ÉTUDE DES EFFETS ENDOCRINIENS PRODUITS PAR LES ... · iii Nos résultats appuient donc ceux de...

MICHEL AUBÉ

ÉTUDE DES EFFETS ENDOCRINIENS PRODUITS PAR LES ORGANOCHLORÉS EN LIEN

AVEC LA CARCINOGENÈSE MAMMAIRE

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Physiologie-Endocrinologie pour l’obtention du grade de Philosophiæ Doctor (Ph.D.)

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2008

© Michel Aubé, 2008

ii

Résumé

Les facteurs impliqués dans la carcinogenèse mammaire sont nombreux et l’environnement

semble jouer un rôle très important. Nous avons constitué un mélange d’organochlorés

dont la composition ressemble à celle de mélanges de contaminants présents chez

l’humain, et évalué ses propriétés endocriniennes et sa capacité à stimuler la prolifération

de cellules tumorales mammaires.

Dans une première étude nous avons évalué le potentiel du mélange sur l’induction d’un

gène rapporteur contrôlé par des promoteurs spécifiques aux récepteurs des estrogènes, des

androgènes ou des hydrocarbures aromatiques. Nous avons ensuite comparé les résultats à

ceux obtenus avec les composantes du mélange testées individuellement afin de

comprendre leur influence sur l’effet global. Nous avons observé que le mélange possède

des propriétés estrogéniques, antiandrogéniques et semblables à celles de la dioxine.

Lors de notre seconde étude, nous nous sommes intéressés au potentiel du mélange sur la

prolifération de plusieurs lignées cellulaires. Chez les cellules MCF-7 le mélange induit

une augmentation draconienne de la prolifération. Nous avons aussi remarqué que le

mélange diminuait la prolifération des cellules non hormono-dépendantes ou des cellules

CAMA-1 en présence d’estrogènes. Toutefois en présence d’androgènes et d’estrogènes, le

mélange induit une augmentation puis une diminution de la prolifération en fonction de la

concentration du mélange dans le milieu de culture.

La troisième partie de notre étude fut réalisée pour investiguer les mécanismes de

prolifération cellulaire qui sont affectés par le p,p’-DDE, une des principales composantes

du mélange. Nous avons observé que ce composé ubiquitaire peut accélérer le processus de

prolifération cellulaire en utilisant comme modèle les cellules tumorales du sein CAMA-1

et MCF-7-AR1. Nos résultats suggèrent qu’en bloquant le récepteur des androgènes, le

p,p’-DDE interfère dans le contrôle de la prolifération des cellules tumorales mammaires

en accroissant l’entrée des cellules en phase S du cycle cellulaire via l’expression de la

cycline D1.

iii

Nos résultats appuient donc ceux de certaines études épidémiologiques suggérant une

association positive entre le cancer du sein et les organochlorés, plus particulièrement avec

le p,p’-DDE. Une contribution additionnelle des autres contaminants de l’environnement

ne peut être écartée car l’ensemble des résultats obtenus montre que plusieurs des

substances testées ont des effets endocriniens.

Avant-Propos Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr. Pierre Ayotte, qui m’a

accueilli dans son laboratoire et qui m’a soutenu pour toute la durée de mes études

doctorales. Sa grande disponibilité, sa confiance et son souci du détail m’ont permis

d’acquérir les outils nécessaires à la poursuite de ma carrière.

Je veux également remercier ses assistants de recherche Christian Larochelle et Nathalie

Ouellet qui m’ont toujours appuyé lorsque j’avais besoin d’aide sur le plan technique et

pour l’interprétation des données.

Je tiens à remercier les membres qui composent le jury pour l’évaluation de ma thèse, soit

les docteurs Marc-Edouard Mirault, Guy Poirier et Michel Charbonneau.

Finalement, je tiens à remercier l’Alliance Canadienne pour la Recherche sur le Cancer du

Sein pour avoir financé l’étude que nous avons réalisée.

Je voudrais dédier ce travail à mes parents qui m’ont encouragé, leur support fut un gage de réussite et de continuité.

Table des matières Résumé................................................................................................................................... ii Avant-Propos ........................................................................................................................ iv Table des matières ................................................................................................................ vi Liste des tableaux.................................................................................................................. ix Liste des figures ..................................................................................................................... x Liste des abréviations........................................................................................................... xii Introduction............................................................................................................................ 1 1. Cancer du sein chez la femme ........................................................................................... 1

1.1 Les prédispositions génétiques .................................................................................... 1 2. Facteurs de risques non génétiques.................................................................................... 2

2.1 Habitudes de vie........................................................................................................... 2 2.1.1 Activité physique ................................................................................................. 3 2.1.2 Alimentation ......................................................................................................... 3

2.1.2.1 Phytoestrogènes ............................................................................................ 4 2.1.3. Consommation d’alcool...................................................................................... 6 2.1.4 Tabagisme............................................................................................................. 7

2.2 Facteurs hormonaux..................................................................................................... 8 2.2.1 Menstruations précoces et ménopause tardive...................................................... 8 2.2.2 Reproduction, contraception et hormonothérapie................................................. 9 2.2.3 Hormones sexuelles endogènes .......................................................................... 10

2.2.3.1 Les estrogènes.............................................................................................. 11 2.2.3.1.1 Métabolites génotoxiques des estrogènes ............................................. 13

2.2.3.2 Les androgènes ............................................................................................ 14 2.3 Facteurs environnementaux ....................................................................................... 17

2.3.1 Radiations ionisantes .......................................................................................... 17 2.3.2 Produits chimiques.............................................................................................. 18

3. Les xénohormones ou perturbateurs endocriniens........................................................... 18 3.1 Différentes classes de xénohormones ........................................................................ 19

3.1.1 Les organochlorés ............................................................................................... 20 3.1.1.1 Biphényles polychlorés................................................................................ 20 3.1.1.2 DDT et ses métabolites ................................................................................ 22 3.1.1.3 Chlordane..................................................................................................... 23 3.1.1.4 Toxaphène.................................................................................................... 23 3.1.1.5 Lindane ........................................................................................................ 24 3.1.1.6 Aldrine et dieldrine ...................................................................................... 24 3.1.1.7 Hexachlorobenzène...................................................................................... 25 3.1.1.8 Mirex............................................................................................................ 25 3.1.1.9 Dioxines et furannes .................................................................................... 25

3.1.2 Autres polluants organiques persistants.............................................................. 26 3.1.3 Hydrocarbures aromatiques polycycliques......................................................... 27 3.1.4 Constituants des plastiques ................................................................................. 27 3.1.5 Les détergents et l’alkylphénol ........................................................................... 28 3.1.6 Autres sources de xénohormones ....................................................................... 29

3.2 Mécanismes d’action des xénohormones .................................................................. 30

vii

3.2.1 Affinité pour les récepteurs nucléaires hormonaux ............................................ 30 3.2.2 Activités agonistes .............................................................................................. 31 3.2.3 Activités antagonistes ......................................................................................... 31 3.2.4 Perturbation de la biotransformation et du transport des hormones endogènes . 31 3.2.5 Autres mécanismes d’action des hormones ........................................................ 33

3.3 Les xénohormones et le cancer du sein ..................................................................... 34 4. Récepteurs stéroïdiens sexuels et récepteur des dioxines................................................ 35

4.1 Structure générale des récepteurs stéroïdiens ............................................................ 36 4.2 Fonction des récepteurs stéroïdiens ........................................................................... 39

4.2.1 Action hormonale classique................................................................................ 40 4.2.2 Action non-génomique ....................................................................................... 40

4.3 Récepteurs des estrogènes ......................................................................................... 42 4.3.1 Récepteur des estrogènes alpha .......................................................................... 43 4.3.2 Récepteur des estrogènes bêta ........................................................................... 44

4.4 Récepteurs de la progestérone ................................................................................... 45 4.5 Récepteurs des androgènes ........................................................................................ 47

4.5.1 Les antiandrogènes ............................................................................................. 48 4.6 Récepteur des hydrocarbures aromatiques ................................................................ 49

5. Modèles pour l’étude des effets endocriniens des xénohormones................................... 51 5.1 Essais in vivo.............................................................................................................. 51 5.2 Essais in vitro............................................................................................................. 52

5.2.1 Systèmes de gène rapporteur .............................................................................. 53 5.2.2 Les modèles cellulaires in vitro .......................................................................... 53

5.2.2.1 Différentes lignées tumorales ...................................................................... 54 5.2.2.2 Mécanismes de contrôle de la prolifération chez les cellules mammaires .. 56

5.2.2.2.1 Rôle de la cycline D1 dans le tissu mammaire ..................................... 56 5.2.2.2.2 Équilibre entre les androgènes et les estrogènes................................... 57

6. Buts de l’étude ................................................................................................................. 58 Chapitre 1............................................................................................................................. 61 Activités endocriniennes d’un mélange complexe d'organochlorés dans différents systèmes de gène rapporteur ............................................................................................................... 61 Contribution ......................................................................................................................... 62 Résumé................................................................................................................................. 64 Abstract................................................................................................................................ 65 Introduction.......................................................................................................................... 66 Material and methods........................................................................................................... 67 Results.................................................................................................................................. 69 Discussion............................................................................................................................ 71 Figure legends...................................................................................................................... 75 Reference List ...................................................................................................................... 77 Table and figures ................................................................................................................. 82 Table 1. Composition of the organochlorine mixture.......................................................... 82 Chapitre 2............................................................................................................................. 88 Effets différentiels d'un mélange d'organochlorés sur la prolifération de différentes lignées tumorales mammaires .......................................................................................................... 88 Contribution ......................................................................................................................... 89 Résumé................................................................................................................................. 90

viii

Abstract................................................................................................................................ 92 Introduction.......................................................................................................................... 93 Materials and methods ......................................................................................................... 94 Results.................................................................................................................................. 97 Discussion.......................................................................................................................... 100 Reference List .................................................................................................................... 103 Figure legends.................................................................................................................... 107 Table 1. Composition of the organochlorine mixture........................................................ 109 Table 2. Cell lines characteristics ...................................................................................... 110 Chapitre 3........................................................................................................................... 115 Le p,p’-dichlorodiphényldichloroéthylène perturbe l’équilibre entre les voies de communication estrogéniques et androgéniques qui contrôlent la prolifération des cellules tumorales mammaires hormono-dépendantes ................................................................... 115 Contribution ....................................................................................................................... 116 Résumé............................................................................................................................... 117 Abstract.............................................................................................................................. 120 Introduction........................................................................................................................ 121 Materials and methods ....................................................................................................... 122 Figure legends.................................................................................................................... 139 Conclusion générale........................................................................................................... 150

Activités endocriniennes évaluées par l’activation d’un gène rapporteur ............. 150 Prolifération des lignées cellulaires hormono- et non hormono-dépendantes ....... 152 Mécanisme d’induction de la prolifération............................................................ 156

Perspectives ....................................................................................................................... 159 Bibliographie ..................................................................................................................... 161

Liste des tableaux Chapitre 1 Table 1. Composition of the organochlorine mixture ..................................................................................82 Chapitre 2 Table 1. Composition of the organochlorine mixture ................................................................................109 Table 2. Cell lines characteristics ................................................................................................................110

Liste des figures Introduction Figure 1 : Comparaison des principaux phytoestrogènes avec l’estradiol. *Estrogène

synthétique non stéroïdien. Adapté de Limer et Speirs [21].......................................... 5 Figure 2 : Synthèse des estrogènes et réponse dans les tissus. ............................................ 12 Figure 3 : Formation des métabolites des estrogènes et des adduits à l’ADN..................... 14 Figure 4 : Synthèse des androgènes..................................................................................... 15 Figure 5 : Quelques exemples de xénohormones. ............................................................... 29 Figure 6 : Hormones sexuelles et enzymes de la stéroïdogenèse ciblés par les perturbateurs

endocriniens. ................................................................................................................ 32 Figure 7 : Structure générale du gène d’un récepteur hormonal.......................................... 37 Figure 8 : Liaison du diéthylstilbestrol avec le récepteur des estrogènes............................ 38 Figure 9 : Représentation des forces de liaison qui permettent à la génistéine de s’enfouir

complètement dans la pochette du récepteur ERβ et de l’activer. ............................... 39 Figure 10 : Voies de signalisation des estrogènes médiées par les récepteurs membranaires

et nucléaires. ................................................................................................................ 42 Figure 11 : Translocation et sous-localisation du récepteur des androgènes transfecté chez

les cellules COS-1........................................................................................................ 49 Chapitre 1 Figure 1 : Estrogenic potential of individual organochlorines. ........................................... 83 Figure 2 : Antiandrogenic potential of individual organochlorines..................................... 84 Figure 3 : Estrogenic potential of the organochlorine mixture compared to those of E2 and

p,p'-DDT. ..................................................................................................................... 85 Figure 4 : Antiandrogenic potential of the organochlorine mixture compared to those of

hydroxyflutamide (OHF) and p,p'-DDE. ..................................................................... 86 Figure 5 : Dioxin-like potential of the organochlorine mixture compared to those of TCDD

and PCBs...................................................................................................................... 87 Chapitre 2 Figure 1 : Proliferative effects induced by the OC mixture in different cell lines ............ 111 Figure 2 : Effect of the OC mixture on cell cycle entry of breast cancer cell lines........... 112 Figure 3 : Effect of the OC mixture on the proliferation of CAMA-1 cells in the presence

of sex hormones ......................................................................................................... 113 Figure 4 : Proliferative effects induced by constituents of the OC mixture in CAMA-1 cells

in the absence (A-D) or presence of sex steroids (E-H). ........................................... 114 Chapitre 3 Figure 1 : Expression of sex-steroid receptors ERα and AR in CAMA-1, MCF-7 and

MCF7-AR1 breast cancer cell line at the protein level. ............................................ 142 Figure 2 : Effects of E2 and DHT on the proliferation of CAMA-1 cells.......................... 143

xi

Figure 3 : p,p’-DDE increases the proliferation of CAMA-1 cells in the presence of E2 and DHT ........................................................................................................................... 144

Figure 4 : p,p’-DDE increases the proliferation of MCF7-AR1 cells in the presence of E2 and DHT .................................................................................................................... 145

Figure 5 : p,p’-DDE increases G0/G1-S transition of CAMA-1 cells in the presence of E2 and DHT .................................................................................................................... 146

Figure 6 : p,p’-DDE modulates the expression of sex-steroid dependent genes in CAMA-1 cells at the mRNA level ............................................................................................. 147

Figure 7 : p,p’-DDE modulates the expression of sex-steroid dependent genes in CAMA-1 cells at the protein level ............................................................................................. 148

Figure 8 : A proposed mechanism for p,p’-DDE induced proliferation of hormone-dependent cells........................................................................................................... 149

xii

Liste des abréviations AF-1 : fonction d’activation 1 AhR : récepteur des hydrocarbures aromatiques AhRE : éléments réponse du récepteur des hydrocarbures aromatiques AMPc : adénosine monophosphate cyclique AR : récepteur des androgènes ARE : éléments de réponse aux androgènes ARNT : translocateur nucléaire du récepteur des hydrocarbures aromatiques ATSDR : Agency for Toxic Substances and Disease Registry BaP : benzo(a)pyrène BPA : bisphénol-A BPC : biphényles polychlorés CDK : kinase cycline-dépendante DBD : domaine de liaison à l’ADN DHEA : déhydroépiandrostérone DHEA-S : sulfate de déhydroépiandrostérone DHT : dihydrotestostérone DRE : éléments de réponse du récepteur des dioxines E1 : estrone E2 : 17β-estradiol EAP : éthoxylates d’alkylphénol ENP : éthoxylates de nonylphénol EOP : éthoxylates d’octylphénol EPA : Environmental Protection Agency ER : récepteur des estrogènes ERE : éléments de réponse des estrogènes HAP : hydrocarbures aromatiques polycycliques HCH : hexachlorocyclohexane IMC : indice de masse corporelle LBD : domaine de liaison du ligand NLS : séquence de localisation nucléaire NP : nonylphénol OCs : organochlorés OMS : Organisation mondiale de la santé PBDE : diphényléthers polybromés PCDD : dibenzo-p-dioxines polychlorées PCDF : dibenzofurannes polychlorés POP : polluants organiques persistants p,p’-DDD : 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophényl)éthane p,p’-DDE : 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophényl)éthylène p,p’-DDT : 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophényl)éthane PR : récepteur de la progestérone SHBG : globuline de liaison des hormones sexuelles SRC : coactivateur des récepteurs stéroïdiens T2 : octachlorocamphène T12 : nonachlorocamphène

xiii

TCDD 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine XRE : éléments de réponse aux xénobiotiques

Introduction

1. Cancer du sein chez la femme Chaque année chez les canadiennes environ 68 000 nouveaux cas de cancers divers sont

diagnostiqués dont 21 000 cas de cancer du sein [1]. Dans les pays industrialisés environ

une femme sur huit en sera atteinte au cours de sa vie. Le cancer du sein représente un défi

majeur pour la médecine moderne et les causes de cette maladie sont multifactorielles.

L’exposition aux polluants de l’environnement tout comme les influences liées à la

reproduction pourraient contribuer à l’incidence ou accroître la progression de la maladie.

Nous allons réviser les connaissances médicales sur les divers facteurs influençant la

carcinogenèse mammaire en se concentrant principalement sur les facteurs non-génétiques.

Selon les données scientifiques actuelles, les facteurs environnementaux semblent jouer un

rôle beaucoup plus important que les défauts génétiques.

1.1 Les prédispositions génétiques Les facteurs génétiques peuvent expliquer une faible proportion des cas de cancer du sein,

soit entre 5 et 10% [2,3]. Les deux gènes mutés responsables de l’augmentation des risques

de développer cette maladie sont BRCA1 et BRCA2. Ces gènes sont également impliqués

dans le cancer ovarien et d’autres types de cancers : BRCA1 dans les cancers de l’estomac,

du foie, des reins, des testicules et la leucémie; BRCA2 dans les cancers de la prostate et du

pancréas (revue de la littérature par Levy-Lahad et Friedman [4]).

Pour qu’il y ait cette augmentation des risques, les porteuses ont des mutations génétiques

sur un seul des deux allèles ce qui correspond à une mutation autosomale dominante et

puisqu’il y a transmission du défaut génétique au descendant, la mutation s’est produite

dans les cellules germinales. Une étude ontarienne a montré qu’à l’âge de 80 ans, 24% des

porteuses de mutations dans BRCA1 auront développé un cancer des ovaires et 90% un

cancer du sein. Pour celles qui ont des mutations dans BRCA2, 8,5% auront un cancer des

ovaires et 41% un cancer du sein [5].

Les statistiques concernant les risques associés à ces mutations sont le sujet d’une

controverse importante puisqu’elles influencent l’utilisation de traitements préventifs

2

draconiens comme l’hormonothérapie avec des anti-estrogènes et l’ablation des seins ou

des ovaires. Ces traitements sont donc appliqués chez les porteuses de mutations

génétiques sans qu’il y ait présence de maladie.

2. Facteurs de risques non génétiques Tel que mentionné précédemment, les causes génétiques n’expliquent qu’une faible

proportion des cancers du sein. Le cancer du sein ne peut être classé comme une maladie

génétique et les travaux de recherche l’ont associé à des facteurs hormonaux bien avant

l’apparition des connaissances en génétique. Les habitudes de vie constituent d’autres

facteurs de risques de la carcinogenèse mammaire.

2.1 Habitudes de vie Les habitudes de vie influencent l’incidence de plusieurs cancers dont le cancer du sein. Il

est important de connaître ces facteurs puisqu’ils sont modifiables par des comportements

que la majorité des femmes peuvent facilement adopter.

Une démonstration impressionnante de l’influence des habitudes de vie sur le cancer du

sein provient de la comparaison des risques de cancer du sein chez les femmes natives d’un

pays où ils sont faibles et qui émigrent vers un pays où ils sont élevés. Des études

épidémiologiques ont montré que leur risque augmente après leur arrivée et qu’après

quelques générations, il rejoint celui des femmes de la terre d’accueil [6,7]. Par exemple les

femmes asiatiques qui ont habité 10 ans ou plus en Amérique ont 80% plus de risque que

celles nouvellement arrivées [6]. Les causes de ces augmentations du risque ne sont pas

parfaitement élucidées et impliquent possiblement plusieurs facteurs. Les femmes

caucasiennes ont une incidence de cancer du sein 2,5 à 4 fois plus élevée comparativement

aux asiatiques (japonaises, chinoises ou philippines) [8]. Certaines hypothèses ont été

évoquées pour expliquer cette différence dont une plus faible expression du récepteur des

estrogènes chez les asiatiques [9] et une alimentation riche en phytoestrogènes [10], leur

aliment de base étant le soja. Ces deux éléments très importants dans l’étude des risques du

cancer du sein sont exposés plus bas. Les habitudes de vie qui ont été associées au risque

de cancer du sein sont l’activité physique, l’alimentation, la consommation d’alcool et le

tabagisme.

3

2.1.1 Activité physique La plus simple des habitudes de vie à modifier consiste à faire de l’exercice. Même si une

femme a été inactive pendant la majeure partie sa vie, elle peut réduire considérablement

son risque de développer un cancer du sein en devenant active. De nombreuses études

rapportent une diminution des risques par la pratique d’activités physiques. Une revue

exhaustive très récente de Monninkhof et al. sur ce sujet [11] confirme cette association.

On y apprend que la protection est plus importante chez les femmes après la ménopause : il

y a 20 à 80% moins de risque chez les femmes actives versus celles inactives après la

ménopause et 15 à 20% moins de risque chez celles actives versus celles inactives avant la

ménopause. La diminution est proportionnelle à la fréquence et l’intensité des exercices.

Chez les femmes ménopausées cette protection par l’exercice physique est partiellement

causée par un plus faible indice de masse corporelle (IMC) et une répercussion sur le

métabolisme des estrogènes, soit une diminution du ratio 2-hydroxyestrone/16-

hydroxyestrone [12]. La 16-hydroxyestrone a un certain potentiel estrogénique

comparativement à la 2-hydroxyestrone qui a peu d’affinité pour le récepteur des

estrogènes (ER) [13]. L’influence de l’IMC sera détaillée dans la section suivante.

2.1.2 Alimentation Les aliments qui peuvent moduler les risques ne sont pas clairement identifiés mais les gras

sont suspectés les augmenter et les fruits et légumes les diminuer. Ces hypothèses ne sont

toujours pas validées par de vastes études épidémiologiques. Il y a les aliments contenant

des phytoestrogènes qui pourraient avoir des effets importants qui seront détaillés plus bas.

Ce qui a plutôt été confirmé c’est l’influence de l’obésité et de la balance énergétique.

L’obésité agit de façon différente avant et après la ménopause. Un IMC élevé diminue les

risques chez les jeunes femmes, probablement parce que leurs ovaires produisent moins

d’hormones et qu’elles ont moins de cycles menstruels que celles avec un IMC plus bas

[14]. Cela conduit à une moins grande exposition aux estrogènes et à une diminution des

risques (ce principe sera détaillé dans la section 2.2).

À l’inverse, après à la ménopause, un IMC élevé augmente les risques de 3 fois

comparativement à un faible IMC car les taux d’estrogènes circulant sont plus élevés chez

4

celles qui ont un IMC élevé [15]. Bien qu’après la ménopause les ovaires ne produisent

pratiquement aucune hormone, les tissus adipeux (dont ceux localisés dans les seins) sont

une source importante d’estrogènes grâce à la biotransformation des androgènes surrénaux

en 17β-estradiol (E2) qui s’y produit [16]. De plus, l’activité de l’aromatase P450 (CYP19)

responsable de cette production augmente avec l’âge [17] et l’ARNm de CYP19 est

surexprimé dans les tumeurs mammaires [18,19].

2.1.2.1 Phytoestrogènes Les phytoestrogènes sont des molécules organiques non stéroïdiennes provenant des

plantes et qui appartiennent à 3 groupes : les isoflavones, les lignanes et les coumestans.

Les similarités structurales avec les estrogènes (Figure 1) permettent aux phytoestrogènes

de se lier aux récepteurs des estrogènes, et d’exercer une activité estrogénique ou anti-

estrogénique selon leur classe. Cette bivalence est certainement partiellement responsable

des conclusions contradictoires quant à leur effet sur les risques de cancer du sein. Une

publication récente de Rice et Whitehead illustre bien la difficulté de cerner cette question

« Phytoestrogens and breast cancer--promoters or protectors? » [20].

Plusieurs études in vivo chez des souris ont été réalisées avec la génistéine, probablement

parce que le soja contient beaucoup de cet isoflavone et que les extraits de soja sont utilisés

comme solution de rechange aux thérapies de remplacement hormonale chez la femme

ménopausée. La consommation de produits du soja entraîne des niveaux circulant de

phytoestrogènes qui sont expérimentalement actifs [20].

5

Figure 1 : Comparaison des principaux phytoestrogènes avec l’estradiol. *Estrogène synthétique non stéroïdien. Adapté de Limer et Speirs [21].

Deux groupes de chercheurs qui ont réalisé des xénogreffes à partir de cellules tumorales

mammaires MCF-7 ou MDAMB231 ont rapporté que la génistéine ou des extraits de

protéines de soja augmentent la prolifération des tumeurs en fonction de la dose [22,23].

Un autre groupe n’a remarqué aucun effet sur les xénogreffes lorsque les phytoestrogènes

étaient administrés seuls; ils induisaient plutôt des effets antiestrogéniques lorsque

combinés à une dose de E2 [24]. Shao et al. ont quant à eux rapporté que la croissance des

mêmes types de xénogreffes était inhibée par la génistéine et que ce phytoestrogène

stimulait l’entrée des cellules en apoptose [25].

Chez les humains, des résultats contradictoires ont aussi été rapportés. McMichael-Phillips

et al. affirment que la consommation de concentrés d’isoflavones peut augmenter de façon

significative la prolifération du tissu mammaire sain [26] tandis que Jakes et al. affirment

6

qu’ils peuvent au contraire réduire la densité mammaire [27]. Une forte densité mammaire

est un facteur reconnu pour augmenter grandement les risques de cancer du sein, soit de 4 à

6 fois comparativement à une densité mammaire faible [28,29].

En fait, le rôle des phytoestrogènes dans la carcinogenèse mammaire n’est pas clairement

défini et des modes d’actions autres que la liaison au récepteur des estrogènes ont été

identifiés, telle une réduction de la biodisponibilité des hormones sexuelles proposée par

Berrino et al. [30]. Ces derniers ont réalisé leur étude chez des femmes en bonne santé qui

avaient des concentrations circulantes d’androgènes élevées. Un régime contrôlé riche en

phytoestrogènes pendant 4,5 mois a permis d’augmenter les niveaux de SHBG (globuline

de liaison des hormones sexuelles) et par le fait même d’abaisser les concentrations

biodisponibles des stéroïdes sexuels endogènes, ce qui pourrait entraîner une diminution du

risque de cancer du sein. Les auteurs concluent que cette hypothèse devra être vérifiée dans

une étude subséquente. Il y a également l’inhibition spécifique de tyrosines kinases

dépendantes de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) par la génistéine qui peut

avoir des effets protecteurs [30]. D’autres isoflavones comme le quercétine possèdent la

capacité d’inhiber les tyrosines kinases dépendantes de l’AMPc [31].

