Etudes des modifications post-traductionnelles de la phosphatase...

UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER

Ecole doctorale Biologie - Santé - Biotechnologie

THESE

Pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III

Discipline : Biologie Cellulaire et Moléculaire

Présentée et soutenue par

Charlotte Mailhat

Le 31 Octobre 2007

Etudes des modifications post-traductionnelles de la

phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition

G2/M du cycle cellulaire

Directeur de thèse : Bernard DUCOMMUN

JURY

M. Bernard DUCOMMUN, Professeur Hospitalo-Universitaire, Toulouse Directeur de thèse

Mme May MORRIS, Chargée de Recherche CNRS, Montpellier Rapporteur

M. Patrick JOUIN Directeur de Recherche CNRS, Montpellier Rapporteur

M. John HICKMAN, Directeur Cancérologie SERVIER, Croissy sur Seine Examinateur

Mme Anastassia HATZOGLOU, Professeur des Universités, Toulouse Président du jury

Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109

118 route de Narbonne - Bâtiment 4R3 entrée B1 31062 TOULOUSE cedex 9

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Charlotte Mailhat�Esmenjaud – Thèse Biologie moléculaire et cellulaire – 31 Octobre 2007

Université Paul Sabatier Toulouse III – Ecole doctorale Biologie, Santé, Biotechnologie

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Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier l’ensemble des membres du jury pour avoir accepter de juger mon travail de thèse. Ce travail de thèse a été financé par le laboratoire pharmaceutique SERVIER et je remercie le

Docteur John Hickman pour son accueil chaleureux au sein du laboratoire de cancérologie de l’institut de recherche SERVIER. J’en profite également pour remercier le Docteur Roy Golsteyn et les membres de son équipe “Cycle cellulaire” : Aurélie et Céline qui ont accompagnés mon projet de recherche pendant un an au sein de l’IdRS et m’ont permis de découvrir le monde de la recherche en industrie. Je remercie le Professeur Bernard Ducommun pour m’avoir accueillie dans son équipe au sein

de LBCMCP et pour avoir endossé la casquette de directeur de thèse. Bernard je te remercie tout particulièrement pour ta patience, tes encouragements et ta

disponibilité, mais également pour m’avoir permis de terminer au mieux ce travail. Je remercie également tous les membres de l’équipe BDuc, en particulier Jean-Pierre pour son

aide précieuse pour la purification de Cdc25C et ses nombreux conseils aussi bien scientifiques que techniques qui m’ont permis d’avancer tout au long de ma thèse. Merci aussi à Odile, Martine et Valérie pour m’avoir aidée à avancer dans mes manipes de dernières minutes. Et je n’oublie pas l’ensemble des membres du LBCMCP pour m’avoir accompagnée et soutenue tout au long de ma thèse. Je tiens aussi à remercier Bernard Monsarrat et son équipe pour m’avoir permis de découvrir

les joies de la spectrométrie de masse et m’avoir permis d’accéder à la plateforme de spectrométrie de masse de la génopôle de Toulouse. Je remercie chaleureusement Carine pour ses formations, ses conseils et son aide précieuse dans les déchiffrages des spectres MS/MS. Pour terminer, je souhaite également remercier mes amis et ma famille : Tout d’abord, mes amies du labo : Corine T, Isa, Corine L, Christelle et Bernie qui m’ont

permis de passer trois supers années, et m’ont permis d’oublier les moments de stress et de découragement. Je regretterais non seulement toutes nos pauses thé ou café, les moments de détentes que nous avons passées ensemble mais aussi tout simplement votre présence et votre compagnie qui m’ont apporté beaucoup tout au long de ma thèse. Je pense également à Chrys avec qui nous nous sommes suivies tout au long de nos thèses

respectives et qui a partagée avec moi chaque étape de nos thèses. Et tous les Ginos qui me suivent maintenant depuis de nombreuses années et qui m’ont

toujours soutenue. Un grand merci à : Tibo, Annef, Mathieu, Marie-Alix, Marie-Pierre, Fabien, Sophie, Xavier, Laurent, Florent, Charlotte, Valérie et Gilles pour vos encouragements et votre amitié sans faille.

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Je souhaite enfin dire un petit mot de remerciement à ma famille et à ma belle-famille pour les grandes choses qu’ils m’ont permise de réaliser. Je remercie tout particulièrement mes parents et mes frères : Guillaume, Cyril et Maxime pour leur patience et leur gentillesse et leur compréhension… Et pour terminer, toutes mes pensées vont à mon mari Nicolas qui m’a toujours soutenue et

qui a joué une grande part dans la réussite de ce projet !

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Charlotte Mailhat-Esmenjaud

Etudes des modifications post-traductionnelles de la phosphatase

Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M du cycle

cellulaire

Directeur de thèse : Bernard Ducommun

Résumé :

La phosphatase Cdc25C est un acteur critique de la progression du cycle cellulaire par son rôle

jouée dans le contrôle de l’activation du complexe CDK1-Cycline B lors de l’entrée en mitose et

de la mise en place des mécanime de surveillance. Son activité est régulée par de nombreuses

kinases impliquées dans les cascades de signalisation cellulaire résultant dans la phosphorylation

de nombreux résidus. Au cours de cette étude, nous avons purifié Cdc25C à partir de cellules

humaines et réalisé une approche protéomique globale dans le but d’identifier de nouvelles

modifications régulatrices. Nous présentons dans ce manuscrit la mise au point des conditions de

purification de la phosphatase et les différentes modifications post-traductionnelles que nous

avons identifiées par spectrométrie de masse, en particulier deux phosphorylations sur les résidus

S168 et S263 et une méthylation sur le résidu R35. Pour terminer nous avons réalisé une analyse

fonctionnelle des phosphorylations sur les S168 et S263. Nous avons montré par imagerie

cellulaire que la mutation de la S263 en alanine conduisait à l’accumulation nucléaire de Cdc25C.

Nous proposons ainsi que la phosphorylation de la S263 soit impliquée dans un mécanisme de

régulation qui module l’import nucléaire de Cdc25C.

Mots clés :

Cycle cellulaire, points de contrôle, Cdc25C, phosphatase, modification post-traductionnelle, localisation.

Discipline administrative :

Biologie Cellulaire et Moléculaire

Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération

Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109

118 route de Narbonne - Bâtiment 4R3 entrée B1

31062 TOULOUSE cedex 9

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Liste des abréviations ADN : Acide DéoxyriboNucléique UV : Ultra- Violet CDK : Cycline Dependent Kinase MPF: M-phase promoting factor MCM : Mini-Chromosome Maintenance CAK : CDKs Activating Kinase CKIs : CDK inhibitors CRS : Cytoplasmique Retention Signal CAK : CDK Activating Kinase INK4 : Inhibitors of CDK4 ATP : Adenosyl tri phosphate MAT1 : Ménage à Trois Cks : CDC kinase subunit RINGO : Rapid Inducer of G2/M progression in Oocytes Cdc25 : Cycle de Division Cellulaire DSPases : Dual Specificity Phosphatase NES : Nuclear Export Signal NLS : Nuclear Localisation Signal APC : Anaphase Promoting Complex SCF : Skp1/Cullin/F-box) CK2 : Caséine Kinase 2 C-TAK1 : Cdc Twenty-five C Associated Kinase 1 CaMKII : Calcium calmoduline-dependent protein Kinase II Plk : Polo kinase Chk : Checkpoint Kinase IR : Radiation ionisante RPA : Replication Protein A MRN : Mre11/Rad50/NBS1 NHEJ : Non Homologous End Joining ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated ATR : ATM and Rad3 related PIKK : Phospho-Inositide 3-Kinase related Kinases p38SAPK : p38 Stress Ativated Protein Kinase MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase ERK : Extracellular-signal Related Kinase SAPKJNK : Stress Activated Protein Kinase/ c-Jun N-terminal Kinase MK2 : MAPKAP-K2 - MAP Kinase Activated Protein Kinase 2 Tap-tag : Tandem Affinity Purification tag BIA-MS : Biomolecular Interaction Analysis – Mass Spectrometry MPT : Modification Post-Traductionnelle MS : Mass Spectrometry ESI : Electrospray LC : Liquid chromtography SDS-PAGE : Sodium Dodécyl Sulfate- PolyAcrylamide Electrophoresis PI : point isoelectrique

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IEF : isoelectric focalisation PMF : Peptide Mass Figerprint MALDI :Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation TOF : Time Of Flight IT: Ion Trap Q : Quadrupole NCBI :National Center for Biotechnology Information IMAC : colonne d’ion metalliques immobilisé NTA : acide nitrilo-acétique HA : hemagglutinin du virus Influenza A IDA : Information-Dependant Acquisition PCC : Condensation prématurée de la chromatine

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE .......................................................................................................... 15 Préambule ............................................................................................................................................... 17

I- Biologie du cycle cellulaire ................................................................................................................ 19 I-2-A : Les complexes CDK-Cyclines ............................................................................................ 21 I-2-A-a : Les complexes CDK-Cycline dans le cycle cellulaire .............................................. 22 I-2-A-b : Les autres rôles des complexes CDK-Cycline ......................................................... 23

I-2-B : La régulation des complexes CDK-Cyclines .................................................................... 24 I-2-B-a : La liaison avec les Cyclines .......................................................................................... 24 I-2-B-b : Les inhibiteurs CKIs .................................................................................................... 27 I-2-B-c : Les modifications post-traductionnelles .................................................................... 28 (i) Phosphorylations activatrices ................................................................................................. 28 (ii) Phosphorylations inhibitrices ................................................................................................ 29 (iii) Déphosphorylations activatrices .......................................................................................... 29 I-2-B-d : Les autres mécanismes de régulation ......................................................................... 30

I-3-A : Présentations des phosphatases Cdc25 humaines ........................................................... 33 I-3-B : Caractérisation des phosphatases Cdc25 humaines ......................................................... 34 I-3-B-a : Le rôle des phosphatases Cdc25 dans le cycle cellulaire ......................................... 34 I-3-B-b : Régulation des phosphatases Cdc25 .......................................................................... 36 (i) Cdc25A ...................................................................................................................................... 36 (ii) Cdc25B ..................................................................................................................................... 39 (iii) Cdc25C .................................................................................................................................... 42

II- La réponse du cycle cellulaire aux dommages sur l’ADN .......................................................... 47 II-1-A : Dommages sur l’ADN et fonctionnement des points de contrôles ........................... 49 II-1-A-a : Les senseurs ................................................................................................................. 49 II-1-A-b : Les transducteurs ........................................................................................................ 49 (i) Les kinases apicales .................................................................................................................. 50 (ii) Les kinases distales ................................................................................................................. 51 II-1-A-c : les effecteurs ................................................................................................................ 51

II-1-B : Arrêt à la transition G1/S .................................................................................................. 52 II-1-C : Arrêt à la transition G2/M ................................................................................................ 53 II-1-C-a : Les événements de régulation post-traductionnels ................................................ 53 II-1-C-b : les événements de régulation transcriptionnelle ..................................................... 54

II-2-A : Modèle d’activation du point de contrôle G2/M en réponse aux stress génotoxiques .............................................................................................................................................................. 55 II-2-B : La sortie des points de contrôle ........................................................................................ 56 II-2-B-a : Retour dans le cycle cellulaire .................................................................................... 57 II-2-B-b : Apoptose ...................................................................................................................... 57

III- L’analyse protéomique ................................................................................................................... 61 III-1-A : Les interactions entre les protéines ................................................................................ 62 III-1-B : La recherche de modifications post-traductionnelles .................................................. 63 III-2-A : La séparation des protéines ............................................................................................. 68

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III-2-A-a : L’électrophorèse sur gel ............................................................................................ 68 III-2-A-b : La chromatographie .................................................................................................. 70

III-2-B : L’identification et la caractérisation des protéines ........................................................ 70 III-2-B-a : Histoire et principe de la spectrométrie de masse ................................................ 71 III-2-B-b : MALDI-TOF MS ..................................................................................................... 72 III-2-B-c : LC-ESI-MS ................................................................................................................. 73 III-2-B-d : La spectrométrie de masse en tandem ................................................................... 75

III-2-C : Les stratégies mises en œuvre pour l’identification des protéines .............................. 77 III-2-C-a : La protéolyse .............................................................................................................. 78 III-2-C-b: Spectrométrie de masse en protéomique ................................................................ 78 III-2-C-c : L’interrogation dans les banques de données ........................................................ 79

III-3-A : Détection des phosphopeptides ...................................................................................... 81 III-3-B : Détermination des sites de phosphorylation par MS/MS. .......................................... 82 III-3-C : Méthode d’enrichissement ............................................................................................... 82

RESULTATS .............................................................................................................................................. 85 Projet de thèse ........................................................................................................................................ 87 A- Situation du projet ............................................................................................................................ 87 B- Présentation des travaux de thèses................................................................................................. 88

I- Construction des outils ..................................................................................................................... 89 I-1 : Description de la lignée cellulaire ................................................................................................ 90 I-2 : Description de la stratégie de purification ................................................................................. 91 I-3 : Construction et clonage de la phosphatase Cdc25C ................................................................ 91 I-3-A : Construction du plasmide pUHD10 ::HA-Cdc25C-His ................................................ 91 I-3-B : Validation de la construction de HA-Cdc25C-His dans les U2OS .............................. 93

I-4 : Activation du point de contrôle en G2/M ................................................................................ 96 I-5 : Les Voies de signalisation en réponse au traitement étoposide ............................................ 100 I-6 : Validation de la stratégie de purification de HA-Cdc25C-His .............................................. 101 I-6 : Conclusion .................................................................................................................................... 102

II- Analyse protéomique ..................................................................................................................... 105 II-1 : Spectrométrie de masse et recherche de MPT ...................................................................... 105 II-1-A : préparation des échantillons ............................................................................................ 106 II-1-B : Recherche des modifications par spectrométrie de masse .......................................... 107

II-2 : Séparation par gels bidimensionnels ....................................................................................... 114 II-2-A : Cartographie par électrophorèse en gel bidimensionnel ............................................. 114 II-2-B : Effet de l’étoposide sur la cartographie des isoformes de Cdc25C par gels bidimensionnels ............................................................................................................................... 116

II-3 : Conclusion .................................................................................................................................. 117

III- Analyse fonctionnelle des phosphorylations S168p et S263p ................................................ 119 III-1 : Le développement des outils .................................................................................................. 119 III-1-A : Construction des mutants .............................................................................................. 119 III-1-B : Génération d’anticorps phospho-spécifiques .............................................................. 120

III-2 : Effet des mutants de Cdc25C ................................................................................................ 122 IV-1-A : Etude de la phosphorylation de la S263 ....................................................................... 124 IV-1-B : Etude de la phosphorylation de la S168 ....................................................................... 128

III-3 : Recherche des kinases impliquées dans la phosphorylation de S168 et S263 ................. 130

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III-4 : Conclusion ................................................................................................................................ 131

DISCUSSION .......................................................................................................................................... 133 I- Validation du modèle d’étude ........................................................................................................ 135

I-1 : La stratégie de purification ................................................................................................ 136 I-2 : Le contrôle du cycle cellulaire .......................................................................................... 137

II- Analyse protéomique ..................................................................................................................... 138 II-1 : La préparation de HA-Cdc25C-His pour la LC-MS/MS ........................................... 139 II-2 : Le taux de couverture de séquence ................................................................................ 140

III- Caractérisation fonctionnelle des phosphorylations identifiées............................................. 144 CONCLUSION GENERALE .............................................................................................................. 149

MATERIELS ET METHODES........................................................................................................... 153 I- Analyse des protéines ...................................................................................................................... 155 I-1 : Western blot ................................................................................................................................. 155 I-2 : Immunofluorescence .................................................................................................................. 155 I-2-A : Indirecte ............................................................................................................................... 155 I-2-B : Directe .................................................................................................................................. 156

I-3 : Cytométrie en flux ....................................................................................................................... 156 I-4 : Essais kinases in vitro ................................................................................................................... 156 II- Culture cellulaire ............................................................................................................................. 157 II-1 : cellules U2OS ............................................................................................................................. 157 II-2 : Transfection transitoire ............................................................................................................. 157 III- Extraction des protéines et purification .................................................................................... 158 III-1 : Protocole classique ................................................................................................................... 158 III-2 : Protocole adapté à la spectrométrie de masse et purifiactions .......................................... 158 IV- Protéomique .................................................................................................................................. 159 IV-1 : spectrométrie de masse ............................................................................................................ 159 IV-2 : Electrophorèse bidimensionnelle ........................................................................................... 160

ANNEXES ............................................................................................................................................... 161

BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................................. 173

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INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

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Préambule

Le cancer est défini comme une prolifération anormale de cellules saines ayant subi des

altérations spécifiques sur leurs génomes, les conduisant à acquérir les capacités nécessaires pour

échapper à la régulation homéostatique de la division cellulaire, envahir les tissus voisins et

générer des métastases vers des sites plus éloignés dans le corps humain. En France, les cancers

représentent la première cause de mortalité chez les hommes et la deuxième chez les femmes

après les maladies cardiovasculaires. 280 000 nouveaux cas sont détectés chaque année et 150 000

personnes en meurent. Un homme sur trois et une femme sur quatre décèderont d’un cancer. Un

thème central dans les efforts pour contrôler et éliminer les cancers est de promouvoir la

recherche en science fondamentale afin de mieux comprendre la biologie du cancer avec l’espoir

de générer de nouvelles interventions thérapeutiques qui pourraient être transformées en

traitements cliniques contre le cancer. Les cancers humains présentent de nombreuses altérations

génétiques qui peuvent conduire à plus d’une centaine de type de tumeurs différentes. Douglas

Hanan et Robert Weinberg ont proposé que six mutations essentielles du processus cellulaire

normal sont responsables de l’apparition de la majorité des cancers. Ces mutations sont :

« l’indépendance vis-à-vis des signaux prolifératifs, l’insensibilité aux signaux inhibiteurs de la

prolifération, l’abolition de la mort cellulaire par apoptose, une capacité proliférative illimitée, une

capacité à susciter l’angiogénèse et la capacité d’invasion de tissu et de prolifération dans des sites

étrangers (métastases) » (Hanahan and Weinberg, 2000). Afin de bien comprendre comment

l’instabilité du génome humain peut contribuer au phénotype tumoral, il est important de

connaître le fonctionnement du processus biologique fondamental avant qu’il ne dérive. Le

travail que nous présentons ici fait parti de l’effort compréhension de la biologie du cycle

cellulaire et la régulation de la machinerie de division cellulaire. Cette étude a également été

entreprise en collaboration avec un partenaire industriel dans le but de mettre en avant les

mécanismes conduisant aux dérégulations de la machinerie de division cellulaire qui pourraient

définir de nouvelles cibles de traitements contre les cancers.


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I- Biologie du cycle cellulaire

I-1 : Le cycle cellulaire

C’est au cours du cycle cellulaire qu’une cellule se divise pour donner naissance à deux cellules

filles identiques. La division cellulaire est à l’origine de la croissance et du développement de tous

les êtres vivants et est au centre de leurs hérédités et de l’évolution. Depuis que Rudolph Virchow

(1821–1902) a proclamé son célèbre “Omnis cellula e cellula”1, la compréhension des mécanismes

contrôlant la division cellulaire et la transmission fidèle de l’information génétique entre chaque

génération est considérée comme un problème majeur en biologie.

Les principaux évènements du cycle cellulaire sont définis par la réplication du matériel

génétique et la ségrégation du génome répliqué conduisant à la division de la cellule (Mitchison

and Creanor, 1971). Chez les eucaryotes ces évènements moléculaires et cellulaires sont séparés

dans le temps et l’espace et sont régulés suivant un ordre chronologique précis.

C’est au cours de la phase S (Synthesis) qu’à lieu la réplication semi-conservative des

chromosomes et la ségrégation des chromosomes répliqués est réalisée durant la phase M ou

mitose (le terme vient du grec mito qui signifie fil) où les chromosomes, visibles et condensés,

ségrègent pour donner deux cellules filles après la cytokinèse (Mitchison and Salmon, 2001). Les

phases G1 (Gap 1) et G2 (Gap 2) précédant respectivement la phase S et la mitose ont pour but

de préparer la cellule aux processus fondamentaux du cycle cellulaire. Au cours de la phase G1 la

cellule prépare la duplication de l’ADN et intègre les signaux environnementaux (mitogènes ou

facteurs de croissance) qui conduiront soit à sa division, soit à son entrée en phase G0 de pause

ou quiescence, soit à sa sortie du cycle cellulaire pour se différencier. La phase G2 est une étape

de transition qui permet à la cellule de se préparer à la division mitotique (figure 1).

Afin de s’assurer que chaque cellule nouvellement formée reçoive un génome complet, le

déroulement du cycle cellulaire est contrôlé de telle manière que chaque phase du cycle cellulaire

n’ait lieu qu’une seule fois par cycle et qu’aucune phase ne puisse commencer sans que les

précédentes ne se soient correctement déroulées. Ce sont les points de contrôle ou en anglais

checkpoint qui sont mis en place aux étapes clés du cycle cellulaire et assurent la coordination des

transitions entre les différentes étapes. Par exemple une cellule ne pourra pas se diviser si tous les


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chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque métaphasique ou ne pourra pas

répliquer son ADN avant d’avoir franchi la mitose (Hartwell and Weinert, 1989; Murray, 1993;

Smith et al., 2002). D’autre part, ces points de contrôle peuvent également provoquer une pause

dans la progression du cycle cellulaire pour permettre à la cellule de se défendre contre les

agressions extérieures à la cellule (radiations ionisantes, UV, drogues, etc.) ou provenant de la

cellule elle-même (radicaux oxygénés, erreurs de réplication, fourches de réplication arrêtées, etc.)

qui peuvent endommager l’ADN et perturber l’intégrité du matériel génétique.

I-2 : les complexes CDK-Cycline

Les kinases dépendantes des Cyclines (Cyclin-Dependent Kinases ou CDK) en association avec

les Cyclines régulatrices conduisent les événements du cycle cellulaire eucaryote et son horloge

interne (figure 2) (Morgan, 1997). Bien que la liaison avec les cyclines soit le premier

Figure 1 : Le cycle cellulaire des cellules eucaryotes

Représentation schématique du cycle cellulaire : la réplication fidèle du matériel génétique a lieu en phase S et la ségrégation du matériel génétique dupliqué a lieu en mitose ou phase M. Les phases G1 et G2 préparent respectivement la progression de la cellule vers la phase S et la phase M.


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déterminant de l’activité des CDK, dont l’expression et la dégradation cyclique donnent le

tempo pour chaque phase du cycle, d’autres facteurs régulent l’activité des complexes CDK-

Cyclines tels que la phosphorylation des CDKs et des cyclines, la déphosphorylation des

CDKs, la liaison à des protéines inhibitrices ou encore la localisation subcellulaire des

complexes CDK-Cyclines.

I-2-A : Les complexes CDK-Cyclines

Les travaux réalisés dans les années 1970 sur les ovocytes d’amphibiens ont conduit à la

découverte d’une activité enzymatique présente dans le cytoplasme, le MPF (M-phase promoting

factor) qui est capable d’induire l’entrée en méiose ou en mitose lorsqu’il est micro-injecté dans un

ovocyte ou une cellule (Ecker and Smith, 1971; Masui and Markert, 1971). Les études

biochimiques et génétiques menées en parallèle sur de nombreux organismes ont à leur tour

montré que le MPF est en fait constitué de la sous-unité enzymatique kinase dénommée

maintenant CDK1 (Russell and Nurse, 1986) et d’une sous-unité régulatrice correspondant à la

cycline de type B (Labbe et al., 1989). Le complexe CDK1-Cycline B qui est conservé de la levure

jusqu’à l’homme a alors été défini comme le régulateur universel de l’entrée en mitose.

A la suite de la découverte du complexe CDK1-Cycline B, de nombreux homologues des

CDKs et des cyclines ont été caractérisés chez divers organismes et sont impliqués dans la

progression de l’ensemble du cycle cellulaire, une CDK pouvant s’associer à différentes cyclines.

Il a également été montré que les complexes CDK-Cycline participaient aussi à la régulation

d’autres événements que le cycle cellulaire.

Actuellement chez l’homme 11 CDKs (CDK1 à CDK11) ont été caractérisées et au moins 29

gènes codant pour des protéines apparentées à la famille des cyclines par la présence d’une

séquence conservée de 150 acides-aminés : “la Cyclin box” ont été mis en évidence. Les cyclines

peuvent être classées en trois groupes : (i) Le groupe des cyclines de phase G1, auquel

appartiennent les Cyclines D et E et qui régulent la progression en phase S et la transition G1/S ;

(ii) Le groupe des cyclines de phase G2 auquel appartiennent les Cyclines A et B, impliquées dans

la transition G2/M (Murray and Marks, 2001) et (iii) le troisième groupe de cycline (notamment

les Cyclines C, K, L et T) qui est impliqué dans la régulation de la transcription (Murray and

Marks, 2001).


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I-2-A-a : Les complexes CDK-Cycline dans le cycle cellulaire

C’est l’association de la Cycline D, activée par les signaux mitogènes, avec les kinases CDK4 et

CDK6 qui assurent la progression de la phase G1 du cycle cellulaire. Ces complexes

phosphorylent et inhibent la protéine de sensibilité au rétinoblastome (Rb) qui libère alors le

facteur de transcription E2F et permet la transcription des gènes nécessaires à la transition G1/S.

Parmi les cibles de transcription du facteur E2F se trouvent les gènes codant pour les Cycline E,

A et B. La Cycline E est essentielle à l’activation de CDK2 et ainsi à la progression de la phase

G1 vers la phase S (Cobrinik, 2005; Malumbres and Barbacid, 2001, 2005). Ce processus est

supposé rendre les cellules indépendantes aux signaux mitogènes et correspond au fameux “point

de restriction” ou point de non retour, qui est défini comme un passage après lequel la cellule n’a

plus recours aux stimuli mitogènes pour engager sa division cellulaire (Dannenberg et al., 2000;

Malumbres and Barbacid, 2001; Sage et al., 2000). De récentes études ont montré que CDK3

pouvait, elle aussi, phosphoryler et inhiber la protéine Rb, il semblerait ainsi que le complexe

CDK3-Cycline C permette aux cellules de sortir de l’état de quiescence (G0) et assure le retour

des cellules à l’état prolifératif lors de la transition G0/G1 (Ren and Rollins, 2004).

La transition G1/S est alors stimulée par le complexe CDK2-Cycline E en permettant, entre

autre, aux protéines MCM (Mini-Chromosome Maintenance) de se fixer aux origines de réplication, ce

qui déclenche l’initiation de la réplication de l’ADN (Hwang and Clurman, 2005; Pagano et al.,

1993). Par ailleurs, CDK3 associée aux Cyclines A et E est peut-être aussi impliquée dans la

transition G1/S (Hengstschlager et al., 1999). Puis, une fois les cellules installées en phase S, le

complexe CDK2-Cycline E est réprimé afin de prévenir les phénomènes de “re-réplication” et le

complexe CDK2-Cycline A achève correctement la phase S et prépare la transition vers la phase

G2 (Hwang and Clurman, 2005; Malumbres and Barbacid, 2005). A la fin de la phase S la Cycline

A s’associe avec CDK1 et assure la progression tout au long de la phase G2, puis la Cycline A est

dégradée alors que la Cycline B est activement synthétisée. CDK1 s’associe alors avec la Cycline

B et conduit à la progression des cellules en mitose. Ce complexe, essentiel à la transition G2/M,

est responsable de la phosphorylation de plus de 70 protéines impliquées dans la progression du

cycle des cellules de mammifères. Sa localisation subcellulaire est finement régulée et permet de

contrôler son rôle dans la fragmentation du réseau golgien, la séparation des centrosomes, la

nucléation des microtubules, la condensation des chromosomes et la déstructuration de

l’enveloppe nucléaire (Nigg, 2001). Finalement la sortie de mitose est assurée par une chute


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brutale de l’activité CDK1-Cycline B via la dégradation de la Cycline B (Malumbres and Barbacid,

2005).

I-2-A-b : Les autres rôles des complexes CDK-Cycline

Les autres CDK ne sont pas impliquées dans la progression proprement dite du cycle

cellulaire. Les CDK7, 8, 9, 10 et 11 sont impliquées dans le contrôle de la transcription avec

néanmoins pour certaines d’entre-elles un rôle direct dans le contrôle du cycle cellulaire (Loyer et

al., 2005). Quant à CDK5, elle est activée par les protéines du cerveau p35 et p39 où elle aurait un

rôle dans le développement et la maintenance du système nerveux central. La dérégulation de

CDK5 est impliquée dans plusieurs maladies neurodégénératives et en particulier la maladie

d’Alzheimer (Cruz and Tsai, 2004; Kesavapany et al., 2004).

Figure 2 : Les complexes CDK-Cycline et la progression du cycle cellulaire

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par l’activation et l’inactivation successive des complexes CDK-Cycline.


24



I-2-B : La régulation des complexes CDK-Cyclines

Faisant suite aux études sur le cycle cellulaire qui ont menées à la découverte des CDKs,

quatre mécanismes majeurs de régulation se détachent et gouvernent l’activité des CDKs. Le

premier qui est aussi le principal est la liaison activatrice avec la sous-unité cycline régulatrice. Il

semblerait cependant que l’activation complète de la plupart des CDKs requiert aussi la

phosphorylation d’un résidu thréonine par la CAK (CDKs Activating Kinase). Enfin le complexe

pleinement actif peut aussi être inhibé : par la liaison avec les sous-unités inhibitrices des CDKs

(CKIs, CDK inhibitors) et par la présence de phosphorylations inhibitrices sur des résidus

conservés dans la région amino-terminale des CDKs.

La détermination de la structure de CDK2 (De Bondt et al., 1993), puis du complexe CDK2-

Cycline A (Jeffrey et al., 1995) associées à des études biochimiques, a permis de mieux

comprendre les mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité catalytique des complexes

CDK-Cycline.

I-2-B-a : La liaison avec les cyclines

La structure de CDK2 humaine est, comme pour les autres protéines kinases, constitué d’un

petit lobe amino-terminal, contenant le domaine PSTAIRE, associé à un lobe carboxy-terminal

plus grand. L’étroite cavité située entre ces deux lobes constitue le site actif. La forme non

modifiée et donc non active de CDK2 est alors caractérisée d’une part par la présence d’une

boucle flexible ou “T-Loop” sortant du lobe carboxy-terminal et qui ferme l’entrée du site

catalytique empêchant la liaison avec le substrat et d’autre part par le positionnement du domaine

PSTAIRE, qui gène la réaction de phosphorylation par un désalignement des résidus clés du site

catalytique (De Bondt et al., 1993 ; Morgan, 1995). Ainsi la protéine kinase doit subir un profond

changement pour pouvoir être activée. La liaison avec une cycline est une étape essentielle au

cours de l’activation des CDKs.

L’interaction entre les domaines “Cyclin box” de la Cycline A et le domaine PSTAIRE de

CDK2, a pour principale conséquence d’abaisser la boucle flexible T-Loop, qui obstruait le site

de liaison avec le substrat, et permet un réalignement des résidus importants pour la

phosphorylation du substrat qui sont ainsi dans une position plus favorable (figure 3). Ce

changement de conformation rend disponible aux phosphorylations un résidu thréonine


25



hautement conservé chez les CDKs (T161 sur CDK1 et T160 chez CDK2) (Jeffrey et al., 1995).

D’autre part, en plus du changement conformationnel favorable à l’activité de la kinase, le choix

de la cycline interagissant avec la kinase CDK va permettre de moduler la spécificité du substrat

de la kinase (Cross et al., 1999; Pines, 1995).

Figure 4 : Régulation temporelle de l’activité des complexes CDK-Cycline

La régulation fine de l’activité des complexes CDK-Cycline permet un contrôle de la progression dans chaque phase du cycle cellulaire (d’après Pines, Nature Cell biology 1999).

Figure 3 : Interaction entre CDK2 et la Cycline A

Représentation schématique de l’impact de la liaison de la Cycline A sur l’activation de CDK2. L’interaction se fait entre le domaine PSTAIRE de CDK2 et la séquence conservée des cyclines, la Cyclin box. L’impact majeur de cette interaction est le déplacement de la séquence T-loop qui obstruait le site catalytique de CDK2.


26



L’oscillation de la concentration des cyclines dans la cellule est en partie responsable des

changements dans l’activité des CDKs au cours du cycle cellulaire (figure 4) (Pines, 1999). Ainsi la

synthèse d’une cycline est responsable du passage à travers une phase particulière du cycle et sa

dégradation conduit à la transition vers la phase suivante. Le niveau des cyclines est donc

strictement contrôlé par un ensemble complexe de mécanismes actifs, aussi bien au niveau de la

transcription des gènes (Breeden, 2000) que de la dégradation des protéines, dépendante du

protéasome (Deshaies, 1995) et spécifique pour chaque étape du cycle cellulaire. En outre,

certaines cyclines possèdent des séquences de localisation cellulaire qui permettent de cibler la

kinase CDK associée dans un compartiment subcellulaire particulier et régulent son activité dans

l’espace en la maintenant éloignée de son substrat (Yang and Kornbluth, 1999). Une séquence

CRS (Cytoplasmique Retention Signal) permet à la Cycline B1 de se lier au facteur d’export nucléaire

Crm1 et conduit ainsi à une localisation principalement cytoplasmique au cours de la phase G2

(Hagting et al., 1998; Porter et al., 2003). Lors de l’entrée en mitose, la Cycline B1 est

phosphorylée par CDK1 et Plk1, elle ne peut plus être exportée ce qui conduit à la relocalisation

nucléaire du complexe CDK1-Cycline B1 (figure 5) (Toyoshima-Morimoto et al., 2001).

Figure 5 : Localisation de CDK1-Cycline B au cours du cycle cellulaire

Le complexe CDK1-Cycline B, même après son activation par la CAK, est maintenu dans le cytoplasme par un export nucléaire supérieur à son import. En fin de phase G2 le complexe devient nucléaire pour assurer la mitose et est dégradé en fin de phase M, conduisant à la sortie de mitose.


27



I-2-B-b : Les inhibiteurs CKIs

Les inhibiteurs des CDKs ou CKIs sont des petites protéines qui ont la capacité de se lier aux

complexes CDK-Cycline afin d’inhiber leurs activités. Des analyses biochimiques ainsi que des

études cristallographiques ont permis de révéler les mécanismes d’action par lesquels ces

inhibiteurs abolissent l’activité des CDKs. Ils sont au nombre de trois : l’inhibition directe de

l’activité kinase du complexe CDK, l’interférence contre l’activation des CDKs par la CAK (CDK

Activating Kinase) et enfin la compétition avec les Cyclines pour la liaison aux CDKs (figure 6)

(Arellano and Moreno, 1997). Chez les mammifères, il existe deux familles de CKIs : la famille

Cip/Kip et la famille INK4 (Inhibitors of CDK4) (Elledge et al., 1996). La famille Cip/Kip

comprend trois membres p21 WAF1/CIP1, p27KIP1 et p57KIP2, qui ont la capacité d’interagir avec tous

les complexes CDK-Cyclines. La détermination de la structure du complexe CDK2-Cycline A-

p27KIP1 a permis de mieux comprendre leurs mécanismes d’action (figure 7) (Russo et al., 1996).

p27KIP1 se lie avec la Cycline A par son domaine amino-terminal (sans affecter sa structure) alors

que sa région carboxy-terminale interagit fortement avec le lobe supérieur de CDK2, ce qui

conduit à changement conformationnel et empêche la fixation de CDK2 à l’ATP. La famille

INK4 comprend quatre membres : p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, et p19INK4d qui inhibent

spécifiquement CDK4 et CDK6 en empêchant leur association avec la Cycline D (figure 6) (Russo

et al., 1998).

Figure 6 : Les inhibiteurs des CDK

Répartition des inhibiteurs de CDK (CKI) dans le cycle cellulaire. La famille Cip/Kip inhibe tous les complexes CDK-Cycline et la famille INK4 inhibe uniquement les complexes CDK4/6-Cycline D.


28



I-2-B-c : Les modifications post-traductionnelles

Les modifications post-traductionnelles sont impliquées dans la régulation de nombreux

mécanismes du cycle cellulaire (voir plus loin). Dans le cas particulier de la régulation des

complexes CDK-Cycline, un jeu de phosphorylations/déphosphorylations de la sous-unité

catalytique CDK intervient, soit pour renforcer l’activité de la kinase, soit pour l’inhiber (figure 8).

