Évaluation de l'impact de produits toxiques sur le criquet de montagne Gomphocerus sibiricus...

Annales des Sciences Natwelles 34 (1998) 127-I 40 0 Elsevier, Paris

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lbaluation de l’impact de produits toxiques sur le criquet de montagne Gomphocerus sibiricus

(colchicine et 6-mercaptopurine)

Jacques Bouchard

Laboratoire de biologie e’volutive et dynamique des populations, universitk Paris-XI-&d, biit. 332, 91405 Orsay

(Regu le 22 janvier, accept6 apres revision le 25 juillet 1998)

Abstract - The mountain locust Gomphocerus sibiricus used as a model to test toxic drugs. We use Gomphocerus sibiri- CUS, a very common locust, strictly located between 2 000 and 2 800 m, in order to test its degree of susceptibility when treated with toxic agents. This species is extremely useful for histological investigations, all its organs having large cells, the fine structure of which appears quite remarkable. Our aim is to establish a practical method for evaluating industrial air poisoning, the consequences of which are soil and grass-eater poisoning.The present work is only a first step where we use two well known drugs, 6-mercaptopurine, a powerful antimetabolite, and colchicine, strongly antimitotic.We studied three mitotic rich tissues: testis, midgut epithelium and cEca1 epithelium. (i) 6-MP induces chromosomal abnormalities even with a low dosage of the drug. During prophase, it appears that the colorability into each chromosome can be extremely irregular, leading to the idea of an excessive asynchronism. Breakage and loss of chromosomes have been frequently observed, inducing multin- uclear and giant cell formation. All this corresponds to what can be called ‘antimetabolic syndrome’. (ii) Colchicine induces well known mitotical abnormalities depending on microtubule disturbance: at 3.6 and I .7.104 M, this drug induces essentially classical ball and exploded metaphases which are considered as arrested mitosis (stathmocinesis). Moreover, we saw that a low dosage, 0.8.10” M, first induces a stimulation of mitosis for 4 hours, then a true antimitotic effect finally leading to synchro- nization (I 3th hour) as a recovery. We can underline the fact that Gomphocerus clearly shows a differential cellular and mitotical sensitivity when treated with the drugs we used; consequently, this species appears very useful for experimental histo-cytological research. The complex, but clear-cut organisation of locusts is an advantage which gives us opportunities for ulterior research, histological or not, working with other drugs the effects of which could also concern other organs. 0 Elsevier, Paris

Gomphocerus sibiricus / colcbicine / 6-mercaptopurine / mitosis / cellular abnormalities / differential sensibility

RCsumC - Nous utilisons Gomphocerus sibiricus, criquet tres commun qui vit uniquement entre 2 000 et 2 800 m, pour Cva- luer son degre de susceptibilite vis-a-vis de substances toxiques. Cette espece est extremement pratique pour des travaux d’histologie, car tous ses organes sont faits de grandes cellules dont la structure est remarquable. Notre but est l’btablissement d’une methode pratique pour I’evaluation des degats produits par les polluants industriels transport& par l’air et qui provoquent la pollution du sol et I’intoxication de consommateurs primaires. Le present travail n’est qu’une premiere Ctape pour laquelle nous utilisons deux drogues bien connues, la 6-mercaptopurine, un antimetabolite puissant, et la colchicine, substance fortement antimitotique. Nous avons Ctudie trois tissus a grande activite mitotique : les testicules, i’epithelium de l’intestin

128 J. Boucharcl

moyen et celui des c5eca digestifs. La 6-MP provoque des anomalies chromosomiques mCme si sa concentration est faible. Pendant la prophase, la colorabilitC, le long d’un chromosome peut &tre extremement irrCguli&re, ce qui conduit B Cvoquer un asynchronisme excessif. Des cassures et des pertes de chromosomes ont CtC Mquemment observCes, ce qui induit la formation de cellules multinucl&es et de cellules geantes. Tout cela correspondant & ce que l’on peut qualitier de (( syndrome antimCta- bolique >). La colchicine provoque les anomalies mitotiques bien connues, consCquences de la dCsorganisation des microtubules : aux concentrations de 3,6 et 1,7. IO” M, la colchicine entraine la formation des mCtaphases << en boules >X ou << explo- &es )> qui sont considCrCes comme des mitoses bloquCes (stathm,ocin&se). Mais par ailleurs, avec la faible concentration O&l@ M, il y a, d’abord, une stimulation mitotique pendant 4 h, puis un effet antimitotique vCritable, conduisant finalement B une synchronisation (1 3e heure). Nous pouvons souligner le fait que Gomphocerus montre clairement une sensibilitk diff& rencielle vis-8-vis des drogues employCes ; en condquence, il nous semble qu’il peut &tre tr&s utile pour une recherche expCri- mentale histocytologique. L’organisation de ce criquet, complexe mais remarquablement Claire, est un avantage qui permet d’envisager un travail ultCrieur plus diversifik, histologique ou non, avec d’autres substances pouvant agir, aussi, sur d’autres organes. 0 Elsevier, Paris

Gomphocerus sibiticus / colchicine / 6-mercaptopurine / mitose / anomalies cellulaires / sensihilitk diffkencielle

1. INTRODUCTION

Gomphocerus sibiricus, Finot, 1890 (= Aeropus sibiricus, Chopard, 1947) est un criquet strictement alpin au sens Ccologique du terme. Ses biotopes sont situ& entre 2 000 et 2 800 m. 11 lui faut, en moyenne, 7 B 14” en juillet ; par ailleurs, il se reproduit en aofit, en plein soleil, sur un sol surchauffe ; mais les ceufs nkcessitent un froid vif et durable (criquet psychrophile ou encore << stenotherme-froid )j [ 141).

