activité de la bactériocine reste stable en présencede l'hexane, l'acétone, et l'alcool 90% mais aucune activité n'a été détectée en appliquant lechloroforme (Fig. 13).

Figure 13: Effet des solvants organiques sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et de Pc. pentosaceus(SD ≤ 5%)

Contrôle (sans bactériocine); Filtrat de Lb. plantarum; Filtrat de Pc. pentosaceus

5.5. Effet des sels inorganiques

Différentes concentrations de NaCl et KCl ont été choisies pour examiner l'effet des selsinorganiques sur l'activité du filtrat de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus après 2 heures d'exposition.

Il y avait une augmentation d'activité de la bactériocine avec l'augmentation de laconcentration du NaCl jusqu’à 3%. Cependant l'activité a diminué de manière significative enprésence du 5% NaCl (Tab. 25).

On a observé la tendance plus ou moins semblable en traitant le filtrat avec différentesconcentrations en KCl. Les bactériocines Lb. plantarum et Pc. pentosaceus ont montré l'activité laplus élevée en présence du KCl 1 à 3% (96.7- 93.6%, et 92.2- 91.5% respectivement) contre L.ivanovii.

Résultats

138

Tableau 26: Effet des sels inorganiques (NaCl et KCl) sur le pouvoir bactériocinogène de Lb.plantarum et de Pc. pentosaceus

Selsinorganiques

NaCl % KCl %

0.5 1 3 5 0.5 1 3 5

Bactériocine deLb. plantarum 83.5±0.3 85.4±1.2 87. 2±1.3 58.7±1.9 88.0±0.3 96.7±1.2 93.6±1.3 96.8±2.7

Bactériocine dePc. pentosaceus 84.4±0.7 84.8±1.6 95.9±1.3 94.3±3.0 83.5±1.5 92.2±0.6 91.5±1.2 64.0±2.0

Les molécules chimiques peuvent être des acides organiques, le nitrite, le chlorure desodium, l’éthanol, des huiles essentielles (l’impact sur les propriétés organoleptiques doit êtresoigneusement évalué) ou des agents chélatants tel que l’EDTA, le phosphate trisodique, le citrate.

Ces agents chélatants permettent de séquestrer les ions magnésium des lipopolysaccharidesde la membrane externe des bactéries Gram- permettant aux bactériocines d’atteindre la membraneinterne, siège de leur activité.

Les traitements physiques peuvent être des traitement thermiques, le stockage sousatmosphère contrôlé l’application de champs électriques ou l’application des hautes pressions(Rodgers, 2004; Deegan et al., 2006; Gálvez et al., 2007).

5.6. Effet des épices utilisées comme additifs

Les épices utilisées dans cette expérience (poivre rouge, poivre vert, ail, piment, et lesgrains de nigelle) avec les concentrations de 3% ont affecté l'activité de la bactériocinedifféremment.

L'addition des extrait de ces épices aux deux bactériocines a eu comme conséquence uneactivité significative contre L. ivanovii (réduction jusqu'à de 50% de croissance), où un déclinpointu dans l'activité a été détecté (Tab. 26).

En général, L. ivanovii a été fortement empêchées par les deux bactériocines en présencede 3% de poivre rouge et poivre vert (≥ 60%). En revanche, l'augmentation de la concentration del’extrait de piment a semblé stimuler l'activité de la bactériocine Pc. pentosaceus et Lb. plantarum.

Les épices sont employées pour donner les propriétés sensorielles souhaitables auxproduits alimentaires, et par conséquent il est important de savoir les effets des différentsingrédients de nourriture sur l'activité de bactériocine (Zaika, 1988; Ankri et Mirelman, 1999;Harris et al., 2001).

Résultats

139

Ettayebi et al., (2000) et Singh et al., (2001) décrit que la combinaison des épices et lesbactériocines avec une faible quantité, peuvent être produites un effet synergique, rendant desmicrobes pathogènes comme L. monocytogenes.

Tableau 27: Effet des épices sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus

Les épices (0.03 mg/ml) Poivre rouge Poivre vert Ail Piment Grains denigelle

Bactériocine de Lb.plantarum 70.77 ± 0.5 80.21 ± 0.5 50.09 ± 0.5 60.88 ± 0.3 50.98 ± 0.2

Bactériocine de Pc.pentosaceus 80.64 ± 0.5 60.61 ± 0.5 51.96 ± 0.3 60.61 ± 0.2 70.01 ± 0.5

*Les résultats sont exprimés par le % d’inhibition ± standard déviations (n=2).*(%) la réduction de croissance de la souche indicatrice.

Conclusion

Selon Dortu et Thonart, (2009), il y a différents facteurs pouvant réduire ou totalementdissiper l’activité de la bactériocine de par son adsorption sur des composantes du produit, lalimitation de sa solubilité et de sa diffusion, sa dégradation par des protéases, l’interaction avec desadditifs alimentaires ou des ingrédients et/ou un pH inapproprié.

Les traitements appliqués aux produits constituent un deuxième facteur pouvant limiterl’activité inhibitrice dans un produit alimentaire. En effet, des traitements thermiques trop élevéspeuvent dégrader les bactériocines (Gálvez et al., 2007; Kouakou et Thonart, 2011).

La combinaison des bactériocines avec d’autres traitements de conservation chimique ouphysique donne des résultats prometteurs pour la conservation des aliments.

L'activité antibactérienne est retenue après un traitement thermique variant sur une gammede température variant de 30°C à 121°C. Elle reste stable sur une large gamme de pH mais engénéral nous observons une plus grande stabilité à des pH plutôt acides. De plus les bactériocinesconservent leur activité après un traitement thermique de plusieurs mois à -20°C.

6. Détermination de poids moléculaire de bactériocine

Afin de démontrer que les deux bactériocines testées possèdent une activitéantimicrobienne anti-Listeria, nous avons réalisé un « gel overlay ». Le gel Tristricine- SDS a étésoumis à une électrophorèse puis découpé en deux parties.

Une partie a été colorée au bleu de Coomassie G-250 et au nitrate d’argent et une autre aété soumise à un test antimicrobien; la partie du gel soumise au test antimicrobien sur L. ivanovii arévélé un halo d’inhibition correspondant à une masse moléculaire 3.25 kDa de la bactériocine deLb. plantarum et 19 kDa de la bactériocine de Pc. pentosaceus (Fig. 14a et 14b).

Résultats

140

Ces résultats impliquent que les deux bactériocines ont été purifiées à homogénéité, et ellespossèdent un spectre d’action très large contre les bactéries à Gram+ et Gram-. Les résultats sontentièrement compatibles avec les études effectuées par Atanassova et al., (2003) sur la bactériocinede Lb. paracasei subsp. paracasei M3 de 43 kDa, la pentocine TV35b de 3930 Da (Okkers et al.,1999), la leucocine KM432Bz de 3930 Da (Makhloufi, 2012), la BacTN635 de 3847 Da (Smaoui,2010)..