(i) Phosphorylations activatrices

L’association avec la Cycline B n’est pas suffisante pour activer pleinement le complexe

CDK1-Cycline B. L’activation nécessite la phosphorylation du résidu thréonine 161 (T161)

présent sur la séquence T-Loop. La kinase CAK est responsable de cette phosphorylation durant

la phase G2 (Solomon et al., 1992; Watanabe et al., 2005). Chez les vertébrés la CAK est un

complexe trimérique constitué de la kinase CDK7 et des protéines Cycline H et MAT1 (Ménage à

Figure 7 : Inhibition des complexes CDK-Cycline par les CKI Les CKI inhibent les CDK soit par une liaison directe avec le complexe CDK-Cycline, soit par une compétition avec la Cycline.


29



Trois) (Harper and Elledge, 1998). La déphosphorylation semble ensuite être assurée par les

phosphatases de la famille PP2C et PP2A (Cheng et al., 2000; Lee et al., 1994; Lorca et al., 1992).

(ii) Phosphorylations inhibitrices

Les complexes CDK-Cycline impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire sont inhibés par

une phosphorylation de la kinase CDK au niveau du résidu tyrosine 15 (Y15) fortement conservé

au cours de l’évolution (Gu et al., 1992). Chez les eucaryotes supérieurs, un deuxième site de

phosphorylation sur la thréonine 14 (T14) est aussi impliqué dans l’inactivation du complexe et

semble simplement renforcer l’inactivation de CDK1 (Krek and Nigg, 1991; Norbury et al.,

1991). Les T14 et Y15 sont toutes les deux situées dans le site catalytique de la kinase à proximité

du site de liaison de l’ATP sur CDK1 et leurs phosphorylations empêcheraient la fixation de

l’ATP ou la reconnaissance du substrat (Berry and Gould, 1996; Morgan, 1997). Wee1 est la

kinase responsable de la phosphorylation sur la Y15 de CDK1 dans les cellules en interphase afin

d’empêcher l’activation du complexe CDK1-Cycline B avant l’entrée en mitose (Russell et al.,

1989). Chez les vertébrés la kinase Myt1, une kinase transmembranaire localisée au niveau du

réticulum endoplasmique apparentée à la famille de Wee1, phosphoryle aussi bien la T14 et la

Y15 (Booher et al., 1997; Mueller et al., 1995). La modulation du taux de phosphorylation sur ces

deux sites est particulièrement importante pour l’activation du complexe CDK1- Cycline B à

l’entrée de la mitose, mais participe également au contrôle de l’activation des CDKs à la transition

G1/S ainsi qu’en phase S.

(iii) Déphosphorylations activatrices

La Y15 et la T14 de CDK1 sont déphosphorylées par les phosphatases de la famille Cdc25,

qui sont conservées au cours de l’évolution. Trois isoformes ont été identifiés chez les

mammifères : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C, et feront l’objet de la partie suivante de l’introduction

générale.


30



I-2-B-d : Les autres mécanismes de régulation

Suc1 identifiée chez Schizoaccharomyces pombe est une petite protéine adaptatrice qui appartient à

la famille des Cks (CDC kinase subunit) et a la particularité de pouvoir s’associer aux CDKs. Les

Cks sont conservées de la levure jusqu’à l’homme (Cksh1 et Cksh2), et malgré la structure

cristallographique du complexe Cks1-CDK2 (Jeffrey et al., 1995), leurs rôles restent mal connus.

Il semblerait cependant que la liaison de Cks1 créé un site de liaison aux phosphoprotéines pour

le complexe CDK-Cycline et aurait un rôle activateur lors de l’entrée en mitose et inhibiteur en

fin de mitose (Harper, 2001; Pines, 1996).

Enfin, plus récemment, il a été montré chez le xénope que les CDKs pouvaient être activées

par leur association avec les protéines RINGO (Rapid Inducer of G2/M progression in Oocytes) sans

recourir à une liaison avec une Cycline (Nebreda, 2006). Ces protéines sont nécessaires à la

Figure 8 : Régulation du complexe CDK1-Cycline B

L’activation complète du complexe CDK1-Cycline B nécessite en plus de la déphosphorylation des résidus Y15 et T14, préalablement phosphorylés par Wee1, la phosphorylation par la CAK du résidu T161 dans la séquence T-loop.


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maturation de l’ovocyte et peuvent s’associer à CDK1 et CDK2 et l’interaction avec RINGO

suffit à la pleine activation de CDK1-RINGO et CDK2-RINGO sans avoir recours à la

phosphorylation par la CAK sur les thréonines 161 et 160 respectivement (Ferby et al., 1999;

Lenormand et al., 1999).

I-3 : Les phosphatases Cdc25

La complémentation fonctionnelle du mutant Cdc25 chez la levure à fission Schizosaccharomyces

pombe a permis de mettre en évidence une protéine jouant un rôle majeur dans le Cycle de

Division Cellulaire (Cdc25) (Russell and Nurse, 1986). La délétion de Cdc25 dans la levure

entraine une absence de division cellulaire accompagnée d’une croissance anormale de la cellule.

Cela suggère que Cdc25, fonctionnant comme un antagoniste de Wee1, qui est un inhibiteur de la

progression dans le cycle cellulaire (voir plus haut), est essentielle pour l’entrée en mitose (Gould

and Nurse, 1989; Russell and Nurse, 1986). Plusieurs études ont permis de caractériser Cdc25

comme une phosphatase impliquée dans la déphosphorylation activatrice du résidu tyrosine 15 de

la kinase CDK1 : (i) tout d’abord la preuve phénotypique que Cdc25 était un antagoniste de la

protéine kinase Wee1 ; (ii) l’accumulation de complexes CDK1-Cycline B inactifs car

phosphorylés sur la tyrosine 15 corrélée à l’augmentation du taux de phosphotyrosine dans les

cellules délétées pour Cdc25 ; (iii) la mutation du résidu tyrosine 15 de CDK1 en phénylalanine

qui rend les cellules de levure résistantes à la délétion de Cdc25 (Gould and Nurse, 1989) et (iv)

l’ajout de Cdc25 purifiée à des extraits d’ovocyte de xénope qui induit leur entrée en mitose

accompagnée d’une déphosphorylation du résidu Y15 de CDK1 et d’une augmentation de

l’activité du complexe CDK1-Cycline B (Jessus and Beach, 1992; Kumagai and Dunphy, 1991).

Mais il fut montré que le produit du gène cdc25 était en réalité une phosphatase atypique. Cdc25

est en effet capable de déphosphoryler à la fois un résidu tyrosine et un résidu thréonine sur la

même molécule (Millar and Russell, 1992). Elle a donc été classée au sein d’une sous famille : les

phosphatases à double spécificité ou DSPases (Dual Specificity Phosphatase) qui appartiennent à la

famille des phosphatases à spécificité tyrosine (PTPases).

Il a été ensuite clairement établi dans les cellules humaines que Cdc25 catalyse la réaction de

déphosphorylation des résidus tyrosine 15 et thréonine 14 de CDK1 préalablement phosphorylés

par les kinases Wee1 et Myt1 (Honda et al., 1993; Sebastian et al., 1993). Trois homologues de

Cdc25 : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C ont été identifiés chez les mammifères et plus


32



particulièrement chez l’homme soit par complémentation fonctionnelle dans la souche de levure

Cdc25-22TS, soit par PCR avec des amorces dégénérées dirigées contre les séquences conservées

entre les Cdc25 (Galaktionov and Beach, 1991; Nagata et al., 1991; Sadhu et al., 1990).

Les trois homologues humains complémentent avec succès la souche mutante de levure

Cdc25-22TS. Il est maintenant connu que leur expression est dépendante du cycle cellulaire dans

les cellules de mammifères : l’ARNm de Cdc25C est majoritairement exprimé au cours des

phases G2 et M, l’expression de l’ARNm de Cdc25B oscille tout au long du cycle cellulaire et est

prédominante en phase G2, enfin l’expression de l’ARNm de Cdc25A oscille aussi au long du

cycle cellulaire avec un pic d’expression au cours des phases G1 et S (Jinno et al., 1994; Sadhu et

al., 1990)(Nagata 1991).

Figure 9 : Les phosphatases Cdc25 au cours du cycle cellulaire

Les phosphatases Cdc25A, B et C sont impliquées dans la progression du cycle cellulaire par la déphosphorylation activatrice des CDK. Chaque phosphatase Cdc25 participe à plusieurs étapes clés cycle cellulaire.


33



I-3-A : Présentations des phosphatases Cdc25 humaines

La majorité des travaux qui ont été abordés ici se rapportera aux phosphatases Cdc25

humaines. Ceux qui concernent d’autres organismes, comme la levure ou le xénope seront

présentés soit pour appuyer les résultats obtenus dans les cellules humaines, soit pour apporter

des données complémentaires.

Les trois isoformes humains Cdc25 sont codés par trois gènes situés sur des chromosomes

différents Cdc25A localisé en 3p21, Cdc25B en 20p13 et Cdc25C en 5q31. La famille des Cdc25

humaines est encore compliquée par un épissage alternatif qui génère au moins deux variants

pour Cdc25A (Wegener et al., 2000) et cinq de chaque pour Cdc25B (Baldin et al., 1997b; Forrest

et al., 1999) et Cdc25C (Bureik et al., 2000; Wegener et al., 2000). Bien que le rôle exact de ces

différents variants d’épissage soit inconnu, il semblerait que dans les cas de Cdc25A et Cdc25C,

les variants d’épissage jouent un rôle différent en fonction des lignées cellulaires ou diffèrent dans

leur distribution au sein du cycle cellulaire. De plus l’épissage alternatif pourrait éliminer des sites

consensus de phosphorylation spécifiques, soumettant ainsi les variants d’épissage à des

mécanismes de régulation différents. La délétion de tels motifs chez Cdc25B conduit à une

diminution de son activité phosphatase et l’activité de Cdc25C a été décrite comme étant

augmentée à la suite de phosphorylation (Baldin et al., 1997b; Gabrielli et al., 1997; Theis-Febvre

et al., 2003; Wegener et al., 2000).

Au niveau protéique, les DSPases Cdc25 sont structuralement divisées en deux domaines

majeurs : un domaine carboxy-terminal hautement conservé représentant environ 30% de la

protéine et délimité par le motif LIGD ; et un domaine amino-terminal dont la taille varie et qui

est peu conservé entre les trois isoformes humains (Draetta and Eckstein, 1997). Le cœur

catalytique des Cdc25 constitué du motif canonique des PTPases HCX5R (ou X représente

n’importe quel acide-aminé) est situé dans le domaine carboxy-terminal. Ainsi, alors que le

domaine carboxy-terminal des Cdc25 renferme la machinerie catalytique de l’enzyme, le domaine

amino-terminal est perçu comme la région régulatrice de la protéine contenant de nombreux sites

de phosphorylation qui peuvent agir soit comme des activateurs, soit comme des inhibiteurs de

l’enzyme (Bulavin et al., 2002; Draetta and Eckstein, 1997; Lyon et al., 2002; Nilsson and

Hoffmann, 2000).

Les structures des cristaux des domaines catalytiques de Cdc25A et Cdc25B ont été résolus à

2,3Å et 1,9Å respectivement mais aucune structure de Cdc25 pleine taille n’a été décrite. Les deux

phosphatases contiennent le motif consensus HCX5R caractéristique du site catalytique des


34



PSPases, niché au sein du motif structurel “P-loop” typique des phosphatases à spécificité

tyrosine (Fauman et al., 1998; Reynolds et al., 1999; Zhang, 1998). Les données de structure

semblent appuyer les études biochimiques qui suggèrent que dans le cas de Cdc25B sa spécificité

avec le substrat est régulée par sa queue carboxy-terminale de 17 acides-aminés et que Cdc25A

nécessite un degré de promiscuité plus élevé pour la sélection de son substrat (Wilborn et al.,

2001; Xia et al., 1999).

I-3-B : Caractérisation des phosphatases Cdc25 humaines

I-3-B-a : Le rôle des phosphatases Cdc25 dans le cycle cellulaire

Les rôles de Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C dans les différentes phases du cycle cellulaire ont été

bien étudiés (figure 9).

La principale fonction attribuée à Cdc25A est de promouvoir la transition G1/S du cycle

cellulaire et la progression en phase S par la déphosphorylation activatrice des complexes CDK2-

Cycline E et CDK2-Cycline A. En effet la surexpression de Cdc25A dans les cellules humaines

accélère l’entrée en phase S avec une activation prématurée de la kinase CDK2, alors que la

micro-injection d’anticorps dirigés contre Cdc25A dans des cellules synchronisées en phase G1

provoque un arrêt du cycle cellulaire (Blomberg and Hoffmann, 1999; Hoffmann et al., 1994;

Jinno et al., 1994). Cependant le niveau protéique de Cdc25A ainsi que son activité restent élevés

après la phase S et augmentent jusqu’à l’entrée des cellules en mitoses où Cdc25A est dégradée

(Bernardi et al., 2000; Molinari et al., 2000), suggérant un rôle à la transition G2/M. En fait c’est

le complexe CDK1-Cycline B1 qui, en phosphorylant Cdc25A, permet sa stabilisation jusqu’à

l’entrée des cellules en mitose (Mailand et al., 2002). De plus l’inhibition de l’expression de

Cdc25A par ARN interférence entraîne une diminution du nombre de cellules entrant en mitose

alors que sa surexpression conduit à une entrée prématurée des cellules en mitose par

déphosphorylation du complexe CDK1-Cycline B1 (Lindqvist et al., 2005; Mailand et al., 2002).

L’inhibition de Cdc25B par la micro-injection d’anticorps conduit à un arrêt des cellules en

phase G2 (Honda et al., 1993; Lammer et al., 1998). Ainsi Cdc25B a été initialement décrite

comme étant impliquée dans l’entrée des cellules en mitose en déphosphorylant le complexe

CDK1-Cycline B1 (Gabrielli et al., 1997). De plus, Cdc25B est capable de déphosphoryler


35



d’autres complexes CDK-Cycline dont la spécificité est dépendante du cycle cellulaire : CDK2-

Cycline A en phase S (Goldstone et al., 2001) (Lammer et al., 1998) et CDK1-Cycline A en phase

G2 (Sebastian et al., 1993) (Lammer et al., 1998). Enfin une autre étude a proposé un rôle de

Cdc25B en phase S (Garner-Hamrick and Fisher, 1998).

Il a tout d’abord été admis que Cdc25C induisait l’entrée des cellules en mitose et catalysait la

progression mitotique par la déphosphorylation du complexe CDK1-Cycline B1 (Gautier et al.,

1991; Lee et al., 1992; Millar et al., 1991b; Strausfeld et al., 1991). En effet la micro-injection

d’anticorps dirigés contre Cdc25C conduit à l’arrêt des cellules en phase G2 (Millar et al., 1991a)

et son activité phosphatase est maximale en ce point du cycle cellulaire (Hoffmann et al., 1993).

De plus Cdc25C déphosphoryle uniquement le complexe CDK1-Cycline B1 (Gabrielli et al.,

1997). Cependant des études plus récentes ont permis de montrer que Cdc25C jouerait également

un rôle lors la transition G1/S (figure 9). En effet, la micro-injection d’ARN antisens dirigés

contre l’ARNm codant pour Cdc25C ainsi que la transfection de cellules HeLa par des siRNA

anti-Cdc25C provoque une inhibition de la réplication et un arrêt des cellules en phase S

(Turowski et al., 2003). Enfin seule la surexpression de Cdc25B conduit à une entrée précoce des

cellules en mitose, même si la réplication de l’ADN n’a pas été correctement accomplie, alors

qu’il faut co-exprimer en même temps la Cycline B avec Cdc25C pour qu’une accélération de

l’entrée en mitose soit observée (Gabrielli et al., 1996; Karlsson et al., 1999). Le modèle actuel

présente donc Cdc25B et Cdc25A comme les activateurs initiaux du complexe CDK1-Cycline

B1, tandis que Cdc25C permet la progression de la cellule en mitose, après son activation par

CDK1-Cycline B1 (Lindqvist et al., 2005).

Des souris invalidées pour les gènes de cdc25b (Lincoln et al., 2002) et cdc25c (Chen et al., 2001)

ont été générés. Il est intéressant de noter que ces souris sont viables, ont des cycles cellulaires

normaux et répondent correctement aux points de contrôles (en réponse aux cassures double

brin ou aux arrêts de la réplication). Seule les souris femelles cdc25b-/- sont stériles, leurs ovocytes

sont bloqués en prophase de méiose I par leur incapacité à activer le MPF (Chen et al., 2001;

Lincoln et al., 2002). Plus récemment des souris invalidées pour les deux gènes cdc25b et cdc25c

ont été obtenues, de la même manière ces souris sont viables, répondent correctement aux points

de contrôle et Cdc25A est régulée normalement (Ferguson et al., 2005). Ces résultats suggèrent

que Cdc25B et Cdc25C ne sont pas requises pour le développement des souris ou lors de l’entrée

en mitose, suggérant que peut être Cdc25A ou d’autres phosphatases sont capables de compenser

fonctionnellement la perte de cdc25b et cdc25c chez les souris.


36



I-3-B-b : Régulation des phosphatases Cdc25

En tant qu’acteurs majeurs du cycle cellulaire, les phosphatases Cdc25 sont finement régulées

au cours du cycle. Elles sont ainsi régulées par différents mécanismes qui contrôlent notamment

leur localisation, leur activité catalytique et leur dégradation. Nous verrons dans la partie suivante

de l’introduction générale que ces mécanismes de régulation sont mis à profit dans l’activation

des points de contrôle lors de la réponse cellulaire aux dommages sur l’ADN.

(i) Cdc25A

L’activité et l’abondance de Cdc25A est régulée par des évènements de phosphorylation

réversibles, des interactions protéine-protéine, ainsi qu’une protéolyse ubiquitine-dépendante

(figure10) (Bernardi et al., 2000; Hoffmann et al., 1994; Mailand et al., 2002; Molinari et al., 2000)

(Conklin et al., 1995).

La régulation subcellulaire de Cdc25A au cours de cycle cellulaire est contrôlée par un

processus dynamique de navettes entre le noyau et le cytoplasme (Kallstrom et al., 2005). Cette

dynamique est dépendante de la présence d’une NES (Nuclear Export Signal) qui a la

caractéristique de ne pas se lier au facteur d’export nucléaire, l’exportine-1, et d’une NLS (Nuclear

Localisation Signal) bipartite canonique KRX10-12KRRK (Kallstrom et al., 2005). A l’origine

Cdc25A était considérée comme une protéine strictement nucléaire, ce qui était en accord avec

son activité d’activation des complexes nucléaires CDK2-Cycline A et CDK2-Cycline E en G1/S

(Blomberg and Hoffmann, 1999). Cependant la mise en évidence de sa localisation également

cytoplasmique montre un rôle de Cdc25A en mitose où elle déphosphorylerait les complexes

CDK1-Cycline B1 (Lindqvist et al., 2005).

La phosphorylation de Cdc25A par le complexe CDK2-Cycline E au moment de l’entrée en

phase S conduit à une augmentation de son activité phosphatase (Hoffmann et al., 1994). Cette

phosphorylation de Cdc25A par son propre substrat crée une boucle de rétrocontrôle positif qui

conduit à l’augmentation de l’activité des complexes CDK-Cyclines lors de la transition G1/S.

Mais la phosphorylation par CDK2-Cycline E et/ou CDK2-Cycline A pourrait également avoir

un contrôle négatif sur la phosphatase Cdc25A (Ducruet and Lazo, 2003). De plus au début de la

mitose, CDK1-Cycline B phosphoryle Cdc25A sur les résidus S18 et S116, conduisant à une


37



stabilisation de la protéine par un mécanisme inconnu qui empêcherait son ubiquitinylation

(Mailand et al., 2002).

Au cours du cycle cellulaire Cdc25A est dégradée par l’intermédiaire de deux ubiquitine-ligases

différentes. A la sortie de mitose Cdc25A est ubiquitinylée par le cyclosome ou APC (Anaphase

Promoting Complex) en association avec la protéine Cdh1. Cdh1 reconnaît le motif KEN de

Cdc25A, alors que la mutation de ces résidus inhibe l’ubiquitinylation par l’APC/C-Cdh1. Par

contre en interphase, Cdc25A est ubiquitinylée indépendamment du motif KEN par le complexe

SCF (Skp1/Cullin/F-box) (Donzelli et al., 2002). La dégradation en phases S et G2 de Cdc25A est

dépendante de la phosphorylation par la kinase Chk1. En effet en absence de dommages sur

l’ADN, Chk1 phosphoryle les résidus : S124, S178, S279 et S293 (Sorensen et al., 2003; Zhao et

al., 2002). Il semblerait qu’elle soit aussi responsable de la phosphorylation du résidu S76, alors

que la protéine kinase responsable de la phosphorylation des acides-aminés S82 et S88 du motif

DSG est encore inconnue. Ces phosphorylations sont nécessaires à la liaison de βTrCP

permettant ensuite le recrutement du complexe ubiquitine-ligase SCF (Busino et al., 2004; Busino

et al., 2003; Jin et al., 2003).

De plus il semblerait que Chk1 soit également responsable de la liaison aux protéines 14-3-3,

impliquées dans la régulation et la localisation de Cdc25A au cours du cycle cellulaire. Cependant

ces études sont controversées. Chk1 phosphoryle la thréonine 504 de xCdc25A et la thréonine

507 de hCdc25A, qui sont situées dans une région conservée en fin du domaine carboxy-terminal

(Chen et al., 2003; Uto et al., 2004). Cette phosphorylation est responsable de la liaison aux

protéines 14-3-3, cependant il apparaît que la liaison aux 14-3-3 ne provoque pas directement la

diminution de l’activité de Cdc25A observée après la phosphorylation par Chk1 (Uto et al., 2004).

La fin du domaine carboxy-terminal de Cdc25A et Cdc25B a été décrite comme le site de liaison

aux substrats (Powers et al., 2000; Wilborn et al., 2001). Ainsi la phosphorylation de la thréonine

507 empêcherait la liaison de la phosphatase à ses substrats, conduisant à la diminution de son

activité catalytique observée après la phosphorylation par Chk1 (Uto et al., 2004).


38



Figure 11 : Les principaux variants d’épissage de Cdc25B

Les trois isoformes de Cdc25B diffèrent par la présence ou l’absence des séquences codantes pour les domaines A et B de 14 et 41 acides aminés respectivement.

Figure 10 : Régulation de la phosphatase Cdc25A Les phosphorylations de Cdc25A par Chk1 conduisent aux liaisons avec les 14-3-3. Cdc25A est stabilisée en mitose par des phosphorylations de CDK1. La dégradation de Cdc25A est dépendante de SCF/βTrCP qui induit son ubiquitinylation et de manière dépendante de la boite KEN, le complexe APC/C conduit également à la dégradation de Cdc25A à la suite de son ubiquitinylation en fin de mitose.


39



(ii) Cdc25B

Parmi les cinq variants d’épissage de Cdc25B dont les séquences sont accessibles dans les

bases de données, trois variants ont été relativement bien décrits : Cdc25B1, Cdc25B2 et

Cdc25B3 (Baldin et al., 1997b). Ils sont différenciés par la présence de deux domaines situés dans

la région amino-terminale régulatrice : le domaine A qui est composé de 14 acides aminés et le

domaine B de 43 acides aminés (figure 11). Ainsi le variant Cdc25B1 ne possède pas le domaine A,

le variant B2 ne possède pas le domaine B et le variant B3 contient les deux domaines A et B. Ces

trois variants ont été exprimés dans la levure à fission et sont capables de complémenter la

souche de levure Cdc25-22TS. C’est le variant Cdc25B2 qui présente la plus forte activité inductrice

de mitose (Baldin et al., 1997b).

Cdc25B fait la navette entre le noyau et le cytoplasme au cours du cycle cellulaire. Cette

variation de localisation s’explique par la présence d’une NES et d’une NLS bipartite située dans

la région amino-terminale régulatrice de Cdc25B (Davezac et al., 2000; Lindqvist et al., 2004;

Uchida et al., 2004) (figure 12). Ces signaux de localisation sont présents dans les différents

variants de Cdc25B, cependant il semblerait que Cdc25B1 soit plutôt localisée dans le noyau où

elle est active lors de l’entrée en mitose (Baldin et al., 2002), alors que Cdc25B3 doit être

cytoplasmique pour entraîner les cellules en mitose (Lindqvist et al., 2004), suggérant ainsi une

régulation de la localisation différente pour chaque variant d’épissage.

Trois sites de liaison aux protéines 14-3-3 sont présents dans le domaine régulateur amino-

terminal de Cdc25B et sont impliqués dans la régulation de sa localisation et de son activité :

RFQpS151MP, RPSpS230AP et RSPpS323MP (Giles et al., 2003; Uchida et al., 2004). La mutation

en alanine de la sérine 323 conduit à une inhibition de la liaison aux protéines 14-3-3 et entraîne

une localisation strictement nucléaire de Cdc25B (Davezac et al., 2000), alors que les simples et

doubles mutations en alanine des sérines 151 et 230 entraînent une augmentation de la

localisation cytoplasmique de la phosphatase. La proximité de ces résidus par rapport aux

séquences NES et NLS pourrait ainsi permettre aux protéines 14-3-3 de réguler la localisation

intracellulaire de Cdc25B en bloquant la liaison de Crm1 ou des Importines à leur séquence de

reconnaissance respective, NES ou NLS (Giles et al., 2003). Il semblerait que la liaison aux

protéines 14-3-3 joue également un rôle dans la modulation de l’activité de Cdc25B en bloquant

l’accès de Cdc25B à son substrat CDK1-Cycline B1 (Forrest and Gabrielli, 2001; Giles et al.,

2003).


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Il a d’autre part été montré que Cdc25B jouait un rôle dans l’activation initiale du complexe

CDK1-Cycline B1 dans le cytoplasme des cellules, au niveau des centrosomes (Jackman et al.,

2003; Lindqvist et al., 2005). De récentes études ont permis de montrer des événements de

régulation positifs et négatifs de Cdc25B aux centrosomes. Tout d’abord la protéine Chk1 régule

négativement la transition G2/M du cycle cellulaire en conduisant à une inhibition de l’activité

des complexes CDK1-Cyclines B aux centrosomes (Kramer et al., 2004). Des travaux de notre

équipe ont montré que Cdc25B3 était phosphorylée par Chk1 in vivo sur son résidu thréonine 563

(homologue du résidu T507 sur Cdc25A) et sur la sérine 230 aux centrosomes (homologue de la

S178 de Cdc25A) (Schmitt et al., 2006). Les acides aminés S151 et S323 sont également

phosphorylés in vitro par la kinase Chk1 (Schmitt et al., 2006) et Cdc25B3 portant une

phosphorylation sur la S323 est localisée aux centrosomes (Lemaire et al., 2006). La T563 de

Cdc25B est localisée dans le domaine carboxy-terminal, qui est bien conservé avec Cdc25A, et

permet la liaison aux substrats. Ainsi la phosphorylation par Chk1 de la T563 conduit à une

inhibition de la liaison de Cdc25B avec les cyclines A1, B1 et E1 (Uto et al., 2004). La protéine

kinase mitotique Aurora A phosphoryle et active Cdc25B3 sur le résidu sérine 353 au niveau des

centrosomes, ce qui a pour conséquence le recrutement et l’activation des complexes CDK1-

Cycline B lors de l’entrée des cellules en mitose (Dutertre et al., 2004) (Hirota et al., 2003). Enfin,

la protéine kinase Eg3 est responsable de la phosphorylation de la S169 de Cdc25B3 qui est

située dans le domaine B (Mirey et al., 2005). Cette phosphorylation a été détectée au niveau des

centrosomes, elle n’a pas d’effet sur l’activité catalytique de Cdc25B in vitro et son mécanisme

d’action au sein de la cellule reste encore à déterminer. Cependant la co-expression des deux

protéines dans les cellules humaines montre qu’Eg3 a un effet négatif sur l’entrée des cellules en

mitose et que cet effet est antagonisé par Cdc25B (Davezac et al., 2002), ainsi Eg3 pourrait agir

comme un régulateur négatif de Cdc25B.

D’autre part la localisation cellulaire de Cdc25B est également régulée par la phosphorylation

de la sérine 353 par la protéine kinase PKB/Akt. En effet, la surexpression d’une forme

constitutivement active de PKB/Akt dans les cellules humaines conduit à une relocalisation

cytoplasmique de Cdc25B dépendante du facteur d’export nucléaire Crm1 (Baldin et al., 2003).

La protéine kinase CK2 (Caséine Kinase 2) qui interagit avec Cdc25B par sa sous unité β,

phosphoryle les résidus S186 et S187, ce qui se traduit par une augmentation de l’activité

phosphatase de Cdc25B observée in vitro mais aussi in vivo (Theis-Febvre et al., 2003). Des

boucles d’amplifications positives et négatives impliquant Cdc25B et les complexes CDK-

Cyclines ont été décrites. CDK1-Cycline A phosphoryle Cdc25B1 et induit sa dégradation de


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manière dépendante du protéasome en phase G2 du cycle cellulaire (Baldin et al., 1997a). Le

complexe CDK1-Cycline B1 phosphoryle, lui aussi, Cdc25B1 sur le résidu sérine 146, situé dans

le domaine B (sérine 160 de Cdc25B3), ce qui entraîne une inhibition de son export nucléaire

mais n’a pas d’effet sur l’activité phosphatase de Cdc25B1 (Baldin et al., 2002). Il a d’autre part

été montré au laboratoire que CDK1-Cycline B1 phosphoryle in vitro de nombreux sites dans la

région régulatrice amino-terminale de Cdc25B (Bouché JP, en préparation). Parmi ces sites, la

phosphorylation in vivo du résidu thréonine 69, situé dans le domaine A de Cdc25B et donc

absente de Cdc25B1, contribuerait à l’augmentation de l’activité de Cdc25B2 et Cdc25B3 en

mitose (Izumi and Maller, 1993; Margolis et al., 2006).

Figure 12 : Régulation de la phosphatase Cdc25B Cdc25B est régulée négativement par Chk1 et Eg3. La phosphorylation sur les S151, S230 et S323 par Chk1 conduit à la liaison avec 14-3-3 et une diminution de l’activité phosphatase. Aurora A régule positivement Cdc25B à l’entrée en mitose et il semblerait que Cdc25B soit également phosphorylée par CDK1.


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Enfin Cdc25B est une protéine instable qui est dégradée au cours de la mitose par le

protéasome (Baldin et al., 1997a). Des études récentes réalisées dans notre laboratoire ont permis

de montrer que les différents variants de Cdc25B étaient dégradés de manière différentielle

dépendant du domaine B. Ainsi les variants Cdc25B1 et Cdc25B3 sont dégradés suivant un

mécanisme dépendant du complexe SCF/βTrCP entre la transition métaphase-anaphase de la

mitose (Kieffer et al., 2007).

(iii) Cdc25C

L’activité de Cdc25C doit être finement régulée afin de permettre la progression des cellules

en mitose de manière rapide et irréversible. La présence d’une NES dépendante du facteur

d’export nucléaire Crm1 et d’une NLS bipartite canonique au niveau de la région amino-

régulatrice de Cdc25C permettent à la phosphatase de réaliser une navette continue entre le

cytoplasme et le noyau de la cellule (Graves et al., 2001; Yang and Kornbluth, 1999). En réalité,

en interphase Cdc25C est phosphorylée sur la sérine 216 et est majoritairement cytoplasmique et

devient majoritairement nucléaire lors de l’entrée en prophase (Dalal et al., 1999). Cette

phosphorylation de la S216 crée un site de liaison aux protéines 14-3-3 qui cache probablement la

séquence de localisation nucléaire et maintient la phosphatase sous une forme inactive dans le

cytoplasme (Dalal et al., 1999; Graves et al., 2001; Peng et al., 1997). Cette interaction entre 14-3-

3 et Cdc25C, cruciale pour le contrôle de l’entrée en mitose, est dépendante de la

phosphorylation de la S216. En effet, la mutation en alanine de la S216 empêche la liaison avec

14-3-3 et conduit à l’observation de cellules présentant une condensation prématurée de la

chromatine (Graves et al., 2001). En absence de dommages sur l’ADN la protéine kinase C-

TAK1 (Cdc Twenty-five C Associated Kinase 1) est responsable de la phosphorylation de ce résidu

(figure13) (Peng et al., 1998). Cependant il est aussi possible que Chk1 soit impliquée dans cet

événement de phosphorylation en raison de son rôle joué lors de la régulation du cycle cellulaire

en absence de dommages sur l’ADN. Lors de l’entrée en mitose, la dissociation de la liaison entre

Cdc25C et 14-3-3 permet l’import nucléaire de la phosphatase où elle peut activer pleinement les

complexes CDK1-Cycline B1. Cdc25C est alors activée par CDK1-Cycline B1 à travers une

boucle de retro-contrôle positif (Bulavin et al., 2003a; Bulavin et al., 2003b). Ainsi CDK1

phosphoryle le résidu sérine 214 très proche de la sérine 216 et empêche la phosphorylation de la

S216. Des études réalisées chez le xénope ont permis de montrer que Cdc25C et 14-3-3 sont


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dissociées après la phosphorylation de la T138. Le site S285 (S214 de hCdc25C) est alors

accessible à la phosphorylation par la kinase CDK1, accélérant considérablement le recrutement

de la phosphatase PP1 qui induit la déphosphorylation de la S216 et entraîne l’entrée des cellules

en mitose (Margolis et al., 2006; Margolis et al., 2003). Cdc25C est également régulée par un

processus d’isomérisation dépendant de la protéine Pin1 (Stukenberg and Kirschner, 2001). Pin1

est une peptidyl-proline isomérase qui interagit par son domaine WW avec Cdc25C phosphorylée

par CDK1 au niveau des motifs pS/pTP (Crenshaw et al., 1998; Shen et al., 1998) (Zhou et al.,

2000). La résultante de la conversion peptidique des liaisons S/TP induit un changement

conformationnel de la phosphatase accompagné de la déphosphorylation par PP2A de motifs

phosphorylés par CDK1, inhibant ainsi Cdc25C (Zhou et al., 2000).

Enfin d’autres phosphorylations sont impliquées dans la régulation de Cdc25C. Ainsi la

protéine kinase CK2 qui phosphoryle le résidu thréonine 236 très proche de la NLS, inhibe la

liaison aux importines α/β et prévient l’import nucléaire de Cdc25C (Schwindling et al., 2004).

La protéine kinase CaMKII (Calcium calmoduline-dependent protein Kinase II), dont les sites de

phosphorylation ne sont pas encore identifiés, permet l’augmentation très nette de l’activité

phosphatase de Cdc25C (Patel et al., 1999). De la même manière la phosphorylation en amino-

terminal de Cdc25C par Pim1 entraîne une augmentation de son activité lors de la progression

G2/M (Bachmann et al., 2006). Cdc25C est aussi phosphorylée par les membres de la famille Plk

(Polo kinase). En effet la sérine 198 est phosphorylée in vitro par Plk1 et Plk3 (Toyoshima-

Morimoto et al., 2002) et la sérine 191 est elle aussi phosphorylée par Plk3 (Bahassi el et al.,

2004). Ces études montrent que les phosphorylations engendrées par les kinases Plk conduisent à

une accumulation nucléaire de Cdc25C suggérant un rôle important des Plk lors du contrôle de la

translocation nucléaire de Cdc25C lors de l’entrée de la cellule en mitose (Bahassi el et al., 2004)

(Toyoshima-Morimoto et al., 2002).

Il a aussi été démontré chez l’ovocyte de xénope que les kinases Erk/MAPK étaient

impliquées dans la phosphorylation de trois résidus de Cdc25C lors de la transition G2/M,

associées à une augmentation de son activité (Wang et al., 2007). Ces résidus sont hautement

conservés chez la phosphatase humaine : T48, T67 et S168, et ont été montrés, en plus des

résidus S122 et T130, comme étant phosphorylés in vivo lors de l’entrée en mitose (Izumi and

Maller, 1993; Strausfeld et al., 1994). Il semblerait que ces sites soient phosphorylés par CDK1

lors de la boucle d’auto-amplification entre Cdc25C et CDK1-Cycline B1 à l’entrée en mitose.

Enfin une étude récente a permis de montrer qu’un événement de phosphorylation était

impliqué dans la dégradation de Cdc25C. La sérine 216, phosphorylée par la kinase p90ARF,


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semble induire la dégradation de manière dépendante de l’ubiquitine de Cdc25C (Eymin et al.,

2006).