2.1.3. Consommation d’alcool La consommation d’alcool augmente les risques de développer un cancer du sein et cette

association fait l’unanimité parmi la communauté scientifique. Selon une méta-analyse qui

a révisé 53 études épidémiologiques, le risque augmente de 32±13% et 46±15% pour une

consommation moyenne de 3 et 4 verres par jour respectivement et augmente de 7% pour

chaque consommation additionnelle [32]. Selon une étude américaine, les femmes

ménopausées atteintes d’un cancer du sein et consommant un verre par jour ont 30% plus

de risque de mourir de leur cancer comparativement à celles qui ne consomment pas

d’alcool [33].

Pour expliquer l’influence de l’alcool plusieurs hypothèses peuvent être soulevées. Afin de

comprendre les mécanismes impliqués, Dorgan et al. ont mesuré le taux des hormones

endogènes chez des femmes ménopausées qui ont suivi une diète strictement contrôlée

avec prise d’alcool ou de breuvages placebos pendant trois périodes de huit semaines [34].

7

Ils ont noté que l’alcool provoque une augmentation du niveau des hormones endogènes

circulant.

Une autre étude chez des femmes qui utilisaient un timbre transdermique pour augmenter

la concentration circulante de E2 a clairement établi que l’alcool réduisait la capacité

d’éliminer l’hormone après l’arrêt du traitement [35]. La demi-vie de E2 fut doublée par la

prise d’alcool.

Une activation accrue de ERα et une légère augmentation de son expression par l’alcool

peut également faire partie des mécanismes tel que le suggèrent des expériences réalisées

sur des lignées de cellules tumorales du sein [36]. Selon les auteurs, cette augmentation de

l’activation et de l’expression de ERα pourrait s’expliquer par une inactivation de BRCA1

induite par l’alcool, puisque BRCA1 inhibe l’expression de ERα [36].

2.1.4 Tabagisme Il est bien connu que le tabagisme est une importante source de substances cancérigènes.

Malgré ce fait, il n’est pas clairement associé à une augmentation des risques de cancer du

sein. Comme pour les phytoestrogènes, les interprétations sont difficiles et cette habitude

de vie a été associée soit à une diminution, soit à une augmentation ou encore s’est révélée

sans effet [37-39]. Une vaste enquête rétrospective très récente effectuée en Iran conclut

que fumer de façon active ou passive augmente les risques de cancer du sein [40]. Une

étude canadienne supporte cette association [41] tandis qu’une seconde étude canadienne

conclut à des différences selon la période de la vie pendant laquelle la femme a fumé [42].

Selon ces derniers auteurs, lorsque les femmes fument à un jeune âge, lorsqu’il y a un

nombre élevé cellules mammaires non différenciées et en prolifération, le tabagisme

augmente les risques de cancer tandis qu’après la ménopause, fumer peut avoir des effets

protecteurs.

La complexité de l’équilibre entre les activités hormonales pourrait expliquer les

différentes conclusions entre les études. Par exemple le tabagisme conduit à une diminution

des concentrations circulantes d’estrogènes et est une source de substances aux propriétés

anti-estrogéniques [43] ce qui expliquerait une diminution des risques.

8

Comme nous venons de le constater, beaucoup de facteurs de risque agissent en influençant

l’homéostasie des hormones sexuelles dans le sang. Dans la section suivante nous allons

définir le rôle important des hormones dans la carcinogenèse mammaire.

2.2 Facteurs hormonaux Les stéroïdes influencent la vie cellulaire en modulant l’expression de gènes spécifiques.

Ils interagissent avec un récepteur nucléaire et contrôlent son activité. Le gène cible doit

contenir des éléments de réponse dans la séquence de nucléotides qui le compose. Il s’agit

du signal cis formé de séquences palindromiques [44]. Par exemple les séquences

consensus ERE (éléments de réponse des estrogènes) permettent aux ERs de contrôler

plusieurs centaines de gènes. La croissance et la différenciation des organes sexuels sont

sous le contrôle des hormones sexuelles. La régulation inappropriée de ces processus

biologiques est un facteur de risque pour les cancers hormono-dépendants comme le cancer

du sein.

En effet, les études épidémiologiques ont clairement démontré une association positive

entre les facteurs hormonaux (tel que la concentration circulante des estrogènes) et le

risque de développer le cancer du sein (revue de littérature par Clemons et Goss [45]). En

fait, à la fin du XIXe siècle, on savait que l’ablation des ovaires (source majeure de la

synthèse des estrogènes avant la ménopause) provoquait une régression des tumeurs

mammaires (courte revue historique dans Love et Philips [46]). Cette chirurgie est utilisée

de nos jours pour réduire les risques de cancer du sein chez les femmes porteuses des

mutations BRCA1 et BRCA2 ainsi que comme thérapie adjuvante pour traiter les cancers du

sein [47,48]. Nous allons maintenant traiter de facteurs biologiques modifiables et non

modifiables qui influencent fortement les concentrations d’hormones endogènes.

2.2.1 Menstruations précoces et ménopause tardive L’apparition des premières règles à un âge précoce et de la ménopause à un âge tardif

augmentent les risques de cancer du sein [49]. Dans ces conditions, il y a généralement

plus de cycles menstruels qui se produisent au cours de la vie. La production d’estrogènes

atteint un pic au cours du cycle ovulatoire et plus le nombre de cycle est élevé, plus grande

est l’exposition des tissus mammaires à cette hormone durant la vie de la femme. Les

9

concentrations d’estrogènes mesurées sont plus élevées après les premières règles [50] et

des études suggèrent que lorsqu’elles arrivent tôt, cela favorise une plus grande exposition

aux estrogènes pendant toute la vie de la femme [51,52].

2.2.2 Reproduction, contraception et hormonothérapie Les facteurs liés à la reproduction représentent un important facteur de risque pouvant

expliquer jusqu’à 40% des cas de cancer du sein [53]. La naissance du premier enfant à un

âge tardif augmente le risque de cancer du sein [54]. Les femmes qui ont eu au moins un

enfant (grossesse à terme) ont 25% moins de risques de développer un cancer du sein que

celles qui n’ont pas eu d’enfants. Le risque pour ce cancer est 50% plus faible chez celles

qui ont donné naissance à cinq bébés ou plus comparativement aux femmes nullipares

[55,56].

L’allaitement semble offrir une protection significative contre le cancer du sein. Une

récente méta-analyse de plusieurs études épidémiologiques supporte l’hypothèse de la

réduction des risques par l’allaitement mais les auteurs soutiennent que l’effet est moins

important que plusieurs autres facteurs cités plus haut comme l’âge de la femme lors du

premier accouchement, le nombre d’enfants ou l’histoire familiale de cancer du sein [57].

La diminution du risque proviendrait du fait que l’allaitement favorise l’élimination

d’éléments cancérogènes de l’organisme maternel [58]. En plus il retarde la reprise de

l’ovulation postpartum [59] et induit la différenciation des cellules mammaires, ce qui

résulte en un effet protecteur additionnel [60]. En moyenne, la première ovulation revient

45 jours après un accouchement chez les femmes qui n’allaitent pas tandis que les

allaitements fréquents du nourrisson bloquent complètement l’ovulation. En contrepartie,

de nombreuses études épidémiologiques n’ont trouvé aucun effet protecteur engendré par

l’allaitement malgré son influence physiologique certaine (pour revue de littérature réf.

[57]).

La prise de contraceptifs oraux semble faiblement associée au risque de cancer du sein chez

les femmes avant la ménopause : il est augmenté d’environ 25% chez les femmes qui les

ont utilisés couramment comparativement à celles qui en n’ont jamais consommés [61].

10

L’utilisation de l’hormonothérapie chez les femmes survient majoritairement à un âge où

les risques de cancer du sein sont les plus élevés, c’est-à-dire après la ménopause. Cet

apport d’hormones exogènes, des estrogènes parfois prescrits en combinaison avec des

progestatifs, procure beaucoup d’avantages physiologiques dont un soulagement des

symptômes de la ménopause, une prévention de l’ostéoporose et une prévention des

problèmes cardio-vasculaires. Plusieurs études ont cependant observé une association

positive entre la prise d’hormones de remplacement et le cancer du sein [62,63].

Étant donné le rôle connu des estrogènes dans la prolifération des cellules mammaires et de

leur implication dans le cancer du sein (le rôle des estrogènes sera détaillé plus bas), la

prise d’hormones exogènes soulève d’importantes interrogations. Il faut bien mesurer les

bénéfices versus les risques d’une telle thérapie. Quelques auteurs suggèrent de vérifier

tous les risques inhérents pour chacune des patientes avant d’entreprendre

l’hormonothérapie [64,65] et de faire un suivi serré des femmes ayant des antécédents

familiaux de cancer du sein [66].

2.2.3 Hormones sexuelles endogènes Une concentration circulante élevée d’estradiol est associée à une augmentation du risque

de cancer du sein (voir revue de littérature réf. [67,68]). Les hormones sexuelles contrôlent

le développement et la fonction de la glande mammaire. Leur implication dans la

carcinogenèse mammaire chez la femme a été démontrée par les études épidémiologiques

et cette association positive fait consensus dans la communauté scientifique [69,70].

Cependant cette association a été clairement identifiée chez les femmes ménopausées

seulement. Selon plusieurs études épidémiologiques chez ces dernières, les concentrations

circulantes d’estradiol élevées peuvent augmenter jusqu’à 2 fois les risques

comparativement aux femmes qui ont des concentrations faibles [69,70].

En contrepartie, des taux élevés de SHBG réduisent les risques parce que cette protéine

plasmatique lie les hormones sexuelles et réduit leur diffusion passive du sang vers le

cytoplasme cellulaire; elle réduit la fraction biodisponible [71,72]. L’implication de la

SHBG dans le cancer du sein reste incertaine car les études sont peu nombreuses et

l’association n’est pas toujours statistiquement significative [73,74].

11

2.2.3.1 Les estrogènes Les estrogènes sont majoritairement d’origine ovarienne et surrénale chez la femme avant

la ménopause et chez ces dernières l’estrone (E1) est transformée en E2 par l’activité

enzymatique de la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase (la Figure 2 illustre la synthèse et

la biotransformation des estrogènes). L’estrone n’induit pas les gènes ER-dépendants; elle

est plutôt métabolisée par le CYP1A1 ou le CYP1B1 et produit des catécholestrogènes

génotoxiques. Plus de détails sur ces métabolites seront présentés dans la prochaine section.

Le cholestérol, la prégnénolone, la 17-hydroxyprégnénolone et l’androstènedione sont des

précurseurs incontournables dans la synthèse de E2 qui est le plus puissant des estrogènes.

Avant la ménopause les tissus périphériques produisent 75% des estrogènes et le reste est

produit par les ovaires et les glandes surrénales [75]. Après la ménopause les tissus

périphériques sont responsables de presque 100% de la synthèse des estrogènes car à cette

période de la vie des femmes, la production par les ovaires devient négligeable [75]. Chez

les femmes avant ou après la ménopause, la testostérone produite par les glandes surrénales

est biotransformée par le cytochrome CYP19 dans les muscles, les tissus adipeux et le foie

[76]. La testostérone est aromatisée en E2, ce qui contribue à l’augmentation des

concentrations d’estrogènes dans le tissu mammaire et à l’induction de la prolifération des

tumeurs hormono-dépendantes par les activités autocrine et paracrine [77]. L‘activité de la

17β-hydroxystéroïde déshydrogénase joue aussi un rôle important dans la formation de E2.

Vermeulen et al. ont rapporté des activités plus élevées de cette enzyme associées à une

plus grande production de E2 dans les tumeurs mammaires comparativement aux glandes

saines [78].

12

Figure 2 : Synthèse des estrogènes et réponse dans les tissus. Tiré de Clemons et Goss [45].

Les études portant sur l’implication des hormones endogènes chez les femmes avant leur

ménopause ont donné des résultats contradictoires et ces études sont compliquées par les

variations des niveaux des estrogènes au cours du cycle menstruel. Toutefois, une large

étude prospective très récente supporte une association positive entre les estrogènes et le

cancer du sein également avant la ménopause [79]. Étant donné que les études sur cet

aspect sont peu nombreuses et que le nombre de participantes à ces études est limité,

d’autres travaux seront nécessaires afin de confirmer cette association.

Les hormones jouent un rôle similaire aux facteurs de croissance sur la prolifération des

cellules mammaires [80]. Selon les études épidémiologiques, ce sont principalement les

fortes concentrations d’estrogènes qui favorisent l’apparition du cancer du sein [81-85].

13

La modulation de la signalisation hormonale par les estrogènes se retrouve donc au premier

plan dans la lutte contre le cancer du sein chez les femmes ménopausées. Les molécules

pharmaceutiques les plus efficaces pour traiter le cancer du sein sont les antiestrogènes

dont la plus populaire est le tamoxifène, qui est aussi utilisé comme moyen de prévention

chez les femmes à risque élevé [86-88]. Bref, il est évident que la voie de signalisation des

estrogènes joue un rôle prépondérant dans la carcinogenèse mammaire.

2.2.3.1.1 Métabolites génotoxiques des estrogènes En plus d’avoir des effets sur la signalisation contrôlée par le récepteur des estrogènes, la

biotransformation des estrogènes engendre des métabolites génotoxiques : les

catécholestrogènes. Le métabolisme des estrogènes se produit principalement dans le foie

[89]. Les métabolites de l’estrone et de l’estradiol sont le 2-hydroxycatéchol estrogène et le

4-hydroxycatéchol estrogène produits par les cytochromes P-450 1A1, 1A2, 3A et 1B1.

(pour une revue de littérature voir Liehr [90]). Les voies de biotransformation des

estrogènes sont illustrées en détail à la Figure 3. Les catécholestrogènes peuvent être

détoxifiés par leur conjugaison au glutathion qui est catalysée par la glutathion-S-

transférase, ce qui permet à l’organisme de les excréter. Toutefois, les catécholestrogènes

qui échappent à la conjugaison arrivent à endommager l’ADN génomique avant leur

élimination [91]. Ces dommages peuvent altérer l’expression de gènes contrôlant le cycle

cellulaire, d’oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs. Le traitement de rats par des

injections intra-mammaires de catécholestrogènes produit des adduits à l’ADN des cellules

du tissu mammaire et provoque la formation de tumeurs [92]. Ces adduits ne sont pas

stables et provoquent la dépurination de l’ADN, ce qui cause des mutations autant in vitro

que in vivo [91].

De plus, le 2-hydroxycatéchol estrogène et le 4-hydroxycatéchol estrogène ont des affinités

pour ER égales ou supérieures (100 et 150 % respectivement) à celle de E2, et ils sont

capables d’activer un gène rapporteur ERE-dépendant [91].

14

Figure 3 : Formation des métabolites des estrogènes et des adduits à l’ADN. Tiré de Cavalieri et al. [92]

2.2.3.2 Les androgènes

La testostérone est le plus puissant des androgènes et sa synthèse provient des glandes

surrénales (25%), des ovaires (25%) et des tissus périphériques (50%) [93]. Une partie de

cette hormone est transformée en dihydrotestostérone par l’enzyme 5α-réductase. La

testostérone est également transformée en estradiol, tel que mentionné à la section 2.2.3.1.

Puisque la voie de synthèse de la testostérone passe par la prégnénolone et la progestérone,

une partie des enzymes impliquées sont les mêmes que celles responsables de la synthèse

des estrogènes. La Figure 4 résume la voie de synthèse des androgènes à partir du

cholestérol. Notez que le DHT ne peut être transformé en estradiol [94] et c’est pour cette

raison que son utilisation est préférée à celle de la testostérone pour les essais

expérimentaux in vitro utilisant des androgènes. Les autres principaux androgènes par

15

ordre de puissance sont la déhydroépiandrostérone (DHEA) et le sulfate de

déhydroépiandrostérone (DHEA-S), lesquels sont produits par les glandes surrénales [95].

Figure 4 : Synthèse des androgènes. Tiré de [94].

Le DHEA-S est la plus importante source d’androgènes chez la femme car sa concentration

est 10 000 fois plus élevée dans le sérum que celle de la testostérone [96]. Grâce à cette

production de DHEA-S, les femmes ont plus des deux tiers de la concentration des

androgènes chez les hommes, mais elles subissent une baisse draconienne de 70% de la

concentration de DHEA et DHEA-S après la ménopause. Ceci résulte en une baisse des

16

androgènes et des estrogènes à la fois puisque ces molécules sont des précurseurs de la

testostérone et de l’estradiol [97].

Les études épidémiologiques ont conduit à des résultats contradictoires sur le rôle des

androgènes dans la carcinogenèse mammaire; des associations positives, nulles ou

négatives ont été rapportées [34,98-101]. Une récente revue de littérature produite par

Hankinson supporte l’implication des androgènes dans le cancer du sein chez les femmes

ménopausées [68]. Toutefois, selon Dimitrakakis et ses collègues, l’ajout de testostérone à

la thérapie hormonale de remplacement hormonal réduit les risques de cancer du sein chez

les femmes ménopausées [102]. Ils ont réalisé une étude rétrospective en suivant 508

femmes ménopausées pendant près de 6 ans. Ils ont rapporté que l’augmentation des

risques associée à l’hormonothérapie était éliminée lorsque la testostérone était incluse. Le

risque de cancer demeurait alors équivalent à celui des femmes qui ne prenaient pas de

traitement hormonal. Pour plusieurs chercheurs, les androgènes constituent un élément

protecteur contre le cancer du sein mais leur fonction comme précurseurs des estrogènes

(androstènedione et testostérone) rend difficile cette interprétation. En effet, plus la

concentration des androgènes est forte, plus il y a production de E2 ce qui favorise de façon

indirecte les risques de développer la maladie (voir revue de littérature réf. [103]).

La participation des androgènes dans la régulation de la prolifération des cellules

épithéliales du sein est reconnue mais les mécanismes moléculaires à la base de cette

régulation ne sont pas complètement élucidés (pour une revue de littérature voir Staub et

De Beer [104]). Nous allons donner plus de détails sur ces mécanismes dans la section

5.2.2.2.2. Le propionate de testostérone fut l’un des premiers androgènes utilisés contre le

cancer du sein en 1947 (revue de littérature par Labrie [96]). Les androgènes ne sont plus

utilisés comme traitement primaire pour traiter les cancers du sein depuis les années ‘60 à

cause de leurs effets masculinisant et ceci limite également leur utilisation comme adjuvant

(voir revue de littérature réf. [103]). Nous allons maintenant élaborer sur certains

contaminants environnementaux qui perturbent l’activité endocrinienne et qui représentent

des facteurs de risque potentiels de cancer du sein.

17

2.3 Facteurs environnementaux La société moderne d’après guerre a introduit des milliers de produits chimiques dans notre

environnement. Des composés ont été développés entre autres pour satisfaire les besoins de

l’industrie métallurgique, des textiles, alimentaire et agricole. Beaucoup de pesticides sont

dérivés du pétrole dont le DDT. Malheureusement, l’observation de la présence de résidus

de pesticides dans l’environnement et dans les organismes vivants s’est produite plusieurs

décennies après leur introduction. Grâce au raffinement des techniques de chimie

analytique nous connaissons désormais les niveaux de contamination chez l’humain pour

des centaines de produits chimiques et ces connaissances, combinées aux résultats des tests

de toxicité, ont donné cours à un meilleur contrôle de leur utilisation et parfois à leur

bannissement total. Par exemple, grâce à la très grande sensibilité des tests de détection mis

au point pour le DDT, on peut croire qu’il n’y a aucun organisme sur la terre qui ne

contient pas de DDT [105] et ce genre d’observation permet de prendre conscience de

l’ampleur des méfaits qui sont causés à l’environnement. Les radiations ionisantes peuvent

également influencer le développement de cancer et elles représentent un autre facteur

environnemental de risque.

2.3.1 Radiations ionisantes L’exposition aux radiations ionisantes reçue au cours d’une vie est généralement faible et

les mécanismes de défense du corps sont capables de réparer les lésions à l’ADN qu’elles

gênèrent. Les effets des rayonnements ionisants peuvent toutefois s’accumuler et

représentent un risque potentiel pour la santé, même à faible niveau. Une méta-analyse

combinant les résultats de huit études épidémiologiques a permis de conclure que

l'exposition aux radiations ionisantes augmente le risque de cancer du sein [106].

L’exposition du tissu mammaire aux radiations ionisantes, avant l’âge de 40 ans, est

susceptible de provoquer un cancer du sein dans les années ultérieures. L’effet des

radiations ionisantes chez ces femmes est associé à un risque de cancer du sein multiplié

par trois, pour une exposition évaluée à 1 Gy [50]. Le risque de cancer du sein semble

similaire pour une exposition unique ou pour des expositions multiples, pour une intensité

d’exposition totale égale [107].

18

2.3.2 Produits chimiques L’exposition aux polluants environnementaux pourrait constituer un important facteur de

risque du cancer du sein ou encore influencer la progression de la maladie [108]. Plusieurs

composés chimiques ont le pouvoir d’interférer avec la signalisation cellulaire contrôlée

par les hormones endocriniennes et ces composés sont appelés xénohormones. Plus de

80 000 produits chimiques sont homologués et une très petite quantité d’entre eux a été

testée pour leurs effets endocriniens [109]. Certains d’entre eux peuvent initier la

carcinogenèse et d’autres promouvoir la prolifération des cellules tumorales et l’agressivité

des tumeurs.

3. Les xénohormones ou perturbateurs endocriniens Les xénohormones sont des xénobiotiques qui peuvent imiter ou inhiber l’activité

d’hormones endogènes. On les retrouve dans l’environnement de tous les jours, à

l’intérieur comme à l’extérieur des bâtiments ainsi que dans la nourriture consommée, les

produits de consommation etc. Les voies d’exposition aux xénohormones sont diverses :

ingestion, inhalation ou par contact cutané.

L’implication des xénohormones dans divers désordres de la reproduction et du

développement d’espèces fauniques a été bien documentée [110]. Par exemple des

altérations dans le développement de l’appareil reproducteur chez les embryons de

goélands par le DDT et autres pesticides de la famille des organochlorés (OCs) [111], ainsi

que la féminisation de poissons mâles dans certaines rivières en Angleterre, due aux

alkylphénols provenant de la dégradation de détergents [112], ont été rapportées. Chez des

travailleurs exposés au DDT ou au chlordécone, deux pesticides organochlorés maintenant

bannis dans les pays industrialisés, des effets néfastes sur l’appareil reproducteur mâle ont

été notés [113,114]. La liste des pathologies potentiellement reliées à l’exposition aux

xénohormones inclut le cancer du sein, des ovaires, des testicules, de la prostate, une

diminution de la fonction reproductrice mâle, l’endométriose et divers problèmes de

fertilité chez la femme [115]. On cite en appui à cette hypothèse l’augmentation durant les

50 dernières années de l’incidence des cancers du sein et de la prostate, deux cancers

hormono-dépendants [116].

19

Typiquement, on a associé le terme « perturbateur endocrinien » aux substances qui

interagissent avec le récepteur des estrogènes ou des androgènes mais désormais nous

savons que différents modes d’action peuvent briser l’équilibre de la signalisation

hormonale [117] et l’interférence dans la synthèse des hormones endogènes en est un bon

exemple [118]. Les nombreuses voies métaboliques qui peuvent être perturbées et

engendrer un phénotype associé aux activités des xénohormones élargissent le nombre de

substances pouvant être cataloguées comme xénohormones. Les différentes voies

contrôlées par les récepteurs nucléaires d’intérêt qui peuvent être perturbées par les

xénohormones seront revues dans les sections 3 et 4.

L’exposition aux xénohormones est devenue une question de santé publique prioritaire à

l’échelle mondiale [119,120]. Les organismes gouvernementaux de plusieurs pays ont initié

des programmes de grande envergure visant l’identification des composés chimiques

pouvant moduler les voies de signalisation hormonale.

3.1 Différentes classes de xénohormones Outre les phytoestrogènes issues des plantes (section 2.1.2.1), les xénohormones

appartiennent à diverses familles de produits chimiques : les organochlorés, les dioxines,

les alkylphénols, etc. On les retrouve dans le pétrole, les formulations de pesticides et

d’herbicides, les solvants, les adhésifs, les cosmétiques, les plastiques, les détergents ou

dans les sous-produits de combustion et de divers procédés industriels.

L’ubiquité des xénohormones dans les produits de consommation et l’exposition fréquente

aux multiples produits chimiques impliquent que nous sommes constamment exposés à des

mélanges de xénohormones [121]. Lorsqu’elles sont sous forme de mélanges, les

xénohormones peuvent produire des effets amplifiés comparativement aux composantes du

mélange testées seules [122]. Quelques études ont été réalisées pour tester les effets

endocriniens de mélanges de xénohormones [123-128]. L’étude des effets endocriniens

produits par les mélanges est devenue une priorité car peu de connaissances existent à ce

sujet.

20

3.1.1 Les organochlorés Les OCs représentent une classe d’agents chimiques avec un fort potentiel de risque pour la

santé humaine. Leur persistance et leur caractère lipophile amènent des taux de

contamination élevés chez certaines espèces de la chaîne alimentaire aquatique comme les

poissons gras et les mammifères marins [129]. Ils se concentrent dans les tissus adipeux

des individus et certains d’entre eux perturbent l’activité endocrinienne. Les OCs

constituent un groupe important de polluants organiques persistants (POPs) qui possèdent

des demi-vies chez les humains allant de quelques mois à plusieurs décades [130]. Une

grande partie du présent travail porte sur les effets d’un mélange d’OCs. Les sous-sections

suivantes présentent les composantes du mélange d’OC utilisé dans la présente étude avec

leurs caractéristiques. Plusieurs de ces substances sont maintenant régies par la Convention

de Stockholm, un accord international impliquant plus d’une centaine de pays et qui vise à

bannir l’utilisation et les émissions de produits chimiques persistants, en commençant par

douze POPs: le chlordane, l’aldrine, le DDT, la dieldrine, l’aldrine, l’heptachlore, le mirex,

le toxaphène, les BPCs, l’hexachlorobenzène, les dioxines et les furanes. Quelques

structures chimiques de xénohormones sont illustrées à la Figure 5.