Cependant, la plus part de ces bactériocines présentent des activités inhibitrices dirigéesuniquement contre les bactéries à Gram+. Les bactériocines ayant des activités contre les bactéries àGram- et les champignons sont très rares (Smaoui, 2010).

Ce genre de bactériocines sont généralement des dérivés de dicétopipérazines à faiblemasse moléculaire inférieure à 1 kDa (Lavermicocca et al., 2000). De rares bactériocines sontdécrites à partir de Lactobacillus ayant une masse moléculaire supérieure à 1 kDa et ayant uneactivité antifongique.

a b

Figure 14: Electrophorèse et zymogramme de bactériocines de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus. a:gel SDS-PAGE; b: zymogramme contre L. ivaonvii (C1 et C2). Colonne 1 et 2: marqueur de taille (kDa); Colonne 3:

Bactériocine de Pc. pentosaceus; Colonne 4: Bactériocine de Lb. plantarum.

Résultats

141

7. Détermination de la CMI et la CMB

Les deux bactériocines de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus présentent respectivement uneCMI de 03 mg.l-1 et 06 mg.l-1. La souche indicatrice L. ivanovii a été très sensible à cesbactériocines, de plus ces valeurs sont variables entre les différentes espèces.

D’autres résultats sont obtenus sur les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 présententune CMI 04 mg.l-1 contre L. ivanovii CIP 12510 et L. innocua CIP 12511 (Jasniewski et al., 2008);la pediocine PA-1 (CMI 6.25-12.5 µg.l-1) contre L. monocytogenes LSD530 et L. monocytogenesLSD538 (Naghmouchi, 2007).

Jasniewski et al., (2008) étudié le mécanisme d'action de la mésentérocine 52A sur deuxsouches de Listeria, L. ivanovii CIP12510, et L. innocua CIP 12511. Ces deux souches présentent lamême CIM 0.95 mg.l-1 et 0.85 mg.l-1 respectivement.

La leucocine KM432Bz est active contre des bactéries à Gram positif phylogénétiquementproches avec des CMI comprises entre 0.08 nM et 10 μM. La leucocine KM432Bz est égalementactive contre des pathogènes telles que L. monocytogenes pour laquelle elle présente une CMI de156 nM.

Enfin, la leucocine KM432Bz exerce par ailleurs, un effet bactéricide sur la croissance deLb. sakei subsp. sakei et un effet bactériostatique sur L. monocytogenes (Makhloufi, 2012).

Résultats obtenus par Gay (1997), montrent que la CMI de la nisine est égale à 210 UA.ml-1. La CMI de la pédiocine AcH n'a pas pu être déterminée car la réduction maximale de lapopulation observée est de 99.99 %. La fraction de cellules survivantes entraîne une croissancevisible après 24 h d'incubation à 30°C.

Nielsen et al., (1990) a été trouvé que la CMI de la bactériocine de Pc. acidilactici est 460AU.ml-1 contre L. monocytogenes et 25.6 AU.ml-1 contre L. ivanovii.

Tableau 28: La concentration minimale inhibitrice (CMI) de Lb. plantarum et Pc. pentosaceuscontre L. ivanovii.

Bactériocine de Lb.plantarum Bactériocine de Pc. pentosaceus

CMIa (mg.l-1) 03 ± 0.5 06 ± 0.5

CMB (mg.l-1) 21 ± 2 35 ± 5

a MIC ont été répétées trois fois. Les résultats sont présentés en tant que le moyen de trois répétitionsindépendantes.

Résultats

142

8. Application de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus dans la fermentation du laitcru de chèvre

La figure 15 montre que L. ivanovii a été éliminée (102x 1.3 UFC/ml) après 4 à 6 heures defermentation de l’échantillon de lait cru de chèvre fermenté avec les deux BL et contaminé par cepathogène à un taux d’environ 107 UFC/ml, soulignant la bonne qualité hygiénique de ce produit.

Le lait cru de chèvre a été caractérisé par une activité microbienne importante des bactérieslactiques qui ont eu comme conséquence un produit avec un pH final d’environ 4.73 à 5.92.

Benkerroum (2002), a été étudié l’application de Lc. Lactis LBII dans la fermentation deLben et du Jben fabriqué par le lait pasteurisé artificiellement contaminé par L. monocytogenes (104

UFC/ml). Les résultats obtenus montrent que ce pathogène a été éliminé après 6 heures defermentation à 30°C et un pH initial de 6.5.

L’addition de la nisine produite par Lc. lactis W8 dans le lait fermenté (Dahi) inoculé par5.2 log UFC/ ml de L. monocytogenes, montre une absence totale de celle ci après 10 h d’incubationà 4°C (Suranjita et al., 2010).

Figure 15: L’évolution du nombre de L. ivanovii au cours de la fermentation du lait cru de chèvre avec un levain de BL(Lb. plantarum et Pc. pentosaceus) respectivement à 30°C.

Lait cru de chèvre innoculé par Lb. plantarum et L. ivanovii.Lait cru de chèvre innoculé par Pc. pentosaceus et L. ivanovii.

Discussion

Discussion

143

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des millénaires pour la fermentation deproduits alimentaires par différentes populations. En plus de leurs propriétés de fermentation, derésistance aux variations de pH et aux températures élevées, la propriété de leur bioconservation aété attribuée.

Les métabolites responsables d’activités antimicrobiennes dirigées contre des pathogènesde l’alimentation comme Listeria, Enterococcus et Salmonella s’avèrent être à l’origine de cettepropriété de bioconservation. Parmi ces métabolites, on trouve l’acide lactique et des peptidesantimicrobiens appelés bactériocines.

La nisine est utilisée depuis 40 ans comme conservateur alimentaire dans plus de 80 pays(Cleveland et al., 2001). Plus récemment, la pédiocine a également été commercialisée commeconservateur alimentaire. Les études portant sur des bactériocines sont toujours en cours afin demieux comprendre leur structure et leurs modes d’actions pour élargir leurs applications.

La grande méfiance des consommateurs vis-à-vis des additifs alimentaires comme lesconservateurs chimiques utilisés pour augmenter la durée de vie de certains aliments, ainsi que del’utilisation de traitements thermiques souvent préjudiciables aux propriétés organoleptiques etnutritionnels d’aliments sensibles à la chaleur ont conduit les chercheurs à proposer d’autresméthodes de conservation des aliments.

Un grand intérêt s’est manifesté pour les inhibiteurs naturels comme les métabolitesmicrobiens possédant des activités contre certains germes indésirables sur les plans hygiénique ettechnologique.

Compte tenu du problème de résistance qui accompagne l’utilisation massive desantibiotiques, des intérêts scientifiques et économiques importants se sont manifestés pour lesconservateurs dotés d’activités antibactériennes ou bactériocines, en particulier ceux produites parles bactéries lactiques (Neetles et Barefoot, 1993).

Les bactéries lactiques interviennent dans l’industrie laitière et dans la fermentation denombreux autres produits alimentaires: fabrication du vin, saurissage des poissons, des viandes etdes salaisons, etc.

