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UNIVERSITE de TOULOUSE III – PAUL SABATIER Ecole Doctorale GEET

THESE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE Délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier

Discipline : Anatomie et Imagerie en Médecine

présentée et soutenue

par

Frédéric LAUWERS

Le 17/12/2007

ETUDE QUANTITATIVE TRIDIMENSIONNELLE DU RESEAU MICRO-VASCULAIRE DU CORTEX

CEREBRAL HUMAIN

Directeur de thèse : Jean-Pierre Marc-Vergnes JURY Me Isabelle Berry Président Mr Jacques Roland Rapporteur Mr Grégoire Malandain Rapporteur Mr Jean-Pierre Marc-Vergnes Directeur Mr Henri Duvernoy Examinateu r Mr Francis Cassot Examinateur Mr Jacques Moscovici Membre invité

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INTRODUCTION 4

ORGANISATION DU MANUSCRIT 5

1 MATERIELS ET METHODES 7

1.1 MATERIEL ANATOMIQUE 7

1.2 CONSTRUCTION DES MOSAÏQUES 9 1.2.1 ACQUISITION DES DONNEES EN MICROSCOPIE CONFOCALE 9 1.2.2 TRAITEMENT DES BLOCS 10 1.2.3 RECALAGE DES BLOCS 11

1.3 SEGMENTATION DU RESEAU VASCULAIRE . 15 1.3.1 SEUILLAGE DE LA MOSAÏQUE 15 1.3.2 MASQUAGE 15 1.3.3 CARTE DE DISTANCES ET EXTRACTION DE LA LIGNE CENTRALE 16

2 ANALYSE DU RESEAU SEGMENTE -CONNECTIVITE. 19

2.1 DEFINITIONS 19

2.2 CONNECTIVITE 19

3 MORPHOMETRIE ELEMENTAIRE 23

4 DIAMETRES ET LONGUEURS 28

4.1 CARACTERISTIQUES DES DISTRIBUTIONS DES DIAMETRES ET DES LONGUEURS : 28 4.1.1 HISTOGRAMME DES LONGUEURS 28 4.1.2 HISTOGRAMME DES DIAMETRES 29

4.2 COMPARAISONS DES DIAMETRES 29 4.2.1 REGION PAR REGION : LATERAL, MEDIAL , SOMMET, BASE 29 4.2.2 COUPE PAR COUPE (V16, V17, V18) 30

4.3 DIAMETRES ET LONGUEURS CAPILLAIRES 31

5 ANALYSE DES STRUCTURES ARBORESCENTES 33

5.1 EXTRACTION DES ARBORESCENCES DU RESEAU 33 5.1.1 METHODES 33 5.1.2 RESULTATS 34

5.2 DIFFERENCIATION ARTERIO -VEINEUSE 38 5.2.1 METHODES 38 5.2.2 RESULTATS 43

5.2.2.1 Différenciation artério-veineuse et classification 43 5.2.2.2 Distribution artério-veineuse 50

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5.3 ANALYSE TOPOLOGIQUE 55 5.3.1 DESCRIPTION GENERALE 55 5.3.2 APPLICATION AUX VAISSEAUX DU CORTEX CEREBRAL 56

5.3.2.1 Notion de groupe – Classification des arborescences selon Strahler-Kassab 56 5.3.2.2 Apport de l’analyse topologique dans la discrimination artério-veineuse 60

5.3.3 ESSAI DE GENERALISATION DES LOIS DE HORTON 65 5.3.3.1 Rappel 65 5.3.3.2 Bases du raisonnement : analyse des lois de Horton « expérimentales » 66 5.3.3.3 Généralisation à l’ensemble des arborescences : lois de Horton généralisées 67 5.3.3.4 Mise en évidence des lois généralisées pour N, L, D quelle que soit l’arborescence 68 5.3.3.5 Comparaison des lois généralisées aux données expérimentales. Ajustement final des paramètres 69 5.3.3.6 Analyse des écarts entre les variables réelles et leurs valeurs prédites par les lois de Horton généralisées 71

5.3.4 POUR CONCLURE CETTE SECTION 72

5.4 ANALYSE TYPOLOGIQUE ET MORPHOMETRIQUE DES BIFURCATIONS 73 5.4.1 DEFINITIONS ET METHODES 73 5.4.2 RESULTATS 74

5.4.2.1 Répartition des bifurcations 74 5.4.2.2 Statistique descriptive 75 5.4.2.3 Analyse des distributions statistiques 76

5.4.3 EN CONCLUSION DE CE CHAPITRE 78

6 ANALYSE SPATIALE DE LA DENSITE VASCULAIRE 80

6.1 CARTES DE DENSITE 80 6.2 ANALYSE DE LA DENSITE EN FONCTION DE LA PROFONDEUR 82 6.3 ANALYSE DE LA DENSITE TANGENTIELLEMENT A LA SURFACE DU CORTEX 86

7 ELEMENTS DE DISCUSSION – PERSPECTIVES METHODOLOGIQUES 89

8 PERSPECTIVES D’APPLICATIONS ET CONCLUSION 93

8.1 IMAGERIE FONCTIONNELLE 93 8.2 DIFFUSION DE L ’OXYGENE 94 8.3 ANGIOGENESE NORMALE ET PATHOLOGIQUE 95

CONCLUSION 96

INDEX 97

BIBLIOGRAPHIE 100

A NOVEL THREE-DIMENSIONAL COMPUTER-ASSISTED METHOD FOR A QUANTITATIVE STUDY OF MICROVASCULAR NETWORKS OF THE HUMAN CEREBRAL CORTEX Microcirculation , 13: 15–32, 2006 109 MORPHOMETRY OF THE HUMAN CEREBRAL CORTEX MICROCIRCU LATION: GENERAL CHARACTERISTICS AND SPACE-RELATED PROFILES. Neuroimage 127

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INTRODUCTION Ce travail consiste en une étude quantitative du réseau micro-vasculaire du cortex cérébral humain. Il s’inscrit dans la thématique de l’unité 825 de l’INSERM développée autour de l’imagerie neuro-fonctionnelle. Dans ce domaine particulier, la microcirculation du cortex est le trait d’union singulier entre l’activation neuronale et le signal enregistré. Nous ne disposons pas actuellement de données anatomiques suffisantes qui permettraient de formaliser les modifications physiologiques de la microcirculation qui sous-tendent les hypothèses posées par le paradigme d’activation cérébrale. La modélisation mathématique du réseau vasculaire cortical humain est probablement aujourd’hui une étape nécessaire à la compréhension du système. Cette approche intégrée a déjà servi l’étude de la macrocirculation cérébrale (18) et fait la preuve de son intérêt dans d’autres domaines de la microcirculation puisque certains modèles ont été validés in vivo (mésentère de rat) (117). Dans le domaine de la microcirculation, le manque d’informations anatomiques, quantitatives, tridimensionnelles, précises est un problème récurrent. Sans vouloir en dresser une liste exhaustive, ces informations sont indispensables à la compréhension de nombreux phénomènes physiologiques ou physiopathologiques. La distribution des pressions et les contraintes de cisaillement dans les micro-vaisseaux (120), le transport et la diffusion de l’oxygène et autres métabolites ou agents thérapeutiques dans les systèmes physiologiques (10, 113) sont étroitement liés à l’architecture du réseau micro-vasculaire. L’anatomie de la microcirculation influence la régulation du débit sanguin, l’angiogénèse et le remodelage vasculaire (17, 82), et l’adaptation immédiate ou progressive du lit vasculaire en réponse à la demande fonctionnelle des tissus (119), comme elle influence les variations du débit sanguin liées à l’activité neuronale. L’anatomie de la microcirculation influence aussi l’interprétation des images fonctionnelles basées sur l’enregistrement de telles variations hémodynamiques (4, 54, 64, 88, 142). Dans tous ces domaines, de nombreux chercheurs ont mis l’accent sur le rôle fondamental de l’architecture du réseau et sur la nécessité de traiter ce sujet dans sa dimension anatomique, proprement tridimensionnelle (149). Cependant, pour des raisons essentiellement d’ordre technique, les études micro-anatomiques chez l’homme sont rares (12) et il n’existe dans la littérature que peu de données quantitatives concernant le réseau micro-vasculaire du cortex cérébral humain. En effet, si la « macrocirculation » du système nerveux central a fait l’objet de très nombreux travaux (79, 80), l’essentiel de nos connaissances concernant les vaisseaux du cortex cérébral humain provient des écrits de Duvernoy (34-36). Henri Duvernoy a décrit les principales caractéristiques des vaisseaux du cerveau humain depuis le réseau pie-mérien jusqu’aux couches profondes du cortex. A partir de ses observations il a proposé une organisation fonctionnelle du réseau et décrit une unité vasculaire centrée par une veine et entourée par une couronne artérielle. Les informations quantitatives et qualitatives proposées nécessitent d’être complétées notamment d’un point de vue topologique. Les réseaux vasculaires pulmonaires (44, 59, 67, 69, 136, 148) et coronaires cardiaques (9, 70, 99, 155) ont été à la base des développements les plus récents en matière

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d’évaluation quantitative. Kassab a notamment mis en avant plusieurs approches innovantes pour l’étude des arborescences vasculaires (70, 71). L’un des éléments les plus marquants de la microcirculation du cortex cérébral est sa complexité géométrique associée à sa nature proprement tridimensionnelle. Des comparaisons entre les résultats obtenus en morphométrie 2D et 3D ont montré que seule une information tridimensionnelle pouvait permettre d’acquérir des données fiables sur les réseaux complexes, les techniques bidimensionnelles devant se cantonner à l’analyse de réseaux plats (bidimensionnels) pour éviter la sous-estimation des paramètres étudiés (97). Au moment où nous écrivons ces lignes peu d’études anatomiques tridimensionnelles ont été publiées concernant le cortex cérébral. Certaines approches originales ont cependant vu le jour (29, 55) concernant la numérisation de grands échantillons du réseau vasculaire cortical chez l’animal. Des résultats quantitatifs en sont issus (125). Au regard des règles méthodologiques imposées, aucune étude, à notre connaissance, n’a concerné le cerveau humain. D’autre part, la mise en évidence d’une potentielle organisation du réseau vasculaire à l’échelle de l’architecture fonctionnelle neuronale requiert une surface critique qui pourrait être estimée aux alentours de 10 millimètres carrés (143). L’objectif de ce travail est d’introduire une méthode d’analyse numérique tridimensionnelle des vaisseaux du cortex cérébral humain permettant d’obtenir les données morphométriques et topologiques pertinentes, indispensables à une approche biomécanique du système. ORGANISATION DU MANUSCRIT La première partie décrit les différentes étapes qui permettent de passer du cerveau à l’image virtuelle tridimensionnelle, incluant la préparation anatomique, l’acquisition des images en microscopie confocale et la segmentation des vaisseaux. Les développements qui suivent s’en tiennent à vérifier la précision de la méthode et contribuent à sa validation à travers une étude morphométrique du réseau dans sa globalité. Une troisième partie concerne l’étude des artères et des veines du cortex cérébral. Nous verrons que la discrimination entre artères et veines reste un problème incomplètement résolu à l’échelle d’un matériel anatomique inerte. Cette séparation des vaisseaux est incontournable pour avancer dans la compréhension du réseau. Dans cette section sont décrits les principes de l’étude topologique des arborescences et leurs perspectives en termes de modélisation sont illustrées par un essai de généralisation des lois qui gouvernent cette organisation topologique. L’analyse des bifurcations vasculaires fait suite à l’étude topologique des arborescences. En effet, la classification des bifurcations tient compte de cet aspect. Les résultats préliminaires concernant la population globale des arborescences, les artères et les veines en particulier, sont présentés. Le dernier chapitre de ce manuscrit s’intéresse à la distribution spatiale du réseau de manière quantitative. Le paramètre étudié est la densité vasculaire et ses variations en fonction de la profondeur corticale mais également dans un plan parallèle à la surface cérébrale. Dans cette étude les populations capillaires et arborescentes sont séparées, ceci permet de décrire la contribution relative de chacune d’entre elles à l’organisation laminaire du cortex dans les deux plans de

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l’espace définis préalablement. Les résultats obtenus sont discutés et leurs implications en matière d’imagerie fonctionnelle font l’objet d’une réflexion particulière. La discussion qui conclu ce travail développe les perspectives qui s’ensuivent, leur portée scientifique en matière de recherche anatomique et les enjeux biomédicaux qui en dépendent. S’agissant d’une approche méthodologique originale, ces perspectives dépassent le domaine d’applications qui leur est donné ici. Le cortex cérébral est un champ d’investigation pérenne, la masse de données traitées à l’occasion de cette thèse a souvent dérouté le matériel informatique utilisé, nous restons pourtant, à l’échelle du cortex, dans l’infiniment petit.

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1 MATERIELS ET METHODES

1.1 MATERIEL ANATOMIQUE

Les 3 coupes que nous avons utilisées sont issues d u cerveau d’une femme de 65 ans décédée depuis 2 heures d’un lympho me digestif. L’injection a été réalisée selon le protocole décri t ci-après en 1978 par Henri Duvernoy à Besançon. Le prélèvement cérébral est réalisé par une craniotomie circulaire du pôle frontal au pôle occipital. D’abord à la scie pour la table externe puis au ciseau à frapper pour la table interne afin d’épargner la dure-mère d’une blessure potentielle. Le volet calvarial est prudemment détaché de la dure-mère. L’intégrité de celle-ci est un facteur prépondérant de la réussite de l’injection. Le décollement est poursuivi au niveau de la base d’avant en arrière. Les pédicules nerveux et vasculaires sont sectionnés au fur et à mesure. La tente du cervelet est désinsérée de ses attaches osseuses et laissée avec la préparation. Les artères carotides internes et vertébrales sont individualisées et canulées en vue de l’injection. Les canules sont des cathéters en polyéthylène de 1,7 à 2 mm de diamètre interne, un trocard mousse est introduit dans chaque artère et maintenu par une ligature solide. L’injection est réalisée alors que le cerveau est suspendu dans un bac d’eau courante tiède. Selon l’auteur la phase de rinçage utilisant du sérum physiologique tiède n’est pas impérative dans la mesure où l’injection a lieu dans des délais post-mortem normaux (inférieur à 6 heures). Cependant un rinçage succinct permet d’observer le cerveau blanchir et d’estimer la qualité du lit vasculaire. Le retour veineux est habituellement très rapide. Préparation de la solution d’injection (400 cc) : On injectera 100 cc de solution par chaque tronc artériel à l’aide d’une seringue en verre de 100 cc. Dans un premier temps on dissout la gélatine à froid dans 200 cc d’eau distillée (10 % de gélatine Gépulver®, laboratoire Merck). Le mélange est battu jusqu’à l’obtention d’un liquide homogène puis chauffé progressivement et maintenu à une température constante de 45° au bain-marie. On ajoute alors à ce premier volume 200 cc d’encre de Chine (Pélikan® noir). La solution parfaitement homogène est gardée à température constante (45°). Les 4 artères sont injectées successivement en clampant tour à tour celles qui ne sont pas utilisées. La pression d’injection n’est pas mesurée, l’injection est manuelle, la pression est forte (subjectif). On observe le cerveau noircir. En fin d’injection les 4 canules sont clampées à l’aide de pinces hémostatiques. Le cerveau injecté est laissé dans un bain d’eau courante froide pour une durée de 4 heures au minimum. Ceci permet la prise de la gélatine. A l’issue de cette phase de refroidissement les canules sont coupées et la phase de fixation est envisagée. Le cerveau injecté est suspendu dans un récipient contenant une solution de 10 litres de formol à 10 %. Pour améliorer la fixation dans les zones les plus profondes, la même solution est injectée dans le système ventriculaire au niveau des cornes frontales des ventricules latéraux. Un trocard est introduit progressivement dans la région orbitaire, le piston de la seringue descend spontanément dès que la corne frontale est atteinte.

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Cette phase de fixation dure 45 jours. Le cerveau est alors lavé à l’eau courante. La fixation au formol s’associe à une rétraction globale de la pièce anatomique. Des blocs de 1 cm d’épaisseur sont découpés pour êt re inclus en paraffine. Idéalement une section sagittale médiane permet de localiser les 2 commissures et de réaliser les coupes ultérieures à partir de ces repères. H. Duvernoy a traité le cerveau dont les coupes que nous utilisons sont issues en sections coronales totales sans référence directe au “plan bi-commissural”. Les blocs de 1 cm d’épaisseur sont plongés dans un bain d’alcool à 97 % changé tous les 5 jours. La manœuvre est répétée 4 à 5 fois. Enfin ces blocs sont passés dans 2 bains successifs d’alcool absolu à 2 jours d’intervalle. Les pièces sont alors trempées dans des bains de toluène changés tous les 4 jours. Quatre bains successifs sont au minimum nécessaires pour envisager l’inclusion en paraffine. Deux bains de paraffine à l’étuve à 57° sont suffis ants. La pièce est alors incluse dans un volume de paraffine adapté à sa taille et refroidie. Les coupes sont réalisées par un microtome permettant de traiter des organes entier (Leica®). La réalisation de coupes paraffinées épaisses (350 à 400 µm) est délicate. Elle nécessite un chauffage prudent de la surface du bloc à l’aide d’un bec-bunsen. La coupe obtenue est étalée sur une plaque en verre préalablement nettoyée et dégraissée, enduite d’une solution de gélatine à 5 % et posée sur une plaque chauffante. Les coupes étalées sur leur lame vont subir une étape de diaphanisation qui consiste à les rendre transparentes de façon à obtenir un meilleur contraste, une meilleure visualisation de l’arbre vasculaire injecté aux dépends du tissu cérébral proprement dit. Un premier temps consiste à enlever la paraffine par des bains successifs de toluène. Au moins 3 bains sont nécessaires à 4 jours d’intervalle. La solution de Spalteholz consiste en un mélange de salicylate de méthyl et de benzoate de benzyl dans des proportions respectives de 3 volumes pour 2. Deux bains sont habituellement suffisants, à quelques jours d’intervalle. Dès lors la coupe diaphanisée, étalée sur sa lame, est séchée à l’air. Une lamelle de dimension adaptée est posée après interposition d’une quantité suffisante de baume du Canada. La mise en forme d’une coupe selon cette technique nécessite donc au minimum 3,5 mois entre le moment où le cerveau est prélevé et le moment où la coupe est prête pour une observation microscopique. C’est une technique longue et minutieuse qui nécessite une certaine habitude. Selon Duvernoy qui a injecté et conditionné lui-même plusieurs centaines de cerveaux, le temps le plus aléatoire reste celui de l’injection proprement dite. Le facteur le plus favorable à un résultat satisfaisant est le délai d’injection post-mortem qui ne doit pas dépasser 6 heures. L’âge et les causes du décès jouent également un rôle prépondérant. Le problème de la rétraction inhérent à certaines étapes de cette technique de préparation n’a pas fait l’objet d’une quantification précise. Il est toutefois nécessaire d’en tenir compte dès que sont abordées des données chiffrées. Les coupes utilisées pour notre étude sont numérotées 231 V16, V17 et V18. Le premier nombre correspond au numéro chronologique du cerveau injecté (231e cerveau injecté). Le chiffre et le nombre qui suivent correspondent au numéro de la coupe dans le cerveau. Il s’agit de coupes frontales passant par la commissure postérieure. La zone que nous avons sélectionnée avec H. Duvernoy est située

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au niveau du lobe temporal de part et d’autre du sillon collatéral (gyrus temporo-occipital médial (para-hippocampal) en médial et gyrus temporo-occipital latéral (fusiforme) en latéral). Cette zone a été choisie pour l’excellente qualité de l’injection à ce niveau et l’orientation préférentielle des vaisseaux, la coupe paraissant orthogonale au plan de la surface corticale.

1.2 CONSTRUCTION DES MOSAÏQUES

1.2.1 Acquisition des données en microscopie confoc ale L’utilisation du microscope confocal en réflexion n’est pas commune (109). Habituellement ce matériel est utilisé en fluorescence. Sans entrer précisément dans des principes énoncés par ailleurs (40), les notions suivantes marquent l’originalité du système par rapport à la microscopie optique conventionnelle :

- illumination d’une petite zone de l’échantillon par une source laser monochromatique à forte luminosité (meilleure résolution latérale),

- passage de la lumière réfléchie par un diaphragme (pinhole) permettant de sélectionner avec précision le plan focal d’acquisition et donc d’éliminer toute lumière qui ne provient pas du plan focal (meilleure résolution axiale),

- balayage de l’échantillon par une micromécanique de balayage optique de précision, ligne par ligne et plan par plan,

- couplage du microscope à un système informatique nécessaire à l’acquisition, au traitement et au stockage des images,

Au total, le microscope confocal à balayage laser e st un “microtome opto-digital” qui permet de générer des coupes optiques jointives digitalisées en 2D pixel par pixel. L’acquisition des images a été réalisée au Centre de Biologie du Développement de l’Université Paul Sabatier sur un microscope confocal Zeiss LSM 410 avec un laser de 543 nm de longueur d’onde et un objectif de grossissement 20x, possédant une ouverture numérique de 0.75 (Zeiss Plan-Apochromat). Les paramètres d’acquisitions choisis sont un compromis tenant compte de la résolution de l’image, la taille des plus petits vaisseaux, le volume de cortex à numériser et le temps d’acquisition. Les plus petites structures qui composent le réseau vasculaire du cortex cérébral ont un diamètre de 3µ.

- Résolution latérale de l’image : l’objectif utilisé couvre une zone de 625µ x 625µ. Une matrice de 512 par 512 donne une résolution latérale de 1.22µ x 1.22µ suffisante pour visualiser des vaisseaux dont le diamètre est supérieur à 2.45µ (Théorème de Niquyst-Shannon),

- Résolution axiale : les coupes de Duvernoy ont une épaisseur d’environ 300µ, cependant quels que soient la résolution et l’objectif utilisés, au-delà de 200µ le rapport signal sur bruit se dégrade jusqu’à ne plus permettre l’identification des vaisseaux. Les 200µ exploitables sont numérisés avec un pas de 3µ en 70 coupes numérotées de 0 à 69. Ce pas de 3µ peut théoriquement générer un effet de volume partiel sur des structures de petite taille (≤ 3µ) mais de tels vaisseaux sont rares et encore plus rarement situés strictement parallèlement au plan de coupe. Ce compromis d’acquisition est donc choisi car il

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représente d’une part, un temps d’acquisition raisonnable et d’autre part, une taille de fichier acceptable.

Chaque pile d’images constitue un bloc (512 x 512 x 70) représentant un volume de 625 µ x 625µ x 207µ, la taille du voxel est de 1.22 µ x 1.22µ x 3µ. Dans la mesure où le volume d’acquisition est limité dans la profondeur (z = 207µ), il est développé dans le plan (x ; y) de telle sorte que nous acquérons une mosaïque de blocs représentant une grande surface de cortex. La platine du microscope a été équipée d’un système de déplacement par vis micrométrique (Linear Encoder Heidenhain LS646C, Display Unit ND720). Ce système permet de maîtriser les mouvements de la platine en x et en y avec une précision d’environ 5µ. L’acquisition de la mosaïque est réalisée ligne par ligne, en respectant environ 50 voxels de superposition entre 2 blocs adjacents (en x et en y) pour faciliter le recalage ultérieur des images de la mosaïque. Chaque étape est consignée sur un cahier de numérisation où sont enregistrés le nom de chaque bloc comportant un code chiffre pour la ligne et un code lettre pour la colonne et donc sa position dans la mosaïque. Les paramètres de contraste et de luminosité ne sont pas modifiés pendant l’acquisition. La surface de la coupe n’étant pas strictement horizontale une mise à niveau est réalisée régulièrement afin d’éviter un certain degré de dérive en z. Le temps d’acquisition est d’environ 7mn incluant le temps de numérisation, d’enregistrement et les manœuvres de déplacement nécessaires avec leur degré de précision. Les données sont stockées sur un disque dur. Chaque image représente 258 Ko, chaque bloc de 70 images représente 17.5 Mo. Les systèmes de visualisation inclus dans le software du microscope confocal permettent de visualiser les blocs de diverses façons notamment en image stéréoscopique ou en codage couleur de la profondeur. En fait, à ce stade, les blocs sont directement traités par un logiciel d’image 3D : ResolveRT 4.0 (Amira Mercury TGS, Merignac, France, San Diego, USA, Zuse Institute, Berlin, Germany). 142 blocs ont été numérisés sur la coupe V16, 143 sur la coupe V17 et 218 sur la coupe V18 qui a bénéficié d’une extension au niveau de la base du gyrus temporo-occipital latéral. A partir de ces acquisitions 10 mosaïques ont été construites.