La présentation globale des mécanismes de régulation et des rôles joués par les phosphatases

Cdc25 au cours de la progression du cycle cellulaire, nous permet de proposer un modèle général

de la progression de la phase G2 vers la phase M du cycle cellulaire en absence de dommages.

Ainsi il semblerait que Cdc2A et Cdc25B soient activées initialement dès l’approche de la

prophase. L’activation précoce des complexes CDK1-Cycline B1 aux centrosomes par Cdc25B3

et Plk1 permettrait d’engager la maturation des centrosomes. Puis les complexes CDK1-Cycline

B1 actifs seraient dirigés vers le noyau et pourraient ainsi activer les phosphatases nucléaires

Figure 13 : Régulation de la phosphatase Cdc25C C-TAK1 phosphoryle la S216 de Cdc25C conduisant à la liaison avec les 14-3-3 et à l’inactivation ainsi que la rétention cytoplasmique de la phosphatase. Lors de l’entrée en mitose, la dissociation de l’interaction avec les 14-3-3 permet à CDK1 de phosphoryler la S214 conduisant à l’activation de Cdc25C. Puis le complexe CDK1-Cycline B actif va ensuite phosphoryler Cdc25C pour permettre d’activer pleinement Cdc25C.


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Cdc25A et CDC25B1. L’entrée ensuite de Cdc25C dans le noyau permettrait aux complexes

CDK1-Cycline B1 d’activer les phosphatases Cdc25C qui, à leur tour, amplifieront l’activation

des complexes CDK1-Cycline B1 nécessaires à la condensation des chromosomes et à la rupture

de l’enveloppe nucléaire.


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II- La réponse du cycle cellulaire aux dommages sur l’ADN

Nous venons de voir que la régulation des phosphatases Cdc25 et des complexes CDK-

Cycline au sein de la progression dans le cycle cellulaire correspond à un schéma complexe qui

fait intervenir des mécanismes de phosphorylation/déphosphorylation ainsi que des interactions

avec des partenaires. L’ensemble de ces modifications va moduler soit l’activité catalytique des

enzymes, soit leur localisation intracellulaire et permettre la bonne progression du cycle cellulaire.

Un certain nombre de ces régulations sont reprises et adaptées pour arrêter le cycle cellulaire, ce

sont les points de contrôle. Ces points de contrôles interviennent à des étapes clés de chaque

phase du cycle cellulaire afin de contribuer au maintien de la stabilité génétique (Hartwell and

Weinert, 1989). Ainsi, en réponse à des dommages sur l’ADN, à un stress réplicatif ou a un

mauvais alignement des chromosomes, les points de contrôle seront activés, conduisant à un

arrêt du cycle cellulaire pour permettre à la cellule de réparer les dommages ou d’achever

correctement une étape.

Au cours de la partie de l’introduction générale suivante, nous nous intéresserons plus

particulièrement aux mécanismes de surveillance impliqués dans la réponse aux dommages sur

l’ADN. En présence d’un endommagement de l’ADN, la cellule s’arrêtera spécifiquement en

deux points précis du cycle cellulaire qui sont la transition entre les phases G1 et S et la transition

entre les phases G2 et M du cycle cellulaire. On parle alors des points de contrôles “G1/S” ou

“G2/M”.

II-1 : Les points de contrôle

Les points de contrôle sont des voies de signalisation qui ont pour buts, lors de la réponse

cellulaire aux dommages sur l’ADN, d’aboutir à l’arrêt du cycle cellulaire, à la réparation des

dommages et, dans le cas de dommages trop sévères, à la mort cellulaire par apoptose. Des

mécanismes de surveillance sont également mis en place aux étapes clés du cycle cellulaire afin de

contrôler la bonne progression du cycle cellulaire. C’est pourquoi une cellule ne pourra pas se

diviser tant que tous ses chromosomes ne seront pas correctement alignés ou ne pourra pas

dupliquer son ADN avant d’avoir franchi la mitose (Smith et al., 2002). La cellule peut employer


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différents mécanismes de surveillance en réponse aux signaux externes (radiations,

génotoxiques…) ou internes à la cellule (radicaux oxygénés, erreurs de réplication…) :

- Ainsi le point de contrôle G1/S conduit à l’inactivation de la transition G1/S et permet

d’empêcher la réplication d’erreurs en phase S.

- Plusieurs points de contrôle en phase S surveillent les arrêts des fourches de réplication et

les dommages.

- Le point de contrôle G2/M bloque la progression des cellules de la phase G2 vers la

mitose et permet d’empêcher la dissémination des erreurs et des dommages sur l’ADN.

- Et enfin le point de contrôle du fuseau mitotique permet de contrôler la ségrégation

correcte des chromosomes lors de la transition métaphase/anaphase.

Dans le cadre de notre projet, nous nous intéressions plus particulièrement à l’activation des

points de contrôle en réponse aux dommages sur l’ADN. C’est pourquoi nous développerons

dans la partie suivante uniquement le fonctionnement des points de contrôle impliqués dans la

réponse aux dommages, c'est-à-dire les points de contrôle G1/S et G2/M.

Parmi les acteurs de ces voies de signalisation, trois catégories se distinguent par leurs rôles et

leur chronologie : les senseurs, les transducteurs et les médiateurs (figure 14) (Sancar et al., 2004).

Figure 14 : La signalisation des points de contrôles

Les dommages sur l’ADN sont détectés par les senseurs. Les transducteurs vont ensuite diffuser l’information conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire, à la réparation des dommages et en cas de dommages trop importants à la mort cellulaire, par l’intermédiaire des protéines effectrices


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II-1-A : Dommages sur l’ADN et fonctionnement des points de contrôles

II-1-A-a : Les senseurs

La première étape dans la mise en place des points de contrôle est la détection par la cellule

des dommages sur l’ADN. Les senseurs sont des protéines capables de se lier à l’ADN et dont le

but est de détecter ces dommages (Zhou and Elledge, 2000). Il existe différents types de

dommages de l’ADN qui sont fonction des stress que subit la cellule : par exemple les dimères de

pyrimidines produits par les radiations ultraviolettes (UV), les cassures simples et doubles brins

de l’ADN induites par les radiations ionisantes (IR) ou les radicaux oxygénés (Sancar et al., 2004).

Les protagonistes sont encore mal connus, cependant nous décrirons succinctement deux types

de complexes qui semblent jouer un rôle de senseurs dans la voie de signalisation des dommages

de l’ADN.

Le complexe RPA (Replication Protein A) est impliqué dans les mécanismes de réplication de

l’ADN et présente une forte affinité pour l’ADN simple brin. RPA reconnaît également les

lésions induites par les UV (Cline and Hanawalt, 2003). Il est constitué de trois protéines p70,

p34 et p14 et il a de plus été montré que p34 était hyperphosphorylée en réponse aux dommages

sur l’ADN (Binz et al., 2004).

Le complexe MRN (Mre11/Rad50/NBS1) semble être impliqué dans la détection des cassures

doubles brins de l’ADN (Lisby et al., 2004; Lisby and Rothstein, 2005). Le complexe MRN

intervient dans les mécanismes de réparation des cassures de l’ADN doubles brins

(recombinaison homologue et NHEJ, Non Homologous End Joining) et colocalise avec RPA en

réponse à certains dommages. Des mutations des gènes Mre11 et NBS1 sont caractérisées au

niveau cellulaire par une instabilité génomique et des points de contrôle défectueux en réponse

aux radiations ionisantes (Robison et al., 2005).

II-1-A-b : Les transducteurs

Après la détection des dommages sur l’ADN par les senseurs et l’initiation des voies de

signalisation, les transducteurs ont alors comme principal objectif de mettre en place la diffusion

du signal. Ce sont des protéines kinases de transduction du signal qui amplifient le signal en

phosphorylant d’autres kinases ou protéines. Ce processus fait appel a des kinases “apicales” ou


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proximales qui répondent aux signaux reçu des senseurs et des kinases “distales” qui transmettent

à leur tour le signal reçu des kinases apicales.

(i) Les kinases apicales

Parmi les membres de ce groupe figurent ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) et ATR (ATM

and Rad3 related) qui appartiennent à la famille des PIKK (Phospho-Inositide 3-Kinase related Kinases)

impliquées dans la réparation de l’ADN et les points de contrôle (Abraham, 2004).

La mutation du gène ATM conduit à l’“Ataxia Telangiectasia” qui est une maladie conférant aux

malades une forte prédisposition aux cancers accompagnée d’une grande sensibilité aux radiations

ionisantes. ATM est une protéine dimérique qui, par un mécanisme d’autophosphorylation en

réponse à des cassures doubles brins de l’ADN, semble reprendre une forme monomérique et

peut alors phosphoryler ses substrats (Bakkenist and Kastan, 2003). ATM est ainsi responsable de

la phosphorylation de nombreux substrats comme : Chk2, BRCA1, p53, MDM2 et Chk1.

La kinase ATR est en revanche essentielle à la viabilité cellulaire chez les mammifères. En effet

l’invalidation du gène ATR chez la souris conduit à une létalité embryonnaire, alors que les souris

ATM-/- sont viables (Sancar et al., 2004). Ces résultats suggèrent ainsi un rôle essentiel de la

kinase en absence de dommages sur l’ADN. ATR est activée en réponse aux cassures simples

brins de l’ADN mais également en réponse aux cassures doubles brins de l’ADN et est

impliquées dans la phosphorylation de Chk1, p53, BRCA1, MDM2 et Chk2 (Gatei et al., 2003;

Liu et al., 2000).

Ainsi les kinases ATM et ATR ont de nombreux substrats en commun en particulier les

kinases de réponse aux stress Chk1 et Chk2. Il a d’ailleurs été démontré récemment qu’en

réponse aux radiations ionisantes les kinases ATM et ATR participeraient à une même voie de

signalisation (Cuadrado et al., 2006). Ces récentes découvertes contrebalancent le dogme initial où

il avait été proposé qu’ATM activait uniquement Chk2 en réponse aux radiations ionisantes alors

qu’ATR activait Chk1 en réponse aux UV.

La kinase p38SAPK (p38 Stress Ativated Protein Kinase), qui appartient à la famille des MAPK

(Mitogen Activated Protein Kinase), joue également un rôle essentiel dans la voie de signalisation en

réponse aux stress induits par les UV ou par des agents génotoxiques (cisplatine, doxorubicine)

conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire (Reinhardt et al., 2007). Trois principales voies de

signalisation sont décrites au sein de la famille des MAPK : la voie ERK (Extracellular-signal Related


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Kinase) qui est impliquée dans la prolifération cellulaire, la voie SAPKJNK (Stress Activated Protein

Kinase/ c-Jun N-terminal Kinase) et p38SAPK qui sont activées en réponses à différents stress (Dent et

al., 2003) (Pearce and Humphrey, 2001).

(ii) Les kinases distales

Les protéines appartenant à ce groupe sont à leur tour impliquées dans la transduction du

signal en réponse aux dommages sur l’ADN suite à leurs phosphorylations par les kinases

apicales. Ces kinases vont phosphoryler les cibles nécessaires à l’arrêt du cycle cellulaire. Parmi les

principales kinases de ce groupe, on peut citer notamment Chk1, Chk2 et MK2 (MAPKAP-K2 -

MAP Kinase Activated Protein Kinase 2).

Chk1 est essentielle à la viabilité cellulaire, les souris invalidées pour le gène Chk1-/- meurent

dès le stade embryonnaire. En réponse aux radiations ionisantes ou aux UV, Chk1 est activée par

ATR, mais aussi par ATM dans certains cas et est impliquée dans la mise en place du point de

contrôle G2/M. Chk2 au contraire de Chk1 n’est pas essentielle à la viabilité cellulaire, en effet les

souris Chk2-/- sont viables, cependant des mutations au niveau de la région codante du gène Chk2

conduirait au syndrome de Li-Fraumeni dans certains cas (Niida et al., 2005). Chk2 est activée

principalement par ATM et semble jouer un rôle prépondérant dans l’activation du processus

apoptotique en réponse aux radiations ionisantes (Ahn et al., 2004). L’invalidation du gène MK2

chez la souris est viable, cependant de récentes études ont montré l’importance de MK2 dans la

mise en place des points de contrôle en réponse aux dommages sur l’ADN. MK2 est une cible de

p38 en réponse aux UV et intervient dans la régulation du cycle cellulaire. Ainsi ces protéines, par

leurs capacités à induire un arrêt précis du cycle cellulaire, jouent un rôle prépondérant dans la

réponse cellulaire aux dommages sur l’ADN.

II-1-A-c : les effecteurs

Comme leur nom l’indique, les effecteurs sont des protéines qui, par leur activation ou leur

inhibition, permettent d’aboutir à l’arrêt du cycle cellulaire et à la réparation des dommages. Dans

certains cas, lorsque les dommages sont trop importants, les effecteurs peuvent aussi conduire à

la mort cellulaire par l’initiation du processus apoptotique. Le suppresseur de tumeur p53 et la


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famille des phosphatases Cdc25 sont les principaux effecteurs des points de contrôle mis en place

en réponse aux dommages sur l’ADN.

p53 est un facteur de transcription. Au cours d’un cycle cellulaire normal p53 est maintenu à

un niveau d’expression relativement bas. En réponse aux dommages sur l’ADN, p53 est stabilisée

par des phosphorylations engendrées par les kinases ATM et ATR, et peut ainsi activer la

transcription de ses gènes cibles impliqués dans la réparation (Sengupta and Harris, 2005), l’arrêt

du cycle cellulaire (comme p21 ou 14-3-3σ) ou l’apoptose (Meek, 2004). De plus p53 peut aussi

réprimer la transcription des gènes essentiels au déroulement de la mitose comme CDK1, Cyline B

ou Cdc25C (St Clair and Manfredi, 2006; Taylor and Stark, 2001).

Les phosphatases Cdc25, par leur activation des complexes CDK-Cycline, sont essentielles à la

progression des cellules dans chaque phase du cycle cellulaire. Ce sont donc des cibles privilégiées

pour conduire à l’arrêt du cycle cellulaire lors de l’activation des points de contrôle en réponse

aux dommages sur l’ADN (Karlsson-Rosenthal and Millar, 2006). Les kinases Chk1 et Chk2

phosphorylent et inactivent les phosphatases Cdc25 en présence de dommages sur l’ADN en

conduisant soit à une modification de leur localisation cellulaire, soit à une inhibition de leur

activité phosphatase ou encore à leur dégradation. Cependant de récentes études ont permis de

mettre en évidence d’autres voies de signalisation impliquées dans l’activation des points de

contrôle, ciblant également les phosphatases Cdc25 (voir ci-après).

II-1-B : Arrêt à la transition G1/S

En réponse à la détection de dommage sur l’ADN en phase G1 du cycle cellulaire, deux voies

de signalisation dépendantes d’ATM/ATR et Chk1/Chk2 sont mises en place et conduisent à

l’inhibition du complexe CDK2-Cycline E. Tout d’abord Cdc25A est rapidement inhibée

conduisant à un arrêt rapide du cycle cellulaire et l’activation de p53 va entrainer une réponse

différée mais plus stable (Bartek and Lukas, 2001a, b).

En réponse aux rayonnements UV, Cdc25A est phosphorylée sur la sérine 214 par Chk1 et

Chk2, ce qui conduit à sa dégradation rapide par le protéasome (Falck et al., 2001; Mailand et al.,

2000). Ainsi la phosphorylation sur la tyrosine 15 de CDK2 est maintenue et les cellules ne

peuvent pas débuter leur phase S. En parallèle de cette voie de signalisation très rapide, la

deuxième cascade d’événements se met en place pour assurer un arrêt plus stable des cellules qui

les conduira vers l’apoptose si les dommages sont trop importants. p53 est stabilisée suite aux


53



phosphorylations des kinases ATM/ATR et Chk1/Chk2 (Vogelstein et al., 2000) et va entre autre

permettre la transcription de la protéine inhibitrice p21CIP1 qui va conduire à l’inhibition du

complexe CDK2-Cycline et assurer le blocage total des cellules.

II-1-C : Arrêt à la transition G2/M

Le blocage des cellules à la transition G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN fait

intervenir l’inhibition du complexe CDK1-Cycline B par le maintien de ses phosphorylations

inhibitrices sur les résidus T14 et Y15 (Gabrielli et al., 1997; Jin et al., 1996; Peng et al., 1997;

Sanchez et al., 1997). De la même manière qu’en G1/S, l’activation du point de contrôle G2/M

fait intervenir deux voies de signalisation. Une réponse rapide qui fait intervenir des événements

de régulation des protéines intervenant dans la transition G2/M par des modifications post-

traductionnelles et une réponse différée et stable qui fait appel à des événements de régulation

transcriptionnelle.

II-1-C-a : Les événements de régulation post-traductionnels

La cascade de signalisation ATM/ATR, par l’activation ou l’inhibition de nombreux

effecteurs, va conduire à l’inactivation du complexe CDK1-Cycline B bloquant ainsi les cellules

en G2/M. L’activité kinase de Wee1 est augmentée suite à la phosphorylation par Chk1 (figure 15)

(O'Connell et al., 1997; Walworth, 2001). Chk1 est aussi impliquée dans la phosphorylation de la

sérine 216 de Cdc25C en réponse aux dommages sur l’ADN créant un site de liaison aux 14-3-3

et conduisant à sa rétention cytoplasmique et à une diminution de son activité catalytique

(Hutchins and Clarke, 2004). Une étude récente a permis de montrer que la S216 de Cdc25C

pouvait également être phosphorylée par la voie Erk1/MAPK et serait impliquée dans sa

dégradation dépendante du protéasome (Eymin et al., 2006). D’autre part, en réponse aux

radiations UV, la kinase SAPK/JNK semble être impliquée dans la phosphorylation inhibitrice de

Cdc25C sur la S168 (Goss et al., 2003). Enfin il a été également décrit une dégradation de

Cdc25C en réponse au point de contrôle G2/M suite à un traitement par l’arsenite. Cette

dégradation est dépendante de la séquence KEN et semble être indépendante de la

phosphorylation sur la S216 (Chen et al., 2002). Cdc25A est ciblée pour la dégradation par


54



l’ubiquitine ligase SCF-βTrCP en réponse à des événements de phosphorylation en amino-

terminal et notamment sur la S124 par Chk1 (Busino et al., 2004; Jin et al., 2003). De plus Chk1

contrôle l’activité catalytique de Cdc25A en phosphorylant la S178 et la T507, ce qui conduit à la

création de sites de liaison aux protéines 14-3-3(Chen et al., 2003). En réponse à un stress

oxydatif PKB/Akt inhibe Cdc25B par une phosphorylation sur la S353, aboutissant à son export

nucléaire (Baldin et al., 2003). De récentes études ont également montré que Cdc25B est inhibée

en réponse aux dommages induits par les radiations par les kinases p38 et MK2 (Bulavin et al.,

2001; Lemaire et al., 2006; Manke et al., 2005). Ainsi, bien que ces mécanismes soient encore mal

compris, l’inactivation de Cdc25B est requise lors de l’activation du point de contrôle G2/M

(figure 15). D’autre part, Plk1 qui est responsable de l’activation de Cdc25C et de CDK1-Cycline B

et de l’inhibition de Wee1, semble être aussi inactivée de manière indirecte par les kinases Chk1

ou Chk2 (Tsvetkov and Stern, 2005).

II-1-C-b : les événements de régulation transcriptionnelle

Une voie de signalisation dépendante de p53 permet aussi l’activation du point de contrôle

G2/M. Ainsi p53, comme dans le cas du point de contrôle G1/S active la transcription de p21CIP1

qui inactive le complexe CDK1-Cycline B1. p53 agit aussi sur la transcription de la protéine 14-3-

3σ qui va permettre de maintenir le complexe CDK1-Cycline B dans le cytoplasme. Enfin p53

permet de réprimer directement la transcription de CDK1 et CyclineB1 (Taylor and Stark, 2001).


55



II-2 : La biologie des points de contrôle

II-2-A : Modèle d’activation du point de contrôle G2/M en réponse aux stress génotoxiques

Le point de contrôle G2/M est un mécanisme de surveillance critique du cycle cellulaire dans

la réponse aux dommages sur l’ADN, qui est bien conservé au cours de l’évolution. La grande

variété d’agents impliqués dans l’activation du point de contrôle G2/M en fait un mécanisme

complexe dont il reste encore de nombreux composants à identifier. De plus, il existe de

multiples redondances dans la régulation de ce point de contrôle en réponse aux larges spectres

Figure 15 : Régulation des Cdc25 au point de contrôle G2/M Le complexe CDK1-Cycline B est la cible finale du point de contrôle G2/M. Il est maintenu inactif par de l’inhibition des phosphatases Cdc25 et de l’activation de Wee1. Cdc25C et Cdc25A sont des cibles de Chk1 ce qui créé un site de liaison aux 14-3-3 accompagné d’une rétention cytoplasmique des phosphatases. Cdc25A peut également être dégradée à la suite de sa phosphorylation sur la S124 par Chk1 et Cdc25C semble être dégradée à la suite d’une phosphorylation par les kinases Erk. Cdc25B dans le cytoplasme est la cible des kinases p38 et MK2 conduisant à son inactivation.


56



de stress génotoxiques. Afin de mieux comprendre la fonction générale de ce point de contrôle

en réponse aux dommages, un modèle simplifié, basé sur les données présentées ci-dessus peut

être proposé.

Différents types de stress induisent des voies de signalisation différentes. La première cascade

de signalisation est responsable de l’initiation du point de contrôle et régule majoritairement la

phosphorylation de Cdc25B dans le cytoplasme. Ainsi, on peut citer par exemple l’activation de la

voie p38MAPK en réponse aux radiations UV, la kinase p38 est responsable in vivo de la

phosphorylation du résidu S309 de Cdc25B conduisant à un site de liaison aux protéines 14-3-3.

L’inhibition de p38 par l’inhibiteur SB202190 empêche l’initiation rapide du point de contrôle

G2/M. La régulation de la phosphorylation de Cdc25B par p38 est donc un évènement critique

de l’initiation de l’activation du point de contrôle G2/M en réponse aux radiations UV (Bulavin

et al., 2001). Mais une autre cascade de signalisation est activée en réponse aux dimères de

thymidine produits par les radiations UV. Ces voies de signalisation qui semblent être légèrement

moins précoces, impliquent les protéines participant à la détection et à la signalisation des

dommages sur l’ADN. Ainsi, la kinase ATR conduit à l’activation de Chk1 qui va elle-même

cibler Cdc25C sur la S216 conduisant ici aussi à un site de liaison aux 14-3-3 et à une inhibition

de la phosphatase. Cette voie de signalisation est impliquée dans la maintenance du point de

contrôle G2/M tant qu’il reste des dommages non réparés sur l’ADN. Donc une réponse

précoce aux stress va conduire à l’initiation de l’activation du point de contrôle G2/M en ciblant

Cdc25B dans le cytoplasme. Si l’ADN n’est pas endommagé, les cellules vont pouvoir entrer en

mitose et terminer leur cycle cellulaire dès que le stress aura été éliminé. En revanche si des

dommages sur l’ADN sont détectés, la progression vers la mitose est alors contrôlée par un

système régulant l’état de phosphorylation de Cdc25C dans le noyau, tel que la voie ATR/Chk1.

Dans ce cas là, les cellules ne pourront entrer en mitose que lorsque les dommages sur l’ADN

seront réparés et dans le cas de dommages trop sévères, les cellules seront conduites vers

l’apoptose (Bulavin et al., 2002).

II-2-B : La sortie des points de contrôle

A la suite de l’établissement d’un point de contrôle, deux choix s’offrent à la cellule : soit le

retour dans le cycle cellulaire après la réparation correcte des dommages, soit dans le cas contraire

la programmation de la mort cellulaire.


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II-2-B-a : Retour dans le cycle cellulaire

Les études menées sur l’établissement des points de contrôle ont permis d’avoir une meilleure

vision sur la mise en place des cascades de signalisation en réponse aux différents stress.

Cependant les mécanismes permettant le retour des cellules dans le cycle cellulaire sont encore

très mal connus. De récentes études ont montré que Cdc25B et Plk1semblaient jouer un rôle

primordial dans la sortie des points de contrôle après la réparation des dommages sur l’ADN.

Ainsi Cdc25B serait impliquée dans l’activation du complexe CDK1-Cycline B1 lors du retour

dans le cycle cellulaire alors que Plk1 cible la kinase Wee1 (Bugler et al., 2006; van Vugt et al.,

2005). Par ailleurs des études ont montré que la surexpression de Cdc25B empêchait

l’établissement d’un point de contrôle (Forrest and Gabrielli, 2001; Miyata et al., 2001). Enfin,

notre équipe a montré récemment que la surexpression de Cdc25B dans les cellules U2OS

conduisait à la sortie prématurée du point de contrôle G2/M, induit par la doxorubicine ou

l’étoposide, et conduit à une entrée en mitose illégitime (Bugler et al., 2006).

Ces résultats permettent d’envisager que Cdc25B soit un élément clé contrôlant la reprise du

cycle cellulaire à la suite de la réparation des dommages sur l’ADN. Cependant, au vu de la

complexité générale des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire, il n’est pas exclu que de

nombreux autres mécanismes régulent finement la sortie des cellules à la suite de l’activation d’un

point de contrôle.

II-2-B-b : Apoptose

La protéine suppresseur de tumeur p53 est impliquée dans les mécanismes apoptotiques. p53

participe à l’induction de la transcription de FAS et intervient dans la production de certaines

protéines de la famille Bcl-2 comme BAX, PUMA et NOXA. Mais d’autres facteurs sont

impliqués dans l’apoptose. Par exemple Chk2 est responsable de la phosphorylation du facteur de

transcription E2F-1 en réponse aux dommages sur l’ADN. L’activation d’E2F-1 est responsable

de l’expression d’un grand nombre d’effecteurs de l’apoptose dans les cellules humaines

(Norbury and Zhivotovsky, 2004).


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II-3 : Dérégulation des points de contrôle et stratégies anti-

tumorales

Bien que le cancer soit une maladie maintenant bien décrite, les évènements conduisant à

l’apparition des cancers sont encore mal compris. Ainsi la meilleure compréhension de la

régulation des acteurs du cycle cellulaires et des points de contrôle permettra le développement

de nouvelles stratégies anti-tumorales conduisant à la production de molécules thérapeutiques.

Dans plus de la moitié des cancers, la protéine p53 est mutée et donc inactive. Cette mutation

conduit principalement à la perte du point de contrôle G1/S et à l’accumulation dans la cellule

d’une multitude d’erreurs non réparées lors de la réplication (Hofseth et al., 2004). De plus des

surexpressions d’acteurs impliqués dans la régulation des CDK tels que Plk1 (Eckerdt et al.,

2005), Cdc25 (Boutros et al., 2007), ATM (McKinnon, 2004) ou Chk2 (Bartek and Lukas, 2003),

aboutissent à une dérégulation des CDK qui entraine par conséquence une absence de point de

contrôle ou une hyperprolifération. La dérégulation des points de contrôle peut conduire à une

accumulation de dommages non réparés ou à une progression trop rapide dans la phase suivante

du cycle cellulaire, alors que la précédente n’était pas terminée, et ainsi mener à une instabilité

génétique.

L’implication de la dérégulation des principaux acteurs du cycle cellulaire et des points de

contrôle, rend difficile le développement spécifique de stratégies anti-tumorales. L’utilisation en

chimiothérapie de molécules à activité anti-proliférative, comme les inhibiteurs des

topoisomérases (doxorubicine, étoposide), les radiomimétiques (bléomycine), les inhibiteurs de la

réplication (gemcitbine), les agents alkylants (cisplatine) ou les poisons des microtubules (taxol,

vinblastine) ont permis d’aboutir à des résultats encourageants, elles ne sont cependant pas

spécifiques des cellules cancéreuses. Toutes les cellules en division de l’organisme sont touchées,

provoquant des effets secondaires qui peuvent être gênants et ne permettent pas d’atteindre des

index thérapeutiques élevés (Zhou and Bartek, 2004). Ainsi, les avancées de la recherche dans la

compréhension des mécanismes gouvernant le cycle cellulaire ont permis de cibler plus

particulièrement les acteurs spécifiques des cellules cancéreuses. On peut citer par exemple le

Glivec (imatinib mesylate) qui a pour cible la kinase BCR-Abl qui n’est présente que dans les

cellules de leucémie myéloïde chronique (Capdeville et al., 2002). Cependant, ce cas n’est pas

représentatif de la majorité des cancers, c’est pourquoi de nouvelles stratégies se tournent vers un

traitement faisant appel à l’association de molécules.


59



Pour cela deux grandes stratégies se développent. La première stratégie consisterait à bloquer

les cellules en phase G2 du cycle cellulaire, tout en les traitants conjointement avec une molécule

induisant l’apoptose des cellules cancéreuses (les radiations ionisantes par exemple). Ainsi cela

permettrait d’augmenter en même temps la résistance des cellules normales tout en guidant les

cellules cancéreuses vers un processus de mort cellulaire. Pour cela des molécules inhibant

l’activité de CDK1 ou des Cdc25 sont décrites dans la littérature (Prevost et al., 2003; Shapiro,

2006). La deuxième stratégie est basée sur des thérapies conduisant, au contraire, à l’inhibition du

point de contrôle G2/M (Kawabe, 2004). L’association d’inhibiteurs, ciblant par exemple la

kinase Chk1, avec des traitements génotoxiques induisant des dommages importants sur l’ADN,

mènerait les cellules cancéreuses à travers le point de contrôle G2/M pour entrer illégitimement

en mitose catastrophique qui mènera les cellules vers la mort cellulaire (Carrassa et al., 2004).


60




61



III- L’analyse protéomique

III-1 : Les principaux objectifs de la protéomique

Le terme “protéome” désigne l’ensemble des protéines exprimées par un génome pour une

cellule, un tissu, un organe ou organisme à un moment donné et dans des conditions données

(Wilkins et al., 1996).

Depuis la première séquence complète du génome de la bactérie Haemophilus influenzae en 1995

de nombreux génomes ont été déterminés. Il est clair aujourd’hui que l’ancien modèle du gène

encodant une seule protéine n’est plus admissible à cause des processus qui augmentent la

diversité chimique des protéines comme les phénomènes d’épissage alternatif, l’édition des ARN,

ou encore les modifications post-traductionnelles. La complexité du protéome excède ainsi de

très loin la séquence du génome.

Comprendre la complexité du protéome est le défi majeur de la protéomique. Mais le

développement n’aurait pas été possible sans les avancées technologiques qui permettent l’étude

du protéome telles que :

- Le séquençage de génomes complets qui alimentent les banques de données.

- L’évolution des techniques de séparation des protéines et de préparation de

l’échantillon avec l’électrophorèse sur gel (mono ou bidimensionnels), l’apparition de

systèmes de micro et nano-chromatographie liquide et leur couplage avec la

spectrométrie de masse.

- Le développement des spectromètres de masse en terme de sensibilité, de précision et

de résolution ainsi que l’apparition régulière de nouvelles générations d’instruments

toujours plus performants.

- Des outils bioinformatiques de plus en plus fiables et puissants.

Aujourd’hui, la protéomique a démontré qu’elle était indispensable à une meilleure

compréhension des processus normaux ou pathologiques, qu’elle pouvait contribuer au

développement de nouveaux biomarqueurs pour le dépistage de diverses maladies et accélérer la

recherche pharmaceutique (Hanash, 2003).

Les enjeux actuels de la protéomique sont d’une part le développement de la protéomique

fonctionnelle, à travers l’étude des interactions entre les protéines et l’étude des modifications


62



post-traductionnelles dans le but d’appréhender la fonction des complexes protéiques, et d’autre

part le développement de l’analyse quantitative. L’enjeu de la protéomique quantitative est de

mettre en évidence l’abondance des protéines qui sont dépendantes de l'état physiologique d'une

cellule ou d'un tissu.

L’aspect quantitatif de la protéomique est principalement représenté par la protéomique

différentielle qui est une des approches les plus anciennes de la protéomique. Elle consiste en la

comparaison de protéomes d’origines diverses, dans le but de mettre en évidence des régulations

positives ou négatives de certaines protéines. Les applications médicales sont diverses et

consistent entre autre à identifier les protéines régulées lors de certaines pathologies ou en

réponse à certaines drogues. L’électrophorèse bidimensionnelle est classiquement employée, elle

permet la comparaison des gels bidimensionnels provenant de différents mélanges protéiques et

la visualisation des protéines régulées de manière positive ou négative. De plus l’émergence de la

spectrométrie de masse permet une identification plus rapide et plus sensible de ces protéines

régulées et qui a largement remplacé la méthode de dégradation d’Edman plus difficile à mettre

en place, plus longue et moins sensible.

La protéomique fonctionnelle consiste à étudier la fonction des protéines exprimées par un

génome. Le plus souvent, les protéines interagissent entre elles au sein de complexes dans

l'établissement d'une fonction. La fonction d'une protéine peut donc être élucidée via la fonction

de ses partenaires et constitue la protéomique des interactions. Ajouté à cela, la caractérisation

fine d'une protéine et de ses modifications post-traductionnelles (MPT) constitue le second enjeu

de la protéomique fonctionnelle.

III-1-A : Les interactions entre les protéines

De manière générale, pour exercer leurs fonctions biologiques, les protéines interagissent entre

elles au sein de complexes protéiques. Par exemple les protéines kinases interagissent avec leurs

substrats en formant un complexe aboutissant à la mise en place du groupement phosphate ou

encore certaines enzymes ne sont actives qu’au sein de complexes protéiques comme c’est le cas

des kinases CDKs. Ainsi la connaissance de la fonction des partenaires protéiques d’une molécule

peut aboutir à la compréhension de la fonction de cette dernière. C’est la protéomique des

interactions.


63



Traditionnellement, les interactions protéiques étaient étudiées individuellement par

différentes techniques comme la méthode du « phage display », la chromatographie d’affinité, la

co-immunoprécipitation … (Phizicky and Fields, 1995). Depuis quelques années des techniques

ont été développées et adaptées pour identifier les interactions protéiques à grande échelle

(Drewes and Bouwmeester, 2003).

Aux côtés des méthodes de biologie moléculaire comme la technique du double-hybride

limitée aux interactions binaires et excluant les interactions liées à des modifications post-

traductionnelles (Fields and Song, 1989), il se développe des méthodes biochimiques d’analyse

des complexes purifiés couplés à la spectrométrie de masse. Nous pouvons citer par exemple le

système Tap-tag (Tandem Affinity Purification tag) (Rigaut et al., 1999), ou encore la technique BIA-

MS (Biomolecular Interaction Analysis – Mass Spectrometry) (Lopez et al., 2003).

III-1-B : La recherche de modifications post-traductionnelles

Au sein du deuxième volet de la protéomique fonctionnelle qui est l’étude de MPTs, un des

principaux enjeux est la caractérisation fine d’une protéine par l’intermédiaire de la mise en

évidence de ses modifications post-traductionnelles.

Les modifications post-traductionnelles (MPT) sont des événements covalents qui modifient

les propriétés physico-chimiques d’une protéine par un clivage protéolytique ou bien l’ajout de

groupements chimiques sur un ou plusieurs acides aminés. Loin d’être seulement des

“décorations”, la présence de MPT sur une protéine peut intervenir sur son activité, sa

localisation, sa stabilité, ainsi que sur ses interactions avec d’autres protéines. Par exemple dans le

phénomène de signalisation cellulaire, les cascades de protéines kinases sont activées ou

inactivées par un jeu réversible d’ajout ou de suppression de groupements phosphates (Cohen,

2000) ou bien, au cours du cycle cellulaire, l’ubiquitinylation marque les Cyclines pour induire leur

dégradation à des moments précis. Les principales modifications avec leurs fonctions sont

présentées dans le tableau 1 (Mann and Jensen, 2003).


64



Type de MPT

∆ Masse (Da) Stabilité Fonctions et notes

Phosphorylations pTyr pSer, pThr

+80 +80

+++ +/++

Réversibles, activation/inactivation des enzymes, interactions moléculaires, stabilité, signalisation…

Acétylation

+42

+++

Stabilité, protection du N terminal, régulation des interactions protéines-ADN

Méthylation +14 +++ Régulation de l’expression des gènes

Acylation, acide gras Farnésyle myristoyle palmitoyle

+204 +210 +238

+++ +++ +/++

Localisation cellulaire, signalisation, Ancrage membranaire. Interactions protéines-protéines.