Elles contribuent à la texture, à la saveur des aliments et à la production de composésaromatiques. Elles fermentent les glucides en acide lactique, d’où une diminution du pH favorable àla conservation des aliments.

Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition pour les substrats et si lesconditions de développement sont favorables (Callewaert et De Vuyst, 2000), de l’élaboration debactériocines (Piard et al., 1992) comme la nisine (Hurst, 1983; Song et Richard, 1997).

Discussion

144

Les bactériocines sont des peptides antibactériens (Klaenhamner, 1988). Elles présententun spectre d’activité étroit envers des espèces pathogènes. Elles ont un optimum de stabilité, desolubilité et d'activité à pH acide. Elles sont inactivées par les protéases et sont thermostables(Aymerich et al., 2000).

Toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques décrites jusqu’à présent ontune activité dirigée contre les bactéries Gram+. Aucune bactériocine produite par des bactérieslactiques avec une activité contre des bactéries Gram- n’a été décrite, la membrane externe desbactéries Gram- ne permettant pas aux bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leuractivité (Dortu et Thonart, 2009).

Nous avons choisi deux bactériocines produites par deux bactéries lactiques isolées deproduits laitiers algériennes, pour cela les souches bactériennes productrices a d’abord été isoléespuis identifiées comme un Lb. plantarum et Pc. pentocaseus.

L’identification des souches de bactéries lactiques (Lactobacillus 0.070%, Pediococcus0.090%, et Enterococcus 0.83%) réalisée au cours de ce présent travail prouve que la floremicrobienne existante dans les produits laitiers est très diverse et les proportions trouvées varientd’un genre à un autre.

Ces chiffres sont relatifs et dépendent essentiellement de la nature du matériel d'isolement,des milieux utilisés et les conditions de cultures. A l’heure actuelle, l’isolement des bactérieslactiques s’effectue à partir de différentes sources et ceci dans le but d’augmenter la diversitégénétique et la hétérogénicité.

Dans les produits carnés, Lb. plantarum représente 8% des lactobacilles isolées et l'espècedominante est Lb. saké avec 55 % (Hugas et al., 1993). Les espèces importantes des levainsartisanaux appartiennent à Lb. plantarum, Lb. curvatus, et Lb. Brevis (Lopez et Mayo, 1994). Pourle poisson, ce sont Lc. lactis subsp. lactis et Ln. citreum et pour le riz bouilli, Lb. paracasei(Bouton et al., 1998; Paludan-Muller et al., 1999).

La caractérisation phénotypique et génotypique de la microflore lactique du cheddar apermis de recenser les espèces dominantes suivantes: Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. curvatus, etLb. brevis (Fitzsimmons et al., 1999).

Dans les produits végétaux tels que le sorgho, les espèces de bactéries lactiquesdominantes appartiennent aux lactobacilles (Lb. plantarum 34.7%, Lb. curvatus 15%), auxleuconostocs (Ln. mesenteroides 28.2%) et aux pédiocoques (Pc. pentosaceus 10.2% et Pc.acidilactici 7.8%); par contre les lactocoques ne représentent que 4% (Kunene et al., 2000).

De nouvelles souches sauvages de bactéries lactiques peuvent être isolées de différentsproduits laitiers (Mayo et al., 1990; Klijn et al., 1995; Cogan et al., 1997; El Shafei et al., 2000).Cette biodiversité naturelle peut offrir de nouvelles possibilités une fois explorée et appliquée dansla pratique (Ayad et al., 1999).

Discussion

145

La caractérisation et la sélection de nouvelles souches sauvage à partir de différents laits etde fromages à travers le monde est considérée comme une voie intéressante dans la recherche denouvelles souches industriellement importantes (Lopez et Mayo, 1994; Bizzarro et al., 2000;Lopez-Diaz et al., 2000; Vukasinovic et Topisirovic, 2001).

Les bactéries lactiques sont largement répandues comme cultures starters dans la laiterie,dans les fermentations de la viande, et végétales (Buckenhüskes, 1993; Stiles, 1996) et lapréservation des produits fermentés (Piard et al.. 1992; De vuyst et Vandamme, 1994c; Dodd etGasson, 1994).

La majorité des BL a une résistance contre les antibiotiques. Cette résistance a étéintrinsèque et non transmissible. L’étude de la sensibilité aux antibiotiques de Lb. plantarum et Pc.pentosaceus est très utile pour justifier leurs utilisations dans le domaine thérapeutique.

Chaque bactériocine possède son propre déterminant immunitaire dont le gène est lié augène de la bactériocine, alors que les déterminants génétiques de résistance aux antibiotiques nesont pas liés, et sont exprimés indépendamment des gènes codant pour la synthèse d’antibiotiques(Diep et Nes, 2002).

Mathara et al., (2008) ont démontré que les lactobacilles sont généralement sensibles àl’ampicilline, Lb. acidophilus sensible à la vancomycine, Lb. casei et Lb. fermentum a unerésistance contre la streptomycine. Lb. rhamnosus HN001 (DR20k) HN067, Lb. acidophilusHN017, Lb. plantarum et Bf. lactis HN019 (DR10k) sont sensibles à l’érythromycine et lanovobiocine (Zhoua et al., 2005).

Les spectres d’activité réalisés pour des bactériocines de Lb. plantarum et Pc. pentosaceusrévèlent une sensibilité de bactéries à Gram positif, en particulier de souches phylogénétiquementproches de la bactérie productrice de cette bactériocine. Nous avons déterminé le spectre d’activitéde ces bactériocines en la testant sur gélose contre des bactéries phylogénétiquement prochesincluant des pathogènes, puis en mesurant la CMI et la CMB sur la souche indicatrice de L.ivanovii.

Ces bactériocines sont actives contre les bactéries pathogènes comme Sl. typhimurium, Sl.paratyphimurium B, S. aureus β-hιmolytique, Str. pyogenes, E. coli, Ps. aeruginosa, B. megateriumID07817, B. megaterium ID07818, Clostridium sp., et L. ivanovii, les deux dernières étantresponsables d’infections respectivement chez l’Homme et l’animal.

La plupart des bactériocines ont pour cible la membrane cytoplasmique des bactéries àGram positif, elles induisent la formation de pores aboutissant à la fuite de moléculesintracellulaires. Toutefois, la nature de ces molécules dépend du type de pores formés (Makhloufi,2011).

Plus particulièrement, les bactériocines de classe IIa induisent dans la plus part des cas, laformation de pores dans la membrane cytoplasmique de la bactérie cible provoquant la fuite d’ionset de petites molécules intracellulaires aboutissant ainsi à la mort de la bactérie (Dalet et al., 2001,Diep et al., 2009).

Discussion

146

Le spectre antimicrobien de bactériocines peut être large ou étroit, elles peuvent doncciblées sélectivement des bactéries pathogènes ou altérantes sans inhiber les bactériesindispensables et ont un mode d’action bactéricide (Gálvez et al., 2007).