3.1.1.1 Biphényles polychlorés Bien qu’ils soient bannis dans tous les pays depuis quelques décennies, la présence des

BPCs dans l’environnement reste ubiquitaire [131]. Les BPCs ont été utilisés dans de

nombreux transformateurs et condensateurs électriques pendant 40 ans, peu après le début

de leur commercialisation à la fin des années ‘20 [132]. Plus d’un million de tonnes ont été

produites à travers le monde pendant cette période [131]. Il s’agit d’huiles très stables

possédant une excellente conductibilité pour la chaleur et des propriétés diélectriques

(isolants électriques). Les BPCs sont utiles comme lubrifiant haute température pour les

machines industrielles, dans les systèmes hydrauliques, comme additifs dans les peintures,

produits en caoutchouc, plastiques ainsi que dans plusieurs autres applications

commerciales [132]. Les BPCs se trouvent en faibles quantités dans les aliments [131] et

ceci fait en sorte qu’on en retrouve également dans les tissus humains chez toutes les

populations du globe [133].

21

Il existe plus de 200 congénères de BPC possibles selon le nombre de substitutions

d’atomes de chlore (voir la figure 5) et ils possèdent des propriétés variées [134]. Lors

d’une étude épidémiologique récente, on a rapporté des concentrations de BPC dans les

tissus adipeux d’hommes et de femmes variant entre 10 et 1640 ng/g avec une moyenne de

633 ng/g [133]. Les activités de surveillance effectuées par Santé Canada montrent une

diminution constante des niveaux de BPC au cours des 20 dernières années et ce, aussi bien

dans les tissus humains que dans les aliments [135]. Malgré cela, les connaissances sur

leurs effets nocifs ne cessent de s’accroître et les BPCs demeurent une menace pour la

santé. Ce sont les résultats de nombreuses observations expérimentales sur des modèles

cellulaires ou animaux ainsi que les études épidémiologiques qui ont amené le

bannissement de ces composés presque partout dans le monde [136,137].

Les BPCs sont classés en deux groupes, les « dioxin-like » et les « non-dioxin-like » [137].

Plusieurs congénères sont capables d’induire les activités de CYP1A et CYP2B, des

enzymes de la famille P450 qui métabolisent les xénobiotiques.

Les effets estrogéniques des BPCs peuvent se produire suite aux interactions directes par

une liaison agoniste avec le ER [138] et aussi par d’autres voies. Par exemple, une étude

réalisée récemment avec un mélange commercial de BPC (Aroclor 1254) a montré que les

BPCs ont des effets estrogéniques qui produisent une baisse de l’expression de la voie de

signalisation Wnt7a, laquelle joue un rôle crucial dans le développement du système

reproducteur et son bon fonctionnement dans la vie adulte [139]. Selon Ma et Sassoon, la

compréhension des mécanismes globaux des effets produits par les BPCs est illusoire étant

donné leurs multiples modes d’actions possibles [139].

Desaulniers et al. ont constitué un mélange de 19 congénères de BPCs, dont la composition

est basée sur les concentrations mesurées dans le lait de femmes canadiennes. Ces

chercheurs ont rapporté que l’exposition néonatale de rates à ce mélange augmente leur

sensibilité à l’induction de lésions bénignes et de tumeurs mammaires induite par un

carcinogène chimique, la méthylnitrosourée [126].

22

3.1.1.2 DDT et ses métabolites Le DDT fut le premier pesticide à être produit en quantité industrielle et il créa une

véritable révolution dans la production agricole. Il a été produit pour la première fois en

1874 et commercialisé à partir de 1945 [140]. Il est facile à synthétiser, peu coûteux et très

efficace contre plusieurs espèces d’insectes [141]. C’est dans les années ‘60 que son

utilisation a été maximale alors que 400 000 tonnes étaient utilisées dans le monde chaque

année [105].

Ce composé est aujourd’hui banni dans la plupart des pays industrialisés mais il est encore

utilisé à l’intérieur des bâtiments pour lutter contre les insectes vecteurs de la malaria, tel

que recommandé par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) [142]. Bien que le DDT

ait contribué à sauver des millions de vie en éliminant des insectes vecteurs de graves

maladies [143], de plus en plus d’efforts sont faits pour tenter de remplacer son utilisation à

cause des effets néfastes suspectés chez l’humain et de sa persistance dans l’environnement

[105]. Le p,p’-DDE [144] est le métabolite du DDT le plus bioamplifié dans la chaîne

alimentaire [145] et il se concentre dans les tissus gras des animaux, des poissons, et des

humains [146-148]. Le p,p’-DDE est fréquemment détecté dans le lait de vache, en

concentrations pouvant atteindre 0,2 µM et plus [149-152]. Les concentrations de p,p’-

DDE et de p,p’-DDT dans les tissus adipeux humains augmentent avec l’âge et les niveaux

mesurés dans la nourriture et chez l’humain ont baissé dans les pays occidentaux

comparativement aux années ’60, lorsque le DDT était fortement utilisé [153].

Le DDT et ses métabolites peuvent interférer dans l’expression de gènes par des

mécanismes non hormono-dépendants [154] mais ils sont reconnus avant tout comme des

perturbateurs endocriniens [132]. Le DDT non purifié et l‘o,p’-DDT sont les composés les

plus fortement estrogéniques de ce groupe de contaminants. Ils sont capables de supporter

la croissance des tumeurs mammaires chez le rat tandis que le p,p’-DDD ne le peut pas

[155,155]. Le p,p’-DDE est un composé antiandrogénique reconnu [156]. Le p,p’-DDT et

le p,p’-DDE sont des substances d’intérêt pour ce travail et plus de détails sur leur

implication possible dans le cancer du sein seront donnés dans la section 3.3.

23

3.1.1.3 Chlordane Le chlordane est un insecticide qui a été utilisé intensivement en Amérique du Nord entre

1950 et 1970 pour traiter les cultures, les gazons, les jardins et comme agent protecteur

pour le bois. La fabrication de chlordane engendre des produits secondaires qui sont

l’oxychlordane et les trans- et cis-nonachlor [157].

Le chlordane n’est plus homologué au Canada, au Mexique et aux États-Unis et il n’est

plus fabriqué en Amérique du Nord. L’Environmental Protection Agency (EPA) des États-

Unis a interdit son utilisation en 1988 [158]. On en retrouve encore dans les aliments, le

sol, l’air et les précipitations [159-162]. Les énantiomères sont bioamplifiés

différentiellement dans la chaîne alimentaire [163].

3.1.1.4 Toxaphène Le toxaphène est un insecticide qui contient un mélange de plus de 670 composés [157]. Sa

composition rend très difficile la comparaison des concentrations mesurées et complique le

design des expériences pour déterminer sa toxicité. Le toxaphène a été détecté dans

l’environnement et chez l’humain [157]. La production mondiale de toxaphène à atteint un

niveau semblable à celle des BPCs avec 1 million de tonnes au total. Ceci explique les

concentrations élevées de ce produit mesurées dans les poissons des Grands Lacs et dans

les mammifères marins [164].

Les recherches sur les effets toxiques ont permis de bannir le toxaphène en Amérique mais

il est encore utilisé en Inde [165] et les connaissances sur sa toxicité à long terme sont très

limitées [157]. Par exemple les molécules T2 et T12 (octachlorocamphène et

nonachlorocamphène respectivement) sont les dérivés du toxaphène qui sont le plus

fréquemment détectés dans les études épidémiologiques et aucune donnée concernant

l’effet de ces composés sur la santé n’existe [166].

Ramamoorthy et al. ont observé que le toxaphène possède des propriétés estrogéniques

qu’ils ont évaluées in vivo dans différents biosystèmes [167]. Chez l’humain, la majorité du

toxaphène est rapidement métabolisée et excrétée ( >90% en 24 à 36 heures); toutefois T1

et T2 demeurent plus longtemps dans les tissus adipeux parce qu’ils sont plus stables [168].

24

3.1.1.5 Lindane La synthèse lindane (γ-HCH) génère un mélange de différents congénères: le α-, β-, γ-, δ-

et ε-hexachlorocyclohexane (HCHs). Le HCH technique et le γ-HCH ont tous deux été

utilisés à l’échelle mondiale comme insecticides. Le γ-HCH a également été utilisé en

médecine humaine et vétérinaire. Ce pesticide est peu règlementé et il est un ingrédient

actif utilisé dans le shampoing contre les poux. L’activité insecticide peut être presque

exclusivement attribuée à l’isomère gamma [169].

Les isomères α-, β- et γ-HCH sont les plus étudiés et sont détectables dans l’environnement

[170]. Le β-HCH est un composé estrogénique qui, lorsqu’adminstré à des rates, perturbe

le cycle ovarien; de plus, ce composé interfère avec le développement de l’appareil

reproducteur chez les deux sexes [169,171]. Une étude récente effectuée à l’aide de cellules

tumorales mammaires rapporte des résultats qui suggèrent une implication du β-HCH dans

la carcinogenèse mammaire [172]. En effet, chez les cellules MCF10AT1, le β-HCH induit

une augmentation de l’expression de l’ARNm de MMP-13 (un marqueur des cancers

mammaires invasifs) en plus d’augmenter l’expression de proto-oncogènes (c-Neu, Cycline

D1, p27) [172].

3.1.1.6 Aldrine et dieldrine L’aldrine, la dieldrine, et l’endrine sont des cyclodiènes dont la synthèse s’effectue par un

processus chimique connu sous le nom de réaction de Diels-Aulne. Au moment où ils

étaient encore commercialisés à grande échelle, la production était environ 90% aldrine et

10% dieldrine [173]. Dans l’hémisphère sud ils sont encore employés dans la culture du

tabac, du coton et dans la production du citron. Plus de 50% de la dieldrine produite en

1964 était utilisée pour le contrôle des parasites en l’agriculture [173]. Plus d’une vingtaine

de pays interdisent toutes les utilisations de l’aldrine. Diverses utilisations sont permises

comme la lutte contre les termites et la mouche tsé-tsé.

Des niveaux élevés de dieldrine ont été mesurés dans le placenta, les tissus mammaires et

la moelle osseuse de femmes [174]. Il est un des plus persistants parmi les produits

chimiques connus [173]. Il possède des activités estrogéniques qui ont été notées lors

d’essais de prolifération effectués avec de cellules tumorales du sein hormono-dépendantes

25

[175]. Les bioessais recommandés pour détecter les activités endocriniennes seront

présentés à la section 5.

3.1.1.7 Hexachlorobenzène L’hexachlorobenzène est abondamment utilisé comme agent antifongique et sert d’élément

de base pour fabriquer des pesticides et des solvants à base de chlore [157]. Les

chlorobenzènes sont détectés dans le lait maternel [176] et dans l’environnement [177].

L’hexachlorobenzène cause des lésions au foie et à la peau et il affecte le développement

sexuel et le système immunitaire chez les animaux de laboratoire [157].

L’hexachlorobenzène tout comme le p,p’-DDE a déjà été associé au cancer du sein [178].

3.1.1.8 Mirex Le mirex a été employé principalement pour contrer les fourmis dans le sud-est des Etats-

Unis, pour combattre les chenilles en Amérique du Sud et les termites en Afrique du Sud.

Le mirex a également été employé industriellement comme ignifuge dans les plastiques, le

caoutchouc, la peinture, le papier et les composantes électriques [179]. Ce composé a été

mesuré dans les poissons des Grands Lacs et il est bioamplifié dans la chaîne alimentaire

[180].

La source primaire d’exposition au mirex chez l’homme est la nourriture mais l’exposition

quotidienne est généralement en deçà des doses quotidiennes tolérables fixées par les

autorités. Le mirex a été banni dans beaucoup de pays [179]. Peu d’études ont été produites

pour connaître ses effets à long terme ou ses effets à faibles doses mais il est considéré

comme un carcinogène potentiel [157]. On a déjà observé que le mirex peut causer de

l’interférence dans la synthèse stéroïdienne in vitro à l’aide de cellules provenant de

glandes surrénales de souris [181].

3.1.1.9 Dioxines et furannes

Les dioxines et les furannes, contrairement aux OCs cités plus haut, ne contiennent pas

dans leur rang des molécules qui sont synthétisées volontairement par l’homme. Il s’agit de

produits générés par les procédés industriels ou de combustion. Ce sont par exemple des

sous-produits de l’incinération, des procédés de sidérurgie et de métallurgie ou des

procédés de chauffage (au bois, mazout ou charbon) [182]. Le terme dioxine est

26

généralement utilisé pour désigner deux groupes de molécules [183]. Un premier groupe de

75 dibenzo-p-dioxines polychlorées (PCDD) et un second de 135 dibenzofurannes

polychlorés (PCDF) [184].

Ces molécules sont d’une très grande stabilité et lipophiles, ce qui occasionne une

bioaccumulation de ces toxines environnementales dans la chaîne alimentaire. Certaines

études rapportent que l’exposition actuelle à ces composés a diminué depuis une trentaine

d’années suite aux efforts de réduction des émissions [184]. Toutefois Charnley et Doull

prétendent que la concentration de ces contaminants dans les aliments n’a pas subi de

baisse dernièrement [185].

Le mécanisme principal de toxicité des dioxines se produit par l’activité agoniste sur le

récepteur des hydrocarbures aromatiques (AhR) et un des isomères, la 2,3,7,8-tétra

chlorodibenzo-p-dioxine, produit l’activation maximale du récepteur. En activant ce

dernier, les dioxines enclenchent une modulation de l’expression de gènes, principalement

la famille d’enzymes appelées cytochromes P450 dont le CYP1A1, le CYP1A2 et le

CYP1B1 [186]. La dioxine a des effets endocriniens sur le développement des glandes

mammaires via l’activation du AhR [187]. D’autres effets seront présentés dans la section

4, consacrée aux récepteurs nucléaires d’intérêt pour ce travail.

3.1.2 Autres polluants organiques persistants Les diphényléthers polybromés (PBDE) sont des POPs beaucoup moins étudiés mais très

utilisés comme produits ignifuges et leurs niveaux dans l’environnement augmentent

continuellement [188]. On les retrouve dans une grande variété de produits de

consommation: les composantes électriques et électroniques, les boîtiers d’appareils

ménagers et électroniques (séchoirs à cheveux, téléviseurs et ordinateurs), les matériaux de

rembourrage et dans les fils électriques [189]. Leurs concentrations dans les tissus humains

sont en hausse constante et ce sont donc des molécules très importantes qui doivent faire

l’objet de plus d’essais endocriniens. Les PBDE possèdent des activités antiandrogéniques

in vivo et in vitro qui ont été rapportées récemment [190].

27

3.1.3 Hydrocarbures aromatiques polycycliques Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) constituent une famille comprenant

plusieurs centaines de composés. Le plus connu est le benzo(a)pyrène (BaP). On retrouve

les HAP dans le sol, l’air, l’eau et dans les aliments. Tous les genres de combustion en

produisent (incinération, moteurs automobiles, tabagisme, cuisson d’aliments, etc.).

Contrairement aux POPs ils sont métabolisés et vite éliminés de l’organisme, sans

s’accumuler.

Les HAP sont toujours présents sous forme de mélanges et les recherches scientifiques se

sont concentrées sur 16 HAP dont certains sont classés cancérigènes et génotoxiques car ils

forment des adduits sur l’ADN génomique [138]. Tout comme pour les dioxines, le

principal mécanisme de toxicité implique l’activation de AhR par les HAP [139]. Peu

d’études rapportent des effets endocriniens associés aux HAP [132] mais, comme nous en

discuterons plus loin, le fait de moduler l’activité des gènes contrôlés par le AhR peut

produire des effets endocriniens.

3.1.4 Constituants des plastiques L’usage commercial des plastiques est de plus en plus répandu. On les utilise entre autres

comme contenants alimentaires, ce qui entraîne un transfert de substances du contenant

vers les aliments et ainsi une exposition humaine [191]. Les composantes des plastiques

possédant des activités endocriniennes les plus documentées sont le bisphénol-A (BPA) et

les phtalates. Le BPA est un des produits chimiques les plus largement fabriqués à travers

le monde : près de 3 millions de tonnes métriques ont été synthétisées en 2003 et cette

production augmente à chaque année [132]. On le retrouve comme additif dans le plastique

transparent (polycarbonate), les contenants de breuvages, le recouvrement de la paroi

interne des boîtes d’aliments en conserve, dans la résine d’époxy (colle tout usage) et dans

le scellant dentaire [192].

Le BPA est non-mutagène et il est transformé par le foie en glucuronide inactif qui est

rapidement excrété par la voie rénale [193]. Selon des essais utilisant un gène rapporteur, le

BPA engendre des effets estrogéniques et antiandrogéniques par sa liaison au récepteur des

estrogènes et au récepteur des androgènes. Sur les animaux de laboratoire il modifie l’âge à

28

la puberté chez les femelles et il a des effets utérotrophiques. Il produit des changements

dans le développement des organes reproducteurs et induit une baisse de la production de

sperme chez le mâle. Il induit également la prolifération des cellules tumorales du sein

MCF-7 (revue de littérature réf. [192]).

Les phtalates sont d’importants constituants des plastiques et ils possèdent des activités

associées aux perturbateurs endocriniens. Ils sont très répandus dans l’environnement et

l’exposition à ces agents est quotidienne [194]. On les utilise dans la fabrication des jouets,

de la peinture, des polyvinyles, des encres, lubrifiants, cosmétiques, emballages d’aliments,

etc. [195].

Tout comme pour le BPA, les phtalates interfèrent avec les voies des androgènes et des

estrogènes. La perturbation des activités androgéniques a été montrée par le développement

sexuel anormal des rats exposés [196] et par les études épidémiologiques qui suggèrent que

les phtalates puissent causer une baisse de la fertilité chez les hommes (revue de littérature

réf. [197]). Lee et Koo ont utilisé le test de référence Hershberger pour mettre en évidence

les propriétés antiandrogéniques des phtalates [198].

Les phtalates possèdent aussi des propriétés estrogéniques qui ont entre autres été révélées

lors de tests chez des lignées cellulaires tumorales mammaires. Kim et al ont rapporté que

les phtalates étaient capables de renverser l’effet apoptotique du tamoxifène chez les

cellules MCF-7 [199]. Les effets estrogéniques des phtalates pourraient être responsable de

la croissance prématurée des seins observée chez de jeunes portoricaines dont le sérum

contenait des concentrations anormalement élevées de phtalates [200].

3.1.5 Les détergents et l’alkylphénol Les éthoxylates d’alkylphénol (EAP) et les éthoxylates d’octylphénol (EOP) sont des

composés fabriqués pour leurs propriétés de détergents et d’agents dispersants pour l’huile.

L’industrie métallurgique utilise grandement les EAP pour dégraisser le métal qui a été

lubrifié avec de l’huile pendant sa coupe. La production mondiale annuelle d’EAP se

chiffre à 650 000 tonnes et la demande augmente de 2% par année aux États–Unis [201].

Les éthoxylates de nonylphénol (ENP) et les EOP sont les principaux agents actifs dans les

détergents que l’on retrouve dans les supermarchés pour l’entretien domestique [132].

29

Après leur utilisation ils se retrouvent dans les systèmes d’épuration des eaux usées et leur

biodégradation engendre la formation de composés bioréfractaires dont le nonylphénol

(NP) qui est persistant et toxique [201]. Le NP et ses dérivés s’accumulent dans les espèces

aquatiques [202-204] et ils sont reconnus comme des composés faiblement estrogéniques

[205,206]. L’exposition humaine au NP peut se produire par absorption cutanée, ingestion

de nourriture et eau contaminée ou inhalation [207].

3.1.6 Autres sources de xénohormones Les médicaments excrétés par les humains et les stéroïdes excrétés par les animaux

d’élevage représentent d’autres sources de perturbateurs endocriniens retrouvés dans l’eau

de consommation [208,209]. Il y a également les cosmétiques [210] tel que les

antisudorifiques. En effet, le chlorure d’aluminium est un agoniste du récepteur des

estrogènes chez les cellules MCF-7 et dans des systèmes de gène rapporteur contrôlé par

les séquences ERE [211].

Figure 5 : Quelques exemples de xénohormones. Tiré du site Internet de la National Library of Medicine [183].

30

Les xénohormones peuvent également être regroupées selon leur activité hormonale. On

retrouve notamment les xénoestrogènes, les antiandrogènes et les composés similaires à la

dioxine. Les mécanismes d’actions possibles des xénohormones sont complexes et très

variés. Ces derniers font l’objet de la section suivante.

3.2 Mécanismes d’action des xénohormones Les xénohormones exercent leurs effets physiologiques par la perturbation des voies

endocriniennes et cette activité pourrait expliquer leur relation avec le cancer du sein. Les

xénohormones affectent les mécanismes de signalisation plutôt que les mécanismes

classiques de toxicité détectés par les tests de toxicologie conventionnels [212]. Par

exemple, une substance peut ne pas avoir d’effet aux doses tolérables selon les résultats des

tests sur des animaux de laboratoire et aux mêmes doses causer des perturbations

endocriniennes dommageables chez l’humain. La régulation hormonale peut être perturbée

par les xénohormones selon de multiples voies. Les xénohormones peuvent agir entre

autres comme agonistes ou antagonistes des récepteurs hormonaux, perturber les voies

métaboliques des hormones endogènes ou encore interférer dans leur transport.

3.2.1 Affinité pour les récepteurs nucléaires hormonaux La liaison et l’activation de récepteurs nucléaires par les xénohormones représente un

mécanisme pour expliquer partiellement l’implication de ces molécules dans la

perturbation endocrinienne.

Pour étudier ces interactions, des tests in vitro de liaison compétitive des xénohormones

aux récepteurs des estrogènes et des androgènes sont effectués depuis plusieurs années

[213]. L’expérience se réalise en milieu acellulaire avec une hormone endogène marquée

avec des radioéléments qui est déplacée du site de liaison du récepteur par la substance

étudiée. Cette technique est utilisée pour mesurer l’affinité de xénohormones putatives avec

les récepteurs stéroïdiens [214,215]. Les résultats de ces essais de liaison ne permettent pas

de déterminer si la molécule testée possède une activité agoniste ou antagoniste mais

complémentent les autres essais in vitro de prolifération et d’induction de gènes rapporteurs

[215].

31

3.2.2 Activités agonistes L’expression de gènes dépendants des estrogènes subit des modulations positives par les

xénoestrogènes lorsque ces derniers lient le ER dans des régions critiques pour son

activation [216]. Les xénoestrogènes agonistes possèdent la capacité de lier le ER dans la

même pochette (site de liaison des ligands formé par la conformation native de la protéine)

que les hormones naturelles.

La découverte de l’activité estrogénique de l’o,p’-DDT et de certains congénères de BPC

remonte à plus de 30 ans [217,218]. Depuis ce temps plusieurs autres agonistes ont été

identifiés, notamment en mesurant leur capacité à induire la prolifération de cellules

tumorales du sein hormono-dépendantes [219]. Parmi les plus connus on retrouve les

BPCs, les alkylphénols et plusieurs des pesticides utilisés dans ce travail et présentés à la

section 3.1 [220].

3.2.3 Activités antagonistes Lorsqu’une xénohormone lie le récepteur et n’induit pas l’activité normalement engendrée

par l’hormone endogène, elle possède une activité antagoniste ou agoniste partiel. Les

antiestrogènes servent à traiter les femmes atteintes du cancer du sein, tel que mentionné

dans la section 2, et constituent un sujet de recherche intense depuis plus de 30 ans [221].

Les xénohormones antagonistes ont donc un potentiel de protection contre le cancer du sein

puisqu’elles limitent l’action des estrogènes. Les agonistes partiels peuvent également

diminuer l’activité hormonale car en forte concentration ils occupent le site de liaison du

récepteur en déplaçant l’hormone endogène et ils activent ce récepteur avec moins

d’efficacité [222].

Les antagonistes du AR font l’objet d’intenses recherches et les plus connus sont le p,p’-

DDE [223], l’antifongique vinclozoline [224] et les BPCs [127,225].

3.2.4 Perturbation de la biotransformation et du transport des hormones endogènes L’interférence des xénohormones dans le métabolisme des hormones peut avoir des effets

qui s’additionnent à ceux engendrés par leur activité agoniste ou antagoniste. Par exemple

32

le DDT et le DDE, les BPCs, certains fongicides, le lindane et plusieurs herbicides

interfèrent dans la stéroïdogenèse (voir ref. [118] pour une revue de littérature).

Les phytoestrogènes ont été beaucoup plus investigués que les autres xénohormones quant

à leur interférence avec la stéroïdogenèse. Par exemple plus de 30 isoflavones ont un

pouvoir d’inhibition sur la 3β-HSD [226] et la génistéine peut réduire l’activité de la 17β-

HSD [227]. Ces propriétés permettent aux phytoestrogènes de réduire la synthèse

d’estradiol. Le p,p’-DDE peut significativement augmenter l’activité de l’aromatase

CYP19 [228] dans des gamétocytes humains et il a également été rapporté que de fortes

concentrations de p,p’-DDE inhibaient le CYP19 dans le foie, la prostate et le placenta

[229]. Le lindane peut lui aussi inhiber l’activité de l’aromatase alors que la vinclozoline

peut l’induire [230].

Figure 6 : Hormones sexuelles et enzymes de la stéroïdogenèse ciblés par les perturbateurs endocriniens. Tiré de Whitehead et Rice [118].

Par ailleurs, certains métabolites hydroxylés des BPCs et des HAP sont capables d’inhiber

l’estrogène sulfotransférase [231,232], une enzyme qui inactive les estrogènes et permet

leur excrétion. Ceci entraîne une augmentation de la concentration circulante des

estrogènes.

33

En fait, l’activité de presque toutes les enzymes impliquées dans la stéroïdogenèse peut être

modifiée par les xénohormones tel que rapporté par différentes études compilées par

Whitehead et Rice (Figure 6). Bien que ces enzymes se retrouvent dans les principaux

sites de la stéroïdogenèse (gonades et glandes surrénales) elles sont également présentes

dans plusieurs autres tissus dont les glandes mammaires. L’enzyme qui a reçu le plus

d’attention est l’aromatase (CYP19) car elle transforme les androgènes en estrogènes. La

biotransformation des estrogènes se produit principalement dans le foie. Un métabolite

important de l’estradiol est le 2-hydroxyestradiol, dont la formation est principalement

catalysée par le CYP1A2 et le CYP3A4 dans le foie, et par le CYP1A1 dans les tissus

périphériques. Le CYP1B1 est fortement exprimé dans les tissus mammaires, les ovaires, et

l’utérus [89]. Le CYP1A1, le CYP1B1, et le CYP3A4 ont la propriété d’oxyder les

catécholoestrogènes pour former des quinones qui réagissent avec l’ADN [233]. Il en

résulte la formation de sites apuriques, lesquels peuvent amener des mutations à l’origine

du cancer du sein.

Tel que nous l’avons décrit dans la section 2.2.3, il est possible que la SHBG module le

risque de cancer du sein parce qu’elle lie les hormones sexuelles, ce qui diminue leur

biodisponibilité. Les xénohormones comme le p,p’-DDT, le p,p’-DDE, le o,p’-DDT, la

dieldrine, l’atrazine et le pentachlorophénol se lient avec la SHBG, ce qui entraîne une

augmentation de la fraction biodisponible des hormones sexuelles capable de diffuser du

sérum vers le cytoplasme cellulaire [234,235]. Le nonylphénol et l’octylphénol, le

bisphénol A et des hydroxybiphényles sont aussi capables de lier la SHBG humaine [235].