11 pullule et peut devenir nCfaste en haute Tarentaise [45], voire en haute Maurienne (obs. pers.). Et cela mal- grk la progression de la pollution atmosphCrique - moins forte qu’en fond de vallCe (Masclet, corn. pers.). On peut se demander s’il constituerait un bon materiel pour Cva- luer cette pollution et son Cvolution. Pour le savoir, il convenait d’estimer, en laboratoire, sa sensibilitk vis-g- vis de substances bien connues et faciles B doser.

Compte tenu de nombreux travaux plus ou moins anciens, quelles substances pouvait-on envisager de choisir pour une analyse histologique cent&e sur l’acti- vitC mitotique ? I1 y a trois groupes :

- les antimitotiques-antifusoriaux tels que la colchi- tine, la colcCmide, la podophylline, la podophyllotoxine, la vincaleucoblastine, la vincristine, etc., dont les effets ont CtC examines sur des animaux t&s divers et avec une extreme minutie (mises au point de Eigsti et Dustin [21], Deysson [ 151 et Dustin Jr. [18] ; Cornman [ 121, Creasey et Markiw [ 131, Borisy et Taylor [3], Lord [33], Begg et Ellis [I]) ;

- les antimitotiques essentiellement antichromosomiques, radiomimCtiques tels que I’aminoptCrine, la

trikthylbne-mClamine ou d’autres alkylants (travaux sur la mitose de Grampa et Dustin [27], travaux cliniques de Garattini et Palma [26] ou de Revesz et al. [37]), alkylants qui sont aussi reconnus mutagknes et carcinogknes [8]. Leurs effets sont alors beaucoup trop complexes pour notre propos immtdiat ;

- les antimitotiques-antimCtaboliques freinant ou bloquant la synthkse de I’ADN. Citons les antifoliques, antipuriques, antiglutamiques et antipyrimidiques [29, 3’01.

En fait, I’activitk biochimique spCcifique de chacune de ces substances n’a pas manqut d’&tre discutCe. 11 convenait, pour nous, d’effectuer ce test prkliminaire en employant deux molCcules bien connues, aux effets fon- damentalement distincts, mais saris nous illusionner sur la purett des &actions (voir discussions de Fitzgerald et Brehaut [23], de Stadler et Frenke [40], ou de Chai, Weinfeld et Sandberg [ 111, pour la colchicine ou la col- cCmide, par exemple).

De plus, on ne peut que rappeler la complexitC du ph&om&ne mitotique, bien soulignCe par une mise au point de Taylor [43] qui insiste sur l’interdkpendance de diverses molCcules intervenant sur la polym&isation et le fonctionnement des tubulines.

C’est pourquoi, dans un premier temps, nous avons inject6 diverses solutions d’un antimktabolite, la 6-mercaptopurine, et d’un antimitotique antifusorial, la colchi- tine. La colchicine est une substance que nous connais- sons bien, utile chez la souris pour analyser le << compor- tement )> de cellules normales ou soumises B l’action de toxiques plus ou moins carcinoghnes [5]. Aussi, avec les criquets, avons-nous insist6 sur 1’Ctude des effets de cet

Produits toxiques SW Gomphoceru.s sibiricus 129

alcalo’ide, en essayant de trouver une concentration effectivement antimitotique, c’est-a-dire depourvue de toxicitt notable, autrement dit, en essayant de travailler a la front&e du supportable pour le Gomphocbre. Tous les effets de la colchicine constituent les donnees de base, le stereotype qui doit nous permettre d’evaluer les effets d’autres toxiques, et, pour le moment, de la 6-mercaptopurine.

Nous avons constate que le materiel biologique employe se p&e a des analyses histologiques precises, compte tenu de la taille des cellules et de la finesse de leur structure. La photographie en noir et blanc ne donne qu’une idee approximative des avantages de ce materiel.

2. MATBRIEL ET MtiTHODES

Les criquets utilises sont tous des adultes males de Gomphocerus sibiricus preleves fin juillet entre 2 200 et 2 400 m sur l’adret de haute-Maurienne, au-dessus de Bon- neval-sur-Arc (La Cristallerie et les Druges). Leur poids varie entre 320 et 360 mg (vif).

Le milieu 199 de Sigma sert de vehicule pour les injections. L’activite mitotique des organes de G. sibiricus est &al&e durant une periode de 13 h apres une injection de 0.05 mL de ce meme milieu.

La colchicine (Fluka. SW.), alcaloi’de antifusorial, est utilisee en solution dans le 199 aux concentrations sui- vantes :

2,5.10-3 M, solution C, soit = 3,6.10A M dans l’animalt ; l,2.10w3 M, solution C/2, soit = I ,7.10A M dans l’animal ; 0,6.10-j M, solution C/4, soit = 0,8.10-4 M dans l’animal.

Les solutions sont preparees extemporanement. La 6-mercaptopurine {Wellcome et Cie, Londres) ana-

logue des purines, provoquant des lesions de I’ADN, est employee a la concentranon de 1 ,3,10e3 M (0,02 %), soit = 0,2.1 Op3 M dans l’animal.

Les injections sont faites A 8 h (TU). Les criquets sont placds dans des bocaux a&es contenant une quantite suffi- Sante de vegetation herbacee - essentiellement Jwzcusjac- quini. 11s s’alimentent presque immediatement apres l’injection.

Pour Cvaluer la cinetique des effets antimitotiques, nous prelevons periodiquement des lots d’animaux trait& durant une periode plus ou moins longue variant de 1 a 13 h. Chaque animal disseque est fixe en entier dans du liquide de Bouin. La double inclusion collodion paraffine est indis- pensable. Seriees, les coupes parasagittales de 5 pm sont

ensuite colorees en adaptant B l’espece la technique trichro- mique de Masson.