1.2.2 Traitement des blocs La construction des mosaïques et la segmentation ultérieures du réseau vasculaire nécessitent un filtrage préalable des blocs. Tout d’abord, un filtre médian 2D permet une diminution globale du bruit lié au microscope. Ensuite, afin de compenser la perte de luminosité dans les coupes les plus profondes, un pré-seuillage est réalisé. Ce seuillage est variable en fonction de la profondeur z et consiste en une fonction arithmétique définie pour chaque point par A = a(a > s (z)), où a est la valeur pour un point (x, y, z), et s (z) est une fonction linéaire croissante de z. Pour la plupart des blocs la fonction utilisée est la suivante :

×+⟩207

2060

zaa

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1 Une coupe appartenant à un bloc avant seuillage (à gauche),

Après application d’un seuil variable (au centre), Projection des 70 coupes du bloc après seuillage (à droite)

Cependant, des corrections plus importantes ont été nécessaires sur certains blocs, probablement en raison de modifications intempestives des paramètres de contraste et de luminosité (ou de variation du pinhole) en cours d’acquisition. Enfin, certaines zones de la coupe V18 ont été numérisées à 4 ans d’intervalle et nous avons pu observer une variation de l’intensité lumineuse des images au détriment de leur partie inférieure notamment. Ceci est probablement dû à la dégradation des qualités optiques du microscope utilisé. Une étude des variations d’intensité en x et en y a conduit à une correction spécifique de ce problème par la fonction arithmétique ci-après :

( )( )263264 10.082.510.1375.1110.4023.110.661.81

099.120

jjii

a−−−− −+−+

+

1 ≤ i ≤ 512 1 ≤ j ≤ 512

1.2.3 Recalage des blocs L’ensemble de ces étapes et sont décrites dans la thèse de Céline Fouard (40) et dans les articles scientifiques qui en découlent (39, 41). La notion de mosaïque tridimensionnelle s’impose à l’analyse de grand volume de cortex dans la mesure où le champ du microscope confocal n’est pas assez étendu pour pouvoir observer l’ensemble de l’échantillon en une seule fois. Le système de déplacement de la platine par vis micrométrique n’est pas toujours d’une précision suffisante. La simple juxtaposition des blocs à partir des déplacements enregistrés sur le système de déplacement fait apparaître des erreurs qui peuvent se cumuler au fur et à mesure de la construction des mosaïques. Lors de l’acquisition des images, un recouvrement partiel d’environ 10% de la taille des images (environ 50 voxels) permet le réalignement. Celui-ci est réalisé automatiquement par une technique de corrélation où la position de deux images adjacentes est estimée en optimisant les résultats d’une mesure de similarité sur la zone de recouvrement (voir Céline Fouard). Le recalage est réalisé d’abord dans le plan XY. Pour ce recalage planaire, les projections en maximum d’intensité des images (ou MIP pour Maximum Intensity Projection) sont utilisées. Dans le plan Z les images présentent une légère déviation. Celle-ci est due au fait que la surface de la coupe n’est pas strictement parallèle à la lamelle de la préparation. Lors de l’acquisition, ce paramètre est pris en compte et une mise au point est réalisée régulièrement de telle sorte que la numérisation commence au niveau des premiers vaisseaux visibles. Ces mises au point successives induisent un décalage dans la direction Z qui est corrigé avec le même principe.

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2 A gauche : noter les zones de superposition qui permette le recalage des blocs. Au centre et à

droite : appréciation de la qualité du recalage sous différentes modalités.

Cette méthode de recalage fonctionne correctement dès lors que les blocs d’images traités sont totalement homogènes en termes d’acquisition et de prétraitement. Au cours de ce travail certains blocs ont été numérisés à plusieurs années d’intervalle et il est probable que les qualités optiques du microscope utilisé voire certaines modifications des paramètres d’acquisition aient pu induire un certain degré d’anisotropie rendant impossible le recalage automatique. Dans ces cas-là, le recalage a été réalisé manuellement en utilisant le logiciel ImagePro et en acceptant le meilleur compromis. Les coordonnées obtenues pour chaque bloc ont été reportées dans ResolveRT pour la suite du traitement. Le système de recalage automatique est parfois tenu en échec pour les mosaïques de très grande taille. Après plusieurs essais, cette constatation est l’un des éléments qui a conduit à découper le cortex étudié en plusieurs zones. Les autres raisons de cette décision étant la limitation propre de la mémoire des ordinateurs utilisés ne permettant pas de manipuler des mosaïques trop importantes, la géométrie du cortex numérisé qui a finalement imposé ce découpage sur des critères anatomiques évidents

3 Identification d’un problème de recalage (V18l)

Dix mosaïques ont été construites à partir de 3 coupes adjacentes de la région du sillon collatéral au niveau du lobe temporal droit. Les limites de chaque mosaïque ont donc été fixées en fonction de la forme du cortex (rectiligne ou curviligne) et de l’appartenance au gyrus temporo-occipital médial (para-hippocampal) ou au gyrus temporo-occipital latéral (gyrus fusiforme).Cette partition du cortex a permis avant tout d’obtenir des volumes de données compatibles avec des temps de calcul raisonnables. Nous avons par ailleurs supposé que les zones de plicature corticales que sont la base et le sommet des gyrus pouvaient présenter des caractéristiques

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morphométriques et topologiques différentes. Enfin, nous avons posé l’hypothèse d’une possible variabilité fonctionnelle entre le cortex situé sur le versant médial du sillon collatéral appartenant au gyrus temporo-occipital médial et le cortex situé sur le versant latéral, appartenant au gyrus temporo-occipital latéral. Ce découpage régional est illustré par la figure ci-après.

4 A gauche : la coupe V17, à droite : la région du sillon collatéral droit

Les mosaïques sont nommées par le numéro de coupe et une initiale correspondant à la région à laquelle elles appartiennent : l pour latéral, m pour médial, s pour sommet, b pour base. Ce découpage impose un certain degré de superposition et certains blocs sont communs à 2 mosaïques adjacentes. Ceci est illustré par la figure suivante.

5 Découpage des mosaïques

Sommet

Base

Gyrus temporo-occipital latéral

Gyrus temporo-occipital médial

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Les dix mosaïques sont représentées ci-dessous en projection et en codage couleur de la profondeur.

6 Les 10 mosaïques représentées en codage couleur de la profondeur

Chaque mosaïque contient une grande quantité de données (plusieurs giga-octets) et ne peut être chargée et traitée en une seule fois dans la mémoire d’un

V16l V16m V16s

V17l V17m V17s

V18l V18m V18s

V18b

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ordinateur de bureau. Pour cette raison, ResolveRT utilise un format de stockage particulier (HDF5) qui permet de gérer des données multidimensionnelles associées à des métadonnées et permet donc un accès rapide à des sous-blocs d’une grande image.

1.3 SEGMENTATION DU RESEAU VASCULAIRE .

1.3.1 Seuillage de la mosaïque Un seuil uniforme est appliqué à l’ensemble de la mosaïque. Compte tenu du seuillage variable déjà appliqué à chaque bloc, il suffit de choisir pour ce seuil une valeur inférieure au minimum du seuil variable. On obtient alors une forme binaire de la mosaïque (labels) où chaque point d’un vaisseau prend la valeur 1 et chaque point du tissu cérébral la valeur 0.

1.3.2 Masquage Les gros vaisseaux qui occupent le sulcus et certaines zones corticales nécessitent une vérification propre car leur visualisation après seuillage laisse apparaître des « défauts de remplissage » qui sont liés au fait que la lumière émise par le microscope confocal est considérablement atténuée dans les régions axiales de ces gros vaisseaux. Ce phénomène peut conduire à des erreurs de segmentation ou d’estimation du diamètre, certains gros troncs vasculaires pouvant à l’extrême prendre un aspect dédoublé. D’autre part, il est nécessaire d’exclure la zone du sillon qui pourrait parasiter les données quantitatives étudiées globalement. Il est cependant nécessaire d’en délimiter proprement les frontières en respectant notamment la première couche corticale qui ne contient que peu de vaisseaux. Cette phase de masquage précède donc le calcul des distances extra ou intra-vasculaires. Il s’agit d’une opération manuelle, longue et fastidieuse car il faut redéfinir les limites du masque sur chaque coupe de chaque bloc contenant soit une partie du sillon, soit un vaisseau de grand diamètre. On utilise un éditeur de segmentation (ResolveRT), qui permet de réaliser cette opération de masquage de manière interactive à l’aide d’outils de sélection classiques. Les masques ainsi définis, sont des images binaires et sont appliqués à la forme binaire de la mosaïque ou labels.

7 Masque appliqué à la mosaïque V17s

16

1.3.3 Carte de distances et extraction de la ligne centrale L’étape suivante consiste en l’extraction de la ligne centrale des vaisseaux. Les lignes centrales sont des représentations compactes des données vasculaires. Elles donnent des informations directes sur la topologie du réseau, la direction des vaisseaux, les longueurs des segments et les types de connections. Si l’on y ajoute une carte de distance, on obtient des informations sur les diamètres et la densité vasculaires. Globalement, à partir de l’image binaire, la carte de distance calcule pour chaque point du vaisseau la distance la plus courte qui le sépare du tissu. Une carte de distance est une image dans laquelle le niveau de gris en chaque point de l’objet correspond à sa distance par rapport au fond. ResolveSkel utilise, pour le calcul de cette distance, un masque de chanfrein. Il s’agit d’une transformation qui calcule une valeur approchée de la distance euclidienne. Cette technique réalise un bon compromis entre la précision du résultat et le temps de calcul. Le squelette est obtenu par un procédé d’amincissement (thinning) qui consiste en la suppression successive des couches frontières de l’objet. Le squelette est défini comme le lieu des maxima locaux de la carte de distance. Ce squelette est homotope et centré. Cet algorithme a été adapté au traitement de blocs d’images en tenant compte de la continuité (ou discontinuité) des trajets vasculaires d’un bloc à l’autre. L’image obtenue est donc une représentation des distances intra-vasculaires, c’est-à-dire de la plus petite distance entre un point et le tissu. Si l’on se situe en un point de l’axe d’un vaisseau (ou ligne centrale ou squelette), cette distance constitue une bonne estimation du rayon en ce point, en admettant que la section du vaisseau soit circulaire, ce qui semble une approximation raisonnable. Notons que, dans le calcul du rayon, l’algorithme retient la distance la plus courte du centre du vaisseau au tissu. Un lissage est généralement appliqué au squelette afin d’en éliminer les petites fluctuations. Le réseau vasculaire est stocké sous forme de lignes (lineset), elles-mêmes constituées d’une succession de points pour lesquels le rayon est connu. Il peut être représenté par des cylindres dont le diamètre restitue le diamètre vasculaire en chaque point du lineset. Ce « lineset » peut être visualisé et superposé aux différents types de représentations tridimensionnelles de l’image originale obtenue en microscopie confocale à des fins d’illustration ou de vérification.

8 Comparaison du réseau reconstruit à partir du lineset et des images originales : a : image en projection de la mosaïque, b : visualisation du lineset en codage couleur de la profondeur, c :

superposition du lineset et des données originales (en jaune).

17

Les différentes étapes de vérification conduisant systématiquement à un certain degré de sous-estimation du diamètre vasculaire par la méthode de segmentation un facteur correctif sera appliqué systématiquement à toute analyse quantitative du réseau. Déterminé de manière empirique ce facteur est de +25 %.

9 Représentation du squelette. A gauche : représentation d’une zone du squelette non lissé, à

droite : la même zone représenté à partir d’un squelette lissé.

Notons que le lineset peut être édité et que les données le composant sont également stockées sous forme d’un fichier ASCII. Chaque ligne de ce fichier correspond à un point du lineset et comprend le numéro du segment auquel il appartient, ses coordonnées x, y, z et le rayon du vaisseau en ce point.

10 Représentation du lineset incluant tous les points du squelette. A droite : les données au format texte qui serviront à l’analyse quantitative. Les 3 premières colonnes sont les coordonnées x, y, z

de chaque point, la quatrième colonne indique le rayon. Les accolades séparent les segments vasculaires.

Pour chacune des dix mosaïques construites, le réseau micro-vasculaire extrait est donc décrit sous la forme d’un « squelette », constitué d’un ensemble de points échantillonnant les lignes centrales de tous les vaisseaux. En chaque point, outre ses coordonnées (X, Y, Z) la segmentation fournit la valeur du rayon du vaisseau en ce point. Outre le fait que cette forme rend possible une analyse morphologique et topologique, que nous traiterons plus loin, il est intéressant de noter l’énorme compression de données ainsi réalisée, puisqu’elle permet de passer d’une mosaïque d’images de 1 à plusieurs giga-octets à un squelette d’à peine plus d’une dizaine de megaoctets, en perdant peu d’information utile. Dans ce travail nous nous posons en utilisateur des outils mis à notre disposition par le logiciel ResolveSkel. L’ensemble des développements méthodologiques qui vont suivre, appliqués au réseau ainsi résumé nous permettront de juger de l’homogénéité des squelettes obtenus et seront discutés dès que l’une ou l’autre des étapes décrites dans ce chapitre pourront être mis en cause ; depuis la préparation du matériel anatomique jusqu’à la méthode de segmentation.

18

La genèse de Resolve RT La possibilité de numériser de grands volumes de la vascularisation corticale a nécessité le développement d’outils informatiques permettant d’extraire automatiquement de l’image les informations pertinentes à l’analyse quantitative du réseau microvasculaire. Historiquement ces informations ont été obtenues manuellement en utilisant le “Neuron tracing system” distribué par Eutectics Electronics, développé par Joseph J. Capowski à partir de 1983 (15, 68) pour tracer, représenter, et cataloguer des neurones dans leur structure tridimensionnelle à partir de l’observation de coupes histologiques en microscopie optique conventionnelle. Ce logiciel permettait de suivre les structures arborescentes jusqu’à un diamètre de 7 microns (78). A partir des premières mosaïques construites à partir d’images de microscopie confocale l’information a été obtenue à l’aide du logiciel SEIRVIN (Suivi et Échantillonnage Interactif d’un Réseau Vasculaire en Images Numériques), développé par Francis CASSOT (1999), programmé en Visual Basic 5.0. Ce logiciel permettait de tracer manuellement et interactivement le réseau microvasculaire et d’en extraire les principales arborescences pour une étude quantitative (19). Ce logiciel n’était pas adapté à l’étude du réseau dans sa globalité. C’est donc pour permettre une étude morphométrique de grande ampleur du réseau microvasculaire cérébral que le projet MicroVisu3D a été créé. Les objectifs étant :

• La construction automatique de mosaïques, à partir d’images 3D, représentant des volumes relativement grands du cortex cérébral,

• A partir des mosaïques, l’extraction de ces données, par des méthodes automatiques ou semi-automatiques de segmentation, du réseau microvasculaire, sous une forme telle qu’elle puisse permettre une analyse quantitative, morphométrique et topologique.

Plusieurs équipes ont travaillé en collaboration pour réaliser ce projet : • l’unité 455 de l’INSERM, • l’équipe EPIDAURE (Epidaure Projet Images, Diagnostic AUtomatique,

RobotiquE) de l’INRIA (Institut National de Recherche en Informatique et Automatique),

• et la société TGS Europe qui a développé le logiciel de visualisation 3D Resolve.

C’est ainsi que MicroVisu3D est devenu une extension du logiciel AMIRA. Depuis Décembre 2005, une version d’AMIRA dédiée à la microscopie est disponible sous le nom de Resolve RT ; elle inclut le module MicroVisu3D, rebaptisé ResolveSkel.

19

2 ANALYSE DU RESEAU SEGMENTE -CONNECTIVITE.

2.1 DEFINITIONS

- Le point est l’unité de segmentation. Le réseau vasculaire est segmenté en points, un point est créé tous les 1.6µ. Pour chacun de ces points sont connus : o les coordonnées dans un repère orthonormé (x, y, z) o le diamètre.

- Le segment est défini par une succession de points entre 2 nœuds. - Le nœud correspond à un évènement du réseau (connectivité) :

o le nœud d’ordre 1 est un nœud sans connexion, il indique un segment terminal

o le nœud d’ordre 2 est un nœud simple, joignant 2 segments. Cet évènement relativement rare semble un accident de la segmentation

o le nœud d’ordre 3 indique une bifurcation o le nœud d’ordre 4 indique une trifurcation o les nœuds d’ordre supérieur à 4 indiquent généralement des connexions

aberrantes et sont des indicateurs de bruit. Les résultats sont exprimés par mosaïque , par zone (latéral et médial correspondant respectivement aux gyrus temporo-occipital latéral et médial), par coupe et enfin totalisés.

2.2 CONNECTIVITE

Mosaïque

Nombre de

blocs

Nombre de

segments

Sgt/ Bloc

Nombre de

nœuds

Segments terminaux

Nœuds simples

Bifurcations

Trifurcations

Connexions

multiples % % % % % V16l 83 48310 582.05 42221 16193 38.35 1035 2.45 22631 53.60 1802 4.27 560 1.33 V17l 91 44249 486.25 40222 16517 41.06 618 1.54 21893 54.43 1010 2.51 184 0.46 V18l 83 52116 627.90 41449 12139 29.29 392 0.95 25898 62.48 2233 5.39 787 1.90 V16m 56 26777 478.16 23396 8928 38.16 89 0.38 13355 57.08 848 3.62 176 0.75 V17m 59 32814 556.17 27168 8996 33.11 132 0.49 16476 60.64 1178 4.34 386 1.42 V18m 65 41138 632.89 32614 9367 28.72 151 0.46 20821 63.84 1731 5.31 544 1.67 V16s 36 15090 419.17 13608 5594 41.11 36 0.26 7535 55.37 365 2.68 78 0.57 V17s 34 15440 454.12 12968 4253 32.80 70 0.54 8189 63.15 400 3.08 56 0.43 V18s 36 21262 590.61 16918 5047 29.83 478 2.83 9891 58.46 1061 6.27 441 2.61 V18b 81 62046 766.00 48113 12249 25.46 454 0.94 29001 60.28 2858 5.94 1551 3.22 Moyenne 559.33 Ecart type 103.80

Latéral 257 144675 562.94 123892 44849 36.20 2045 1.65 70422 56.84 5045 4.07 1531 1.24 Médial 180 100729 559.61 83178 27291 32.81 372 0.45 50652 60.90 3757 4.52 1106 1.33 Sommet 106 51792 488.60 43494 14894 34.24 584 1.34 25615 58.89 1826 4.20 575 1.32 Base 81 62046 766.00 48113 12249 25.46 454 0.94 29001 60.28 2858 5.94 1551 3.22

V16 175 90177 515.30 79225 30715 38.77 1160 1.46 43521 54.93 3015 3.81 814 1.03 V17 184 92503 502.73 80358 29766 37.04 820 1.02 46558 57.94 2588 3.22 626 0.78 V18 (-b) 184 114516 622.37 90981 26553 29.19 1021 1.12 56610 62.22 5025 5.52 1772 1.95 V18 265 176562 666.27 139094 38802 27.90 1475 1.06 85611 61.55 7883 5.67 3323 2.39

Total 624 359242 575.71 298677 99283 33.24 3455 1.16 175690 58.82 13486 4.52 4763 1.59 Tableau 1 Connectivité

20

Le nombre de segments par bloc peut être considéré comme un indicateur de bruit. En ce sens, le squelette V18b est probablement le plus bruité. Ceci est corroboré par une grande proportion de connexions multiples (3.22%). A l’inverse, le nombre de segments terminaux augmente avec l’importance du filtrage. En effet, plus le filtrage est intense plus le risque de déconnexion est important. Ce paramètre semble donc varier en sens inverse des indicateurs de bruit cités plus haut. Environ un tiers des segments sont terminaux ce qui peut paraître énorme. Environ 60% des nœuds d’ordre 1, marquant l’extrémité « libre » de ces segments sont effectivement situés sur les frontières du domaine de la mosaïque. Les 40% restants, soit à peu près 13% des segments, indiquent une interruption « interne » au domaine de la mosaïque. Elle peut être (25) soit d’ordre physiopathologique, soit liée à une injection imparfaite, soit liée à un problème de rupture de la continuité dû à la segmentation. Le fait que le nombre de ces déconnections augmente avec la profondeur indique que cette dernière hypothèse est la plus vraisemblable. D’autre part, on peut considérer que la partie déconnectée du réseau principal englobe une proportion importante de bruit. Pour isoler cette sous-population de vaisseaux connectés le réseau est injecté à partir d’une arborescence correctement centrée dans la mosaïque, sans contrainte de résistance (ou r = 1000000000). Les résultats de ce filtrage secondaire sont exprimés dans le tableau ci-dessous.

Réseau complet Réseau connecté Réseau déconnecté Nombre

de segments

Nombre de

points

Pts/ Sgt

Nombre de

nœuds Segments Points Pts/

Sgt Nœuds Segments

Points

Pts/ Sgt

Mosaïque % % % % %

V16l 48310 1446033 29.93 42221 83.60 87.08 31.18 73.60 16.40 12.92 23.57

V17l 44249 1662158 37.56 40222 87.74 90.71 38.84 79.01 12.26 9.29 28.45

V18l 52116 1508827 28.95 41449 89.98 92.81 29.86 74.34 10.02 7.19 20.78

V16m 26777 891837 33.31 23396 86.15 89.12 34.46 76.45 13.85 10.88 26.16

V17m 32814 1050282 32.01 27168 90.16 92.68 32.90 75.49 9.84 7.32 23.82

V18m 41138 1195210 29.05 32614 90.00 96.97 31.31 74.81 10.00 3.03 8.79

V16s 15090 547061 36.25 13608 83.37 87.80 38.18 73.76 16.63 12.20 26.60

V17s 15440 605517 39.22 12968 92.25 93.14 39.60 77.95 7.75 6.86 34.72

V18s 21262 613223 28.84 16918 85.10 90.41 30.64 73.93 14.90 9.59 18.57

V18b 62046 1700237 27.40 48113 90.56 93.97 28.44 68.10 9.44 6.03 17.49

Moyenne 32.25 Moyenne 33.54 Moyenne 22.89

Ecart Type 4.16 Ecart Type 4.03 Ecart Type 7.05

Latéral 144675 4617018 31.91 123892 87.16 90.26 33.05 75.60 12.84 9.74 24.21

Médial 100729 3137329 31.15 83178 89.03 93.30 32.64 75.49 10.97 6.70 19.01

Sommet 51792 1765801 34.09 43494 86.73 90.53 35.59 75.07 13.27 9.47 24.32

Base 62046 1700237 27.40 48113 90.56 93.97 28.44 68.10 9.44 6.03 17.49

V16 90177 2884931 31.99 79225 84.32 87.85 33.33 74.47 15.68 12.15 24.78

V17 92503 3317957 35.87 80358 89.35 91.78 36.84 77.65 10.65 8.22 27.70

V18 (-b) 114516 3317260 28.97 90981 89.08 93.87 30.52 74.43 10.92 6.13 16.28

V18 176562 5017497 28.42 139094 89.60 93.90 29.78 72.24 10.40 6.10 16.66

Total 359242 11220385 31.23 298677 88.21 91.72 32.48 74.29 11.79 8.28 21.94

Tableau 2 Proportion du réseau connecté Ces données permettent encore d’apprécier la qualité de la segmentation et donc indirectement de la numérisation et peut-être de la qualité de préparation

21

des coupes. Le fait d’éliminer les segments déconnectés du réseau principal élimine une partie du bruit qui s’exprime de façon aléatoire sous la forme de segments aberrants isolés ou connectés en amas, de diamètres et de longueurs variables. Ces segments représentent environ 10% d’une population globale de 359242 segments. On note que l’analyse par région n’entraine pas de variabilité nette. V16 présente une proportion de segments déconnectés plus importante (15.68 %) qui peut encore traduire un filtrage plus agressif. L’image suivante sépare le réseau connecté des segments déconnectés. Elle montre que ces derniers comprennent :

- une part de bruit, - des segments réels déconnectés au sein du cortex, - une partie du réseau appartenant à la substance blanche.

11 Visualisation de la part connectée et de la part déconnectée du réseau Ces premiers éléments permettent de valider raisonnablement les différentes étapes de la méthode depuis le choix du matériel anatomique, de la technique de numérisation en microscopie confocale optimisant le rapport signal sur bruit en faisant certes une concession sur l’étendue de l’acquisition en profondeur, mais permettant de segmenter la totalité du réseau vasculaire sans accident notable. L’examen des segments déconnectés montre qu’il s’agit le plus souvent de segments aberrants. On peut noter que si l’on déconnecte d’authentiques parties du réseau, il s’agit exclusivement de zones appartenant à la substance blanche. Ce type de déconnexion en masse ne s’est jamais produit dans le cortex proprement dit. Il ne nous a pas paru nécessaire à l’issue de cette première analyse d’envisager un procédé de raccordement des discontinuités. Il ressort de cette étape des informations qui nous paraissent fondamentales et qu’il est aisé de vérifier en « se promenant » dans ces images tridimensionnelles du réseau vasculaire du cortex cérébral humain dont la résolution est extrêmement haute :

V18l : lineset complet V18l : réseau connecté V18l : segments déconnectés

Zoom Zoom

22

- ResolveSkel permet de segmenter automatiquement de très grands

volumes vasculaires avec une fiabilité évidente. - Le réseau vasculaire du cortex cérébral humain est un réseau continu

entièrement interconnecté, qu’il est possible à priori de perfuser dans son ensemble. Sur ce volume d’étude qui, au moins en surface, est à l’échelle d’un gyrus, il n’a pas été mis en évidence de rupture dans cette continuité notamment d’ordre pathologique.

Ces premiers éléments ne font pas apparaître d’information spécifiquement quantitative, on peut cependant noter que les trifurcations ne sont pas un évènement fortuit de la segmentation et représentent environ 4.5 % des modes de branchements à l’intérieur de ce réseau. Il n’est pas possible d’envisager de comparer statistiquement les différentes mosaïques concernant ces données dans la mesure où sur un échantillon de cette taille, toute différence, y compris minime, apparaît significative. Ceci pose le problème du choix pertinent des outils nécessaires à valider et interpréter les résultats qui vont suivre.