Ce mécanisme peut en principe induire la prolifération des cellules hormono-dépendante. Il

en résulte une perturbation endocrinienne qui peut affecter l’homéostasie des tissus

sensibles aux hormones [234].

3.2.5 Autres mécanismes d’action des hormones Toutes les substances qui perturbent la régulation de la concentration des stéroïdes, des

récepteurs stéroïdiens ou des co-récepteurs qui leur sont associés et qui produisent une

modification de la signalisation hormonale sont classées perturbateurs endocriniens.

34

Ainsi Kang et Lee ont rapporté que les phtalates sont capables d’augmenter l’expression de

l’ARNm de ERα en diminuant le niveau de méthylation de son promoteur [236], ce qui

constitue un autre mode d’action possible des xénohormones. En effet, les tissus sont très

sensibles aux variations du niveau d’expression des récepteurs sexuels et une surexpression

de ERα augmente les risques de cancer du sein [237,238]. Les xénoestrogènes comme

l’endosulfane, le pirimicarbe, le prochloraz, le fenarimol, l’endosulfane et la dieldrine

peuvent débalancer le ratio ERα/ERβ en agissant sur le niveau d’ARNm et ceci rend

possible leur participation dans la carcinogenèse mammaire [239]. Le rôle de chacun des

récepteurs sera détaillé dans la section 4.

3.3 Les xénohormones et le cancer du sein La complexité de la carcinogenèse mammaire rend difficile l’interprétation des études

épidémiologiques sur l’implication des xénohormones dans le cancer du sein. Ce sujet

représente toujours une question d’actualité, compte tenu de la mise en évidence sur une

base régulière de nouveaux composés environnementaux pouvant potentiellement perturber

l’équilibre hormonal [240]. Pour l’étude de l’implication des OCs dans l’étiologie du

cancer du sein,, un problème important complique les données. Un cancer peut être

provoqué par une exposition à des xénohormones pendant le développement embryonnaire

tel que démontré par une exposition au bisphénol A ou à un mélange de biphényles

polychlorés (BPCs), p,p’-DDT et de p,p’-DDE sur des modèles animaux [126,241]. Ces

observations sont supportées chez l’humain entre autres par une étude réalisée chez des

femmes souffrant de pré-éclampsie qui produisent moins d’estrogènes intra-utérin (due à

cette maladie) et dont les filles ont moins de risques de cancer du sein [242]. L’exposition à

des xénohormones pendant le développement embryonnaire ou dans l’enfance peut

influencer le développement des glandes mammaires et les rendre plus susceptibles aux

stress environnementaux (revue de littérature réf. [243]). L’exemple le plus connu est celui

de l’utilisation du diéthylstilbestrol chez les femmes enceintes entre les années 1938 et

1971 pour prévenir l’arrêt spontané des grossesses. Suite à l’exposition in utero, les filles

nées de ces femmes ont été sujettes à un nombre anormalement élevé de cancers du vagin

et à une légère augmentation des risques du cancer du sein alors que les garçons ont été

sujets à des anormalités dans le développement du système reproducteur et à une

35

augmentation des risques du cancer de la prostate et des testicules (revue de littérature par

Schrager et Potter réf. [244]).

Les études épidémiologiques associent principalement les BPCs et le DDE au cancer du

sein. Dans la littérature on dénombre au moins 14 études qui concluent à une association

positive entre les BPCs et le cancer du sein, 8 pour le DDE et 2 pour le DDT. En

contrepartie un minimum de 34 études rapportent une association positive non

significative, nulle ou encore une association négative entre le cancer du sein et les BPCs

ou le DDE (voir revue de littérature réf. [245]).

Une étude épidémiologique réalisée à cette époque par Demers et al. a montré que les

femmes ménopausées ayant développé un cancer du sein et qui avaient les plus fortes

concentrations plasmiques d’organochlorés (principalement le p,p’-DDE) étaient atteintes

de cancers plus agressifs [246]. Le phénotype des ces cancers se caractérisait par des

tumeurs plus grosses et un envahissement plus important des ganglions sous-axillaires que

chez les femmes montrant des taux plus bas d’OC. Le p,p’-DDE est un antagoniste du

récepteur des androgènes (AR) [156] et puisque les androgènes ont un effet inhibiteur sur

la prolifération des cellules tumorales du sein, ceci nous a amené à postuler que les

antiandrogènes pourraient constituer une deuxième classe de xénohormones d’intérêt dans

l’étude des causes environnementales du cancer du sein, en plus des xénoestrogènes.

4. Récepteurs stéroïdiens sexuels et récepteur des dioxines Les récepteurs stéroïdiens et le AhR font partie de la grande famille des récepteurs

nucléaires , laquelle comprend environ 50 gènes. Les récepteurs ERα et AR sont

particulièrement intéressants dans l’étude des xénohormones en relation avec le cancer du

sein car ils ont des effets opposés sur la prolifération des cellules mammaires, tel que

mentionné dans la section 2.2.3. Ces deux récepteurs utilisent un coactivateur commun et

cela entraîne une communication entre les deux voies de signalisation, un « cross talk »

[247]. Le AhR interfère aussi avec la voie de signalisation des estrogènes [248] et contrôle

36

l’expression d’enzymes responsables de la biotransformation des estrogènes et de plusieurs

xénobiotiques [249].

4.1 Structure générale des récepteurs stéroïdiens Les stéroïdes participent au développement des vertébrés et à l’accomplissement de

plusieurs fonctions physiologiques. Les récepteurs des hormones stéroïdiennes sont

constitués de trois sections formant les principaux domaines (pour une revue plus complète

des informations présentées dans la section 4.1, voir Bain et al. [250]) : 1- une région N-

terminale variable qui induit la transactivation ; 2- une région centrale très conservée et

riche en cystéine qui forme les doigts de zinc, le domaine de liaison à l’ADN (DBD) ; 3-

une région C-terminale, le domaine de liaison du ligand (LBD). La Figure 7 représente la

structure générale des gènes des récepteurs hormonaux.

La région N-terminale contient un domaine AF-1 (fonction d’activation 1) peu conservé

(<15% d’homologie entre les membres de la famille des récepteurs nucléaires) qui possède

une activité de transactivation indépendante du ligand. Le AF-1 fonctionne en synergie

avec la région AF-2.

Le DBD est une région hautement conservée qui reconnait les éléments de réponse situés

dans la séquence du gène cible et donne la spécificité au récepteur. Cette région se situe au

centre du gène du récepteur et est connectée au LBD via ce que l’on appelle la région

charnière. Le DBD participe avec le LBD à la formation de dimères entre les récepteurs.

37

Figure 7 : Structure générale du gène d’un récepteur hormonal. AF-1/AF-2: fonctions de transactivation; DI: interfaces de dimérisation; DBD: domaine de liaison à l’ADN dépendant et indépendant du ligand; LBD: domaine de liaison du Iigand. Adapté de Wierman [251].

Ils s’associent par une homodimérisation ou une hétérodimérisation permissive ou non-

permissive, ce qui constitue un mode de régulation de l’activité de ces récepteurs.

Le LBD joue plusieurs rôles critiques dans le fonctionnement du récepteur et il contient

une séquence AF-2 moyennement conservée. Le LBD forme une pochette à l’intérieur de

laquelle se fait la liaison. Cette pochette est une région hautement hydrophobe formant un

creux bien intégré dans la protéine. Les forces électrostatiques permettant la liaison du

diéthylstilbestrol à ER sont représentées à la Figure 8. Le AF-2 sert entre autres à recruter

différents coactivateurs comme ceux de la famille SRC et à induire la transactivation. Les

coactivateurs interagissent à leur tour avec des molécules capables de remodeler la

chromatine, un évènement nécessaire à l’activité de transcription. Ils permettent de cibler

des tissus cellulaires spécifiques car l’activation du récepteur hormonal se produit

seulement à l’intérieur des tissus qui expriment les coactivateurs nécessaires.

38

Résidus hydrophobes

Figure 8 : Liaison du diéthylstilbestrol avec le récepteur des estrogènes. Dans la partie du haut le récepteur est représenté en vert, le ligand (diéthylstilbestrol) est dessiné en bleu à l’intérieur du ERα. Dans la partie du bas, les structures chimiques de quelques acides aminés du ER sont représentées ainsi que quelques unes des liaisons électrostatiques entre le diéthylstilbestrol et ER. Le ligand est pointé par une flèche rouge. Adapté de Oostenbrink et al. [252].

La liaison du ligand engendre la structure tridimensionnelle nécessaire à la reconnaissance

des éléments de réponse. Une des principales caractéristiques communes aux

xénohormones qui permet la liaison au LBD d’un récepteur est la présence d’un noyau

aromatique dans la structure de la molécule. Les ponts hydrogènes et les forces de van der

Waals qui lient le ligand au récepteur sont beaucoup plus nombreux que ceux présentés à la

39

Figure 8. Le schéma de la Figure 9 montre en détail les forces de liaison entre la

génistéine et ERβ. Le phytoestrogène est complètement inclus dans la pochette du

récepteur de la même manière que le serait le ligand naturel E2.

Figure 9 : Représentation des forces de liaison qui permettent à la génistéine de s’enfouir complètement dans la pochette du récepteur ERβ et de l’activer. Les acides aminés de ERβ en bleu forment des ponts hydrogènes (lignes pointillées et distances en noir) avec le ligand et les acides aminés en vert participent aux forces de van der Waals. La génistéine est représentée en noir au centre du dessin. Wat = molécule d’eau. Tiré de Pike et al. [253].

4.2 Fonction des récepteurs stéroïdiens En combinaison avec les récepteurs nucléaires, les stéroïdes participent au développement

des vertébrés et sont nécessaires pour l’accomplissement de plusieurs fonctions

physiologiques et au maintien de l’homéostasie des individus. Traditionnellement l’activité

des hormones sexuelles estrogènes, androgènes et progestérone a été associée aux organes

sexuels mais depuis une dizaine d’années les recherches ont montré que beaucoup d’autres

tissus répondent aussi à ces hormones (voir revue de littérature réf. [251]). Les os, les reins,

le système vasculaire et le système nerveux en sont des exemples.

40

4.2.1 Action hormonale classique Les stéroïdes sont des molécules lipophiles qui peuvent diffuser dans les cellules de façon

passive. Ils influencent la vie cellulaire en modulant l’expression de gènes spécifiques. Ils

interagissent avec un récepteur nucléaire lié par défaut à des chaperonnes (par exemple

Hsp90 et Hsp56). Les chaperonnes sont importantes pour configurer un repliement adéquat

de la structure ternaire du LBD et cela représente le premier évènement dans la

signalisation hormonale. La liaison du ligand au récepteur provoque le détachement des

chaperonnes (voir revue de littérature par Pratt et Toft [254]). Lorsqu’un ligand est lié, il

produit un changement de la configuration tridimensionnelle du récepteur qui permet la

liaison d’un coactivateur.

Les récepteurs AR et PR se retrouvent en équilibre au noyau et au cytoplasme car ils

contiennent une séquence de localisation nucléaire (NLS) active de façon constitutive et

située au DBD. Ils possèdent une seconde NLS située au LBD, laquelle est révélée par la

liaison du ligand et elle induit une translocation du complexe ligand-récepteur à partir du

cytoplasme vers le noyau. Cette étape entraîne une activité intense du récepteur qui

contrôle alors la transcription de gènes hormono-dépendants qui contiennent les éléments

de réponse spécifiques, formés d’une séquence consensus habituellement située en amont

du promoteur du gène cible. Cette séquence est formée de deux paires de six nucléotides

qui sont répartis de chaque côté d’un palindrome imparfait (répétition des séquences

complémentaires) et elles sont séparées par trois nucléotides variables. Contrairement au

AR et au PR, les récepteurs ERα et ERβ se trouvent au noyau avant leur liaison par le

ligand [255]. Les récepteurs ER et AR peuvent également s’insérer dans la membrane

cytoplasmique et induire de la signalisation non-génomique. Une séquence conservée de 9

acides aminés située dans le LBD et qui permet cette localisation a été identifiée

récemment [256].

4.2.2 Action non-génomique Au cours des dernières années, plusieurs travaux ont permis l’identification de récepteurs

des stéroïdes sexuels qui sont localisés dans la membrane cytoplasmique ou à proximité de

celle-ci. Au moment de leur découverte, il n’était pas clair si ces récepteurs étaient

identiques aux récepteurs classiques ou encore s’il s’agissait d’isoformes, mais ils sont

41

reconnus par les mêmes anticorps [257]. Les travaux récents de Pedram et ses collègues

confirment que chez les cellules MCF-7 le ERα membranaire est identique au ERα

nucléaire [258]. Il existe des preuves dans la littérature que l’action non-génomique des

stéroïdes et des xénohormones puisse être transmise aux seconds messagers via les

récepteurs aux hormones sexuelles membranaires et leurs isoformes [259].

Le ERα membranaire active des réponses cellulaires variées suite à sa liaison par les

ligands habituels. Par exemple, il a été montré que E2 peut mener à la formation d’AMPc, à

la phosphorylation de CREB, à la formation du IP3, au relargage du Ca2+ et à l’activation

de la voie des MAPs et des ERK kinases [259]. Toutes ces modulations anti-apoptotiques

se produisent sans intervention sur le génome, à l’aide de seconds messagers

cytoplasmiques. Ces actions non-génomiques provoquées par les stéroïdes sont inhibées

par un antagoniste du récepteur ER. Elles ne sont pas inhibées lorsque des inhibiteurs de

synthèse des protéines ou de la transcription sont présents. Ces effets épigénétiques sont

mesurables en terme secondes, ou tout au plus dans les premières dix minutes suivant

l’ajout des stéroïdes, ce qui est trop rapide pour que la synthèse de nouvelles protéines

s’accomplisse.

Les seconds messagers peuvent dans certains cas moduler l’expression de gènes hormono-

dépendants, ce qui rend le système encore plus complexe. L’état actuel des connaissances

ne permet pas de préciser si ces modes d’actions sont concertés mais il se pourrait que la

voie non-génomique contribue à augmenter la spécificité cellulaire de l’action des stéroïdes

[259]. Un schéma simplifié des voies de signalisation contrôlées par le récepteur des

estrogènes membranaire et cytoplasmique est présenté à la Figure 10. Les voies classiques

dépendent de l’interaction directe de l’estrogène avec son récepteur au noyau. Une fois

activé, le complexe estrogène-récepteur active la transcription en se liant directement à

l’ADN via les séquences de reconnaissance ou agit indirectement avec des facteurs de

transcription. Les voies non-classiques dépendent de la capacité de l’estrogène à se lier

avec un récepteur non-stéroïdien ou stéroïdien, situé dans la membrane cytoplasmique, ce

qui déclenche une cascade de protéines kinases. Ces dernières induisent alors la division

cellulaire [260,261].

42

4.3 Récepteurs des estrogènes Il existe deux sous-types du récepteur aux estrogènes: ERα et ERβ. Leurs fonctions

semblent s’opposer dans le contrôle de la prolifération des cellules épithéliales du sein

[262]. Tel que mentionné plus tôt, un des mécanismes pour freiner l’effet du complexe

estradiol-ERα pourrait être la formation d’hétérodimères ERα/ERβ qui possèdent une

Figure 10 : Voies de signalisation des estrogènes médiées par les récepteurs membranaires et nucléaires. Les voies classiques (I et II) dépendent de l’interaction directe de l’estrogène avec ER. Les voies non-classiques (III et IV) dépendent de liaisons avec un récepteur non-stéroïdien (III) ou ER (IV) membranaire. Tiré de Lorenzo [263].

43

activité différente de celle d’un homodimère ERα/ERα [264]. ERα se localise au même

endroit que ERβ dans le tissu mammaire mais ERβ est beaucoup plus répandu et il est

présent dans des régions où ERα n’est pas exprimé. Ces observations amènent Speirs et al.

à conclure que ERβ est la forme dominante dans le tissu mammaire [265].

Selon Thornton, l’évolution d’un récepteur des estrogènes ancestral a donné naissance aux

six récepteurs stéroïdiens [266] : AR, ERα, ERβ, PR et les récepteurs des glucocorticoïdes

et des minéralocorticoïdes. Chen et al. ont par ailleurs montré que des modifications

génétiques dirigées par PCR sur ERα engendrent une affinité et une spécificité du récepteur

muté pour les androgènes [267]. Le ER étant le plus ancien récepteur stéroïdien, il

participerait à de multiples voies de signalisation et intégrerait une multitude de signaux,

jouant en quelque sorte le rôle d’un carrefour de la signalisation stéroïdienne [268].

4.3.1 Récepteur des estrogènes alpha Le gène ESR1 qui code le ERα a été cloné en 1985 par Walter et al. [269] à partir des

cellules tumorales du sein MCF-7. L’implication du ERα dans la progression de la

carcinogenèse mammaire est reconnue [270-272].

Ce récepteur n’est pas exprimé ou il l’est à un faible niveau dans les tissus mammaires

sains et les tumeurs mammaires bénignes alors qu’il est fortement exprimé dans 60 à 70%

des cancers mammaires [273]. Au moins les deux tiers des tumeurs mammaires sont ER+

[274] et le niveau d’expression de l’ARNm corrèle fortement avec le niveau d’expression

de la protéine encodée [275]. Ceci suggère que l’expression du récepteur est

principalement contrôlée par la synthèse de son ARNm. Le récepteur ERα peut moduler

positivement ou négativement plus de 400 gènes dont plusieurs sont impliqués dans le

contrôle du cycle cellulaire [276,277].

Des analyses de polymorphisme de longueur des fragments de restriction ont montré que le

gène ESR1 demeure intact dans les lignées tumorales du sein [273]. L’expression accrue de

ERα dans les tumeurs mammaires ne découle pas d’un réarrangement ni d’une

amplification génomique de sa séquence. Piva et al. [278] et Falette et al. [279] ont montré

que le niveau d’expression de ER peut varier suite à une modification du niveau de

méthylation du gène dans la région du promoteur. Cependant, ils n’ont pas mesuré de

44

différences significatives de méthylation entre les tumeurs mammaires ER+ et les tumeurs

ER-.

4.3.2 Récepteur des estrogènes bêta Le gène ESR2 qui code le ERβ a été cloné en 1996, soit un peu plus de dix ans après ERα

[280]. Depuis sa découverte, plusieurs isoformes de ERβ ont été identifiées [281].

Les DBD de ERα et ERβ ont une forte homologie avec 96% de séquences identiques alors

que le LBD est identique à 58% [280]. La région N-terminale n’est pas conservée (17%

identique) et l’homologie globale entre ERα et ERβ est de 47% [282]. Ceci explique la

différence majeure quant aux gènes contrôlés par les deux types de récepteurs même s’ils

ont une affinité semblable pour E2. La découverte de ERβ augmente elle aussi la

complexité des interactions et rend plus difficile la compréhension des modes d’action des

estrogènes ou des xénoestrogènes.

L’activité spécifique des ER dans certains tissus peut être causée par l’expression ou

l’absence des coactivateurs/corépresseurs et par le ratio d’expression entre les deux types

de ER. Le ratio ERα/ERβ est affecté durant la tumorogenèse mammaire [283] et

l’expression de ERβ est diminuée dans les cancers du sein les plus invasifs [284,285].

L’activité transcriptionnelle globale déclenchée par un xénoestrogène dépend d’autres

facteurs. Par exemple, bien qu’il ait une affinité équivalente pour les deux récepteurs [286],

E2 a moins d’efficacité pour induire la transcription de gènes dépendants de ERβ

comparativement à ERα [280] contrairement à certains xénoestrogènes. En effet, les

xénoestrogènes comme la génistéine, le diéthylstilbestrol, 4-tert-octylphénol, 2’,3’,4’,5’-

tétrachlorobiphényl-ol et le bisphénol A ont plus de facilité à activer ERβ par l’induction

d’un meilleur recrutement des coactivateurs [287]. L’efficacité varie également selon le

gène cible car les promoteurs sont variables [288]. Autre observation importante, la

génistéine possède au moins dix fois plus d’affinité pour ERβ que pour ERα [289].

L’activité transcriptionnelle déclenchée par un xénoestrogène va donc dépendre de son

affinité pour chacune des isoformes de ER et de la capacité du complexe ER-xénoestrogène

à adopter la conformation particulière lui permettant de se lier aux promoteurs spécifiques.

Ceci explique la diversité des réponses induites par les xénoestrogènes.

45

Le chlordécone et le méthoxychlore ont des activités agonistes sur ERα et antagonistes sur

ERβ [290]. Ceci peut théoriquement être très néfaste car l’activation de ERα augmente les

risques, tout comme l’antagonisme sur ERβ. D’ailleurs de plus en plus d’études confirment

que ERβ s’oppose à l’effet prolifératif de ERα. Deux équipes indépendantes ont observé

qu’en transfectant les lignées hormono-dépendantes MCF-7 et T47D avec le gène ERβ

fonctionnel, l’effet prolifératif de E2 est réduit de façon significative parce que ERβ

interfère dans le contrôle du cycle cellulaire exercé par ERα [291,292].

Saji et al. suggèrent que la recherche de nouveaux agents modulateurs des récepteurs des

estrogènes devrait tirer profit de ces données récentes et tenter de découvrir une molécule

de synthèse qui est à la fois agoniste de ERβ et antagoniste de ERα pour traiter le cancer du

sein [293].

4.4 Récepteurs de la progestérone Le récepteur de la progestérone humain (PR) codé par le gène PGR a été cloné à la fin des

années ‘80 à partir du criblage d’une banque d’ADNc provenant des cellules tumorales du

sein T47D [294]. Ce criblage s’est fait à l’aide d’une sonde créée pour détecter l’ADNc du

récepteur de la progestérone chez le lapin. Il était connu à cette époque que les cellules

T47D contenaient de façon constitutive une forte concentration du PR comparativement à

d’autres lignées [295]. Exceptionnellement, l’expression du PR n’est pas contrôlée par les

estrogènes dans cette lignée cellulaire [296].

La progestérone joue un rôle central dans la reproduction. Elle est liée à l’établissement et à

l’entretien de la grossesse et elle est impliquée dans la carcinogenèse mammaire (voir

revue de littérature réf. [297]). Le récepteur de la progestérone est médiateur des effets

produits par cette hormone. Il existe deux isoformes, PRα et PRβ (94 et 114 kDa

respectivement), qui sont identiques, à l’exception des 164 acides aminés additionnels

situés dans le domaine N-terminal de PRβ. La différence ne provient pas d’un épissage

différentiel de l’ARNm mais elle résulte plutôt de la présence d’un second site promoteur

de la transcription ERα-dépendant situé à l’intérieur du gène codant PRβ.

Bien que PRα et PRβ partagent plusieurs domaines structuraux identiques, ils ont des

activités distinctes sur le contrôle de transcription des gènes possédant les éléments de

46

réponses spécifiques (voir revue de littérature réf. [298]). Les deux isoformes ont

différentes propriétés : PRβ fonctionne comme activateur de la transcription dans la plupart

des contextes alors que PRα fonctionne comme un répresseur ligand-dépendant. Il a été

montré que les tumeurs mammaires qui surexpriment PRα sont plus agressives que celles

qui surexpriment PRβ [299] et qu’un débalancement dans le ratio d’expression des deux

récepteurs (normalement 1:1) est un évènement précoce de la carcinogenèse mammaire

[300]. Suite à leur revue de littérature sur le rôle des PRs, Jacobsen et al. ont conclu que ces

récepteurs sont plus que de simples marqueurs de l’activité de ERα, le ratio PRα/PRβ ayant

une importance majeure dans le phénotype des tumeurs mammaires [301].

La progestérone augmente l’expression de la cycline D1 et cette production s’additionne à

l’induction de cycline D1 produite par E2; cette action de la progestérone semble essentiel

pour le développement alvéolaire conduisant à la lactation [302]. L’activation de la cycline

D1 peut augmenter la susceptibilité au cancer du sein tel que rapporté par Yu et al. [303] et

dans la revue de littérature de Arnold et Papanikolaou [304]. Le rôle de la cycline D1 dans

la carcinogenèse mammaire fait l’objet de la section 5.2.2.2.1. D’autres observations

suggèrent une influence possible du PR dans la voie de signalisation contrôlée par ERα :

PRα se co-localise avec ERα, son expression est induite par E2 via un mécanisme ERα-

dépendant. Donc, en augmentant l’expression du PRα, E2 augmente la cycline D1 et les

risques de cancer du sein indirectement via ce récepteur. Contrairement à PRα, l’expression

de PRβ n’est pas modulée par E2 et son expression est induite par la progestérone [305].

Par ailleurs, il a été observé dans plusieurs études sur des modèles animaux qu’un

traitement du cancer du sein avec des antiestrogènes était plus efficace lorsque des

antiprogestines étaient ajoutés au traitement [306-308]. Les antiprogestines ont un pouvoir

de prévention lorsqu’ils sont administrés chez les porteuses de mutations BRCA1 [309].

Il apparaît évident qu’un débalancement de la voie de signalisation contrôlée par le PR peut

avoir des conséquences sur le cancer mammaire. Très peu d’études sur le potentiel des

xénohormones à interférer avec cette voie de signalisation ont été réalisées. Klotz et al. ont

toutefois montré que des insecticides de la famille des carbamates inhibent l’activité du E2

et de la progestérone [310]. D’autres études ont montré que plusieurs organochlorés sont

capables de lier le PR et de jouer le rôle d’antagonistes dont le p,p’-DDT, le p,p’-DDD, le

47

p,p’-DDE, les BPCs et le chlordane [311,312]. Scippo et al. ont aussi montré que le DDT

et ses métabolites ainsi que l’aldrine, le α- et β-endosulfane, le toxaphène et le trans-

nonachlore ont plus d’affinité pour PR que pour ERα et suggèrent que ces composés

puissent produire des perturbations endocrines via le PR [312].

4.5 Récepteurs des androgènes Le gène du récepteur des androgènes a été cloné en 1988 à partir de cellules T47D [313].

Son plus puissant agoniste connu est le DHT, suivi par un agoniste synthétique le R1881 et

par la testostérone. Il semble que la série de gènes pouvant être modulée par le AR soit

quatre fois moins grande que celle contrôlée par ERα car seulement une centaine de gènes

contenant les éléments de réponse aux androgènes (ARE) ont été identifiés [314].

L’activité du récepteur des androgènes a des effets protecteurs sur la carcinogenèse

mammaire et on lui impute un rôle très important dans le contrôle de la prolifération des

cellules mammaires suivant son activation par la testostérone [315]. Ce récepteur est

exprimé dans 60 à 80% des tumeurs mammaires primaires [316,317] et plus

particulièrement dans les tumeurs ER+ [318]. Le AR possède une demi-vie très courte

lorsqu’il n’est pas lié à son agoniste (environ 1 h) comparativement à sa demi-vie en

présence d’androgènes (6 h) [319]. Le niveau du AR dans les cellules subit une forte

régulation post-transcriptionnelle dépendante du protéasome [314].