On effectue les comptages mitotiques au sein des organes les plus riches en mitoses chez les criquets adultes : l’intestin moyen et les coca sont tres propices. Les testicules ne conviennent pas pour des comptages mais permettent des observations cytomorphologiques. Au niveau intestinal - ou caecal - l’activitt mitotique est limitee aux nids de cellules claires qui jalonnent I’CpithClium. Ces nids sont constitues de six ou sept cellules ; et leur nombre est, gCnCralement, de 50 9 60 sur une coupe parasagittale de l’intestin moyen.

Une mesure du flux mitotique peut etre obtenue a partir de plusieurs coupes suffisamment espacees du m&me organe - par exemple une sur six ou sept - et si l’on note les mitoses (metaphases et ana-dlophases) pour deux cents, voire quatre cents nids d’un m&me individu, on ramene ensuite i cent nids2.

Ce flux est exprime en valeur absolue affectee de l’er- reur type - systeme applique lors de nombreux travaux par Bullough et ses collbgues chez les mammiferes [7].

3. RfiSULTATS

Rappelons-le, utiliser trois concentrations differentes de colchicine avait pour but de determiner celle qui aurait une activite essentiellement antimitotique sans toxicite parasite Cvidente.

Nous presentons, d’abord, les resultats microsco- piques correspondant aux effets des drogues sur les testicules puisque nous n’y avons pas fait de comptages. Et, pour les testicules comme pour I’CpithClium intestinal, nous presentons d’abord les effets de la 6-MP, nos observations &ant plus limitees qu’en utilisant la colchi- tine.

3.1. Effets de la 6-MP ou de la colchicine sur les testicules

3.1.1. Rkactions aprh injection de 644P

Durant les premieres heures, le traitement par la 6-MP ne conduit a rien d’evident ; les chromosomes peuvent apparaitre moniliformes et de colorabilite plus ou moins hettrogene.

1 Eigsti et Dustin preconisent des doses comprises entre IO-3 et IO4 M pour G les invertebres >> [21]. 2 Systkme de comptage preconise par Eigsti et Dustin [21] puisqu’il s’agit des mammiferes.

N d’unites histologiques )> comme les cryptes intestinales

130 J. Bouchard

Figure 1. Structure de I’CpithClium digestif normal de Gomphocerus. Ce document correspond A la jonction entre l’t5pithClium de l’intestin moyen (Z&f) et celui d’un czcum (C). Plusieurs nids sont visibles et fl&hCs (n) Voir I’anaphase (a) dans l’un d’eux. Remar- quer la bordure de microvillositCs (bmv) ; m : musculature intestinale, ici t&s mince ; mp : membrane pbritrophique en formation avec quelques dCbris cellulaires ; t : trachCes ; tM : tube de Malpighi. Figure 1. Structure of the normal digestive epithelium of Gomphocerus. This view corresponds to a junction between the epithelium of the midgut (ZM) and of a czcum (C). Some regenerative nests can be observed (arrows n) one with a mitose (anaphase, a); bmv: remarkable microvillosities of the striated border; m: the intestinal muscles. here extremely thin; mp: peritrophic membrane with some degenerated cells; t: tracheae; tM: malpighian tube.

Environ 13 h aprks le d&but du traitement, on constate que :

l la maturation des cellules sexuelles est t&s fortement freinCe ; leur Cvolution s’arrete fkquemment au stade spermatide ;

l de plus, les anomalies cellulaires ne sont pas rares et peuvent etre plus ou moins spectaculaires ; ainsi :

- des cellules souches (gonies) peuvent &tre pycnotiques ;

- des spermatocytes I ou II peuvent $tre anormaux ;

- des cellules gkantes, avec un ou plusieurs noyaux ou groupes chromosomiques (Blanche I) ; certaines d’entre elles sont t&s fortement hyperchromatiques et :souvent en pleine d6gCnkescence. 11 semble qu’il puisse is’agir, parfois, de cellules limitantes de cystes. Quoi- qu’il en soit, la 6-MP provoque une hypertrophie prC- coce et qui peut &tre monstrueuse. Alors que, normale- ment, les cellules limitantes, CC nourricikres D, restent de I:aille modeste et ne dkgknkrent, semble-t-il, qu’au moment de l’accouplement.

on voit souvent - des anaphases a ponts chromosomiques ; ce qui

implique de multiples liaisons aberrantes et irrkversibles entre les chromatides @lanehe II, figures 1 & 4),

3.1.2. R&actions aprk injection de colchicine

Quelle que soit la concentration utilisee, la colchi- tine (< bloque N rapidement, dks la 4e heure, les divi-

Planche I. Effets de la 6-MP sur le testicule. Treizigme heure. Figure 1. Cellules en mitose g la base du testicule. La plupart d’entre elles effectuent leur division de man&e normale : le fuseau parait &tre intact lors de ces debuts d’anaphases et les chromosomes bien rkpartis. c.n. : cellule nourrici&re ; C.p. : cellule pycnotique. Figure 2.. Tendance & l’asynchronisme des divisions de spermatocytes. Figure 3. Trois points sont & souligner : 1 tendance cedkmateuse dans la plupart des cystes ; 2 pycnose de deux cellules au niveau spermatocytes I ; 3 hypertrophie d’une cellule, par ailleurs en division, dans un cyste B spermatocytes II. Figure 4. Cyste B spermatocytes II montrant ici deux cellules hypertrophiCes. Figure 5. Cellule tr+s hypertrophike et nettement polyploi’de (cyste B spermatides). Figure 6. Phase finale de l’hypertrophie : cellule g macronoyau (N) et cytoplasme pCriph&ique tr&s basophile (C). La cellule voisine est complbtement pycnotique.