23

3 MORPHOMETRIE ELEMENTAIRE Pour chaque mosaïque ont été calculés :

- le volume tissulaire - le nombre de segments total et par mm3 - la longueur vasculaire totale et par mm3 - la surface vasculaire totale par mm3 - le volume vasculaire total et la densité vasculaire (pourcentage du

volume vasculaire par rapport au volume tissulaire)

Mosaïque

Volume tissulaire

(mm3)

Nombre de

segments

Longueur vasculaire

totale (mm)

Surface vasculaire

totale (mm2)

Volume vasculaire

total (mm3)

Nombre de

segments / mm3

Longueur vasculaire

/mm3 (mm/mm3)

Surface vasculaire

/mm3 (mm2/mm3)

Densité vasculaire

(%)

V/S

V16l 4.7 48310 2279 48.14 0.103 10278.72 484.89 10.24 2.19 0.21

V17l 5.17 44249 2585.4 59.19 0.1344 8558.80 500.08 11.45 2.60 0.23

V18l 4.7 52116 2447.1 60.08 0.1456 11088.51 520.66 12.78 3.10 0.24

V16m 2.6 26777 1389.8 34.06 0.0794 10298.85 534.54 13.10 3.05 0.23

V17m 3.165 32814 1658.6 38.46 0.0888 10367.77 524.04 12.15 2.81 0.23

V18m 3.79 41138 1989.1 50.25 0.1207 10854.35 524.83 13.26 3.18 0.24

V16s 2.35 15090 884.6 21.32 0.0484 6421.28 376.43 9.07 2.06 0.23

V17s 2.21 15440 961.8 25.93 0.0666 6986.43 435.20 11.73 3.01 0.26

V18s 2.37 21262 1006 23.35 0.0531 8971.31 424.47 9.85 2.24 0.23

V18b 4.41 62046 2704.1 55.71 0.1172 14069.39 613.17 12.63 2.66 0.21

Moyenne 9789.54 493.83 11.63 2.69 0.23

Ecart type 2194.90 67.20 1.46 0.41 0.01

Latéral 14.57 144675 7311.5 167.41 0.383 9929.65 501.82 11.49 2.63 0.23

Médial 9.555 100729 5037.5 122.77 0.2889 10542.02 527.21 12.85 3.02 0.24

Sommet 6.93 51792 2852.4 70.6 0.1681 7473.59 411.60 10.19 2.43 0.24

Base 4.41 62046 2704.1 55.71 0.1172 14069.39 613.17 12.63 2.66 0.21

V16 9.65 90177 4553.4 103.52 0.2308 9344.77 471.85 10.73 2.39 0.22

V17 10.545 92503 5205.8 123.58 0.2898 8772.21 493.67 11.72 2.75 0.23

V18 (-b) 10.86 114516 5442.2 133.68 0.3194 10544.75 501.12 12.31 2.94 0.24

V18 15.27 176562 8146.3 189.39 0.4366 11562.67 533.48 12.40 2.86 0.23

Total 35.465 359242 17905.5 416.49 0.9572 10129.48 504.88 11.74 2.70 0.23

Tableau 3 Résultats morphométriques sur la totalité de l’échantillon

24

Mosaïque

Volume (mm3)

Nombre de

segments

Longueur vasculaire

totale (mm)

Surface vasculaire

totale (mm2)

Volume vasculaire

total (mm3)

Nombre de

segments / mm3

Longueur vasculaire

/mm3 (mm/mm3 )

Surface vasculaire

/mm3 (mm2/mm3 )

Densité vasculaire

(%)

V/S

V16l 4.7 40385 1996.7 44.58 0.0963 8592.55 424.83 9.49 2.05 0.22

V17l 5.17 38822 2355.6 55.23 0.1276 7509.09 455.63 10.68 2.47 0.23

V18l 4.7 46896 2273 56.88 0.1397 9977.87 483.62 12.10 2.97 0.25

V16m 2.6 23068 1247 31.43 0.073 8872.31 479.62 12.09 2.81 0.23

V17m 3.165 29585 1544.1 36.32 0.0833 9347.55 487.87 11.48 2.63 0.23

V18m 3.79 37024 1854.8 47.25 0.1132 9768.87 489.39 12.47 2.99 0.24

V16s 2.35 12580 755.6 18.57 0.0428 5353.19 321.53 7.90 1.82 0.23

V17s 2.21 14243 896.9 24.31 0.0625 6444.80 405.84 11.00 2.83 0.26

V18s 2.37 18095 903.5 21.51 0.0496 7635.02 381.22 9.08 2.09 0.23

V18b 4.41 56187 2546.6 53.5 0.1141 12740.82 577.46 12.13 2.59 0.21

Moyenne 8624.21 450.70 10.84 2.52 0.23

Ecart type 2064.15 70.78 1.55 0.41 0.01

Latéral 14.57 126103 6625.3 156.69 0.3636 8654.98 454.72 10.75 2.50 0.23

Médial 9.555 89677 4645.9 115 0.2695 9385.35 486.23 12.04 2.82 0.23

Sommet 6.93 44918 2556 64.39 0.1549 6481.67 368.83 9.29 2.24 0.24

Base 4.41 56187 2546.6 53.5 0.1141 12740.82 577.46 12.13 2.59 0.21

V16 9.65 76033 3999.3 94.58 0.2121 7879.07 414.44 9.80 2.20 0.22

V17 10.545 82650 4796.6 115.86 0.2734 7837.84 454.87 10.99 2.59 0.24

V18 (-b) 10.86 102015 5031.3 125.64 0.3025 9393.65 463.29 11.57 2.79 0.24

V18 15.27 158202 7577.9 179.14 0.4166 10360.31 496.26 11.73 2.73 0.23

Total 35.465 316885 16373.8 389.58 0.9021 8935.15 461.69 10.98 2.54 0.23

Tableau 4 Résultats morphométriques sur la partie connectée de l’échantillon Le tableau 3 étudie la totalité des linesets, le tableau 4 étudie la partie connectée du réseau. Pour optimiser ces résultats il a paru nécessaire de restreindre le volume de chaque mosaïque en z afin d’obtenir un échantillon homogène éliminant d’une part les zones vides créées par le recalage des blocs, et éliminant d’autre part les parties du réseau situées en superficie et surtout en profondeur contenant l’essentiel du bruit. Pour chaque squelette les données morphométriques ont donc été recalculées sur ce nouvel échantillon consistant en une « bande » comprise entre deux plans de coordonnées z=ZH et z=ZB. ZH et ZB variant pour chaque mosaïque de telle sorte que z est compris entre 100 et 120 µ. Le tableau 5 donne les paramètres étudiés pour cette nouvelle population.

12 V17l visualisée en (y) ci-dessus et en (x, z) ci-dessous : noter la position irrégulière des blocs après recalage en z

25

Homogénéisation de l’échantillon par contrainte en Z

Mosaïque

Volume (mm3)

Nombre de

segments

Longueur vasculaire

totale (mm)

Surface vasculaire

totale (mm2)

Volume vasculaire

total (mm3)

Nombre de

segments / mm3

Longueur vasculaire

/mm3 (mm/mm3

Surface vasculaire

/mm3 (mm2/mm3)

Densité vasculaire

(%)

V/S

V16l 2.73 31835 1407.7 31.11 0.07 11671.43 516.09 11.41 2.54 0.22

V17l 2.50 23194 1217.2 28.72 0.07 9281.31 487.07 11.49 2.65 0.23

V18l 2.72 29598 1383 35.06 0.09 10870.43 507.93 12.88 3.13 0.24

V16m 1.66 17491 849.8 21.74 0.05 10554.55 512.79 13.12 3.16 0.24

V17m 1.53 16007 758.6 18.4 0.04 10468.93 496.14 12.03 2.90 0.24

V18m 1.83 20336 926.6 24.26 0.06 11118.64 506.62 13.26 3.26 0.25

V16s 1.36 9613 533 13.39 0.03 7070.46 392.03 9.85 2.32 0.24

V17s 1.28 9767 538.8 15.03 0.04 7635.24 421.20 11.75 3.08 0.26

V18s 1.38 11315 541.5 13.31 0.03 8220.72 393.42 9.67 2.31 0.24

V18b 2.13 28695 1257.7 27.06 0.06 13471.83 590.47 12.70 2.74 0.22

Moyenne 10036.36 482.38 11.82 2.81 0.24

Ecart type 1978.42 62.38 1.27 0.35 0.01

Latéral 7.95 84627 4007.9 94.89 0.22 10645.71 504.18 11.94 2.78 0.23

Médial 5.02 53834 2535 64.4 0.16 10734.17 505.46 12.84 3.12 0.24

Sommet 4.02 30695 1613.3 41.73 0.10 7644.70 401.80 10.39 2.56 0.25

Base 2.13 28695 1257.7 27.06 0.06 13471.83 590.47 12.70 2.74 0.22

V16 5.74 58939 2790.5 66.24 0.15 10260.25 485.78 11.53 2.67 0.23

V17 5.31 48968 2514.6 62.15 0.15 9226.71 473.81 11.71 2.83 0.24

V18(-b) 5.93 61249 2851.1 72.63 0.18 10331.80 480.94 12.25 2.98 0.24

V18 8.06 89944 4108.8 99.69 0.24 11161.80 509.89 12.37 2.92 0.24

Total 19.11 197851 9413.9 228.08 0.54 10353.38 492.62 11.94 2.82 0.24

Tableau 5 Optimisation des résultats par contrainte de l’échantillon en z

Mosaïque ZH ZB Epaisseur (mm)

Aire (mm2)

Volume (mm3)

V16l 30 150 0.12 22.73 2.7276

V17l 100 200 0.1 24.99 2.499

V18l -20 100 0.12 22.69 2.7228

V16m 30 150 0.12 13.81 1.6572

V17m 50 150 0.1 15.29 1.529

V18m 0 100 0.1 18.29 1.829

V16s 30 150 0.12 11.33 1.3596

V17s 30 150 0.12 10.66 1.2792

V18s 15 135 0.12 11.47 1.3764

V18b 0 100 0.1 21.3 2.13

ZH

ZB

± 110 µ z

26

Les données de densités vasculaires des 3 populations sont comparées dans le tableau 6. Les chiffres issus du premier échantillon constituent la densité dite « totale », les chiffres issus du 2e échantillon constituent la densité dite « connectée », les chiffres issus du 3e échantillon constituent la densité dite « locale ». La densité « locale » est la donnée la plus réaliste.

Mosaïque Densité

vasculaire « totale »

Densité Vasculaire

« connectée »

Densité vasculaire « locale »

V16l 2.19 2.05 2.54 V17l 2.60 2.47 2.65 V18l 3.10 2.97 3.13 V16m 3.05 2.81 3.16 V17m 2.81 2.63 2.90 V18m 3.18 2.99 3.26 V16s 2.06 1.82 2.32 V17s 3.01 2.83 3.08 V18s 2.24 2.09 2.31 V18b 2.66 2.59 2.74

Tableau 6 Optimisation des valeurs de densité vasculaire Dans sa globalité, le volume d’étude représente 35 mm3 de volume tissulaire, 18 mètres de longueur vasculaire, 400 mm2 de surface vasculaire et 1 mm3 de volume vasculaire appartenant au cortex temporal droit. Après réajustement des paramètres consistant à ne conserver que la partie connecté de l’échantillon et à éliminer les zones vides et les zones les plus bruitées de chaque mosaïque nous obtenons les valeurs de densité linéique, surfacique et volumique du cortex dans cette région. Ces valeurs moyennées sur les 10 mosaïques sont les suivantes (tableau 5):

- densité linéique : 492.62 mm/mm 3 - densité surfacique : 11.94 mm 2 /mm 3 - densité volumique : 2.82 %

Sur une simple analyse qualitative des résultats, on remarque que ces chiffres sont relativement constant d’une coupe à l’autre, la variabilité n’intégrant probablement que des effets liés à la qualité intrinsèque de chaque coupe. Par contre ces chiffres apparaissent plus nettement différents d’une région à l’autre et il apparaît que la densité vasculaire semble notamment moins importante au niveau de la région du sommet du sillon. Il est peut être hasardeux de se livrer à une interprétation de ce résultat mais notons que dans cette zone le phénomène de gyration se fait en extension. Les variations de l’architecture histologique à ce niveau sont décrites (47, 105) et il existe peut-être un lien entre ces 2 phénomènes. Cette constatation est à prendre en compte et demande à être vérifiée en d’autres zones du cerveau. Il n’existe pas dans la littérature sur la vascularisation cérébrale, que ce soit chez l’homme ou chez les animaux gyrencéphales, de comparaison tenant compte de ces aspects géométriques. La base du gyrus temporo-occipital latéral, où la gyration pourrait entrainer une contraction des structures tissulaires, ne présente pas des valeurs de densité particulièrement plus grandes. Enfin, ces mesures représentant un rapport des longueurs, surfaces ou volumes au volume tissulaire global, l’influence de la rétraction de la pièce anatomique ne nous apparaît pas prépondérante dès lors qu’elle peut être considérée comme globale et homogène sur l’ensemble des constituants tissulaires.

27

L’intérêt de ces différentes mesures est discuté dans les 2 articles que nous présentons en annexe de cette thèse. Il en est de même de la comparaison des résultats à ceux de la littérature, exploitant essentiellement des informations bidimensionnelles issues de travaux histologiques (tableau 12 p. 30). Cependant, en tenant compte des travaux les plus récents sur le sujet comprenant des études menées chez l’animal sur de grands volumes de cortex (125) les valeurs que nous présentons ici sont pour ainsi dire toujours supérieures aux valeurs publiées. Ceci met en avant la qualité exceptionnelle du matériel de Duvernoy et justifie son utilisation dans ce travail, et ouvre certainement le débat sur les variations observées entre les diverses espèces étudiées et l’homme. Enfin, l’une des caractéristiques principales de la vascularisation corticale est son hétérogénéité. Les variations de la densité vasculaire en fonction de la profondeur du cortex apparaissent à l’œil nu dans certaines zones de cortex secondaire sur les coupes injectées à l’encre de Chine. Cette particularité fait l’objet d’une approche spécifique dans la dernière partie de ce travail.

28

4 DIAMETRES ET LONGUEURS Les données élémentaires issues de la segmentation sont le diamètre de chaque point du réseau de coordonnées x, y, z et la longueur de chaque segment défini par 2 nœuds. Un premier traitement permet d’obtenir la valeur moyenne du diamètre pour chaque segment. Ces données sont connues globalement pour chacune des 10 mosaïques étudiées. Cependant, pour les raisons évoquées plus haut, l’analyse statistique des distributions des diamètres et des longueurs est réalisée sur un échantillon de la population totale ne conservant que les segments connectés. De plus, les segments terminaux sont exclus de l’analyse car il semble plus logique de n’étudier le critère « longueur » que sur des segments supposés entiers. Les diamètres sont étudiés sur cette même population. Les valeurs des diamètres sont pondérées telles que :

∑

∑ ⋅=

ii

iii

moyen l

DlD

4.1 CARACTERISTIQUES DES DISTRIBUTIONS DES DIAMETRES ET DES LONGUEURS :

Diamètres Longueurs N = 247015 d d

1

l ( )llog

Minimum 3.00 0.12 1.87 0.63 Maximum 67.50 0.58 1172.13 7.07 Moyenne 7.82 0.38 52.67 3.54 Ecart type 3.52 0.069 50.38 0.96 Variance 12.37 0.005 2537.78 0.93 Skewness 2.96 0.22 2.27 -0.1 Kurtosis 20.62 3.23 14.37 2.18

Tableau 7 Distributions des diamètres et longueurs (population globale)

4.1.1 Histogramme des longueurs

13 Histogramme des longueurs : à gauche : échantillon non transformé à droite : transformation log La distribution des longueurs des segments est normalisée par une transformation logarithmique.

29

4.1.2 Histogramme des diamètres

14 Histogramme des diamètres : à gauche : échantillon brut, à droite transformation par d/1

Cette population suit une distribution normale après transformation par d1

.

4.2 COMPARAISONS DES DIAMETRES

4.2.1 Région par région : latéral, médial, sommet, base La taille de l’ensemble des observations collectées donne la capacité de mettre en évidence statistiquement des comparaisons n’ayant pas d’intérêt de recherche particulier. En effet, l’ensemble des comparaisons effectuées est significatif à un seuil inférieur à 10-4 y compris pour des différences inférieures à la capacité de précision de la méthode. Nous avons estimé le nombre d’observations nécessaires pour mettre en évidence de façon statistique une différence d’au moins 1 micron entre les diamètres des différentes régions (11). Ce nombre de 175 observations par région a permis de constituer respectivement 561, 410, 201 et 239 échantillons aléatoires sans remise à partir des localisations latérale, médiale, sommet et base. Ces échantillons ont été comparés deux à deux par des tests de Student sur les données transformées, les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous.

Significativité (valeur de p) Comparaisons

des régions Nombre de

comparaisons N (%) <0.05 Médiane IQR*

Base versus Latéral Médial

Sommet

239 239 201

188 (78.7) 235 (98.3) 200 (99.5)

0.004 <10-4 <10-4

10-3 - 0.03 <10-5- <10-3

<10-6 - <10-3 Latéral versus

Médial Sommet

410 115

106 (25.8) 86 (42.8)

0.18 0.09

0.05-0.46 0.02- 0.27

Médial versus Sommet

201

7 ( 3.5)

0.53

0.26-0.78

Tableau 8 Comparaisons région par région * intervalle interquartile

30

Il apparaît que la distribution des diamètres des vaisseaux de la base du gyrus est significativement différente de celle des vaisseaux des autres régions du sillon. La différence la plus marquée concerne la comparaison des diamètres entre la base et le sommet du sillon. Les modifications géométriques liées à la plicature du cortex pourraient expliquer ces résultats. D’autre part les vaisseaux de la base sont issus de la surface visible du cortex et ont à priori une origine plus distale sur le réseau pie-mérien. A l’inverse les vaisseaux du sommet sont issus de troncs plus proximaux à l’échelle de la circulation pie-mérienne. Les résultats des données brutes et transformées sont donnés dans le tableau ci-dessous.

Diamètres Latéral Médial Sommet Base

Non transformés Médiane 7.12 7.51 7.65 6.33

IQR* 5.64-8.98 6.03-9.36 6.19-9.41 5.01-7.99

Transformés

Moyenne 0.38 0.37 0.37 0.4

Médiane 0.37 0.36 0.36 0.4

IQR* 0.33-0.42 0.33-0.41 0.33-0.40 0.35-0.45

Tableau 9 Comparaisons des diamètres région par région : données brutes * intervalle interquartile

4.2.2 Coupe par coupe (V16, V17, V18) De la même façon, nous avons estimé le nombre d’observations nécessaires à mettre en évidence de façon statistique une différence d’au moins 1 micron entre les diamètres des différentes coupes. Ce nombre est de 200 observations par coupe et permet de constituer respectivement 302, 314 et 410 échantillons aléatoires sans remise à partir des coupes V16, V17 et V18. Ces échantillons ont été comparés deux à deux par des tests de Student sur les données transformées, les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous.

Significativité (valeur de p) Comparaisons Des coupes

Nombre de comparaisons

N(%) <0.05 Médiane IQR*

V16 versus V17 V18

302 302

55 (18.21) 65 (21.52)

0.30 0.23

0.085/0.6 0.06/0.53

V17 versus V18

314

17 (5.41)

0.51

0.24/0.74

Tableau 10 comparaisons coupe par coupe *intervalle interquartile

Les diamètres sont comparables d’une coupe à l’autre. Il n’apparaît pas de différence significative entre les distributions. Ceci appuie la reproductibilité de la méthode (de l’acquisition à la segmentation) d’une coupe à l’autre.

31

4.3 DIAMETRES ET LONGUEURS CAPILLAIRES

Il est certain que la présence des structures arborescentes au sein de cette population rend délicate toute tentative de normalisation dans la mesure où certaines arborescences présentent des diamètres très importants qui créent une nette asymétrie de la courbe à droite. Afin de préciser la distribution des diamètres capillaires, l’extraction de cette population arborescente a été réalisée par la combinaison de 2 méthodes. D’une part, les arborescences ont été identifiées et isolées par un procédé qui sera décrit avec l’étude consacrée à cette partie de la population. Dès lors ces vaisseaux ont été simplement soustraits de l’échantillon global. D’autre part, le seuil du diamètre le plus haut a été modifié pas à pas jusqu’à obtenir une distribution symétrique de l’ensemble des valeurs. En effet, après la première étape de soustraction il reste des fragments arborescents qui contribuent à l’asymétrie de la distribution. Sur des critères de symétrie et d’amplitude la distribution est quasiment normalisée pour les vaisseaux de diamètre inférieur à 10µm. Cette population pourrait correspondre à une définition statistique des éléments proprement capillaires du réseau mais ceci est un élément de discussion sur lequel nous reviendrons. En effet, le critère « diamètre » paraît insuffisant pour isoler les capillaires des vaisseaux arborescents. Nous savons que certains vaisseaux arborescents ont des segments dont les diamètres peuvent être inférieurs à 10 µm. Dans un souci de modélisation de cette population de vaisseaux on ajuste la distribution des diamètres par transformation selon la fonction : ( )113307.1ln −d . En effet, sur l’ensemble de l’échantillon la distribution s’écarte légèrement de la loi normale. Les courbes sont proposées ci-dessous.

15 Distribution des diamètres capillaires (d<10µ) : à gauche : distribution globale, à droite

distribution transformée

32

16 Distribution des longueurs capillaires (d<10µ) : à gauche distribution globale, à droite

transformation log Sur cette population (Arborescences extraites soustraites et d<10µ) on détermine la valeur moyenne d’un diamètre et d’une longueur d’un capillaire du cortex cérébral :

Diamètre moyen : 6.47 µ Longueur moyenne : 52.95 µ

“Capillaires”

Diam Long Moyenne 6.47 52.95 Déviation Standard 1.70 49.75 Médiane 6.45 36.07 IQR 5.20/7.74 16.01/75.7 Skewness 0.03 1.97 Kurtosis 2.21 10.5

Tableau 11 Distribution des diamètres et longueurs capillaires (récapitulatif) Le tableau ci-dessous est donné à tire indicatif et concerne les valeurs retrouvées dans la littérature selon divers protocole d’étude et dans diverses espèces animales.

Auteur Espèce Technique Diamètre

Moyen µm

Longueur Moyenne

mm

Longueur Vasculaire mm / mm3

Surface Vasculaire mm2/mm3

Densité Vasculaire

%

Pawlick (111) chat transillumination in vivo 5.1 108 939 15.3 2.1

Hunzinker (63) chat histologie 4.8 416 7.4 2.9

Wiederhold (145) chat histologie 4.7 426 6.2 2.8

Alexander (1) chat histologie 5

Lierse (85) chat histologie 6.5 407 8.3 1.4

Campbell (14) chat histologie 957

Nos résultats homme confocal 3D 6.47 52.95 492 11.94 2.82

Risser (126) marmouset synchrotron 3D 90.8 270 7.87 2.74

Bär(7) rat histologie 114 1090

Craigie (28) rat histologie 2.9 1067 9.7 0.7

Ma (90) rat épi-illumination in vivo 4.2

Risser (126) rat synchrotron 3D 77.25 292 7.82 2.36

Ivanov (65) rat épi-illumination in vivo 2 à 5 60 à 200

Hudetz (61) rat épi-illumination in vivo 4.4 56

Schlageter (132) rat histologie 4.7

Tableau 12 Valeurs morphométriques issues de différentes études

33

5 ANALYSE DES STRUCTURES ARBORESCENTES L’un des points évidents de l’architecture du réseau vasculaire cortical est constitué par le fait qu’il est composé d’un réseau capillaire maillé et de vaisseaux arborescents clairement identifiables. Il nous a semblé important de séparer ces 2 parties dans la mesure où leur analyse topologique utilise des outils différents. Nous verrons dans un premier chapitre méthodologique de quelle façon les structures artério-veineuses arborescentes ont été isolées du réseau maillé. Dès lors que nous avons extrait ces vaisseaux, la question de distinguer au sein de cette population les artères et les veines s’est posée. La distinction entre artères et veines n’a pu se faire, dans le contexte, que par des critères morphologiques, anatomiques, probablement subjectifs. Un deuxième chapitre expose les bases bibliographiques et personnelles qui ont permis cette discrimination et les résultats observés. D’autre part, d’un point de vue topologique, un vaisseau arborescent est décrit sur la base d’un schéma tenant compte de l’agencement de ses branches dans un ordre particulier loin d’être simplement dichotomique. Nous avons choisi d’utiliser la classification de Strahler modifiée par Kassab qui tient compte du diamètre des segments vasculaires en rapport. Les éléments qui sous-tendent cette classification sont décrits dans un troisième chapitre. Les résultats de cette analyse sont décrits et discutés ainsi que les perspectives qu’apporte ce type d’approche méthodologique. Enfin, une approche méthodologique de l’analyse des bifurcations est proposée à titre d’évaluation.

5.1 EXTRACTION DES ARBORESCENCES DU RESEAU

5.1.1 Méthodes L’origine du vaisseau est déterminée à l’aide de l’éditeur de Lineset de ResolveRT. Celle-ci se situe le plus souvent au niveau du sulcus en particulier ou de la surface du cortex en général. Certaines arborescences peuvent avoir leur origine apparente dans l’épaisseur du cortex en raison des aléas liés au plan de coupe. Un logiciel spécifique « Contrôle Réseau », programmé sous Visual BASIC permet d’enregistrer tout le trajet du vaisseau à partir de cette origine en respectant une contrainte de résistance. La résistance d’un segment donné est estimée selon la loi de Poiseuille (proportionnelle à la longueur du segment et inversement proportionnelle à la 4e puissance du diamètre) pour une viscosité relative apparente tenant compte des effets Fahraeus (réduction dynamique de l’hématocrite du sang circulant dans des petits vaisseaux) et Fahraeus-Lindqvist (la viscosité sanguine est fonction du diamètre et de l’hématocrite) et simplifiée à un hématocrite constant de 0.45. Nous avons utilisé la combinaison d’équations exponentielles proposée par Pries (118, 120) où le premier terme exprime l’augmentation de la viscosité avec la diminution du diamètre du vaisseau (pour des diamètres < 7µ) et les termes suivants adaptent la viscosité pour des diamètres plus importants. Cette estimation de la viscosité est basée sur une méta-analyse des données expérimentales obtenues à partir de plusieurs études in vitro.