Plusieurs preuves s’accumulent pour confirmer le rôle du AR dans l’homéostasie du tissu

mammaire, bien que la majorité des travaux cliniques et expérimentaux portent sur les

estrogènes et le ERα. Plus d’informations sur les effets opposés des voies des androgènes et

des estrogènes seront présentées dans la section 5.2.2.2.2.

Les androgènes ont été utilisés comme traitement primaire pour soigner le cancer du sein

mais les médecins ont cessé cette approche depuis les années ‘60 à cause des effets

masculinisant (par exemple : hirsutisme, acné, atrophie des seins). L’efficacité d’un

traitement aux androgènes comme le fluoxymestrone est comparable à celle obtenue avec

l’antiestrogène tamoxifène [320]. Plusieurs études concluent qu’un niveau élevé de AR

dans les tumeurs représente un élément favorable au pronostic du cancer du sein. Les

patientes qui souffrent de tumeurs exprimant fortement le AR bénéficient d’une plus

48

longue période sans récurrence de la maladie et survivent plus longtemps après une

récurrence du cancer [321-324].

4.5.1 Les antiandrogènes Les antiandrogènes sont une classe de xénohormones qui reçoit une attention croissante de

la part des chercheurs et des organismes gouvernementaux [229,325-328]. Plusieurs modes

d’action des antiandrogènes sont connus. L’antiandrogène diindolyméthane compétitionne

avec l’agoniste naturel et empêche la translocation du récepteur vers le noyau [329].

Certains antagonistes comme le p,p’-DDE et l’hydroxyflutamide provoquent la migration

du récepteur au noyau mais empêchent la liaison du récepteur stéroïdien à l’ADN

[319,330]. D’autres antagonistes comme le cyprotérone acétate sont des agonistes partiels

car ils induisent une faible activation de la transcription, ce qui les empêche d’éliminer

complètement l’activité du récepteur [331].

La Figure 11 représente l’action du DHT et de quelques antiandrogènes sur la localisation

du AR. Dans la figure 11a on observe la localisation cytoplasmique du AR non activé. La

figure 11b montre la translocation et la focalisation du complexe récepteur-agoniste dans le

noyau induite par le DHT alors qu’en présence de p,p’-DDE (4,4’-DDE) et de DHT, le AR

subi quand même une translocation du cytoplasme au noyau mais la focalisation ne se

produit pas (figure 11e). Tout comme le p,p’-DDE, la vinclozoline et la procymidone

bloquent la focalisation du AR au noyau (figure 11c et d) contrairement aux autres

antiandrogènes (figure 11f-h).

49

Figure 11 : Translocation et sous-localisation du récepteur des androgènes transfecté chez les cellules COS-1. a) sans agoniste; b) DHT seul; c) DHT + procymidone; d) DHT + vinclozoline; e) DHT + 4,4’-DDE; f) DHT + 2,4-DDE; g) DHT + 4,4-DDT ou h) DHT + chlozolinate. Tiré de Roy et al. [330].

4.6 Récepteur des hydrocarbures aromatiques Ce récepteur cloné en 1993 par Dolwick et al. [332] porte également le nom de récepteur

des dioxines car il possède une forte affinité pour ces molécules. Le AhR est un médiateur

des effets toxiques engendrés par plusieurs composés aromatiques halogénés planaires

[333]. Le plus puissant agoniste connu du AhR est la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine

(TCDD). Plusieurs extraits de plantes et d’aliments possèdent des activités agoniste ou

antagoniste sur le AhR (voir revue de littérature par Jeuken et al. [334]). L’existence de

ligands naturels endogènes du AR semble confirmée bien qu’aucune fonction ne leur soit

attribuée [335].

Le fonctionnement de l’AhR est semblable à celui de certains récepteurs stéroïdiens. Il se

localise dans le cytoplasme et une fois lié à un ligand, le complexe recrute une protéine de

translocation appelée translocateur nucléaire du récepteur des hydrocarbures aromatiques

(ARNT) et va se fixer aux éléments de réponse du récepteur des hydrocarbures

aromatiques (AhRE), aussi appelés éléments de réponse aux xénobiotiques (XRE) ou

encore éléments de réponse à la dioxine (DRE). Tout comme pour celles des récepteurs

50

stéroïdiens, ces séquences génomiques sont des « enhancers » qui accroissent la réponse

transcriptionnelle.

De nombreux gènes répondent au AhR, dont plusieurs sont impliqués dans la réponse au

stress oxydatif. Récemment on a découvert que des gènes sous le contrôle du AhR jouent

un rôle dans le contrôle du cycle cellulaire et de l’apoptose (voir revue de littérature réf.

[336]). Certains des gènes modulés par le AhR sont utiles dans la défense de l’organisme

contre les toxines des plantes et cette fonction très importante aurait dirigé l’évolution des

P450, une famille d’enzymes responsables de la biotransformation de nombreux

xénobiotiques [337]. La principale fonction des P450 est la détoxification par la formation

de métabolites pouvant plus facilement être excrétés, mais comme pour la

biotransformation des estrogènes présentée à la section 2.2.3.1.1, les métabolites sont

parfois plus toxiques que la substance mère (voir revue de littérature réf. [338]).

Une des principales préoccupations concernant le AhR et son implication dans la

carcinogenèse mammaire est sa communication avec le ERα, tel que mentionné au début

de la section 4. Par un mode d’activation non conventionnel, le AhR agit entre autres

comme un co-régulateur pour stimuler la transcription contrôlée par ERα en formant un

hétérodimère avec ce dernier [339]. Le PR pourrait diminuer cet effet en réduisant l’activité

du AhR [340].

Plusieurs études in vitro et in vivo ont d’ailleurs confirmé un lien entre l’activité de ERα et

AhR. Par exemple, en transfectant le gène fonctionnel ERα à des cellules tumorales du sein

ERα-négative qui ne répondent pas à une stimulation par la dioxine, Thomson et al. ont

montré que l’effet estrogénique de la TCDD était rétabli [341]. Des rates ovariectomisées

sont insensibles à la TCDD lorsqu’elle est administrée seule alors qu’en présence de E2

elles deviennent sensibles tandis que les mâles ne subissent pas d’effets dans les mêmes

conditions [342,343]. Il a récemment été avancé que des agonistes du AhR peuvent être

agonistes de ERα et conduire directement à son activation dans les cellules MCF-7 [344];

on parle alors de xénoestrogènes bivalents.

51

La communication entre les voies métaboliques contrôlées par ERα et AhR est très

complexe. Il est également possible que le ERα lie les DRE en présence de E2 et de TCDD

de façon séquentielle après avoir activé les gènes contenant les ERE (comme pS2 un gène

stimulé par les estrogènes) [345]. Le traitement par la TCDD seule induit le recrutement de

ERα aux DRE et cet effet est amplifié par la présence de E2. En fait, il est désormais certain

que les deux récepteurs ont des voies qui se croisent et l’implication du AhR dans la

carcinogenèse mammaire pourrait vraisemblablement être directement reliée au ERα et à

E2 [345].

5. Modèles pour l’étude des effets endocriniens des xénohormones Suite à l’intérêt soutenu depuis le début des années ‘90 pour l’étude des composés

chimiques pouvant perturber l’équilibre endocrinien, une rencontre réunissant des

représentants de différents milieux a été créée en 1996 : le « Endocrine Methods

Workshop ». Les instigateurs de ce groupe de travail étaient un représentant de l’industrie

chimique, Theo Colborn représentant la World Wildlife Fund et auteur d’une publication

ayant sonné l’alarme sur les effets néfastes des xénohormones dans le règne animal et chez

l’humain [110], ainsi que deux membres du personnel de l’Environmental Protection

Agency (EPA) des États-Unis. Leur première rencontre a donné naissance à un rapport

détaillé sur les méthodes d’évaluation à utiliser pour le dépistage des xénohormones

putatives [346]. Selon ce rapport les méthodes in vitro et in vivo ont chacune leurs

avantages.

5.1 Essais in vivo Les essais in vivo ont tout d’abord la particularité de tenir compte de la formation de

métabolites des contaminants dans l’organisme. Les méthodes pour les essais in vivo sont

bien définies et utilisées depuis plusieurs décennies. Elles permettent d’intégrer de

multiples mécanismes d’action et d’évaluer les effets sur le système endocrinien

globalement.

Les essais de référence « gold standard » pour évaluer les activités (anti-) estrogéniques ou

(anti-) androgéniques d’un composé sont réalisés avec des rats immatures; on les nomme

52

respectivement essais utérotrophiques et Hershberger [347]. Dans le premier cas, la masse

de l’utérus est mesurée après avoir administré les substances à tester à des femelles

ovariectomisées. La masse augmente en fonction du potentiel estrogénique de la substance.

Dans le test Hershberger, ce sont divers tissus génitaux et glandes accessoires qui sont

évalués chez un mâle castré. On évalue entre autres la prostate, les vésicules séminales, le

pénis et les glandes de Cowper dont la taille, la disposition ou la masse sont reliées aux

propriétés androgéniques. Ces essais sont sur le point d’être approuvés par l’Organization

for Economic Cooperation and Development (OECD). L’évaluation des méthodes est

réalisée par plusieurs laboratoires répartis dans différents pays. Par exemple l’essai

Hershberger a récemment été évalué en phase II par 16 laboratoires situés dans sept pays et

les études concluent que cet essai est reproductible et concordant entre les différents

laboratoires [348].

Toutefois les essais in vivo souffrent d’un manque de spécificité, les mécanismes

endocriniens débalancés par les xénohormones pouvant être différents de ceux ciblés par

l’expérience. Ce désavantage peut aussi être un avantage lorsqu’on désire évaluer un effet

global et plus large. Il est à noter que ces expériences sont coûteuses, longues et exigent le

sacrifice d’animaux. Pour ces raisons, les essais in vivo ne peuvent pas être utilisés pour le

criblage des milliers de produits chimiques qui doivent être évalués pour leur potentiel de

perturbateur endocrinien.

5.2 Essais in vitro Avec les essais in vitro la sensibilité est plus grande, la réponse spécifique, le coût plus

faible et la quantité nécessaire des substances à tester est moindre. On peut également

utiliser des robots pour automatiser certaines étapes et adapter les essais pour une large

production; jusqu’à des milliers d’analyses peuvent être produites chaque mois. Des

mélanges complexes extraits des matières environnementales ou biologiques peuvent être

analysés. Cependant, lorsqu’on ne possède pas toutes les données sur la formation de

métabolites dans l’organisme, les résultats des analyses in vitro devraient être appuyés par

des tests in vivo pour éviter les faux négatifs.

53

5.2.1 Systèmes de gène rapporteur Cette méthode d’évaluation des effets endocriniens est basée sur les séquences cis

retrouvées dans les gènes qui répondent spécifiquement à un récepteur nucléaire activé par

son agoniste. On utilise des cellules génétiquement modifiées qui ont reçu de façon

permanente ou transitoire un plasmide composé d’un gène rapporteur (généralement la

luciférase) couplé aux séquences consensus (ERE, ARE ou DRE). L’expression du gène

rapporteur dépend alors du récepteur activé par son ligand naturel ou une xénohormone.

Lorsque les cellules utilisées n’expriment pas le récepteur nécessaire pour activer le gène

rapporteur, on doit procéder à une double transfection en ajoutant un plasmide

supplémentaire contenant le récepteur d’intérêt. Ces systèmes utilisant un gène rapporteur

permettent de déterminer si le composé possède des effets agonistes ou antagonistes. Pour

ce faire on doit procéder en deux expérimentations distinctes, avec ou sans l’agoniste

naturel. Si un signal est détecté en présence du composé à évaluer sans l’agoniste naturel

on déduit qu’il s’agit d’un agoniste. On peut ensuite comparer sa puissance avec celle du

ligand naturel. Dans un deuxième temps on inclut le ligand naturel en plus du composé à

évaluer dans le même essai. Si une concentration croissante de ce composé réduit

l’expression du gène rapporteur, on conclut à une activité antagoniste. Ces tests ont une

excellente sensibilité et permettent de déterminer s’il s’agit d’un agoniste/antagoniste

partiel ou total. On peut utiliser ces essais dans le cadre d’études sur les xénohormones

impliquées dans le cancer du sein en utilisant des lignées de cellules tumorales du sein qui

expriment le récepteur d’intérêt, ou en l’introduisant par transfection. Dans le cadre du

cancer du sein, ce sont les composés avec des activités estrogéniques qui ont été les plus

étudiés, étant donné le rôle prédominant des estrogènes dans cette pathologie. Les cellules

MCF-7 transfectées avec une séquence ERE couplée à un gène rapporteur peuvent être

utilisées à cette fin [349].

5.2.2 Les modèles cellulaires in vitro Les lignées primaires provenant de cellules tumorales du sein sont très rares et

extrêmement difficiles à isoler (voir revue de littérature par Taylor-Papadimitriou et al.

[350]). Les difficultés techniques rencontrées lors de l’isolation de cellules tumorales

mammaires viables permettent de réussir une fois sur 136 essais (0.7%) selon Amadori et

al. [351]. Par conséquent seulement une centaine de lignées ont été établies et la plupart des

54

cellules tumorales du sein utilisées comme modèle proviennent d’effusions pleurales. Ces

lignées cellulaires ont tout de même conservé le phénotype des cellules mammaires. Les

lignées tumorales du sein permettent de mettre en évidence des effets endocriniens en

mesurant la prolifération cellulaire ou en examinant la modulation de gènes hormono-

dépendants.

5.2.2.1 Différentes lignées tumorales Les cellules tumorales du sein hormono-dépendantes ont été utilisées pour des essais

d’induction de la prolifération [171]. On a donné le nom de E-Screen (E pour estrogénique

et Screen pour criblage) aux essais de prolifération réalisés avec les cellules MCF-7 et la

validation formelle de ce système pour évaluer les propriétés estrogéniques des substances

chimiques remonte à 1995 [219]. Plusieurs xénoestrogènes ont été identifiés grâce au test

E-Screen. La lignée cellulaire MCF-7 a été isolée au début des années ‘70 [352] et

plusieurs clones ont été distribués jusqu’à ce jour. Certains paramètres rendent difficile la

comparaison des résultats obtenus dans différents laboratoires [353] mais les MCF-7

demeurent un excellent modèle pour détecter les substances aux propriétés estrogéniques.

Le test E-Screen possède la plus grande sensibilité parmi tous les tests d’estrogénicité

disponibles en plus d’être très spécifique [354]. Cette méthode offre la possibilité d’évaluer

des mélanges ce qui est extrêmement utile pour vérifier les interactions entre les différentes

xénohormones [355,356].

Puisqu’un agoniste engendre des modulations de l’expression de gènes spécifiquement

contrôlés par son récepteur, ces modulations peuvent être mesurées afin de préciser

l’activité d’une xénohormone. Par exemple l’expression de pS2 et du PR qui est contrôlée

par ER peut être évaluée pour complémenter les essais de prolifération réalisés avec des

substances estrogéniques [357,358]. Les essais de modulation d’expression de gènes

hormono-dépendants sont beaucoup moins sensibles que les essais de prolifération et n’ont

jamais été utilisés pour cribler des xénohormones putatives [354].

Il existe d’autres lignées tumorales du sein qui sont utilisées pour des essais in vitro dont

les T47D qui expriment les mêmes récepteurs stéroïdiens sexuels que les MCF-7 et la

lignée non hormono-dépendante MDAMB231 qui n’expriment pas les récepteurs ERα et

AR. En fait, ces trois lignées MCF-7, T47D et MDAMB231 ont été utilisées dans plus des

55

deux tiers de toutes les études réalisées avec des cellules tumorales du sein [359]. Les

cellules T47D sont aussi utilisées pour investiguer des mécanismes moléculaires impliqués

dans les voies estrogéniques et progestatives puisqu’elles expriment fortement les deux

récepteurs (ER et PR) [360-362] ainsi que pour tenter d’élucider les effets des dioxines sur

la carcinogenèse mammaire [363,364]. Autre exemple, pour prouver l’implication du

récepteur ERα dans certains effets endocriniens, des chercheurs introduisent le gène

complet et fonctionnel ERα dans les MDAMB231, tel que Thompson et al. l’ont fait pour

rétablir leur sensibilité à la TCDD et montrer que les deux voies (ERα et AhR)

communiquent entre elles [341].

Pour l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques contre le cancer du sein, certains groupes

utilisent plusieurs lignées tumorales, comme Eltsner et al. qui ont investigué le potentiel

apoptotique du troglitazone sur huit lignées au bagage génétique différent [365] dont les

ZR-75-1. Ces dernières sont relativement fréquemment utilisées par les chercheurs et ont

été utilisées récemment avec les T47D pour analyser l’effet des dioxines et des BPCs sur la

prolifération en relation avec les estrogènes et le AhR [366].

Une lignée qui a été peu utilisée dans le passé a servi de modèle principal dans le présent

travail : les cellules CAMA-1. Ces cellules ont été très utiles à Leung et al. afin de

caractériser l’action des estrogènes sur la prolifération, l’arrêt en G0/G1 des cellules

hormono-dépendantes privées de sérum et pour démontrer le recrutement des cellules

tumorales mammaires en phase S induit par E2 [367-372].

Les CAMA-1 ont également servi à étudier l’effet des dioxines sur l’expression de

CYP1A1 en compagnie des T47D, MCF-7 et ZR-75-1 et il a été montré que les CAMA-1

répondent très faiblement à la TCDD comparativement aux trois autres lignées [373]. La

principale caractéristique qui nous a amené à utiliser cette lignée dans notre étude est leur

forte réponse aux androgènes [374]. Il est très surprenant que ces cellules soient si peu

utilisées. Leur faible utilisation est probablement reliée au manque d’intérêt dans la

communauté médicale face au rôle des androgènes dans la carcinogenèse mammaire [375].

56

5.2.2.2 Mécanismes de contrôle de la prolifération chez les cellules mammaires L’étude des mécanismes régulant la prolifération des cellules mammaires aide à

comprendre le potentiel carcinogénique des xénohormones. En effet, une perte de contrôle

dans les mécanismes impliqués dans la prolifération cellulaire résulte en une perte de

l’homéostasie tissulaire. Ceci représente un point commun dans tous les types de cancers

(revue de littérature par Hanahan et Weinberg [376]). L’évaluation du niveau d’expression

de gènes qui contrôlent la prolifération cellulaire est le meilleur outil pour prédire

l’agressivité des tumeurs mammaires et plus particulièrement celles du phénotype ER+

[377]. Ceci supporte l’importance cruciale du cycle cellulaire dans la progression de la

carcinogenèse mammaire.

D’autres évènements comme un dérèglement dans le mécanisme apoptotique contribuent à

l’accumulation de lésions génétiques qui peuvent conduire à l’activation de proto-

oncogènes ou l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs [378]. Les cellules les plus

sensibles à la carcinogenèse mammaire sont celles formant les lobules les moins

différenciés à la terminaison des canaux galactophores (ou conduits lactifères). Ce sont les

lobules de type 1 qui contiennent une forte concentration de cellules ER+. C’est là que

s’amorcent les cancers canalaires, les plus fréquents types de cancers mammaires. La

stimulation de ces cellules ER+ par les estrogènes augmente leur division ce qui peut

contribuer à initier la carcinogenèse mammaire [378].

5.2.2.2.1 Rôle de la cycline D1 dans le tissu mammaire Le point de contrôle le plus critique dans la progression des cellules dans les différentes

phases du cycle cellulaire est le G1. C’est pendant cette phase que la cellule prendra la voie

de s’auto-renouveler, de se différencier ou de programmer sa mort (voir revue de littérature

réf. [379]). Une interprétation inadéquate par la cellule des signaux moléculaires qui

régulent ces éléments de transition et qui amènent la cellule à proliférer sans cesse, à ne pas

se différencier et ne pas mourir résulte en une cascade d’évènements qui peuvent entraîner

l’acquisition de mutations génétiques favorables à la carcinogenèse. Plusieurs oncogènes et

gènes suppresseurs des tumeurs peuvent être associés à une perte de contrôle dans la phase

G1 du cycle cellulaire.

57

Dans les cellules mammaires, la cycline D1 joue un rôle majeur dans la progression G1-S.

Une surexpression de cette protéine stimulée par les facteurs de croissance et les stéroïdes

est un évènement précoce de plusieurs cancers mammaires [380]. Il est naturel d’associer la

cycline D1 aux cancers mammaires puisqu’elle est stimulée par les estrogènes et que les

cellules de tumeurs mammaires sont majoritairement ER+ [274]. La cycline D1 est en fait

surexprimée dans plus de 50% des tumeurs mammaires [381,382]. Le mécanisme de

contrôle de la cycline D1 dans le tissu mammaire par le ERα diffère des autres tissus et il

semble maintenant partiellement élucidé. Très récemment Eeckhoute et al. ont montré à

l’aide des cellules MCF-7 que E2 agit sur la boucle d’inhibition de CCND1 en déplaçant la

protéine NFIC codée par un gène qui est probablement suppresseur de tumeur [383]. Ils ont

observé que les éléments cis de cette régulation se retrouvent en aval de la séquence codant

la cycline D1 et que ERα est recruté à cet endroit avec un autre facteur de transcription :

FoxA.

5.2.2.2.2 Équilibre entre les androgènes et les estrogènes Tel que mentionné aux sections 2.2.3.2 et 4.5 il est bien connu que les androgènes

contrôlent la prolifération des cellules mammaires. Il est alors possible que des substances

antiandrogéniques puissent avoir une influence sur l’homéostasie du tissus mammaire et

sur la progression des tumeurs ER+, mais les mécanismes moléculaires à la base de cette

régulation ne sont pas complètement élucidés (pour une revue de littérature voir réf. [104]).

Dès 1980 des chercheurs ont montré que l’augmentation de la concentration du PR induite

par E2 chez les cellules MCF-7 était complètement inhibée par la testostérone ou la

dihydrotestostérone (DHT) [384]. Les androgènes freinent également la prolifération

cellulaire induite par E2 dans différentes lignées cellulaires [385]. De plus, en clinique

lorsque des androgènes sont donnés en médication avec des antiestrogènes, le cancer du

sein progresse moins rapidement et davantage de patientes répondent positivement au

traitement [386,387]. Ceci montre bien l’importance de la voie de signalisation des

androgènes sur le contrôle de la prolifération des cellules épithéliales mammaires

cancéreuses.

Les androgènes inhibent la prolifération cellulaire dans le tissu mammaire entre autres en

diminuant l’expression de ERα [388,389]. Les androgènes peuvent également réguler

58

l’expression de protéines impliquées dans le cycle cellulaire. Pour la lignée CAMA-1, il a

été démontré que le traitement avec des androgènes augmente l’accumulation des cellules

en phase G1 et diminue la phosphorylation de pRb [374]. La DHT diminue également

l’activité de la cycline E en augmentant la quantité des protéines p27kip1, un inhibiteur de la

CDK (kinase cycline-dépendante) qui forme un complexe avec la cycline E et CDK2 [374].

D’autres mécanismes concernant la survie cellulaire ont aussi été identifiés chez les ZR-75-

1 tel une diminution par les androgènes de l’expression du protooncogène Bcl-2 au niveau

de l’ARNm et de la protéine [390]. De plus en plus d’évidences indiquent que les

androgènes jouent un rôle important en s’opposant à l’effet prolifératif de E2 sur les

cellules épithéliales mammaires, de façon analogue à la progestérone au niveau de

l’endomètre utérin [391]. Très récemment Birrell et al. ont avancé que la progestine

synthétique inclue dans les contraceptifs oraux bloquent la signalisation des androgènes et

augmentent ainsi les risques de cancers mammaires et que l’interférence inhibitrice sur la

signalisation androgénique par la progestine incluse dans la thérapie hormonale de

remplacement et dans les anovulants sont responsables de l’augmentation des risques de

cancer du sein associée à ces thérapies [392]. Ces observations appuient les nombreux

résultats in vitro et in vivo suggérant un rôle protecteur de la voie de signalisation des

androgènes sur la carcinogenèse mammaire [315,391,393-397].

Finalement, puisque plusieurs substances estrogéniques sont également antiandrogéniques

[398], l’exposition aux xénohormones peut engendrer un débalancement dans l’équilibre

entre les androgènes et les estrogènes endogènes pour le contrôle de la prolifération des

cellules mammaires. Cette perte d’équilibre peut résulter en une augmentation de la

prolifération cellulaire, une augmentation des risques d’accumuler des lésions génétiques et

une augmentation des risques d’induction de la carcinogenèse mammaire. Cette hypothèse

est centrale dans le présent travail.

6. Buts de l’étude Certaines études épidémiologiques ont mis en lumière une association entre les OCs et le

cancer du sein, notamment le p,p’-DDE. Nous avons voulu étudier la plausibilité

biologique à l’implication de ces contaminants environnementaux ubiquitaires dans la

carcinogenèse mammaire. Pour ce faire nous avons utilisé un mélange complexe

59

d’organochlorés dont la composition a été établie à partir de la teneur d’échantillons

biologiques humains, afin de tenir compte des interactions possibles entre les différents

composés auxquels la population est exposée chaque jour via l’environnement.

Pour vérifier nos hypothèses, des techniques immunologiques, de biologie cellulaire et

moléculaire ont été utilisées sur des modèles in vitro afin d’évaluer la capacité des OCs à

moduler les voies de signalisation hormonale et à induire la prolifération des cellules

tumorales du sein.

Nous avons tout d’abord évalué le potentiel endocrinien du mélange d’organochlorés. La

première partie du travail a été réalisée pour vérifier l’hypothèse qu’un mélange complexe

d’OC puisse perturber diverses voies de signalisation endocriniennes d’importance dans la

carcinogenèse mammaire. Pour ce faire, le potentiel endocrinien du mélange d’OC a été

évalué à l’aide de biotests. Ce sont des essais d’activation ou d’inhibition de l’expression

d’un gène rapporteur contrôlé soit par le promoteur spécifique de AR, de ERα ou par celui

des hydrocarbures aromatiques.

Puisque la perturbation des voies de signalisation endocrinienne peut engendrer un

dérèglement dans le contrôle de la prolifération des cellules tumorales mammaires, nous

avons testé dans un deuxième temps l’effet du mélange d’organochlorés sur la prolifération

de trois lignées cellulaires hormono-dépendantes (CAMA-1, MCF-7 et T47D) et deux non

hormono-dépendantes (MDAMB231 et CV-1). Ces essais ont permis d’observer des

différences majeures et intrigantes dans le potentiel du mélange sur la prolifération des

cellules. Nous avons observé des effets estrogéniques et antiandrogéniques selon la

composition hormonale du milieu de culture et le phénotype des cellules utilisées. Des

effets cytotoxiques médiés par AhR pourraient également se produire et amener une

diminution de la prolifération.