Les bactériocines connues (par exemple la nisine) n'agissant pas toujours sur les espècestaxonomiquement proches, des classifications des bactériocines suivant leurs spectres d'activité sontapparues nécessaires.

Klaenhammer, (1988) classe les bactériocines des bactéries lactiques en deux groupes: lesbactériocines à spectre d'activité classique inhibant les espèces proches ou occupant la même nicheécologique, et les bactériocines à spectre d'activité englobant une large gamme de bactéries àGram+.

D'autre part, la majorité des bactériocines des bactéries lactiques s'adsorbent à desrécepteurs non spécifiques, se trouvant aussi bien sur les bactéries sensibles que sur les bactériesrésistantes (Desmazeaud, 1994).

De plus, il a été montré que certaines bactériocines agissent sur des protoplastes ou dessphéroplastes (Andersson, 1986), ce qui montre que les sites de réception ne sont pas spécifiques.

Dans cette étude, Lb. plantarum et Pc. pentosaceus ont montré un large spectreantimicrobien, capable d'être actives contre les bactéries gram positifs et gram négatifs. Maximumactivité et production de ces deux bactériocines a été détecté à la fin de la phase exponentielle et audébut de la phase stationnaire, après croissance sur bouillon MRS à 30ºC et à pH 7.5. Des résultatsidentiques sont obtenues par (Hörner et al., 1990; Biswas et al., 1991; Jiménez et al., 1993;Bárcena et al., 1998).

Les deux substances antibactériennes synthétisés par Lb. plantarum et Pc. pentosaceussont inactivées (60 à 70%) par la pepsine et la trypsine. L’action d’enzyme protéolytique n’enlèvepas l’inhibition complètement, c’est possible que pour ces deux souches, l’agent inhibiteur contientun composé mineur lié au peptide cas des glycoprotéines (Lewis, 1991; Liu et Hansen, 1990).

Des résultats similaires sont observés par (Zeliha et Metin, 2001; Noonpakdee et al.,2003; Savadogo et al., 2004; Lash et al., 2005; Albano et al., 2007; Anastasiadou et al., 2008;Khalil et al., 2009). Les bactériocines trouvées jusqu’à l’heure actuelle ont des réponses différentesselon les enzymes protéolytiques employées.

La résistance de bactériocines aux enzymes protéolytiques peut être expliquée sur la basede la présence des peptides de structure cycliques, qui peuvent être résistants à l'hydrolyse par desprotéases (Eckart, 1994).

Discussion

147

Une meilleure production de ces deux bactériocines a été obtenue sur le milieu MRS àtempérature d’incubation 30°C et pH 7.5 par rapport l’utilisation de milieu BHI et M17 à 37°C et45°C. Ces résultats montrent que les facteurs influençant la production de bactériocines sontprincipalement la souche productrice, la température, le pH, la composition du milieu et latechnologie de fermentation employée.

Les conditions de culture influencent fortement la production de bactériocines (Parente etal., 1999). Il a été suggéré que des conditions de croissance défavorables permettent de stimuler leurproduction (Verluyten et al., 2004).

Les températures et pH optimaux de production sont souvent inférieurs à ceux utilisés pourla croissance. C’est par exemple le cas pour la production de bactériocine par Lb. curvatusLTH1174 (Messens et al., 2003), Ln. mesenteroides L124 et Lb. curvatus L442 (Mataragas et al.,2003), de sakacine P par Lb. sakei CCUG42687 (Moretro et al., 2000), d’amylovorine L471 parLb. amylovorus DC E471 (De Vuyst et al., 1996) et de pediocine PA-1 par Pc. damnosus (Nel etal., 2001).

Différentes expériences ont été conçues pour atteindre les meilleures conditions de culturedisponibles qui pourraient aider dans la production des bactériocines, avec les moindres coûtséconomiques possibles et avec les méthodes les plus simples disponibles.

Généralement, les meilleurs résultats correspondant à l'effet inhibiteur le plus élevé sur L.ivanovii ont été obtenus en MRSm agar contenant le lactose et le maltose pour Lb. plantarum et Pc.pentosaceus respectivement.

Les résultats de la source d’azote et carbone utilisés ont prouvé que l'effet inhibiteur le plusélevé a été obtenus en MRS agar complété avec acide glutamique, et l'acétate d’ammonium. Lesrésultats de (Liao et al., 1993; Guerra et Pastrana, 2002; Todorov et Dicks, 2006) sontcontradictoires à nous résultats.

La composition du milieu, tout particulièrement les sources et concentrations de carbone etazote, affectent fortement la production de bactériocines. Les bactéries lactiques productricesrequièrent de nombreux nutriments pour leur croissance et des milieux riches contenant de l’extraitde viande, de levure et des hydrolysats de protéines sont nécessaires.

Il a déjà été montionée que l’augmentation des concentrations en extrait de levure, extraitde viande ou peptone peut permettre une augmentation de la production de bactériocines (Aasen etal., 2000; Nel et al., 2001; Mataragas et al., 2004; Todorov et al., 2004; Verluyten et al., 2004).

D’autre part, quelques études ont montré que la source de carbone utilisée et saconcentration est un facteur important dans l’optimisation de la production de bactériocines (Leal-Sanchez et al., 2002; Todorov et Dicks, 2005; Leroy et al., 2006; Chen et al., 2007;Anastasiadou et al., 2008).

Discussion

148

L’ajout de ces nutriments lors d’une culture fed-batch permet souvent d’augmenter laproduction comparativement à une culture en batch (Callewaert et al., 2000; Lv et al., 2005).

Des conditions environnementales spécifiques, y compris ceux trouvées en aliments, ontété étudiées par (Leroy et De Vuyst, 2003) et (Motta et Bradelli, 2003) pour déterminer leur effetsur la production des bactériocines. Selon (Leal Sánchez et al., 2002) le changements desconditions environnementales peuvent changer la production de bactériocine (Jozala et al., 2005).

La production de bactériocine est influencée par plusieurs facteurs environnementaux, telsque le pH (Nilsen et al., 1998), la température (De vuyst et al., 1996), la concentration en NaCl etl’éthanol (Leroy et De vuyst, 1999; Ogunbanwo et al., 2003).

Ces facteurs environnementaux peuvent influencer négativement la croissance et lasécrétion du facteur d'induction (De vuyst et al., 1996). De plus, on a suggéré que quelques facteursenvironnementaux ramènent l'attache du facteur d'induction à son récepteur (Nilsen et al., 1998).

La compréhension de l'influence des facteurs environnementaux sur l'induction desbactériocines est essentielle pour l'application commerciale efficace des BL productrices debactériocine dans la conservation des produits alimentaires.

Ainsi, l'influence de la température et le pH joue un rôle important sur la croissance dessouches productrices et de ce fait sur l’effet inhibiteur de la bactériocine. L’effet de la pediocineAcH est maximale à pH 6 (Bhunia et al., 1991).

Alors que pour d’autres bactériocines, l’activité est active entre une certaine gamme de pHqui peut se situer entre pH 3 et 9 (Navarro et al., 2000) ou à un pH variant entre 2 et 10(Noonpakdee et al., 2003; El- Shafei et al., 2000).