Prod&s toxiques sur Gomphocerus sibiricus 131

Planche I. Effects of 6-MP on testis; I 3th hour. Figure 1. Mitoses in a germarium. Most of the cells divide normally: spindles seem to be intact during anaphases and chromosomes are not scattered. c.p.: dead cell; CA: nutritive cell. Figure 2. Tendency towards asynchronism of spermatocyte divisions. Figure 3. Three points must be underlined: 1. the oedematous tendency in many cysts; 2. two cells are dead among spermatocytes I; 3. a dividing cell is hypertrophied in a cyst which contains spermatocytes II. Figure 4. Two cells are hypertrophied among spermatocytes II. Figure 5. Hypertrophy and polyploidy of a cell at the spermatid level. Figure 6. Subsequent evolution of hypertrophy: this cell has an enormous nucleus and the cortical part of the cytoplasm is strongly basophilic.

132 J. Bouchard

sions cellulaires, mitotiques ou mkiotiques : - avec la concentration la plus faible, C/4, les m&a-

phases <c n’kvoluent D plus ; le fuseau n’apparait pas nettement. 11 s’agit de mttaphases dites << en Ctoiles b>, dont les chromosomes sont distincts et orient& pour former une plaque (planche II,$gures 10 et 11) ;

- avec les concentrations C/2 et C, les mktaphases sont dites << en boules D car on ne rep&e plus les chromosomes qui, selon les donnCes classiques, sont entas- SCS sans ordre, mais non soudts. L’accumulation de mktaphases en boules est I’indice d’une action antimitotique forte, constquence de la destruction totale du fuseau - ou plut& de l’absence totale de polymkrisation cohkente des tubulines. De plus, on trouve aussi des mktaphases (< explodes >> oti les chromosomes sont dis- perk dans le cytoplasme ; ce qui est l’indice d’un effet antimitotique important de la drogue3.

La pycnose se produit seulement avec des doses dites toxiques. En fait, la toxicid de la solution C n’est pas Cvidente pour le testicule. Elle limite cependant la tentative de maturation des spermatides ou l’kvolution des spermatocytes II. Corrklativement, les tubes testiculaires sont pauvres en spermatides et spermatozo’ides au

niveau distal. Soulignons le fait qu’il est rare d’observer des cellules gkantes. On en trouve cependant avec la solution C/4.

3.2. Effets de la 6-MP ou de la colchicine sur I’intestin moyen et les czeca

Notons que, chez les tkmoins, le flux mitotique ne varie pas notablement pendant la durt5e de l’expkrimen- tation, c’est-&dire 13 h (graphique 1).

3.2.1. Rbactions aprh injection de 6MP

Contrairement aux rtactions testiculaires, il n’y a pas de monstruositks cellulaires Cvidentes.

1 Graphique 1

tbmoins 199 (intestin)

?-- t

1 4 8 10 13 h

inject. 199 dun% du traitement

Graphique 1. Indices d’activitk mitotique pour I’intestin des gotnphockres-tkmoins, aprks injection de 199. Graph 1. Mitotic index in the intestinal epithelium of gom- phocers, after injection of 199.

On constate cependant que les chromosomes de certaines promktaphases, courts ou dkjti clivCs, mais surtout des prophases dkbutantes, ont un aspect moniliforme (Blanche II, figures 5 j 9). Par ailleurs, la lumikre des c:eca contient de nombreuses cellules desquamkes, pycnotiques et qui sont entrainkes durant la migration de la membrane pCritrophique.

Au bout de 13 h, la 6-MP produit : l un gonflement des noyaux dans l’ensemble de

I’CpithClium intestinal et czcal ; la chromatine devient t&s finement granuleuse et la membrane nuclCaire s’estompe ; aspect pseudo-prophasique ;

l une pycnose disc&e dans les nids intestinaux, mais assez forte pour les caeca (tableau I) ;

Planche II. Figures l-4. Effets de la 6-MP sur le testicule ; treizikme heure. Divers exemples d’aberrations lors de I’anaphase. Le premier peut correspondre a une perte ou une fragmentation chromosomique. Les autres Cvoquent plut6t un empgtement ou la N fonte N des chromosomes. Figures 5-9. Effets de la 6-MP sur I’intestin moyen ; treizikme heure. Cinq exemples destinks k montrer I’aspect moniliforme du matkriel chromatique en fin de prophase. L’empltement est particulikrement net dam la figure 8. Ces photographies ne peuvent donner qu’un apergu d’une rt5alitC non Cquivoque B l’observation directe, en faisant varier la mise au point. Figures 10-11. Effets de la solution C/4 de colchicine sur I’intestin moyen, au bout de 4 h. Figure 10. Cette coupe longitudinale 1Cgkrement tangentielle ne passe pas par I’axe des cryptes Cpithkliales et I’Cpaisseur de la musculature intestinale (M) est nettement exagkrke. Cinq nids sont flCchCs ; on y rep&re quatre mktaphases. Figure 11. Un exemple de plaque mktaphasique en Ctoile. Les cliches 5-9 et II sont h la mCme Cchelle.

3 Mais pas plus important que la prksence des mktaphases en boules.

Prod&s toxiques sur Gomphocerus sibiricus 133

Planche II. Figures l-1. Effects of 6MP on testicular cells; 13th.hour. Abnormalities during anaphase. The first example can correspond to a loss or to a breakage of chromosomes. The others seem to show agglutination or “melting” of chromosomes. Figures 5-9. Effects of 6-MP on midgut; 13th hour. Five examples tending to show the great heterogeneity of the chromatic material during the end of prophases. Figure 8 shows a poorly stained substance partly covering the chromosomes (black). Their “moniliform” aspect is deli- cate to demonstrate with photography, but appears quite obvious during direct microscopical examination. Figures 10-11. Effects of colchicin (sol. C/4); 4th hour. Figure 10. Slightly tangential, this longitudinal section does not show the complete structure of epithelial crypts; and the intestinal muscle (M) appears thicker than normal. The arrows correspond to five cellular “nests” where four metaphases can be noted. Figure 11. A colchicin star-metaphase. Figures 5-9 and II are at the same scale.