Enfin, dans la troisième partie de ce travail, nous avons voulu investiguer plus en détail la

capacité du p,p’-DDE, une composante majeure du mélange qui possède un potentiel

antiandrogénique reconnu, à induire la prolifération de cellules tumorales mammaires.

Nous avons testé l’effet prolifératif du p,p’-DDE sur des cellules CAMA-1 et une lignée

modifiée génétiquement, les MCF-7-AR1, en présence de concentrations physiologiques

60

d’estrogènes et d’androgènes. Finalement nous avons voulu mieux comprendre le

mécanisme responsable de cette activité du p,p’-DDE et pour ce faire nous avons entrepris

des études d’induction du cycle cellulaire et d’expression de gènes hormono-dépendants ou

de gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire chez les cellules CAMA-1.

Chapitre 1

Activités endocriniennes d’un mélange complexe

d'organochlorés dans différents systèmes de gène

rapporteur

62

Contribution Ce manuscrit a été soumis pour publication à la revue Environmental Health Perspectives.

Pour cette étude, j’ai participé avec M. Christian Larochelle à la réalisation et au design des

expériences pendant mon intégration au laboratoire. J’ai aussi rédigé le premier jet de

l’article, participé à la rédaction de sa forme finale et j’ai procédé aux analyses statistiques.

63

Characterisation of the Endocrine Disrupting Properties of a Complex

Organochlorine Mixture

Michel Aubé1, Christian Larochelle1, Pierre Ayotte1,2

1Unité de Recherche en Santé Publique, Centre de Recherche du Centre Hospitalier

Universitaire de Québec-CHUL; 2Laboratoire des biomarqueurs, Institut national de santé

publique du Québec, Québec, Québec G1V 5B3, Canada.

Corresponding author:

Pierre Ayotte, PhD

Unité de recherche en santé publique CHUQ-CHUL

945 avenue Wolfe

Québec, QC G1V 5B3, Canada

Phone: 418-650-5115

Fax: 418-654-2148

Pierre Ayotte: [email protected]

64

Résumé Pendant la dernière décennie, les produits chimiques qui interfèrent avec les voies de

signalisation contrôlées par des récepteurs hormonaux ont suscité une attention croissante

de la part de chercheurs s’intéressant aux problèmes de santé reliés à l’environnement.

Dans la plupart des études réalisées jusqu'à ce jour, seules les propriétés endocriniennes de

différents composés ou de mélanges simples ont été investiguées. Pourtant, l’imposante

quantité de produits chimiques retrouvée dans l'environnement fait en sorte que les

humains sont exposés à plusieurs composés simultanément. Nous avons constitué un

mélange d'organochlorés comprenant 15 substances différentes, dont la composition est

basée sur les teneurs de ces substances dans les tissus adipeux des populations humaines.

La capacité du mélange et de ses constituants à induire des effets (anti-) estrogéniques,

(anti-) androgéniques et similaires à la dioxine a été testée en utilisant des systèmes

cellulaires avec gène rapporteur. L'aldrine, la dieldrine, les dérivés du DDT, le β-

hexachlorocyclohexane et le toxaphène ont tous montré une activité estrogénique à des

concentrations micromolaires lorsqu’ils ont été testés individuellement. Le mélange a

induit un effet estrogénique auquel plusieurs xénoestrogènes faibles présents dans le

mélange ont probablement contribué. Les PCBs et les dérivés du DDT ont induit des

activités antiandrogéniques fortes avec des valeurs de IC50 submicromolaires. Le mélange

induit une inhibition de l'activité du récepteur des androgènes, laquelle pourrait en grande

partie être expliquée par son contenu en p,p’-DDE. Parmi tous les composés du mélange,

seuls les BPC ont montré une activité semblable à celle de la dioxine. Le mélange a induit

une réponse dans ce système qui peut être expliquée par sa teneur en BPC. Nous concluons

que le mélange complexe d'organochlorés peut perturber plusieurs voies de signalisation

hormonale, avec une puissance correspondant à celles de ses principaux constituants

hormono-actifs.

65

Abstract During the last decade, chemicals that interfere with signaling pathways controlled by

hormone receptors have received growing attention from environmental health researchers.

In most studies performed to date, the focus was placed on identifying the endocrine

properties of individual compounds or simple mixtures, in spite of the large quantity of

chemicals present in the environment and the fact that humans are exposed to several

compounds concomitantly. We tested an environmentally-relevant organochlorine mixture

composed of 15 different constituents for its capacity to interfere with estrogen receptor,

androgen receptor and aryl hydrocarbon receptor signaling pathways using reporter gene

cell bioassays. Aldrin, dieldrin, DDT compounds, β-hexachlorocyclohexane and

toxaphene all exhibited estrogenic activity when tested individually in micromolar

concentrations. The mixture induced a concentration-dependent estrogenic effect to which

several weak xenoestrogens in the mixture likely contributed. PCBs and DDT compounds

elicited strong antiandrogenic activities with submicromolar IC50 values. The mixture

induced a concentration-dependent inhibition of the androgen signaling pathway that could

largely be explained by its content in p,p’-DDE. Of all compounds in the mixture, only

PCBs exhibited some dioxin-like activity. The mixture induced a concentration-dependent

dioxin-like response that paralleled that induced by PCBs, except at the highest

concentration tested which elicited a lower response than that produced by PCBs alone. We

conclude that our environmentally-relevant complex organochlorine mixture can perturb

several hormone signaling pathways, with potencies that are in line with those of its main

hormonally-active constituents.

66

Introduction During the last decade, there has been growing interest from environmental health

researchers and public health organizations concerning hormonally-active compounds

(HACs) that are released into the environment. These compounds can alter hormone

signaling pathways through a variety of mechanisms, including binding to hormone

receptors and interference with hormone the synthesis, transport and biotransformation.

Exposure to HACs may be a risk factor for various hormone-dependent disorders including

breast and prostate cancers as well as abnormal development, reproductive damage and

immune system dysfunction (1-7).

Organochlorines (OCs) are a group of chemicals that comprises pesticides and their

metabolites [e.g. p,p’-dichlorodiphenyltrichlorethane (p,p’-DDT), p,p’-

dichlorodiphenyldichlorethylene (p,p’-DDE)], industrial compounds and by-products of

various industrial processes [e.g. hexachlorobenzene (HCB), polychlorinated biphenyls

(PCBs), polychlorodibenzo-p-dioxins (PCDDs) and polychlorodibenzofurans (PCDFs)].

Their lipophilic nature and great stability lead to their accumulation in fatty tissues of

living organisms including humans (8). Several authors have reported that concentrations

of persistent OCs increase in body fat with age in various populations throughout the world

(8-10). A complex mixture of OCs comprising many well known HACs is therefore present

in lipids and these compounds can access all tissues and organ in the body through passive

diffusion. For example, β-Hexachlorocyclohexane, DDT compounds as well as PCBs and

their metabolites display weak estrogenic activities (9-11). PCBs also exhibit anti-

estrogenic and anti-androgenic properties (12-14). p,p’-DDE, the main DDT metabolite, is

a potent antagonist of the androgen receptor (AR) (15) but is also a weak estrogen receptor

(ER) agonist (16). Mono- and non-ortho substituted PCB congeners bind the

arylhydrocarbon receptor (AhR) and exhibit dioxin–like activity (17). Additive interactions

have been reported between OCs in simple mixtures on breast cancer cell proliferation (18-

20). However, little is known on the endocrine disrupting properties of complex OC

mixtures similar in composition to those encountered in human populations in various parts

of the world.

67

We have constituted an OC mixture containing 15 different components and assessed its

capacity to perturb estrogen receptor, androgen receptor and aryl-hydrocarbon receptor

signaling pathways, using reporter gene cell bioassays. Here we report on the estrogenic,

antiandrogenic and dioxin-like activities of the mixture and the constituents most likely

responsible for these activities.

Material and methods Chemicals. 17β-estradiol (E2) was purchased from Sigma (St. Louis, MO) and

dihydrotestosterone (DHT) from Steraloids (Newport, RI). These hormones were dissolved

in ethanol at a concentration of 1.0 mM. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) was

purchased from AccuStandard (New Haven, CT) and dissolved in dimethylsulfoxide

(DMSO) at a concentration of 1 µM. The composition of the OC mixture and the suppliers

of chemicals can be found in Table 1. DMSO was also used as the vehicle for the OC

mixture. The final concentration of each vehicle in the cell culture medium was 0.1% (v/v).

Cell culture and transfection. MCF-7, CAMA-1, CV-1 cells were used for transient

reporter gene assays and were purchased from American Type Culture Collection

(Manassas, VA). Stably transfected with dioxin response elment, H4IIE-luc cells (21) were

kindly provided by Dr. A. Brouwer (Vrije University, Amsterdam, the Netherlands).

CAMA-1 and H4IIE-luc were maintained in phenol red-free RPMI medium supplemented

with 10% (v/v) fœtal bovine serum (FBS) from Wisent (St.-Bruno, QC, Canada), 1.0 mM

pyruvate, 2.0 mM L-glutamine, 0.1 µg/ml streptomycin and 0.1 U/ml penicillin in a

humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C. MCF-7 and CV-1 cells were maintained in

phenol red-free Dulbecco’s modification of Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with

10% (v/v) FBS, 1.0 mM pyruvate, 2.0 mM L-glutamine, 0.1 µg/ml streptomycin, 0.1 U/ml

penicillin and 1 µg/ml insulin and maintained in the same condition as described above.

AhR reporter gene expression. Either 80,000 H4IIE-luc cells were seeded in 24-well cell

culture plates (Sarstedt, Montreal, QC, Canada) and exposed during 24 hr in triplicate to

TCDD standard, DMSO alone, the OC mixture or individual compounds. Cells were then

washed with phosphate buffered saline (PBS), lysed in 100 µL lysis buffer (Passive Lysis

68

5× buffer; Promega, Madison, WI) for 30 min, and the lysate was frozen at 80°C. For

measurement of luciferase activity, samples were thawed and 40 µL lysate was pipetted

into a 96-well microtiter plate (Dynex Technologies Ltd., Worthing, UK). The plate was

placed in a Lmax luminometer (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) and the

following sequence of events was programmed for each well: a) injection of 100 µL

luciferin assay mix (Promega); b) 4-sec delay; c) light production measured over a 10-sec

period.

ER and AR reporter gene expression. The estrogenic activity of the compounds was

assessed using 50,000 MCF-7 breast cancer cells in each well, which were transiently

transfected with 667 ng of a reporter vector that contains two copies of the vitellogenin

consensus estrogen response elements fused to a 105-bp thymidine kinase promoter and the

luciferase gene ([(ERE)2-vit-TK-luc]; provided by Dr Van Luu-The, Université Laval,

Quebec, Canada). MCF-7 cells express a functional estrogen receptor (ERα). The

androgenic activity was assessed using 80,000 CV-1 cells in each well co-transfected with

33 ng of full length functional AR plasmid (pARQ20; provided by Dr Leonard Pinsky, Sir

Mortimer B. Davis-Jewish General Hospital, Montreal, Canada) and 667 ng of a reporter

plasmid, which comprises the androgen-responsive mouse mammary tumor virus promoter

in front of the luciferase gene (MMTV-luc; provided by Dr. Ronald M. Evans, The Salk

Institute, San Diego, CA) or using 75,000 CAMA-1 breast cancer cells which express a

functional androgen receptor that were transiently transfected with 667 ng of MMTV-luc.

In both androgenic and estrogenic transient transfection assays, 33 ng of a plasmid

containing the Renilla reporter gene (pRL-SV40; Promega) was co-transfected to control

for the efficacy of the transfection. MCF-7 and CAMA-1 cells were transfected using

Fugene 6® transfection reagent (Roche, Basel, Switzerland) while CV-1 cells were

transfected using Lipofectin® reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transfections were

performed as described by the manufacturers. Endogenous hormones, DMSO, the OC

mixture or individually-tested compounds were added and cells were further incubated for

a 24-h period. The luciferase activity was determined as described above. Each condition

was assessed in triplicate.

69

Statistical analysis. The median effective concentration (EC50) or the median inhibitory

concentration (IC50) were determined using the PRISM 5.0 software (GraphPad Software

Inc., San Diego, CA) and results were compared using Student’s t-tests. For dioxin-like and

estrogenic activities, differences between treatment means were tested using one-way

ANOVA followed by the Bonferroni post-hoc test. For the antiandrogenic activity, we used

the Wilcoxon rank-sum test to effect comparisons between treatments.

Results Screening individual compounds for estrogenic activity. We screened all individual

OCs listed in Table 1 for estrogenic and antiestrogenic activities prior to testing the

mixture. None of the chemicals exhibited antiestrogenic activity when tested at a

concentration of 10 µM in the presence of 1 nM E2 (data not shown). Figure 1 shows the

estrogenic activity for ten out of fifteen chemicals. Chlordane, chlorinated benzenes and

mirex did not exhibit estrogenic activity when tested at 10 µM in preliminary experiments.

α-HCH and γ-HCH elicited weak estrogenic activities, not statistically different from that

of the vehicle control. In contrast, the induction of ER-dependent luciferase expression by

10 µM β-HCH was nearly maximal (93 ± 13%; p < 0.001).

p,p’-DDT was the most potent of the three DDT-related compounds tested and at a 10-µM

concentration induced ER-dependent luciferase expression to 83 ± 5% of that elicited by 1

nM E2 (p < 0.001). When tested at a concentration of 1 µM, p,p’-DDT and it’s metabolites

did not induce luciferase expression above the level noted for the vehicle control. At 10

µM, p,p’-DDD and p,p’-DDE moderately increased gene expression to 67 ± 8 and 65 ± 8%

respectively (p < 0.001).

Three additional pesticides showed significant estrogenic activities. At 10 µM toxaphene

induced the highest ER-dependent gene activation all chemicals tested (136 ± 25% ; p <

0.001). At a 10-µM concentration, aldrin and dieldrin estrogenic activities were 56 ± 6% (p

< 0.01) and 91 ± 10% (p < 0.001) of that induced by the 1-nM E2 treatment, respectively.

PCBs only produced a weak estrogenic activity at 10 µM (37 ± 5%), which was not

statistically different from that of the control.

70

Screening individual compounds for androgenic activity. All chemicals were tested for

androgenic activity in transiently transfected CV-1 cells but none were active (data not

shown). However, several compounds were able to antagonize luciferase expression

induced by treatment with 1 nM DHT (Figure 2). At a concentration of 10 µM, PCBs, p,p’-

DDT, p,p’-DDE and p,p’-DDE almost completely abolished the androgenic response

induced by 1 nM DHT. PCBs and p,p’-DDT appeared slightly more potent than the other

compounds since these compounds significantly reduced the DHT-induced response to 68

± 8% (p < 0.01) and 58 ± 8% (p < 0.01), respectively, while the others were not effective

at that concentration. Aldrin and dieldrin were not full antagonist and seemed less potent

the rest of antiandrogenic OCs.

Estrogenic activity of the mixture. Figure 3 displays concentration-response curves for E2

the OC mixture and p,p’-DDT, which were tested for their estrogenic activity in transfected

MCF-7 cells. We diluted the OC mixture to obtain p,p’-DDT concentrations ranging from

0.05 to 5 µM, in order to compare the estrogenic activity of p,p’-DDT within the mixture to

that of p,p’-DDT alone. p,p’-DDT as part of the mixture exhibited a greater potency than

when tested alone. Dilutions of the OC mixture yielding p,p’-DDT concentrations of 0.5,

1.0 and 5.0 µM all induced statistically significant increases in the expression of the

estrogen-responsive reporter gene compared to that of the control treatment, whereas only

the highest concentration (5 µM) was effective when p,p’-DDT was added alone to the cell

culture medium. Statistically-significant differences in estrogenic responses between p,p’-

DDT added as part of the mixture and p,p’-DDT alone were observed at 0.5 µM (41 ± 2%

vs 13 ± 1%; p < 0.01), 1 µM (72 ± 4% vs 15 ± 2%; p < 0.001) and 5 µM (82 ± 4 vs 52 ± 2;

p < 0.05). Furthermore, the EC50 value for p,p’-DDT within the mixture was 0.6 ± 0.2 µM

(mean ± SEM), a value 8-fold lower (p < 0.01) than that of 4.8 ± 0.9 µM calculated for

p,p’-DDT alone.

Antiandrogenic activity of the mixture. Figure 4 presents concentration-response curves

for OHF, the OC mixture and p,p’-DDE, which were tested for their antiandrogenic activity

in transfected CAMA-1 cells treated with 1 nM DHT. We diluted the OC mixture to obtain

p,p’-DDE concentrations ranging from 0.01 to 10 µM, in order to compare the

71

antiandrogenic activity of p,p’-DDE within the mixture to that of p,p’-DDE alone. p,p’-

DDE alone or as part of the mixture exhibited a similar inhibition of DHT-induced reporter

gene expression at all concentrations tested. The IC50 value for p,p’-DDE within the

mixture was 1.1 ± 0.2 µM, which is not statistically different from that of 0.8 ± 0.2 µM

obtained with p,p’-DDE alone..

Dioxin-like activity of the mixture. In preliminary experiments, all chemicals were tested

for dioxin-like activity in H4IIE-luc cells in concentrations up to 10 µM in the cell culture

medium but only PCBs elicited a dioxin-like response in these cells. Figure 5 shows

concentration-response curves for PCBs and the potent AhR activator 2,3,7,8-

tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). The OC mixture was diluted to yield PCB

concentrations ranging from 0.0001 to 10 µM, in order to compare the dioxin-like activity

of PCBs within the mixture to that of PCBs alone. PCBs alone or as part of the mixture

displayed very similar dioxin-like activities at all concentrations tested, with the exception

of the highest concentration, at which PCBs as part of the mixture elicited a lower reporter

gene induction compared to that induced by PCBs (62 ± 2% vs 79 ± 2%; p < 0.001). The

EC50 value for PCBs within the mixture was slightly (24%) lower than that estimated for

PCBs alone (0.43 ± 0.01 µM vs 0.57 ± 0.04 µM; p < 0.05).

Discussion In this study we investigated the endocrine disrupting potential of an environmentally-

relevant OC mixture and its 15 components using reporter gene cell assays designed to

assess estrogenic, androgenic and dioxin-like activities. The mixture elicited concentration-

related estrogenic and dioxin-like responses whereas it antagonized the androgenic

response induced by DHT. We identified several compounds that are likely responsible for

the hormonal activities of this mixture, which was designed to approximate the

composition of mixtures present in general human populations exposed through the

environment.

72

Several constituents of the OC mixture elicited estrogenic activity in our reporter gene cell

assay when tested at the highest concentration used in our study (10 µM). However, none

of them were active at the 1-µM concentration. This narrow range of effective

concentrations precluded a comprehensive characterization of their efficacy and potency.

p,p’-DDT and its metabolites p,p’-DDE and p,p’-DDD all induced estrogenic responses,

which is in agreement with results previously reported by several research groups as early

as the late 60’s (22-25). β-HCH was the only hexachlorocyclohexane isomer exhibiting

estrogenic effects; the estrogenic properties of this compound have been described by

several researchers (26-28). Toxaphene induced the strongest estrogenic effect in our assay,

exceeding by 40% that induced by 1 nM E2. Two cyclodiene pesticides, dieldrin and aldrin,

were also capable of inducing luciferase expression in our estrogenic responsive cell assay.

Toxaphene and dieldrin have been shown to be estrogenic in the E-Screen assay (29).

Scippo et al. reported that aldrin displays some affinity for the estrogen receptor (30).

In vitro and in vivo studies revealed that PCBs or their hydroxylated metabolites exhibit

estrogenic or antiestrogenic effects depending on the chemical structure of the congener

(31-36). In our study, PCBs induced a weak estrogenic stimulation that did not reach

statistical significance. We speculate that the lack of response observed in our study could

be the result of the antiestrogenic activity of some congeners balancing out the estrogenic

activity of other congeners present in the PCBs mixture especially designed for our study.

p,p’-DDT as part of the OC mixture appeared more potent as a xenoestrogen than p,p’-

DDT tested alone at the same concentrations. This result may indicate that estrogenic

compounds other than p,p’-DDT are contributing to the estrogenic effects of the mixture.

p,p’-DDE and toxaphene are two other main constituents of the mixture that exhibited

estrogenic activities when tested alone. It is noteworthy that combining 0.5 µM p,p’-DDT

together with 1.5 µM, 0.4 µM toxaphene and other compounds at or below their individual

no-observed-effect concentrations (NOECs) resulted in a statistically significant mixture

effect (42% of 1 nM E2 response; see figure 3). Others have reported that combining weak

xenoestrogens at concentrations below their individual NOECs can result in significant

estrogenic effects in a reporter gene cell assay (37;38).

73

Several organochlorines displayed antiandrogenic activity when tested individually in our

reporter gene androgenic cell assay. In particular four compounds in the mixture, p,p’-

DDT, p,p’-DDE, p,p’-DDD and PCBs, completely abolished the androgenic response

induced by the potent androgen DHT (figure 2). p,p’-DDE was the first environmental

toxicant reported to interfere directly with AR activation (15). p,p’-DDT and p,p’-DDD

were also shown to exhibit antiandrogenic activity (15;39). Other researchers have

previously reported that commercial PCB mixtures and individual PCB congeners can

antagonize AR-mediated transcription (40).

p,p’-DDE as part of the OC mixture seemed equally potent as an androgen blocker as p,p’-

DDE tested alone at the same concentrations. Surprisingly, PCBs did not appear to

contribute to the antiandrogenic activity exhibited by the OC mixture in our cell assay,

even though PCB concentration exceeds that of p,p’-DDE in the mixture and the

antiandrogenic potency of PCBs is similar to that of p,p’-DDE. We further hypothesize that

competition between two or more antagonists in a reporter gene system occurs in a context

where nuclear receptors are saturated and bound strongly by the natural ligand DHT. One

compound can displace another one with similar affinity, resulting in equilibrium between

them and no additivity. In contrast, agonistic activity occurs in a context where the nuclear

receptors are not saturated by ligands and are for the most part free. Hence because there is

less competition between ligands for the receptor, an additive interaction may be more

readily observed between agonists than between antagonists.

Only PCBs were effective in inducing a dioxin-like response in H4IIE-luc cells. It is well

known that PCBs induce dioxin-like responses, particularly the non-ortho substituted PCBs

which adopt a planar conformation. These congeners possess a strong affinity for the AhR,

the ability to induce nuclear translocation and then activate its transcriptional activity

(reviewed in (17)). We therefore expected that PCBs alone or as part of the mixture would

produce similar dioxin-like responses in the reporter gene cell assay. the highest

concentration, at which PCBs as part of the mixture elicited a lower reporter gene induction

compared to that induced by PCBs. This was observed at all concentrations tested, except

at the highest concentration tested, where PCBs as part of the mixture exhibited a lower

74

dioxin-like response compared to that generated by PCBs alone. This would suggest that

other compounds in the mixture can antagonize the dioxin-like effects of PCBs. Hahn et

al. has shown the direct binding of hexachlorobenzene to the AhR and its activation in vitro

and in vivo (41). They concluded that hexachlorobenzene is a weak AhR agonist (10,000

less affinity for the AhR than TCDD). Its low affinity for the AhR and the fact that it is

only a minor constituent of the mixture militate against its involvement in blocking dioxin-

like effects induced by the OC mixture. Alternatively, the highest concentration of the

mixture might have elicited non specific toxicity in H4IIE-luc cells.

In summary, we observed that an environmentally-relevant complex OC mixture can

induce estrogenic, antiandrogenic and dioxin-like effects in reporter gene cells assays. In

view of the cross-talk occurring between these hormone signaling pathways, the endocrine

disrupting effects of such complex mixtures should be tested using more biologically-

complex endpoints, such as reproductive development and mammary carcinogenesis.

75

Figure legends Figure 1. Estrogenic potential of individual organochlorines. MCF-7 cells were transfected

with (ERE)2-vit-TK-luc and a plasmid containing the Renilla gene as a transfection

control. Cells were treated during 24 h with various concentrations of E2 or test chemicals.

Results are expressed relative to the luciferase expression induced by 1 nM E2 (100%).

Each bar represents the mean ± SEM of four independent experiments. Single, double and

triple asterisks indicate respectively p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.001 vs vehicle control by

ANOVA followed by a Bonferroni post hoc test.

Figure 2. Antiandrogenic potential of individual organochlorines. CV-1 cells were

transfected with three plasmids: 1) the full length functional AR (pARQ20); 2) MMTV-luc;

3) a plasmid encoding the Renilla gene as a transfection control. Cells were treated during

24 h with different concentrations of DHT and/or test chemicals. Results are expressed

relative to luciferase expression induced by 1 nM DHT (100%). Each bar represents the

mean ± SEM of five independent experiments. Double asterisks indicate p < 0.01 vs 1-nM

DHT treatment by Wilcoxon rank-sum test.

Figure 3. Estrogenic potential of the organochlorine mixture compared to those of E2 and

p,p'-DDT. MCF-7 cells were transfected with (ERE)2-vit-TK-luc and a plasmid containing

the Renilla gene as a transfection control. Cells were treated during 24 h with various

concentrations of the OC mixture, p,p’-DDT or E2. Results are expressed relative to the

luciferase expression induced by 1 nM E2 (100%). Each point represents the mean ± SEM

of four independent experiments. Single, double and triple asterisks indicate respectively p

< 0.05, p < 0.01 and p < 0.001 vs the corresponding p,p’-DDT concentration by Student’s

t-test.

76

Figure 4. Antiandrogenic potential of the organochlorine mixture compared to those of

hydroxyflutamide (OHF) and p,p'-DDE. CAMA-1 cells were transfected with the MMTV-

luc plasmid and a plasmid encoding the Renilla gene as a transfection control. Cells were

treated during 24 h with various concentrations of the OC mixture, p,p'-DDE or OHF in the

presence of 1 nM DHT. Results are expressed relative to the luciferase expression induced

by 1 nM DHT (100%). Each point represents the mean ± SEM of five independent

experiments.

Figure 5. Dioxin-like potential of the organochlorine mixture compared to those of TCDD

and PCBs. H4IIE-luc cells were treated during 24 h with various concentrations of the OC

mixture, PCBs or TCDD. Results are expressed relative to the luciferase expression

induced by 1 nM TCDD (100%). Each point represents the mean ± SEM of four

independent experiments. Single asterisk indicates p < 0.05 vs the corresponding p,p’-DDT

concentration by Student’s t-test.