La production de bactériocines qui possèdent un large spectre d’activité peut être uneimportante propriété pour les cultures starter. L. monocytogenes pousse à des températuresinférieures à 5°C et S. aureus à des températures comprises entre 5 et 12°C, le contrôle de leurcroissance en employant le froid est inadéquat (Pucci et al., 1988; Schillinger et Lücke, 1989).

Les bactériocines sont généralement produites à la fin de la phase exponentielle et au débutde la phase stationnaire de croissance. Nos résultats rejoignent ceux trouvés dans la littérature avecune production d’acide lactique de 48 à 50 °D (De vuyst et Vandamme, 1992; De vuyst et al.,1996; Parente et al., 1997; Lejeune et al., 1998; Zamfir et al., 2000; Achemchem et al., 2004;Diop et al., 2008).

Les substances antimicrobiennes produites par les deux souches bactériennes isolées desdifférents produits laitiers répondent aux critères retenus par Klaenhammer, (1988) et ont un effetbactéricide sur L. ivanovii.

Discussion

149

Les même résultats sont obtenus par lactacine B (Barefoot et Klaenhammer, 1983),sakacine P (Larsen et al., 1993), acidocine CH5 (Chumchalová et al., 2004), bactériocine T8 (DeKwaadsteniet et al., 2006), divergicine M35 (43 acides aminées, 4518 Da) (Naghmouchi, 2007),mesentérocine E131 (Xiraphi et al., 2008), et la mesentérocine 52 (Jasniewski, 2008).

Lors d’une application alimentaire, la composition du produit est un des premiers facteurspouvant réduire ou totalement dissiper l’activité de la bactériocine de par son adsorption sur descomposantes du produit, la limitation de sa solubilité et de sa diffusion, sa dégradation par desprotéases, l’interaction avec des additifs alimentaires ou des ingrédients et/ou un pH inapproprié.

Les traitements appliqués aux produits constituent un deuxième facteur pouvant limiterl’activité inhibitrice dans un produit alimentaire. En effet, des traitements thermiques trop élevéspeuvent dégrader les bactériocines présentes.

La température de stockage pourra également réduire l’activité des bactériocines, qui varieen fonction de la température (Gálvez et al., 2007). Un autre facteur limitant l’activité desbactériocines est la flore autochtone, principalement sa concentration, la présence de bactériesrésistantes, la présence de microorganismes produisant des protéases dégradant la bactériocine etl’état physiologique de cette flore.

Un état physiologique stationnaire ou stressé ainsi que la formation de spores peutconduire à une résistance accrue. En outre, dans les produits solides, les bactéries forment desmicrocolonies ou des biofilms dont la résistance aux bactériocines peut être plus élevée (Schöbitz etal., 2003).

D’autre part, il sera également important de considérer l’impact de la bactériocine sur laflore résidente favorable des aliments. Si celle-ci est sensible à la bactériocine, son déséquilibrepourra conduire à la croissance de microorganismes résistants aux bactériocines, pathogènes et/oualtérants avec des conséquences sanitaires et/ou organoleptiques défavorables (Bouttefroy et al.,2000; Vignolo et al., 2000; Schöbitz et al., 2003; Kouakou et al., 2008).

Les bactériocines de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus conservent ses activitéesantagonistes après avoir été soumises à des traitements thermiques assez élevés 120°C/ 20 mincomparables à la pasteurisation et la stérilisation du lait, ces caractéristiques font penser qu’on aaffaire à des bactériocines (Janes et al., 1999; Zhu et al., 2000; Ivanova et al., 2000; Noonpakdeeet al., 2003; Achemchem et al., 2004; Bromberg et al., 2005; Vinod et al., 2006; Diop et al.,2008).

Effet du pH sur le pouvoir bactériocinogène de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus montreque les deux bactériocines restes stables à pH 2-6. Nos résultats sont similaires au pediocine F,pediocine AcH, pediocine A, pediocine PA-1, lactacine, lactacine 27, acidoline, nisine, etdiplococcine (Özlem et al., 1997).

Discussion

150

Mais certaines bactériocines peut être influencés par la variation du pH (De Vuyst etVandamme, 1994) comme la bactériocine de Lb. plantarum J-5; la nisine, pediocine, sakacine A,brevicine B37, caseicine 80 (Rammelsberg et Radler, 1990), plantaricine A (Daeschel et al.,1990), plantaricine S et T (Jiménez-Diaz et al., 1993), plantaricine C (Gonzalez et al., 1994),plantaricine F (Fricourt et al., 1994), la bozacine 14 (Ivanova et al., 2000), et la bactériocine deLb. plantarum CA44 (Joshi et al., 2006).

La période de stockage des bactériocines reste un paramètre très important pour leursapplication dans les industries agro-alimentaires, même les traitements physiques peuvent être destraitements thermiques, le stockage sous atmosphère contrôlé, l’application de champs électriquesou l’application des hautes pressions (Gálvez et al., 2007), alors nos bactériocines ont été presquemaintenues stables pendant 90 jours à 4°C et -20°C (Navarro et al., 1999; Zeliha et Metin, 2001;Ogunbanwo et al., 2003a).

D’autres résultats sont enregistrés par Rodriguez et al., (2002) sur la pediocine PA-1 qui aété reste active après 21 jours de stockage à 15°C, mais la bavarecine A perdue leur activité après 4h à 15°C (Larsen et al., 1993), la nisine W8 reste active pendant 30 jours à 4°C (Suranjita et al.,2010), la pediocine SA-1 reste active après stockage à 80°C, -20°C, et 4°C pendant 04 semaines(Anastasiadou et al., 2008).

Etude de l’effet des radiations UV et l’action des solvants orgiaques sur la stabilité de lastructure chimique des bactériocines étudiées montre que les radiations ont un effet remarquable surleurs natures protéiques, mais nos bactériocines gardes leur activité bactériocinogène en présence del'hexane, l'acétone, et l'alcool 90%, ces résultats indiquent que ces trois solvants organiques peuventêtre utilisés comme phase mobile dans l’extraction des bactériocines (Özlem et al., 1997; Zeliha etMetin, 2001; Ogunbanwo et al., 2003a; Jasniewski, 2008).

La combinaison des bactériocines avec d’autres traitements de conservation chimique ouphysique donne des résultats prometteurs pour la conservation des aliments. Les moléculeschimiques peuvent être des acides organiques, le nitrite, le chlorure de sodium, l’éthanol, des huilesessentielles (l’impact sur les propriétés organoleptiques doit être soigneusement évalué) ou desagents chélatants tel que l’EDTA, le phosphate trisodique, le citrate (Rodgers, 2004; Deegan et al.,2006; Gálvez et al., 2007).

Les agents chélatants permettent de séquestrer les ions magnésium des lipopolysaccharidesde la membrane externe des bactéries Gram- permettant aux bactériocines d’atteindre la membraneinterne, siège de leur activité. D’autre part, l’utilisation d’inhibiteurs de protéases ou de protéines desoja a été suggérée afin de prévenir la dégradation des bactériocines par les protéases présentes dansle produit à conserver (Kouakou et al., 2008).