645.006.03.145.0 44.22.3220 DD

rel ee −− ⋅−+⋅=η

En pratique l’utilisateur définit l’origine et la valeur de résistance qu’il souhaite et lance le logiciel. Le logiciel indique le nombre de segments recrutés et stocke les coordonnées et le diamètre de chaque point identifiés sur le trajet vasculaire

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dans un format texte qu’il est possible d’éditer dans ResolveRT. Dans la mesure où il existe une certaine irrégularité des diamètres des segments vasculaires (liée à la qualité de l’injection en certains points ou à la qualité de la numérisation des images), « Contrôle Réseau » permet de bloquer ou de forcer tout point du réseau afin d’affiner les limites de l’arborescence. Ceci est l’apanage de l’utilisateur qui décide de la conduite à tenir en fonction des résultats obtenus en incrémentant le critère résistance d’une valeur adaptée. Il en résulte que ce mode de sélection des vaisseaux est semi-automatique. Il peut fonctionner de manière quasi automatique lorsque le lineset est régulier et peu bruité, il demande plus d’interventions de l’utilisateur lorsque les segments vasculaires sont plus irréguliers. Notons que dans certains cas, il est nécessaire de réaliser des corrections du lineset pour poursuivre l’extraction. Ces modifications ont nécessité la réalisation d’un logiciel spécifique sous Visual Basic. Il est important de noter que cette méthode d’extraction des arborescences sensibilise l’opérateur à un niveau très distal. Les descriptions anatomiques les plus exhaustives s’arrêtent généralement à la collatéralité des branches secondaires d’un vaisseau alors qu’en utilisant ici un critère de résistance la manipulation est poussée jusqu’à la jonction avec le réseau capillaire assurant ainsi le recrutement le plus exhaustif pour chaque arborescence.

17 Extraction d’une arborescence veineuse du réseau. A gauche : vue latérale de l’arborescence

(z), à droite vue planaire (x, y).

5.1.2 Résultats 245 arborescences ont été extraites à partir des 10 mosaïques de l’étude. 10 arborescences ont été exclues dans la mesure où elles n’étaient constituées que par un tronc d’origine avec un développement arborescent minime voire nul, ne permettant généralement pas de les caractériser avec certitude et ne pouvant être utilisées dans une approche topologique.

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Ces 235 arborescences concernent en fait 200 vaisseaux . En effet, certains grands vaisseaux présentaient un développement tel que l’on puisse retrouver des fragments arborescents leur appartenant à des endroits différents d’une même mosaïque, voire d’une mosaïque à l’autre ou d’une coupe à l’autre. L’appartenance de plusieurs arborescences à un même vaisseau a toujours été vérifiée à la loupe binoculaire.

18 Une veine corticale principale dans la partie latérale du sillon collatéral. A gauche :

représentation en isosurface des 3 mosaïques recalées montrant le développement de ce vaisseaux à travers les 3 coupes de l’étude. A droite : le vaisseau seul et les 11 arborescences qui

le composent. Bien que ce travail ait été mené avec attention certains vaisseaux ou parties de vaisseaux ont pu être « oubliés ». La possibilité de soustraire les arborescences du réseau complet au sein de chaque mosaïque permet de visualiser ces fragments oubliés en intégrant, en plus, un simple seuillage du diamètre éliminant l’essentiel du réseau capillaire (arbitrairement fixé à 10 µm) ; cette manipulation du lineset n’ayant, à ce stade que l’intérêt de vérifier la qualité du travail d’extraction et permettant de revenir éventuellement sur un oubli flagrant. Nous reviendrons plus loin sur la séparation pertinente des deux composantes du réseau. La principale réflexion issue de cette étape tient au fait que le matériel d’étude ne permet pas de comprendre avec certitude les distributions vasculaires (artério-veineuses) au sein du cortex cérébral. La limitation essentielle est dans la faible épaisseur numérisée (210 µm) qui ne suffit pas à contenir une arborescence dans sa totalité. Par contre, le matériel de Duvernoy présente l’avantage d’offrir une injection complète du réseau vasculaire sachant que nous n’avons à aucun moment noté de diminution anormale de la densité vasculaire pouvant évoquer un « accident vasculaire » lié à la technique utilisée. Néanmoins chacune des arborescences extraites représente une partie plus ou moins complète d’un vaisseau entier et ce uniquement en raison des effets du microtome et des limites du microscope confocal sur ce type de matériel. Les 235 arborescences extraites représentent 29402 segments soit 12.5 % de la totalité de l’échantillon utilisé pour cette étude et peuvent donc être considérées comme un matériel contributif à une analyse topologique et statistique. Avant d’exposer ces résultats certaines remarques nous paraissent importantes. L’utilisation d’un outil informatique permettant de « perfuser » le réseau en tenant compte d’un critère de résistance nous a permis, en cours d’extraction, d’explorer

36

ponctuellement les rapports des vaisseaux entre eux et le comportement global du réseau. Les valeurs absolues des résistances utilisées ne peuvent être retenues car elles sont extrêmement variables d’une mosaïque à l’autre et parfois évoluent au sein d’une même mosaïque en fonction de la qualité de la segmentation. Par contre les valeurs relatives pouvant être visualisées sous ResolveRT en utilisant un simple codage couleur ont permis pour chaque arborescence d’obtenir une extraction homogène de chaque vaisseau selon ce critère en contrôlant pertinemment les points de blocage ou de forçage. La notion selon laquelle le réseau vasculaire cérébral est un réseau interconnecté continu a été aisément vérifiée puisque pour chaque mosaïque il a été possible d’injecter la totalité du réseau à partir de n’importe quelle entrée en s’affranchissant du critère de résistance. En incrémentant la valeur de résistance de manière très progressive certains phénomènes anastomotiques ont pu être appréhendés. Les zones « d’anastomoses » sont en clair les zones où l’utilisateur du logiciel « contrôle réseau » réalise le plus souvent les blocages nécessaires à l’extraction du vaisseau. Trois évènements ont pu se produire régulièrement :

- Des anastomoses transversales entre les artères dans la couche moyenne du cortex, formant un système d’arcades facilement identifiables à l’œil nu. Ces anastomoses se caractérisaient par la visualisation d’un vaisseau directement adjacent au vaisseau en cours d’extraction pour des valeurs de résistances restant inférieures au seuil capillaire local. Ceci est illustré sur la figure ci-dessous.

19 Extraction du système d’arcades sur une zone de la mosaïque V16s

A partir de ce système d’arcades apparaissent des vaisseaux droits ascendants (vers les couches profondes du cortex) ou descendants (récurrents vers la surface). Si cet disposition particulière est connue et décrite pour les artères du cortex, la notion d’une continuité d’un vaisseau à l’autre intégrant à priori une relation fonctionnelle n’apparaît pas dans la littérature. Cette relation est déduite à partir de la valeur de résistance utilisée (proportionnelle au diamètre) et notons que dans l’essentiel des cas ces arcades apparaissent avant que le réseau capillaire ne soit concerné.

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20 Le système d’arcades visible sur une image en codage couleur de la profondeur (V18s)

- Des anastomoses sous-corticales ou dans la couche la plus profonde

du cortex. Il s’agit cette fois soit de shunts artério-veineux qui ne font généralement pas de doute quant à leur identification puisqu’ils intéressent des grands vaisseaux dont la caractérisation est généralement plus aisée (voir photo), soit d’un système anastomotique large incluant des connexions entre artères mais aussi entre artères et veines. Le cortex est « perfusé » à distance du point d’entrée à partir de vaisseaux longs, situés le plus souvent dans la substance blanche et connectés les uns aux autres par des arcades en échelle. Cette disposition est notamment rencontrée dans les zones de plicature corticale, c’est-à-dire dans les mosaïques du sommet et de la base (voir photo). Il faut cependant noter qu’en raison de la géométrie particulière du cortex, c’est à ce niveau que nous avons numérisé le plus de substance blanche. Il n’est donc pas exclu que ces phénomènes puissent être présent dans d’autres zones du cortex.

21 Shunt artério-veineux sous-cortical (mosaïque V16s). La connexion entre les 2 vaisseaux est

visible dans le cercle blanc

22 A droite : Extraction du réseau interconnecté de la substance blanche sous-corticale au niveau de la base (où il est particulièrement regroupé). A gauche : visualisation des arcades étagées qui

relient les vaisseaux longitudinaux.

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- La dernière constatation issue de cette étape d’extraction vasculaire

par une approche fonctionnelle concerne l’existence de shunts artério-veineux intra-corticaux. Il s’agit cette fois de segments vasculaires de petit diamètre qui mettent en relation des vaisseaux adjacents pouvant évoquer les canaux préférentiels évoqués par Hasegawa (51). Cette particularité est illustrée ci-dessous.

23 Trajets artério-veineux préférentiels

Ces particularités ont été signalées car elles sont apparues au fur et à mesure du travail d’extraction. Elles n’ont pas été étudiées de manière proprement quantitative et il est difficile d’estimer leur fréquence. Celle-ci est néanmoins suffisante pour être apparue évidente au cours de l’étude. Chacune de ces relations vasculaires a été vérifiée avec soin pour éviter de mal interpréter ce qui, au premier abord, aurait pu être un accident de la segmentation. Elles seront discutées plus loin.

5.2 DIFFERENCIATION ARTERIO-VEINEUSE

5.2.1 Méthodes La distinction entre artères et veines reste un problème très actuel dans l’approche fonctionnelle du réseau vasculaire du cortex cérébral. Pfeifer est souvent cité en référence (34, 112) pour la qualité de ses travaux sur le sujet, au sein desquels artères et veines ont été systématiquement confondues. Notons que :

- Depuis les premiers travaux de Duret (33) les artères ont souvent suscitées plus de réflexions que les veines. Ceci est directement lié au fait que les injections veineuses rétrogrades sont techniquement difficiles, et leur opacification antérograde habituellement hasardeuse. Lazorthes (79, 80) n’injectait que le réseau artériel en utilisant une solution de haute viscosité, technique certes discriminatoire mais faisant abstraction compète du réseau veineux.

- Le plus sûr moyen de différencier artères et veines dans le cortex est

de les analyser à partir de leur origine au niveau du réseau pie-mérien. Ceci n’est pas possible à partir des coupes injectées à l’encre de chine car les gros vaisseaux pie-mériens sont probablement lésés par le microtome et l’observation à la loupe binoculaire ou en microscopie confocale ne permet pas de les discerner.

- Enfin les études de moulages en résine en microscopie électronique permettent une caractérisation nette par l’observation des impressions nucléaires (34, 98, 100, 122) qui sont typiquement ovoïdes pour les artères

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et arrondies et profondes pour les veines. Cette dernière approche est ponctuellement très précise pour la description des vaisseaux, mais elle suppose une injection parfaite avec une réplétion complète du vaisseau, voire de tous les vaisseaux au sein d’une région d’étude ce qui paraît difficile voire impossible à obtenir.

Il existe dans la littérature anatomique de nombreuses descriptions des artères et des veines intra-corticales centrées autour d’une catégorie de vaisseaux dont les caractères devenus flagrants permettent à l’observateur entraîné de les discriminer sans trop de risque d’erreur. C’est essentiellement à partir de critères morphologiques que nous avons différenciés artères et veines intra-corticales. Les caractères métaphoriques habituellement rencontrés sont les suivants :

- Concernant les artères : o L’aspect en candélabre de Rowbotham et Elsa Little (128), o Les branches courbes ascendantes récurrentes de Saunders et

Bell (130), o La vannerie vasculaire de Hassler (52, 53) décrit l’enroulement de

certaines collatérales autour de leur tronc d’origine donnant un aspect de corde tressée

o L’aspect d’un orme pour Courville (26)…

- Concernant les veines o L’aspect touffu en buisson de Saunders (130) du dense réseau

collatéral, o Pour Courville (26) elles ont l’aspect d’un chêne…

Ces caractères sont illustrés ci-dessous :

24 Artère corticale type, présentant des branches courbes ascendantes, puis récurrentes donnant

l’aspect d’un candélabre ou d’un orme.

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25 Torsade artérielle, « vannerie vasculaire »:

noter que le procédé de segmentation fait disparaître cet aspect

26 Veines corticales typiques : à gauche aspect en « chêne » montrant des collatérales primaires

d’autant plus longues que l’on s’éloigne de la surface du cortex ; à droite aspect touffu, « en buisson » selon Saunders.

D’autres caractères morphologiques sont mis en avant :

- Le plus grand volume des veines principales et leur large territoire de drainage est remarqué par plusieurs auteurs dont Lewis (84)

- L’aspect des bifurcations primaires à angle droit pour les veines, à angle aigu pour les artères (130, 131),

- L’aspect conique ou triangulaire des petites bifurcations veineuses (51,

130),ce dernier point est souligné par Duvernoy qui note quant à lui une nette augmentation de diamètre au niveau de ces bifurcations(34),

- Les tortuosités présentées par les artères à la jonction substance grise – substance blanche sont notées par certains(21, 112) sans qu’il leur soit attribué un rôle ou une cause bien défini.

41

27 A droite : Bifurcations veineuses de forme triangulaire ou conique comportant un certain degré

d’élargissement. A gauche : bifurcations artérielles se faisant à angle plus aigu et présentant souvent un aspect d’enroulement.

28 Boucles sur le tronc d’une artère à la jonction cortex-substance banche

A partir de ces caractères « classiques », artères et veines types sont « aisément » reconnues. Cependant, le polymorphisme des arborescences vasculaire du cortex cérébral fait que certains vaisseaux échappent à ces descriptions et ce n’est que par un faisceau d’arguments et des observations répétées que l’on peut déduire la nature artérielle ou veineuse d’un vaisseau. Ceci est d’autant plus vrai que l’arborescence est de petite taille. Il faut encore signaler que la partie latérale du sillon collatéral avait été initialement sélectionnée par Duvernoy pour la qualité de l’injection à cet endroit, parce que les vaisseaux étaient orientés dans un plan parallèle au plan de coupe et enfin parce que ces vaisseaux étaient assez caractéristiques sur le plan morphologique. Il s’avère qu’en élargissant la zone d’étude à la partie médiale du sulcus et aux zones de gyration nous étions confrontés à des vaisseaux moins typiques et souvent fragmentaires car s’écartant du plan de coupe de manière significative. Dans la mesure où nous ne disposions parfois que d’éléments très partiels, il nous a paru nécessaire de contrôler chacune des arborescences extraites en l’observant directement sur la coupe à la loupe binoculaire. En effet, nous ne disposons, sur l’image en microscopie confocale, que des deux tiers de l’épaisseur de la coupe native. Il peut arriver que l’information manquante sur l’image numérisée apparaisse à la loupe et permette la caractérisation, notamment pour les vaisseaux se développant à la surface ou dans la profondeur de la coupe. La vision tridimensionnelle qu’offre la loupe binoculaire reste fondamentale dans l’appréciation du tonus des parois vasculaires. En effet, les troncs veineux sont souvent aplatis par la préparation alors que les troncs artériels gardent une certaine résistance. On peut utiliser cet argument en

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utilisant les outils de représentation tridimensionnelle offert par ResolveRT qui permet en plus de manipuler l’image pour l’observer selon différents angles de vision.

29 Troncs vasculaires vu sous différents angles. A et B : noter l’aspect aplati du tronc principal qui

correspond à une veine. C et D : aspect plus tonique d’un vaisseau artériel. En dernier recours l’origine du vaisseau dans l’épaisseur de la coupe a pu également servir à argumenter la caractérisation (surtout pour les petits vaisseaux) en spéculant sur le fait que ces vaisseaux proviennent d’un même tronc dans la mesure où ils ne sont pas trop éloignés les uns des autres.

30 Les flèches blanches indiquent des artères qui semblent naitre d’un même vaisseau dans le

sillon ; les flèches bleues indiquent des veines selon la même analogie. Vaisseau par vaisseau, chaque observation (numérique ou optique) a été consignée dans un document synthétisant les résultats. Enfin, pour pouvoir évaluer de manière systématique le développement des arborescences dans l’épaisseur du cortex, nous avons mesuré pour chaque vaisseau identifié :

- l’épaisseur du cortex à son niveau, - la distance séparant l’origine du tronc par rapport à la surface du

cortex, - la distance séparant la branche terminale la plus basse de la surface

corticale, - la distance séparant la branche terminale la plus haute de la surface

corticale, - ces 2 distances étant ramenées au pourcentage de l’épaisseur

corticale pour évaluer la distribution du vaisseau et éventuellement le classer.

Les classifications utilisées sont décrites avec les résultats pour faciliter la compréhension du document.

A B C D

43

31 Mesures réalisées pour quantifier la position des vaisseaux par rapport à l’épaisseur du cortex

(ResolveRT)

5.2.2 Résultats

5.2.2.1 Différenciation artério-veineuse et classif ication Sur les 235 arborescences examinées, selon des critères morphologiques, 155 ont été interprétées comme étant de nature artérielle et 80 comme étant de nature veineuse. Ces 235 arborescences correspondent à 200 vaisseaux qui, dès lors, sont séparés en 141 artères et 59 veines. Si ces vaisseaux peuvent être facilement identifiés dans les zones rectilignes du cortex, leurs caractéristiques morphologiques sont souvent moins proches des descriptions classiques dans les zones dites de gyration ou de plicature. D’autre part, dans ce polymorphisme vasculaire, certains vaisseaux peuvent être considérés comme réellement atypiques. Leur distinction est alors le fait d’un recoupement d’indices dans lequel la forme n’apparaît pas comme critère de premier ordre. Dans la plupart des descriptions concernant les artères et les veines intra-corticales ces vaisseaux sont séparés en 3 groupes (petit, moyen, grand) en fonction de leur degré de pénétration dans l’épaisseur du cortex (lequel est grossièrement divisé en trois tiers) (79, 80, 122). Nous n’avons pas utilisé cette classification car elle ne tient pas compte de la réalité cyto-architectonique sous-jacente. Duvernoy a proposé une classification en 5 groupes (en fait 6 pour les artères et 5 pour les veines) calquée sur l’organisation histologique du cortex cérébral (34, 36). Selon Duvernoy les vaisseaux du cortex sont classés de la manière suivante :

- Groupe 1 : Vaisseaux de la couche 1 (couche moléculaire) pouvant atteindre la couche 2 (couche granulaire externe)

- Groupe 2 : Vaisseaux qui atteignent la partie superficielle de la couche pyramidale (IIIa, b)

- Groupe 3 : Vaisseaux les plus nombreux selon Duvernoy ; ils pénètrent dans la partie moyenne ou centrale du cortex qui est la plus

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vascularisée. Cette région est centrée sur la couche IV (granulaire interne) et déborde au-dessous sur la couche pyramidale (IIIc) et au-dessus sur la couche ganglionnaire (Va)

- Groupe 4 : Vaisseaux qui atteignent la couche multiforme et la limite interne de la zone sous-corticale

- Groupe 5 : Vaisseaux qui traversent le cortex et vascularisent aussi bien le cortex que la substance blanche adjacente.

- Groupe 6 : ce groupe ne concerne que certaines artères qui traversent le cortex sans donner de bifurcation et vascularisent seulement la substance blanche. Duret les appelle artères médullaires. D’après Bär (7), pendant le développement cortical, les artères les plus longues sont les premières à apparaître, les artères les plus courtes sont les dernières.

32 Classification des vaisseaux du cortex selon Duvernoy

Les tableaux ci-dessous exposent les résultats de la classification de Duvernoy pour les 200 vaisseaux extraits des 10 mosaïques en valeur absolue et en pourcentage du nombre d’observations.

Mosaïque Artères Veines Total

A1 A2 A3 A4 A5 Total V1 V2 V3 V4 V5 Total

V16 l 0 3 3 5 8 19 0 3 3 1 0 7 26

V17 l 0 5 6 3 4 18 0 0 1 4 1 6 24

V18 l 0 6 6 2 4 18 0 1 3 2 0 6 24

V16m 0 5 5 2 2 14 0 1 3 3 0 7 21

V17m 0 3 2 1 5 11 0 2 3 3 1 9 20

V18m 0 2 4 3 4 13 1 1 2 0 2 6 19

V16s 0 0 3 2 2 7 0 0 0 2 1 3 10

V17s 0 2 7 4 2 15 0 0 1 2 1 4 19

V18s 0 0 2 7 2 11 0 0 1 0 0 1 12

V18b 0 3 4 5 4 16 0 1 5 1 2 9 25

Latéral 0 14 15 10 16 55 0 4 7 7 1 19 74

Médial 0 10 11 6 11 38 1 4 8 6 3 22 60

Sommet 0 2 12 13 6 33 0 0 2 4 2 8 41

Base 0 3 4 5 4 16 0 1 5 1 2 9 25

V16 0 8 11 9 12 40 0 4 6 6 1 17 57

V17 0 10 15 8 11 44 0 2 5 9 3 19 63

V18 0 11 16 17 14 58 1 3 11 3 4 22 80

Global 0 29 42 34 37 142 1 9 22 18 8 58 200 Tableau 13 Classification de Duvernoy, par mosaïque, par région, par coupe, global.

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Mosaïque Artères Veines Total

A1 A2 A3 A4 A5 Total V1 V2 V3 V4 V5 Total

V16 l 0 11.54 11.54 19.23 30.77 73.08 0.00 11.54 11.54 3.85 0.00 26.92 100.00

V17 l 0 20.83 25.00 12.50 16.67 75.00 0.00 0.00 4.17 16.67 4.17 25.00 100.00

V18 l 0 25.00 25.00 8.33 16.67 75.00 0.00 4.17 12.50 8.33 0.00 25.00 100.00

V16m 0 23.81 23.81 9.52 9.52 66.67 0.00 4.76 14.29 14.29 0.00 33.33 100.00 V17m 0 15.00 10.00 5.00 25.00 55.00 0.00 10.00 15.00 15.00 5.00 45.00 100.00

V18m 0 10.53 21.05 15.79 21.05 68.42 5.26 5.26 10.53 0.00 10.53 31.58 100.00

V16s 0 0.00 30.00 20.00 20.00 70.00 0.00 0.00 0.00 20.00 10.00 30.00 100.00

V17s 0 10.53 36.84 21.05 10.53 78.95 0.00 0.00 5.26 10.53 5.26 21.05 100.00

V18s 0 0.00 16.67 58.33 16.67 91.67 0.00 0.00 8.33 0.00 0.00 8.33 100.00

V18b 0 12.00 16.00 20.00 16.00 64.00 0.00 4.00 20.00 4.00 8.00 36.00 100.00

Latéral 0 18.92 20.27 13.51 21.62 74.32 0.00 5.41 9.46 9.46 1.35 25.68 100.00

Médial 0 16.67 18.33 10.00 18.33 63.33 1.67 6.67 13.33 10.00 5.00 36.67 100.00

Sommet 0 4.88 29.27 31.71 14.63 80.49 0.00 0.00 4.88 9.76 4.88 19.51 100.00

Base 0 12.00 16 20.00 16.00 64.00 0.00 4.00 20.00 4.00 8.00 36.00 100.00

V16 0 14.04 19.30 15.79 21.05 70.18 0.00 7.02 10.53 10.53 1.75 29.82 100.00

V17 0 15.87 23.81 12.70 17.46 69.84 0.00 3.17 7.94 14.29 4.76 30.16 100.00

V18 0 13.75 20.00 21.25 17.50 72.50 1.25 3.75 13.75 3.75 5.00 27.50 100.00

Global 0 14.50 21.00 17.00 18.50 71.00 0.50 4.50 11.00 9.00 4.00 29.00 100.00 Tableau 14 Classification de Duvernoy, par mosaïque, par région, par coupe, global (%).

Les tableaux 13 et 14 montrent que les distributions de chaque groupe restent difficiles à apprécier. Les régions latérales du sulcus qui sont les mieux orientées par rapport aux vaisseaux sont probablement celles qui donnent la meilleure idée de cette distribution. Nous reviendrons sur la distribution artério-veineuse après avoir examiné cette population groupe par groupe. Nous n’avons identifié aucune artère et une seule veine du groupe 1. Ces vaisseaux sont généralement assez mal injectés et leur développement intracortical est extrêmement faible. Compte-tenu de leur faible diamètre leur résistance s’apparente à celle du réseau capillaire. De par le procédé d’extraction que nous avons utilisé, il était très difficile de fixer une limite entre la structure arborescente et le réseau maillé pour ce type de vaisseau. Il existe cependant des « raccordements » évidents du réseau capillaire au réseau pie-mérien qui peuvent être interprété comme autant de structures appartenant à ce groupe. Ceci dépasse les limites du matériel et de la méthode utilisés dans cette étude.

33 V1

Les vaisseaux des groupes 2 et 3 sont assez nombreux (les artères et les veines du groupe 3 sont respectivement les plus nombreux) et présentent des

46

caractéristiques assez communes, y compris au niveau des zones de gyration. Les troncs d’origine de ces vaisseaux donnent souvent une première branche collatérale à proximité de la surface corticale, ce qui leur donne un aspect presque bi-tronculaire. Leur caractérisation repose ensuite sur les aspects morphologiques classiques décrits plus haut. Quelques exemples sont représentés ci-après :

34 A2 A2 V2 V2

35 A3 A3 V3 V3

47

Les vaisseaux du groupe 4 sont en fait les vaisseaux types à partir desquels est déduit l’essentiel des caractéristiques morphologiques. Ce sont les vaisseaux les plus visibles car ils traversent l’essentiel de l’épaisseur du cortex et donnent leurs branches terminales au niveau des couches IV et V. Ce sont les vaisseaux « tape à l’œil » qui sont tout de suite visibles dans leur totalité à l’examen du cortex à faible grossissement.

36 Vaisseaux types (d’après Duvernoy)

37 V4 V4 A4 A4

48

Les vaisseaux du groupe 5 sont des vaisseaux traversant qui participent de manière variable à la vascularisation du cortex et vont ensuite se terminer dans la substance blanche. Les artères semblent avoir une périodicité remarquable dans les coupes que nous avons examinées notamment au niveau de V16 et V17. Elles sont globalement plus nombreuses que les artères du groupe 4. Les veines sont très volumineuses et constituent les veines principales du cortex. Sur le matériel utilisé ces vaisseaux sont toujours extraits de manière très partielle et souvent des segments sont retrouvés d’une mosaïque à l’autre voire d’une coupe à l’autre. Ces veines sont, à l’inverse des artères du même groupe, moins fréquentes que les veines du groupe 4.