77

Reference List 1. Colborn T, vom Saal FS, Soto AM 1993 Developmental effects of endocrine-

disrupting chemicals in wildlife and humans. Environ Health Perspect 101:378-384

2. Aronson KJ, Miller AB, Woolcott CG, Sterns EE, McCready DR, Lickley LA, Fish

EB, Hiraki GY, Holloway C, Ross T, Hanna WM, SenGupta SK, Weber JP 2000

Breast adipose tissue concentrations of polychlorinated biphenyls and other

organochlorines and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 9:55-63

3. Demers A, Ayotte P, Brisson J, Dodin S, Robert J, Dewailly E 2000 Risk and

aggressiveness of breast cancer in relation to plasma organochlorine concentrations.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 9:161-166

4. Woolcott CG, Aronson KJ, Hanna WM, SenGupta SK, McCready DR, Sterns EE,

Miller AB 2001 Organochlorines and breast cancer risk by receptor status, tumor size,

and grade (Canada). Cancer Causes Control 12:395-404

5. Weisglas-Kuperus N, Vreugdenhil HJ, Mulder PG 2004 Immunological effects of

environmental exposure to polychlorinated biphenyls and dioxins in Dutch school

children. Toxicol Lett 149:281-285

6. Hess-Wilson JK, Knudsen KE 2006 Endocrine disrupting compounds and prostate

cancer. Cancer Lett 241:1-12

7. Chalubinski M, Kowalski ML 2006 Endocrine disrupters--potential modulators of

the immune system and allergic response. Allergy 61:1326-1335

8. Kutz FW, Wood PH, Bottimore DP 1991 Organochlorine pesticides and

polychlorinated biphenyls in human adipose tissue. Rev Environ Contam Toxicol

120:1-82

78

9. Bigsby RM, Caperell-Grant A, Madhukar BV 1997 Xenobiotics released from fat

during fasting produce estrogenic effects in ovariectomized mice. Cancer Res 57:865-

869

10. Zava DT, Blen M, Duwe G 1997 Estrogenic activity of natural and synthetic

estrogens in human breast cancer cells in culture. Environ Health Perspect 105 Suppl

3:637-645

11. Shiraishi F, Okumura T, Nomachi M, Serizawa S, Nishikawa J, Edmonds JS,

Shiraishi H, Morita M 2003 Estrogenic and thyroid hormone activity of a series of

hydroxy-polychlorinated biphenyls. Chemosphere 52:33-42

12. Kramer VJ, Helferich WG, Bergman A, Klasson-Wehler E, Giesy JP 1997

Hydroxylated polychlorinated biphenyl metabolites are anti-estrogenic in a stably

transfected human breast adenocarcinoma (MCF7) cell line. Toxicol Appl Pharmacol

144:363-376

13. Schrader TJ, Cooke GM 2003 Effects of Aroclors and individual PCB congeners on

activation of the human androgen receptor in vitro. Reprod Toxicol 17:15-23

14. Rasmussen TH, Nielsen F, Andersen HR, Nielsen JB, Weihe P, Grandjean P 2003

Assessment of xenoestrogenic exposure by a biomarker approach: application of the E-

Screen bioassay to determine estrogenic response of serum extracts. Environ Health

2:12

15. Kelce WR, Stone CR, Laws SC, Gray LE, Kemppainen JA, Wilson EM 1995

Persistent DDT metabolite p,p'-DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature

375:581-585

16. Sohoni P, Sumpter JP 1998 Several environmental oestrogens are also anti-

androgens. J Endocrinol 158:327-339

17. Safe S 1990 Polychlorinated biphenyls (PCBs), dibenzo-p-dioxins (PCDDs),

dibenzofurans (PCDFs), and related compounds: environmental and mechanistic

79

considerations which support the development of toxic equivalency factors (TEFs). Crit

Rev Oncog 21:51-88

18. Payne J, Scholze M, Kortenkamp A 2001 Mixtures of four organochlorines

enhance human breast cancer cell proliferation. Environ Health Perspect 109:391-397

19. Hotchkiss AK, Parks-Saldutti LG, Ostby JS, Lambright C, Furr J, Vandenbergh

JG, Gray LE, Jr. 2004 A mixture of the "antiandrogens" linuron and butyl benzyl

phthalate alters sexual differentiation of the male rat in a cumulative fashion. Biol

Reprod 71:1852-1861

20. Birkhoj M, Nellemann C, Jarfelt K, Jacobsen H, Andersen HR, Dalgaard M,

Vinggaard AM 2004 The combined antiandrogenic effects of five commonly used

pesticides. Toxicol Appl Pharmacol 201:10-20

21. Murk AJ, Legler J, Denison MS, Giesy JP, van de GC, Brouwer A 1996 Chemical-

activated luciferase gene expression (CALUX): a novel in vitro bioassay for Ah

receptor active compounds in sediments and pore water. Fundam Appl Toxicol 33:149-

160

22. Welch RM, Levin W, Conney AH 1969 Estrogenic action of DDT and its analogs.

Toxicol Appl Pharmacol 14:358-367

23. Gellert RJ, Heinrichs WL, Swerdloff RS 1972 DDT homologues: estrogen-like

effects on the vagina, uterus and pituitary of the rat. Endocrinology 91:1095-1100

24. Klotz DM, Beckman BS, Hill SM, McLachlan JA, Walters MR, Arnold SF 1996

Identification of environmental chemicals with estrogenic activity using a combination

of in vitro assays. Environ Health Perspect 104:1084-1089

25. Chen CW, Hurd C, Vorojeikina DP, Arnold SF, Notides AC 1997 Transcriptional

activation of the human estrogen receptor by DDT isomers and metabolites in yeast and

MCF-7 cells. Biochem Pharmacol 53:1161-1172

80

26. Van Velsen FL, Danse LH, Van Leeuwen FX, Dormans JA, Van Logten MJ 1986

The subchronic oral toxicity of the beta-isomer of hexachlorocyclohexane in rats.

Fundam Appl Toxicol 6:697-712

27. Hatakeyama M, Zou E, Matsumura F 2002 Comparison of the characteristic of

estrogenic action patterns of beta-HCH and heregulin beta1 in MCF-7 human breast

cancer cells. J Biochem Mol Toxicol 16:209-219

28. Penza M, Bonetti E, Villa R, Ganzerla S, Bergonzi R, Biasiotto G, Caimi L,

Apostoli P, Ciana P, Maggi A, Di Lorenzo D 2004 Whole body action of xenoestrogens

with different chemical structures in estrogen reporter male mice. Toxicology 205:65-

73

29. Soto AM, Chung KL, Sonnenschein C 1994 The pesticides endosulfan, toxaphene,

and dieldrin have estrogenic effects on human estrogen-sensitive cells. Environ Health

Perspect 102:380-383

30. Scippo ML, Argiris C, Van De WC, Muller M, Willemsen P, Martial J, Maghuin-

Rogister G 2004 Recombinant human estrogen, androgen and progesterone receptors

for detection of potential endocrine disruptors. Anal Bioanal Chem 378:664-669

31. Jansen HT, Cooke PS, Porcelli J, Liu TC, Hansen LG 1993 Estrogenic and

antiestrogenic actions of PCBs in the female rat: in vitro and in vivo studies. Reprod

Toxicol 7:237-248

32. Safe SH 1994 Polychlorinated biphenyls (PCBs): environmental impact,

biochemical and toxic responses, and implications for risk assessment. Crit Rev Oncog

24:87-149

33. Soto AM, Sonnenschein C, Chung KL, Fernandez MF, Olea N, Serrano FO 1995

The E-SCREEN assay as a tool to identify estrogens: an update on estrogenic

environmental pollutants. Environ Health Perspect 103 Suppl 7:113-122

81

34. Connor K, Ramamoorthy K, Moore M, Mustain M, Chen I, Safe S, Zacharewski T,

Gillesby B, Joyeux A, Balaguer P 1997 Hydroxylated polychlorinated biphenyls

(PCBs) as estrogens and antiestrogens: structure-activity relationships. Toxicol Appl

Pharmacol 145:111-123

35. Gierthy JF, Arcaro KF, Floyd M 1997 Assessment of PCB estrogenicity in a human

breast cancer cell line. Chemosphere 34:1495-1505

36. Ramamoorthy K, Vyhlidal C, Wang F, Chen I, Safe S, McDonnell DP, Leonard LS,

Gaido KW 1997 Additive estrogenic activities of a binary mixture of 2',4',6'-trichloro-

and 2',3',4',5'-tetrachloro-4-biphenylol. Toxicol Appl Pharmacol 147:93-100

37. Rajapakse N, Silva E, Kortenkamp A 2002 Combining xenoestrogens at levels

below individual no-observed-effect concentrations dramatically enhances steroid

hormone action. Environ Health Perspect 110:917-921

38. Silva E, Rajapakse N, Kortenkamp A 2002 Something from "nothing"--eight weak

estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant

mixture effects. Environ Sci Technol 36:1751-1756

39. Maness SC, McDonnell DP, Gaido KW 1998 Inhibition of androgen receptor-

dependent transcriptional activity by DDT isomers and methoxychlor in HepG2 human

hepatoma cells. Toxicol Appl Pharmacol 151:135-142

40. Portigal CL, Cowell SP, Fedoruk MN, Butler CM, Rennie PS, Nelson CC 2002

Polychlorinated biphenyls interfere with androgen-induced transcriptional activation

and hormone binding. Toxicol Appl Pharmacol 179:185-194

41. Hahn ME, Goldstein JA, Linko P, Gasiewicz TA 1989 Interaction of

hexachlorobenzene with the receptor for 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in vitro

and in vivo. Evidence that hexachlorobenzene is a weak Ah receptor agonist. Arch

Biochem Biophys 270:344-355

82

Table and figures Table 1. Composition of the organochlorine mixture

Compounds Origina CAS number

Concentrationb (mM)

PCBsc AccuStandard 116.3

p,p'-DDE Radian 72-55-9 78.8

Technical chlordane Radian 12789-03-6 67.9

α-HCH Radian 319-84-6 27.6

p,p'-DDT Cerilliant 50-29-3 24.9

Technical toxaphene Radian 8001-35-2 20.6

Aldrin Radian 309-00-2 9.0

Dieldrin Sigma Aldrich 60-57-1 7.1

1,2,4,5-Tetrachlorobenzene Sigma Aldrich 95-94-3 5.2

β-HCH Radian 319-85-7 2.0

p,p'-DDD Cerilliant 72-54-8 2.0

Hexachlorobenzene Sigma Aldrich 118-74-1 1.6

Pentachlorobenzene Sigma Aldrich 608-93-5 0.9

γ-HCH Sigma Aldrich 58-89-9 0.9

Mirex Cerilliant 2385-85-5 0.5

a AccuStandard Inc. (New Haven, CT); Cerilliant Corp, (Round Rock, TX); Radian Corp. (Austin, TX); Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). All product purity ≥ 98% except Dieldrin 90%. b Dimethylsulfoxide as the solvent. c Mix containing Aroclor 1260 (58.9%), Aroclor 1254 (39.3%), 2,4,4’-triclorobiphenyl (PCB 28; 1.0%), 2,2’,4,4’-tetrachlorobiphenyl (PCB 47; 0.8%), 3,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyl (PCB 126; 0.02%), and 3,3’, 4,4’-tetrachlorobiphenyl (PCB 77; 0.004%).

83

Figure 1 : Estrogenic potential of individual organochlorines.

Compound (µM)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

vehi

cle

0.00

0001

0.00

001

0.00

01

0.00

1 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10

E2 α-HCH β-HCH γ-HCH p,p'-DDD

p,p'-DDE

p,p'-DDT

Toxa-phene

Aldrin Dieldrin PCBs

Compound (µM)

****** ***

*** ******

***

***

* **

Gen

eac

tivat

ion

(% o

f1 n

ME 2

)

Compound (µM)

0

20

40

60

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100

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140

160

vehi

cle

0.00

0001

0.00

001

0.00

01

0.00

1 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10


p,p'-DDE

p,p'-DDT

Toxa-phene


Compound (µM)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

vehi

cle

0.00

0001

0.00

001

0.00

01

0.00

1 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10


p,p'-DDE

p,p'-DDT

Toxa-phene


Compound (µM)

0

20

40

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160

vehi

cle

0.00

0001

0.00

001

0.00

01

0.00

1 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10


0

20

40

60

80

100

120

140

160

vehi

cle

0.00

0001

0.00

001

0.00

01

0.00

1 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10


p,p'-DDE

p,p'-DDT

Toxa-phene


Compound (µM)

****** ***

*** ******

***

***

* **

Gen

eac

tivat

ion

(% o

f1 n

ME 2

)

84

Figure 2 : Antiandrogenic potential of individual organochlorines.

85

Figure 3 : Estrogenic potential of the organochlorine mixture compared to those of E2 and p,p'-DDT.

-14 -12 -10 -8 -6 -40

50

100E2p,p'-DDTp,p'-DDTin mixture

Compound (M)

Gen

e ac

tivat

ion

(% o

f 1nM

E2) E2

-14 -12 -10 -8 -6 -40

50

100E2p,p'-DDTp,p'-DDTin mixture

Compound (M)

Gen

e ac

tivat

ion

(% o

f 1nM

E2) E2

*** *

**

86

Figure 4 : Antiandrogenic potential of the organochlorine mixture compared to those of hydroxyflutamide (OHF) and p,p'-DDE.

87

Figure 5 : Dioxin-like potential of the organochlorine mixture compared to those of TCDD and PCBs.

-14 -12 -10 -8 -6 -40

50

100TCDDPCBsPCBsin mixture

Compound (M)

Gen

e ac

tivat

ion

(% o

f 1nM

TC

DD

)

*

88

Chapitre 2

Effets différentiels d'un mélange d'organochlorés sur la

prolifération de différentes lignées tumorales mammaires

89

Contribution Ce manuscrit a été soumis pour publication à la revue Endocrinology. Pour cette étude, j’ai

effectué la totalité des expériences à l’exception de la partie sur la prolifération des MCF-7

pour laquelle Christian Larochelle m’a aidé. De plus, j’ai rédigé le premier jet de l’article et

participé à la rédaction de sa forme finale.

90

Résumé Les organochlorés (OCs) constituent un groupe de composés organiques persistants qui

s’accumulent dans les tissus adipeux avec l’âge. Bien que certains OCs aient été

caractérisés individuellement pour leur capacité à induire la prolifération de cellules

tumorales mammaires, peu d’études ont examiné les effets prolifératifs induits par des

mélanges complexes de ces substances, similaires à ceux retrouvés dans les tissus adipeux

chez l’humain. Nous avons constitué un tel mélange d’OC comprenant 15 composés

différents et avons évalué ses effets sur la prolifération de quatre lignées cellulaires

tumorales mammaires (CAMA-1, T47D, MCF-7 et MDAMB231) et d’une lignée cellulaire

non-tumorale (CV-1). Nous avons également déterminé la capacité du mélange à moduler

l’entrée des cellules dans le cycle cellulaire. Nous avons observé que les concentrations les

plus faibles du mélange ont stimulé la prolifération des cellules MCF-7 tandis que les

concentrations les plus élevées ont produit l’effet opposé. Le mélange a aussi diminué la

prolifération des cellules non hormono-dépendantes MDAMB231 et CV-1. En accord avec

les résultats des tests de prolifération, le mélange a augmenté de manière significative le

nombre de cellules MCF-7 dans la phase S du cycle cellulaire. Cet effet a été bloqué par

l’antiestrogène ICI 182,780 ce qui suggère que ERα est médiateur des effets du mélange

sur la prolifération des MCF-7. Les faibles concentrations du mélange ont également causé

une augmentation de la prolifération des cellules CAMA-1 mais seulement en présence

d’estradiol et de dihydrotestostérone dans le milieu de culture. Lorsque testés

individuellement, le DDT et ses analogues ainsi que les biphényles polychlorés ont tous

stimulé la prolifération des cellules CAMA-1 cultivées en présence des hormones

sexuelles. Nos résultats indiquent que le mélange complexe d’OC augmente la prolifération

des cellules MCF-7 par son potentiel estrogénique tandis que l’effet prolifératif du mélange

sur les cellules CAMA-1 peut être dû en partie aux propriétés antiandrogéniques du p,p’-

DDE, lequel est un constituant majeur de notre mélange.

91

Differential effects of an organochlorine mixture on the proliferation of breast cancer cell lines






Pierre Ayotte, PhD


945 avenue Wolfe


Phone: 418-650-5115

Fax: 418-654-2148


92

Abstract Organochlorine compounds (OC) are a group of persistent compounds that accumulate in

fatty tissues with age. Although OCs have been tested individually for their capacity to

induce breast cancer cell proliferation, few studies examined the combined effect of

complex mixtures, similar in composition to those found in the body fat of women

environmentally-exposed to these compounds. We constituted such an OC mixture

containing 15 different components and assessed its proliferative effects in four breast

cancer cell lines (CAMA-1, T47D, MCF-7, MDAMB231) as well as in non-cancerous CV-

1 cells. We also determined the capacity of the mixture to modulate cell cycle stage of

breast cancer cells. We observed that low concentrations of the mixture stimulated the

proliferation of MCF-7 cells while higher concentrations had the opposite effect. In

contrast, the mixture inhibited the proliferation of non hormone-dependent cell lines. The

mixture significantly increased the number of MCF-7 cells entering the S phase, an effect

that was blocked by ICI 182,780. Low concentrations of the mixture also caused an

increase in CAMA-1 cell proliferation, in the presence estradiol and dihydrotestosterone.

DDT analogs and polychlorinated biphenyls all had the capacity to stimulate the

proliferation of CAMA-1 cells in the presence of sex steroids. Our results indicate that the

complex OC mixture increases the proliferation of MCF-7 cells due to its estrogenic

potential. The proliferative effect of the mixture on CAMA-1 cells in the presence of sex

steroids may be due in part to the antiandrogenic properties of p,p’-DDE, a major

constituent of the mixture.

93

Introduction Breast cancer is a major public health concern as one out of nine women will develop the

disease in her lifetime. Well recognized risk factors include genetic predisposition (1;2)

and reproductive history (3). These factors may be involved in 30-50% of all breast

cancers, while lifestyle habits could explained part of the remaining cases (4;5). The

potential implication of exposure to environmental contaminants as a risk factor for breast

cancer has been controversial but is still being researched intensively [reviewed in (6)].

Organochlorines (OCs) are a group of chemicals that comprises pesticides and their

metabolites [e.g. p,p’-dichlorodiphenyltrichlorethane (p,p’-DDT), p,p’-

dichlorodiphenyldichlorethylene (p,p’-DDE)], industrial compounds and by-products of

various industrial processes [e.g. hexachlorobenzene (HCB), polychlorinated biphenyls

(PCBs), polychlorodibenzo-p-dioxins (PCDDs) and polychlorodibenzofurans (PCDFs)].

Their lipophilic nature and resistance to biodegradation lead to their accumulation in fatty

tissues of living organisms including humans (7). Several studies have shown that by the

time they reach menopause, women have accumulated several OCs in their body fat (8-10),

which form a complex mixture of compounds with different hormonal activities. Some

OCs such as DDT, β-hexachlorocyclohexane and PCBs or their metabolites display weak

estrogenic activities (11-13). PCBs also exhibit anti-estrogenic and anti-androgenic

properties (14-16). p,p’-DDE, the main DDT metabolite, is a potent antagonist of the

androgen receptor (AR) (17) but is also a weak estrogen receptor (ER) agonist (18). To

further complicate the situation, xenoestrogens differentially activate estrogen receptors

alpha and beta, which have opposite influences on the proliferation of breast cancer cell

lines (19-21). Hence, it is difficult to predict the effect that exposure to a complex OC

mixture made up of several compounds with multiple hormonal activities might have on

biological systems.

Breast cancer cell lines have been used extensively to test the capacity of xenobiotics,

alone or in combination, to induce cell proliferation, cell cycle gene expression and

apoptosis (reviewed in (22)). Breast cancer cell lines differ with regard to the expression of

sex-hormone receptors and the proliferative response induced by steroid hormones and

94

other hormonally-active compounds. A number of studies examined the proliferative

effects of complex mixtures of chemicals in MCF-7 cells (23-31); some of theses studies

reported additive responses for mixtures of xenoestrogens or xenoestrogens together with

steroidal estrogens (23;25;26;31). In addition to estrogenic compounds, chemicals that can

block the androgen receptor have emerged as new xenohormones of interest in the field of

endocrine disruption (23;32). The CAMA-1 breast cancer cell line strongly expresses the

AR and is especially sensitive to growth inhibition by androgens (33). This cell line

therefore represents a good model to test the activity of environmental anti-androgens on

breast cancer cell proliferation.

To our knowledge, no one evaluated breast cancer cell proliferation induction by a complex

OC mixture similar in composition to those found in the body fat of women in various parts

of the world. We have constituted an OC mixture containing 15 different components and

assessed its proliferative effects in four breast cancer cell lines (CAMA-1, T47D, MCF-7,

MDAMB231) as well as in non-cancerous CV-1 cells. The mixture was also tested for its

proliferative effects in CAMA-1 cells in the presence of estrogens and androgens. Here we

show that the mixture can induce different effects on the proliferation of breast cancer cells

depending on the cell line and whether or not sex steroids are present in the cell culture

medium.

Materials and methods Reagents. 17β-estradiol (E2) was purchased from Sigma (St. Louis, MO) and

dihydrotestosterone (DHT) from Steraloids (Newport, RI), whereas ICI 182,780 was

purchased from Tocris (Ellisville, MO). These compounds were dissolved in ethanol at a

concentration of 1.0 mM. All tested chemicals were dissolved in dimethylsulfoxide

(DMSO) at a concentration of 10.0 mM. The final concentration of each vehicle in the cell

culture medium was 0.1% (v/v). The composition of the OC mixture can be found in Table

1.

Cell proliferation assays. CAMA-1, MCF-7, T47D, MDAMB231 and CV-1 cells were

purchased from American Type Culture Collection (Manassas, VA). CAMA-1 and T47D

95

cells were maintained in phenol red-free RPMI medium supplemented with 10% (v/v)

fœtal bovine serum (FBS) from Wisent (St.-Bruno, QC, Canada), 1.0 mM pyruvate, 2.0

mM L-glutamine, 0.1 µg/ml streptomycin and 0.1 U/ml penicillin in a humidified

atmosphere of 5% CO2 at 37°C. MCF-7, MDAMB231 and CV-1 cells were maintained in

phenol red-free DMEM supplemented with 10% (v/v) FBS, 1.0 mM pyruvate, 2.0 mM L-

glutamine, 0.1 µg/ml streptomycin, 0.1 U/ml penicillin and 1 µg/ml insulin and maintained

in the same condition as described above. 2 x 103 cells/well (CAMA-1 and T47D) or 1 x

103 cells/well (MCF-7, MDAMB231 and CV-1) were seeded in FBS-supplemented

medium in 96-well plate (6 wells per treatment) and were incubated during 24 h at 37°C.

The complete medium was then substituted for FBS-free medium for a 24-h period. On day

1 of the experiment, the FBS-free medium was replaced by a medium containing 10%

dextran-coated charcoal-treated FBS (DCC-FBS, from Wisent), the hormones and test

chemicals (or vehicles). Cells were grown over a 9-day period with a medium replacement

every 3 days. The medium was then removed and nucleic acids were stained using the

CyQuant® kit (Molecular Probes, Eugene, OR) as described by the manufacturer.

Sex steroids receptor basal expression levels. 2 x 106 cells were seeded into 10-cm dishes

in 10 ml medium supplemented with 10% FBS as described above and were incubated

during 24 h at 37°C. Total RNA was isolated with TRIzol® (Gibco, Grand Island, NY) as

described by the manufacturer and diluted in 40 µl of diethyl pyrocarbonate-treated H2O.

mRNAs were reverse transcribed by Super Script II™ using Oligo(dt) primer from Gibco

as described by the manufacturer in a final volume of 50 µl. An amount of 500 ng of total

RNA was included as template for each reaction. The amount of cDNA used for PCR

reaction was adjusted for each target gene. To assess ESR1 mRNA (forward primer: 5’

AATTCAGATAATCGACGCCAG-3’; reverse: 5’-GTGTTTCAACATTCTCCCTC-CTC-

3’; Tm=58ºC; 344 bp) (34) and ESR2 mRNA (forward primer: 5’-TAGTG-

GTCCATCGCCAGTTAT-3 ; reverse: 5’-GGGAGCCACACTTCACCAT-3’; Tm=54ºC;

392 bp) (34), a 10-µl aliquot of cDNA was used compared to 1 µl for β-actin (forward

primer: 5'-CGTGA-CATTAAGGAGAAGCTGTGC-3'; reverse: 5'-

CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3'; Tm=58ºC; 375 bp) (35), while 10 µl (ESR1

and ESR2) and 5 µl (β-actin) of amplified product were loaded on a 8% polyacrylamide

96

gel. To evaluate mRNAs for AR (forward primer: 5-GTCAAAA-GCGAAATGGGCCCC-

3’; reverse: 5-CTT-CTGGGTTGTCTCCTCAGT-3’; Tm=60ºC; 420 bp) (36), we used 5-µl

aliquots of cDNA and a 2-µl aliquot for β-actin, while 10 µl of amplified products were

loaded on the gel. Taq DNA polymerase and deoxynucleotides (Roche, Basel, Switzerland)

were used as described by the manufacturer in a 50-µl final volume. The PCR settings were

adjusted to complete each reaction within the linear portion of amplification. PCR

conditions were one 5-min cycle at 95°C, 25 (β-actin) or 30 cycles (target mRNAs) each

comprising a 30-sec step at 95°C, followed by a 30-sec step at primer specific annealing

temperature and a 45-sec step at 72°C, and one last cycle of 7 min at 72°C. Negative

controls were included for each reaction. PCR products were stained with ethidium

bromide and captured with a 16-bit camera. Densitometry was determined by Quantity One

1-D Software Analysis from Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) and normalized with β-

actin.

Cell cycle analysis. 50 x 103 cells/well were seeded in 1 ml FBS-supplemented medium in

24-well plates and incubated during 24 h at 37°C. The medium was replaced by FBS-free

medium during 48 h to promote G0/G1 synchronization. FBS-free medium was then

replaced by a medium containing 10% DCC-FBS, hormones and test chemicals (or

vehicles) for a 24-h incubation period at 37ºC. Cells were harvested following

trypsinization, fixed in 70% ethanol for 30 min at -30ºC and then stained with propidium

iodine (50 µg/ml) in PBS containing 40 U/ml RNase A for 1 h at 37ºC. The DNA content

in each cell was determined by flow cytometry analysis using the Wallac 1420 Multilabel

Counter from Perkin-Elmer Life Sciences (Wellesley, MA).

Statistical analyses. Concentration-response relationships were tested using linear or

quadratic regression analysis. Group means were compared using an analysis of variance

followed by Dunnett’s multiple comparison procedure. All statistical analyses were

performed using the SPSS for Windows software (v. 11.5.0; SPSS Inc, Chicago, IL).

97

Results Effects of the OC mixture on the proliferation of breast cancer cell lines. We first

characterized the expression of ERα, ERβ and AR in cell lines by RT-PCR (Table 2). We

observed similar expression levels of ERα and ERβ in CAMA-1, T47D and MCF-7 cell

lines. AR expression level was the greatest in CAMA-1 cells; this receptor was also

expressed but to a lesser extent in MCF-7 and T47D cells. The non hormone-dependent

breast cancer cell line MDAMB2321 expressed ERβ only whereas none of the sex steroid

receptors were expressed in CV-1 cells.