134 J. Bouchard

Tableaux I et II. Evaluation comparative de quelques effets de la 6-MP et de la colchicine.

Tables I and II. Comparative evaluation of some effects of 6-MP and colchicine.

Intestin moyen Caeca

4e heure 1 3e heure 4e heure 1 3e heure

met a-t PYC met a-t PYC met a-t PYC met a-t PYC

t Milieu 199 11,s 4,15 0,6 11.7 3,38 1.2 9,26 2,59 0 12,93 2,74 0,63 +2,78 ?I,7 + 2,38 f 0,41 + 1,23 + 0,73 + I,7 + 0,46

6-MP 23,2 4 2,4 14,7 0,75 2,9 20,4 3,6 35 1 I.8 1,56 7,2 *4,54 +1,6 -1-0,6 k 3,23 ?0,3 ?0,9 + 5,6 * 1,3 * 1,2 + 1,26 +0,44 + 1,4

It Colchine C/4 50,24 0.72 0,7 1 34,7 2,6 0,75 46,4 0,9 0,98 383 1.4 0,8 +4,1 f 1,85 *0,6 + 4,2 f 3,s

Cl2 58,6 < 1 474 5,8 0,6 2,75 54,7 0 3 58,7 03 1,s + 6,2 r 0,7 f 4,3 f 0,8 k 4,6 zk 0,7 zk 5,4

C 18,l 0 59 42,9 0 4,39 16,7 0 3,26 37,6 0 4,39 +2 f 2,4 f 4,8 ir 1,8 +_ 2,3 -t 1,4 f 3,s f 1,7

pyc : Nombre de noyau pycnotiques pour 100 nids ; a-t : anaphases et t&phases pour 100 nids; met : metaphases pour 100 nids.

Tableau III. Effets de la colchicine en concentration faible (C/4). Table III. Effects of the weakest concentration of colchicine (C/4).

Duree du traitement lh 4h 6h 8h 10h 13h (h) - Mitoses et pycnoses met a-t pyc met a-t pyc m&t a-t pyc met a-t pyc met a-t pyc met a-t pyc

Temoins 199 intestin 16 2 0,9 11,s 4,75 0,6 - - - II 3,9 0,14 151 6,9 1,34 II,7 338 I,2 coca 1566 I,50 0,68 9,26 259 0 - - - 13,58 3.12 0,18 lo,73 3,27 1,44 12,93 2,74 0,63

Colchine C/4 intestin 19,2 0,9 0,66 50,24 0,72 0.71 30,24 I,7 1 14,13 0,2 0,63 14.9 0.2 0,25 34,7 2,6 0,75 cieca 21.3 1,1 0,62 46,4 0,9 0,98 22.9 1 0,7 20,02 0 I,8 IO.6 0.15 I,4 38,16 1,4 0.8

Tous les chiffres correspondant a 100 nids de cellules souches. Les erreurs types sont indiquees sur les graphiques. pyc : Nombre de noyau pycnotiques pour 100 nids ; a-t : anaphases et telophases pour 100 nids; met : metaphases pour IO0 nids.

l un effet antimitotique decelable seulement par une I’accumulation des metaphases en Ctoiles (4e heure). reduction du taux d’ana-telophases (de 3,38 a 0,75 au Les concentrations plus fortes provoquent la formation bout de 13 h pour l’intestin ; tableau I). de mttaphases essentiellement en boules.

3.2.2. Rt!actions apA injection de colchicine l Les trois solutions entrainent une pycnose ; eile

est B peine sensible chez les animaux inject& avec la solution C/4 (tableaux II et III), mais t&s nette avec la solution C (tableau IQ

Nous avons done choisi d’approfondir la chronologie des effets de la solution C/4 par rapport aux temoins 199.

Voici ce que l’on constate pour I’CpithClium de l’intestin moyen et des caeca (tableaux II, III et graphiques I et 2).

l Les trois solutions conduisent a un blocage m&a- phasique apparent. Seule la concentration C/4 permet

Produits toxiques sur Gomphocerus sibiricus 135

Le gruphiqne 1 ne permet pas de souligner l’existence d’une onde mitotique durant la journee chez les temoins 199, aussi bien pour l’intestin moyen que pour les caeca. La valeur relativement Clevee pour l’ensemble metaphases-anaphases-telophases dans l’epithelium intestinal, au bout de 10 h (18 h TU), ne parait pas avoir une signification veritable. D’autant que ce maximum ne se retrouve pas pour les caeca.

Le gvaphique 2 (solution C/4) montre que : l Les animaux reagissent precocement face a la

drogue ; le taux metaphasique est ClevC au bout de 4 heures pour l’epithelium des deux organes etudies. 11 est compris entre 40 et 50, alors que, a la meme heure, les taux de metaphases +ana-telophases des temoins ne sont que de 15,s et II,8 dans les memes organes. Cette elevation considerable des taux mttaphasiques est a peine inferieure a celle que l’on constate 4 h apres l’emploi de la solution C/2, legerement toxique (tableau Zr).

l Les taux metaphasiques s’effondrent jusqu’a la 10e heure, devenant proches des valeurs temoins.

IO

Graphique 2

0

1

1 4 6 6 10 13h

durbe du traitement colchicine 0,6.1 Oe3M (C/4)

Graphique 2. Indices mitotiques pour I’intestin et les caeca digestifs apr&s ingestion de colchicine B la concentration C/4. Graph 2. Mitotic index in the intestinal and czcal epithelium after ingestion of colchicine (C/4).

l Dans un troisieme temps, il y a remontee de ces taux pour les deux organes. 11s sont cependant un peu inferieurs a ceux de la 4e heure (aux alentours de 30-35 metaphases pour 100 nids de cellules << basales >)).