Cependant, en situation de stress (pH bas, stress au froid ou à la chaleur, présence dechélateurs, absence d'ions métalliques, stress au sel...), certaines bactéries à Gram négatif sontsensibles à l'action de certaines bactériocines (Labioui et al., 2010).

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gram_n%C3%A9gatif

Discussion

151

Les bactériocines de Lb. plantarum et Pc. pentosaceus ont montré l'activité la plus élevéeen présence du KCl et le NaCl 1-5% (95.4 à 95.9%, et 92.2 à 92.7% respectivement). Les résultatsobtenus indiquent qu’il ya une action synergétique entre les bactériocines et les sels inorganiquesadditionnés.

En général, L. ivanovii a été fortement empêchées par les deux bactériocines en présencede poivre rouge, poivre vert, ail, pimon, et grains de nigelle de 0.5% à 3%. Des résultats similairesont été observés par Khalil et al., (2009). Beaucoup des épices comme les huiles essentielles on uneffet antimicrobien sur les germes pathogènes et d’altération (Zaika, 1988), le plus efficace c’estl’ail où leur substance active principale a été identifiée comme allicine (Ankri et Mirelman, 1999;Harris et al., 2001; Abo-Amer, 2007).

Des études intéressantes ont été réalisées pour déterminer les propriétés inhibitrices de l'aildans les aliments alimentaires et sur les bactéries Gram positifs et les bactéries Gram négatifs(Kumar et Berwal, 1998; Ross et al., 2001; Leuschner et Zamparini, 2002).

Singh et al., (2001) ont indiqué que la nisine et l’ail peuvent donné un effet synergiquecontre L. monocytogenes; même dans le cas de thymole et la nisine contre B. subtilis et L.monocytogenes (Ettayebi et al., 2000). Lors de la préparation de saucisse, la bactériocine produitepar les bactéries lactiques à baisse de pH, présence de sel, les épices, et l’ail améliore l’effetsynergique contre les germes indésirables (Lemon, 2001).

L'étude de mode d'action bactéricide de la bactériocine est nécessaire à l'optimisation deleur utilisation comme un agent de bioconservation dans certains aliments ainsi que leur acceptationpar l'industrie alimentaire. Nos bactériocines ont un effet bactéricide très marqué contre L. ivanovii,avec une CMI de 3 à 6 mg.ml-1 et CMB de 21 à 35 mg.ml-1 respectivement.

Ces résultats indique que la bactériocine généralement, cause la mort de la souche indicatrice et/ouinduire la fuite de K +, des acides aminés, désaccouplent la respiration et l'épuisementmitochondriques du ATP ou lyses la paroi cellulaire (Chikindas et al., 1993; Ahern et al., 2003;Diop et al., 2008).

Le mode d’action des bactériocines est leur effet sur une population de bactéries cibles ;après leur adsorption sur les bactéries sensibles, les bactériocines comme les antibiotiques peuventavoir trois types d’effets soit un effet bactériostatique, un effet bactériolytique, ou un effetbactéricide (Tagg et al., 1976; Bhunia et al., 1991).

L’effet observé pour une bactériocine donnée dépend souvent des conditionsexpérimentales, comme la concentration et la pureté du peptide, la souche cible, la populationcellulaire initiale ainsi que le milieu de culture. L’état physiologique des bactéries cibles joueégalement un rôle très important dans ce type d’étude, l’effet combiné de bactériocines a été peuétudié (Martinez-Cuesta et al., 1997).

Discussion

152

Cependant, des effets synergiques ont été reportés entre la pédiocine AcH et la nisine(Hanlin et al., 1993), entre la curvaticine 13 et la nisine (Bouttefroy et al., 2000), entre la lactocine705, l’entérocine CRL35, et la nisine (Vignolo et al., 2000). Une synergie d’action a également étémise en évidence entre des bactériocines à deux composants telles que les plantaricines JK et EF(Moll et al., 1999b).

La purification partielle de bactériocines étudiées s’est réalisée par précipitation au sulfated’ammonium à 45% de saturation suivie d’une purification par Sephadex G-25. Le poidsmoléculaire apparent déterminé par SDS-PAGE avec le système Tris-tricine est estimé de 3.25 kDapour la bactériocine de Lb. plantarum et à 19 kDa pour la bactériocine de Pc. pentasaceus (Bhuniaet al., 1987; Marugg et al., 1992; Schved et al., 1993; Green et al., 1997; Jennes et al., 2000;Todorov et al., 2004; De Kwaadsteniet et al., 2005; Albano et al., 2007; Mkrtchyana et al.,2009).

Les études d’application de ces deux bactériocines sur le lait cru de chèvre ont montré leureffet bactéricide contre L. ivanovii, en perspectives à ce travail, nous projetons des essais de cesbactériocines dans le domaine agroalimentaire seraient très intéressants vu le spectre d’action largecontre les bactéries à Gram+ et à Gram-. Des applications alimentaires de ces bactériocines en tantqu’additif pourraient être envisagées.

Conclusion

Conclusion

153

Le secteur des industries agroalimentaires utilise un certain nombre d’auxiliairestechnologiques, parmi lesquels les bactéries lactiques, pour élaborer des aliments fermentés. Lesbactéries lactiques constituent un groupe hétérogène qui rassemble à des bactéries capables deproduire de l’acide lactique par un métabolisme fermentaire.

L’acidification et les procédés enzymatique accompagnant leur développement influencentles qualités organoleptiques et la préservation de nombreux aliments. Les différentes applicationsdes bactéries lactiques en agroalimentaire reposent sur l’utilisation de six genres-clefs: Lactococcus,Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus et Streptococcus.

La conservation des aliments demeure un problème majeur, dans le secteur bioalimentaireà cause des problèmes d'ordre microbiologique rencontrés. En particulier, les produits laitiersconstituent un substrat bactériologique potentiellement dangereux en raison d'un certain nombre defacteurs intrinsèques dont: une activité de l'eau élevée, un pH proche de la neutralité et une quantitéimportante en protéines.

Ainsi, des pathogènes tels que Listeria, Clostridium botulinum, Vibrio parahaemolyticus,Salmonella, et S. aureus sont capables de se développer dans ces produits et peuvent provoquer desinfections graves chez le consommateur.

Les moyens de lutte employés contre ces agents pathogènes font le plus souvent appel àune barrière microbiologique traditionnelle telle que le sel. Cependant, les nouvelles tendances dumarché montrent une réticence des consommateurs pour les additifs chimiques et le sel.

De plus le consommateur favorise de plus en plus le recours aux produits naturels. Ainsi,des investigations récentes se sont orientées vers la lutte biologique qui consiste à valoriser lesproduits issus du métabolisme des bactéries lactiques ayant une activité antimicrobienne.