38 A5 A5 A5

39 Fragments de veines principales du cortex (V5)

49

Toutes les artères traversantes examinées donnaient des branches corticales. Le nombre de ces branches restait néanmoins variable. Bien qu’elle ait été classée dans le groupe A5 l’artère représentée ci-dessous pourrait être rangée dans le groupe A6 car sa distribution corticale s’en tient à 2 collatérales très profondes qui se distribuent à la jonction cortico-sous-corticale. Cette artère est assez rectiligne ou directe et ne donne pas les boucles que l’on rencontre habituellement à la jonction entre le cortex et la substance blanche dans le groupe A5.

40 Probable artère du groupe A6

Certains vaisseaux sont parfois très atypiques. Il s’agit notamment des artères multi-tronculaires dont un exemple est donné ci-dessous. Dans les zones de plicature les grands vaisseaux perdent également les caractéristiques classiques. On peut envisager que ces vaisseaux aient pu subir un certain degré de transformation à cause du processus de gyration. Ceci laisserait à supposer qu’ils étaient présents avant que ce processus ne se produise ou que l’architecture tissulaire soit particulièrement différente au niveau de régions que l’on peut considérer comme des zones de transition fonctionnelle. Ces remarques restent bien sûr à reconsidérer lors de travaux ultérieurs.

41 Artère multi-tronculaire

50

42 A gauche : artère du groupe A4 présentant un développement transversal très important dans

une zone de « plicature corticale en extension ». A droite : une veine du groupe V5 ne présentant pas le large développement transversal qu’il est classique d’observer pour un vaisseau de cette

taille, dans une zone de « plicature corticale en contraction ». En dehors des groupes A1, V1 et A6 qui ne sont pas ou peu représentés, les vaisseaux examinés s’intègrent correctement dans la classification de Duvernoy. Il faut noter que la taille (ou le développement intracortical) et l’aspect morphologique ne suffisent pas à eux seuls. En pratique, la division cyto-architectonique du cortex étudié nous manque cruellement puisque c’est à partir de cet élément qu’est construite cette classification.

5.2.2.2 Distribution artério-veineuse Le rapport du nombre d’artères sur le nombre de veines est exprimé dans le tableau suivant, globalement et groupe par groupe en fonction de la classification de Duvernoy.

Mosaïque A/V A/V Groupe 2 A/V Groupe 3 A/V Groupe 4 A/V Groupe 5

V16 l 2.71 1.00 1.00 5.00 V17 l 3.00 6.00 0.75 4.00 V18 l 3.00 6.00 2.00 1.00

V16m 2.00 5.00 1.67 0.67 V17m 1.22 1.50 0.67 0.33 5.00 V18m 2.17 2.00 2.00 2.00

V16s 2.33 1.00 2.00 V17s 3.75 7.00 2.00 2.00 V18s 11.00 2.00

V18b 1.78 3.00 0.80 5.00 2.00

Latéral 2.89 3.50 2.14 1.43 16.00 Médial 1.73 2.50 1.38 1.00 3.67 Sommet 4.13 6.00 3.25 3.00 Base 1.78 3.00 0.80 5.00 2.00

V16 2.35 2.00 1.83 1.50 12.00 V17 2.32 5.00 3.00 0.89 3.67 V18 2.64 3.67 1.45 5.67 3.50

Total 2.45 3.22 1.91 1.89 4.63 Tableau 15 Nombre d’artères/nombre de veines.

Comme le laissait entendre le paragraphe précédent les artères sont environ 2.5 fois plus nombreuses que les veines. On peut noter que ce rapport reste stable

51

d’une coupe à l’autre. Il semble par contre exister des variations en fonction de la région qui sont cependant difficiles à vérifier. La mosaïque V18s ne contient qu’une seule veine et biaise à l’évidence toute tentative d’analyse fiable. Il est encore plus délicat de s’exercer à des comparaisons en fonction du groupe puisque certaines cases du tableau ci-dessus ne sont pas renseignées (absence de veine) et que les résultats varient nettement d’une mosaïque à l’autre. Le chiffre de 4.63 retrouvé pour les vaisseaux du groupe 5 n’est peut-être pas aussi surprenant. Il s’approche de la valeur de Duvernoy qui considère que dans les couches moyenne et profonde du cortex les artères sont au moins quatre fois plus nombreuses que les veines. Ces vaisseaux sont les plus visibles et se prêtent facilement à un comptage visuel en microscopie optique. Malheureusement, compte tenu de leur taille, ce sont ceux qui sont le plus souvent amputé dans nos échantillons. Ces résultats sont donc à prendre avec réserve. L’analyse des structures arborescentes nécessite une étude à une échelle plus tridimensionnelle. La faible épaisseur des coupes fait que la distribution des vaisseaux est difficile à appréhender en dehors de certaines zones ou le plan de section permet de recruter plusieurs vaisseaux contigus. Cette constatation est nécessairement encore plus vraie pour les veines qui sont donc en nombre inférieur. L’hétérogénéité de la distribution topographique des artères et des veines apparaît nettement sur les représentations ci-dessous, pour chaque mosaïque.

V16l V17l

V18l V16m

V17m V18m

52

V16s V17s

V18s V18b

43 Distribution artério-veineuse mosaïque par mosaïque On peut néanmoins se livrer à une analyse plus qualitative des périodicités vasculaires. Les images ci-dessous mettent en évidence ces périodicités en fonction des groupes.

44 Sur V16l on recrute plusieurs artères du groupe A5. Elles sont régulièrement espacées (environ

700 à 800 µm en fonction du niveau de la mesure)

53

45 V16l : les artères du groupe A4 présentent sur cette coupe une certaine régularité. La périodicité

de ces vaisseaux est moins nette que pour les artères de type A5

46 V18l : les artères appartenant aux groupes A2 et A3 apparaissent par endroit assez regroupées (environ 300µm). Ces regroupements comprenant 2 à 3 artères sont eux-mêmes distribués assez

régulièrement sur cette coupe.

47 V16l :les veines des groupes V2 et V3 pénètrent dans le cortex à des intervalles grossièrement

réguliers (500 à 700 µm).

54

48 V17l : veines de type V4 espacées d’environ 3 mm sur cette coupe

49 Projection en 2D des 9 mosaïques en ne représentant que les veines principales (V5) du cortex : celles-ci apparaissent à environ 2 mm les unes des autres. Barre d’échelle=2mm.

A partir de ces observations purement anatomiques il apparaît que le rapport artères/veines des vaisseaux de type 4 et 5 est bien de l’ordre de 4/1 (une artère tous les 7-800 µm pour une veine tous les 2 à 3 mm). Pour les vaisseaux plus petits (groupes 2 et 3) ce rapport pourrait approcher 2/1. Il est évident que ces hypothèses, bien que soutenues par la qualité de l’injection en certains endroits, méritent vérification. Elles ont l’avantage de permettre d’appréhender le volume nécessaire à identifier clairement cette distribution topographique. Il apparaît que la numérisation d’une très large « surface » corticale (x, y) trouve sa justification dans les résultats ci-dessus, par contre la limitation en z entraîne une perte d’information certaine, bien que l’analyse de 3 coupes adjacentes permette de recruter des vaisseaux sur environ 1mm dans cette direction. Ces aspects méthodologiques qui touchent à la fois aux techniques d’injections anatomiques et d’acquisition d’images tridimensionnelles de haute résolution seront discutées à la fin de ce travail en terme de perspectives.

55

5.3 ANALYSE TOPOLOGIQUE

5.3.1 Description générale Il est possible de décrire un arbre vasculaire par un système « généalogique » utilisant des générations et calculant le nombre de branches issues d’un ascendant commun (144). Il est également possible d’utiliser la méthode de Strahler (57, 137, 138) qui est utilisée en géologie pour caractériser les bassins de drainage d’un cour d’eau. Dans le système de Strahler le plus petit vaisseau est dit d’ordre 1. Quand 2 vaisseaux d’ordre 1 se rencontrent le vaisseau de diamètre supérieur qui en résulte est dit d’ordre 2, quand 2 vaisseaux d’ordre 2 se rencontrent ils forment un vaisseau d’ordre 3… Par contre, quand un vaisseau d’ordre 1 rencontre un vaisseau d’ordre 2, le numéro d’ordre du tronc qui en est issu reste 2… Dans une arborescence vasculaire où les bifurcations seraient symétriques – un vaisseau parent donne naissance à 2 branches identiques – alors le rapport de branchement est égal à 2 (nombre de vaisseau d’ordre n au nombre de vaisseau d’ordre n+1). Le système de Strahler tient compte de l’aspect « irrégulier » (ou asymétrique) du branchement et donne une idée plus précise du mode de connexion. Kassab et Fung propose une modification du système de Strahler (43, 73). Chaque segment de vaisseau est défini par une longueur et un diamètre. D’après la loi de Poiseuille, pour un gradient de pression sanguine donné, le débit est proportionnel à la longueur et inversement lié à la puissance 4e du diamètre. La priorité est donnée au diamètre. On définit la moyenne (Dn) et la déviation standard (SDn) des diamètres des segments d’ordre n. Quand un segment d’ordre n rencontre un autre segment d’ordre n ou inférieur, le segment qui en résulte est dit d’ordre n+1 si et seulement si :

son diamètre est plus grand que [(Dn + SDn) + ( Dn+1 - SDn+1)] / 2 Sinon son numéro d’ordre reste n. Un système d’itérations est nécessaire pour déterminer les numéros d’ordre de tous les segments. Le plus simple est d’abord d’ignorer l’équation précédente et d’appliquer la simple loi de Strahler où deux segments d’ordre n donnent naissance à un segment d’ordre n+1, quand un segment d’ordre n rencontre un segment d’ordre n-1 le segment qui en résulte reste d’ordre n. A partir de cette première itération la moyenne (Dn) et la déviation standard (SDn) sont calculées puis le paramètre « diamètre » est appliqué à chaque bifurcation en commençant avec n = 1. Les numéros d’ordre sont alors corrigés si nécessaire. (Dn) et (SDn) sont alors recalculées et le procédé s’arrête lorsque la convergence est obtenue. Normalement 2 à 3 itérations suffisent. Les résultats de ce procédé montrent que plusieurs segments de même ordre peuvent être connectés en série se comportant d’un point de vue fonctionnel comme un seul vaisseau de même diamètre. Ce type de combinaison de segments est appelé un élément. La relation entre le nombre total d’éléments d’ordre n, E(n), et le nombre total de segments d’ordre n, S(n) est :

S(n) = E(n).R(n)

56

Où R(n) est égal au nombre de segments d’ordre n divisé par le nombre d’éléments de même ordre n. Le mode de bifurcation d’une arborescence est alors décrit par une matrice de connectivité, C(m,n), rapport du nombre d’éléments d’ordre m issus d’éléments d’ordre n sur le nombre total d’éléments d’ordre n. On peut exprimer la relation entre le diamètre moyen (ou la longueur moyenne) et le numéro d’ordre par une équation du type :

Log10 Xn = a + bn Xn représente le diamètre moyen, Dn, ou la longueur moyenne, Ln, ou le nombre total d’éléments d’ordre n, Nn. a et b sont des constantes. b est positive pour Dn et Ln dont la valeur augmente avec le numéro d’ordre et négative pour Nn dont la valeur diminue avec le numéro d’ordre. Si on applique l’équation précédente à Xn puis à Xn-1 et que l’on soustrait on obtient :

Log10(Xn/Xn-1) = b donc Xn/Xn-1 = 10b Ceci montre que le rapport des diamètres (ou longueurs ou nombre d’éléments) des segments d’ordre successifs est une constante indépendante de n. Les 2 équations précédentes sont connues sous le terme de lois de Horton. Un système obéissant à cette loi est considéré fractal.

5.3.2 Application aux vaisseaux du cortex cérébral La classification de « Strahler-Kassab » décompose chaque arborescence en éléments – constitués d’un ou plusieurs segments contigus, un segment reliant entre eux deux nœuds ou bifurcations consécutifs. Chaque élément se voit attribuer un numéro d’ordre en fonction de sa position « hiérarchique » dans l’arborescence, en commençant par l’ordre 0 pour les branches « terminales », pré- ou post-capillaires suivant que l’arborescence est une artériole ou une veinule, l’ordre le plus élevé étant attribué à ou aux éléments portés par le « tronc » principal.

5.3.2.1 Notion de groupe – Classification des arbor escences selon Strahler-Kassab

Nous avons soumis l’ensemble des 235 arborescences extraites à la classification de Strahler-Kassab et classé les résultats en fonction du nombre d’ordres inclus dans la décomposition de l’arborescence. Ce nombre est égal à la valeur de l’ordre maximal augmenté d’une unité. De même, pour chaque arborescence ont été définis les coefficients moyens des lois de Horton pour chacune des 3 variables supposées satisfaire à ces lois, soit le nombre d’éléments, le diamètre et la longueur moyens pour chaque ordre. Ceci a permis d’étudier ces résultats de manière statistique et d’envisager de mettre en évidence une différence entre les divers paramètres des lois de Horton, la classe morphologique de chaque arborescence et sa nature artérielle ou veineuse.

57

Des exemples de cette classification topologiques sont donnés ci-dessous.

50 A droite : Classification de Strahler-Kassab pour une artère de type A5 ; Les différents ordres identifiés sont représentés en codage couleur (l’ordre maximal 4 identifie une arborescence du groupe S5). A gauche : lois de Horton pour chaque variable ; en haut, le nombre d’élément dans chaque ordre, en bas, le diamètre et la longueur moyens pour chaque ordre.

51 A droite : Classification de Strahler-Kassab pour une artère de type A4 ; Les différents ordres identifiés sont représentés en codage couleur (l’ordre maximal 3 identifie une arborescence du groupe S4). A gauche : lois de Horton pour chaque variable ; en haut, le nombre d’élément dans chaque ordre, en bas, le diamètre et la longueur moyens pour chaque ordre.

58

52 A droite : Classification de Strahler-Kassab pour une veine de type V2 ; Les différents ordres identifiés sont représentés en codage couleur (l’ordre maximal 2 identifie une arborescence du groupe S3). A gauche : lois de Horton pour chaque variable ; en haut, le nombre d’élément dans chaque ordre, en bas, le diamètre et la longueur moyens pour chaque ordre.

53 A droite : Classification de Strahler-Kassab pour une veine de type V2 ; Les différents ordres identifiés sont représentés en codage couleur (l’ordre maximal 1 identifie une arborescence du groupe S2). A gauche : lois de Horton pour chaque variable ; en haut, le nombre d’élément dans chaque ordre, en bas, le diamètre et la longueur moyens pour chaque ordre. La répartition en fonction du groupe apparaît sur le tableau suivant. Les groupes S2 et S5 sont très peu représentés. L’essentiel des arborescences appartient aux groupes S3 et S4.

59

Groupe (=Ordre maximal + 1) S2 S3 S4 S5

Nombre d’arborescences 6 107 116 6

Tableau 16 Classification par groupe selon Strahler-Kassab On peut assimiler le groupe selon Strahler à la taille du vaisseau. Plus un vaisseau est grand, plus sa distribution collatérale est importante et plus il monte dans l’échelle de Strahler. Cette notion garde sa logique mais reste difficile à démontrer dans le contexte de cette étude. En effet, pour beaucoup d’arborescences on ne dispose que de fragments vasculaires. Le graphique suivant compare le groupe de Strahler au groupe de Duvernoy.

23

45 S2

S3

S4

S5

0

5

10

15

20

25

Fréquence (%)

groupe (Duvernoy) ordre (Strahler)

54 Comparaison Duvernoy/Strahler-Kassab

Cette relative dispersion peut s’illustrer par le vaisseau suivant. Il s’agit d’une artère de type A5, vaisseau habituellement transcortical, qui est ici amputée de nombre de ses collatérales et génère uniquement 3 ordres selon Strahler-Kassab.

Artère du groupe A5 selon Duvernoy, groupe S3 selon Strahler-Kassab

Il existe une certaine cohérence entre la classification morphologique et la classification topologique.

- Le coefficient de corrélation global est mesuré à 0.65

- Le % de coïncidences sur la diagonale à 0.43 - Le % de coïncidences sur la bande tri-

diagonale à 0.92

60

Ceci conduit à analyser la distribution des coefficients de régression concernant les 3 variables étudiées par les lois de Horton pour les 235 arborescences analysées.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

r

Fré

quen

ce (%

)

N

D

L

55 Coefficients de régression des nombre d’éléments (N), diamètres moyens (D) et longueurs

moyennes (L) pour les 235 arborescences étudiés. Notons que la longueur est la variable la moins ajustée. Sachant que la loi de Horton examine les moyennes des longueurs et des diamètres pour chaque ordre, une part de la variabilité de ces variables est déjà ignorée par l’analyse.

5.3.2.2 Apport de l’analyse topologique dans la dis crimination artério-veineuse

5.3.2.2.1 Diamètre des arborescences à l’origine Les critères d’extraction à l’origine n’ont pas intégré le fait que le vaisseau naisse directement de la surface et nombres d’arborescences extraites sont donc des fragments vasculaires isolés dans l’épaisseur du cortex. Disposant, pour chaque arborescence de la position de l’origine par rapport à la surface nous avons isolé une population de vaisseaux que l’on peut considérés « entiers » dont l’origine se situe entre 0 et 200 µm de la surface. Cette population comprend 138 vaisseaux, soit 92 artères et 46 veines. Il est extrêmement difficile de déterminer le diamètre à l’origine de manière rigoureuse que ce soit à partir des images natives ou à partir du squelette. En effet, sur les images natives, l’origine dans le sillon apparaît souvent évasée, alors que sur les reconstructions des vaisseaux à partir du squelette cette zone est le plus souvent effilée (Illustration ci-dessous). Nous avons donc estimé le diamètre à l’origine à partir des données de la classification de Strahler-Kassab, en retenant la moyenne des valeurs maximum du diamètre des éléments d’ordre maximal pour chacun des 138 vaisseaux. Les résultats apparaissent dans le tableau ci-dessous, classés par groupe de Duvernoy. Les valeurs proposées par cet auteur pour chaque groupe sont exposés dans la dernière colonne.

61

56 Sur l’image en projection (codage couleur de la profondeur) les origines vasculaires sont

légèrement évasées alors que sur certaines reconstructions à partir du lineset elles peuvent être particulièrement effilées.

N D Min Max D Duvernoy

Artères du groupe 1 0 ND ND ND 10

Artères du groupe 2 24 23.48 15.21 32.92 15-25

Artères du groupe 3 39 27.96 17.77 43.24 15-30

Artères du groupe 4 21 30.78 20.75 37.76 30-40

Artères du groupe 5 8 34.90 20.19 51.66 30-75

Artères du groupe 6 0 ND ND ND 50-240

Veines du groupe 1 1 17.54 17.54 17.54 20

Veines du groupe 2 9 22.01 17.43 25.65 30

Veines du groupe 3 24 28.00 17.98 38.45 45

Veines du groupe 4 9 31.23 17.98 44.05 65

Veines du groupe 5 3 49.66 39.39 71.16 80

138

Tableau 17 Diamètres « à l’origine » Pour Reina De La Torre (122) qui sépare les artères intra-corticales en 3 groupes, les petites artères ont un diamètre moyen de 20 µm, les artères dites moyennes ont un diamètre de 30 à 60 µm, les grandes artères ont un diamètre moyen de 60 µm. Ces valeurs sont mesurées sur des moulages en mercox. Les valeurs que nous proposons ici, sous-estiment obligatoirement le diamètre à l’origine tel qu’il a pu être appréhendé par Duvernoy (34) ou par Reina. (122) Ceci est notamment vrai pour les veines. Les veines sont aussi les éléments qui sont le moins bien injectés et dont la paroi vasculaire est la plus déformée par la préparation. Si nous retenons que la méthode de squelettisation et de calcul des cartes de distance retient le plus petit rayon qu’elle rencontre, il est possible que la mesure des troncs veineux soit plus sous-estimée que celle des vaisseaux artériels dont la paroi est plus rigide. La logique voudrait que l’on applique un facteur correctif différent à ces 2 populations. La méthode que nous avons utilisée pour la mesure du diamètre est supportée par le fait que de nombreux auteurs avant nous aient constaté que le diamètre du tronc d’origine des vaisseaux du cortex reste globalement constant sur toute sa longueur dans l’épaisseur du cortex (26, 51). Enfin les résultats proposés par Duvernoy pour les veines sont issus de moulages vasculaires en mercox dans la mesure où il considère qu’en raison de la faiblesse de la paroi veineuse les coupes à l’encre de Chine sous-estiment très largement la mesure du diamètre. Les conditions d’une mesure plus pertinente nécessitent de changer de matériel d’injection et d’estimer correctement la rétraction sur les échantillons.

62

5.3.2.2.2 Comparaison des diamètres et des longueurs artériels et veineux A partir des 138 vaisseaux isolés de l’échantillon initial et des données de la classification de Strahler-Kassab nous avons comparé les nombres d’éléments (N) diamètres (D), longueurs (L) pour les éléments artériels et veineux de même ordre pour des vaisseaux appartenant à un même groupe (S3, S4, S5). Le groupe S2 est exclu de l’étude car il contient un faible nombre d’éléments (respectivement 42 et 22 pour les artères et les veines). Les hypothèses soutenant cette approche sont les suivantes :

- Visuellement les segments artériels apparaissent plus longs que les segments veineux, quels ordres sont affectés par cette différence ?

- Les veines apparaissent généralement plus volumineuses que les

artères, cette notion se vérifie-t-elle sur tous les ordres ?

- L’extraction des vaisseaux étant poussée jusqu’à la limite du lit capillaire, existe-t-il une différence pour les ordres 0 entre artères et veines ?

- Enfin le rapport artères/veines étant largement supérieur à 1, les

troncs veineux drainent-ils plus d’éléments d’ordre inférieur que les troncs artériels ?

Les figures suivantes s’intéressent aux diamètres et longueurs. Les comparaisons sont réalisées par un test non paramétrique de Kruskall-Wallis, le seuil de significativité est p<0.05. Faut-il rappeler à ce moment que les artères et les veines ont été séparées par un seul opérateur, à partir de critères métaphoriques ou empiriques, d’observations répétées sous diverses modalités, aboutissant à la caractérisation de la totalité des vaisseaux. Ce travail intègre donc la part du doute que la méthode statistique vient ici mettre à l’épreuve.

02

46

8

0 1 2

veine artere veine artere veine artere

S3

510

1520

2530

0 1 2

veine artere veine artere veine artere

S3

Longueurs Diamètres

p<0.01 p<0.001 p=0.11

p=0.002 p<0.001 p=0.06

63

02

46

8

0 1 2 3

veine artere veine artere veine artere veine artere

S4

020

4060

0 1 2 3

veine artere veine artere veine artere veine artere

S4

02

46

8

0 1 2 3 4

veine artere veine artere veine artere veine artere veine artere

S5

010

2030

40

0 1 2 3 4

veine artere veine artere veine artere veine artere veine artere

S5

57 Comparaisons des diamètres et longueurs artères/veines, pour chaque groupe en fonction e

l’ordre. * p non estimé en raison d’un trop faible nombre d’observation dans le groupe. Ces résultats sont difficiles à analyser. Ceci est du en partie au fait que les populations étudiées sont très différentes ne serait ce que par le nombre d’observations dans chaque échantillon testé. Par définition, l’ordre 0 contient le plus d’éléments. On peut répondre aux questions posées de la manière suivante :

- Concernant les longueurs : lorsqu’il existe une différence de longueur entre les éléments artériels et veineux celle-ci se fait au détriment des veines (segments plus courts) sauf au niveau de l’ordre maximal du groupe S4 (et probablement du groupe S5 qui n’a pas été testé faute d’observations). Le seuil de significativité est atteint pour les ordres 0 et 1 dans S3, 1 et 2 dans S4, 0 dans S5. Dans les cas où le seuil n’est pas atteint la moyenne des longueurs artérielles est supérieure à la moyenne des longueurs veineuses. Ces résultats semblent étayer l’impression morphologique que donnent ces vaisseaux. L’aspect « touffu » des veines et les longues branches des candélabres artériels seraient donc documentés par ces différences morphométriques.

- Concernant les diamètres : Les moyennes varient différemment en

fonction des ordres. Les diamètres moyens des veines sont plus petits dans les ordres 0 tout groupes confondus, et pour tous les ordres dans S3. Cette différence est significative pour l’ordre 0 dans S4, et pour les ordres 1 et 2 dans S3. Les diamètres moyens des veines sont plus volumineux dans les ordres1, 2 et 3 dans S4 et 1, 2, 3 et 4 dans S5. Cette différence est significative pour l’ordre 2 dans S4 et les ordres 2 et 3 dans S5. Il s’agit là des éléments les plus caractéristiques de la morphologie veineuse puisqu’ils correspondent

Longueurs Diamètres

p=0.6 p<0.001 p<0.001

p=0.029 p=0.89 p<0.001

p<0.001

p=0.63

Longueurs Diamètres

p=0.01 p=0.06 p=0.2

p<0.0001

p=0.06 p=0.38

p=0.89

p=0.02

*

*

64

aux branches qui cheminent parallèlement à la surface, d’autant plus longues qu’elles sont plus profondes et à leur distribution collatérale immédiate. On peut noter par contre que ce résultat laisserait entendre que les veinules post-capillaires sont de diamètre inférieur aux artérioles post-capillaires.

- Ceci amène à l’examen de l’ordre 0 pour chaque groupe. La

différence se fait toujours dans le même sens. Les éléments artériels sont donc plus longs et de plus grand diamètre que les éléments veineux. Cette différence est significative au niveau de S4 et uniquement pour les longueurs au niveau de S3 et S5. L’ordre 0 est dans notre étude défini par un critère de résistance. Il s’agit du seuil au-delà duquel le réseau capillaire est injecté massivement. Bien que cette approche reste de l’ordre d’une simulation sommaire d’un écoulement réel, ce critère à permis d’extraire l’ensemble des arborescences avec une grande facilité. Cette notion morphométrique sur les jonctions capillaro-artérielles et capillaro-veineuses n’est pas, à notre connaissance, documentée dans la littérature. Ce résultat est à prendre en compte et à vérifier dans des travaux futurs. Son interprétation reste hypothétique intégrant les notions d’anastomoses pré-capillaires, de vasomotricité et de régulation en général (76, 77, 104). Il n’est peut-être pas surprenant que le réseau vasculaire de distribution (actif) soit « mieux taillé » que le réseau collecteur (plus passif). On peut aussi se demander si les pré-capillaires artériels ne contiendraient pas dans leur paroi vasculaire des fibres musculaires permettant de réguler leur tonus vasculaire, dont seraient dépourvus les post-capillaires veineux (102).