Cette fois, contrairement a ce que nous avons dit pour les temoins, les courbes obtenues ont une signification qui apparait clairement de man&e directe mais aussi en calculant l’intervalle de confiance a 5 % (graphique 3).

4. CONCLUSIONS

On sait a quel point les modifications des facteurs Ccologiques peuvent perturber les peuplements d’Ortho- pteres, et cela d’une man&e qu’il n’est pas toujours facile d’interpreter (voir [34], pour Culliptumus italicus, ou 1441 pour Gomphocerus sibiricus).

Par exemple, selon Johnson et Lincoln [31], l’aug- mentation du taux de CO, favoriserait la croissance de deux especes nord americaines de Melanoplus.

On est en droit de penser que de nombreux facteurs chimiques peuvent perturber, non seulement le metabo- lisme de criquets montagnards, mais aussi les conditions de la multiplication cellulaire. Lair qu’ils respirent ainsi que les plantes plus ou moins polluees dont ils se nour- rissent peuvent entrainer des troubles qu’il ne serait pas inutile de dCcele#.

l Les injections de colchicine, faites dans un but pre- paratoire, permettent d’etablir quelques rep&-es dont nous aurons besoin lorsque nous analyserons ulterieure- ment les effets de polluants atmospheriques susceptibles de se condenser sur des plantes devorees par les criquets. On sait que la colchicine est un outil que l’on Cva- lue - actuellement encore - depuis les travaux de AI? Dustin lui-mCme [17], et l? Dustin Jr. [20], qui ont mis en lumiere les effets de cette drogue et son role dans le blocage mitotique a la mttaphase par defaut de N fibres >> furosiales - par defaut de polymerisation des tubulines [ 191. On a utilise des materiels biologiques t&s divers, vCgCtaux ou animaux, mais force est de constater que ce sont les mammiferes qui ont fait l’objet de la majorit des recherches tant in vitro qu’in vivo. Sur des criquets, il apparait que les effets de la colchi- tine ont CtC rarement analyses et sont peu connus. Certes, d&s 1951, T. Tahmisian [41] avait remarque que cette substance agissait de faGon << interessante j> chez

4 Comme dans le cas du fluor ou du SO, agissant sur les lichens.

136 J. Boucharcl

Graphique 3

0’ , , , , , , , , , , , / , I 41 4 6 6 10 13h 4 6 6 10 13h

I dur& du traitement I

durhe du traitement Graphique 3. Intervalles

colchicine 0,6.1O”M (C/4) colchiclne 0,6.1U3M (C/4) de confiance B 5 70.

lntervalles de contiance I 5 %

Melanoplus differentialis ; il semble que ses resultats n’aient pas CtC exploit& F. Zajdela n’a pas poursuivi un travail qu’il avait entrepris avec Psophus pour tenter de mieux analyser la polypldidisation (corn. pets.). Cepen- dant, Gaulden et Carlson (251 se sont servis des neuroblastes de criquet pour dissequer in vitro les &apes du blocage mitotique, completant ainsi, de man&e particu- librement Claire, les etudes faites avec d’autres animaux ; en effet, les neuroblastes sont de grandes cellules qui montrent des chromosomes bien observables, a l’instar du fuseau, et, done, remarquablement propices a l’observation fine. Mueller, Gaulden et Drane ont employ&, en 197 1, le mCme materiel pour affiner une etude de la cinetique des effets de la colchicine in vitro [36]. 11 en sera question un peu plus loin.

Nous avons constate que Gomphocerus sibiricus possede aussi de grandes cellules dont la structure est tres propice a l’analyse mitotique et a la detection des aberrations nucleaires precedant ou non la pycnose. Nos resultats montrent que la concentration de colchicine C/4, a 0,6.10-3 M, est a la fois antimitotique et t&s fai- blement toxique. Elle correspond a une concentration intra-corporelle un peu inferieure a 1. 1OA M, concentration faible, compte tenu de ce que prtconise P. Dustin pour les pdikilothermes que sont les invert&b& (I OA a 1O-3 M).

L’etude des images Cvoquant le blocage mitotique n’apporte rien d’original. En revanche, I’analyse quan-

Graph 3. Confidence inter- vals (5 %).

titative des effets de la solution Cl4 sur une periode de 13 h pose quelques problemes que l’on peut tenter de nfsoudre. Les courbes obtenues pour l’intestin et pour les caeca n’apparaissent pas du tout rectilignes, contrairement a ce que les travaux de nombreux auteurs pouvaient laisser envisager. Mais ces travaux portaient sur les mammiferes et, dans ces cas, les doses de col- clhicine etaient relativement fortes comme nous l’avons c’onstate et precise en 1987 [5]. Deja, en 1987, nous avons souligne le fait que l’on pouvait obtenir, chez la souris, des courbes non rectilignes si l’on utilisait une concentration modeste, trois a quatre fois plus faible que celles dont parlaient les auteurs couramment cites (graphique 4). Nous avions tent6 une interpretation qui peut etre reprise et tres resumee, saris modification essentielle.

A premiere vue, le pit metaphasique de la 4e heure semble correspondre a un blocage tres transitoire du phenomene mitotique (graphique 2). Certes, ce pit est important et la chute du taux d’anaphases-telophases (a-t) est drastique : ce dernier passe de 4,75 et 2,59 chez les temoins a 0,72 et 0,9 chez les criquets colchicines (tableau HZ) : mais il n’est pas nul et il augmente un peu ou se maintient au bout de 6 h (1,7 et 1). Cela peut s’interpreter comme un c< Ccoulement )> ralenti du stock des metaphases de la 4e heure. Ce stock est <( CpuisC >> au blaut de 8-10 h puisqu’il n’y a plus guere d’anaphases ni de telophases a la 10e heure : 0,2 et 0,15.