Glycosylation N-glycosylation O-glycosylation

>800 203, >800

+/++ +/++

Excrétion des protéines. Reconnaissance cellulaire/signalisation. O-GlcNAc, réversible, régulation fonctionnelle

“Ancres” GPI

>1000

++

Ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI). Ancrage membranaire des enzymes et des récepteurs

Hydroxyproline +16 +++ Stabilité, interactions protéines-ligands

Sulfatation sTyr

+80

+

Modulation Interactions protéine/protéine, récepteur/ligand

Pont disulfure -2 ++ Stabilité, crosslink intra et inter moléculaire

Déamidation

+1

+++

Interactions protéines/protéines -/ligands. Modifications chimique artéfactuelle

Acide pyroglutamique

-17

+++

Stabilité protéique, blocage de l’extrémité N-terminale

Ubiquitinylation

>1000

+/++

Signal de dégradation

Nitratation des tyrosines +45 +/++ Oxydation / processus inflammatoire

Stabilité : + labile en spéctrométrie de masse en tandem, ++ modérement stable, +++ stable

Tableau 1 : Présentation des modifications post-traductionnelles les plus communes et importantes

Source : (Mann and Jensen, 2003)


65



Malgré la grande importance des MPT dans les fonctions biologiques, de part leurs propriétés

intrinsèques (charge, masse, labilité, structure), leur étude à grande échelle a été entravée par leur

grande diversité (plus d’une centaine de MPT sont dénombrées à l’heure actuelle) et par un

manque de méthodes appropriées. Ces méthodes doivent en effet être choisies en fonction de la

modification recherchée. Cependant les récents développements en spectrométrie de masse

combinés avec l’émergence de méthodes d’enrichissement et d’extraction par affinité et les

techniques de séparations multidimensionnelles ont contribué à rendre particulièrement

attrayante la recherche globale des MPT en protéomique. Ces différentes approches sont très

bien décrites dans la littérature (Jensen, 2004; Mann and Jensen, 2003; Mann et al., 2002;

Schweppe et al., 2003). Nous présenterons succinctement dans ce chapitre, sans prétendre à

l’exhaustivité, les principales stratégies mises en œuvre pour la caractérisation des modifications

les plus importantes, autant du point de vue de leur fréquence que de leur rôle physiologique

(tableau 1).

Les stratégies développées diffèrent en fonction de la stabilité de la modification lors de

l’analyse MS.

L’étude des modifications stables est sans doute la plus simple à mettre en place, puisqu’une

analyse protéomique standard est suffisante pour mettre en évidence une différence de masse

caractéristique d’une modification spécifique. Néanmoins, certaines stratégies ont été décrites,

notamment pour l’étude des méthylations ou des acétylations. L’exemple, bien connu, de

l’acétylation et la désacétylation réversible des histones représente la conservation au cours de

l’évolution de modifications post-traductionnelles qui jouent un rôle important lors de la

régulation de la transcription, de la réparation de l’ADN et de la réplication (Hake et al., 2004).

D’autres modifications des histones ont été décrites comme les phosphorylations,

l’ubiquitinylation ou encore les méthylations. La méthylation des résidus arginines des histones

H3 et H4 conduit généralement à une activation de la transcription alors que la méthylation des

lysines engendre soit une activation soit une répression dépendante de l’état de méthylation

(Andersen and Mann, 2000; Santos-Rosa et al., 2002). Les approches de spectrométrie de masse

ont apporté de réels progrès pour la mise en évidence rapide et sensible des acétylations et des

méthylations. Ainsi la MS/MS permet la détection d’ions “signatures” dont les masses ont été

caractérisées et qui sont spécifiques de la modification permettant ainsi d’identifier

spécifiquement le type de modification (Brame et al., 2004; Gehrig et al., 2004). En effet, on peut

citer comme exemple l’arginine portant une double méthylation (N-diméthylarginine), caractérisée


66



par la détection d’un ion diméthylammonium (m/z 46) et d’un ion diméthylcarodiimidium (m/z

71) en mode ESI-MS/MS (Brame et al., 2004).

Mais le caractère labile de certaines MPT conduisant à la perte du groupement chimique lors

de l’analyse MS/MS, a contribué au développement de nouvelles stratégies. C’est le cas de la

phosphorylation des résidus sérines et thréonines.

La phosphorylation est une des plus importantes et des plus abondantes modifications. En

effet, plus de 30% des protéines sont modifiées par l’attache covalente d’un groupement

phosphate (Hubbard and Cohen, 1993). Les plus communs et importants des sites de

phosphorylation chez les eucaryotes sont les résidus sérine, thréonine et tyrosine. Les résidus

sérine et thréonine sont plus fréquemment phosphorylés que les résidus tyrosine, avec un ratio de

(pS:pT:pT) 1800:200:1 dans une cellule de vertébré.

Les principales techniques utilisées pour la mise en évidence des phosphoprotéines sont

représentées dans le tableau 2 figurant dans la partie suivante de l’introduction générale (Cf. § III-

3) (Mann and Jensen, 2003). Traditionnellement, l’analyse des phosphorylations est étudiée à

l’aide d’un marquage métabolique avec du phosphore 32 (32P). La révélation par autoradiographie

des protéines ayant incorporées du 32P est la plus sensible et la plus spécifique. Cependant cette

technique est efficace lorsqu’elle est appliquée sur des échantillons de faible quantité ou pour

étudier des phosphorylations in vitro, mais le “radiomarquage” in vivo des protéines est limité à

l’étude des peptides monophophorylés et lourd à mettre en place (Boyle et al., 1991). L’utilisation

d’anticorps dirigés contre les acides aminés phosphorylés permet aussi de détecter spécifiquement

les phosphoprotéines à partir d’échantillon divers. Mais si les anticorps dirigés contre les

phosphotyrosines sont spécifiques, les anticorps dirigés contre les phosphosérines et les

phosphothréonines le sont beaucoup moins. L’utilisation de colorants fluorescents spécifiques

comme le ProQ diamond permet de mettre en évidence des phosphoprotéines sur les gels de

polyacrylamide (Laugesen et al., 2006). Cette technique présente l’avantage d’être simple et rapide

à mettre en place et permet la réalisation d’une analyse par spectrométrie de masse. Cependant

cette technique est peu sensible, les colorants sont onéreux et nécessitent l’emploi d’un matériel

lourd et coûteux pour la visualisation des spots et leur découpe en vue d’une analyse MS.

Avec la généralisation de l’utilisation de la spectrométrie de masse, d’autres approches ont

également été développées et feront l’objet d’une partie ultérieure de l’introduction générale (Cf. §

III-3).


67



III-2 : Approches générales de la protéomique

Classiquement l’analyse protéomique se divise en deux grandes approches faisant appel à la

spectrométrie de masse : l’approche dite “hors-gel” moins commune mais qui subit un fort

développement, et l’approche “en gel” qui est la plus couramment utilisée (figure 16). Si l’approche

hors-gel subit un réel essor, c’est pour s’affranchir des limites liées à la séparation

électrophorétique des mélanges de protéines. Dans cette approche, l’hydrolyse enzymatique a lieu

en solution et le mélange peptidique peut être séparé par chromatographie liquide

multidimensionnelle (Kislinger et al., 2005). Cependant nous développerons plus particulièrement

l’approche “en gel” qui a été mise en œuvre au cours de notre projet. Cette approche repose sur

la séparation préalable des mélanges de protéines par des méthodes d’électrophorèse mono ou

bidimensionnelle. Les fragments de gel contenant les protéines d’intérêt sont alors découpés et

soumis à une hydrolyse enzymatique dans le gel. Les mélanges peptidiques obtenus après élution

du gel peuvent ensuite être analysés suivant deux stratégies distinctes : soit les mélanges

peptidiques sont analysés par cartographie peptidique massique, soit les mélanges peptidiques

sont analysés par LC-MS/MS qui permettra d’obtenir également des informations de séquence

(voir ci-dessous). Enfin l’identification et la caractérisation de la protéine est réalisée par

interrogation des banques de données à l’aide d’outils bioinformatiques.

Figure 16 : Approches générales de la protéomique

Deux approches principales se sont développées. Lors de l’approche “en gel” les protéines sont préalablement séparées par électrophorèse avant d’être hydrolysées dans le gel. La deuxième approche “hors gel” s’affranchit de l’étape d’électrophorèse et les protéines sont hydrolysées en solution. Les mélanges peptidiques obtenus sont ensuite analysés par spectrométrie de masse pour conduire à l’identification des protéines


68



III-2-A : La séparation des protéines

Un défi important de la protéomique est de pouvoir séparer les protéines issues de complexes

ou de mélanges protéiques. Les protéines sont des molécules présentant des propriétés chimiques

très hétérogènes. Le point isoélectrique (pI) des protéines peut aller de moins de 3 à plus de 12.

Elles sont hydrophobes ou hydrophiles, et leur taille varie de quelques centaines à plusieurs

millions de Dalton. De plus chez les eucaryotes supérieurs, une large proportion de protéines est

modifiée (voir ci-dessus). Ces modifications sont souvent essentielles pour la fonction, la solubilité,

la stabilité et la localisation des protéines. Enfin les protéines présentent une forte variabilité de

concentration. La différence de concentration entre les protéines abondantes et rares dans un

fluide biologique peut dépasser 109 et 90 % de la masse d’un protéome est représentée par

seulement 10 % des protéines. La purification de ces objets biologiques qui présentent une telle

variabilité en termes de caractéristique chimique et de quantité est un défi important qui est

difficilement envisageable par une seule méthode. Un des défis est de pouvoir identifier les

protéines présentes en très faible quantité. Aujourd’hui, les principales méthodes de séparation

des protéines sont basées sur des approches chromatographiques et électrophorétiques.

III-2-A-a : L’électrophorèse sur gel

Dans de nombreux cas, l’électrophorèse sur gel est la méthode de choix pour séparer un

mélange de protéines simple : par exemple les protéines purifiées par immunoprécipitation,

affinité, GST-pull-down. La technique de SDS-PAGE (Sodium Dodécyl Sulfate- PolyAcrylamide

Electrophoresis) permet de séparer les protéines selon leur taille et leur poids moléculaire (Shapiro

et al., 1967). Le principe consiste à faire migrer les protéines dans un champ électrique en

fonction de leur charge vers l’électrode de charge opposée à travers un réseau de polymère

d’acrylamide plus ou moins réticulé. La présence de SDS permet de dénaturer les protéines en

rompant les liaisons non covalentes et d’introduire une densité de charge équivalente sur toute la

longueur de la protéine (Laemmli, 1970). L’utilisation de réseau d’acrylamide en gradient permet

aussi de séparer les protéines sur une plus grande plage de masse, mais sera moins résolutive.

Une approche particulière de l’électrophorèse sur gel est la focalisation isoélectrique (IEF).

Dans ce cas les protéines sont soumises à une électrophorèse dans un gel comprenant des


69



ampholytes avec un gradient de pH connu. Au cours de cette étape les protéines soumises à un

champ électrique constant migrent dans le gel jusqu’à atteindre une valeur de pH égale à leur

point isoélectrique pour laquelle la charge globale de la protéine est nulle (Dossi et al., 1983).

C’est en 1975, que l’association de ces deux séparations permettra de séparer les protéines

selon deux paramètres indépendants et marquera ainsi la naissance de l’électrophorèse

bidimensionnelle (2D) (O'Farrell, 1975; Scheele, 1975). L’électrophorèse par gels 2D est

actuellement la méthode la plus résolutive de séparation d’un mélange complexe de protéines,

loin devant les approches chromatographiques. Il reste cependant des limitations à cette

technique qui sont majoritairement la faible détection des protéines peu abondantes, basiques ou

hydrophobes, en particulier pour les protéines membranaires, même si récemment des

chercheurs ont relevé ce défi et ont montré la séparation de protéines hydrophobes par gels 2D

(Luche et al., 2003).

La détection des protéines immobilisées dans des polymères d’acrylamide peut être réalisée par

plusieurs techniques. La première, la plus sensible, est l’utilisation de la radioactivité par

incorporation d’acides aminés radioactifs. C’est la seule méthode qui permet de visualiser les

protéines néo-synthétisées. La seconde méthode, qui et aussi la plus classique, est l’utilisation du

bleu de coomassie. Cette technique de coloration présente cependant deux principaux

inconvénients : une faible sensibilité et une gamme de linéarité faible (Neuhoff et al., 1988). La

troisième méthode est la coloration à l’argent qui présente une bonne sensibilité, mais une faible

linéarité et qui est moyennement compatible avec l’analyse par MS (Gharahdaghi et al., 1999;

Shevchenko et al., 1996). Enfin, la dernière méthode, la plus récente, est l’utilisation de la

fluorescence par couplage covalent de molécules fluorescentes (Unlu et al., 1997) ou l’utilisation

des complexes organométalliques fluorescents du type Sypro-Ruby (Berggren et al., 2000;

Rabilloud et al., 2001). Ces colorations fluorescentes sont très sensibles, présentent une très

grande gamme de linéarité et sont parfaitement compatibles avec la spectrométrie de masse. Ces

colorations sont à l’origine de nouvelles avancées dans les études comparatives par

électrophorèse 2D. Cependant, comme pour l’utilisation du ProQ diamond (voir plus haut, § III-1-

B) les colorants sont onéreux et nécessitent l’emploi d’un matériel lourd et couteux pour la

visualisation des spots et leur découpe en vue d’une analyse MS.


70



III-2-A-b : La chromatographie

Toutes les méthodes de chromatographie peuvent constituer une étape de pré-fractionnement

lors d’une analyse protéomique. La chromatographie est une méthode qui est employée pour

diviser l’extrait protéique sans à priori et selon les critères physico-chimiques de la protéine

(charge, hydrophobicité, taille, affinité…) par l’utilisation de différentes phases. Ainsi la

chromatographie sur phase inverse sépare les analytes en fonction de leur hydrophobicité. La

phase mobile est en général constituée de solvants organiques (acétonitrile, méthanol) et est

acidifiée afin de maintenir les analytes sous forme chargée. L’utilisation de ce type de solvants

peut ainsi permettre un couplage direct avec la spectrométrie de masse. Par ailleurs, les fractions

obtenues peuvent être séparées par une autre chromatographie (c’est par exemple la

chromatographie multidimensionnelle (LC/LC) (Davis et al., 2001; Washburn et al., 2002)) ou

par électrophorèse bidimensionnelle (Butt et al., 2001).

Un grand nombre de combinaisons de chromatographies liquides ont été développées en

mode LC/LC (Shen and Smith, 2002). En règle générale la deuxième étape de LC est une phase

inverse afin de permettre un couplage direct avec la spectrométrie de masse, mais la première

étape peut être constituée par de multiples types de chromatographies liquides. L’avantage de ces

méthodes est d’éviter les inconvénients liés à l’électrophorèse bidimensionnelle. Elles sont plus

rapides à réaliser, présentent une meilleure reproductibilité et apparaissent plus facilement

automatisables.

III-2-B : L’identification et la caractérisation des protéines

L’identification des protéines a été réalisée dans le passé par des techniques comme la

composition en acides aminés ou le séquençage d’Edman. Depuis une dizaine d’année, la

spectrométrie de masse est devenue incontournable dans l’étude et la caractérisation des

macromolécules biologiques et en particulier dans l’étude des peptides et des protéines.

L’empreinte peptidique massique ou Peptide Mass Figerprint (PMF) a progressivement remplacé le

séquençage d’Edman pour l’identification des protéines. L’analyse en PMF consiste en la mesure

des masses du mélange peptidique obtenu par digestion enzymatique d’une protéine inconnue et

son identification rapide par des outils informatiques. A l’heure actuelle, avec les progrès réguliers


71



effectués dans le développement des spectromètres de masse, l’identification et la caractérisation

des protéines se fait principalement par des approches de type LC-MS/MS.

III-2-B-a : Histoire et principe de la spectrométrie de masse

Un spectromètre de masse est un système composé de trois éléments. L’échantillon liquide,

solide ou gazeux est ionisé dans la première partie du spectromètre de masse appelée source. Une

source est couplée à au moins un analyseur qui est un système de triage des ions en fonctions de

leur rapport masse sur charge (m/z). Enfin, un détecteur complète le spectromètre de masse et

dénombre les ions séparés dans l’analyseur. Un système informatique est nécessaire pour collecter

toutes les informations et permettre le traitement du signal et la visualisation du spectre (figure 17).

La spectrométrie de masse est une technique ancienne que l’on peut associer au physicien

Joseph John Thomson (1856-1940) de l’université de Cambridge. Il recevra le prix Nobel de

physique en 1906. Des améliorations seront apportées par Francis W. Aaston (prix Nobel de

physique en 1922). La première analyse d’une molécule biologique date des années 1960. Mais

c’est dans les années 1980 que les applications biochimiques commenceront à apparaître. Peu de

temps après, de nouveaux progrès dans les méthodes d’ionisation comme l’électrospray (ESI)

Figure 17 : Principe de la spectrométrie de masse L’échantillon est ionisé au niveau de la source. Les ions générés sont triés dans l’analyseur en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z). Les ions séparés par l’analyseur sont alors dénombrés par le détecteur qui est couplé à un système informatique permettant le traitement du signal.


72



développé dans le laboratoire de John Fenn (Fenn et al., 1989) et de désorption/ionisation laser

assisté par matrice (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation, MALDI) (Karas and Hillenkamp,

1988; Tanaka et al., 1998) permettront à la spectrométrie de masse des macromolécules

biologiques de franchir un nouveau cap. John Fenn et Koichi Tanaka ont été récompensés par le

prix Nobel de chimie en 2002. Parallèlement au développement de nouvelles sources d’ionisation,

des analyseurs permettant le tri des masses ont été développés. On peut citer les analyseurs à

temps de vol (Time Of Flight, TOF), à filtre quadripolaire (Q) ou à piège ionique (Ion Trap, IT).

Dans les années 1990, les appareils combinant des sources MALDI et des analyseurs à temps de

vol ou des sources ESI couplées à des analyseurs quadripolaires ont dominé les applications en

biologie. Les couplages MALDI-TOF ou ESI-Q sont bien adaptés, mais aujourd’hui de plus en

plus d’appareils hybrides combinant des sources avec différents analyseurs sont disponibles, on

peut citer par exemple : le Q-TOF, le Q-Trap ou encore le LTQ-Orbi-Trap.

III-2-B-b : MALDI-TOF MS

L’analyse en MALDI-TOF nécessite un appareil constitué d’une source MALDI associée à un

analyseur de type TOF. Depuis la description par Karas et Hillenkamp (Hillenkamp and Karas,

1990) de la technique de désorption/ionisation par laser assisté par matrice appelée MALDI, les

appareils basés sur cette technologie se sont répandus dans les laboratoires de spectrométrie de

masse ainsi que dans les laboratoires de biochimie. Cette technique est simple d’utilisation et est

appliquée à des peptides de quelques acides aminés, mais peut aussi être utilisée pour l’analyse de

protéines entières avec des molécules de plus de 150 kDa. L’ionisation MALDI utilise un faisceau

de laser pulsé pour désorber et ioniser un mélange d’échantillon co-cristallisé avec une matrice

sur une plaque métallique (Karas and Hillenkamp, 1988). La matrice absorbe l’énergie et

provoque l'amputation d’une partie de cette matrice qui est transformée en gaz entraînant des

molécules d’échantillon (figure 18). Un des avantages de l’ionisation MALDI est qu’elle présente

une relative tolérance vis-à-vis des tampons, des sels et de certains détergents. Les ions gazeux

obtenus sont alors accélérés vers l’analyseur par application d’un champ électrostatique.

L’ionisation sous l’effet de l’impact laser génère principalement des ions mono-chargés, ce qui

facilite l’analyse des spectres de masse obtenus en MALDI-TOF MS (Karas et al., 2000). Ce type

d’ionisation est couramment associé à un analyseur à temps de vol. Le TOF mesure le ratio m/z

d’un ion en déterminant le temps nécessaire pour que l’ion traverse le tube de vol. De plus, le


73



couplage MALDI avec un analyseur TOF permet d’obtenir des spectres avec de bonnes

résolutions (>15000) et précisions de masse (<20ppm), ce qui aboutit a une grande spécificité de

recherche dans les banques de données.

Cependant il existe un phénomène de suppression de signal en mode MALDI-TOF (Kratzer

et al., 1998). Ce phénomène s’explique par la différence d’ionisation des peptides, liée à leur

composition en acides aminés. Ainsi dans un mélange peptidique complexe, les peptides

faiblement ionisés peuvent être masqués rendant l’identification des protéines par PMF

inefficace.

III-2-B-c : LC-ESI-MS

La deuxième approche qui joue un rôle primordial dans l’analyse des macromolécules

biologiques est la spectrométrie de masse en mode électrospray (Fenn et al., 1989) Le mécanisme

de l’ionisation par électrospray n’est pas encore parfaitement compris. Néanmoins, on peut

décrire le phénomène. Dans un premier temps, une solution d’échantillon est introduite dans un

capillaire qui est porté à un haut potentiel électrique. Ce champ électrique provoque la formation

Figure 18 : Principe de l’ionisation MALDI Une matrice est cocristallisée en présence d’analyte sur une plaque. L’énergie émise par le laser est absorbée par les molécules de matrice provoquant leur désorption entrainant aussi les molécules d’analyte. Les ions ainsi formés sont ensuite dirigés vers l’analyseur du spectromètre de masse (TOF généralement).


74



d’un nuage de gouttelettes chargées qui se dirigent vers l’entrée du spectromètre de masse. Par

évaporation, ces gouttelettes vont porter une charge positive de plus en plus importante qui

provoquera une succession d’explosion coulombiennes pour aboutir à la fin du processus à des

ions moléculaires multichargés de type [M+nH]n+ ou n est le nombre de charges portées par la

molécule analysée de masse M (figure 19).

Les sources ont été peu à peu miniaturisées ce qui permet d’augmenter la sensibilité de

l’analyse LC-ESI-MS. À côté des sources ESI classiques, on trouve des sources microélectrospray

(microESI) (Emmett et al., 1995), nanoélectrospray (nanoESI) (Shevchenko et al., 1996) ou

picospray (picoESI) (Valaskovic et al., 1996). L’échantillon est simplement solubilisé dans un

solvant compatible avec l’électrospray comme un mélange méthanol-eau 1:1 (v/v) contenant 1%

(v/v) d’acide formique en mode positif ou en présence de NH4OH pour le mode négatif.

Cependant, contrairement au MALDI, les détergents et autres sels sont très mal tolérés par les

sources ESI. Les sources ESI peuvent être associées à des techniques séparatives comme la nano-

chromatographie en phase liquide (nanoLC). On parle alors de LC-ESI-MS ou encore de LC-

ESI-MS/MS ou LC/LC-ESI-MS/MS. Ce dernier indique la chromatographie bidimensionnelle

Figure 19 : Principe de l’ionisation par electrospray (ESI) Un échantillon est porté à haut potentiel électrique (3-6kV) lors de son passage à travers un capillaire métallique. Au cours de leur trajectoire, les gouttelettes sont désolvatées créant une accumulation de charges à leur surface. Lorsque la densité de la charge devient trop importante, les gouttelettes explosent pour former des espèces désolvatées et multichargées.


75



couplée à la MS en tandem (§III-2-A-b et §III-2-B-d). La production d’ions multichargés permet

d’analyser des molécules de hautes masses avec des analyseurs de masse possédant une gamme

limitée. Les sources électrospray ont été très souvent couplées à des analyseurs de masse

quadripolaire, comme le quadripôle ou le piège ionique (Jonscher and Yates, 1997). Mais ces

sources sont de plus en plus fréquemment couplées à d’autres analyseurs comme le Q-TOF

(Chernushevich et al., 2001) ou le FT-ICR (McLafferty et al., 2001).

III-2-B-d : La spectrométrie de masse en tandem

La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) combine au moins deux analyseurs

permettant d’étudier les informations structurales d’un échantillon. Le principe général est décrit

en figure 20. Les ions formés dans une source entrent dans un premier analyseur qui permet de

sélectionner l’ion que l’on souhaite fragmenter. Cet ion est appelé l’ion précurseur, il sera le seul à

sortir du premier analyseur et viendra entrer en collision avec des molécules de gaz neutres

placées dans une chambre de collision. La collision provoquera sa fragmentation en peptides plus

petits qui seront utilisés pour déduire la séquence en acide aminés. Les rapports m/z des

fragments sont triés par un second analyseur. La formation de ces ions suit des règles précises et

l’étude du spectre MS/MS obtenu donne des informations fiables sur la séquence de l’ion

précurseur. On peut observer des fragments N-terminaux obtenus en cassant une liaison

peptidique et en conservant la charge du côté N-terminal. Ils sont appelés les ions a, b, c. Les

fragments C-terminaux sont complémentaires des fragments N-terminaux, mais la charge est

localisée du côté C-terminal. Ils sont appelés les ions x, y, z. La nomenclature associe à ces

fragments un indice qui indique le nombre de résidus portés par l’ion fragment (figure 21)

(Biemann, 1990b). En protéomique, ce type d’expérience est notamment utilisé pour déterminer

la séquence d’un peptide, pour identifier des modifications post-traductionnelles ou la présence

de mutations.


76



Figure 20 : Principe de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) Les deux analyseurs MS1 et MS2 sont séparés par une cellule de collision. Les ions isolés dans le premier analyseur sont fragmentés dans la cellule de collision. Les ions fragments obtenus sont alors analysés dans le deuxième analyseur pour générer des spectres MS/MS

Figure 21 : Fragmentation préférentielle observée en mode MS/MS de peptide Illustration de la nomenclature des fragmentations d’après Biemann sur un tripeptide, les chaînes latérales sont notées R1, R2 et R3. La nomenclature de Biemann permet de classer les fragments générés (Biemann, 1990a). Après fragmentation la charge peut être retenue sur le fragment amino-terminal (ions a, b et c) ou bien sur le fragment carboxy-terminal (ions x, y et z). les ions fragments sont généralement caractérisés par un chiffre (y1, y2, y3…) traduisant le nombre de résidus portés par le fragment.


77



III-2-C : Les stratégies mises en œuvre pour l’identification des protéines

L’identification des protéines en protéomique peut être effectuée par deux types d’approches

faisant appel à la spectrométrie de masse. La stratégie “Bottom-Up” qui consiste à analyser un

mélange peptidique issu d’une protéolyse enzymatique et la stratégie “Top-Down” qui permet

d’identifier une protéine par spectrométrie de masse sans passer par la protéolyse (figure 22)

(Bulavin et al., 2002; Reid et al., 2001; Sze et al., 2002). Nous développerons dans ce chapitre plus

particulièrement l’approche “Bottum-Up” qui est la plus classiquement utilisée et celle que nous

avons suivie lors la réalisation de notre projet.

La stratégie Bottum up est apparue en 1993, et est très bien décrite dans la littérature

(Aebersold and Goodlett, 2001; Mann et al., 2001). Elle consiste en l’identification, par

spectrométrie de masse MALDI-TOF ou LC-ESI-MS/MS, de peptides issus de l’hydrolyse

enzymatique de la protéine. La comparaison des données expérimentales avec les fragmentations

“théoriques” issues de l’hydrolyse virtuelle des protéines contenues dans les banques de données

permet ainsi d’identifier les candidats.

Figure 22 : Identification des protéines par la spectrométrie de masse L’identification des protéines par spectrométrie de masse peut être réalisée par l’analyse de protéines entières. Cependant l’approche la plus courante consiste à hydrolyser les protéines à l’aide d’une protéase (en générale la trypsine) et l’identification est réalisée à partir du mélange peptidique obtenu.


78



III-2-C-a : La protéolyse

La trypsine est la protéase classiquement utilisée en protéomique. C’est une protéine de

23,5kDa qui a la capacité de pénétrer entre les mailles d’acrylamide, permettant de réaliser la

protéolyse des protéines candidates directement dans le gel d’acrylamide. Elle a la capacité de

cliver spécifiquement les protéines en carboxy-terminal de leurs résidus lysines et arginines. La

fréquence d’occurrence de ces résidus basiques permet de générer des peptides dont la taille

moyenne est d’environ 10 nucléotides ce qui correspond à un poids moléculaire de 1100Da, taille

idéale pour une analyse par spectrométrie de masse. Aussi les peptides générés par la trypsine ont

la particularité d’avoir un résidu basique en position carboxy-terminal, ce qui facilite l’ionisation

en mode positif et favorise la formation d’ions de la série y dans les expériences de fragmentation

en mode MS/MS. Cependant, des alternatives à l’hydrolyse par la trypsine ont été développées,

en particulier lors de la caractérisation fine d’une protéine (variant ou recherche de modifications

post-traductionnelles) qui passe par l’obtention d’une couverture de séquence le plus large

possible.

Ainsi l’endoprotéinase Lys-C clive spécifiquement en carboxy-terminal des lysines, mais

génère des peptides plus longs que ceux de la trypsine. L’endoprotéinase Asp-N clive

spécifiquement en amino-terminal des résidus asparagines et glutamines, mais génère des peptides

non chargés qui sont plus difficiles à ioniser. Enfin la chymotrypsine clive de manière peu

spécifique en carboxy-terminal des résidus tryptophanes, tyrosines, phénylalanines, leucines et

moins fréquemment les résidus méthionines et histidines. Le clivage chimique au bromure de

cyanogène, très spécifique des méthionines est une alternative à l’utilisation des endoprotéinases

mais génère des peptides plus longs.

III-2-C-b: Spectrométrie de masse en protéomique

Les peptides obtenus sont analysés par spectrométrie de masse et leur rapport m/z est mesuré.

Pour cela deux types d’approches sont possibles : soit la cartographie peptidique en mode

MALDI-TOF MS, soit la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en

tandem, le mode LC-ESI-MS/MS.

Le mode PMF consiste à mesurer le rapport m/z des peptides en mélange (voir ci-dessus, §III-2-

B-b). Cette technique présente l’avantage d’être simple, rapide d’utilisation et facilement


79



automatisable. Cependant l’analyse en mode MALDI est limitée par les phénomènes de

suppression ce qui conduit à un risque de perte d’information.

Le mode ESI-MS/MS, de son côté, en couplage avec une chromatographie liquide permet de

séparer les peptides dans le temps et donc de minimiser le phénomène de suppression.

L’avantage majeur de cette approche réside dans la possibilité de réaliser des expériences de

fragmentation en mode MS/MS et d’atteindre ainsi une très grande spécificité lors de

l’interrogation dans les banques de données. Cependant cette technique est plus longue à mettre

en œuvre principalement à cause de la durée de la chromatographie. C’est pourquoi la stratégie

LC-MS/MS n’est réalisée que lorsque la cartographie peptidique massique n’est pas suffisante

pour l’identification ou la caractérisation de la protéine. Cette technique est également bien

adaptée à l’analyse de mélange complexe de protéines, de protéines de faible abondance et de

petites protéines.

III-2-C-c : L’interrogation dans les banques de données

Les banques de données sont des collections de fichiers regroupant les séquences des

protéines connues avec des annotations sur leurs fonctions, leurs modifications post-

traductionnelles connues ou encore les variants connus des différentes protéines. Les banques

contenant des informations non redondantes les plus complètes sont SWISSPROT et Protein

Information Ressource (PIB). Parmi les autres banques de données ont peut citer la Protéine

Data Bank qui est une banque de structure protéique, TrEMBL qui correspond à la traduction de

la banque génomique EMBL, déductions faites des entrées de SWISSPROT et GenePept, la

traduction de GenBank gérée par le National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Enfin la banque protéique du NCBI a été compilée à partir de sources multiples incluant

SWISSPROT, PIR, PDB et la traduction de régions codantes dans GenBank.

Les outils bio-informatiques sont donc essentiels dans les sciences protéomiques. L’apparition

d’internet a permis de partager l’information à une vitesse impensable quelques années

auparavant. Le serveur ExPASy a permis dès 1993 d’interroger la banque de données

SWISSPROT. Ainsi, ces bouleversements informatiques ont permis de développer une multitude

d’outils bio-informatiques, en particulier des algorithmes permettant d’identifier des protéines à

partir des résultats obtenus par spectrométrie de masse par l’intermédiaire de l’interrogation des


80



banques de données. Il faut citer par exemple pour l’analyse des cartographies peptidiques

massiques les sites de Protein Prospector (Clauser et al., 1999) ProFound (Zhang and Chait,

2000), Mascot (Perkins et al., 1999), Phenix et Sequest (Klimek et al., 2007). Outre la masse

expérimentale des peptides trypsiques plusieurs paramètres sont pris en compte dans les

algorithmes de recherche dans les banques de données. Nous pouvons citer par exemple l’origine

de la protéine, ses propriétés physiques et la nature de la protéase utilisée qui peuvent permettre

de restreindre la recherche. Mais encore la prise en compte de la présence de modifications post-

traductionnelles sur la protéine. Bien que sensiblement différente, l’interrogation en banques de

données à partir des données de MS/MS fait intervenir les mêmes éléments. Enfin des

algorithmes de séquençage de Novo de plus en plus performants sont disponibles et permettent

d’identifier une séquence à partir de spectres MS/MS qui n’ont pas été interprétés. Par exemple,

les logiciels PEAKS (Anderson et al., 2003), MassLynx de Micromass et Biotools de Bruker.

III-3 : Analyse protéomique pour l’étude des phosphorylations

Comme nous l’avons vu dans les parties précédentes de l’introduction générale, les

phosphorylations sont des évènements majeurs intervenant dans la régulation de l’activité, de la

localisation ou de la stabilité des protéines. L’identification et la caractérisation précise des

évènements de phosphorylation régulant une protéine sont des éléments déterminants pour la

compréhension de la fonction biologique liée à cette molécule. Le caractère transitoire de la

phosphorylation et la faible proportion des protéines phosphorylées par rapport aux protéines

non phosphorylées rendent leur étude très difficile. L’étude des phosphorylations est donc

devenue un défi majeur de la protéomique et de nombreuses approches ont été développées

(figure 23).


81



III-3-A : Détection des phosphopeptides

L’étude des phosphorylations par spectrométrie de masse suit, le plus généralement, une

stratégie de type Bottum up (voir ci-dessus). Ainsi les mélanges protéiques ou les protéines purifiées

pour lesquelles les phosphorylations sont recherchées sont préalablement hydrolysées. La

trypsine est la protéase classiquement utilisée. Le mélange peptidique obtenu est ensuite soumis à

une analyse par spectrométrie de masse.

Les phosphopeptides sont détectés par l’augmentation de masse caractéristique du

groupement phosphate (HPO3), qui correspond à +80Da pour une espèce monophosphorylée.

La différence de masse de -80Da consécutive à un traitement phosphatase facilite aussi

l’identification des phosphopeptides.

Figure 23 : Approches protéomiques utilisées pour l’analyse des phosphopeptides Voici un aperçu des techniques développées par la protéomique pour l’enrichissement et l’analyse des protéines ou des peptides phosphorylés.


82



Les peptides phosphorylés peuvent également être mis en évidence en utilisant le mode

“balayage de perte de neutre” lors d’une analyse ESI-MS/MS (Jaffe et al., 1998). Cette méthode

se sert de la fragmentation pour induire la perte du groupement neutre H3PO4 des phospho-

sérines ou des phospho-thréonines. Seuls les ions présentant une perte de masse de 98Da sont

sélectionnés pour être séquencés. Cependant les résidus phospho-tyrosines ne peuvent pas être

identifiés en mode de balayage par perte de neutre, à cause de la meilleure stabilité du

groupement phosphate sur ce résidu.

Le balayage des ions précurseurs ou “precursor ion scan” est aussi utilisé en spectrométrie de

masse en tandem en mode négatif pour identifier les phosphopeptides (Carr et al., 1996; Wilm et

al., 1996). Chaque ion parent libérant des ions négatifs à m/z=79 après la fragmentation est

sélectionné et analysé par MS/MS après un retour en mode positif. Le mode “precursor ion

scan” peut aussi être utilisé en mode positif pour identifier l’ion immonium caractéristique des

résidus phospho-tyrosines (m/z 216,04) (Mann et al., 2002).

III-3-B : Détermination des sites de phosphorylation par MS/MS.

Une fois le peptide phosphorylé identifié, il est possible de déterminer la position exacte de la

phosphorylation par MS/MS. Le phosphopeptide est sélectionné dans le premier analyseur du

spectromètre de masse et fragmenté. Les informations de séquences obtenues lors de la

fragmentation permettent de remonter la séquence du peptide. La phosphorylation est visible sur

le spectre de masse par un écart de masse de 80 ou de 98Da. Pour l’analyse de mélanges

complexes, il est nécessaire de procéder à une première séparation des peptides sur phase reverse

par HPLC.