- Concernant le nombre d’éléments par ordre. On peut s’en tenir à une

simple comparaison moyennant le nombre d’éléments par le nombre de vaisseaux recensés dans chaque population. Les courbes moyennées par le nombre de vaisseaux divergent nettement indiquant, comme cela paraît évident à l’œil, que proportionnellement le réseau veineux comprend nettement plus d’éléments que le réseau artériel. On ne tirera pas de conclusions sur le rapport artères/veines examiné à l’échelle des éléments. Sur cet échantillon pris globalement la tendance reste néanmoins au bénéfice des artères et on peut aussi remarquer que ce rapport croit légèrement de l’ordre 1 à l’ordre 3. Cette notion mériterait d’être confirmée par une analyse groupe par groupe.

Ces résultats sont illustrés par le tableau et la figure ci-dessous.

Ordre Nombre

d’éléments artériels

Nombre d’éléments

veineux

Rapport artères / veines

Nb. d’éléments moyens par artère

(N=92)

Nb. d’éléments moyens par veine (N=46)

0 3536 2564 1.38 38.43 55.74

1 1009 766 1.32 10.97 16.65

2 212 145 1.46 2.38 3.30

3 44 30 1.47 1.13 1.15

4 3 3 1.00 1.00 1.00

Moyenne = 1.33

Tableau 18 Analyse du nombre d’éléments en fonction de l’ordre et selon sa nature artérielle ou veineuse

65

Eléments en fonction de l'ordre

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5

Ordre

Nb

d'el

ts m

oyen

/arb

Artères

Veines

58 Analyse du nombre d’éléments en fonction de l’ordre et selon sa nature artérielle ou veineuse

5.3.3 Essai de généralisation des lois de Horton A partir des données expérimentales obtenues pour chaque variable (N, D et L) nous avons cherché à mettre en évidence des lois de Horton généralisées valables pour les 3 variables, quel que soit le groupe. Les lois expérimentales et généralisées ont été comparées afin d’ajuster le résultat. Les éléments proprement méthodologiques ayant conduit à ces résultats seront expliqués pas à pas dans les sections suivante. Il s’agit là d’une première étape de modélisation des arborescences du cortex cérébral humain dont les perspectives seront discutées.

5.3.3.1 Rappel La topologie des arborescences décomposées en éléments sur la base de la classification de Strahler-Kassab est décrite par les lois de Horton dont la formulation générale est donc :

Log10 Xn = a + bn Où X désigne soit le nombre (N), soit la longueur (L) soit le diamètre (D) moyens des éléments; n, l’ordre, b, la « pente », a, l’ordonnée à l’origine. Pour chaque arborescence, nous avons déterminé les coefficients (« pente » et « ordonnée à l’origine ») de ces lois - linéaires en coordonnées semi-logarithmiques – et leur coefficients de détermination de Pearson (ou de régression linéaire R2). Les arborescences ont été regroupées en 4 groupes (S2, S3, S4 et S5) en fonction du nombre d’ordre n qu’elles comportent. Les arborescences de « tailles » S3 et S4 représentent près de 95 % des 235 arborescences classifiées, les arborescences des groupes S2 et S5 n’en représentant que 2.5% chacune.

66

5.3.3.2 Bases du raisonnement : analyse des lois de Horton « expérimentales » Une fois ces regroupements par « taille » effectués, on estime, pour chacun des groupes, les valeurs moyennes des coefficients des lois de Horton. Ces moyennes sont calculées en pondérant les valeurs trouvées pour chaque arborescence par le coefficient de détermination correspondant :

∑∑=i

ii

ii RxRx 22

La moyenne des pentes est calculée vectoriellement comme la somme des vecteurs unitaires correspondants (pondérés par le coefficient de régression). La dispersion angulaire (ou circular standard deviation - CSD) (150) est estimée comme la valeur en degrés de la racine carrée de l’opposé du double du logarithme népérien de la norme du vecteur résultant (compris entre 0 et 1) de l’addition de ces vecteurs unitaires :

)(2180

∑−= iuLnCSDπ

Les pentes sont exprimées angulairement (ie par leur arc tangentes, ie l’angle que les droites de régression font avec l’axe des abscisses). Le tableau ci-dessous donne les « pentes » moyennes pour chaque taille d’arborescence.

Pentes (b) Arc tg (b) (°) ± CSD

N L D N L D

2 -1.424 1.089 0.206 -54.92±5.06 47.44±15.82 11.62±6.12

3 -1.396 0.855 0.289 -54.38±4.44 40.54±11.81 16.12±4.87

4 -1.292 0.605 0.282 -52.27±3.20 31.19±8.05 15.74±4.14

5 -1.187 0.594 0.332 -49.89±4.47 30.72±4.78 18.37±2.91

Tableau 19 Pentes des lois de Horton « expérimentales » La moyenne des ordonnées à l’origine (a) des lois de Horton correspond en fait à la valeur moyenne du logarithme de N, L et D pour les éléments terminaux (ou d’ordre 0). Elle est estimée algébriquement dans la mesure où ces grandeurs sont des scalaires.

Ordonnée à l’origine ± Ecart-Type

N L D N0=exp(a)

2 2.42±0.37 4.48±0.36 2.12±9.80E-02 11.26

3 3.17±0.59 4.58±0.27 2.17±0.12 23.87

4 3.87±0.51 4.59±0.23 2.18±9.38E-02 47.97

5 4.57±0.68 4.39±0.13 2.11±0.10 96.75

Tableau 20 Ordonnées à l’origine (a) des lois de Horton « expérimentales » La figure 59 ci-après en donne une représentation graphique sous forme d’histogrammes.

67

-2

-1.5-1

-0.5

0

0.51

1.5

2 3 4 5

groupe

pent

eN

L

D

-100

-50

0

50

100

2 3 4 5

groupe

pent

e (°) N

L

D

59 Histogramme des pentes (gauche) et des arcs tangentes des pentes (droite) en fonction des

groupes pour N, L et D Il apparaît que les pentes varient peu en fonction du groupe pour les variables N et D. par contre ces valeurs varient pour la longueur (L). Les figures suivantes visualisent graphiquement les ordonnées à l’origine :

0

1

2

3

4

5

2 3 4 5

groupe

Val

eur

à l'o

rigin

e

L

D

0

1

2

3

4

5

2 3 4 5

Groupe

Val

eur

à l'o

rigin

e (b

N)

N

60 Histogramme des ordonnées à l’origine pour L et D (à gauche), pour N (à droite) en fonction du

groupe On constate que l’ordonnée à l’origine reste relativement constante pour D et L et varie très nettement pour N.

5.3.3.3 Généralisation à l’ensemble des arborescenc es : lois de Horton généralisées

5.3.3.3.1 Variations des pentes des lois de Horton suivant le groupe En première approximation du moins, on peut considérer les pentes des lois de Horton pour le nombre d’éléments et pour le diamètre comme des constantes, égales respectivement à :

bN = -1.325 (± 0.107) bD = 0.277 (± 0.05) Comme illustré plus haut, on observe par contre d’importantes variations de ce coefficient pour la longueur. Pour tenir compte de ces variations qui tendent à disparaître aux nombres d’ordre les plus élevés, on ajuste les points expérimentaux suivant la loi asymptotique suivante :

)exp()( 3321 smmmsbL −+=

68

bL désignant ici l’arc tangente de la pente exprimée en degrés. L’ajustement des données expérimentales à cette fonction est réalisé à l’aide de l’algorithme de Levenberg-Marquardt. Les valeurs des 3 paramètres sont les suivantes :

0.03225;57.23;6.29 321 === mmm

5.3.3.3.2 Mise en évidence d’une loi généralisée pour le nombre de segments terminaux.

On évalue le nombre de segments terminaux en fonction du groupe

N0 = 2.7352e0.7151s

R2 = 0.9997

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5

Groupe

N0

61 Nombre de segments en fonction du groupe

On en déduit la forme générale, valable pour n’importe quel groupe :

( ) )715.01(exp)715.0exp(735.20 sssN +≈=

Si le nombre de segments terminaux varie donc suivant une loi puissance, en fonction du « nombre d’ordres » du groupe d’arborescences, en revanche, on peut noter que pour le diamètre et la longueur, les variations des ordonnées à l’origine (a) sont très faibles. On pourra donc considérer ces ordonnées à l’origine pour ces 2 variables comme des constantes que l’on prendra égales aux moyennes de ces paramètres entre les 4 groupes soit :

aL = 4.51 (± 0.09) aD = 2.14 (± 0.03)

5.3.3.4 Mise en évidence des lois généralisées pour N, L, D quelle que soit l’arborescence

En résumé, on peut déduire de l’étude des lois de Horton pour les divers groupes d’arborescences les lois généralisées suivantes, dont la forme valable quelle que soit l’arborescence n’est fonction que de la taille s et de l’ordre n :

)log()log( 0NnbN N += Où )1exp()(0 ssN β+=

69

DD anbD +=)log(

LL anbL +=)log( Où ( )[ ]180/)exp(tan)( 3321 smmmsbL −+= π .

Le tableau 21 résume les valeurs des constantes intervenant dans ces lois.

Nb β N

-1.3248 0.7151

Db Da D

0.2771 2.14265

1m 2m 3m La L

29.6 23.569 0.032246 4.51075

Tableau 21 Constantes des lois de Horton généralisées

5.3.3.5 Comparaison des lois généralisées aux donné es expérimentales. Ajustement final des paramètres

Les lois de Horton généralisées permettent de prédire des valeurs « théoriques » de N, D et L, pour chaque groupe d’arborescences et pour chaque ordre. On peut comparer ces valeurs aux valeurs « expérimentales » correspondantes. Graphiquement d’abord comme représenté sur les figures ci-dessous :

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4ordre

Ln(N

)

2

3

4

5

2T

3T

4T

5T2

2.5

3

3.5

4

0 1 2 3 4

ordre

Ln(D

)

2

3

4

5

T

62 Comparaisons des lois de Horton « expérimentales » (trait continu) et « théoriques » ou

« généralisées » (trait pointillé) pour N à gauche et pour D à droite

4

5

6

7

0 2 4 6ordre

Ln(L

)

2

3

4

5

2T

3T

4T

5T

2

63 Comparaisons des lois de Horton « expérimentales » (trait pointillé) et « théorique » ou

« généralisée » (marqueur) pour L Qualitativement, les lois généralisées semblent rendre compte de manière tout à fait acceptable des données expérimentales. Néanmoins une comparaison

70

globale et directe plus quantitative (fig. 64) obtenue en comparant les graphes X théorique = f(X expérimental) à la droite identité (y=x) montre que les lois généralisées sous-estiment les données expérimentales d’un rapport constant.

Comparaison exp-theorie pour N

y = 0.8039xR2 = 0.995

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120 140

N exp

N th

.

Comparaison exp-théorie pour D

y = 0.8908x

R2 = 0.9318

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40

D exp

D th

comparaison exp-théorie pour L

y = 0.8733x

R2 = 0.8906

0

200

400

600

800

1000

0 200 400 600 800 1000L exp

L th

64 Comparaisons « théorie-expérience » ou modèle-réalité

Il suffit alors d’un simple réajustement, par des constantes multiplicatives, des lois de Horton, en fait des lois de puissance – du type X= X0 ωn – pour obtenir un accord d’ensemble cohérent avec la droite d’identité (Nth = N exp.). Les inverses des constantes appliquées sont :

8733.0;8908.0;8039.0 === LDN κκκ

La figure 65 montre qu’avec ces corrections, les régressions linéaires entre valeurs théoriques et expérimentales pour les 3 variables donnent la droite identité y=x

comparaison exp-théorie pour N

y = 1.0036xR2 = 0.9942

0

20

40

60

80

100

120

140

0 50 100 150N exp

N th

Comparaison exp-théorie pour D

y = xR2 = 0.9318

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30 35D exp

D th

71

Comparaison exp-théorie pour L

y = 0.9999xR2 = 0.8906

0

200

400

600

800

1000

1200

0 200 400 600 800 1000

L exp

L th

65 Comparaisons « théorie-expérience » ou modèle-réalité après correction

On note que les coefficients de régression sont proches, voire très proches de 1 pour le nombre d’éléments N (R2>0.99) et le diamètre moyen D (R2>0.93), moins élevé mais néanmoins très significatif pour L (R2>0.89). On peut donc en conclure que les lois de Horton généralisées donnent, en moyenne, une représentation précise de la topologie des arborescences vasculaires du cortex cérébral humain. On en donne ci-dessous les formulations en termes de lois de puissance, compte tenu des corrections :

nL

snLN NnbNN λγηλ 000 )exp( === (1)

Où .2660)exp( == NN bλ et ( ) ( )ssN ssN 04.238.3)1exp(1)( 00 ×==+= γηβκ

n

DD DnbDD λ00 )exp( ==

Où 32.1)exp( == DD bλ et ( ) 6.9)exp(10 == DD aD κ (µm)

n

LL LnbLL λ00 )exp( ==

Où )()exp( sfpLL ==λ avec ( )[ ]180/)exp(tan)( 3321 smmmsbL −+= π

Et ( ) 104)exp(10 == LL aL κ (µm)

5.3.3.6 Analyse des écarts entre les variables réel les et leurs valeurs prédites par les lois de Horton généralisées

Les lois de Horton généralisées déduites ci-dessus permettent de prédire des valeurs moyennes des 3 variables – N, D et L – aux divers ordres et pour les divers groupes d’arborescences en bon accord avec les valeurs moyennes observées « expérimentalement ».

- Qu’en est-il si l’on compare les valeurs de ces variables telles que les prédisent ces lois aux valeurs réelles observées pour chaque arborescence -pour N - voire pour chaque élément d’arborescence – pour D et L ?

- Peut-on caractériser ces écarts ou « résidus » statistiquement, (ie

quelle est la probabilité d’observer un écart donné X par rapport à ces lois) ?

1 On prendra en fait la valeur entière la plus proche de cette valeur, N étant un entier

72

On peut mesurer cet écart de deux façons : soit comme la différence entre la valeur réelle et la valeur prédite, soit comme le rapport entre ces 2 valeurs (ou sa différence à l’unité, ou la même mesure en échelle logarithmique). Ces deux mesures ont été appliquées, mais la seconde semble d’autant plus pertinente que les lois de Horton s’expriment très simplement –linéairement- en échelle logarithmique et que le logarithme du rapport des valeurs réelles et prédites est en fait la différence du logarithme de la valeur réelle au logarithme de la valeur prédite qui n’est autre que l’expression la plus simple de la loi de Horton elle-même. Cette analyse a d’abord été réalisée groupe par groupe, mais il s’est avéré possible de la synthétiser pour l’ensemble des arborescences sans tenir compte de leur groupe autrement qu’à travers l’expression de la loi de Horton généralisée. Nous examinons le cas du diamètre. La figure ci-dessous montre que la probabilité que l’écart du logarithme du diamètre réel au diamètre prédit s’écarte assez peu d’une loi normale.

ln(Dn/Dnth)Minimum -0.97Maximum 1.78Points 13273Moyenne -0.06Médiane -0.09Std Deviation 0.22Variance 0.05Std Error 0.00Skewness 1.20Kurtosis 3.66

Histogramme de Ln(D/Dnth) et loi normale

0

2

4

6

8

10

12

-1 -0.5 0 0.5 1

Ln(D/Dnth)

f(%

)

f%(Ln(Dn/Dnth)

loi normale

66 Analyse des résidus

5.3.4 Pour conclure cette section La loi de Horton est une loi puissance qui analyse des rapports d’échelle. Les lois puissances (et les fractales) offrent un large champ d’application dans le domaine de la recherche biomédicale (9, 13, 141). Elles constituent un outil puissant qui permet d’éclaircir les principes universels qui gouvernent les structures et les fonctions de systèmes complexes. Dans le contexte, il paraissait légitime de proposer un essai de généralisation des lois de Horton à partir de l’échantillon vasculaire dont nous disposions aussi partiel soit-il puisque cette approche méthodologique laisse entrevoir les premiers pas vers un modèle de la vascularisation du cortex cérébral. Le nombre d’éléments, le diamètre et la longueur obéissent expérimentalement à la loi de Horton dont on déduit la nature fractale des arborescences. La dimension fractale pour une structure arborescente peut être exprimée par le rapport nombre d’élément par ordre à la longueur moyenne pour cet ordre (141). Bien que nous ayons pu, à titre d’exemple, calculer la dimension fractale à partir d’une arborescence (voir le premier article en annexe), cette aspect de l’analyse devra être compléter à partir de cet échantillon plus large. Les fractales sont une heureuse rencontre de la biologie et des mathématiques, leur intérêt dans la compréhension des systèmes vasculaires est à l’origine de nombreuses publications mais peu d’entre elles ont pu s’intéresser aux cortex cérébral humain (5, 70, 72, 93).

73

5.4 ANALYSE TYPOLOGIQUE ET MORPHOMETRIQUE DES BIFURCATIONS

Ce travail préliminaire définit une méthodologie de l’étude des bifurcations. Les résultats sont donnés à titre indicatif et concernent la population entière des arborescences (N=235).

5.4.1 Définitions et méthodes Pour une arborescence donnée il est possible de recueillir les données géométriques tridimensionnelles de chaque bifurcation ou nœud. Nous définissons arbitrairement un système « matrilinéaire » utilisant les termes mère et filles pour définir la parenté entre les segments vasculaires. Ceci ne tient donc pas compte de la nature de l’arborescence (artère ou veine) et donc du sens de l’écoulement. Avant toute analyse morphométrique le type de branchement est défini en fonction de la classification de Strahler-Kassab selon le schéma suivant :

67 Types de bifurcation

D’autre part une caractérisation de la forme est réalisée et 3 modes sont définis selon le schéma suivant :

68 Formes des bifurcations

n

n n

n

n-1 n-1

n

n m<n

Type +n : un segment d’ordre n donne naissance à 2 segments de même ordre. On parle de branchement intra-élément (BIE)

Type -n : un segment d’ordre n donne naissance à 2 segments d’ordre n-1. On parle de branchement homogène symétrique (BHS)

Type 2n+m : un segment d’ordre n donne naissance à 1 segment d’ordre n et un segment d’ordre m (m<n). On parle de branchement anti-symétrique latéral (BAL)

Mode aa : les 2 branches filles sont en position antérograde par rapport au plan transversal de la bifurcation

Mode ar : une des branches filles est en position antérograde, l’autre en position rétrograde par rapport au plan transversal

Mode rr : les 2 branches filles sont en position rétrograde par rapport au plan transversal de la bifurcation

74

La planéité est définie par l’angle entre le plan des segments filles et le segment mère (calculé comme l’arc cosinus de la valeur absolue du produit mixte des vecteurs unitaires des 3 branches de la bifurcation) Les angles de bifurcations sont définis et traités de la façon suivante :

- β1 : angle entre la branche fille de plus grand diamètre et l’axe de la branche mère

- β2 : angle entre branche fille de plus petit diamètre et branche mère - Asymétrie de la bifurcation : (β1 + β2)/2 - Demi-angle entre branches filles (p.symétrie) : (β1 - β2)/2

69 Planéité et angles des bifurcations

Les rapports de branchement (rapport des aires des sections) :

- Rapport entre la somme des sections des deux branches filles et la section de la branche mère : RBFM = (A1 + A2)/A0

- Rapport entre la section de chaque branche fille et la section de la branche mère : RB10 = A1/A0 et RB20 = A2/A0

5.4.2 Résultats

5.4.2.1 Répartition des bifurcations En fonction de la nature – artère ou veine – des ar borescences :

Nature Nombre de bifurcations %

Nombre moyen de bifurcations

par arborescence Artères (155) 5470 57.63 35.3 Veines (80) 4022 42.37 50.3 Total (235) 9492 100 40.4

Tableau 22 Répartition des bifurcations en fonction de la nature du vaisseau

Plan des branches filles

Planéité

β1

β2

Branche mère

Branche fille 2

Branche fille 1

Axe de la branche mère

75

En fonction du nombre d’ordres de l’arborescence :

Bifurcations / Nb. d'ordres

010203040506070

S2 S3 S4 S5

Nombre d'ordres de l'arborescence

Fré

quen

ce (

%)

A

V

70 Répartition des bifurcations en fonction du groupe de Strahler-Kassab

En fonction de la forme et du type de branchement :

Bifurcations / forme

0

10

20

30

40

50

60

70

AA AR RR

Forme

Fré

quen

ce (

%)

A

V

Bifurcations / type de branchement

0

20

40

60

BHS BIE BAL

Type de branchement

Fré

quen

ce (

%)

A

V

71 Répartition des bifurcations en fonction de la forme et du type

5.4.2.2 Statistique descriptive Paramètres angulaires :

Planéité moyenne ±CSD[1] Demi-angle

moyen ±CSD Asymétrie moyenne ±CSD

Tous vaisseaux 26.93 20.91 56.46 25.95 15.53 22.34

Artères 27.16 21.03 57.41 26.30 15.80 22.42

Veines 26.62 20.75 55.17 25.48 15.06 22.23

Forme « aa » 23.33 18.45 52.53 15.68 11.27 11.05

Forme « ar » 33.04 22.91 62.88 48.87 14.59 21.73

Forme « rr » 60.70 19.61 -64.59 30.78 43.62 49.25

Type « BHS » 27.77 21.08 56.31 25.51 15.37 22.82

Type « BIE » 27.26 21.04 57.24 26.15 15.13 21.90

Type « BAL » 26.30 20.75 56.43 26.22 15.70 22.07

Groupe S2 29.72 21.80 57.04 25.87 17.36 19.55

Groupe S3 26.95 20.94 57.03 26.12 15.45 23.04

Groupe S4 26.79 20.78 56.48 25.90 15.47 21.93

Groupe S5 27.71 21.71 54.01 25.70 15.90 23.23

Tableau 23 Paramètres angulaires des bifurcations (1) CSD= « circular standard deviation » ou dispersion angulaire

76

Les méthodes statistiques pour décrire et analyser les distributions des variables angulaires, mesurées sur une échelle circulaire sont différentes des méthodes statistiques pour décrire et analyser les grandeurs scalaires mesurées sur une échelle linéaire (150). Paramètre scalaires (Rapports de branchement) : RBFM RB10 RB20

N Moyennes SD[1] Moyennes SD Moyennes SD

Tous vaisseaux 9492 1.63 0.69 0.98 0.46 0.64 0.29

Artères 5470 1.66 0.72 1.01 0.48 0.66 0.30

Veines 4022 1.58 0.64 0.96 0.43 0.62 0.28

Forme « aa » 6316 1.61 0.66 0.97 0.44 0.64 0.29

Forme « ar » 3026 1.66 0.75 1.01 0.51 0.66 0.31

Forme « rr » 150 1.57 0.60 0.95 0.40 0.62 0.29

Type « BHS » 3546 1.56 0.57 0.90 0.35 0.66 0.26

Type « BIE » 818 1.88 0.73 1.12 0.52 0.76 0.27

Type « BAL » 5128 1.63 0.74 1.02 0.51 0.61 0.31

Groupe S2 78 1.87 1.02 1.13 0.72 0.74 0.34

Groupe S3 2756 1.67 0.69 1.01 0.47 0.66 0.30

Groupe S4 5929 1.62 0.69 0.98 0.46 0.64 0.30

Groupe S5 729 1.50 0.58 0.91 0.39 0.59 0.27

Tableau 24 Rapports de branchements 1 SD= « Standard Deviation »

5.4.2.3 Analyse des distributions statistiques Paramètres angulaires Planéité

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90

planéité (°)

%

Tous vaisseauxArtèresVeines

72 Analyse de la planéité : à gauche représentation des distributions pour l’ensemble des vaisseaux, pour les artères et pour les veines. A droite : ajustement de la distribution par une fonction quadratique :

( ) 2cpbpapf ++= Où p est l’angle, a=14.3, b=0.25 et c=0.0011 (R=0.9975)

77

Demi-angle entre branches filles (( β1 - β2)/2)

0

5

10

15

20

0 50 100 150 200

Demi-angle (°)

%Tous vaisseaux

Artères

Veines

73 Analyse du demi-angle au sommet (entre branches filles) : à gauche : distribution de chaque population. A droite : ajustement par la gaussienne :

( ) ( )( )2/ smaf −−= ββ Avec a=15.59, m=58.1, s=17.7 (R=0.999) Asymétrie (( β1 + β2)/2)

0

4

8

12

16

0 30 60 90 120Asymétrie (°)

%

Tous vaisseaux

Artères

Veines

74 Analyse de l’asymétrie entre branches filles : à gauche : distribution de chaque population. A droite : la distribution du degré d’asymétrie (γ) varie comme une « demi-gaussienne » centrée à l’origine et telle que :

( ) ( )( )( )2/ smabf −−+= γγ Avec a=12.76, m=0.1, s=44.8, b=0.13 (R=0.999)

78

Paramètres scalaires (Rapports de branchement)

0

4

8

12

16

20

0 1 2 3 4rapports de branchement

%Tous vaisseaux

Artères

Veines

RBFM

RB10

RB20

75 Analyse des rapports de branchements : A gauche : distributions dans chaque configuration décrite pour tous les vaisseaux, les artères et les veines. Les distributions ne sont pas normales mais on remarque que la population RBFM (Rapport entre la somme des sections des deux branches filles et la section de la branche mère) est log-normale. A gauche : L’ajustement de l’histogramme des logarithmes de RBFM pour tous les vaisseaux est réalisée par une gaussienne :

( ) ( )( )( )2/ smabf −−+= αα Où α=ln(RBFM), b=0.068, a=10.99, m=0.47, s=0.5 (R=0.999)

5.4.3 En conclusion de ce chapitre L’analyse d’une bifurcation en 3 dimensions est complexe. On remarque que les structures veineuses comportent en moyenne plus de bifurcations que les artères. Ceci va avec la logique définit par les lois de Horton montrant notamment que le nombre de segments par ordre évolue de manière différente entre artères et veines, les veines comprenant plus de segments terminaux (ordre 0). Ceci ne fait qu’illustrer la différence numérique entre ces 2 populations, le bassin de drainage d’une veine intégrant probablement le bassin d’irrigation de plusieurs artères. Cette organisation reste encore à préciser. On peut cependant noter que la cohérence des résultats consolide les bases méthodologiques utilisées dans la mesure où les résultats quantitatifs obtenus à partir des vaisseaux segmentés sont en accord avec l’observation anatomique. La caractérisation que nous proposons tient compte :

- De la nature artérielle ou veineuse de l’arborescence.