En fait, les causes de cette accumulation metaphasique initiale nous paraissent pourtant un peu plus complexes. Nous envisageons que le pit metaphasique de la 4e heure puisse &tre la consequence d’un effet mito- declencheur initial, suivi, rapidement, d’un effet antifusorial conduisant a un ralentissement du cycle. En effet, nous savons que le blocage normal en G2 des cellules (c habilitees )> a se diviser peut Ctre plus ou moins long - sauf chez l’embryon - et, d’autre part, les tubulines sont associees a des molecules diverses, entre autres5. des proteines fibreuses particulieres, les MAP. On peut alors envisager que la colchicine, ainsi que d’autres antifusoriaux, puisse, dans un premier temps (a) lever un controle de la polymerisation ties tubulines effectue par des molecules associees, wire par un exces des tubulines stockees, ou bien (b) favoriser la liaison tubulines fac- teur(s) de nucleation au niveau des centres organisateurs centriolaires ou chromosomiques (MTOC) (voir [5], annexe no 2). Cela dans un premier temps.

Mais tres vite avec un bref decalage, la colchicine se concentrant dans les cellules, on arrive a un effet antifusorial qui se produit sans doute d&s la premiere heure puisque le taux d’ana-telophases est de 0,8 et 1,l. L’effet antimitotique se superpose a l’effet de recrutement, de mobilisation des cellules competentes que l’on decele dans les premieres heures, mais qui disparait apres 4 h : l’effet antimitotique devient dominant. La colchicine, dans un cas comme dans l’autre, pourrait agir sur les memes substances, inhibitrices ou favorisantes, mais ses effets s’inverseraient au-dessus d’une concentration seuil.

Ensuite, c’est-a-dire durant la ptriode qui precede la 10e heure, l’effet antimitotique parait intervenir seul ; mais sans accumulation metaphasique puisque, dans les tissus ttudies, intestin et c%ca, le (< balayage >> des cellules competentes, p&es a la division s’est effectue dans les premieres heures.

Enfin, l’animal metabolisant6 la colchicine, la concentration de celle-c:i diminue. Et le taux de metaphases redevient fort au bout de 13 h, atteignant des valeurs bien superieures a la normale. On est conduit a penser qu’il s’agit de la consequence d’une synchronisation provoquee precedernment par la drogue. Certes, le taux d’ana-telophases ent alors plus &eve, mais encore inferieur a la normale.

11 apparait que cette analyse est proche de celle que nous avons faite en travaillant sur plusieurs tissus normaux chez des souris [5]. Avec Gomphocerus la remontee secondaire du taux metaphasique se fait pourtant nettement plus tard (13e heure contre 8e heure chez les males et 10e chez les souris femelles). Mais, bien stir, il s’agit cette fois d’animaux a (< sang froid )k, qui. logique- ment doivent metaboliser plus lentement les drogues Pll.

Nous insistons sur le fait que le type de reaction obtenu ici, qui donne des courbes metaphasiques non rectilignes, depend de l’emploi d’une solution colchici- nique peu concentree (C/4). Nous avons vu que des solutions plus fortes, C/2 et C, conduisent d’emblee a la formation des metaphases anormales, essentiellement depourvues de fuseau, durablement bloqdes. La plupart des anciens auteurs, utilisant la colchicine ou la colcemide chez les mammiferes, employaient des doses fortes et ils ne tenaient pas compte de travaux de Brues7 [lo], qui preconisait l’emploi d’une dose deux a quatre fois plus faible que les leurs : (1 mg.kg-t soit 2,5.1O-‘j M pour la colchicine. Dose que Eigsti et Dustin ont consi- d&e comme un optimum [21].

Or, cette dose de 1 mg.kg-t nous a don& des courbes non rectilignes des 1966 [6] pour l’tpiderme de souris, puis, ensuite, pour d’autres tissus normaux (graphique 4). D’ailleurs, en 1967, pour l’intestin, Tannock obtenait, saris les interpreter, des resultats Cvoquant les notres avec la colchicine, la vinblastine et la vincristine alors que la colcemide ne lui donnait pas d’optimum

~421. Dans ces conditions, les resultats que nous avons

obtenus avec les criquets ne pouvaient guere nous Cton- ner (m&me si l’ordre de grandeur des trois concentrations Ctait nbcessairement bien superieur - lOA contre lt@),

Remarquons que l’idee que la colchicine puisse ini- tier la mitose au debut du traitement de nos souris ou de nos criyuets se trouve corroboree par un remarquable travail de Mueller, Gaulden et Drane [36]. Employant des neuroblastes de criquet (Melanoplus) Ctudits un par un in vitro, ils ont clairement constate que la colchicine declenche initialement la mitose dans les 308 minutes correspondant au traitement ( 197 1).

A priori, pourquoi n’en serait-il pas ainsi in vivo ? C’est d’ailleurs bien ce que nous avons constate chez la

5 MAP, actine, ARN, etc., wns compter les substances G non figurkes x telles que I’AMPc, la calmoduline, l’ATP, des proteiue-kinases, etc. (ex. : Donoso et al. [ 161 : Taylor [43]. 6 Ou excretant directement la colchicine. ’ I1 est vrai que Brues s’interessait au foie en regentration et que son travail pouvait paraitre succinct.

138 J. Bouchard

Graphique 4

dur6e du traitement

I I I I II I I I II 1 2 3 4 5 6 7 6 910h

d&e du traitement

Graphique 4. Effets de la colchicine (1 mg.kg-l) sur I’Cpiderme (Al) et SW 1’6pith6lium des cryptes duodenales (A2) de la souris adulte mble. Graph 4. Effects of colchicine (1 mg.kg-I) on the epidermis (Al) and on the epithelial cells of duodenal crypts (A2) of the male adult

souris, puisque, la mCme ann&e, nous obtenions le m$me effet in vivo (240’) et in vitro (360’) pour 1’6piderme normal - voire pour certaines tumeurs 6pidermiques [41 -. Enfin, il y a tout lieu de croire que cet effet mitogtine initial puisse &tre produit par les divers antimitotiques antifusoriaux : les r&ultats de Tannock paraissent l’indi- quer - sauf pour la colcCmide - et nous l’avons constad en comparant les effets de trois de ces substances sur 1’Cpiderme de l’oreille de souris : les rCsultats sont t&s voisins8 pour la colchicine, la vincaleucoblastine et la podophylline [5]. La podophyllotoxine serait trop fortement toxique, selon Loike et al. [32], pour jouer un r61e effectivement << clair )) au niveau fusorial.