III-3-C : Méthode d’enrichissement

Bien que les phosphopeptides puissent être identifiés à des niveaux de l’ordre de la

femtomole, l’identification du résidu modifié reste un challenge dû au niveau d’abondance

beaucoup plus faible du peptide phosphorylé par rapport au peptide non phosphorylé dans un

mélange de digestion peptidique. La grande sélectivité de la perte de neutre ou du “precursor ion


83



scan” permet l’identification de phosphopeptides dans des mélanges complexes, cependant ces

approches nécessitent de très grandes quantités de matériel (de l’ordre de la micromole).

Ainsi d’autres approches ont été développées dont le but est d’enrichir le mélange peptidiques

en phosphopeptides. Cet enrichissement peut être réalisé par chromatographie d’affinité utilisant

des ions métalliques immobilisés (IMAC) sur une colonne d’acide imino-diacétique (IDA) ou

d’acide nitrilo-acétique (NTA). De nombreux ions métalliques peuvent être utilisés (fer, cuivre,

zinc, gallium…) et donnent des résultats différents qui sont parfois complémentaires (Posewitz

and Tempst, 1999). Mais la limite de cette chromatographie IMAC réside dans son manque de

spécificité puisque les peptides acides sont eux aussi fréquemment retenus. Néamoins la méthyl-

estérification préalable des groupements carboxyliques permet de réduire grandement le

phénomène de fixation non spécifique (Zheng et al., 2005). En revanche, il n’est pas exclu que

certains peptides phosphorylés ne soient pas retenus. Plus récemment les colonnes TiO2 ont

également été introduites pour l’enrichissement des phosphopeptides avant l’analyse par

spectrométrie de masse et semblent être prometteuses pour l’étude de la phosphoprotéomique

fonctionnelle (Pinkse et al., 2004). Les peptides phosphorylés sont séparés des peptides non

phosphorylés en étant retenus sur la colonne de TiO2 en condition acide.

Détection Méthodologie Phosphoprotéines

Marquage métabolique Incorporation d’isotopes radioactifs 32P (pY, p, pT…)

Western blot Coloration Sondes spécifiques des PTM

Anticorps Sondes fluorescentes Enzymes

α-pY, α-pS/pT Pro-Q diamond Phosphatase, kinase

Enrichissement Liaisons aux épitopes Chélateurs

Anticorps Ions immobilisés

α-pY, α-pS/pT Fe(III)-IMAC Ga(III)-IMAC

Etiquettage Chimique Beta-élimination Biotynilation (pS/pT) Détermination de la masse Chimique Beta-élimination Détermination de la différence

de masse (pS/pT)

Spectrométrie de masse Détermination de la masse Séquençage Détection sélective quantitation

MS MS/MS MS/MS de l’ion précurseur Perte de neuter par MS/MS

∆ masse (80 Da) ∆ masse (80, 98) 216 (pY), 79 (pS/pT/pY) 98 (H3PO4)

Tableau 2 : Présentation des approches utilisées pour l’analyse des phosphopeptides

Source : (Mann and Jensen, 2003)

84



85



RESULTATS

86



Projet de thèse

87



Projet de thèse

A- Situation du projet

Mes travaux de thèse, présentés ici, ont été réalisés dans le cadre d’une convention cifre

(Convention Industrielle de Formation par la Recherche) et sont le résultat d’une collaboration entre un

laboratoire industriel (l’Institut de Recherche SERVIER) et un laboratoire académique (le

LBCMCP).

Nous avons vu tout au long de l’introduction générale l’importance des modifications post-

traductionnelles et en particulier des phosphorylations dans les mécanismes de contrôle et de

régulation du cycle cellulaire. De plus, avec l’émergence de la recherche de nouvelles stratégies

pour la lutte contre le cancer, des stratégies utilisant des inhibiteurs des kinases Chk en

association avec un traitement génotoxique se développent dans le but de pousser les cellules

cancéreuses vers une mitose catastrophique les conduisant ainsi à la mort cellulaire.

La réalisation de ce projet de thèse s’est donc déroulée autour d’un objectif commun entre ces

deux laboratoires qui était d’étudier dans ce contexte la régulation de la phosphatase Cdc25C, lors

de la progression dans le cycle cellulaire ou à la suite de l’activation du point de contrôle G2/M, à

travers l’analyse de ses modifications post-traductionnelles.

Figure 24 : Présentation du projet

Projet de thèse

88



Ainsi, les intérêts dégagés par la réalisation de ces travaux étaient doubles : (i) au sein de la

recherche académique la caractérisation fonctionnelle de ces modifications post-traductionnelles

permettra de comprendre les mécanismes impliqués et de proposer un modèle de régulation et

(ii) dans le cadre de la recherche en industrie pharmaceutique l’identification des enzymes

régulatrices responsables de ces modifications post-traductionnelles pourrait être à l’origine de la

mise en évidence de nouvelles cibles pharmacologiques (figure 24).

B- Présentation des travaux de thèses

La réalisation de ce projet s’est déroulée autour de trois thèmes principaux :

- Tout d’abord la mise au point de conditions de purification de Cdc25C compatibles avec

la spectrométrie de masse, d’un contrôle de la progression dans le cycle cellulaire et de

l’activation du point de contrôle G2/M.

- Ensuite l’identification et la caractérisation des modifications post-traductionnelles de

Cdc25C par spectrométrie de masse proprement dites.

- Et enfin l’analyse fonctionnelle des modifications post-traductionnelles mises en évidence,

ainsi que la caractérisation des enzymes régulatrices impliquées dans ces mécanismes.

Pour cela, le choix de la stratégie de purification, qui était le point de départ de notre projet,

était essentiel pour mener à bien la suite de ces travaux. Ainsi je décrirai dans un premier temps le

cheminement qui nous a conduit à choisir une stratégie de purification. Puis je présenterai le

principe de l’analyse protéomique globale que nous avons mis en place et qui nous a permis de

mettre en évidence de nouvelles modifications post-traductionnelles sur la phosphatase Cdc25C,

en particulier la présence d’une phosphorylation sur le résidu sérine 168 et d’une phosphorylation

sur le résidu sérine 263. Enfin, avant de conclure ce mémoire de thèse sur une discussion

générale, la troisième partie de cette étude sera consacrée à la description des résultats

préliminaires que nous avons obtenus lors de la caractérisation de ces phosphorylations.

Résultats

89



I- Construction des outils

La réalisation de ce projet a nécessité la génération d’outils biologiques permettant l’étude

pharmacologique de la phosphatase Cdc25C lors de l’activation du point de contrôle en phase G2

du cycle cellulaire tout en étant compatible avec une analyse protéomique de recherche de

modifications post-traductionnelles. Afin d’éviter les problèmes liés à la surexpression de

Cdc25C, nous avons choisi de construire une lignée cellulaire exprimant la phosphatase de façon

conditionnelle.

De nombreux systèmes inductibles permettant une expression régulée du gène d’intérêt dans

les cellules de mammifères ont été développés et la plupart d’entre eux reposent sur l’utilisation

de métaux lourds, d’hormones stéroïdes ou encore de chocs thermiques. Cependant la limite de

tels systèmes provient du fait que ces inducteurs peuvent générer des effets pléiotropiques (chocs

thermiques, glucocorticoïdes…). Ainsi d’autres systèmes d’expression inductible de gènes, qui

reposent sur des systèmes de régulation procaryotes adaptés aux cellules de mammifères, ont été

développés [le système Tet (tétracycline), le système RheoSwitch, le système Q-Mate…]. Parmi

toutes ces techniques, ce sont les systèmes inductibles Tet qui ont été le mieux décrit. Deux

versions ont été développées : le système Tet-on qui permet l’expression du gène d’intérêt en

présence de tétracycline (ou de doxycycline) et le système Tet-off en absence de tétracycline (voir

ci-après). Le système Tet-off est cependant mieux régulé que le système Tet-on, il a en effet été

décrit des fuites d’expression du gène d’intérêt en absence de tétracycline dans ce dernier. C’est

pourquoi nous avons choisi d’utiliser le système d’expression inductible Tet-off pour induire

l’expression de Cdc25C dans les cellules humaines.

D’autre part, pour faciliter la sélection des clones et la purification de Cdc25C, une étiquette

HA (hemagglutinin du virus Influenza A) en N-terminal et une queue poly-Histidine (His) en C-

terminal ont été ajoutés à la séquence de la phosphatase Cdc25C (HA-Cdc25C-His).

Afin de mieux comprendre ces choix, je décrirai tout d’abord les particularités de notre lignée

cellulaire et la stratégie de purification, puis je présenterai la construction, la validation et la

purification de notre modèle proprement dit.

Résultats

90



I-1 : Description de la lignée cellulaire

Les U2OS sont des cellules épithéliales adhérentes issues d’un ostéosarcome humain. La lignée

cellulaire U2OS t-TA dérive de la lignée cellulaire U2OS parentale et permet l’expression

conditionnelle d’une protéine d’intérêt sous le contrôle du système inductible Tet-off (Theis-

Febvre et al., 2003; Triezenberg et al., 1988). Le système Tet off dérive du mécanisme de

régulation chez Escherichia coli de l’opéron résistance à la tétracycline (opéron Tet). Brièvement, chez

la bactérie la protéine Tet répresseur (TetR) régule négativement les gènes de l’opéron Tet sur le

transposon Tn10. Ainsi, en absence de tétracycline, TetR bloque la transcription de ces gènes en

se liant sur les séquences tet opérateur (tetO). Dans le système inductible Tet-off adaptés aux

eucaryotes, la protéine TetR est fusionnée avec le domaine d’activation VP16 (Virion protéine 16)

du virus Herpes simplex (Triezenberg et al., 1988). La protéine hybride qui en résulte, le

transactivateur contrôlé par la tétracycline (t-TA), devient alors “activateur” de transcription.

Cette protéine t-TA est exprimée de manière constitutive dans la lignée cellulaire U2OS-t-TA

(Baldin et al., 2003). Le deuxième élément du système Tet-off repose sur le plasmide “réponse”

(pUHD10) qui exprime un gène d’intérêt sous le contrôle de l’élément de réponse à la tétracycline

(TRE) (figure 25). Le TRE est constitué de sept éléments répétés d’une séquence de 42 paires de

bases contenant le tetO et localisé juste en amont du promoteur minimal du cytomégalovirus

(CMV), auquel il manque l’enhancer fort qui lui est traditionnellement associé. Cette dernière

particularité permet d’empêcher la fuite de l’expression du gène d’intérêt en absence de la liaison

avec TetR. Le principe du système Tet off consiste ensuite à créer une lignée cellulaire stable avec

le plasmide « réponse ». Les cellules exprimeront alors le gène d’intérêt par la liaison de t-TA sur

le TRE en absence de tétracycline dans le milieu de culture (Gossen and Bujard, 1992) (figure 25).

Figure 25 : Le système Tet off

La tétracycline empêche la liaison de t-TA sur le domaine TRE du promoteur PminCMV et bloque la transcription du gène d’intérêt. En absence de tétracycline la protéine de fusion se lie au domaine TRE et permet l’activation de la transcription du gène d’intérêt.

Résultats

91



I-2 : Description de la stratégie de purification

Comme nous l’avons vu au cours de l’introduction générale, la protéomique nécessite des

conditions de purification et de préparation de l’échantillon spécifiques afin de ne pas perturber

l’ionisation des peptides. Notre étude reposant sur la recherche de nouvelles modifications post-

traductionnelles sur la séquence de la phosphatase Cdc25C, il était important de mettre au point

une stratégie de purification de la phosphatase adaptée à la recherche de modifications post-

traductionnelles par spectrométrie de masse. L’enjeu de cette purification est de conserver le

maximum de modifications sur la séquence de Cdc25C tout en respectant les conditions de faible

salinité et de basses forces ioniques requises pour la spectrométrie de masse.

Une stratégie de purification a été mise au point au laboratoire avec succès par le Docteur

Jean-Pierre Bouché pour l’étude par spectrométrie de masse de la phosphatase Cdc25B3

(manuscrit en préparation). Nous avons choisi de l’appliquer à notre modèle. Cette stratégie, en deux

étapes, repose dans un premier temps sur une purification par affinité sur une matrice de nickel-

nitrilotriacétique (Ni-NTA) dans des conditions très dénaturantes. La protéine est retenue par

son étiquette poly-histidine dans un tampon contenant de l’urée à très forte concentration et est

éluée par de l’imidazole. Ensuite, après une brève étape de renaturation (Baynes et al., 2005;

Tsumoto et al., 2004) (Cf. Matériels et méthodes) la protéine, ayant retrouvé sa forme native, est alors

immuno-précipitée sur des billes couplées à un anticorps anti-HA et éluée par du tampon de

charge (Laemmli) puis directement déposée sur un gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide gel electrophresis) (figure 34a).

C’est donc le choix de cette stratégie de purification qui nous a conduit à ajouter les étiquettes

HA et His en N- et C-terminal de la protéine respectivement avant de cloner la phosphatase

Cdc25C dans le plasmide pUHD10.

I-3 : Construction et clonage de la phosphatase Cdc25C

I-3-A : Construction du plasmide pUHD10 ::HA-Cdc25C-His

Cdc25C avait préalablement été clonée dans un plasmide d’expression spécifique des cellules

humaines avec une étiquette HA en position amino-terminale : le plasmide pCDNA3 ::HA-

Résultats

92



Cdc25C. Sur ce plasmide nous avons ajouté une séquence streptomycine-6-histidines (His) par

synthèse d’un oligonucléotide inséré entre les sites de restriction BspI et pflMI en C-terminal de

Cdc25C. L’étiquette streptomycine avait été clonée à l’origine en aval de la séquence de Cdc25B3

afin de réaliser une première étape de purification par affinité avec des billes d’avidine. Cependant

cette étape n’avait pas permis la purification de Cdc25B3 pour des raisons inconnues et la

séquence 6-histidines avait été ajoutée à la suite de l’étiquette streptomycine. Cette construction

s’est révélée efficace. Présumant que la présence de l’étiquette streptomycine en amont de

l’étiquette poly-histidine pouvait jouer un rôle sur la conformation carboxi-terminale de Cdc25B3

et favoriser sa purification sur une matrice Ni-NTA, nous avons choisi d’utiliser la même

construction néanmoins nous ne mentionneront plus l’étiquette streptomycine durant le reste de

cette étude.

Le plasmide nouvellement construit a été nommé pCDN3 ::HA-Cdc25C-His. La suite de cette

construction consistait à cloner Cdc25C étiquetée dans le plasmide pUHD10. Afin d’optimiser la

construction et d’obtenir une bonne expression de Cdc25C, nous avons tout d’abord ajouté une

Figure 26 : Construction de pUHD10 HA-Cdc25C-His

La fraction 1 a été purifiée après une hydrolyse enzymatique du pcDNA3 HA-Cdc25C-His par les enzymes de restriction Not1 et EcoR1. La fraction 2 a été purifiée après une hydrolyse enzymatique du pcDNA3 HA-Cdc25C-His par les enzymes de restriction EcoR1 et Xba1. La cassette HA-Cdc25C-His a été cloné dans le plasmide pUHD10HA entre les sites Not1 et Xba1 par ligation ternaire des fractions 1 et 2.

Résultats

93



séquence consensus de Kozak CCACCATG par mutagenèse dirigée en aval du promoteur

minimal PminCMV du pUHD10. La cassette HA-Cdc25C-His a été sortie du plasmide

pCDNA3 ::HA-Cdc25C-His grâce à deux hydrolyses enzymatiques successives avec les enzymes

de restriction NotI et EcoRI, puis EcoRI et XbaI. Enfin, nous avons cloné la cassette HA-

Cdc25C-His par ligation ternaire entre les sites NotI (présent dans l’étiquette HA) et XbaI (site de

clonage multiple du pUHD10) dans le pUHD10. Ce dernier plasmide a été nommé

pUHD10 ::HA-Cdc25C-His (figure 26). La sélection des clones a été réalisée par hydrolyse

enzymatique puis séquençage. Le plasmide pUHD10 ::HA-Cdc25C-His nouvellement obtenu a

été transfecté de manière stable dans les U2OS-t-TA dans le système Tet off.

La construction de cette lignée cellulaire conditionnelle était une étape clé dans le

développement de ce projet. Il était donc important de s’assurer de la validité de cet outil.

I-3-B : Validation de la construction de HA-Cdc25C-His dans les U2OS

Les cellules U2OS t-TA ont été co-transfectées par le plasmide d’intérêt pUHD10 ::HA-

Cdc25C-His et le pREP ::Hygro en présence de Lipofectin Plus Reagent (Cf. Matériels et méthodes).

Le plasmide pREP ::Hygro confère aux cellules un gène de résistance eucaryote à l’hygromycine

et a été utilisé ici comme pression de sélection. La sélection des clones a été réalisée en présence

de 300µg/ml d’hygromycine, 100µg/ml de G418 (pression de sélection pour la lignée U2OS t-

TA) et 2µg/ml de tétracycline dans le milieu de culture. Vingt-deux clones ont été sélectionnés

par immunofluorescence (IF) et par western blot (WB) avec des anticorps dirigés contre

l’étiquette HA de la protéine après 20h d’induction par retrait de la tétracycline du milieu de

culture. Les trois clones U2OS C4, C9 et C16, présentés figure 27a montrent un exemple des

différents profils d’expression obtenus pour chacun des cas testés. L’analyse par WB anti-HA met

en évidence une bande contaminante classiquement décrite avec l’anticorps anti-HA (Roche) à

65kDa signalée par une étoile. Nous pouvons observer une deuxième bande inférieure

correspondant à la taille attendue de HA-Cdc25C-His (60kDa), la comparaison de ces trois clones

par rapport à la bande contaminante de l’anticorps anti-HA nous indique que le clone C9

n’exprime pas la phosphatase, les clones C4 et C16 expriment correctement la phosphatase HA-

Cdc25C-His, cependant le clone C16 présente le meilleur niveau d’expression de la phosphatase.

Afin de s’assurer de l’homogénéité du clone et de sa stabilité au fur et à mesure des passages, un

sous clonage par dilutions limites du clone U2OS C16 a été réalisé. Les “sous clones” ont été

Résultats

94



sélectionnés de la même manière par immuno-détection à l’aide d’un anticorps anti-HA et le

clone U2OS C16-5 a été retenu pour la suite des travaux. La figure 27b représente une expérience

d’immunofluorescence avec l’anticorps anti-HA sur le clone U2OS C16-5 induit pendant 20h par

retrait de la tétracycline. Nous pouvons observer une répartition de Cdc25C cytoplasmique avec

un marquage plus intense autour de la membrane nucléaire. Les cellules en mitose sont aussi

détectées avec une plus forte intensité dans toute la cellule. HA-Cdc25C-His est donc

correctement exprimé dans les cellules U2OS C16-5 avec la localisation intracellulaire attendue

(Cf. Introduction générale §I-3-B-b).

Dans le but de valider la construction de cette lignée cellulaire dans le système Tet-off, nous

nous sommes assurés dans un premier temps que le système était bien régulé et bloquait toute

expression de la phosphatase en absence d’induction. Le western blot anti-Cdc25C présenté

figure 28 montre qu’en absence de tétracycline dans le milieu de culture c'est-à-dire en présence

d’induction on peut observer une bande présentant un retard de migration par rapport à Cdc25C

endogène qui correspond à la taille attendue de HA-Cdc25C-His. Cette analyse confirme que la

Figure 27 : Validation de la lignée cellulaire

conditionnelle exprimant HA-Cdc25C-His

A. WB anti-HA. 3 clones issus de la transfection stable des cellules U2OS t-TA avec le plasmide pUHD10 HA-Cdc25C-His ont été analysés par WB après 20h d’induction par retrait de la tétracycline. La phosphatase HA-Cdc25C-His est détectée à l’aide d’un anticorps anti-HA (Roche). * correspond à une bande non spécifique de l’anticorps anti-HA. B. IF anti-HA. La phosphatase HA-Cdc25C-His est détectée par marquage avec un anticorps anti-HA dans les cellules U2OS C16-5 après 20h d’induction par retrait de la tétracycline.

Résultats

95



phosphatase HA-Cdc25C-His s’exprime bien à la taille attendue après induction des cellules par

retrait de la tétracycline et qu’il n’y a pas d’expression de HA-Cdc25C-His lorsque les cellules

sont cultivées en absence d’induction (-Tet). Nous avons ensuite cherché à caractériser quel était

le temps d’induction correspondant au meilleur niveau d’expression de la phosphatase. Pour cela

nous avons réalisé des cinétiques d’induction pour l’expression de HA-Cdc25C-His (figure 28a).

Nous pouvons observer que HA-Cdc25C-His est exprimée dans les cellules après le retrait de la

tétracycline dès 16h, son expression est maximale entre 20h et 24h et enfin à partir de 36h, il y a

une diminution de la quantité de HA-Cdc25C-His. L’induction de l’expression de la phosphatase

dans les cellules est donc assez précoce, mais atteint son maximum entre 20h et 24h d’induction.

Enfin pour vérifier que l’expression de Cdc25C ne perturbait pas la progression des cellules

U2OS C16-5 dans le cycle cellulaire, des expériences d’analyses du cycle cellulaire par cytométrie

en flux ont été réalisées (figure 28b). La répartition dans le cycle cellulaire des cellules U2OS C16-5

est identique en présence ou en absence de tétracycline. Ainsi l’expression de HA-Cdc25C-His

n’a pas d’effet sur la progression du cycle cellulaire des cellules U2OS C16-5.

Figure 28 : Caractérisation de la lignée cellulaire conditionnelle exprimant HA-Cdc25C-His

A. WB anti-HA Les cellules U2OS C16-5 ont été cultivées pendant 16h, 20h, 24h et 36h après le retrait de la tétracycline du milieu de culture. La phosphatase HA-Cdc25C-His est détectée avec un anticorps anti-HA. B. WB anti-Cdc25C. Les cellules U2OS C16-5 ont été cultivées pendant 24h en présence ou en absence de tétracycline. La phosphatase Cdc25C est détéctée avec un anticorps anti-Cdc25C et la bande inférieure correspond à Cdc25C endogène et la bande supérieure à HA-Cdc25C-His. C. Analyse du cycle cellulaire des cellules U2OS C16-5 par cytométrie en flux après 24h d’induction.

Résultats

96



I-4 : Activation du point de contrôle en G2/M

Pour la suite de ce projet il était important de mette en place des conditions d’activation

contrôlées du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire. En effet le but premier de ce projet

était l’analyse de la régulation de la phosphatase Cdc25C plus particulièrement lors de l’activation

du point de contrôle G2/M.

Dans ce but nous avons tout d’abord analysé la répartition des cellules U2OS C16-5,

exprimant la phosphatase HA-Cdc25C-His, dans le cycle cellulaire en réponse à différents

traitements génotoxiques afin de mettre au point une stratégie d’activation spécifique de ce point

de contrôle. Pour cela les cellules U2OS ont été traitées avec trois traitements génotoxiques

présentant chacun un mode d’action différent : l’étoposide (inhibiteur de la topo-isomérase II), la

bléomycine (radiomimétique qui créé des cassures doubles brins sur l’ADN) et la gemcitabine

(inhibiteur de la réplication). La répartition des cellules dans le cycle cellulaire a ensuite été analysé

24h après chaque traitement et est présentée figure 29. A la suite du traitement étoposide 81%

des cellules sont en phase G2/M du cycle cellulaire. En revanche après le traitement par la

bléomycine seulement 45% des cellules sont en phase G2/M après un traitement continu de 24h.

Enfin le traitement gemcitabine conduit à une répartition des cellules majoritairement en phase S

du cycle cellulaire (56%). D’après ces résultats seul le traitement étoposide induit une activation

spécifique du point de contrôle G2/M. En effet le traitement gemcitabine induit une

synchronisation des cellules en phases S et dans le cas du traitement bléomycine, le fait qu’il y ait

encore 38% des cellules en phase G1 après 24h de traitement nous permet de conclure que ce

traitement n’induit qu’une activation partielle du point de contrôle en G2 dans ces conditions.

Nous nous sommes ensuite demandés quel était l’effet de l’expression de HA-Cdc25C-His

dans les cellules U2OS C16-5 après l’activation du point de contrôle G2/M par l’étopside.

Les cellules U2OS C16-5 non induites ont été traitées pendant 1h par l’étoposide puis les

cellules ont été relâchées en présence ou en absence de tétracycline pendant 24h et la répartition

des cellules dans le cycle cellulaire a été analysée par cytométrie en flux (figure 30a). Comme le

montre la figure 30b, 81% des cellules non induites sont en phase G2/M du cycle cellulaire 24h

après le traitement et 87% des cellules induites pour l’expression de la phosphatase HA-Cdc25C-

His. Ainsi l’expression de HA-Cdc25C-His dans les cellules U2OS C16-5 n’a pas d’effet sur la

répartition des cellules dans le cycle cellulaire et sur l’activation du point de contrôle G2/M du

cycle cellulaire.

Résultats

97



Figure 29 : Effet des agents génotoxiques

Les cellules ont été traitées 1h 40µM étoposide puis relâchée pendant 24h ou continuellement avec 50mM de gemcitabine et 7,5µM de bléomycine et analysées par cytométrie en flux 24h post-traitement à l’aide d’un marquage des noyaux à l’iodure de propidium (IP).

Figure 30 : Activation du point de contrôle G2/M

Pour activer le point de contrôle G2/M, les cellules ont été traitées 1h avec 40µM étoposide et le cycle cellulaire a été analysé 24h après le traitement par cytométrie en flux à l’aide d’un marquage des noyaux à l’iodure de propidium (IP). L’expression de HA-Cdc25C-His a été induite par élimination de la tétracycline (Tet).

A

B

Résultats

98



Pour aller plus loin, nous avons cherché à vérifier que l’activation spécifique du point de

contrôle G2/M était stable au cours du temps et que la surexpression de Cdc25C n’entrainait pas

une entrée prématurée des cellules en mitose. Pour cela des cellules U2OS C16-5 ont été traitées

par de l’étoposide puis induites pour l’expression de HA-Cdc25C-His et la répartition des cellules

dans le cycle cellulaire a été déterminée par cytométrie en flux suivant différents temps de

relâchement du traitement étoposide. Les résultats présentés figure 31 montrent, 38h post-

traitement, que 79% des cellules sont en phase G2/M du cycle cellulaire et le profil est identique

à celui du contrôle (24h post-traitement). Ainsi dans ces conditions le traitement étoposide

permet d’obtenir une activation spécifique et stable au cours du temps du point de contrôle

G2/M dans les cellules U2OS C16-5 exprimant HA-Cdc25C-His.

Au laboratoire, des expériences antérieures avaient permis de montrer que la phosphatase

Cdc25B, en surexpression dans les cellules U2OS, était capable d’outrepasser le point de contrôle

mis en place en phase G2 suite à un traitement étoposide (Bugler et al., 2006). Au vu de ces

résultats, et bien que Karlsson et ses collaborateurs aient montrés que la surexpression seule de

Cdc25C ne suffit pas à outrepasser le point de contrôle G2/M (Karlsson et al., 1999), nous avons

voulu nous assurer que dans notre modèle la surexpression de la phosphatase Cdc25C

n’entraînait pas une sortie prématurée du point de contrôle G2/M permettant ainsi aux cellules

d’entrer en mitose. Pour cela nous avons réalisé des expériences de piège mitotique dont le

principe consiste après 1h de traitement étoposide à remettre les cellules dans le cycle en présence

de nocoazole (inhibiteur de la polymérisation des microtubules) pendant 24h. Les cellules passant

outre le point de contrôle en G2/M sont alors piégées en mitose et dénombrées par

détermination de l’index mitotique de la population cellulaire (Roberge et al., 1998). La figure 32

représente la détermination de l’index mitotique à l’aide d’un marquage dirigé contre l’histone H3

phosphorylée par cytométrie en flux. Il faut ajouter l’inhibiteur de Chk1 “UCN01” pour observer

une sortie des cellules du point de contrôle G2/M, 24h après le traitement étoposide. Nous

pouvons donc conclure que le protocole d’activation spécifique du point de contrôle G2/M par

l’étoposide que nous avons mis au point sur les cellules U2OS C16-5 est stable au cours du temps

et irréversible sans ajout d’inhibiteurs de Chk1.

Résultats

99



Figure 32 : Effet des agents génotoxiques

Les cellules sont traitées avec 40µM d’etoposide 1h puis 250ng/ml de nocodazole et 100nM d’UCN01. L’index mitotique (M%) a été déterminé par cytométrie en flux avec un marquage anti-Histone H3 phosphorylé associé à un marquage IP de l’ADN.

Figure 31 : activation du point de contrôle G2/M par l’étoposide

Les cellules ont été traitées 1h 40µM etoposide puis relâchées en absence de tétrcycline. La répartition des cellules dans le cycle cellulaire a été analysée par cytométrie en flux 24h ou 38h suivant le traitement.

Résultats

100



I-5 : Les Voies de signalisation en réponse au traitement étoposide

La réponse cellulaire aux agressions externes ou internes à la cellule passe par l’activation

d’une cascade de protéines kinases conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire. En fonction du stress,

de la phase du cycle cellulaire ou même de la lignée cellulaire, la réponse cellulaire aux dommages

induit une “voie de signalisation” spécifique (Cf. Introduction générale). Ainsi nous avons cherché à

déterminer quelles “voies” étaient activées par les cellules U2OS consécutivement au traitement

étoposide. Pour cela des cellules U2OS ont été traitées ou non par de l’étoposide et remises en

culture pendant 24h. Les résultats obtenus sont présentés figure 33. L’anticorps anti-p-Chk1

détecte une forme active de la kinase Chk1 suite au traitement étoposide, ce qui suggère que la

voie ATM/Chk1 des cellules U2OS C16-5 est activée dans ce contexte. De la même manière

l’anticorps anti-p-p42/p-p44 détecte les formes actives des kinases p42MAPK2 et p44MAPK1 dans les

extraits cellulaires ayant subis un traitement étoposide. Ainsi la voie p38/MAPK est elle aussi

impliquée dans la réponse des U2OS à l’étoposide. Il est d’autre part intéressant de noter que

l’ajout d’UCN01 qui a été développé comme un inhibiteur de Chk1, n’a aucun effet sur les

formes phosphorylées “actives” des kinases Chk1 et p42MAPK2 ou p44MAPK1 ce qui n’est pas

surprenant puisque l’UCN01 agit en bloquant le site actif de la kinase.

Figure 33 : Réponse des cellules U2OS C16-5 au traitement étoposide

Des cellules U2OS C16-5 non traitées, traitées 1h avec 40µM d’étoposide ou traitées 1h avec 40µM d’étoposide puis avec 100nM d’UCN01, ont été lysées après 24h. Les extraits cellulaires ont été déposés sur un gel SDS-PAGE et des westerns blot avec les anticorps anti-Cdc25C, anti-Chk1, anti-p-Chk1 (S345), anti-p42/p44 et anti-p-p42/p-p44 ont été réalisés.

Résultats

101



I-6 : Validation de la stratégie de purification de HA-Cdc25C-His

Les cellules U2OS C16-5 en phase exponentielle de croissance ont été cultivées en absence de

tétracycline afin de permettre l’expression de HA-Cdc25C-His. Après 20h d’induction de la

phosphatase, les cellules ont été lysées par lyse osmotique et les extraits cellulaires totaux repris

dans une solution de dénaturation contenant de l’urée 7,5M et de la thiourée 1,5M. Les

échantillons sont ainsi conservés dans des conditions très dénaturantes afin de s’affranchir des

contaminants protéiques qui pourraient agir sur les modifications post-traductionnelles de la

phosphatase avant son analyse par spectrométrie de masse, tels que les phosphatases.

Figure 34 : Stratégie de purification de HA-Cdc25C-His

A. Schéma représentant les différentes étapes de la stratégie de purification. B. WB anti-HA. Extraits cellulaires issus des U2OS C16-5 après 24h d’induction purifiés sur des billes Ni-NTA. L’anticorps anti-HA détecte la phosphatase HA-Cdc25C-His dans les différentes fractions. C. WB anti-HA. La totalité des extraits purifiés après la renaturation arginine, ont été incubés sur la nuit avec des billes couplées à un anticorps anti-HA (Roche). L’anticorps anti-HA détecte la phosphatase HA-Cdc25C-His dans les différentes fractions. (ET : extraits totaux, NL : non lié aux billes, L : fractions de lavages)

Résultats

102



Les extraits préparés ont été incubés avec des billes de Nickel-NTA, préalablement équilibrées

avec la solution de dénaturation contenant 5mM d’imidazole. La phosphatase HA-Cdc25C-His

est retenue par affinité entre sa queue poly-histidine et les billes de Nickel (figure 34a). Après

plusieurs lavages avec la solution de dénaturation contenant 5 mM d’imidazole, la phosphatase a

été éluée par une solution de dénaturation contenant 300mM d’imidazole. Le western blot avec

l’anticorps anti-HA présenté figure 34b montre un contrôle des différentes étapes de la

purification. On peut ainsi observer qu’en présence de 5mM imidazole la phosphatase est bien

liée aux billes et que celle-ci est correctement éluée en présence de 300mM imidazole. Les

fractions d’élutions ont été rassemblées et après concentration de l’échantillon par précipitation

acétone, la solution contenant HA-Cdc25C-His a été rapidement diluée dans une solution de

renaturation contenant 0,3M KCl et 0,5M arginine (Baynes et al., 2005) puis incubée en présence

des billes couplées aux anticorps anti-HA préalablement équilibrées avec la solution de

renaturation (figure 34a). Après trois lavages successifs avec la solution de renaturation, HA-

Cdc25C-His a été éluée dans le tampon de charge Laemmli chauffé à 95°C et déposé sur un gel

SDS-PAGE. La figure 34-C montre un WB anti-HA représentant les différentes étapes de la

purification de HA-Cdc25C-His sur les billes anti-HA. La phosphatase est bien retenue sur les

billes anti-HA et est éluée correctement avec le tampon de charge.

I-6 : Conclusion

Au cours de cette première partie de mes travaux de thèse, nous avons donc mis au point des

outils nécessaires à l’étude des modifications post-traductionnelles présentes sur la phosphatase

Cdc25C lors de l’activation du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire.

- Pour cela nous avons construit une lignée cellulaire conditionnelle : la lignée U2OS C16-5

qui exprime Cdc25C étiquetée afin de faciliter sa purification.

- Nous avons validé la construction de cette lignée cellulaire : Cdc25C est correctement

exprimée dans les cellules U2OS C16-5, avec la localisation intracellulaire attendue

(majoritairement cytoplasmique) et un cycle cellulaire qui n’est pas perturbé par

l’expression de la phosphatase.

- Puis nous avons mis au point un protocole d’activation spécifique du point de contrôle

G2/M du cycle cellulaire. Nous sommes en effet en mesure d’activer le point de contrôle

G2/M de manière stable en présence de l’expression de HA-Cdc25C-His dans notre

Résultats

103



modèle cellulaire par l’intermédiaire de l’activation des protéines kinases Chk1 et P42MAPK2

et P44MAPK1.

Enfin nous avons mis au point et validé une stratégie de purification spécifique de HA-

Cdc25C-His qui est adaptée a une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

Nous allons maintenant pouvoir réaliser l’analyse proprement dite des modifications post-

traductionnelles jouant un rôle dans sa régulation lors de l’activation ou non du point de contrôle

G2/M du cycle cellulaire.

Résultats

104



Résultats

105



II- Analyse protéomique

L’analyse protéomique a été réalisée dans le but de rechercher les modifications post-

traductionnelles présentes sur la phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M.

Nous avons ainsi cherché à identifier de nouvelles MPT mais aussi à caractériser des

modifications différentielles impliquées dans la régulation de la phosphatase plus particulièrement

lors de l’activation du point de contrôle G2/M.

Pour cela nous avons réalisé une analyse par spectrométrie de masse de recherche globale de

modifications post-traductionnelles sur la séquence de Cdc25C. En parallèle de ces travaux, nous

avons débuté la mise au point d’une analyse de séparation bidimensionnelle des isoformes

modifiés de la phosphatase dans le but d’accéder à une cartographie des différents isoformes de

la phosphatase Cdc25C en réponse aux stress.