En effet, il a été démontré que les bactéries lactiques (BL) peuvent accroître la durée deconservation des aliments par la production naturelle de composés antimicrobiens tels des acidesorganiques, du peroxyde d'hydrogène et des bactériocines.

Les bactériocines sont des peptides ou des polypeptides ayant une activité bactéricide oubactériostatique envers les micro-organismes phylogénétiquement proches des souchesproductrices. Ces substances antimicrobiennes présentent des propriétés intéressantes pouvant êtreutilisées à des fins de biopréservation des différentes denrées alimentaires.

La capacité des BLs d'inhiber la croissance des bactéries pathogènes comme L.monocytogenes est notamment reliée à la production de bactériocines. Mais l'utilisation de cesbactériocines en tant que bio-ingrédient est limitée par l'émergence des populations résistantes à cespeptides.

Dans notre étude, 141 souches provenant de produits laitiers ont été soumises à unesélection et une caractérisation bien définie pour la recherche des cultures protectrices bio-préservatives utiles dans l'industrie laitière.

Conclusion

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En premier lieu, les bactéries lactiques ont été testées pour leur type de fermentation« homofermentatif ou hétérofermentatif » et pour leur tolérance en sel. Deuxièmement le pouvoirantibactérien vis-à-vis de germes d’altération et L. ivanovii a été déterminé par la méthode "spot"agar.

En conclusion, deux bactéries lactiques Lb. plantarum et Pc. pentosaceus présentant uneforte activité bactériocinogénique, ont été évaluées sur leurs natures compétitives en comparantleurs taux de croissance et la production d'acides lactiques dans des conditions anaérobies dans lebouillon MRS.

Les deux isolats lactiques présentent aussi des différences au niveau de leurs sensibilitésaux différents antibiotiques, qui justifier leurs utilisations dans le domaine thérapeutique.

Les deux substances antimicrobiennes synthétisées par Lb. plantarum et Pc. pentosaceusont une nature hétérogène, cela est généralement démontré par l'inactivation de celles-ci par desprotéases, lipase, et α-amylase.

La production optimale de la bactériocine de Lb. plantarum a été enregistrée dans MRSmcontenant le glucose 0.02 g/ml et l’acide glutamique 0.4%; et MRSm plus 0.04 g/ml de maltosepour Pc. pentosaceus, après 18 heures d'incubation à 30°C et pH 7.5.

Les deux bactériocines sont thermostables jusqu'au 120°C pendant 15 min, stable à unintervalle de pH 2 à 6, et insensible à l’action des solvants organiques comme l’hexane et l’acétone.Leurs productions débutent au cours de la phase exponentielle et reste stable durant toute la phasestationnaire de croissance.

Ces bactériocines montrent une sensibilité remarquable après traitement par UV, lacombinaison de certains épices et des sels (NaCl et KCl) avec ces bactériocines à une faiblequantité, peuvent être produites un effet synergique, rendant des microbes pathogènes comme L.ivanovii et nous pouvant les stockées pendant trois mois à 4°C et -20°C.

Leurs modes d’action s’est révélé double, il est à la fois bactéricide et bactériolytique. Lapurification partielle est réalisée par précipitation au sulfate d’ammonium à une saturation de 45%suivie d’une dialyse et une extraction à l’hexane.

L'étude de leurs modes d'action est nécessaire à l'optimisation de son utilisation commeagent de bioconservation de certains aliments avec une CIM de 3 à 6 mg.l-1, ainsi que sonacceptation par l'industrie alimentaire.

Les deux souches bactériocinogènes et ses bactériocines montrent des potentialités trèsintérissantes pour leurs applications dans le lutte contre L. ivanovii dans des systèmes alimentaires,notamment dans les produits laitiers (lait cru de chèvre) et dans des conditions hygiéniques noncontrôlées.

Conclusion

155

La production de bactériocine peut être influencée par le pH, la température, lacomposition du milieu de culture, les agents de DNA-damaging, et les conditions de croissance(Rammelsberg et al., 1990; Fricourt et al., 1994; De Vuyst et al., 1996; Nel et al., 2001;Maldonado et al., 2003; Avila et al., 2005; Todorov et Dicks, 2006; Abo-Amer, 2007; Albano etal., 2007; Anastasiadou et al., 2008; Diep et al., 2009).

Perspectives:

· Profil plasmidique des souches isolées.· Alignement de séquences de peptides de ces bactériocines (résidus d’acides

aminés).· La compréhension des mécanismes d’action des bactériocines ainsi leurs

phénomènes de résistance.· La pénétration de la bactériocine dans la membrane de la cellule ciblée.· Les différentes conséquences de la pénétration du peptide antibactérien sur le

fonctionnement de la membrane.· La caractérisation des propriétés physico-chimiques de l’enveloppe de la cellule

ciblée.· L’étude des relations entre structure et fonction des bactériocines.· Des applications alimentaires de ces bactériocines en tant qu’additif pourraient être

envisagées.

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Les publications :Fatima Djadouni and Kihal Mebrouk (2012). Antimicrobial Activity of Lactic Acid Bacteria andthe Spectrum of their Biopeptides against Spoiling Germs in Foods. Brazilian Archives of Biologyand Technology. Vol.55, n. 3: pp.435-443. ISSN 1516-8913 Printed in Brazil.Fatima Djadouni and Kihal Mebrouk (2013). Characterization and determination of the factorsaffecting anti-listerial bacteriocins from Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceusisolated from dairy milk products. African Journal of Food Science Vol. 7(2) pp. 35-44. Availableonline at http://www.academicjournals.org/AJFS. DOI: 10.5897/AJFS12.037. ISSN 1996-0794©2013 Academic Journals.

http://www.academicjournals.org/AJFS

Annexes

Annexes

Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975)Acide ascorbique 0.5 gEau distillée qsp 1000 mlExtrait de levure 2.5Extrait de viande 5 gLactose 5 gMgSO4 0.25 gPeptone de caséine 10 gPeptone papaïne de soja 5 gPeptone pepsique de viande 2.5 gβ-glycérophosphate 19 gpH=7.2

Milieu MRS (De Man Rogosa et Sharpe, 1960)Acétate de sodium 5 gCitrate de sodium 2 gCystéine-HCl 0.5 gEau distillée qsp 1000 mlExtrait de levure 5 gExtrait de viande 10 gGlucose 20 gKH2PO4 2 gMgSO4 0.25 gMnSO4 0.05 gPeptone 10 g

Milieu MRS BCPAcétate de sodium 5 gCitrate de sodium 2 gEau distillée qsp 1000 mlExtrait de levure 5 gExtrait de viande 10 gGlucose 20 gKH2PO4 2 gMgSO4 0.25 gMnSO4 0.05 gPeptone 10 gPourpre de bromocrésol 0.025 mg

Annexes

Milieu KMK (Kempler et McKay, 1980)Biopolytone 2.5 gEau distillée qsp 1000 mlExtrait de levure 3 gGlucose 5 gpH=6.6Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé (121°C, 15mn). Au moment del’emploi, 1 ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v) et 1 ml d’unesolution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p) sont ajoutés. Cessolutions sont stérilisées par filtration (millipores 0.22 μm) et sont conservées à l’obscurité a+4°C.

Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)Acétate de sodium 1.8 gAcide ascorbique 0,5 gAgar 10 gBiopolytone 5 gEau distillée qsp 1000 mlExtrait de levure 2.5 gExtrait de viande 5 gLactose 2 gL-Arginine 4 gPeptone papaînique de soja 5 gPourpre de bromocrésol 0.05 gpH 6.5.

Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)Azothydrate de sodium 0.075 gCitrate de sodium 1 gEau distillée qsp 1000 mlExtrait de levure 5 gGélatine 2,5 gGlucose 5 gSaccharose 100 gTryptone 10 gpH 6.5.

Milieu YMA (yeast milk agar)Eau distillée 1000 mlExtrait de levure 3 gGélose 15 gLait écrémé 1 gPeptone 5 gpH 7.0

Annexes

Milieu BHI (Brain Heart Infusion)Eau distillée qsp 1000 mlGlucose 2 gHNa2PO4 2.5 gInfusion de cervelle de veau 7.7 gInfusion de cœur de 9.8 gNaCl 5 gProtéose 10 gpH 7.2-7.6

Bouillon nutritifChlorure de sodium 5 gExtrait de levure 2 gExtrait de viande 1 gPeptone 5 gpH 7.4.

Eau physiologiqueChlorure de sodium 8.5 gEau distillée qsp 1000 mlPeptone 0.5 gpH 7.

Eau peptonéChlorure de sodium 5 gPeptone exemple d’indole 10 gpH 7.2.

Gélose nutritiveChlorure de sodium 5 gExtrait de levure 2 gExtrait de viande 1 gPeptone 5 gpH 7.4.

Lait écréméEau distillée qsp 100 mlExtrait de levure 0.5 gLait écrémé 10 gpH 7.0

Tous les milieux sont stérilisés par autoclavage à 121°C pendant 20mn sauf ceux contenant lelait (110°C pendant 10 min).

Résumé

Résumé

Résumé

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques ont été utilisées comme un moyen de conservation desdenrées alimentaires de point de vue santé et qualité. Les deux souches isolés à partir de lait cru de chèvre AlgérienLb. plantarum et Pc. pentosaceus présentant une forte activité bactériocinogénique contre L. ivanovii. Les deuxsubstances antimicrobiennes sont de nature protéique, et ont été synthétisées durant la phase stationnaire. Les deuxbactériocines sont thermostables jusqu'au 120°C pendant 15 min, stablent à un intervalle de pH 2 à 6, etinsensiblent à l’action des solvants organiques comme l’hexane et l’acétone. Ces bactériocines montrent unesensibilité remarquable après traitement par UV, la combinaison de certains épices à 5%, et sels à 5% avec cesbactériocines, peuvent être produites un effet synergique, rendant des microbes pathogènes comme L. ivanovii, etnous pouvant les stockées pendant trois mois à 4°C et -20°C. Ces bactériocines possèdent un effet bactéricide, etont une masse moléculaires de 3.25 kDa et 19 kDa. Les deux souches bactériocinogènes et ses bactériocinesmontrent des potentialités très intérissantes pour leurs applications dans les systèmes alimentaires notamment dansles produits laitiers.

Summary

Bacteriocins produced by lactic acid bacteria offer potential as tools for ensuring food safety and quality. Theantimicrobial peptides produced by Pidiococcus pentocaseus and Lactobacillus plantarum isolated from Algeriangoat’s milk were active against the pathogen Listeria ivanovii, expressed during the stationary growth phase andpossessed a bactericidal mode of action. The bacteriocins were thermally stable over a wide temperature range upto 120°C for 15 min and retained their activity at pH values between 2.0 and 6.0. Bacteriocins activity were stableafter three months of storage at 4°C and -20°C, for 75 min of exposure to UV light, bacteriocin produced by Pc.pentosaceus was completely destroyed, treatment with proteolytic enzymes resulted in a remarkable stability ofactivity. Results obtained showed an increase in bacteriocins activity of the strain against L. ivanovii on increasingthe concentration of NaCl and KCl up to 5%, in presence of spices 5%. SDS-PAGE analysis of the purifiedbacteriocins revealed an apparent molecular weight ranging from 3.25kDa for Lactobacillus plantarum and 19kDafor Pidiococcus pentocaseus. Results presented here support the idea that the bacteriocin may propose someindustrial advantage that renders it as a good natural food biopreservative candidate.

العربيصالملخ

،تھافي حفظ األغذیة وزیادة فترة تداول وتمدید صالحیبنیكللمض ااحالمنتجة من طرف بكتیریا المثبطات البكتیریةتستخدم Pidiococcusوھماحلیب المعز الجزائري المعزولة من ریامن البكتیساللتانتم انتقاء.یفي وتركیبي وكذلك بیئيظولھا تنوع و

pentocaseusوLactobacillus plantarum ممرضةالالعصویة البكتیریاعالي فعال ضد بنشاط و الالتي تمیزتاListeriaivanovii.121حتىالعالیة تصلفائقة على تحمل درجات الحرارةة قدرالبكتیریة بطات تمیزت ھذه المثبºھذا ،دقیقة15لمدة م

لمدة تمكنت ھذه المثبطات باالحتفاظ بفعالیتھا. 6إلى 2في الوسط الحامضي والقاعدي ما بین یتھافعالباإلضافة إلى ثباتدقیقة 90بنفسجیة لمدة البعد تعریضھا لألشعة فوق و كذلك ، م20º-و م4ºحرارة الحفظ و التخزیندرجةثالثة أشھر عند Lactobacillusبالنسبة للساللة plantarum .تقد تمیزذات طبیعة بروتینیة وأظھرت الدراسة أن ھذه المثبطات البكتیریة

التوابل المستخدمة من 5%و، كلورید الصودیوم وكلورید البوتاسیوممن 5%، الھیكسان واألسیتونفي وجود بثبات الفعالیةدراسة أن ھذه المثبطات البكتیریة تمتلك آلیة قاتلة ضد الھذهتوصلنا من خالل. سواء في حفظ الغذاء أو تحسین الطعم والنكھة

وبإیجاز یمكن أن .SDS-PAGEدالتون عن طریق و كیل19و 3.25لھما ب تم تحدید الوزن الجزیئي و ، الممرضةیاالبكتیر، الممرضةریانتائج السابقة تشیر إلى أن ھذه المثبطات ذات نشاط ممیز في القضاء على األنواع المختلفة من البكتینقول أن ال

یمكن تعدیل وتحسین خصائصھا إلمكانیة استخدامھا في المجال الصناعي خاصة في مجال حفظ األطعمة حیث یمكن و.المستھلكوامھا وخصائصھا الحسیة لدىإضافتھا إلى العدید من األغذیة للتأثیر على نسیجھا وق

Evolution de l'activité antimicrobienne des isolats de …Remerciments Ce travail s’est déroulé...

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