Les injections de 6-mercaptopurine donnent des r&ultats moins divers qu’il nous semble inGressant de comparer St ce qui vient d’Ctre dit.

Auparavant, rappelons que cet analogue de l’hy- poxanthine synthCtisC par Elion, Burgi et Hitchings [22], fut un des premiers antimetabolites utilisCs - avec plus ou moins de succ&s - en chimiothkrapie anticancCreuse. I1 perturbe la synth&.se des purines [28, 291. Comme pour les autres antimktabolites, les recherches ont port6 sur divers types de cancers et leuc&mies plut& que sur des cellules normales. La nature des l&ions produites, essentiellement antichromosomiques, a poussC cher-

cheurs et cliniciens g combiner les antimCtabolites et les antifusoriaux pour tenter d’obtenir des effets plus nets et plus durables ; ils y sont d’ailleurs parvenus, ce qui sou- lignait bien l’intCr& qu’il y avait B comparer soigneuse- ment les deux types de drogues.

D&s 1961, Rich et Eidinoff [38] ont CvaluC la toxicit de la 6-MP sur des fibroblastes de poulet en culture et montrC qu’elle ttait maximale a la concentration 1.104 M, alors qu’il suffisait de 1.1O-6 M pour bloquer toute croissance de cellules d’un carcinome humain (H. Ep #l) ; et les premiers effets toxiques sur les cul- tures correspondaient aux concentrations 1-1O-5 et 1~10-7 M respectivement. La m$me annee, Biesele [2] n’obtenait que des r&sultats cytologiques N dkcevants N en observant des cellules H. Ep.2 traitCes par des concentrations du mCme ordre ; c’est tout juste s’il notait l’existence de quelques << mCtaphases )> g trois groupes de chromosomes ou franchement <c explosCes >>, tout en parlant de c< l&ions >) chromosomiques. Bien sQr, on sait maintenant que les lesions chromosomiques pro- voquCes par les antimktabolites sont invisibles dans leur t&s grande majorit&, que les cc erreurs >> provoqutes soient corrigCes ou qu’elles ne le soient pas. Mais les troubles observCs par Biesele ne manquaient pas d’intC- riit : les cassures et les collages - anaphasiques corres-

8 Malgrt des differences - qui n’ont rien d’ktonnant.


pondent & ce que l’on peut qualifier (( d’erreurs lourdes )j ; et la nature du phCnomcne conduisant & l’isolement de groupes de chromosomes plus ou moins fragment& mCritait aussi des analyses qui paraissent encore man- quer - les thkrapeutes continuant de privilegier le <c screening >> d’autres substances, par rapport B l’appro- fondissement des donnCes ant&ieures [24] ; ce qui n’est pas le cas pour les antifusoriaux, dont les effets, complexes, ne sont pas encore tous compris [9,39].

Une observation attentive des cellules du tube digestif et des testicules de C;. sibiricus nous conduit & penser que la 6-MP affecte t&s s&ieusement <c l’anachromase9 )). On constate, par ailleurs, l’existence de << perturbations lourdes >) avec cassures et collages chromosomiques, suivies parfois de monstruosids, de gigantisme cellulaire avec multiplication dCsordonnte de noyaux et pycnose partielle essentiellement au sein des testicules. Ces faits symptomatiques signent une atteinte des chromosomes au niveau ou au voisinage des kinCtochores, done au niveau de I’hCtCrochromatine jouxtant les microtubules fusoriaux. Mais ce sont les c< perturbations dis- c&es >> de l’anachromase qui paraissent &tre les plus significatives : les filaments chromatiniens granuleux, les chromosomes moniliformes, voire de colorabilitC hCtCrog&ne lo ou anormalement faible aux niveaux intestinal et c%cal, sont remarquables d& les premikres heures d’action de la Cl-MP. De plus, le gonflement de noyaux est tr&s frappant au bout de 13 h dans les nids des caeca, ce qui accentue l’aspect finement granuleux de la chromatine. La plupart des cellules ont alors un aspect prophasique ou prkprophasique pouvant Cvoquer une synchronisation des cellules.

Quels que soient les troubles p&is provoquCs par la drogue, il est clair qu’ils sont franchement diffkrents de ce que l’on observe al)& action de la colchicine. Et c’est bien 18 ce que nous esp&rions.

Notre travail sur Gomphocerus sibiricus permet d’envisager :

1) une expCrimentation de mCme nature avec des substances liposolubles. potentiellement carcinog2nes et qui existent maintenant dans l’atmosphkre avant de se condenser et de s’incorporer aux plantes ;

2)la comparaison des atmosph&es de divers sites plus ou moins pollds, cela dans des conditions initiales simples, de r&olte en milieu nature], et avec des moyens t&s modestes pour le dtSpouillement des premiers rCsul- tats.

RfiFkRENCES

Ul

PI

[31

[41

[51

[61

f71

PI

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9 Vieux terme qui, pourtant, caractkrise bien ce que l’on voit juste avant la prophase typique I0 Asynchronisme exagCr6 de la rCplication.

140 J. Bouchard

[ISI

[161

[I71

1181

u91

L91

[211

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1231

1241

WI

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Évaluation de l'impact de produits toxiques sur le criquet de montagne Gomphocerus sibiricus...

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