II-1 : Spectrométrie de masse et recherche de MPT

Pour identifier de nouvelles modifications post-traductionnelles sur la séquence de la

phosphatase Cdc25C impliquées dans la régulation du point de contrôle G2/M, nous avons

réalisé des analyses de spectrométrie de masse ESI-MS/MS en couplage HPLC après digestion

trypsique de la phosphatase purifiée. Pour cela, des purifications à grande échelle de HA-

Cdc25C-His ont été réalisées dans trois conditions différentes : tout d’abord à partir d’une

population de cellules asynchrones qui nous servira de témoin, d’une population de cellules dont

le point de contrôle G2/M a été activé par l’étoposide (Cf. ci-dessus) et enfin d’une population de

cellules synchronisées en mitose par un poison des microtubules. La phosphatase purifiée a

ensuite été soumise à une protéolyse par la trypsine et le mélange peptidique obtenu a été analysé

par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour une recherche globale des

modifications post-traductionnelles présentes sur la phosphatase HA-Cdc25C-His dans chacune

des conditions testées.

Résultats

106



II-1-A : préparation des échantillons

Les purifications de HA-Cdc25C-His ont été réalisées à partir de 160 millions de cellules

U2OS-C16-5 en phase exponentielle de croissance, induites pendant 24h pour l’expression de la

phosphatase et subissant différentes conditions de traitement : (a) des cellules asynchrones non

traitées, (b) des cellules traitées étoposide 40µM par un pulse d’une heure et “relâchées” pendant

24h et (c) des cellules traitées par du nocodazole 250ng/ml pendant 24h (figure 35a). Les cellules

ont été lysées par choc osmotique et les purifications ont été réalisées suivant le protocole

précédemment décrit (Cf. § Résultats-I-2 et Matériel et méthodes). La totalité des échantillons élués a

été déposée sur gels SDS-PAGE et colorée au bleu de Coomassie colloïdal dans des conditions

adaptées à une analyse protéomique par spectrométrie de masse (blouse propre, port de gants et

masques, matériels à usage spécifiques…) afin de s’affranchir d’éventuels contaminants

protéiques tels que les kératines (figure 35b).

Figure 35 : Purification de HA-Cdc25C-His

A. Schéma du protocole expérimental. (a), (b) et (c) Les cellules U2OS C16-5 ont été induites pour l’expression de HA-Cdc25C-His par retrait de la tétracycline pendant 24h. (b) traitement pulsé d’1h avec 40µM étoposide. (c) traitement continu des cellules avec 250ng/ml de nocodazole. B. Gel SDS-PAGE. Dépôt de la totalité des échantillons purifiés sur un gel SDS-PAGE et détection au bleu de Coomassie colloïdal. Les bandes correspondantes à HA-Cdc25cC-His sont ensuites découpées du gel pour être soumises a une protéolyse in-gel par la trypsine.

Résultats

107



La bande correspondant à la phosphatase HA-Cdc25C-His est représentée par une flèche

noire (figure 35). Nous pouvons remarquer qu’il reste de nombreux contaminants présents sur les

gels probablement dû aux faibles rendements de purification obtenus (le niveau d’expression de

HA-Cdc25C-His dans les U2OS C16-5 est peu supérieur à celui de la phosphatase endogène ce

qui explique notre difficulté à la purifier). De plus pour détecter le faible niveau de HA-Cdc25C-

His purifié, nous avons réalisé une coloration au bleu de Coomassie colloïdal très poussée (4

jours de coloration). Cette technique longue de coloration a également contribué à la détection de

bandes minoritaires non-spécifiques encore présentes sur le gel malgré les différentes étapes de

purification. Cependant la présence de contaminants protéiques sur le gel ne devrait pas perturber

l’analyse protéomique puisque d’une part le mode ESI-MS/MS permet l’analyse de mélanges de

protéines et d’autre part nous allons découper la bande spécifique correspondant à Cdc25C. En

revanche la recherche de PTM à partir des formes modifiées de Cdc25C pouvant présenter un

retard de migration sur le gel est rendu plus complexe. En effet ces bandes de plus haut poids

moléculaires sont en général plus faibles et sortiront avec des bandes non-spécifiques de la

purification qui s’ajouteront aux phénomènes de suppression dû à la présence des peptides non

modifiés. Ainsi les bandes observées pour les échantillons “non traité” et “étoposide” étaient

suffisantes pour réaliser une recherche de modifications par spectrométrie de masse, au contraire

de celle de l’échantillon “nocodazole” qui présente un rendement de purification beaucoup plus

faible (il est difficile de détecter la bande correspondante à la phosphatase HA-Cdc25C-His sur le

gel) (figure 35).

Les bandes correspondant à la taille attendue de HA-Cdc25C-His pour les trois analyses ont

été découpées du gel SDS-PAGE et après lavages, ont été réduites et alkylées avant d’être

soumises à une protéolyse en gel par la trypsine (Cf. Matériels et méthodes). Enfin les peptides ainsi

obtenus ont été extraits du gel et soumis à une analyse par spectrométrie de masse en tandem

pour la recherche de modifications post-traductionnelles.

II-1-B : Recherche des modifications par spectrométrie de masse

Les produits issus de la protéolyse trypsique ont été analysés par couplage nanoLC-MS/MS

sur un spectromètre de masse hybride : Q-TOF (QSTAR, Applied Biosystems). Les mélanges

peptidiques ont tout d’abord été séparés sur une colonne hydrophobe C18 selon un gradient de 0

à 50% de solvant B pendant 100 minutes (le solvant A est constitué de 0,2% d’acide formique

Résultats

108



dans 5% d’acetonitrile et le solvant B de 0,2% d’acide formique dans 90% d’acetonitrile).

L’utilisation d’un gradient long au cours de la chromatographie a été réalisé dans le but de séparer

un maximum de peptides et ainsi d’obtenir un plus grand nombre de spectres MS/MS qui

augmenteront le recouvrement de séquence final. Les peptides ont ensuite été identifiés et

caractérisés en couplage LC-ESI-MS/MS. Les données MS et MS/MS ont été acquises

continuellement en mode IDA (Information-Dependant Acquisition) avec des cycles de 10 secondes.

Chaque cycle correspond à l’acquisition pendant 1 seconde d’un spectre MS, suivi de trois

MS/MS successives réalisées sur les trois pics les plus intenses du spectre MS. D’autre part, une

exclusion dynamique d’une durée de 60 secondes a été utilisée pour prévenir la sélection répétée

d’un même ion, (cela correspond a la durée d’élution d’un peptide au cours de la

chromatographie). La mise au point de ces conditions d’analyse avait préalablement été réalisée

pour l’étude des phosphorylations présentes sur la phosphatase Cdc25B (Jean-Pierre Bouché,

manuscrit en préparation). Ces conditions favorisent la sélection d’un plus grand nombre de peptides

pour lesquels seront générés des spectres MS/MS et permettent ainsi l’augmentation du taux de

couverture de séquence.

Les données obtenues ont été soumises au logiciel d’analyse MASCOT pour l’identification et

la caractérisation des modifications présentes sur ces peptides en comparant les spectres MS/MS

expérimentaux avec la banque de données Swiss-Prot à laquelle a été incrémentée la séquence de

la phosphatase HA-Cdc25C-His. Comme nous cherchions plus spécifiquement des modifications

post-traductionnelles, les recherches ont été réalisées en ajoutant de nouvelles contraintes dans

l’algorithme de recherche MASCOT prenant en compte la présence de phosphorylations sur les

résidus S, T et Y et de méthylations, di-méthylations et tri-méthylations sur les résidus R et K. Les

résultats obtenus sont représentés figure 36. Pour l’échantillon “non traités” 62% de la séquence

de la phosphatase a été recouverte par l’analyse, ce qui correspond à la couverture de 69% des

résidus sérines et thréonines susceptibles d’être phosphorylés. La séquence de la phosphatase

pour l’échantillon “étoposide” a été recouverte à 66% ce qui correspond ici aussi à la couverture

de 69% des résidus S/T. L’échantillon “nocodazole”, quant à lui, nous a permis d’obtenir 32% de

couverture de séquence de la phosphatase correspondant à seulement 11% du taux de S/T total.

Ainsi l’analyse par spectrométrie de masse des échantillons “non traité” et “étoposide” a conduit

à l’obtention des informations de séquence correspondant aux deux-tiers de la phosphatase HA-

Cdc25C-His grâce à la génération de spectres MS/MS.

L’hydrolyse enzymatique théorique de Cdc25C par la trypsine (PeptideCutter) indique que

89% de la séquence sera couverte par une analyse de spectrométrie de masse, les 11% restant

Résultats

109



étant trop petits pour être analysés. Ainsi l’obtention du taux de 66% de recouvrement de

séquence pour cette analyse est globalement satisfaisante. Cependant il restera toujours des

domaines de la séquence de la phosphatase non couverts par l’analyse MS/MS du à la génération

de peptides de trop petites ou de trop grandes tailles suite à la protéolyse par la trypsine ou

encore au phénomène de suppression (Cf.Introduction générale). D’autre part, le faible taux de

couverture de séquence obtenu pour l’échantillon “nocodazole” n’est pas surprenant au regard

du faible rendement de purification observé sur le gel. C’est pourquoi nous n’avons pas été

étonnés de ne mettre en évidence aucune modification post-traductionnelle pour cette condition.

En effet l’identification de la phosphatase reposait sur des peptides déjà peu intenses au niveau de

la cartographie peptidique massique et l’intensité relative des ions correspondant aux peptides

phosphorylés sont souvent moins intenses d’une part par leur difficulté à être ionisés, dû à la

présence de la charge négative, et d’autre part parce qu’ils sont souvent les représentants de

formes minoritaires de la protéine.

Chaque spectre MS/MS présentant des phosphorylations ou d’autres modifications post-

traductionnelles a été vérifié manuellement. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3

et les spectres MS/MS correspondants sont en Annexes.

Nous avons tout d’abord mis en évidence des phosphorylations déjà connues :

- Le peptide 214-SPSMPENLNRPR-225 non phosphorylé a été identifié dans les trois

analyses et nous avons pu mettre en évidence la présence d’une phosphorylation sur la

S216 de la phosphatase HA-Cdc25C-His dans les échantillons “non traité” ainsi qu’après

activation du point de contrôle G2/M par le traitement étoposide.

- Le peptide 165-YLGSPITTVPK-175 non phosphorylé a été identifié dans les trois

analyses. Mais il est intéressant de noter que seule l’analyse de l’échantillon “étoposide” met

en évidence la présence d’une phosphorylation sur la S168 (voir ci-après).

Résultats

110



Séquence peptidique Modifications Non traité

Etoposide Nocodazole

28-MLNLLLERme-35 méthylation R35 x

165-YLGSpPITTVPK-175 phospho S168 x

214-SPSpMPENLNRPR-225 phospho S216 x x

261-TVSpLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 phospho S263 x x

261-TVSLCDITpITpQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 phospho T268 ou T270

x

Tableau 3: Modifications mises en évidence par l’analyse LC-MS/MS

Figure 36 : Résultats MASCOT de l’analyse LC-MS/MS

Les spectres MS/MS ont été acquis sur un QSTAR (Applied Biosystems) avec le logiciel d’acquisition Analyst Les données MS/MS ont été soumises au logiciel d’analyse MASCOT en prenant en compte la présence de phosphorylations sur les résidus S, T et Y et de méthylations, di-methylations et tri-méthylations sur les résidus R et K. A, B et C représentent le taux de couverture de séquence obtenu pour chaque échantillon. Les peptides identifiés et séquencés sont représentés en rouge.

Résultats

111



Nous avons d’autre part mis en évidence la présence de nouvelles modifications post-

traductionnelles sur la séquence de la phosphatase :

- Le peptide 261-TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 non phosphorylé a été

identifié dans les analyses des échantillons “non traité” et “étoposide”. Les analyses

manuelles des spectres MS/MS nous ont permis de mettre en évidence deux ions

parentaux tri-chargés mono-phosphorylés présentant des temps de rétention

chromatographique différents. Le premier ion, correspondant à la fraction

chromatographique éluée à 78,6 min, n’a été retrouvé que dans l’analyse de l’échantillon

“non traité” et l’analyse du spectre MS/MS ne nous permet pas de conclure sur la position

de la phosphorylation entre les résidus T268 ou T270 (Cf. annexe 2). Le deuxième ion,

correspondant à la fraction chromatographique éluée à 83,6 min de l’échantillon non

traité, a été identifié dans les deux échantillons “non traité” et “étoposide” et confirme la

présence d’une phosphorylation sur la séquence de la phosphatase HA-Cdc25C-His à la

position S263 (voir ci-après).

- Le peptide 28-MLNLLLER-35 non modifié a été identifié dans les trois analyses et seule

l’analyse de l’échantillon “non traité” nous permet de mettre en évidence une méthylation

sur le résidu R35 (Cf. annexe 1).

La découverte d’une méthylation sur la séquence de la phosphatase HA-Cdc25C-His comme

modification “non permanente” (nous retrouvons au cours de la même analyse le peptide ne

portant pas cette modification) est une perspective très excitante pour la compréhension des

mécanismes de régulation de la phosphatase au cours du cycle cellulaire. En effet jusqu’à présent

toute les données bibliographiques ne faisaient référence qu’à des mécanismes de

phosphorylations/déphosphorylations de la phosphatase et donc à une régulation de cette

dernière par un jeu interactif entre les kinases et les phosphatases. La présence de cette

méthylation semble suggérer qu’il existe d’autres mécanismes de régulation à l’image de celui

maintenant bien connu du “code des histones” (Hake et al., 2004). Cependant l’étude des

méthylations nécessite des outils ainsi qu’une expertise que nous ne possédions pas au

laboratoire, nous avons donc fait le choix d’aborder ultérieurement l’étude de cette modification

pour nous focaliser sur l’étude des phosphorylations sur les S263 et S168.

La figure 37 représente le spectre MS/MS du peptide mono-phosphorylé 165-

YLGSPITTVPK-175. Les ions fragments observés confirment la séquence du peptide et la

présence d’un groupement phosphate localisé sur le résidu S168. La série des ions y jusqu’à l’ion

Résultats

112



fragment y7 (m/z 779,4) indiquent que les T170 et T171 ne sont pas phosphorylées. De plus la

présence de l’ion fragment b2 (m/z 201,1) révèle que le résidu Y165 n’est pas, lui non plus,

phosphorylé, ce qui nous a permis de conclure que la phosphorylation était bien localisée sur le

résidu S168. Le fait d’avoir retrouvé le peptide correspondant à la S168 phosphorylée seulement

dans l’analyse de l’échantillon traité par l’étoposide nous porte à croire que cette sérine semble

être impliquée dans la réponse aux stress et dans l’activation du point de contrôle G2/M. Cette

hypothèse est renforcée par les travaux de Valérie Goss et collaborateurs qui ont montré une

inhibition de l’activité phosphatase de Cdc25C après la phosphorylation sur la S168 en réponse

aux UV (Goss et al., 2003). D’autre part, la séquence de la phosphatase Cdc25C 168-SPITTVP-

174 présente une forte homologie avec la séquence 364-SPITTSP-370 de la phosphatase MKP1

(MapKinase Phosphatase 1). La phosphorylation sur la S364 de MKP1 par les kinases p42 et p44 est

impliquée dans la stabilité de cette dernière (Brondello et al., 1999). Ceci nous amène à penser

que la phosphorylation sur la S168 de la phosphatase Cdc25C pourrait être impliquée dans un

mécanisme de régulation similaire.

Figure 37 : Identification de la phosphorylation sur la

S168

Spectre MS/MS du peptide mono-phosphorylé 165-YLGSPITTVPK-175 [Ion parental doublement chargé, (MH2)2+ à m/z 628,3]. Les séries d’ions y et b (en accord avec la nomenclature de Biemann (Biemann, 1990a) indiquent que la S168 est phosphorylée. * correspond à la perte de H3PO4.

Résultats

113



De la même manière la figure 38 représente le spectre MS/MS du peptide mono-phosphorylé

261-TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288. Les ions fragments observés confirment

la séquence du peptide ainsi que la présence d’un groupement phosphate sur la S263. En effet la

série des ions y et l’ion fragment b2 (m/z 201,13) montre que les résidus S277, S287 et T261 ne

portent pas de groupement phosphate. D’autre part, l’ion fragment b3 (m/z 368,12) confirme la

présence du groupement phosphate sur la S263. La phosphorylation sur la S263, quant à elle, est

une nouvelle phosphorylation qui n’a jamais été décrite dans la littérature. Cependant l’alignement

de séquence entre les phosphatases Cdc25C et Cdc25B montre que la S263 est localisée dans un

groupement d’acides-aminés conservés et le résidu équivalent chez Cdc25B correspond à la S375.

Il est intéressant de noter que les travaux du laboratoire ont montré que la S375 de Cdc25B est

phosphorylée dans les cellules en phase exponentielle de croissance (Bouché JP., en préparation) et

que c’est un site putatif de phosphorylation par les kinases Chk1, pEg3, Aurora A et PkB-Akt

(Baldin et al., 2003; Schmitt et al., 2006). Ces observations suggèrent qu’au moins une de ces

kinases pourrait aussi être impliquée dans la phosphorylation de Cdc25C sur la S263 (Voir § IV-

2).

Figure 38 : Identification de la phosphorylation sur la

S263

Spectre MS/MS du peptide mono-phophorylé 261-TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 [Ion parental triplement chargé, (MH3)3+ à m/z 1077,9]. Les séries d’ions y et b mettent en évidence que la S263 est phosphorylée. * correspond à la perte de H3PO4.

Résultats

114



II-2 : Séparation par gels bidimensionnels

L’autre volet de l’analyse protéomique sur l’étude des modifications de la phosphatase HA-

Cdc25C-His reposait sur la réalisation d’une analyse de protéomique différentielle. Le but premier

de cette analyse était de mettre en évidence des régulations positives ou négatives, dépendantes

des conditions de traitement, sur les différents isoformes de Cdc25C, à l’aide d’une cartographie

des isoformes de la phosphatase par séparation sur une électrophorèse bidimensionnelle. Ainsi le

ou les isoformes caractérisés auraient été soumis à une analyse par spectrométrie de masse dans le

but de rechercher les modifications post-traductionnelles à l’origine de ce changement de profil.

Cependant cette technique nécessite de déposer sur le gel bidimensionnel une très grande

quantité de Cdc25C purifiée, de manière à pouvoir réaliser une analyse par spectrométrie de

masse, de recherche de modifications post-traductionnelles à partir du spot découpé sur le gel.

Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, il a été difficile d’obtenir un bon

recouvrement de séquence et de réaliser une recherche globale satisfaisante des modifications

post-traductionnelles de la phosphatase à partir d’une bande correspondant à la totalité de la

quantité de Cdc25C déposé sur le gel. Ainsi il nous a paru impossible de réaliser une recherche de

PTM par LC-MS/MS sur un spot correspondant à une fraction de la quantité totale de Cdc25C

dans ces conditions.

Il a donc ensuite été décidé de réaliser simplement des cartographies des isoformes de Cdc25C

purifiée par gels bidimensionnels. La comparaison de ces cartographies, obtenues à partir

d’échantillons ayant subit préalablement différents traitements par des drogues activant le point

de contrôle G2/M, livrerait des informations sur l’abondance relative des isoformes modifiés de

Cdc25C en fonction des conditions de traitement.

II-2-A : Cartographie par électrophorèse en gel bidimensionnel

Cette analyse cartographique se voulait donc complémentaire de la spectrométrie de masse et

avait pour principal objectif la mise au point d’un modèle quantitatif d’analyse des différentes

formes phosphorylées de Cdc25C en fonction de sa régulation. Pour cela il nous a tout d’abord

fallu mettre en place un protocole reproductible de séparation des isoformes de la phosphatase

par électrophorèse bidimensionnelle. La technique d’électrophorèse en gel bidimensionnel

nécessite des conditions de préparation de l’échantillon compatibles avec la première dimension :

Résultats

115



la séparation IEF. Les conditions d’extraction de la phosphatase HA-Cdc25C-His et de la

purification par affinité sur de billes de Nickel en présence d’urée et de thiourée étant très

proches des conditions standard de la séparation IEF des protéines, nous avons choisi d’enrichir

notre échantillon avec HA-Cdc25C-His en réalisant la première étape de la purification mise au

point pour l’analyse par spectrométrie de masse de HA-Cdc25C-His. Pour cela, les cellules U2OS

C16-5 ont été induites par retrait de la tétracycline pendant 24h puis lysées selon le protocole de

purification précédemment décrit et enfin purificatiés sur les billes de Nickel (Cf. § résultats I-2) les

échantillons ont été déposés sur un gel de première dimension IEF avec un gradient de pH 3 à 10

et la tension a été appliquée suivant une progression par palier (Cf. Matériels et méthodes). Le gel

d’IEF a ensuite été déposé sur un gel SDS-PAGE pour la deuxième dimension et les échantillons

ont été détectés à l’aide d’un western blot avec un anticorps anti-Cdc25C (figure 39). Nous

pouvons observer sur le gel plusieurs spots correspondant à la phosphatase HA-Cdc25C-His et à

la phosphatase Cdc25C endogène (par rapport à la bande contrôle de migration pour la deuxième

dimension).

Ces premiers résultats étaient encourageants car ils mettaient en évidence la séparation de

certains isoformes de Cdc25C. Nous pouvons ainsi remarquer sur ce gel bidimensionnel que

certains spots sont séparés uniquement selon leurs points isoélectriques et non pas selon leur

masse moléculaire, ce qui nous permet de penser que ces profils correspondent à différentes

Figure 39 : Séparation sur gels bidimensionnels

WB anti-Cdc25C. 100µg d’extrait cellulaire U2OS C16-5 induits pendant 24h, ont été déposés sur une strip 3-10 (Amersham). La strip a été déposée en sarcophage sur un IPGphore (Amersham) pour la première dimension puis déposée sur un gel SDS-PAGE 12% pour la deuxième dimension avec une piste contrôle contenant 20µg d’extraits totaux (à gauche). Après transfert, la membrane a été incubée avec un anticorps anti-Cdc25C (TC15) détectant les spots correspondant à Cdc25C endogène et HA-Cdc25C-His.

Résultats

116



formes phosphorylées de la phosphatase. Bien qu’il soit difficile d’imaginer que ces spots

correspondent à la totalité des formes modifiées de la phosphatase, nous avons cependant obtenu

dans ce contexte un profil cartographique d’au moins une partie des isoformes de Cdc25C.

II-2-B : Effet de l’étoposide sur la cartographie des isoformes de Cdc25C par gels

bidimensionnels

Nous avons ensuite cherché à déterminer si l’activation du point de contrôle G2/M

consécutive au traitement étoposide conduisait à un phénotype remarquable sur le profil

cartographique des isoformes de Cdc25C par électrophorèse bidimensionnelles. Pour cela des

cellules U2OS C16-5 ont été induites et traitées ou non par de l’étoposide dans les conditions

nécessaires à l’activation du point de contrôle G2/M, puis les extraits cellulaires ont été analysés

par électrophorèse sur gel bidimensionnel et Cdc25C a été révélée par western blot avec

l’anticorps anti-Cdc25C. Cependant, bien que cette expérience ait été réalisée plusieurs fois, nous

n’avons pas réussi à reproduire les résultats obtenus précédemment. En effet la figure 40a

représente la séparation des isoformes de Cdc25C à partir de l’échantillon contrôle non traité, et

nous pouvons observer une baisse de la résolution et de la sensibilité avec seulement trois spots

correspondant à HA-Cdc25C-His (indiqué par le cadre rouge) et un profil continu non résolu

pour Cdc25C endogène. De la même manière, les résultats obtenus à partir de l’échantillon traité

par l’étoposide sont très peu résolus et montrent ici aussi un problème de sensibilité (Figure 40b).

Néanmoins la comparaison des profils de chacun de ces gels bidimensionnels permet de mettre

en évidence une différence de profil de migration des isoformes de HA-Cdc25C-His entre

l’échantillon non traité et l’échantillon traité par l’étoposide. Mais le manque de sensibilité, la

faible résolution ainsi que le manque de reproductibilité d’une expérience à l’autre ne nous

permet pas de conclure quant à la différence de profil observé entre les deux gels.

Résultats

117



II-3 : Conclusion

En conclusion, la recherche de modifications post-traductionnelles de Cdc25C par

spectrométrie de masse nous a permis de mettre en évidence deux nouvelles modifications une

méthylation sur l’arginine 35 et une phosphorylation sur la sérine 263. De plus lors d’une

activation du point de contrôle G2/M consécutive à un traitement étoposide, nous avons montré

la présence d’une phosphorylation sur la sérine 216 comme le décrit la littérature ainsi qu’une

phosphorylation sur la sérine 168.

D’autre part, l’analyse cartographique des isoformes de Cdc25C par gels bidimensionnels était

un challenge qui aurait pu nous apporter des informations complémentaires de la spectrométrie

Figure 40 : Séparation sur gels bidimensionnels

WB anti-Cdc25C. 100µg d’extrait cellulaire U2OS C16-5, traités ou non par un pulse d’étoposide 1h et induits pendant 24h, ont été déposés sur des strips 3-10 (Amersham). Les strips ont été déposées en sarcophage sur un IPGphore (Amersham) pour la première dimension puis déposée sur un gel SDS-PAGE 12% pour la deuxième dimension. Après transfert, la membrane a été incubé avec un anticorps anti-Cdc25C (TC15) détectant les spots correspondant à Cdc25C endogène et HA-Cdc25C-His. A. Echantillon non traité. B. Echantillon traité avec 40µM d’étoposide pendant 1H puis « relaché » 24h Les encadrés rouges indiquent l’emplacement sur les gels des isoformes de HA-Cdc25C-His.

Résultats

118



de masse. Cependant la qualité du signal obtenu en western blot dans les conditions que nous

avons testées n’était malheureusement pas suffisante pour que nous puissions obtenir des

informations supplémentaires par rapport aux données de spectrométrie de masse.

Nous avons donc poursuivi notre projet avec l’analyse fonctionnelle des phosphorylations

présentes sur les sérines 168 et 263 de Cdc25C.

Résultats

119



III- Analyse fonctionnelle des phosphorylations S168p et S263p

Les phosphorylations du domaine amino-terminal des phosphatases Cdc25 sont des

évènements majeurs de régulation de ces dernières. Nous avons vu au cours de l’introduction

générale que ces évènements interviennent à plusieurs niveaux : soit sur la stabilité des Cdc25,

soit sur leur activité ou encore sur leurs localisations et font intervenir de nombreuses protéines

kinases. Il parait donc essentiel pour comprendre les phénomènes de régulation de connaître le

rôle exact de chaque phosphorylation intervenant sur les phosphatases.

La phosphorylation sur la sérine 263 n’avait encore jamais été décrite. Ainsi, suite à la

découverte de ce nouvel évènement de phosphorylation, de nombreuses questions ont été

posées : quel est son rôle ? Mais aussi quelles sont les voies de régulation qui sont impliquées

dans la phosphorylation de ce résidu et quels acteurs font-elles intervenir ?

D’autre part, bien que la phosphorylation de la sérine 168 ait déjà été décrite dans la littérature,

les mécanismes intervenant dans cet évènement de phosphorylation sont mal connus. En effet,

au moins deux kinases ont été identifiées comme phosphorylant le résidu sérine 168 de Cdc25C

en réponse à deux mécanismes de régulation différents : CDK1-Cycline B active Cdc25C lors de

la boucle d’auto-amplification et SAPKJNK inhibe l’activité de la phosphatase en réponse au stress

(Goss et al., 2003). Ainsi nous avons donc cherché à mieux comprendre quels mécanismes

étaient impliqués dans la phosphorylation de la sérine 168 et quels étaient leurs rôles.

Afin de répondre à ces questions nous avons donc choisi deux approches qui pourront nous

apporter des informations complémentaires : l’analyse des mutants de Cdc25C sur ces sites de

phosphorylation et le développement d’anticorps spécifiques de ces sites de phosphorylation.

III-1 : Le développement des outils

III-1-A : Construction des mutants

La construction de mutants non-phosphorylables ou phospho-mimétiques est classiquement

utilisée pour l’étude des phosphorylations. L’utilisation des mutants permet de mettre en évidence

Résultats

120



le rôle de la phosphorylation sur la régulation des protéines grâce à l’apparition de phénotypes de

perte ou de gain de fonction par rapport à la protéine sauvage. De plus, l’utilisation des mutants

peut aussi fournir des informations sur les protéines kinases régulatrices impliquées dans la

phosphorylation des ces résidus à travers la réalisation d’essais kinases in vitro.

Ainsi dans le cadre de l’analyse fonctionnelle des phosphorylations sur les sérines 168 et 263

de Cdc25C, des mutants non-phosphorylables par mutations des sérines 168 et 263 en alanine

(S168A et S263A) et des mutants mimant la phosphorylation, “phospho-mimétique”, par

mutation des sérines 168 et 263 en aspartate (S168D et S263D) ou en glutamate (S168E et S263E)

ont été générés. Chacune de ces mutations a été réalisée dans le plasmide pUHD10 ::HA-

Cdc25C-His (Cf. Matériel et méthodes). Et les plasmides ont été transféctés transitoirement dans la

lignée cellulaire U2OS t-TA en absence de tétracycline, afin de permettre l’expression de ces

mutants.

III-1-B : Génération d’anticorps phospho-spécifiques

L’autre approche que nous avons développée pour l’étude fonctionnelle de ces

phosphorylations, était la réalisation d’anticorps dirigés spécifiquement contre la sérine 168

phosphorylée (S168p) et la sérine 263 phosphorylée (S263p) de la phosphatase Cdc25C.

L’utilisation d’anticorps phospho-spécifiques permet de caractériser in vitro ou in vivo les protéines

kinases impliquées dans ces mécanismes de phosphorylations, d’obtenir des informations sur la

localisation spécifique de la forme phosphorylée de la protéine et aussi, par leur utilisation en

western blot, d’obtenir des informations mécanistiques en réponse aux drogues ou lors de

l’activation de certaines voies par exemple.

Des lapins ont donc été immunisés avec des peptides de synthèse présentant la S168p et la

S263p afin de générer des anticorps anti-phospho-spécifiques dirigés contre chacun de ces sites

de phosphorylation. Pour chaque anticorps, deux lapins ont été immunisés et le sérum des lapins

a été purifié par affinité, tout d’abord sur une colonne présentant le peptide phosphorylé afin de

retenir spécifiquement les anticorps reconnaissant ce peptide, puis l’éluat a été redéposé sur une

deuxième colonne présentant le peptide non phosphorylé et les anticorps non liés ont été retenus.

Cette stratégie permet ainsi de s’affranchir d’une partie des anticorps dirigés contre le peptide,

mais non spécifiques de la forme phosphorylée. Dans le but de s’assurer de la spécificité des

anticorps ainsi obtenus, nous avons réalisé des expériences de western blot sur des extraits

Résultats

121



cellulaires U2OS C16-5. La figure 41 montre les résultats obtenus avec les anticorps générés

spécifiquement contre la sérine 168 phosphorylée. Les anticorps purifiés à partir du premier lapin

permettent la détection d’une bande qui migre au même niveau que celui de HA-Cdc25C-His

(voir contrôle), cependant cette bande est aussi détectée dans les extraits cellulaires non induits ce

qui confirme la non spécificité de cet anticorps. De plus mes anticorps purifiés à partir du

deuxième lapin sont très peu sensibles et ne permettent aucune détection sur le gel (figure 41).

Ainsi l’immunisation des lapins avec ce peptide phosphorylé ne nous a pas permis de générer

d’anticorps phospho-spécifiques. Une nouvelle immunisation avec une synthèse peptidique

légèrement différente serait peut-être plus efficace.

De la même manière, nous avons cherché à déterminer la spécificité des anticorps dirigés

contre la sérine 263 phosphorylée. Les Western blot réalisés sur des extraits totaux de cellules

U2OS montrent que les anticorps purifiés à partir des deux sérums de lapin reconnaissent une

bande migrant sur le gel à la taille attendue pour HA-Cdc25C-His qui semble être spécifique de la

phosphatase (figure 42). Cependant lorsque nous avons utilisé ces anticorps pour rechercher les

kinases potentiellement impliquées dans la phosphorylation de ce résidu (Voir ci-après, § III-3)

nous nous sommes aperçu que ces anticorps, bien que spécifiques de Cdc25C, ne sont pas

spécifiques de la forme phosphorylée. Le manque de spécificité de ces anticorps provient sans

Figure 41 : Anticorps phospho-spécifique anti-S168 phosphorylée

Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Elles ont été transféctés 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.

Résultats

122



doute de la stratégie de purification employée. En effet, seulement un passage a été réalisé contre

les peptides non phosphorylés dans le but de retenir préférentiellement les anticorps non

spécifiques de la phosphorylation après la première purification contre le peptide qui a servi à

immuniser les lapins. Dans ce cas précis, peut être que ce seul passage n’a pas suffit à épuiser la

totalité des formes non spécifiques de la phosphorylation, ainsi nos échantillons d’anticorps

“purifiés” regroupe un mélange d’anticorps anti-Cdc25C spécifiques ou non de la forme

phosphorylée.

III-2 : Effet des mutants de Cdc25C

Les cellules U2OS parentales ont été transféctées de manière transitoire en absence de

tétracycline avec les plasmides codant soit pour la forme sauvage de Cdc25C, soit pour les

différentes formes mutées en absence de tétracycline pendant 24h. Dans un premier temps, nous

nous sommes tout d’abord assurés que chacun des plasmides étaient correctement exprimés dans

Figure 42 : Anticorps phospho-spécifique anti-S168 phosphorylée

Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Les cellules ont été transféctés 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.

Résultats

123



la lignée cellulaire U2OS t-TA. La figure 43a montre un western blot avec un anticorps anti-

Cdc25C sur les différentes formes mutées de la phosphatase HA-Cdc25C-His. Malgré un dépôt

des échantillons non homogène (par rapport à la bande contrôle représentant la forme endogène

de Cdc25C), chaque mutant est exprimé correctement dans la cellule et migre à la taille attendue.

Nous avons ensuite affiné cette analyse en déterminant quelle était la meilleure cinétique

d’expression des mutants de Cdc25C en transfection transitoire. Pour cela les mutants ont été

transféctés dans les cellules U2OS t-TA et les extraits cellulaires totaux ont été analysés par

western blot 24h, 48h ou 72h après la transfection. La figure 43b montre les résultats obtenus

pour la forme sauvage et le mutant S263A de HA-Cdc25C-His. L’expression de HA-Cdc25C-His

24h après la transfection est identique au niveau de la phosphatase endogène, mais ce niveau

diminue très fortement après 48h pour disparaître complètement après 72h de transfection. Ces

résultats indiquent que le plasmide n’est pas stable dans les cellules U2OS et doit être rapidement

dégradé, expliquant la chute brutale du niveau de HA-Cdc25C-His dans la cellule dès le temps

48h. C’est pourquoi pour s’assurer une bonne homogénéité ainsi qu’un niveau suffisant

d’expression des mutants de Cdc25C, toutes les transfections transitoires ont ensuite été réalisées

durant 24h. Enfin nous avons regardé la localisation intracellulaire de chacun des mutants par

immunofluorescence avec des anticorps anti-HA. HA-Cdc25C-His, comme précédemment

décrit, est majoritairement localisée dans le cytoplasme avec une exclusion nucléaire. Les mutants

S168A et S168E sont eux aussi majoritairement localisés dans le cytoplasme. Bien qu’il semble

qu’il y ait une légère relocalisation nucléaire par rapport à la forme sauvage, celle-ci est

insuffisante pour justifier que la phosphorylation sur la S168 puisse avoir un rôle dans la

localisation de la phosphatase. En revanche les mutants S263A, S263D et S263E présentent,

quant à eux, un phénotype de relocalisation nucléaire de la phosphatase par rapport au phénotype

de la forme sauvage. D’autre part, le phénotype est identique pour les trois formes mutées de la

S263 ce qui suggère que les mutants S263D et S263E ne jouent pas leurs rôles de phospho-

mimétique (figure 43c) (Law et al., 2006) (Esteban et al., 2003).

En conclusion la phosphorylation de la S168 de la phosphatase Cdc25C ne semble donc pas

intervenir dans les phénomènes de régulation intracellulaire de la phosphatase. Par contre, le

phénotype de relocalisation nucléaire des mutants S263A/D/E montre un rôle de la

phosphorylation de ce résidu impliqué dans les mécanismes d’export cellulaire de la phosphatase.