- Du groupe (classification de Strahler-Kassab) auquel elle appartient.

- De la forme : ce critère nous paraît important car on peut considérer que les branchements rétrogrades comportent peuvent traduire une

79

connexion anastomotique. Leur fréquence n’est pas négligeable et une analyse morphologique plus détaillée s’impose pour vérifier cette hypothèse

- Du type : il est important de prendre en compte ce paramètre car les

critères morphologiques qui ont permis de différencier artères et veines ont tenu compte de l’aspect des bifurcations « primaires », c’est-à-dire entre le tronc principal (n max) et les collatérales qui en sont issues (n max – 1 en général, BIE ou BAL). Si le type BIE apparaît assez rare, le type BAL est largement représenté. Ceci nécessite de sous échantillonner les populations pour identifier dans chaque groupe celle qui correspondent à ce critère et de tenter de mettre en évidence une différence quantitative entre artères et veines. D’autre part s’il existe peu d’étude concernant les bifurcations dans la microcirculation, elles semblent faire apparaître une différence d’angulation en fonction de la progression du flux artériel vers la distalité (42). L’organisation de l’échantillon telle que nous l’avons réalisé pourrait permettre de vérifier ce type de constatation.

Les mesures réalisées sont exhaustives. Les premiers résultats montrent des courbes de distributions complètement superposables entre artères et veines. Cette première analyse s’en tient à examiner la population de manière globale, sans tenir compte du groupe ou de l’ordre. Ces résultats méritent donc d’être affinés pour tester leur contribution à la discrimination entre artères et veines mais ils restent intéressants dans un effort de modélisation des vaisseaux. Le groupe S4, qui contient le plus de bifurcations et concerne des vaisseaux, par définition, assez complets pourrait être un échantillon contributif dans cette optique. Dans l’attente de préciser cette géométrie on peut proposer, de façon très informelle, l’aspect d’une bifurcation moyenne issu de cette première analyse.

76 Aspect d’une bifurcation moyenne

80

6 ANALYSE SPATIALE DE LA DENSITE VASCULAIRE

6.1 CARTES DE DENSITE

L’analyse porte sur la densité volumique exprimée en pourcentage du volume tissulaire. Les mesures réalisées à partir de densités surfacique exprimée en mm2/mm3, et linéique exprimée en mm/mm3 n’apportent pas d’information complémentaire. Ces informations sont obtenues directement à partir des données du lineset. Pour chaque mosaïque 2 cartes de densité ont été calculées. L’une dite « vasculaire » porte sur l’ensemble des vaisseaux (réseau complet), arborescences incluses, l’autre dite « capillaire » porte sur le réseau capillaire qui est extrait selon la méthode exposée précédemment consistant à soustraire les arborescences suivi d’un seuillage du diamètre (d<10 µm). Nous ne présenterons ici que les cartes de densités réalisées à partir des populations dites « capillaires ». Pour faciliter ce travail et afin de mieux comprendre les variations de la densité en fonction de la profondeur du cortex, une rotation a été appliquée aux mosaïques des régions latérales et médiales (zones rectilignes) de telle sorte que la surface du cortex soit parallèle à l’axe x. Nous avons utilisé une grille tridimensionnelle composée de boîtes de 100 x 100 x 100 µm. Pour chacune de ces boîtes ont été calculées les valeurs de densités. La grille a été définie telle que le centre de chaque boîte est située dans un plan y = yn où yn = n∆y avec ∆y = 50 µm.

77 Représentation de la grille de calcul appliquée au lineset pour l’analyse spatiale de la densité.

81

A partir de cet ensemble de boîtes superposées en y une cartographie de la densité a été construite, les valeurs locales de la densité étant représentées par un codage couleur.

78 Cartes de densités capillaires des mosaïques V16l(en haut) et V16m (en bas). Les vaisseaux

sont représentés en superposition mais les arborescences ne sont pas intégrées dans le calcul des cartes de densité. Barre d’échelle = 1 mm

79 Cartes de densités capillaires de la mosaïque V16s. A gauche : sans représentation des

vaisseaux, à droite : avec les vaisseaux en superposition. Barre d’échelle = 1 mm Ceci a permis d’appréhender l’hétérogénéité de la densité vasculaire à travers le cortex et d’illustrer à l’évidence les variations de mesure qui peuvent apparaître dans des études portant sur des volumes voire des surfaces restreints (96, 111). Sur ces cartes de densité capillaires les grands vaisseaux apparaissent en négatifs déterminant pour certains d’entre eux des zones dépourvus de capillaires. Ceci identifie en fait l’espace de Pfeifer (Pfeifer décrit une bande de tissu nerveux dépourvue de capillaires entourant chaque tronc artériel ou veineux), cet espace semble proportionnel à la taille du vaisseau et semble parfois se poursuivre sur les branches secondaires issus du tronc principal (34). Nous pouvons faire les mêmes constatations à partir des images ci-dessus. Il est intéressant de noter que, dans cette approche quantitative de la vascularisation cérébrale, il serait aisé de mesurer précisément cet espace sachant que son élargissement a été constaté dans certaines pathologies (91).

82

D’autre part l’analyse des cartes de densité montre des taches d’hyperdensité relative. Ces taches se situent pour l’essentiel dans la couche moyenne du cortex mais peuvent parfois apparaître dans les couches superficielles, plus rarement dans les couches profondes. Leur régularité sur certaines mosaïques (voir la carte de densité correspondant à V16m ci-dessus) laisse évoquer la possibilité de zones d’activité fonctionnelle plus intense (30, 63). Ce type de corrélations entre la densité vasculaire (« taches vasculaires » identifiées par mesure de la densité linéique) et l’organisation structurelle et fonctionnelle (« taches fonctionnelles » identifiées par cytochrome oxydase) ont été bien documentées par Zheng dans une étude sur le cortex du sagouin (154).

6.2 ANALYSE DE LA DENSITE EN FONCTION DE LA PROFONDEUR

De nombreux auteurs ont constaté une augmentation de la densité vasculaire dans la couche moyenne du cortex caractérisant notamment le cortex sensoriel secondaire (27, 28, 30, 33, 123). Dans cette étude la profondeur du cortex a été définie par un procédé de filtrage directement déterminé à partir des valeurs de la densité volumique.

80 Mesure de l’épaisseur du cortex à partir des données de la densité. L’extrémité du sillon est à

droite En effet il apparaît à l’œil nu que l’épaisseur du cortex est différente au niveau des 2 versants du sillon. Elle est notamment plus importante sur le versant latéral (2.5.mm en moyenne contre 1.95 mm sur le versant médial) D’autre part elle décroit légèrement de la base vers le fond du sillon. Ce cortex « vasculaire » a donc été défini depuis la surface jusqu’au point où la densité vasculaire devient inférieure à 50 % de la valeur moyenne obtenue sur l’axe y donné, perpendiculaire à la surface du cortex. La profondeur du cortex (y) a été normalisée et exprimée en pourcentage. Les valeurs de densité ont été ré-échantillonnées, par interpolation spline, en fonction de cette profondeur normalisée avec un pas d’échantillonnage de 2 %. Le calcul des moyennes selon l’axe x a permis de déduire les valeurs moyennes de la densité en fonction de la profondeur normalisée. L’analyse a porté sur la totalité de l’échantillon (population dite « vasculaire ») et sur le réseau capillaire isolé des vaisseaux arborescents (population « capillaire »). Au niveau du sommet et de la base (zones plicaturées) le même type d’analyse a été réalisée en utilisant des coordonnées polaires.

83

Les résultats sont exprimés ci-dessous :

81 Représentation graphique de la densité vasculaire globale et capillaire en fonction de la

profondeur corticale pour chaque zone du cortex étudiée. Les barres verticales mesurent les écarts types dans la direction x.

Les résultats observés sur la figure ci-dessus montrent un certain degré d’autosimilarité, les courbes étant assez superposables d’une région à l’autre. Les courbes de densité vasculaire subissent probablement des variations qui sont fonction du recrutement plus ou moins important de structures arborescentes. Cette inhomogénéité de la population arborescente d’une mosaïque à l’autre a été envisagée précédemment. Remarquons néanmoins que ces résultats moyennent 3 mosaïques pour « latéral », « médial », « sommet ». Nous ne disposons que d’une mosaïque de la base (V18).

82 Superposition des courbes de densité capillaire des 4 régions étudiées et définition de 4

couches vasculaires en fonction des principales inflexions observées. Délimitation d’une zone d’hyperdensité (zone grisée) dans le tiers moyen du cortex.

84

Si l’on s’en réfère aux courbes de densité capillaire on observe 3 grandes variations de densité qui permettent de définir 4 couches dans l’épaisseur du cortex depuis la surface jusqu’à la jonction avec la substance blanche :

- Depuis la surface jusqu’à 10 % de l’épaisseur corticale : Zone dépourvue de capillaire suivie d’une brutale augmentation de la densité

- De 10 à 50 % : la densité augmente légèrement jusqu’à un maximum - De 50 à 80 % : la densité diminue légèrement - De 80 à 100% : Diminution franche de la densité jusqu’à la substance

blanche. On constate une zone d’hyperdensité qui correspond approximativement au tiers moyen du cortex. Cette organisation est particulièrement nette sur les zones rectilignes, le long du sulcus et diffère légèrement au niveau des zones curvilignes. Au niveau du sommet du gyrus la couche 1 semble plus large (16 %) puis le profil devient comparable aux autres avec toutefois un moindre maximum. Cet aspect peut être expliqué par les variations extrêmes qui affectent l’épaisseur du cortex d’un gyrus à l’autre. D’autre part, cette différence de profil peut être due aux variations des couches cellulaires dans cette zone (7). La moindre densité dans cette zone du cortex a été remarquée plus haut et nous avions évoqué la possibilité d’un effet de la gyration (plicature en extension). Si l’on étudie le comportement des courbes de densité vasculaire (complète), on remarque que la zone d’hyperdensité se décale vers la surface corticale et s’étale de 10 à 50 % dans toutes les régions sauf au niveau de la base du gyrus dont le profil retrace certainement le trajet convergent des vaisseaux vers la substance blanche. La segmentation utilisée ici tient compte des inflexions des courbes des échantillons capillaires. A partir de l’observation des mêmes coupes, Duvernoy décrit également 4 couches vasculaires qu’il corrèle aux couches histologiques du cortex. On peut comparer sa classification qualitative à la segmentation quantitative proposée ici très simplement :

- La couche 1 de Duvernoy correspond exactement à la couche 1 décrite plus haut. La correspondance est d’autant plus évidente qu’il s’agit d’une zone pour ainsi dire avasculaire comprenant des troncs vasculaires de passage et un maillage capillaire relativement lâche,

- La couche 3 correspond pour Duvernoy à la zone d’hyperdensité définie ci-dessus. Il la situe exactement dans le même rapport que nous. Elle occupe le 1/3 moyen du cortex.

- Ceci définit par déduction les couches 2 et 4 pour lesquelles Duvernoy note : o Pour la couche 2 un aspect palissadique lié aux troncs de

passage et aux vaisseaux récurrents (artériels) provenant des couches plus profondes

o Pour la couche 4 une diminution progressive de la densité vasculaire vers la substance blanche.

85

83 Les couches vasculaires du cortex cérébral selon Duvernoy (34). A gauche est mentionnée la

lamination histologique, à droite la lamination vasculaire. La segmentation proposée par Duvernoy est donc tout à fait cohérente avec l’analyse quantitative que nous proposons. Celle-ci précise certains points et permet notamment de mesurer la réalité de ce contraste qui apparaît nettement en microscopie optique à faible grossissement. En effet, de nombreux auteurs ont identifié une zone d’hyperdensité vasculaire dans la couche moyenne du cortex chez le rat (27, 103, 110), chez le chat (145), chez le singe (154) et chez l’homme (85, 122). Il semble évident que ce contraste puisse varier d’une région à l’autre du cortex (92) et une étude comparant des zones fonctionnellement différentes pourrait étayer ces résultats. Si l’on doit rapprocher nos résultats des variations de signal en fonction de l’épaisseur corticale enregistrées en IRM fonctionnelle à haut champ (31, 45, 49, 124,

135, 153) il semble logique d’insister sur le fait que l’organisation spatiale du réseau contribue certainement à la construction du signal observé par ces auteurs. Cependant les variations relativement faibles observées entre 10 et 80 % de l’épaisseur corticale ne paraissent pas suffisantes à elles seules pour expliquer les profils laminaires obtenus en IRMf. Ces éléments sont plus largement discutés dans le deuxième article proposé à la fin de ce document. D’autres caractéristiques doivent être signalées compte tenu de leurs implications potentielles en imagerie fonctionnelle. Elles concernent notamment le poids relatif des structures capillaires (ou tissulaire en terme de signal IRMf) et des structures arborescentes (ou « gros vaisseaux » dans ces mêmes termes) (49, 153). La contribution relative des 2 populations est illustrée ci-après. On remarque que les vaisseaux capillaires prédominent dans la couche d’hyperdensité.

84 Contribution des vaisseaux capillaires et arborescents à la densité vasculaire en fonction de la

profondeur corticale

86

Par contre si l’on s’intéresse aux diamètres des vaisseaux en fonction de la profondeur du cortex, on constate qu’ils ne varient pas et que par conséquent les variations de la densité globale et de la densité capillaire sont le fait de la longueur et du nombre de segments vasculaires.

85 Répartition des diamètres en fonction de la profondeur corticale pour les vaisseaux capillaires,

arborescent et pour l’ensemble de la population.

6.3 ANALYSE DE LA DENSITE TANGENTIELLEMENT A LA SURFACE DU CORTEX

On remarque que la globale hétérogénéité de la densité vasculaire apparaît à travers une organisation en colonnes rythmée par les vaisseaux arborescents. Cette notion de périodicité des grands vaisseaux corticaux a été abordée au chapitre précédent. Sans vouloir tomber dans une comparaison trop directe, cette apparente régularité vasculaire pourrait supposer une relation entre les vaisseaux du cortex et l’architecture de tissu nerveux sous-jacent dans sa dimension fonctionnelle en colonnes corticales telles qu’elles ont été décrites par Mountcastle (1957) (101) et Hubel et Wiesel (1977) (60). L’idée d’un module vasculaire calqué sur une unité fonctionnelle neuronale et ses implications en matière d’imagerie fonctionnelle a été largement défendue dans la littérature (48, 147) et considérée par ces auteurs comme la pierre angulaire des études fonctionnelles sur le cerveau humain conscient (traduction littérale : the cornerstone of the awake human brain functional studies). Pour tenter d’observer ce schéma d’organisation « verticale » nous avons étudié les variations de la densité dans cette direction, en utilisant la même matrice mais cette fois selon des lignes parallèles à la surface corticale. Par contre pour renforcer les possibles variations de la densité dans cette dimension de l’espace le cortex a été divisé en 4 zones selon le schéma découlant de l’analyse précédente :

- De 0 à 10 % : couche superficielle - De 10 à 50% : couche moyenne - De 50 à 80% : couche profonde - De 80 à 100% : couche sub-corticale

Une fonction d’auto-corrélation a permis d’analyser les profils de densité moyens pour chaque couche dans le but de mettre en évidence un comportement périodique. Cette étude n’a été réalisée que sur les 6 mosaïques centrées sur la partie du cortex rectilignes (zones latérales et médiales du sillon collatéral).

Valeur moyennes des diamètres: - Capillaires : 6.65 ±0.17 µm - Arborescents : 12.6 ±1.8 µm - Population globale : 8 ± 0.7 µm

87

Les résultats mettent en évidence une périodicité qui est de l’ordre de 6 à 800 µm sur la partie latérale du sillon (gyrus temporo-occipital latéral) et de 3 à 500 µm sur la partie médiale (gyrus temporo-occipital médial). Les données des couches moyenne et profonde sont superposables, les données issues des couches superficielle et sub-corticale ne sont pas interprétables. On peut rapprocher ces chiffres des observations faites lors de l’analyse de la distribution des arborescences. La période de 600-800 µm correspond aux écarts mesurés sur les artères de type A4 et A5, clairement visibles sur les mosaïques correspondantes. Il semble que nous enregistrions simplement ici une séquence artérielle qu’il serait abusif de rapporter à un module fonctionnel. Pour information rappelons que :

- Duvernoy évoque la possibilité d’une unité vasculaire fonctionnelle décrite sous la forme d’une veine centrale entourée d’une couronne artérielle. Il évalue le diamètre de ce module de 1 à 4 mm, fonction de la taille de la veine centrale (34),

- Mountcastle décrit l’unité fonctionnelle de base du cortex et la nomme

mini-colonne, s’étendant des couches cellulaires II à VI, perpendiculaire à la surface piale, mesurant 300 à 600 µm de diamètre, différent peu d’une espèce à l’autre quel que soit le volume du cerveau(101),

- Grinvald citant Hubel et Wiesel et Mountcastle avance un chiffre de

200 à 1000 µm en évoquant la possibilité ‘d’accéder à cette résolution en IRMf. (48)

L’une des discussions qui anime particulièrement la recherche en matière d’imagerie fonctionnelle tourne autour de la réalité de la détection d’un signal vasculaire à la résolution ultime d’un module (ou colonne) cortical. La part de l’anatomie est bien posée dans ce débat car il est vraisemblable que, quel que soit les phénomènes de régulation qui préside à la distribution préférentielle du volume sanguin en tel ou tel point du cortex activé, la possibilité d’observer une telle image suppose une organisation géométrique de la vascularisation corticale. Nous ne nous risquerons donc à aucune comparaison sur ce thème qui nécessite d’envisager l’analyse d’échantillons approchant dans les 3 dimensions de l’espace le volume de quelques colonnes… La figure ci-après synthétise les 3 points de l’analyse spatiale

88

86 Mosaïque V16l : Carte de densité en codage couleur mettant en évidence des taches

d’hyperdensité essentiellement réparties dans la couche moyenne du cortex (taches oranges-rouges). A gauche profil de densité capillaire en fonction de la profondeur du cortex. A droite, en bas profil « tangentiel » analysé par une fonction d’auto-corrélation montrant une nette périodicité

(≈ 600 µm) dans les couches moyenne et profonde du cortex étudié. Barre d’échelle = 1mm.

89

7 ELEMENTS DE DISCUSSION – PERSPECTIVES METHODOLOGIQUES

Ce travail n’est qu’une étape dans la compréhension de la microcirculation corticale. Il n’existe pas à notre connaissance de base de données aussi importante sur le réseau vasculaire du cortex sachant qu’à l’échelle de cet organe les informations que nous avons traitées n’en représentent qu’une infime partie. C’est là l’ambiguïté qui nous a accompagnés tout au long de la manipulation de cet échantillon du réseau. Ceci n’exclut pas que les données collectées puissent constituer la première partie d’une base de données qui pourrait être complétée et analysée dans un projet de recherche multicentrique (116). La principale limitation est la faible épaisseur des mosaïques. Nous avons mesuré l’épaisseur des coupes de Duvernoy aux alentours de 300 µm, les caractéristiques du microscope confocal utilisé nous ont conduit à en sacrifier un tiers, le post-traitement des images nécessitant d’éliminer des zones vides liées au recalage en z et une partie du bruit situé essentiellement dans la zone la plus profonde en a sacrifié près d’un autre. Nombre des résultats présentés sont certainement affectés par cet élément. La base de données constituée à partir des coupes de Duvernoy contient une somme d’informations qui n’ont été que partiellement abordées ici. L’analyse de la maille capillaire en fait partie, orientation des vaisseaux, analyse fractale, connectivité, géométrie. Il est certain que chaque résultat exposé dans ce travail appelle une autre question dont la réponse (ou des éléments de réponse) est probablement à notre disposition dans les 200 000 segments qui constituent cette base de données épurée. Le temps passé dans l’observation des vaisseaux du cortex cérébral humain constitue à proprement parler un travail d’anatomiste où l’analyse morphologique donne la piste à suivre pour déterminer les critères pertinents de l’analyse morphométrique. Un exemple de ce parti-pris méthodologique peut en être le suivant. La maille capillaire apparaît morphologiquement comme un polygone irrégulier, pentagone ou hexagone présentant souvent un grand et un petit côté. L’aspect bimodal de la distribution des longueurs capillaires observé pourrait-il s’expliquer par cette observation anatomique ? Si l’anatomiste s’inspire du résultat quantitatif pour orienter sa compréhension de l’organisation du réseau, le physicien s’attache aux données morphologiques, qualitatives (et cliniques) pour valider son interprétation des résultats. Ce travail est donc avant tout le reflet d’une collaboration multidisciplinaire, interactive et productive. L’étude des structures artério-veineuses proprement dites (arborescences) est probablement à aborder selon d’autres techniques anatomiques bien que nous ayons pu extraire des vaisseaux quasiment complets, vaisseaux appartenant aux couches superficielles et moyennes du cortex. Ces vaisseaux sont ceux qui sont décrits par 4 ou 5 ordres successifs par la classification de Strahler modifiée par Kassab (73). Dans son étude portant sur les coronaires du porc Kassab décrit 11 ordres successifs depuis leur origine sur l’aorte jusqu’au lit capillaire (70, 71). Il est probable que compte tenu de l’épaisseur du cortex la réalité du nombre d’ordre des vaisseaux qui l’occupent soit ici systématiquement sous-estimée d’un ordre mais il paraît peu probable que ces vaisseaux puissent être décrits par plus de 6 ordres successifs. Là encore le matériel de Duvernoy garde tout son intérêt car un examen plus large des coupes qui composent cette collection permettrait

90

probablement d’isoler une population de vaisseaux complets pour affiner nos résultats. D’autres techniques anatomiques et surtout d’autres techniques d’imagerie microscopique permettent d’accéder à une information tridimensionnelle de résolution identique. Nous avons pu participer à la confection d’échantillons destinés à la microtomographie synchrotron (115). Les premiers résultats quantitatifs obtenus par ce type de protocole sur le cerveau du rat et du marmouset sont extrêmement intéressants et ont donné lieu récemment à une thèse (126). Cependant, d’un point de vue anatomique, on note que les injections étudiées dans ce travail ne sont pas réplétives et sont amputées probablement de tout ou partie du secteur veineux. Ceci rend délicate toute comparaison des résultats mais n’enlève rien à la valeur méthodologique de l’analyse quantitative concernant notamment ses implications en matière de caractérisation de la néo-angiogénèse tumorale. Heinzer (55) a proposé récemment une étude en microtomographie synchrotron utilisant des moulages vasculaires dont la radio-opacité a été obtenue par vaporisation de tetroxyde d’osmium avec des résultats qualitatifs extrêmement probants. Il a visualisé semble-t-il la totalité du réseau vasculaire de la surface piale au lit capillaire chez la souris avec une résolution de l’ordre de celle utilisée ici (1.4 µm). L’expérience en matière d’injection anatomique montre que les injections réplétives dédiées à une analyse tridimensionnelle peuvent être obtenues indifféremment par la méthode gélatine-encre de Chine ou par injection de résine acrylique de basse viscosité type Mercox (29, 34, 78, 122). Dans le premier cas on conserve l’information topographique, anatomique, localisatrice qui permet de savoir clairement à quelle zone du cortex on s’intéresse ; dans le second cas on perd tout ou partie de cette information même en étant très rigoureux dans le traitement des informations. Il semble que Heinzer (55) ait apporté une partie des solutions à ce dernier problème et l’application de ce type de protocole au cerveau humain dans une étude post-mortem semble envisageable et fait partie de nos préoccupations. Quel que soit le produit utilisé des imperfections d’injection (25) sont régulièrement observées et mises en balance avec d’autres procédés qui sont de l’ordre de la coloration histologique et ne donne qu’une information bidimensionnelle incomplète et surtout inadaptée à l’étude d’une structure dont la réalité tridimensionnelle n’est plus à démontrer (139). D’autre part l’influence du produit d’injection et du traitement infligé à la pièce sont autant d’éléments à prendre en compte dans la précision d’une analyse quantitative. En ce sens les moulages en résine basse viscosité sont largement supérieurs aux injections gélatine-encre de Chine qui nécessitent une étape de fixation, de diaphanisation et de conditionnement sous lamelle qui sont autant de facteurs de rétraction et de déformation de l’échantillon. Le facteur de rétraction est difficile à apprécier (126), et il semble très arbitraire d’affecter un coefficient de correction aux valeurs mesurées. L’idée que la rétraction puisse être globale et homogène (isotrope) permet de penser que les valeurs de densité et l’analyse des distributions des diamètres et des longueurs ne sont que peu affectées par ce phénomène. Les moulages en résine donnent des informations morphologiques plus précises en microscopie électronique (34, 50, 100, 122, 127) visualisant les impressions nucléaires et les structure péri-vasculaires. Par contre leur numérisation en microscopie confocale reste délicate même si le contraste obtenu est spectaculaire, la profondeur d’acquisition grandement optimisée et la segmentation probablement idoine, la manipulation de ces échantillons extrêmement fragile à l’air libre reste éminemment problématique (95). Les essais

91

réalisés entre nos mains avec la collaboration du laboratoire d’anatomie de Barcelone se penchent actuellement sur l’intégration de ces échantillons dans un gel de silicone pour tenter de résoudre ces problèmes de manipulation. La localisation de ces échantillons dans l’espace est un autre problème dans la mesure où sont gommées toutes les structures anatomiques qui permettent habituellement de se repérer dans cet organe. On pourrait comparer cette situation à l’interprétation d’IRMf sans aucune image morphologique associée.