Résultats

124



IV-1-A : Etude de la phosphorylation de la S263

La localisation intracellulaire de la phosphatase HA-Cdc25C-His par immunofluorescence à

l’aide d’un anticorps anti-HA est représentée figure 44a Nous pouvons observer une répartition

strictement cytoplasmique de la phosphatase HA-Cdc25C-His, comme décrit précédemment,

alors que la forme mutée S263A est localisée aussi bien dans le noyau de la cellule que dans le

cytoplasme (marquage “pan cellulaire”).

Dans le but de déterminer quel était le mécanisme impliqué dans le phénotype de

relocalisation nucléaire des mutants de la sérine 263, les cellules U2OS ont été traitées avec

20ng/ml de leptomycine B (LMB) qui est un inhibiteur de l’export nucléaire des protéines via

Figure 43 : Effet des mutants S168A et S263A de Cdc25C

A. WB anti-Cdc25C. Transfection transitoire des différents mutants de HA-Cdc25C-HIs dns les U2OS t-TA pendant 24h en absence de tétracycline. La bande inférieure correspond à la Cdc25C endogène et la bande supérieur aux mutants HA-Cdc25C-His. B. Cinétique de transfection. La forme sauvage et le mutant S263A ont été transfecté dans les U2OS t-TA et les extraits cellulaires ont été réalisés 24h, 48h et 72h post-transfection et détecté par WB anti-Cdc25C. C. Localisation des mutants. Les cellules U2OS t-TA ont été transfectées par les différents mutants HA-Cdc25C-His et leur localisation a été détectée par IF anti-HA sur un microscope Leica. Pour chaque analyse au moins 100 cellules ont été comptées.

A

B

C

Résultats

125



l’inhibition du facteur d’export nucléaire, exportin1 (Crm1) (Ossareh-Nazari et al., 1997). Les

résultats présentés figure 44b montrent la relocalisation nucléaire de la forme sauvage de HA-

Cdc25C-His, 85% des cellules présentent un marquage de type nucléaire après le traitement des

cellules par la LMB. La forme mutante de la phosphatase S263A présente un marquage

majoritairement “pan-cellulaire” avec néanmoins 32% des cellules marquées strictement dans le

cytoplasme dans la population non traitée. Lorsque l’on ajoute de la LMB, on observe un effet

additif de la relocalisation nucléaire de HA-Cdc25C-His S263A avec un marquage “pan-

cellulaire” qui devient strictement nucléaire (plus que 3% des cellules présentent un marquage

cytoplasmique strict alors qu’on observe 42% de cellules avec un marquage strictement

nucléaire). Cette expérience confirme donc le rôle joué par la phosphorylation sur la S263 dans la

localisation cellulaire de la phosphatase Cdc25C et suggère que cette dernière soit impliquée dans

les mécanismes de régulation de l’export nucléaire de la phosphatase de manière indépendante au

facteur d’export nucléaire Crm1, puisque l’ajout de LMB renforce l’accumulation nucléaire de

Cdc25C.

Figure 44 : Implication de la S263 dans la localisation cellulaire

A et B. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. A. IF anti-HA. Les cellules sont observées sur un microscope Leica au grossissement X100. HA-Cdc25C-His est immuno-détectée par un anticorps anti-HA couplé à un anticorps secondaire Alexa 488 et l’ADN est marqué au dapi. B. Effet de S263A sur la localisation de Cdc25C. Les cellules ont été transféctés 24h et traitées 3h avant fixation par 20ng/ml de LMB. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA. Les barres d’erreurs représentent la déviation standard obenues à partir de 3 analyses différentes.

B

A

Résultats

126



Ensuite, afin de déterminer si cette phosphorylation était aussi impliquée dans la réponse au

stress, nous avons analysé l’effet de différents stress sur la localisation cellulaire du mutant S263A

par rapport à la phosphatase sauvage. Comme chaque stress conduit à l’activation d’une voie de

régulation particulière, aboutissant à la régulation de différents effecteurs, nous avons choisi de

traiter les cellules soit avec un stress oxydatif : H2O2, soit en activant directement la voie p38 avec

l’anisomycine. Les cellules ont donc été traitées 24h après la transfection par 0,4mM d’H2O2, ou

1µg/ml d’anisomycine. Les résultats sont présentés figure 45. La forme sauvage de HA-Cdc25C-

His est relocalisée dans le noyau lors du traitement H2O2, on observe un marquage “pan-

cellulaire” de la phosphatase pour 40% des cellules. Après le traitement des cellules par

l’anisomycine la forme sauvage reste majoritairement cytoplasmique, bien qu’on observe ici aussi

une légère relocalisation de nucléaire de HA-Cdc25C-His (25% de marquage “pan-cellulaire” au

lieu de 10% pour le contrôle non traité). En revanche les résultats obtenus avec le mutant S263A

ne montrent aucune différence de localisation de la phosphatase après les différents stress par

rapport au contrôle non traité. Ces expériences nous permettent donc de conclure que la

phosphorylation de la S263 ne semble pas être impliquée dans les mécanismes de régulation en

réponse aux stress mais uniquement dans la régulation de la localisation à travers l’export

nucléaire de la phosphatase HA-Cdc25C-His.


Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Les cellules ont été transféctées 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.

Résultats

127



D’autre part, nous avons vu au cours de l’introduction générale que la séquestration nucléaire

de Cdc25C par la mutation en alanine de la sérine 216 conduisait à une entrée prématurée des

cellules en mitose (Graves et al., 2001). Nous nous sommes donc demandés si le phénotype de

relocalisation nucléaire du mutant S263A induisait une entrée prématurée des cellules en mitose

comme c’est le cas pour les mutants de la S216.

Afin de pouvoir répondre à cette question nous avons observé la localisation intracellulaire de

Cdc25C par un marquage direct des noyaux. Cette technique présente l’avantage de ne pas perdre

les cellules en mitose ou en apoptose au cours des lavages, ce qui permet de dénombrer les

cellules entrées prématurément en mitose ou présentant une condensation anormale de la

chromatine. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne permet pas de réaliser de marquages

par immunofluorescence. Nous avons donc utilisé les plasmides pEGFP ::Cdc25C et

pEGFP ::Cdc25C-S216A, codant pour l’expression de la phosphatase Cdc25C en fusion avec la

GFP (Green Fluorescent Protein) et nous avons construit le plasmide pEGFP ::Cdc25C-S263A par

mutagénèse dirigés. Les cellules U2OS ont été transféctées par ces plasmides et analysées par

marquage des noyaux au dapi direct et seules les cellules positives pour la GFP ont été

dénombrées. Ainsi la fluorescence de la GFP a permis de déterminer la localisation intracellulaire

de Cdc25C sauvage et des mutants et le marquage des noyaux a permis de différencier les cellules

mitotiques de celles présentant une condensation prématurée de la chromatine (PCC). De la

même manière que pour HA-Cdc25C-His, la phosphatase GFP-Cdc25C sauvage est localisée

strictement dans le cytoplasme. Le mutant S216A présente une relocalisation nucléaire (50% de

marquage nucléaire) avec une augmentation significative (15%) du nombre de cellules présentant

condensation prématurée de la chromatine. Ces résultats sont en accord avec ceux de la

littérature (Graves et al., 2001). Le mutant GFP-Cdc25C-S263A présente lui aussi une

relocalisation nucléaire de la phosphatase qui est ici aussi accompagnée d’une augmentation de

23% du nombre de cellules entrant prématurément en mitose (figure 46).

Ces résultats confirment dans un premier temps que la localisation observée de Cdc25C

sauvage et des mutants n’est pas un artéfact provenant de l’étiquette anti-HA puisque nous

observons des phénotypes de localisation intracellulaire de la forme sauvage et du mutant S263A

de Cdc25C identiques à ceux observés en immunofluorescence avec l’anticorps anti-HA. Enfin,

la rétention nucléaire de Cdc25C-S263A est accompagnée d’une augmentation du nombre de

cellules entrant prématurément en mitose au même titre que le mutant Cdc25C-S216A, ce qui

suggère un rôle dans les mécanismes de la régulation de l’entrée des cellules en mitose peut-être

ici aussi par l’intermédiaire de la liaison avec les protéines 14-3-3 ?

Résultats

128



IV-1-B : Etude de la phosphorylation de la S168

Dans le cadre de l’analyse de la phosphorylation de la sérine 168 de Cdc25C en réponse à un

traitement étoposide, nous avons cherché à comprendre quel était le rôle de cette

phosphorylation sur la régulation de la phosphatase et quelles étaient les voies métaboliques de

réponse aux stress qui étaient impliquées.

Pour cela les effets de différents stress génotoxiques ont été analysés par des expériences

d’immunofluorescence avec l’anti-HA sur les mutants S168A et S168E de Cdc25C. Les résultats

obtenus sont présentés figure 47.

La forme mutante S168A est localisée majoritairement dans le cytoplasme. Lorsque les cellules

sont traitées avec de l’H2O2, on n’observe plus le phénotype de relocalisation nucléaire de la

phosphatase que nous avions observé avec la forme sauvage de HA-Cdc25C-His . Lorsque les

cellules sont traitées avec de l’anisomycine, on observe une relocalisation nucléaire de la

phosphatase au contraire du phénotype observé avec la forme sauvage. De la même manière,

alors que la forme mutante S168E est majoritairement cytoplasmique en condition normale, celle-


Effet de S263A sur l’entrée prématurée des cellules en mitose. Les cellules ont été transféctés 24h avec Cdc25C étiquetée GFP. L’ADN a été marqué au DAPI et seul les cellules GFP positive ont été comptée.détectées Pour chaque expériences au moins 100 cellules ont été comptées

Résultats

129



ci se relocalise dans le noyau suite au traitement H2O2. Elle reste majoritairement cytoplasmique

après le traitement par l’anisomycine bien que dans ce cas là, il y ait une forte relocalisation

nucléaire de la phosphatase par rapport au contrôle non traité. Ceci nous permet de conclure qu’il

semble que le mutant S168E joue bien le rôle de phospho-mimétique et contrebalance l’effet

observé avec le mutant S168A. D’autre part cette expérience suggère que la phosphorylation sur

la sérine 168 de la phosphatase HA-Cc25C-His semble être impliquée dans la régulation de la

phosphatase lors de la réponse aux stress.

Figure 47 : Effet des stress génotoxiques sur le mutant S168A

A. IF anti-HA : Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA et observées sur un microscope Leica grossissement X100.

Résultats

130



III-3 : Recherche des kinases impliquées dans la phosphorylation de S168 et S263

Pour terminer, nous avons recherché quelles kinases étaient potentiellement responsables de

ces phosphorylations. Pour cela, nous avons réalisé des essais kinases in vitro en présence de

phosphate radiomarqué, 33p. Les résultats de l’autoradiographie sont présenté figure 48a. Nous

avons ainsi mis en évidence que les kinases candidates Chk1, MK2, Aurora A, Cdk1/cycline B,

p42 et p44 étaient capable de phosphoryler la phosphatase Cdc25C in vitro. Afin de déterminer

spécifiquement si au moins une de ces kinases était impliquée dans la phosphorylation spécifique

su résidu sérine 263, ces mêmes essais kinases ont été réalisés à froid et la phosphatase a été

détectée par Western blot, en utilisant l’anticorps anti-phosphospécifiques dirigé contre le site

S263 qui semblait être spécifique (voir § III-1-B). Cependant, comme l’illustre le Western blot

anti-S263p réalisé sur l’essai kinase Cdk1/Cycline B présenté figure 48b, cet anticorps n’est pas

spécifique de la phosphorylation et détecte la forme non phosphorylé de la phosphatase MBP-

Cdc25C purifiée chez E. coli.

Figure 48 : Essais kinases in vitro

Autoradiographie représentant les essais kinases réalisés sur MBP-Cdc5C purifiée chez E.coli. La bande correspondante à MBP-Cdc25C est indiquée par une flèche. Essais kinases réalisés in vitro avec la kinase Cdk1/cycline B. Détection par WB avec un anticorps phosphospécifique anti-S263p et comme contrôle anti-Cdc25C (clone TC15).

A

B

Résultats

131



Ainsi bien que nous ayons mis en évidence de nombreuses kinases candidates pour la

phosphorylation de ces résidus particuliers. Nous ne pouvons pas encore déterminer précisément

quelles kinases sont impliquées dans ces phénomènes de phosphorylation.

III-4 : Conclusion

Cette dernière partie était consacrée à l’étude du rôle fonctionnel des phosphorylations des

sérines 168 et 263 sur la régulation de Cdc25C.

Les résultats obtenus avec les mutants de la sérine 263 ont montré que cette phosphorylation

est impliquée dans un mécanisme qui retient Cdc25C dans le cytoplasme et prévient sa

relocalisation nucléaire. En effet la mutation de la sérine 263 en alanine conduit à augmenter

l’accumulation nucléaire de Cdc25C, cela de manière indépendante du facteur d’export nucléaire

Crm1 puisque l’inhibition de l’exportine par la LMB renforce son accumulation nucléaire (figure

49). La S263 est localisée dans un domaine proche de la NLS de Cdc25C, il est donc tentant de

supposer que la mutation de la S263 peut affecter la disponibilité de la NLS lors de son

interaction avec les importines. Un mécanisme de régulation similaire avait été proposé dans le

cas de la phosphorylation sur la T236 de Cdc25C. La T236 est située juste en amont de la NLS et

lorsqu’elle est phosphorylée par la protéine kinase CK2, sa translocation nucléaire est augmentée

et Cdc25C s’accumule dans le noyau (Schwindling et al., 2004).

De plus, l’accumulation nucléaire de Cdc25C est accompagnée d’une entrée prématurée de

cellules en mitose similaire à celle provoquée par la forme non-phosphorylable de la S216 (Dalal

et al., 1999). Nous pouvons donc imaginer que la phosphorylation sur la S263 intervient dans un

mécanisme de régulation négatif de Cdc25C en maintenant la phosphatase dans le cytoplasme

afin d’empêcher son interaction avec son substrat CDK1 et ainsi maintenir la cellule en phase G2

tant qu’elle n’est pas prête à entrer en mitose.

La phosphorylation de la sérine 168, quant à elle, ne semble pas être impliquée dans les

phénomènes de régulation de la localisation, la forme non-phosphorylable de la S168 ne perturbe

pas la localisation intracellulaire de Cdc25C. Néanmoins en réponse à des stress genotoxiques

nous pouvons observer un changement de comportement sur la localisation intracellulaire de

Cdc25C qui semble être contrebalancée par les mutants phospho-mimétiques de la S168. Il avait

déjà été montré que le résidu S168 de Cdc25C pouvait être phosphorylé en réponse aux stress

Résultats

132



(Goss et al., 2003). La phosphorylation sur la S364 de la phosphatase MKP1 par les protéines

kinases p42MAPK et p44MAPK n’agit pas sur son activité mais conduit à la dégradation de la

phosphatase (Brondello et al., 1999). Dans le cas de la réponse aux stress on pourrait imaginer un

mécanisme similaire qui conduirait à l’activation rapide du point de contrôle G2/M par

l’intermédiaire de la dégradation de Cdc25C.

Figure 49 : Rôle de la phosphorylation sur la S263 – présentation d’un modèle

La phosphorylation de Cdc25C contrôle négativement la translocation du cytoplasme vers le noyau. La mutation de la S263 en alanine conduit à son accumulation nucléaire par un mécanisme indépendant de Crm1.

DISCUSSION

Discussion

134



Discussion

135



Nous avons vu au cours de l’introduction générale de ce manuscrit que la phosphatase

Cdc25C était contrôlée par de nombreux évènements de phosphorylations/déphosphorylations

qui régulent la phosphatase aussi bien au niveau de sa localisation intracellulaire que de son

activité. Il a également été proposé récemment que la stabilité de Cdc25C soit contrôlée par des

évènements de phosphorylation (Eymin et al., 2006). Par ailleurs, une même phosphorylation

semble pouvoir être impliquée dans plusieurs mécanismes de régulation différents. C’est le cas

par exemple de la S168 qui est impliquée dans l’activation de Cdc25C à la suite de sa

phosphorylation par CDK1 (Izumi and Maller, 1993), mais que nous avons identifiée lors de

l’activation du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire en réponse à un traitement étoposide

et qui semble être impliquée dans un phénomène d’inhibition de Cdc25C (Goss et al., 2003).

Lorsque nous avions débuté ce projet de thèse, nous cherchions à comprendre les mécanismes de

régulation post-traductionnelle de la phosphatase Cdc25C et à identifier de nouveaux régulateurs

qui puissent constituer éventuellemnt de nouvelles cibles pharmacologiques. Nous avions donc

développé dans ce but une analyse protéomique globale de recherche de MPT sur Cdc25C. Ainsi,

notre projet s’est déroulé autour de deux grands axes qui étaient le développement d’un modèle

d’étude et la mise en place de l’analyse protéomique pour la recherche de MPT sur Cdc25C. Puis,

à la suite de la mise en évidence de plusieurs modifications, nous avons cherché à déterminer

quelles étaient les fonctions jouées par les phosphorylations sur les S263 et S168.

I- Validation du modèle d’étude

La recherche globale des MPT de la phosphatase Cdc25C par spectrométrie de masse reposait

sur la purification de quantité de protéine de l’ordre du microgramme de Cdc25C dans un

contexte naturel. Du point de vue industriel, dans le cadre de la recherche de nouvelles thérapies

basée sur des approches conduisant à l’inhibition du point de contrôle G2/M (Cf. Introduction

générale, §II-3), il était important d’analyser les mécanismes impliqués dans la régulation de la

phosphatase lors de l’activation spécifique du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire par des

agents génotoxiques. C’est pourquoi nous nous sommes également appliqués à valider, dans le

modèle cellulaire que nous avions construit pour cette étude, la mise en place spécifique du point

de contrôle G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN.

Discussion

136



I-1 : La stratégie de purification

Ainsi la première étape de ce projet consistait à purifier Cdc25C. Pour cela nous avons

construit un modèle cellulaire où la phosphatase Cdc25C étiquetée était surexprimée de manière

conditionnelle dans des cellules humaines : les U2OS. Les cellules U2OS sont des cellules

adhérentes humaines issues d’un ostéosarcome. Elles ont l’avantage d’avoir un temps de

doublement relativement rapide (20h), et de se prêter facilement aux synchronisations (ce qui

facilite l’étude du cycle cellulaire). Pour la purification de la phosphatase, nous avons adapté le

protocole de purification mis au point dans notre laboratoire par le Dr Jean-Pierre Bouché pour

l’étude par spectrométrie de masse des modifications de la phosphatase Cdc25B (Bouché JP, en

préparation). Cette stratégie est basée sur la reconnaissance de deux étiquettes : l’étiquette HA et

l’étiquette poly-histidines. La première étape de purification sur une matrice d’affinité de Nickel-

NTA a été choisie car elle supporte les conditions de dénaturations très stringentes utilisées lors

de l’extraction de Cdc25C. Mais cette étape ne permettait pas d’obtenir un très bon rendement de

purification. Ainsi la seconde étape de purification sur une matrice d’immunoaffinité porteuse

d’anticorps anti-HA était nécessaire. Cette étape nécessitait la renaturation préalable de protéines

purifiées dans des conditions dénaturantes. Elle n’aurait pas pu être réalisée sans les résultats

récents de Tsumoto et ses collaborateurs qui ont montré que l’ajout de d’arginine dans les

tampons jouait un rôle dans le repliement des protéines, leur solubilisation et leur purification

(Tsumoto et al., 2004). Le rôle exact de l’arginine lors des phénomènes de repliement et de

renaturation des protéines est encore mal connu, cependant il semblerait qu’elle agisse en

induisant un ralentissement des interactions protéine-protéine, conduisant à une stabilisation des

protéines avec un effet concomitant au niveau du repliement des protéines (Baynes et al., 2005).

Ainsi la renaturation rapide de Cdc25C après la purification par affinité Ni-NTA permettait de

réaliser des expériences d’immuno-purifications avec des anticorps anti-HA, augmentant

significativement le rendement.

Le clone U2OS C16-5 a été sélectionné pour le niveau et l’homogénéité de l’expression de

HA-Cdc25C-His dans les cellules U2OS grâce à des expériences de western blot et

d’immunofluorescence à l’aide d’anticorps dirigés contre l’étiquette HA de la phosphatase.

Néanmoins nous avons rencontré des limitations au niveau des rendements de purification

obtenus, ce qui a compliqué l’analyse par spectrométrie de masse (voir ci-après). Nous pensons que

ces limitations proviennent en partie du faible niveau d’expression de HA-Cdc25C-His dans les

cellules U2OS. En effet les expériences de western blot réalisées à l’aide d’un anticorps dirigé

Discussion

137



contre Cdc25C avaient mis en évidence que la quantité de HA-Cdc25C-His présente dans les

extraits cellulaires n’était que légèrement supérieure à celle de Cdc25C endogène. Ceci constituait

un avantage à nos yeux car la purification était réalisée à partir de cellules exprimant des taux de

Cdc25C relativement proche d’un taux physiologique et dont la biologie était ainsi perturbée à

minima. Cependant, l’inconvénient évident auquel nous nous sommes retrouvés confrontés est la

faible quantité de protéine purifiable.

Afin d’améliorer la quantité finale de la phosphatase Cdc25C obtenue à partir de ce modèle

cellulaire, l’augmentation du nombre de cellules en culture auraient peut-être suffit. Cependant,

les cellules U2OS étant des cellules adhérentes, l’augmentation du nombre de cellules implique

l’utilisation d’un matériel beaucoup plus important et une manipulation plus lourde et présente

donc un risque pour la reproductibilité des expériences. Afin de contourner ces problèmes, il

serait envisageable de cultiver les cellules dans un système CellCube par exemple qui permet de

cultiver les cellules adhérentes en “spinner” et d’augmenter significativement le nombre de

cellules en culture.

I-2 : Le contrôle du cycle cellulaire

Le contrôle de l’activation dans des conditions normales du point de contrôle G2/M,

représentait un aspect important de la validation de notre modèle cellulaire. Parmi les différents

agents génotoxiques qui ont été testés (dommages à l’ADN par la bléomycine, inhibition de la

réplication par la gemcitabine…), seul un traitement par l’étoposide a permis d’obtenir une

activation spécifique et irréversible du point de contrôle G2/M sur les cellules U2OS C16-5.

L’étoposide génère des cassures simples et doubles brins de l’ADN en formant un complexe

ternaire avec la topoisomérase de type II, conduisant à une inactivation de la kinase CDK1 et a

un blocage irréversible des cellules en phase G2. Nous avons aussi montré que l’activation du

point de contrôle G2/M par l’étoposide dans ces conditions était accompagnée d’une activation

des kinases Chk1, p42/Erk2MAPK2 et p44/Erk1MAPK1.

Chk1 est une kinase distale de la transduction du signal, activée par ATM ou ATR en réponse

aux cassures doubles brins et simple brin de l’ADN, qui phosphoryle Cdc25C sur la S216 et

inhibe son activité, empêchant alors la déphosphorylation activatrice de CDK1 et conduisant au

blocage des cellules au point de contrôle G2/M (Cf. Introduction générale §II-1). p42/Erk2 et

p44/Erk1 font parties de la grande famille des MAP kinases et appartiennent à la cascade de

signalisation ERK. De nombreuses études ont montré que l’exposition des cellules aux radiations

Discussion

138



ionisantes ou à une variété d’autres stress toxiques conduisait à une activation compensatrice

simultanée des voies de signalisation MAPK (Dent et al., 2003) (Cf. Introduction générale § II-1-B).

La voie Raf/MEK/Erk est classiquement impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire

et la différentiation est activée par des stimuli externes comme les facteurs de croissance. Une

récente étude a montré que p42MAPK était directement impliquée dans l’activation de Cdc25C chez

le xénope durant la transition G2/M, suggérant ainsi un rôle de la voie ERK dans le contrôle du

cycle cellulaire (Wang et al., 2007). Cependant il a été montré que cette voie était également

impliquée dans la réponse cellulaire aux stress provoqués par les radiations ionisantes ou bien les

traitements génotoxiques (Abbott and Holt, 1999; Dent et al., 2003; Tang et al., 2002). Tang et

ses collaborateurs ont montré dans les cellules humaines que p42 et p44/MAPK étaient activées

suite à un traitement étoposide conduisant à un arrêt du cycle cellulaire de manière indépendante

de p53 et ATM (Tang et al., 2002). Enfin une étude plus récente a montré que p42 et p44 était

directement impliquées dans la phosphorylation inhibitrice de Cdc25C sur la S216 et conduisait à

sa dégradation lors du point de contrôle G2/M (Eymin et al., 2006).

Ainsi, nos résultats concordent avec les données bibliographiques décrivant la régulation du

point de contrôle G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN. Nous pouvons donc présenter ici

un résumé général exposant les évènements qui semblent être impliqués dans les cellules U2OS

en réponse à un traitement étoposide.

L’étoposide par l’inhibition de la topoisomérase II, va conduire à la création de cassures

simples et doubles brins sur l’ADN qui vont être reconnues par les complexes MRN et RPA et

ainsi recruter et activer les kinases ATM et/ou ATR conduisant à l’activation de Chk1. La forme

active de Chk1 va alors bloquer la progression cellulaire à la transition G2/M en phosphorylant

ses substrats dont la S216 de Cdc25C, conduisant à une inhibition de la phosphatase empêchant

la déphosphorylation activatrice de CDK1, nécessaire à l’entrée en mitose. En parallèle de cette

cascade de signalisation qui est bien connue, a lieu l’activation de la voie Raf/MEK/Erk et les

kinases Ek1/p44 et Erk2/p42 vont stabiliser l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 par la

phosphorylation inhibitrice de Cdc25C sur la S216 conduisant à sa dégradation et par

l’inactivation directe de CDK1. Ces deux voies semblent être additives puisque l’ajout d’UCN01

n’entraîne qu’une sortie partielle du point de contrôle G2/M.

II- Analyse protéomique

Discussion

139



L’analyse par spectrométrie de masse de Cdc25C a été réalisée dans le but d’identifier des

modifications post-traductionnelles présentes in vivo sur la phosphatase Cdc25C purifiée de

cellules en culture.

Cette analyse a ainsi été réalisée par nano-LC-MS/MS sur trois échantillons de populations

cellulaires ayant subi différentes conditions de traitement : des cellules asynchrones (cellules ayant

un cycle cellulaire normal), des cellules traitées par l’étoposide (activation du point de contrôle

G2/M) et des cellules ayant subi un traitement par du nocodazole (les cellules sont synchronisées

en début de mitose). Ces trois conditions avaient été choisies dans le but d’obtenir des

informations sur les MPT régulant les différents “états” de Cdc25C au cours du cycle cellulaire.

En effet Cdc25C est régulée négativement au cours d’un cycle cellulaire normal pour empêcher

les cellules d’entrer précocement en mitose ; Cdc25C est également la cible d’une régulation

négative par les transducteurs lors de l’activation du point de contrôle G2/M ; enfin Cdc25C est

activée lors de l’entrée en mitose.

II-1 : La préparation de HA-Cdc25C-His pour la LC-MS/MS

La première étape consistait donc à purifier la phosphatase Cdc25C dans ces trois conditions

avec le meilleur rendement possible. Nous avons cependant obtenu une quantité de Cdc25C

relativement modeste pour les échantillons “non traité” et “étoposide”, en effet de nombreuses

bandes contaminantes sont encore présentes sur le gel. La purification de l’échantillon

“nocodazole” était de mauvaise qualité et il était, dans ce cas, difficile de détecter la bande

correspondant à HA-Cdc25C-His sur le gel (voir ci-dessous).

Comme la préparation des échantillons avait pour but final de réaliser une analyse par

spectrométrie de masse en mode electrospray, il était nécessaire de détecter sur le gel la bande

correspondant à Cdc25C avec un colorant compatible. Nous avons ainsi choisi le bleu de

coomassie colloïdal qui représente un compromis entre le bleu de coomassie classique, peu

sensible, et la coloration à l’argent, la technique de coloration la plus sensible mais qui est

moyennement compatible avec la spectrométrie de masse. Néanmoins, même si l’ajout du réactif

colloïdal a permis d’augmenter la sensibilité de la détection des protéines, celle-ci reste limitée par

une sensibilité moyenne et une faible linéarité (Neuhoff et al., 1988). Ainsi la coloration poussée

pour permettre la détection de Cdc25C a été accompagnée d’un marquage non spécifique des

protéines minoritaires encore présentes après les étapes de purification. A cause du relativement

faible niveau d’expression de la phosphatase dans les cellules U2OS C16-5 et de la lourdeur de la

Discussion

140



stratégie de purification, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir suffisamment de matériel pour

mettre au point de meilleures conditions de purification et de détection des protéines sur le gel.

Par ailleurs l’approche de spectrométrie de masse “bottum up” permettait de s’affranchir d’une

grande partie de ces contaminants puisque nous avons découpé dans le gel la bande

correspondant spécifiquement à Cdc25C. La phosphatase a ensuite été hydrolysée par la trypsine

et le mélange peptidique obtenu a été analysé par LC-MS/MS.

II-2 : Le taux de couverture de séquence

Nous avons néanmoins pu réaliser une analyse par spectrométrie de masse sur ces

échantillons. Comme nous recherchions de nouvelles modifications post-traductionnelles sur la

séquence de Cdc25C, nous avons choisi de réaliser une recherche “globale” de modifications. De

plus, étant limités par la quantité de matériel, il était essentiel d’obtenir le maximum d’information

de séquence à partir d’une seule analyse. Pour cela nous avions choisi une approche nanoLC-

MS/MS sur un appareil hybride de type Q-TOF (QSTAR, Applied Biosystems). En effet le

couplage de l’analyseur temps de vol avec l’ionisation electrospray permet en plus d’un couplage

chromatographique simplifiant le mélange peptidique, d’obtenir une meilleure résolution

augmentant ainsi la qualité des spectres MS/MS. Plus la qualité des spectres MS/MS est grande et

meilleures seront les informations de séquences. Au niveau du gradient de chromatographie, nous

avons choisi un gradient long dans le but de séparer le maximum de peptides. Ainsi au cours de

l’analyse MS un plus grand nombre d’ions parents pourront être sélectionnés pour l’analyse

MS/MS, augmentant à la fois le taux de couverture de séquence analysée et les chances d’obtenir

des informations de séquences sur les peptides modifiés.

Pour chaque échantillon, nous avons appliqué les mêmes conditions d’analyse, mais nous

avons cependant obtenu des taux de couverture de séquence différents. En effet, pour

l’échantillon “non traité” représentant une population cellulaire asynchrone, comme pour

l’échantillon “étoposide” représentant une population de cellules arrêtées en G2/M du cycle

cellulaire par l’activation du point de contrôle, nous avons obtenu un taux de recouvrement de

séquence de 62% et 66% respectivement. En revanche dans le cas de l’échantillon “nocodazole”

représentant les cellules synchronisées en mitose, nous n’avons obtenu que 32% de recouvrement

de séquence.

Discussion

141



La faible quantité de Cdc25C purifiée, obtenue avec l’échantillon “nocodazole” peut expliquer

les mauvais résultats acquis au cours de l’analyse par spectrométrie de masse. Le fait que chaque

échantillon ait subi les mêmes conditions de préparation, nous permet d’envisager que la

synchronisation des cellules en mitose pourrait aussi être une cause du mauvais rendement de

purification et du taux de couverture de séquence dérisoire obtenus. Nous proposons ainsi

comme hypothèse que les cellules en mitose, qui sont relativement fragiles puisque leur forme

arrondie leur confère une adhérence limitée, ont été en grande partie perdues au cours de la

manipulation. Cela pourrait expliquer la faible quantité de Cdc25C obtenue dans ces conditions.

Finalement les mauvais résultats obtenus dans ces conditions ne nous ont pas permis de mener

plus loin l’études des MPTs de Cdc25C en mitose.

Par ailleurs, au premier abord les taux de recouvrement de séquence obtenus pour les

échantillons “non traité” et “étoposide” paraissaient suffisants. Nous avions en effet séquencé

plus de la moitié de la séquence de la phosphatase, ce qui correspondait à l’obtention de

séquences peptidiques couvrant environ 70% des résidus sérines et thréonines potentiellement

phosphorylables. Mais nous avions suivi cette approche globale de recherche de MPT dans

l’espoir in fine d’obtenir des informations d’identification et de caractérisation exhaustives des

modifications pouvant être impliquées dans la régulation de Cdc25C. Les couvertures de

séquence obtenues au cours de cette analyse sont ainsi largement insuffisantes pour répondre à

cette question puisque au terme de l’analyse il manque encore 40% d’information de séquence.

L’objectif de l’analyse de Cdc25C par spectrométrie de masse, qui était de développer un outil

puissant permettant d’identifier le maximum de MPT présentes sur la séquence de la

phosphatase, n’a donc pas pu être atteint. L’hydrolyse de Cdc25C avec une autre protéase de

manière conjointe à la trypsine pourrait permettre d’améliorer le taux de couverture de séquence.

Ainsi la double hydrolyse de Cdc25C avec la trypsine et l’endoprotéase Glu C qui réalise des

hydrolyses en carboxy-terminal des résidus acide glutamique et acide aspartique permet d’obtenir

in silico une fragmentation peptidique dont les peptides identifiables par MS/MS correspondent à

93% de la séquence de la phosphatase (d’après PeptideCutter). Ce taux peut encore être augmenté

jusqu’à la totalité de la séquence de la phosphatase si on estime que l’une ou l’autre des enzymes

conduisent à des clivages manqués. Cependant la principale difficulté à laquelle nous avons été

confrontés lors de la mise au point de cette approche résidait dans la complexité d’analyse des

spectres MS/MS obtenus (résultats non montrés). En effet la fragmentation résultante des peptides

obtenus après une hydrolyse par Glu C est aléatoire contrairement aux peptides tryptiques, plus

facile à analyser car par la charge porté par le résidu carboxy-terminal permet plus généralement

Discussion

142



d’obtenir une fragmentation suivant la série des ions y. L’augmentation de la quantité de Cdc25C

purifiée permettra également d’améliorer la couverture de séquence. En effet le mauvais

rendement de purification que nous avons obtenu lors de la préparation des échantillons est

probablement très certainement à l’origine des mauvais résultats obtenus par spectrométrie de

masse. Enfin l’utilisation d’appareils plus performants comme par exemple le LTQ-OrbiTrap, qui

offre une résolution bien supérieure à celle du Q-TOF, permettrait également d’augmenter

significativement les taux de couverture de séquence. En effet la précisons de masse pour cet

appareil est inférieure à 5 ppm, ce qui conduit à une grande précision lors de l’interrogation dans

les banques de données.

L’analyse des spectres MS/MS a néanmoins permis de mettre en évidence deux nouvelles

phosphorylations sur la S263 et sur le résidu S268/ou T270. Il semblerait également que Cdc25C

soit méthylée sur le résidu R35. Il est toutefois surprenant que ce site méthylé soit un site de

clivage par la trypsine, puisqu’en général la trypsine ne reconnaît pas comme site de clivage les

résidus portant des modifications. L’analyse du spectre MS/MS correspondant semble cependant

présenter clairement une méthylation qui ne peut être que sur le résidu R35 (Cf.annexe 1). Enfin,

deux autres phosphorylations, qui avaient déjà été décrites dans la littérature, ont été identifiées,

elles sont localisées sur la S216 et la S168. Il est intéressant de noter que la S168 n’a été retrouvée

phosphorylée que dans le cas de l’analyse de l’échantillon traité par l’étoposide, alors que le

peptide non phosphorylé correspondant à ce site de phosphorylation a été identifié dans les

analyses de l’échantillon non traité et celle de l’échantillon traité par l’étoposide. Le fait que le

peptide non phosphorylé ait été mis en évidence dans les deux analyses nous permet de penser

que ce résidu est phosphorylé en réponse au traitement génotoxique et pourrait être impliqué

dans la régulation du point de contrôle G2/M. De la même manière la phosphorylation de la

S216 a été mise en évidence dans les deux analyses, ce qui nous permet de confirmer le rôle de

cette phosphorylation dans la régulation du cycle cellulaire et dans la réponse aux dommages sur

l’ADN. Il est par ailleurs important de noter que le peptide non phosphorylé correspondant au

site de phosphorylation de la S216 a été mis en évidence dans les deux analyses.

Finalement, les résultats obtenus à partir de l’analyse des spectres MS/MS ont permis de

mettre en évidence quelques modifications post-traductionnelles sur la séquence de Cdc25C, et

en particulier des nouvelles modifications. Cependant ces résultats sont loin d’être satisfaisants

puisque nous n’avons pas été en mesure d’identifier de nombreuses phosphorylations pourtant

décrites dans la littérature. Comment se fait-il que nous n’ayons pas été en mesure de mettre ces

phosphorylations en évidence alors que les peptides non phosphorylés correspondant à ces sites

Discussion

143



étaient présents et détectés ? Plusieurs hypothèses qui sont peut être indépendantes les unes des

autres peuvent être proposées :

Tout d’abord nous ne détectons aucune phosphorylation sur les sites S/TP, phosphorylés lors

de la boucle d’activation de Cdc25C : S48, T67, T130 et S214 [la S168 est un cas particulier

puisque nous avons montré qu’elle était également impliquée dans des mécanismes d’inactivation

de la phosphatase (voir plus loin et Cf. partie résultat §IV-1-B)], ni les sites phosphorylés par les

kinases Plk lors de la translocation nucléaire conduisant à l’activation de la phosphatase : la S191

et la S198. Tous ces sites de phosphorylation sont impliqués dans les mécanismes d’activation de

la phosphatase Cdc25C lors de la progression de la cellule en mitose. Il paraît donc normal que

ces sites ne soient pas phosphorylés dans l’échantillon étoposide où le point de contrôle G2/M

est activé. Dans le cas des cellules asynchrones nous proposons que ces formes actives de

Cdc25C soient minoritaires par rapport aux formes inactives de la phosphatase.

D’autre part, il est très probable qu’à l’image du faible taux de couverture de séquence obtenu

au cours de ces analyses, la qualité du signal ait été trop faible pour permettre la réalisation d’une

bonne analyse des spectres correspondant aux peptides phosphorylés minoritaires.

Une autre alternative pour étudier les phosphorylations de Cdc25C en spectrométrie de masse

serait de réaliser une analyse sur la protéine entière (stratégie “Top Down”, Cf. Introduction

générale). Cependant la taille moyenne de Cdc25C rendra son extraction du gel difficile et l’analyse

en solution (approche “hors gel”) de Cdc25C est compliquée puisqu’elle nécessite de trouver des

conditions d’élution de la phosphatase à partir du gel, qui soient adaptées à la spectrométrie de

masse.

Pour conclure sur cette partie nous n’avons globalement pas été satisfaits des résultats obtenus

à la suite de cette analyse par spectrométrie de masse. Mais la lourdeur de l’expérimentation qui

nécessite la manipulation d’un très grand nombre de cellules, une stratégie de purification

complexe et la préparation de l’échantillon pour l’analyse bottom-up ne nous a pas permis

d’améliorer chacune de ces étapes pour aboutir à une analyse globale et définitive des

modifications post-traductionnelles présentes sur la phosphatase Cdc25C. Nous avons

néanmoins pointé du doigt deux sites de phosphorylations, la S168 et la S263 qui semblent être

impliquées dans les mécanismes de régulation de la phosphatase Cdc25C. La compréhension du

rôle fonctionnel de ces phosphorylations pourrait alors éclairer une partie des mécanismes

impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et des points de contrôle à travers l’activation ou

l’inactivation de la phosphatase Cdc25C. La présence d’une méthylation sur le résidu R35 était

Discussion

144



également une découverte très intéressante puisqu’elle ouvre des perspectives nouvelles sur les

mécanismes de régulation du cycle cellulaire. Nous regrettons cependant de ne pas avoir pu aller

plus loin et chercher à comprendre quelles étaient ses rôles à cause du manque combiné de temps

et d’expérience dans ce domaine.

III- Caractérisation fonctionnelle des phosphorylations identifiées

La troisième partie de notre projet était donc consacrée à l’étude du rôle fonctionnel des

phosphorylations sur la sérine 168 et sur la sérine 263 de la phosphatase Cdc25C.

Nous avons montré au cours de cette étude que la sérine 263 de Cdc25C était phosphorylée,

aussi bien dans les cellules asynchrones que dans les cellules bloquées au point de contrôle G2/M

par un traitement étoposide.

Nous avons montré avec des expériences d’immunofluorescences avec le mutant non

phosphorylable de la S263 que la phosphorylation de la S263 était impliquée dans un mécanisme

de prévention de la translocation nucléo-cytoplasmique de Cdc25C. En effet, la mutation de la

S263 en alanine conduit à une augmentation de l’abondance nucléaire de Cdc25C. Nous avons

également mis en évidence que ce mécanisme était indépendant du facteur d’export nucléaire

Crm 1, puisque l’inhibition de celui-ci par la leptomycine B renforce l’accumulation nucléaire de

Cdc25C. De plus nous n’avons pas observé de phénotype différent entre la forme sauvage et les

différents mutants en réponse à différents stress cellulaires, ce qui suggère un rôle de la

phosphorylation sur le résidu S263 lors de la régulation de la phosphatase Cdc25C au cours d’un

cycle cellulaire normal, mais pas lors de l’activation du point de contrôle en réponse aux

dommages sur l’ADN.

La S263 est située juste en aval de la NLS, il est alors tentant de proposer que la

phosphorylation de la S263 affecte la disponibilité de la NLS pour les importines, et bloque ainsi

l’import nucléaire de la phosphatase. Un mécanisme de régulation similaire avait été proposé dans

le cas de la phosphorylation sur la T236 de Cdc25C qui est située juste en amont de la NLS. Les

auteurs de ce travail ont montré que l’import nucléaire de Cdc25C était régulé par son interaction

avec l’importine β et/ou l’importine α/β. La phosphorylation de la T236 par la kinase CK2

diminue fortement l’interaction de Cdc25C avec les importines et conduit à une rétention

cytoplasmique de Cdc25C mais n’a aucune influence sur l’activité enzymatique de la phosphatase

(Schwindling et al., 2004). Les auteurs avaient alors proposé que la rétention cytoplasmique de

Cdc25C ne fût pas uniquement due à l’interaction de la phosphatase avec les protéines 14-3-3

Discussion

145



suite à la phosphorylation de la S216. Ce modèle était d’ailleurs renforcé par les études montrant

que la mutation de la S216 en un résidu non phosphorylable ne conduisait qu’à une accumulation

partielle de Cdc25C dans le noyau (Dalal et al., 1999; Graves et al., 2001). Nous proposons à

notre tour que la rétention cytoplasmique de Cdc25C soit contrôlée par plusieurs événements de

phosphorylation qui semblent être indépendants les uns des autres puisque l’invalidation d’un

seul de ces sites de phosphorylation conduit à une translocation nucléaire partielle de la

phosphatase.

Nous avons également montré que l’accumulation nucléaire du mutant S263A était

accompagnée d’une augmentation du nombre de cellules présentant une condensation

prématurée de la chromatine (PCC) similaire à celle observée lors de l’expression du mutant

S216A de Cdc25C. Il avait par ailleurs été montré que l’induction de PCC par Cdc25C nécessitait

la présence de la Cycline B1 accompagnée d’une déficience de la liaison aux 14-3-3 (Dalal et al.,

1999). De plus une étude structurale avait permis de proposer un modèle où la régulation de

Cdc25C serait dépendante de la compétition entre l’interaction avec les 14-3-3 ou la Cycline B.

L’interaction entre la boite P de la Cycline B et Cdc25C est nécessaire pour l’activation de

Cdc25C et la déphosphorylation de CDK1 lors de la transition G2/M. Ainsi en interphase les 14-

3-3 ont plus d’affinité pour la forme phosphorylée de la S216 et inactive la phosphatase de deux

manières : en masquant la NLS conduisant à sa séquestration cytoplasmique et en empêchant

l’interaction avec la Cycline B. Les auteurs proposaient alors que la dissociation entre 14-3-3 et

Cdc25C soit préliminaire à la déphosphorylation de la S216 (Morris et al., 2000).

Ces données bibliographiques ainsi que les résultats obtenus, nous conduisent à formuler les

questions suivantes : (i) les 14-3-3 interagissent-elle toujours avec Cdc25C(S263A) ? (ii) la

translocation nucléaire de Cdc25C(S263A) est-elle accompagnée d’une dissociation des 14-3-3,

comme dans le cas du mutant S216A ?

La réponse à ces questions permettrait d’appréhender le rôle de cet évènement de

phosphorylation lors de la régulation d’un cycle cellulaire normal. En effet, deux hypothèses

peuvent être envisagées. Tout d’abord la liaison avec les 14-3-3 est maintenue lors de la

relocalisation nucléaire de Cdc25C(S263A). La régulation de la localisation de Cdc25C par

l’intermédiaire de la phosphorylation de la S263 permet d’empêcher l’entrée prématurée des

cellules en mitose de manière indépendante de la liaison aux 14-3-3. Cette hypothèse mettrait

ainsi en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la phosphatase dépendant uniquement

de sa localisation intracellulaire. En revanche si la liaison aux 14-3-3 est dissociée, nous pourrions

alors proposer un mécanisme de régulation similaire à celui de la S216. Dans ce cas la

Discussion

146



phosphorylation de la S263 conduirait à la rétention cytoplasmique de Cdc25C et l’interaction

avec les 14-3-3 dans le cytoplasme permettrait de maintenir Cdc25C sous une forme inactive. Il

serait pour cela important d’analyser les activités catalytiques de la phosphatase phosphorylée sur

la S263 et du mutant S263A. Nous nous proposons également de réaliser des expériences de

“pull down” en utilisant des isoformes de 14-3-3 purifiés, sur lesquels on ferait passer des extraits

cellulaires transfectés par Cdc25C ou ses formes mutées non phosphorylables.

Tous ces résultats permettent de mettre en évidence une régulation complexe de la

phosphatase Cdc25C au cours d’un cycle cellulaire normal par un jeu de

phosphorylation/déphosphorylation.

Un alignement de séquence entre Cdc25B et Cdc25C a permis de montrer que la S263 est

située au niveau d’un des groupements d’acides aminés conservés entre ces deux protéines. Le

résidu équivalent chez Cdc25B est la S375 qui a été identifiée comme étant phosphorylée dans les

cellules en phase exponentielle de croissance (Bouché JP, en préparation). La S375 peut être

phosphorylée par de nombreuses kinases comme Chk1, pEg3, Aurora A et PKB/Akt (Baldin et

al., 2003; Dutertre et al., 2004; Mirey et al., 2005; Schmitt et al., 2006). Ces observations suggèrent

qu’au moins une de ces kinases pourraient phosphoryler la S263 de Cdc25C. Les essais de

phosphorylation in vitro par des kinases recombinantes que nous avons réalisé, nous ont permis

de confirmer que Cdc25C était phosphorylée par Chk1, CDK1-Cycline B, p42 et p44, MK-2 et

AuroraA. Cependant, nous n’avons pas encore été en mesure de déterminer quelles kinases

étaient impliquées spécifiquement dans la phosphorylation de la S263. Pour le savoir, les

anticorps anti-phosphospécifiques auraient été un bon outil. Afin d’appréhender le rôle de cette

phosphorylation dans la régulation de Cdc25C des lapins ont été immunisés avec un peptide de

synthèse présentant le site de phosphorylation de la S263. Cependant, malgré les différentes

étapes de purification à partir du sérum des lapins, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des

anticorps dont la spécificité puisse permettre la réalisation de ces expériences (Cf. Partie résultats

§III-1-B). Ainsi en attendant l’immunisation de nouveaux lapins, nous pourrions envisager de

réaliser des essais kinases in vitro sur une forme mutante non phosphorylable de la S263.

Nous avons également mis en évidence une phosphorylation de sur la S168 de Cdc25C en

réponse à un traitement génotoxique par l’étoposide. Les expériences d’immunofluorescence avec

des mutants de la S168 ne montrent aucun phénotype particulier au cours d’un cycle cellulaire

normal. Cependant en réponse à différents stress génotoxiques, un traitement H2O2 ou par

l’activation de la voie p38, nous avons pu observer un changement de comportement du mutant

Discussion

147



S168A sur la localisation intracellulaire de Cdc25C, qui semble être contrebalancé par le mutant

phospho-mimétique (S168E). Ces résultats nous permettent donc de proposer un rôle pour la

phosphorylation de la S168 dans la réponse cellulaire aux dommages et l’activation des points de

contrôle.

Cette hypothèse est renforcée par une étude antérieure qui avait déjà permis de mettre en

évidence que Cdc25C était phosphorylée sur la S168 en réponse aux rayonnements UV. Au cours

de cette analyse les auteurs ont montré que ce résidu était phosphorylé dans la cellule en réponse

aux dommages sur l’ADN et conduisait à une diminution de l’activité phosphatase de Cdc25C

liée a une activation du point de contrôle G2/M. Des études in vitro ont permis de proposer un

rôle de la kinase SAPK/JNK dans la phosphorylation de la S168 (Goss et al., 2003).

Une recherche dans les banques de données a aussi permis de mettre en évidence une forte

homologie de séquence entre les résidus du site consensus de la S168 de Cdc25C : pSPITTVP et

les résidus d’un site de phosphorylation sur la S364 de la MAP kinase phosphatase 1 (MKP1) :

pSPITTSPS. La phosphatase MKP1 est impliquée dans l’inhibition de la voie des MAPK, il a été

montré que les kinases p42MAPK et p44MAPK était impliquées dans cet évènement de

phosphorylation conduisant à la dégradation de MKP1 dépendante du protéasome (Brondello et

al., 1999). Les auteurs ont proposé à partir de ces résultats l’existence d’un mécanisme de contrôle

complexe de la voie ERK où, afin d’éviter une activation trop longue et non désirée des kinases

p42 et p44 (qui conduit à une inhibition de la progression cellulaire en réponse aux dommages)

celles-ci activent les phosphatases MKP1 qui entraînent leur dégradation. Ainsi, bien que nos

résultats aient été obtenus dans un contexte très différent, la régulation du point de contrôle

G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN, nous proposons que les kinases p42 et p44, lors de

l’activation du point de contrôle G2/M, puissent être impliquées dans la phosphorylation

inhibitrice de la S168. En effet, nous avons montré que la voie ERK était activée par l’étoposide,

que la S168 de Cdc25C est phosphorylée en réponse au traitement par l’étoposide et semble être

impliquée dans l’inhibition de la phosphatase en réponse aux stress et enfin que le site de la S168

est homologue d’un site de phosphorylation par les kinases p42 et p44. Pour aller plus loin nous

proposons un modèle similaire à celui de la régulation des phosphatases MKP1. En réponse aux

dommages sur l’ADN, les cascades de signalisation sont activées et en particulier la voie ERK. Ce

qui conduit à une activation prolongée des kinases p42 et p44 inhibant la progression du cycle

cellulaire, entre notament par la phosphorylation de la S168 de Cdc25C entraînant ainsi sa

dégradation. Pour renforcer cette hypothèse, nous pourrions envisager de co-traiter ou non les

cellules, transfectées par les différents mutants de la S168, avec un agent génotoxique et un

Discussion

148



inhibiteur spécifique de la voie des MAPK comme le PD98059. Nous pourrions également

étudier la stabilité de Cdc25C en réalisant des cinétiques à la suite d’un traitement génotoxique en

présence d’un inhibiteur de la synthèse protéique comme le cyclohéximide ou l’émétine.

Il serait également essentiel d’identifier les kinases responsables de cette phosphorylation dans

la cellule en réponse aux stress et de mieux comprendre quels sont les mécanismes d’inhibition de

la phosphatase en réponse aux stress. Nous pouvons bien sûr imaginer qu’à l’image de la

régulation de la phosphatase lors d’un cycle cellulaire normal, de nombreux mécanismes de

régulation coexistent. Pour cela la génération de lignées cellulaires stables conditionnelles

exprimant Cdc25C(S168A) ou Cdc25C(S168E) soumises a différent stress en présence des

inhibiteurs des principales voies de signalisation nous permettrait de mieux comprendre le rôle de

cette phosphorylation. D’autre part, l’utilisation d’anticorps spécifiques de cette phosphorylation

serait un atout considérable.

CONCLUSION GENERALE

Conclusion générale

150




151



Au cours des dernières années, les progrès dans la compréhension du cycle cellulaire et des

points de contrôle a permis de mettre en évidence le rôle critique joué par les modifications post-

traductionnelles dans la régulation des protéines. La multiplicité et la diversité du nombre de

MPT rendent cependant complexe l’étude de la régulation post-traductionnelle des régulateurs du

cycle cellulaire. Face à ce nouveau défi, le développement de la protéomique a permis de

proposer des approches alternatives et puissantes pour la détection et la caractérisation des MPT.

Ainsi l’utilisation appliquée de la protéomique pour l’étude des MPT semble être devenue une

technique de choix pour répondre aux enjeux actuels de l’étude et de la compréhension des

mécanismes régulant le cycle cellulaire.

Cependant, les résultats que nous avons obtenus au cours de cette étude à l’aide d’une

approche de protéomique globale de recherche sont loin d’être satisfaisants. Dans le but

d’atteindre notre premier objectif, c'est-à-dire l’identification de manière exhaustive tous les

évènements de phosphorylation ou de modification post-traductionnelle présents sur la

phosphatase Cdc25C, il sera important d’améliorer notre approche protéomique. Nous avons

pour cela proposé d’augmenter la quantité de protéine, de réaliser des hydrolyses enzymatiques

avec différentes protéases et d’utiliser des appareils plus performants afin d’améliorer le

recouvrement de séquence et d’augmenter le nombre de MPT identifiés. Il est également

envisageable de changer de stratégie et de préférer une combinaison d’approches spécifiques à

l’approche protéomique globale. Nous pourrions ainsi mettre en oeuvre des techniques

d’enrichissements par affinité, par exemple les colonnes IMAC ou TiO2 pour la recherche

spécifique des phosphorylations. Ces approches spécifiques présentent l’avantage d’être mieux

adaptées à l’identification et à la caractérisation des MPT. Elles nécessitent cependant de grandes

quantités de matériel et des traitements de l’échantillon qui peuvent être lourdes à mettre en

place. Ainsi il devra également être envisagé de changer de système d’expression de la protéine

pour améliorer le rendement de purification. Néanmoins le développement constant de nouveaux

spectromètres de masse accompagné de nouvelles stratégies d’analyse des MPT, fait de la

protéomique un outil de choix pour décoder des patrons de modifications et ainsi mieux

comprendre la régulation du cycle cellulaire.

Nous avons vu en effet au travers de l’analyse des phosphorylations de Cdc25C que plusieurs

kinases sont responsables de la phosphorylation de plusieurs sites et chaque site peut être

phosphorylé par des kinases différentes. Nous proposons une régulation complexe de la

phosphatase à travers la mise en place de patrons de phosphorylation ou de modification post-

traductionnelles. Nous pouvons en effet imaginer qu’une modification (phosphorylation ou


152



méthylation) à un moment donné puisse être à l’origine d’un changement conformationnel de

Cdc25C, permettant alors l’exposition d’autres sites de modification à d’autres enzymes actives à

ce moment précis du cycle cellulaire. Un aspect important dans l’analyse de la régulation de

Cdc25C au cours du cycle cellulaire et lors de l’activation des points de contrôle sera d’identifier

ces différents patrons, puis de comprendre l’information biologique qu’ils transmettent. C’est

pourquoi l’enjeu majeur de cette recherche sera de développer les outils nécessaire à l’analyse de

ces modifications, afin d’accéder à la compréhension de ces différents profils.

Au cours de cette étude, il est également ressorti que de multiples voies de signalisation

pouvaient être activées en réponse aux différents stress et que chaque stress pouvait activer une

ou plusieurs voies de signalisation. Ainsi, de nombreuses cascades de signalisation ont été mises

en évidence lors de l’activation du point de contrôle G2/M et contrôlant l’activité de Cdc25C,

comme par exemple les voies dépendantes des MAP kinases ou encore les voies dépendantes des

kinases ATM ou ATR. Un aspect important sur l’étude de la régulation des points de contrôle en

réponse aux dommages sur l’ADN serait de déterminer spécifiquement quelles cascades de

signalisation sont activées lors de la réponse cellulaire aux endommagements de l’ADN. En effet

l’activation spécifique d’une voie à la suite d’un traitement particulier parallèlement à la mise en

évidence d’un patron de modifications sur Cdc25 pourrait nous mener vers une meilleure

compréhension de la régulation des points de contrôle du cycle cellulaire.

Ainsi après la mise en évidence des différentes modifications impliquées dans la régulation

d’un acteur du cycle cellulaire, le développement d’outils spécifiques pour l’analyse de ces

modifications, comme l’utilisation d’anticorps dirigés spécifiquement contre les sites

phosphorylés, permettrait d’appréhender leur fonction. L’utilisation de ces outils permettra alors

de caractériser spécifiquement les éléments de modification impliqués dans les mécanismes de

régulation du cycle cellulaire et leurs interconnexions. Le décodage des modifications et de leurs

interconnexions permettra alors de décrypter les cascades de signalisation aboutissant aux patrons

spécifiques de phosphorylation sur les protéines effectrices. Une meilleure connaissance des

acteurs et de leurs rôles au cours de la régulation du cycle cellulaire permettra de mettre en

évidence de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement contre les cancers. En effet, les

enzymes régulatrices responsables de ces modifications post-traductionnelles pourrait être ciblées

par la recherche en industrie pharmaceutique dans le cadre du développement de nouvelles

thérapies contre le cancer.

MATERIELS ET METHODES

Matériel et méthodes

154




155



I- Analyse des protéines

I-1 : Western blot

Les extraits protéiques sont séparés par migration électrophorètique dans des gels précoulés 4-

12% Bis-Tris NuPAGE (invitrogen). Le gel est ensuite transféré sur une membrane de

nitrocellulose en milieu semi-sec. Après 1h de saturation de la membrane dans un tampon TBS

0,2%Tween 5% lait , la membrane est incubée à température ambiante pendant 1h avec les

anticorps primaires dilués dans le tampon de saturation : Anti-HA monoclonal (Roche) au

1/3000, anti-HA monoclonal clone 15CA5 (Babco) au 1/1000, anti-Cdc25C polyclonal clone

C20 (SantaCruz), anti-Cdc25C monoclonal clone TC15 au 1/3000 (Upstate). Après lavages dans

du TBS 0,2%Tween, la membrane est incubée 1h avec les anticorps secondaires : HRP-anti-

Mouse et HRP-anti-Rabbit (Cell Signaling) dilués au 1/5000 dans la solution de saturation de la

membrane.

I-2 : Immunofluorescence

I-2-A : Indirecte

Les cellules ensemencées sur des lamelles de verre sont lavées doucement avec du PBS pour

éliminer le milieu. Les cellules sont ensuite fixées 20 min à +4°C par 3,7% de formaldéhyde dans

du PBS et perméabilisées 5 min à température ambiante par 0,25% de triton X100 dans du PBS

et par du méthanol 10 min à -20°C. Après réhydratation des cellules dans du PBS 3% sérum, les

cellules sont saturées 1h à température ambiante avec du PBS 3% sérum. Les lamelles sont

ensuite incubées 1h à température ambiante avec les anticorps primaires dilués dans le tampon de

saturation des lamelles PBS 3% sérum : anti-HA monoclonal (Roche) 1/3000, anti-HA

monoclonal clone 15CA5 (Babco) 1/1000, anti-histone H3p (Upstate) 1/500. Après lavages, les

lamelles sont incubées 45min avec les anticorps secondaires couplé à un fluorochrome Alexa488-

anti-Mouse ou Alexa646-anti-Rabbit dilués au 1/800 dans le tampon de saturation des lamelles .

Les lamelles ont ensuite été incubées 10 min à température ambiante dans le noir avec 0,1µg/ml


156



de DAPI. Puis les lamelles sont montées, séchées après un bref lavage dans de l’H2OmQ, sur une

lame de verre dans du liquide de montage (Dako). Les cellules ont ensuite été observées avec un

microscope à fluorescence droit. (DM5000, Leica au LBCMCP et Zeiss chez SERVER).

I-2-B : Directe

Les cellules ensemencées sur des lamelles ont été rincées avec du PBS puis fixée et avec du

formaldéhyde 3,7% pendant 15 minutes puis perméabilisées avec du Triton X100 0,25%. Les

lamelles sont incubées avec 0,1µg/ml de DAPI et montées sur les lames de verre avec du lique de

montage (Dako). Les cellules ont ensuite été observées avec un microscope à fluorescence droit.

(DM5000, Leica au LBCMCP).

I-3 : Cytométrie en flux

Les culots cellulaires ont été fixés au moins 2h à -20°C avec 70% éthanol dans du PBS

1%BSA, puis perméabilisés 10min à +4°C avec 0,25% triton X100. Après lavages les culots

cellulaires ont été incubés avec l’anticorps primaire anti-Histone H3p polyclonal (Upstate) dilué au

1/400 dans du PBS 1%BSA, puis avec l’anticorps secondaire Alexa488-anti-Rabbit au 1/800

dans le noir pendant 30 min. Enfin après lavage des culots, les cellules ont été incubées 10min

avec une solution contenant 1µg/ml de RNAseA et 1µg/ml d’iodure de propydium (IP) et

transvasées dans les tubes à cytométrie. L’analyse a été réalisé : au LBMCP sur un cytomètre en

flux de type Becton Dickinson FACS Calibur et l’acquisition des donnée a été réalisée via le

logiciel CellQuest.

I-4 : Essais kinases in vitro

2µg de MBP-Cdc25C a été incubé dans 20µl de mélange réactionnel pour une incubation entre

30 et 60 min à 30°C. La réaction a été arrêtée avec l’ajout de tampon charge Laemmly 5 min à

95°C. Les échantillons ont ensuit été déposés sur un gel SDS-PAGE et autoradiographiés après

que le gel ait été préalablement séché.


157



Tampon kinase MK2 : 20mM Hepes NaOH pH 7,5 ; 10mM MgCl2 ; 50mM β-mercaptoéthanol;

100µg/ml BSA.

Tampon kinase Chk1 : 50mM Tris HCl pH 7,5 ; 10mM MgCl2 ; 1mM DTT.

Tampon kinase Aurora A : 50mM Tris HCl pH 7,5 ; 10mM MgCl2 ; 1mM DTT.; 25mM NaCl ;

0,01% Triton X100.

Tampon kinase P42 et p44 : 50mM Tris HCl pH 7,5 ; 10mM MgCl2 ; 1mM DTT.; 25mM NaCl.

Tampon kinase CDK1-Cycline B1 : 20mM MOPS pH 7,5 ; 15mM MgCl2 ; 25mM β-

glycérophosphate ; 1mM DTT ; 0,5mM EDTA ; 1mM EGTA.

Mélange réactionnel : Tampon kinase, 5µCi ATPγ32/33P, enzyme purifiée (environ 200ng),

2µg MBP-Cdc25C.

II- Culture cellulaire

II-1 : cellules U2OS

Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (Dubelco’s Modified Eagle’s Medieum) avec la

glutamine stabilisée à 4,5g/l de glucose ayant été complété par 10% SVF (Serum de veau Fœtal),

100U/ml de pénicilline, 100U/ml de streptomycine, 2µg/ml de tétracycline et 500µg/ml de

G418. Les cellules sont incubées à 37°C sous atmosphère humide contenant 5% de CO2.

Pour permettre l’expression de HA-Cdc25C-His les cellules ont été cultivées en absence de

tétracycline durant tout le temps de l’induction.

II-2 : Transfection transitoire

Les cellules U2OS à confluence ont été transfectées à l’aide de la solution V du kit AMAXA.

Des culots cellulaires contenant 1 à 5 106 cellules ont été repris avec 100µl de solution V

(AMAXA), puis transférés dans les cuves à électroporation et les cellules ont été soumises au

protocole adapté aux cellules U2OS X-010. Les cellules ont été directement reprises avec 500µl

de milieu de culture complet et ensemencées en fonction des besoins.


158



III- Extraction des protéines et purification

III-1 : Protocole classique

Le culot cellulaire est repris dans le tampon de lyse : 50mM Tris-HCl pH 7,5 ; 150mM NaCl ;

5mM EDTA ; 1% Triton X100 ; 1% NP40 ; 10mM NaF ; 2mM PMSF ; 2mM Na3VO4 ; 20µg/ml

Inhibiteur I de Calpaïne ; cocktail d’inhibiteurs de protéases (Roche) et il est incubé 1h à +4°C en

vortexant régulièrement. Les cellules sont centrifugée 15min à 15000g pour clarifier le lysat et le

surnageant est conservé et soumis à un dosage protéique suivant la technique de Bradford.

III-2 : Protocole adapté à la spectrométrie de masse et purifiactions

Les cellules sont lysées par lyse osmotique avec lavage bref avec de l’H2OmQ, puis reprises avec

de l’éthanol. Les cellules ont été culottées et le culot a été repris avec le tampon de dissolution

contenant 5mM d’imidazole. Le lysat a été centrifugé 10min à 12000g et le surnageant est

récupéré et dosé au Bradford.

Purification sur billes NiNTA agarose :

Les lysats sont ensuite incubés 2h à température ambiante avec une suspension de billes

NiNTA agarose (Qiagene) préalablement équilibrée avec le tampon SD5. Le mélange est ensuite

déposé sur une colonne vide et la colonne est lavée avec 3 volumes de SD5, puis éluée avec 2

volumes de tampon d’élution SD contenant 300mM d’imidazole. Les fractions d’élutions sont

alors poolées et précipitées sur la nuit avec 4 volumes d’acétone. Le culot final est alors repris

avec le tampon : 20mM Tris pH 8,0 ; 7,5M Urée ; 1,5M Thiourée ; 10mM DTT.

Purification sur billes anti-HA

La suspension de billes anti-HA (Roche) est préalablement équilibrée avec la solution de

renaturation. La solution de Cdc25C est diluée rapidement 8X dans la solution froide SR, ajoutée

aux billes et agitée sur la nuit à +4°C sur la roue. Après lavages HA-Cdc25C-His est éluée par du

tampon de charge Laemmli, chauffée à 95°C et déposée sur un gel NuPAGE (invitrogen).


159



Tampon de dissolution SD5 : Tris 20mM (pH 8,0) ; Urée 7,5M ; Thiourée 1,5M ; CHAPS

4% ;Spermine 20mM ; β-Mercapto Ethanol 5mM ; imidazole 5mM.

Solution de renaturation SR : Tris 20mM (pH 8,0) ; KCl 0,3M ; Arginine 0,5M (pH 8,0) ;

DTT 10mM.

IV- Protéomique

IV-1 : spectrométrie de masse

La bande colorée au bleu de coomassie colloïdal a été découpée du gel et soumise à une

digestion dans le gel par la trypsine (Promega). Les digestats tryptiques obtenu a été analysé par

un capillaire HPLC (LC Packings) couplé à un spectromètre de masse Qq-TOF nanospray

(QSTAR Pulsar, Applied Biosystems). Les peptides ont été séparés sur une colonne C18 Pep-

MapTM (75µm x 15cm) , après une pré-concentration sur une pré-colonne C18 (5mm x 3cm)

(LC Packings, Dionex) avce un débit de 200nl/min. Les peptides sont élués avec un gradient

linéaire 0-50% de solvant B pendant 100 min (solvant A : 0,2% d’acide formique dans 5%

d’acétonitrile et solvant B : 0,2% d’acide formique dans 5% d’acétonitrile). Le spectromètre de

masse est utilisé en mode positif avec une tension appliquée à l’aiguille de 2,1kV. Les données MS

et MS/MS sont acquises continuellement en mode IDA (information-dependant acquisition) avec des

cycles de 10 secondes. A chaque cycle, un spectre MS est accumulé pendant 1 seconde sur la

plage de masse 300-2000 m/z suivi de trois acquisitions MS/MS de 3 secondes chacune sur les

trois ions les plus abondant du spectre MS. Une exclusion dynamique de 60 secondes est utilisée

pour prévenir la sélection répétée d’un même ion. Les données MS/MS sont acquises avec une

fenêtre d’isolement de 3 m/z. L’énergie de collision est ajustée automatiquement en fonction de

l’état de charge et de la masse de l’ion précurseur et le gaz de collision est N2. Le moteur de

recherche MASCOT (Matrix Science, London) a été utilisé pour l’identification de la protéine et

des peptides modifiés.


160



IV-2 : Electrophorèse bidimensionnelle

La première dimension est établie sur le système IPGphor. Les IPG strips (pH 3-10 NL) sont

réhydratés par l’échantillon pendant 12h sous 50V à 20°C. L’échantillon est ensuite focalisé par

gradient de 50V à 500V en 1h, 500-1000V en 1h, 1000-8000V 3h suivi d’un pallier 8000V 1h.

Immédiatement avant la deuxième dimension, l’IPG strip est incubée dans 5ml de 50mM Tris-

HCl, 6M urée, 2% SDS, 30% glycérol et 65mM DTT pendant 15 minutes sous agitation

continue, suivie de 15 minutes dans le même tampon où le DTT est remplacé par 2,5%

d’iodoacétamide. Les protéines sont ensuite séparées dans une deuxième dimension SDS-PAGE

au moyen du système SE600 (Pharmacia).sur des gels d’acrylamide 12%. La migration est arrêté

après 4h à 160V et les protéines sont détéctées par western blot.

ANNEXES

Annexes

162



Annexes

163



Annexe 1 : Spèctre de MS/MS de l’arginine 35 méthylée

L’annexe 1 représente le spectre MS/MS du peptide 28-MLNLLLER-35 portant une

méthylation [ions parental doublement chargé (MH2)2+ à m/z 508,3]. Les ions fragments observés

confirment la séquence du peptide et la présence d’un groupement méthyl. Localisé. L’ion y2

(m/z 318,2) confirme la présence d’une méthylation sur le résidu R35.

Annexes

164



Annexe 2 : Spèctre MS/MS de la phosphorylation sur la T268 ou T270

L’annexe 2 représente le spectre MS/MS du peptide monophosphorylé 261-

TVSLCDITITQMLEEDSNQGHLIGDSFK-288 [Ion parental triplement chargé, (MH3)3+ à

m/z 1083,2]. Les ions fragments observés confirment la séquence du peptide ainsi que la

présence d’un groupement phosphate sur le peptide. La série des ions y et l’ion fragment b4 (m/z

401,24) montrent que les résidus S277, S287, T261 et S263 ne portent pas de groupement

phosphate. Le spectre MS/MS ne nous permet pas de conclure sur la position de la

phosphorylation entre les résidus T268 et T270.

Annexes

165



Annexe 3 : Article

Annexes

166



Annexes

167



Annexes

168



Annexes

169



Annexes

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Annexes

171



Bibliographie

172



Bibliographie

173



BIBLIOGRAPHIE

Bibliographie

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Charlotte Mailhat-Esmenjaud

Etudes des modifications post-traductionnelles de la phosphatase Cdc25C lors de la régulation de la transition G2/M du cycle

cellulaire

Directeur de thèse : Bernard Ducommun

Résumé :

La phosphatase Cdc25C est un acteur critique de la progression du cycle cellulaire par son rôle

jouée dans le contrôle de l’activation du complexe CDK1-Cycline B lors de l’entrée en mitose et

de la mise en place des mécanismes de surveillance. Son activité est régulée par de nombreuses

kinases impliquées dans les cascades de signalisation cellulaire résultant dans la phosphorylation

de nombreux résidus. Au cours de cette étude, nous avons purifié Cdc25C à partir de cellules

humaines et réalisé une approche protéomique globale dans le but d’identifier de nouvelles

modifications régulatrices. Nous présentons dans ce manuscrit la mise au point des conditions de

purification de la phosphatase et les différentes modifications post-traductionnelles que nous

avons identifiées par spectrométrie de masse, en particulier deux phosphorylations sur les résidus

S168 et S263 et une méthylation sur le résidu R35. Pour terminer nous avons réalisé une analyse

fonctionnelle des phosphorylations sur les S168 et S263. Nous avons montré par imagerie

cellulaire que la mutation de la S263 en alanine conduisait à l’accumulation nucléaire de Cdc25C.

Nous proposons ainsi que la phosphorylation de la S263 soit impliquée dans un mécanisme de

régulation qui module l’import nucléaire de Cdc25C.

Mots clés :

Cycle cellulaire, points de contrôle, Cdc25C, phosphatase, modification post-traductionnelle, localisation.

Discipline administrative :

Biologie Cellulaire et Moléculaire

Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération

Université Paul Sabatier- CNRS- UMR5088- IFR109 118 route de Narbonne - Bâtiment 4R3 entrée B1

31062 TOULOUSE cedex 9

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