87 Essai de numérisation d’un moulage du réseau vasculaire cérébral en mercox. L’échelle de

couleur codant la profondeur développe 500 µm du bleu au rouge. Indépendamment de ce problème de localisation de l’échantillon à l’échelle d’un gyrus, d’une aire fonctionnelle, ou d’un lobe cérébral…, l’information histologique reste fondamentale tant il reste de spéculations en cours sur la façon dont l’architecture vasculaire se superpose à l’organisation tissulaire voire fonctionnelle du cortex. C’est l’un des points les plus attractifs de ce travail. Pour valider son étude Duvernoy avait pris soin de réaliser régulièrement une coupe histologique de 20 µm d’épaisseur pour bénéficier de l’information cyto-architectonique. Dans cette optique l’attitude qui semble la plus adaptée à obtenir des informations portant simultanément sur la vascularisation et le parenchyme cérébral est d’utiliser des techniques de marquages immuno-histochimiques couplées à un fluorochrome permettant une visualisation en microscopie confocale en fluorescence (29, 127). L’approche dynamique de la vascularisation, de même que l’analyse des rapports du compartiment vasculaire et du compartiment tissulaire profite actuellement du développement de la microscopie biphotonique, technique non destructrice qui permet d’étudier des tissus vivants (22, 108). Outre le fait que ce travail apporte un certain nombre d’éléments quantitatifs qui puissent directement trouver des applications notamment en matière d’IRMf et d’interprétation du signal BOLD (89), il reste essentiellement une approche méthodologique originale dédiée à la microcirculation. La numérisation et la segmentation du réseau en 3 dimensions redonne à ce domaine d’étude sa dimension anatomique, par opposition aux nombreuses études histologiques dont sont issues des informations partielles et par définition bidimensionnelles (95-

97). On pourrait insister sur l’intérêt de coupler la séculaire observation anatomique à la description topologique de la vascularisation. L’une et l’autre se complètent pour arriver à une interprétation cohérente des données. Pour exemple, nous ne nous sommes pas arrêtés sur une classification définitive des vaisseaux du

92

cortex notant que celle proposée par Duvernoy ou par Reina De La Torre et Rodriguez Baeza avaient chacune leurs avantages, mais nous avons montré comment la simple description des vaisseaux par la classification de Strahler-Kassab pouvait résumer les observations de ces auteurs avec précision. Cette classification topologique est une étape indispensable vers la construction d’un modèle mais il est certain que les travaux qui suivront profiteront de ce procédé et permettront (si nécessaire) d’en déduire une classification anatomique (structurelle) peut-être plus appropriée. Il s’agit simplement de définir les éléments nécessaires à une description plus explicite des vaisseaux que ne le fait habituellement le discours anatomique. Nous n’avons pas retrouvé d’exemple d’applications de la classification de Strahler à la vasculature du cortex cérébral (56) mais elle a été validée dans d’autres organes tels que le cœur, le poumon ou le rein (67, 70, 106). D’autre part, les progrès de l’imagerie médicale (clinique) et des techniques de segmentation sont probablement en passe de permettre l’extraction d’un arbre vasculaire à un niveau distal (intra-organe) de manière presque routinière (24, 83, 151). Au-delà de l’intérêt biomécanique que présente la classification de Strahler modifiée par Kassab, il est possible de prévoir « sa vulgarisation anatomique » tant elle fait le lien entre le qualitatif et le quantitatif. Parmi les outils développés dans ce travail, le logiciel d’extraction des arborescences (Contrôle Réseau) nécessite d’être remarqué pour sa contribution à une approche fonctionnelle du réseau. Celle-ci devra être privilégiée et développée dans de futurs travaux. « Contrôle Réseau » est basé sur une modélisation sommaire du réseau résistif qui ne tient pas compte des variations de l’hématocrite qui elles, supposent résolu le problème de l’écoulement. Si l’on examine le procédé d’extraction des arborescences tel qu’il est réalisé par ce logiciel et que l’on suppose par ailleurs la segmentation réaliste, l’incrémentation de la résistance permet d’arrêter l’extraction dès lors que l’on atteint une résistance qui « allume » ou « opacifie » le réseau capillaire. Lorsque, en cours d’extraction, apparaissent d’autres structures arborescentes que celle ciblée, pour des valeurs de résistance qui ne sont pas de l’ordre de celles des capillaires on conçoit aisément que nous sommes en face d’une probable anastomose. Il en résulte que tous les vaisseaux « bloqués » pour isoler telle ou telle arborescence méritent un examen particulier car ils correspondent potentiellement à un phénomène anastomotique. Or, si au cours de l’extraction de 245 arborescences nous avons pu globalement observer et interpréter certains phénomènes par leur caractère répétitif (arcades vasculaires de la couche moyenne, shunt sous-corticaux, canaux préférentiels…), nous n’avons pas pris le temps de les quantifier précisément. Ce travail fait partie des projets prioritaires à mettre en œuvre dans la mesure où il existe d’une part de grandes incertitudes sur la réalité notamment fonctionnelle de ces anastomoses et qu’indépendamment des implications cliniques que peuvent avoir leur caractérisation précise, nombre de tentatives d’interprétation du signal en imagerie fonctionnelle (88) ou d’essais de modélisation des processus d’angiogénèse (37, 82) supposent notamment l’absence de shunt artério-veineux. Les anastomoses intra-corticales ont fait l’objet de descriptions spécifiques (51,

121). Les anastomoses artérielles pouvant pour les uns être définies comme une entité anatomique (2) ou ne pouvant être discernées au sein d’un réseau capillaire continu pour les autres (121). Les anastomoses veineuses ne sont jamais retrouvées (2, 34, 121), ce que nous pouvons corroborer. Les shunts intra-corticaux (joignant des troncs de diamètre importants) sont considérés comme rares ou absents (121), par contre les anastomoses artério-veineuses, considérées comme des « canaux préférentiels » capables de redistribuer le volume sanguin en fonction de la demande fonctionnelle, semblent relativement fréquentes (51). Elle constitue pour Ravens un système évolué de la microcirculation corticale (neo-

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vascular system) en opposition avec un système vestigial (paleo-vascular system) fait d’anastomoses de grand diamètre, séquelles de la disposition en boucles artério-veineuses rencontrée chez certains invertébrés (ver de terre), les vertébrés inférieurs et certains mammifères tels que les marsupiaux (opossum) (20, 81, 84, 146). Par contre certains auteurs insistent sur le fait qu’il est difficile de prouver la réalité de ces anastomoses à partir d’observations en microscopie optique. (34, 130). « Contrôle Réseau » est ici particulièrement adapté et les pistes ouvertes par ce travail préliminaire pourraient conduire à une description plus systématique de cette particularité. 8 PERSPECTIVES D’APPLICATIONS ET CONCLUSION Nous avons à travers ce travail développé une approche quantitative de la microcirculation qui n’est spécifiques ni de l’espèce, ni de l’organe et dont les domaines d’applications sont nombreux. Nous les énumérons ci-dessous en faisant référence à ceux dont nous nous sommes inspirés.

8.1 IMAGERIE FONCTIONNELLE

Nous reviendrons brièvement sur le domaine d’applications qui est à l’origine de cette étude et qui en reste le fil conducteur : l’imagerie fonctionnelle du cortex cérébral. Nous avons discuté des corrélations possibles entre l’organisation spatiale du réseau en termes de densité vasculaire. Certains travaux ont mis en avant que le volume et le débit sanguin cortical pourraient être régulés à l’échelle fonctionnelle représentée par une colonne corticale (32, 75) avec toutefois un débat ouvert sur la réalité de ces observations récentes (86). Même si nos résultats apportent des éléments à ce débat il nous semble encore prématuré de spéculer sur le fait que cette régulation puisse être directement corrélée à la disposition périodique que nous avons pu observer (152). Cependant, la réalité d’un module vasculaire ne nous paraît pas aberrante et sa démonstration pourrait donc nécessiter l’examen d’un volume plus tridimensionnel et une analyse plus poussée des densités dans un plan tangentiel à la surface. Un autre élément d’intérêt est que la zone d’étude à laquelle nous nous sommes consacrés pourrait potentiellement appartenir au cortex visuel secondaire (8, 94) et que nombre d’études concernant ce sujet sont centrées sur le cortex visuel (3, 48, 87, 152, 154). Nous sommes, par contre, plus près de rapprocher les variations laminaires de la densité « anatomique » des profils laminaires observés en IRMf. Les raisons en ont été évoquées plus haut et sont discutées dans le deuxième article en annexe de ce travail. Même si les variations de nos profils anatomiques, statiques sont faibles elles sont superposables aux profils IRM dynamiques enregistré par ces auteurs. Notamment lorsque l’on prend en compte la contribution relative des « gros vaisseaux » et des capillaires Certaines études prennent le soin de superposer les profils enregistrés à une étude histologique ou en IRM morphologique permettant de précisément localiser les pics d’intensité par rapport aux couches cellulaires (45, 49) mais aucune ne tient compte de la réalité quantitative de la densité vasculaire. La conclusion réservée qui s’impose à ce stade indique que, parmi les nombreux facteurs qui contribuent au signal en IRMf, les facteurs anatomiques (et hémodynamiques) jouent un rôle qui a probablement été sous-estimé. L’un des éléments fondamentaux qui reste à mettre en évidence à partir du matériel anatomique dont nous disposons est la contribution du secteur veineux et du secteur artériel à la densité vasculaire. En effet, le signal BOLD à faible

94

champ est enregistré principalement à partir des veines. Nous avons isolé les 2 populations à partir de critères morphologiques et il reste un pas à franchir pour obtenir des informations quantitatives précises qui pourraient nous permettre de séparer artères et veines de manière automatique. Parmi ces critères on peut compter l’analyse de la géométrie des bifurcations, de la tortuosité et de l’orientation des segments dans l’espace. Un autre élément important dans l’analyse sera de rattacher à chaque arborescence artérielle ou veineuse le lit capillaire qui en dépend. Ceci pourrait être réalisé par l’utilisation d’un algorithme (type algorithme de Dijkstra) permettant de déterminer le plus court chemin entre un capillaire et une arborescence en utilisant un critère de résistance plutôt qu’un critère de distance. Ces résultats pourraient permettre d’estimer de manière plus précise la contamination veineuse et « la réponse hémodynamique impulsionnelle » (Point Spread Function) (134, 135, 142).

8.2 DIFFUSION DE L’OXYGENE

Si la faible épaisseur des mosaïques reste un obstacle à l’analyse des structures arborescentes, elle reste adaptée à l’étude du réseau capillaire. En effet, il est vraisemblable que 120 µm d’épaisseur incluent 2 à 3 fois la taille de la maille capillaire et représentent de ce fait un volume pertinent pour l’étude du réseau à cette échelle. Cette dimension a pu être appréhendée par l’étude des cartes de distance extravasculaires. Ce point n’a pas été développé dans cette thèse car, bien qu’intégrant une dimension fondamentale des processus qui concourent aux échanges entre les vaisseaux et le tissu nerveux environnant, ils dépassent les limites anatomiques que nous nous étions fixées. La méthodologie en est décrite dans le premier article présenté en annexe. La figure ci-dessus donne une idée d’une carte de distance extravasculaire et du traitement des données en fonction de la profondeur du cortex. Si l’on s’en tient à la dimension anatomique approchée par ce calcul, on note que la distance moyenne qui sépare tout point du tissu du vaisseau le plus proche varie de 22 à 27 µm entre 10 et 90 % de l’épaisseur du cortex ; la carte de distance apparaît plus homogène que les cartes de densité observées plus haut ; On peut déduire de ce résultat la taille approximative de la maille capillaire aux alentours de 50 µm.

88 Carte des distances extravasculaires sur une partie de la mosaïque V17l. A gauche :

représentation graphique de cette donnée en fonction de la profondeur du cortex

95

La géométrie vasculaire est un paramètre fondamental de la diffusion de l’oxygène (23, 46, 62, 113, 114). Les échanges entre les vaisseaux et le tissu environnant sont gouvernés par des équations de convection-diffusion dans une configuration géométrique complexe et peuvent être modélisés par différentes méthodes telles que la méthode des différences finies (10, 46) ou par fonction de Green (58, 133). Notons que ces méthodes sont elles-mêmes dérivées de l’équation de Poisson qui, en 3 dimensions est proportionnelle à l’inverse de la distance entre le tissu et le vaisseau. De ce fait, l’appréciation plus précise des distances extravasculaires au sein du parenchyme cérébral pourrait être un indicateur fiable de la capacité du réseau vasculaire à répondre à la demande métabolique liée à une activité neuronale localisée. Il est d’autre part montré que la distance de diffusion n’est pas évaluée précisément par la simple densité vasculaire (74).

8.3 ANGIOGENESE NORMALE ET PATHOLOGIQUE

L’angiogénèse normale est peu décrite chez l’homme (7, 107). Des études chez l’animal ont permis de documenter les relations existant entre la synaptogénèse et la vasculogénèse se basant sur des calculs de densité à partir d’images 2D (38) corroborant l’hypothèse de Norman selon laquelle l’augmentation de la densité vasculaire dans la couche moyenne du cortex apparaît après la naissance et s’intensifie avec le processus de synaptogénèse. Compléter les données de Bar et Norman par une approche quantitative et tridimensionnelle semble une perspective réaliste. L’angiogénèse pathologique est au centre des préoccupations de tout chercheur qui s’intéresse à la microcirculation (6, 17, 140). C’est probablement l’orientation prioritaire que prendra probablement la suite de cette thèse. Il a été montré que la complexité des réseaux de néo-angiogénèse tumorale pouvait être décrite par la mesure de la dimension fractale des micro-vaisseaux. Ce type d’analyse, indépendamment de son apport indubitable dans la compréhension des mécanismes biologiques qui sous-tendent l’angiogénèse tumorale, pourrait être corrélé à un indice de gravité (5, 16, 129). Dans cette démarche de caractérisation du réseau pathologique, la place que prend la compréhension du réseau normal est d’autant plus importante. En effet, les efforts réalisés pour différencier un réseau normal d’un réseau pathologique prendront toute leur valeur dans une rigoureuse évaluation de l’efficacité des médications anti-angiogéniques et définiront leur place dans nos conduites thérapeutiques futures (66).

96

CONCLUSION Ce travail est en cours. Il met en avant, à partir d’une méthodologie originale, certaines caractéristiques morphométriques et topologiques du réseau micro-vasculaire du cortex cérébral humain. Ces données anatomiques ne sont qu’une étape dans la compréhension de la microcirculation cérébrale et nécessitent d’être complétées. Cartographier la vascularisation du cortex cérébral est un travail qui probablement dépasse les capacités d’un simple humain. L’idée que ce type d’approche méthodologique ou que les résultats qui en découlent puissent servir une réflexion sur la conception d’un modèle théorique est donc rassurant. Quoiqu’il en soit, la capacité d’un tel modèle à simuler une situation réaliste reste du domaine de la recherche en anatomie. Ceci ne nous permettant pas de ponctuer cette dernière phrase d’un point final…

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INDEX

A

algorithme de Dijkstra · 93 algorithme de Levenberg-Marquardt · 67 analyse topologique · 32 anastomose · 35, 36, 78, 91 anastomoses pré-capillaires · 63 angiogénèse · 94 angles de bifurcations · 73 arcades artérielles · 35, 91 architecture histologique · 25 artères · 37, 38, 39, 61 artères multi-tronculaires · 48 asymétrie des bifurcations · 73, 76 autosimilarité · 82

B

bassin d’irrigation · 77 bassin de drainage · 77 bifurcation · 39, 55, 72 bifurcation moyenne · 78 Branchement Anti-symétrique Latéral · 72 Branchement Homogène Symétrique · 72 Branchement Intra-Elément · 72 bruit · 18, 19, 20, 23

C

calcul du rayon · 15 canaux préférentiels · 91 capillaire · 30, 31 carte de densité · 79, 80 carte de distance · 15 cartographie · 80 classification de Duvernoy · 42, 43, 49, 58,

91 classification de Strahler-Kassab · 54, 58,

64, 88, 91 classifications · 41 coefficient de détermination de Pearson · 64 colonnes corticales · 85 comparaisons des diamètres · 28 compression · 16 connectivité · 18, 88 connexions multiples · 19 contamination veineuse · 93 contrôle réseau · 32, 35, 91 coordonnées · 16 cortex sensoriel secondaire · 81 couche avasculaire · 83 couche moyenne · 81 couches histologiques · 83 couches vasculaires · 83 couronne artérielle · 86

D

demi-angle au sommet · 76

demi-angle entre branches filles · 73 densité · 25 densité linéique · 25, 79 densité surfacique · 25 densité volumique · 25, 79 densités surfacique · 79 dérive en z · 9 diamètre à l’origine · 59 diaphanisation · 7 différenciation artério-veineuse · 32, 37, 40 diffusion de l'oxygène · 93 dimension fractale · 71 dispersion angulaire · 65 distance extravasculaire · 93 distribution artério-veineuse · 44, 49, 53, 63 distribution des diamètres · 28 distribution des longueurs · 27

E

éditeur de segmentation · 14 effet Fahraeus · 32 effet Fahraeus-Lindqvist · 32 élément · 54, 55, 64 épaisseur du cortex · 41, 81 équation de Poisson · 94 espace de Pfeifer · 80 extraction des arborescences · 33, 37, 44, 91

F

facteur correctif · 16, 60 fichier ASCII · 16 filtrage · 9, 19 fixation · 6 fonction d’auto-corrélation · 85 forme · 77 forme des bifurcations · 72 fractales · 55, 71, 88, 94

G

générations · 54 grille tridimensionnelle · 79 grossissement · 8 groupe 1 · 44 groupe 2 · 44 groupe 3 · 44 groupe 4 · 46 groupe 5 · 47 groupe A2 · 45 groupe A3 · 45 groupe A4 · 46 groupe A5 · 47, 48, 58 groupe A6 · 48 groupe S2 · 57 groupe S3 · 57 groupe S4 · 56 groupe S5 · 56 groupe V1 · 44 groupe V2 · 45

98

groupe V3 · 45 groupe V4 · 46 groupe V5 · 47 gyration · 25, 29, 36, 40, 42, 48, 83 gyrus temporo-occipital · 8

H

hématocrite · 32 hétérogénéité · 26, 80, 85

I

ImagePro · 11 impressions nucléaires · 37, 89 inclusion · 7 injection · 6, 19 injections réplétives · 89 interpolation spline · 81 IRMf · 84, 85, 86, 90, 92

J

jonction cortico-sous-corticale · 48 jonctions capillaro-artérielles · 63 jonctions capillaro-veineuses · 63

L

labels · 14 ligne centrale · 15, 16 lineset · 15 lobe temporal · 11 loi de Poiseuille · 32, 54 loi puissance · 67, 71 lois de Horton · 55, 64, 77 lois de Horton expérimentales · 65 lois de Horton généralisées · 66, 70 lois de puissance · 70 lois expérimentales · 64 lois généralisées · 64 longueur d’onde · 8 longueur vasculaire · 22 longueurs · 62 loupe binoculaire · 40

M

maille capillaire · 93, Voir masquage · 14 matrice de connectivité · 55 méthode de Strahler · 54 microscopie biphotonique · 90 microscopie confocal · 34 microscopie confocale · 8 microscopie électronique · 37 microtome · 7 microtomographie synchrotron · 89 mini-colonne · 86 modélisation · 64, 71, 78

module cortical · 86 module vasculaire · 85, 92 mosaïque · 9 moulages en résine · 37, 60, 89

N

néo-angiogénèse tumorale · 94 nœud · 18, 55 nombre d’éléments · 55 nombre d’ordres · 55, 67

O

ordonnée à l’origine · 64 ordre · 54, 55, 64 organisation en colonnes · 85 organisation histologique · 42 organisation spatiale du réseau · 84 orientation des vaisseaux · 88 origine · 32, 37, 41, 59

P

paramètres d’acquisitions · 8 pente · 64, 65, 66 périodicités vasculaires · 51, 85 planéité · 73, 75 point · 18 prélèvement cérébral · 6 profondeur du cortex · 81

R

rapports d’échelle · 71 rapports de branchement · 73 rayon · 16 RB10 · 73 RB20 · 73 RBFM · 73 régulation · 63 relation fonctionnelle · 35 relations vasculaires · 37 réponse hémodynamique impulsionnelle · 93 reproductibilité de la méthode · 29 réseau capillaire · 63 réseau continu · 35 résistance · 32, 34, 35 résolution · 89 résolution axiale · 8 résolution latérale · 8 ResolveRT · 9, 14, 33 ResolveSkel · 21 rétraction · 7, 60, 89 rotation des mosaïques · 79

S

segment · 18 segmentation · 19, 35

99

segments connectés · 27 segments terminaux · 19, 27 séquence artérielle · 86 seuil variable · 9, 14 seuillage · 9, 14 shunts artério-veineux · 36, 91 sillon collatéral · 40 Spalteholz · 7 squelette · 16 stockage · 14 structure péri-vasculaires · 89 substance blanche · 36 surface vasculaire · 22 synaptogénèse · 94 système de déplacement · 9 système matrilinéaire · 72

T

taille du voxel · 9 techniques anatomiques · 89 tonus pariétal · 40 topologie des arborescences · 70 tortuosité · 39 trifurcations · 21 type de bifurcation · 72, 78

U

unité fonctionnelle neuronale · 85 unité vasculaire fonctionnelle · 86

V

vaisseaux atypiques · 42, 48 vaisseaux droits · 35 vaisseaux pie-mériens · 37 vaisseaux types · 46 variables angulaires · 75 veine centrale · 86 veines · 37, 38, 39, 61 veines principales du cortex · 47 viscosité relative apparente · 32 volume tissulaire · 22, 79 volume vasculaire · 22

Z

zone d’hyperdensité · 83, 84 zones d’activité fonctionnelle · 81 zones de transition fonctionnelle · 48

100

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ABSTRACT Detailed information on microvascular network anatomy is a requirement for understanding several aspects of microcirculation, including interpretation of haemodynamically based functional imaging methods, but very few quantitative data on the human brain microcirculation are available. The main objective of this study is to propose a new method to analyze this microcirculation. From thick sections of India ink-injected human brain, using confocal laser microscopy, the author developed algorithms adapted to very large data sets to automatically extract and analyze centre lines together with diameters of thousands of brain microvessels within a large cortex area. From this database the global densities, the statistical distributions of diameters and lengths were analysed, separating the tree-like and the net-like parts of the microcirculation. The topological structure of the cerebral arterioles and venules is tree-like, while that of the capillaries is net-like. Because of this essential difference in nature, the topology of these branching or mesh structures must be analyzed separately. To extract a vascular tree from the skeleton, we identified its origin in the sulcus and traced automatically all the paths from this origin through vessels in which resistance to flow is lower than a prescribed value. The branching pattern of the arteriolar and venous trees extracted is best described by the diameter defined Strahler system. Furthermore, our analysis included variations in volume density along the cortical depth and along vectors parallel to the cortical surface. It appears that spatial specificity of fMRI signals at an intracortical level could profit from precise quantitative evaluation of the vascular network suggested by the present anatomic study.

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AUTEUR : Frédéric LAUWERS TITRE : Etude quantitative tridimensionnelle du réseau micro-vasculaire du cortex cérébral humain. DIRECTEUR DE THESE : Jean-Pierre Marc-Vergnes LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Toulouse le 17/12/2007 RESUME: Des informations anatomiques quantitatives précises sont indispensables à la compréhension de la microcirculation du cortex cérébral humain. Le but de ce travail est d’introduire une méthode d’analyse tridimensionnelle des vaisseaux permettant d’obtenir les données morphométriques et topologiques pertinentes, indispensables à une approche biomécanique du système. Les images sont numérisées en microscopie confocale à partir de coupes d’un cerveau injecté à l’encre de Chine. Une étape de segmentation automatique permet d’obtenir des informations directes sur la morphométrie et la topologie du réseau. L’analyse tient compte de la dualité du réseau Les artérioles et les veinules corticales ont une structure arborescente alors que le réseau capillaire est un réseau maillé. L’extraction des arborescences utilise une méthode originale respectant une contrainte de résistance. Les arborescences sont soumises à une analyse topologique (système de Strahler) et quantitative complète (longueur, diamètre, géométrie des bifurcations, rapports de branchement). Une analyse spatiale de la densité micro-vasculaire est proposée dans tous les plans de l’espace. Une zone d’hyperdensité vasculaire dans le tiers moyen du cortex est délimitée. Dans un plan parallèle à la surface l’analyse spatiale décrit une périodicité dont la fréquence est discutée par rapport au schéma fonctionnel des colonnes corticales. Les résultats proposés sont mis en balance avec d’autres obtenus le plus souvent dans des études animales et par des analyses en 2 dimensions. Il est actuellement reconnu que les limites de la résolution spatiale en imagerie fonctionnelle par résonnance magnétique sont déterminées par l’anatomie de la microcirculation. La contribution de ce travail à l’imagerie fonctionnelle est discutée. De nombreux domaines peuvent tirer partie de la méthode utilisée dans ce travail, indépendamment de l’espèce ou de l’organe. MOTS-CLES: Cortex cérébral humain – Microcirculation cérébrale - Morphométrie – Microscopie confocale - Segmentation – Topologie – Classification de Strahler – Densité vasculaire – Imagerie Fonctionnelle DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Anatomie et Imagerie en Médecine LABORATOIRE: INSERM U825