In preliminary experiments, we determined the proliferative responses induced by E2 in

CAMA-1, T47D and MCF-7 over a 9-day period. Maximal proliferation of 4.4 ± 0.1, 3.2 ±

0.1 and 4.1 ± 0.5 (mean ± SEM) fold induction over vehicle controls were achieved by

treatment with 100 pM E2 in CAMA-1 and T47D, and 10 pM E2 in MCF-7 cells

respectively (data not shown). MDAMB231 and CV-1 cells displayed exponential growth

in the presence or absence of E2 in the cell culture medium.

Next we investigated the effect of increasing concentrations of the OC mixture on the

proliferation of the cells lines, in the absence of sex steroids in the cell culture medium.

The relation between the concentration of the mixture and the proliferation of CAMA-1,

T47D and MCF7 cells followed inverted U-shaped curves (Figure 1A, 1B and 1C,

respectively). Quadratic models best described concentration-response relationships in

these cells lines (CAMA-1: r-square = 0.416, P < 0.01; T47D: r-square = 0.320, P < 0.05;

MCF-7: r-square = 0.739, P < 0.001). At low concentrations, the mixture tended to increase

the proliferation of CAMA-1 and T47D cells, while higher concentrations tended to

decrease cell proliferation, but none of the values were statistically different from that of

vehicle-treated cells. In contrast, the lowest concentration of the mixture (100 x 103

dilution) caused a statistically-significant 2.4-fold increase in the proliferation of MCF-7

cells over the vehicle treatment (P < 0.01). The maximum proliferative effect was observed

at the 20 x 103 dilution (3.2 fold; P < 0.001). The highest concentration tested (5 x 103

dilution) resulted in a low cell proliferation that was not different from that of the vehicle-

treated cells.

98

In non-hormone-dependent MDAMB231 (Figure 1D) and CV-1 cells (Figure 1E), the OC

mixture caused a concentration-dependent decrease in cell proliferation that followed a

linear relationship (MDAMB231: r-square = 0.702, P < 0.001; CV-1: r-square = 0.862, P <

0.001). The highest concentration (5 x 103 dilution) caused a 50% decrease in cell

proliferation in both cells lines compared to vehicle-treated cells (P < 0.001). This

concentration was cytotoxic in all cell lines as determined by visual inspection of the cells

under light microscopy.

Effects of the OC mixture on cell cycle entry. In order to better characterize the

proliferative response induced by the OC mixture, we measured cell transition from the

G0/G1 phase to the S phase and G2/M phases in cell lines following a 24-h treatment with

the OC mixture. Adding 1 nM E2 significantly decreased (P < 0.01) the percentage of cells

in the G0/G1-phase compared to vehicle-treated controls in the three hormone-dependent

cell lines (data not shown). Treatment with the OC mixture induced cell cycle entry only in

MCF-7 cells. The OC mixture at the 20 x 103 and 10 x 103 dilutions decreased the number

of MCF-7 cells in the G0/G1-phase by about 25% compared to the vehicle-treated cells (P

< 0.05 and P < 0.01 respectively; Figure 2C). These treatments also increased the number

of cells in the S-phase by 160% (p<0.05) and 180% (p<0.01) at the 20 x 103 and 10 x 103

dilutions, respectively. The addition of 1.0 µM ICI 182,780 (ER antagonist) to the cell

culture medium abolished the OC-mediated cell cycle entry (Figures 2G). Treatment with

the highest concentration of the mixture increased the number of MDAMB231 cells in the

G0/G1 phase compared to the vehicle-treated cells (P < 0.05; Figure 2D and 2H).

Modulation of CAMA-1 cell proliferation by the OC mixture in the presence of sex

hormones. We tested the potential of the OC mixture to interfere with the control exerted

by sex steroids on the proliferation of CAMA-1 cells. To this end, increasing

concentrations of the mixture were added to the cell culture medium together with E2 alone

(10 or 100 pM) or with a combination of E2 (100 pM) and DHT (500 pM). In the presence

of E2 alone (Figures 3A-B), the OC mixture caused concentration-dependent linear

decreases in the proliferation of CAMA-1 cells (E2 10 pM: r-square = 0.753, P < 0.001; E2

100 pM: r-square = 0.933, P < 0.001). The 20 x 103 dilution of the mixture caused a 30%

99

decrease in cell proliferation compared to the E2 + DMSO treatment (P < 0.001). In the

presence of 100 pM E2 and 500 pM DHT, increasing concentrations of the mixture caused

a biphasic response in the proliferation of CAMA-1 cells, resulting in an inverted U-shaped

curve (r-square for the quadratic model: 0.547, P < 0.001; Figure 3C). Treatment with the

50 x 103 dilution of the OC mixture caused a 70% increase in CAMA-1 cell proliferation

compared to the E2+DHT treatment (P < 0.05; Figure 3C). Similarly to the results obtained

in the presence of E2 alone, further increases in concentrations led to a reduction in cell

proliferation.

Effects of individual constituents of the mixture on the proliferation of CAMA-1 cells.

Additional experiments were performed to identify which compounds in the mixture are

responsible for the increased proliferation noted in CAMA-1 cells in the presence of E2 and

DHT. Firstly, each constituent was tested individually at a concentration of 5 µM and

compounds that showed some proliferative activity at this concentration were selected for

further characterization (data not shown). p,p’-DDD, p,p’-DDE, p,p’-DDT and PCBs were

then tested in concentrations varying from 0.1 to 10.0 µM, either alone or in combination

with E2 and DHT (Figure 4A-H). All three DDT compounds induced concentration-related

increases in cell proliferation in the absence of sex steroids (p,p’-DDD: r-square = 0.425, P

< 0.001; p,p’-DDT: r-square = 0.768, P < 0.001; p,p’-DDE: r-square = 0.593, P < 0.001).

Statistically-significant increases of 30%, 40% and 90% (P < 0.05) were observed

following treatment with p,p’-DDD, p,p’-DDT and p,p’-DDE respectively at the highest

concentration tested (10 µM). PCBs did not induce the proliferation of CAMA-1 cells in

the absence of sex steroids in the cell culture medium. p,p’-DDD tended to increase cell

proliferation in the presence of sex hormones (linear r-square = 0.307, P < 0.01; Figure 4F)

but statistically-significant differences were not observed between the treatments. There

was also evidence for a linear concentration-response relationship for p,p’-DDE (r-square =

0.303, P < 0.01; Figure 4G) and PCBs (linear r-square = 0.409, P < 0.001; Figure 4H).

p,p’-DDE was the most potent compound in the presence of the endogenous hormones: a

5-µM concentration increased cell proliferation by 160% compared to the E2+DHT

treatment (Figure 4G; P < 0.001). PCBs at a concentration of 10 µM increased cell

proliferation by 41% compared to E2+DHT treatment (Figure 4H, P < 0.05).

100

Discussion We analysed the capacity of an OC mixture containing 15 components, some of which

possessing known hormone disrupting activity, to modulate the proliferation of four

different breast cancer cell lines. The mixture decreased the proliferation of the non-

hormone-dependent MDAMB231 cell line, strongly induced the proliferation of MCF-7

cells, while it had little effect on the proliferation of the other two hormone-dependent

breast cancer cell lines (T47D cells and CAMA-1). However, in the presence of sex

steroids, the mixture significantly increased the proliferation of CAMA-1 cells, indicating

that the hormonal milieu to which cells are exposed modulates their response to the

hormonally active OC mixture. While studying the endocrine disrupting activities of

complex real-life mixtures similar to the one used here is important (37;38), our results

indicate that predicting how mixtures of chemicals can influence complex biologic

processes such as breast cancer cell proliferation remains an elusive goal.

We noted that the MCF-7 cell line was the most responsive to the proliferative effect of the

OC mixture. The MCF-7 cell line is exquisitely sensitive to estrogenic stimulation and have

been extensively used to characterize the estrogenic potential of xenohormones (39-41).

This striking difference in sensitivity between the breast cancer cell lines to the

proliferative effects of the OC mixture could result in part from differences in the

expression of the sex steroids hormone receptors ERα, ERβ and AR (Table 2). The co-

receptor expression levels differ between cell lines and this is also likely to play a

determinant role in modulating the proliferative responses of the cell lines exposed to

xenohormones (42).

Several authors have shown that ERα and ERβ have opposite effects on breast cancer cell

proliferation (19-21). Paruthiyil et al. reported that the overexpression of ERβ in ERα

positive MCF-7 cells inhibits cell proliferation in vitro and prevents tumor formation in the

mouse model in response to E2 treatment (43). Three constituents of our OC mixture -

DDT, chlordane and toxaphene - were shown to activate both ERα and ERβ in reporter

gene cell assays (44). In addition, hydroxy-metabolites of PCBs, which might be formed

through the biotransformation of PCBs in breast cancer cells, can also activate both ER

101

subtypes (45). The proliferative activity of the mixture in a specific cell line could therefore

reflect the balance of ERα and ERβ signalling pathways, which can be both activated by

xenoestrogens in the mixture.

In addition to being ER agonists, several environmental contaminants can bind the AR and

exert antagonistic activity (18). This is most notably the case for p,p’-DDE which displays

a greater affinity for AR (17) than for the ER (46). The greater potential of p,p’-DDE as an

AR blocker than a ER agonist can be observed in our experiments in CAMA-1 cells that

included sex steroids in the cell culture medium. In these conditions, DHT inhibits the

proliferation of CAMA-1 cells induced by E2. The 5-µM p,p’-DDE concentration caused a

160% increase in CAMA-1 cell proliferation compared the E2 + DHT treatment (Figure

4G; p < 0.001), whereas the same concentration of p,p’-DDE was without effect in the

absence of sex steroids (Figure 4C). p,p’-DDD and PCBs also exhibited some capacity to

induce CAMA-1 cell proliferation. Considering their potential and their concentration in

the mixture, p,p’-DDE and PCBs might be responsible for the proliferative effect exerted

by the mixture at the 50 x 103 dilution (Figure 3C). At this dilution, concentrations of p,p’-

DDE and PCBs in the cell culture medium are respectively 1.6 and 2.4 µM, close to the

concentrations inducing cell proliferation when tested individually.

The proliferation of the non-hormone-sensitive breast cancer cell line MDAMB231 (which

expresses the ERβ) and that of CV-1 cells were markedly reduced by treatment with the

OC mixture (Figure 1D-E). Furthermore, in the presence of E2, CAMA-1 cell proliferation

was also reduced by treatment with the OC mixture (Figure 3A-B). PCBs are the major

constituent of the mixture, accounting for one third of the total molar concentration. PCBs

have been shown to inhibit MCF-7 breast cancer cell proliferation and to exhibit

antiestrogenic as well as antiandrogenic activities (15;16;47). However, since the

proliferation of both hormone-dependent and non hormone-dependent cell lines is reduced

by the mixture, a cytotoxic effect is more likely. Lin and Lin reported that two PCB

congeners (IUPAC nos. 126 and 153) induced reactive oxygen species (ROS) and caused

cell death in T47D and MDAMB231 cells (48). We speculate that a cytotoxic mechanism,

102

sush as ROS induction might be responsible for the decrease in cell proliferation observed

in all cell lines treated with the highest concentration of our mixture.

Androgens have been shown to inhibit the proliferation of T47D and ZR-75-1 hormone-

dependent breast cancer cell lines (49). Also, activation of AR by DHT resulted in the

inhibition of MCF-7 and CAMA-1 cell proliferation (33;50;51). In view of the large

number of compounds that have been shown to block the androgen receptor, researchers

should pay more attention to the possible role of antiandrogens in increasing the

proliferation of hormone-dependent breast cancer cells. The possibility that androgen

blockers might increase breast cancer progression should be examined.

In summary, we showed that a complex OC mixture resembling that found in adipose

tissue of women in several parts of the world can induce the proliferation of two hormone-

dependent breast cancer cell lines. The increase in proliferation of MCF-7 cells is likely

caused by xenoestrogens in the mixture. The proliferative effect of the mixture on CAMA-

1 cells in the presence of sex steroids may be due in part to the antiandrogenic properties of

p,p’-DDE, a major constituent of the mixture. Other contaminant mixtures should be

investigated for their capacity to induce the proliferation of CAMA-1 cells in the presence

of endogenous hormones.

103

Reference List 1. Margolin S, Lindblom A 2006 Familial breast cancer, underlying genes, and clinical

implications: a review. Crit Rev Oncog 12:75-113

2. Dunning AM, Healey CS, Pharoah PD, Teare MD, Ponder BA, Easton DF 1999 A systematic review of genetic polymorphisms and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8:843-854

3. Shantakumar S, Terry MB, Teitelbaum SL, Britton JA, Millikan RC, Moorman PG, Neugut AI, Gammon MD 2006 Reproductive factors and breast cancer risk among older women. Breast Cancer Res Treat

4. Clarke CA, Purdie DM, Glaser SL 2006 Population attributable risk of breast cancer in white women associated with immediately modifiable risk factors. BMC Cancer 6:170

5. Kamarudin R, Shah SA, Hidayah N 2006 Lifestyle factors and breast cancer: a case-control study in Kuala Lumpur, Malaysia. APJCP 7:51-54

6. Mitra AK, Faruque FS, Avis AL 2004 Breast cancer and environmental risks: where is the link? J Environ Health 66:24-32, 40

7. Kutz FW, Wood PH, Bottimore DP 1991 Organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls in human adipose tissue. Rev Environ Contam Toxicol 120:1-82

8. Demers A, Ayotte P, Brisson J, Dodin S, Robert J, Dewailly E 2000 Risk and aggressiveness of breast cancer in relation to plasma organochlorine concentrations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 9:161-166

9. Garcia AM 2003 Pesticide exposure and women's health. Am J Ind Med 44:584-594

10. Sandanger TM, Sinotte M, Dumas P, Marchand M, Sandau D, Pereg D, Bérubé S, Brisson J, Ayotte P 2007 Plasma concentrations of selected organobromine compounds and polychlorinated biphenyls in postmenopausal women of Quebec, Canada. Environ Health Perspect 115:2429-2434.

11. Bigsby RM, Caperell-Grant A, Madhukar BV 1997 Xenobiotics released from fat during fasting produce estrogenic effects in ovariectomized mice. Cancer Res 57:865-869

12. Zava DT, Blen M, Duwe G 1997 Estrogenic activity of natural and synthetic estrogens in human breast cancer cells in culture. Environ Health Perspect 105 Suppl 3:637-645

13. Shiraishi F, Okumura T, Nomachi M, Serizawa S, Nishikawa J, Edmonds JS, Shiraishi H, Morita M 2003 Estrogenic and thyroid hormone activity of a series of hydroxy-polychlorinated biphenyls. Chemosphere 52:33-42

14. Kramer VJ, Helferich WG, Bergman A, Klasson-Wehler E, Giesy JP 1997 Hydroxylated polychlorinated biphenyl metabolites are anti-estrogenic in a stably transfected human breast adenocarcinoma (MCF7) cell line. Toxicol Appl Pharmacol 144:363-376

104

15. Schrader TJ, Cooke GM 2003 Effects of Aroclors and individual PCB congeners on activation of the human androgen receptor in vitro. Reprod Toxicol 17:15-23

16. Rasmussen TH, Nielsen F, Andersen HR, Nielsen JB, Weihe P, Grandjean P 2003 Assessment of xenoestrogenic exposure by a biomarker approach: application of the E-Screen bioassay to determine estrogenic response of serum extracts. Environ Health 2:12

17. Kelce WR, Stone CR, Laws SC, Gray LE, Kemppainen JA, Wilson EM 1995 Persistent DDT metabolite p,p'-DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature 375:581-585

18. Sohoni P, Sumpter JP 1998 Several environmental oestrogens are also anti-androgens. J Endocrinol 158:327-339

19. Cappelletti V, Saturno G, Miodini P, Korner W, Daidone MG 2003 Selective modulation of ER-beta by estradiol and xenoestrogens in human breast cancer cell lines. Cell Mol Life Sci 60:567-576

20. Lazennec G, Bresson D, Lucas A, Chauveau C, Vignon F 2001 ER beta inhibits proliferation and invasion of breast cancer cells. Endocrinology 142:4120-4130

21. Hall JM, McDonnell DP 1999 The estrogen receptor beta-isoform (ERbeta) of the human estrogen receptor modulates ERalpha transcriptional activity and is a key regulator of the cellular response to estrogens and antiestrogens. Endocrinology 140:5566-5578

22. Gelbke HP, Kayser M, Poole A 2004 OECD test strategies and methods for endocrine disruptors. Toxicology 205:17-25

23. Birkhoj M, Nellemann C, Jarfelt K, Jacobsen H, Andersen HR, Dalgaard M, Vinggaard AM 2004 The combined antiandrogenic effects of five commonly used pesticides. Toxicol Appl Pharmacol 201:10-20

24. Willingham E 2004 Endocrine-disrupting compounds and mixtures: unexpected dose-response. Arch Environ Contam Toxicol 46:265-269

25. Silva E, Rajapakse N, Kortenkamp A 2002 Something from "nothing"--eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environ Sci Technol 36:1751-1756

26. Rajapakse N, Silva E, Kortenkamp A 2002 Combining xenoestrogens at levels below individual no-observed-effect concentrations dramatically enhances steroid hormone action. Environ Health Perspect 110:917-921

27. Charles GD, Gennings C, Zacharewski TR, Gollapudi BB, Carney EW 2002 Assessment of interactions of diverse ternary mixtures in an estrogen receptor-alpha reporter assay. Toxicol Appl Pharmacol 180:11-21

28. Mumtaz MM, Tully DB, El Masri HA, De Rosa CT 2002 Gene induction studies and toxicity of chemical mixtures. Environ Health Perspect 110 Suppl 6:947-956

29. Desaulniers D, Leingartner K, Russo J, Perkins G, Chittim BG, Archer MC, Wade M, Yang

105

J 2001 Modulatory effects of neonatal exposure to TCDD, or a mixture of PCBs, p,p'-DDT, and p-p'-DDE, on methylnitrosourea-induced mammary tumor development in the rat. Environ Health Perspect 109:739-747

30. Stelzer A, Chan HM 1999 The relative estrogenic activity of technical toxaphene mixture and two individual congeners. Toxicology 138:69-80

31. Arcaro KF, Vakharia DD, Yang Y, Gierthy JF 1998 Lack of synergy by mixtures of weakly estrogenic hydroxylated polychlorinated biphenyls and pesticides. Environ Health Perspect 106 Suppl 4:1041-1046

32. Gray LE, Ostby J, Furr J, Wolf CJ, Lambright C, Parks L, Veeramachaneni DN, Wilson V, Price M, Hotchkiss A, Orlando E, Guillette L 2001 Effects of environmental antiandrogens on reproductive development in experimental animals. Hum Reprod Update 7:248-264

33. Lapointe J, Labrie C 2001 Role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1) in androgen-induced inhibition of CAMA-1 breast cancer cell proliferation. Endocrinology 142:4331-4338

34. Enmark E, Pelto-Huikko M, Grandien K, Lagercrantz S, Lagercrantz J, Fried G, Nordenskjold M, Gustafsson JA 1997 Human estrogen receptor beta-gene structure, chromosomal localization, and expression pattern. J Clin Endocrinol Metab 82:4258-4265

35. Lipman ML, Stevens AC, Bleackley RC, Helderman JH, McCune TR, Harmon WE, Shapiro ME, Rosen S, Strom TB 1992 The strong correlation of cytotoxic T lymphocyte-specific serine protease gene transcripts with renal allograft rejection. Transplantation 53:73-79

36. Ito K, Suzuki T, Akahira J, Moriya T, Kaneko C, Utsunomiya H, Yaegashi N, Okamura K, Sasano H 2002 Expression of androgen receptor and 5alpha-reductases in the human normal endometrium and its disorders. Int J Cancer 99:652-657

37. Colborn T, vom Saal FS, Soto AM 1993 Developmental effects of endocrine-disrupting chemicals in wildlife and humans. Environ Health Perspect 101:378-384

38. Crews D, Willingham E, Skipper JK 2000 Endocrine disruptors: present issues, future directions. Q Rev Biol 75:243-260

39. Payne J, Jones C, Lakhani S, Kortenkamp A 2000 Improving the reproducibility of the MCF-7 cell proliferation assay for the detection of xenoestrogens. Sci Total Environ 248:51-62

40. Fang H, Tong W, Perkins R, Soto AM, Prechtl NV, Sheehan DM 2000 Quantitative comparisons of in vitro assays for estrogenic activities. Environ Health Perspect 108:723-729

41. Andersen HR, Andersson AM, Arnold SF, Autrup H, Barfoed M, Beresford NA, Bjerregaard P, Christiansen LB, Gissel B, Hummel R, Jorgensen EB, Korsgaard B, Le Guevel R, Leffers H, McLachlan J, Moller A, Nielsen JB, Olea N, Oles-Karasko A, Pakdel F, Pedersen KL, Perez P, Skakkeboek NE, Sonnenschein C, Soto AM, . 1999 Comparison

106

of short-term estrogenicity tests for identification of hormone-disrupting chemicals. Environ Health Perspect 107 Suppl 1:89-108

42. Magklara A, Brown TJ, Diamandis EP 2002 Characterization of androgen receptor and nuclear receptor co-regulator expression in human breast cancer cell lines exhibiting differential regulation of kallikreins 2 and 3. Int J Cancer 100:507-514

43. Paruthiyil S, Parmar H, Kerekatte V, Cunha GR, Firestone GL, Leitman DC 2004 Estrogen receptor beta inhibits human breast cancer cell proliferation and tumor formation by causing a G2 cell cycle arrest. Cancer Res 64:423-428

44. Lemaire G, Mnif W, Mauvais P, Balaguer P, Rahmani R 2006 Activation of alpha- and beta-estrogen receptors by persistent pesticides in reporter cell lines. Life Sci 79:1160-1169

45. Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, Corton JC, Safe SH, van der Saag PT, van der BB, Gustafsson JA 1998 Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology 139:4252-4263

46. Matthews J, Celius T, Halgren R, Zacharewski T 2000 Differential estrogen receptor binding of estrogenic substances: a species comparison. J Steroid Biochem Mol Biol 74:223-234

47. Oenga GN, Spink DC, Carpenter DO 2004 TCDD and PCBs inhibit breast cancer cell proliferation in vitro. Toxicol In Vitro 18:811-819

48. Lin CH, Lin PH 2006 Induction of ROS formation, poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation, and cell death by PCB126 and PCB153 in human T47D and MDA-MB-231 breast cancer cells. Chem Biol Interact 162:181-194

49. Birrell SN, Bentel JM, Hickey TE, Ricciardelli C, Weger MA, Horsfall DJ, Tilley WD 1995 Androgens induce divergent proliferative responses in human breast cancer cell lines. J Steroid Biochem Mol Biol 52:459-467

50. MacIndoe JH, Etre LA 1981 An antiestrogenic action of androgens in human breast cancer cells. J Clin Endocrinol Metab 53:836-842

51. Ando S, De Amicis F, Rago V, Carpino A, Maggiolini M, Panno ML, Lanzino M 2002 Breast cancer: from estrogen to androgen receptor. Mol Cell Endocrinol 193:121-128

107

Figure legends Figure 1 Proliferative effects induced by the OC mixture in different cell lines: CAMA-1

(A); T47D (B); MCF-7 (C); MDAMB-231 (D) and CV-1 (E). Cells were plated in 96-well

plates and supplemented with dextran-coated charcoal-treated FBS. Increasing

concentrations of the OC mixture or DMSO were added to the medium and cells were

incubated over a 9-day period. Cell proliferation was assessed by nucleic acid

quantification in each well. Each bar represents the mean ± SEM of four independent

experiments. Asterisk, ** and *** indicate P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001 versus

vehicle control respectively as determined by ANOVA followed by a Dunnet’s post hoc

test.

Figure 2 Effect of the OC mixture on cell cycle entry of breast cancer cell lines. CAMA-1,

T47D, MCF-7 and MDAMB231 cells were treated with the OC mixture or DMSO, either

with (A-D) or without (E-H) ICI 182,780, and were incubated for a 24-h period. Cell cycle

stage was assessed by flow cytometry analysis (10,000 events were collected for each

condition) according to the nucleic acid content of each cell. Each bar represents the mean

of four independent experiments. Asterisk and ** indicate P < 0.05 and P < 0.01 versus

vehicle control respectively as determined by ANOVA followed by a Dunnet’s post hoc

test.

Figure 3. Effect of the OC mixture on the proliferation of CAMA-1 cells in the presence of

sex hormones. Cells were exposed to increasing concentrations of the OC mixture or

DMSO for a 9-day period in the presence of 10 pM E2 (A), 100 pM E2 (B) or 100 pM E2 in

combination with 500 pM DHT (C). Relative cell proliferation was assessed by nucleic

acid quantification in each well. Each bar represents the mean ± SEM of four independent

experiments. Asterisk, ** and *** indicate P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001 versus vehicle

control respectively and † indicates P < 0.05 versus E2 + DHT treatment as determined by

ANOVA followed by a Dunnet’s post hoc test.

Figure 4. Proliferative effects induced by constituents of the OC mixture in CAMA-1 cells.

Cells were exposed for a 9-day period to increasing concentrations of individual

108

compounds alone or in presence of 100 pM E2 in combination with 500 pM DHT: (A) p,p’-

DDD; (B) p,p’-DDD; (C) PCBs mixture or (D) p,p’-DDE. Relative cell proliferation was

assessed by nucleic acid quantification in each well. Each bar represents the mean ± SEM

of four independent experiments. Asterisk and *** indicates P < 0.05 and P < 0.001 versus

vehicle control respectively; † or ††† indicate P < 0.05 and P < 0.001 versus E2 + DHT

treatment respectively as determined by ANOVA followed by a Dunnet’s post hoc test.

109

Table 1. Composition of the organochlorine mixture

Compounds Origina CAS number Concentration (mM)

PCBsb AccuStandard. 116.3

p,p'-DDE Radian. 72-55-9 78.8

Technical chlordane Radian. 12789-03-6 67.9

α-HCH Radian 319-84-6 27.6

p,p'-DDT Cerilliant 50-29-3 24.9

Technical toxaphene Radian. 8001-35-2 20.6

Aldrin Radian 309-00-2 9.0

Dieldrin Sigma Aldrich 60-57-1 7.1

1,2,4,5-Tetrachlorobenzene Sigma Aldrich 95-94-3 5.2

β-HCH Radian 319-85-7 2.0

p,p'-DDD Cerilliant 72-54-8 2.0

Hexachlorobenzene Sigma Aldrich 118-74-1 1.6

Pentachlorobenzene Sigma Aldrich 608-93-5 0.9

γ-HCH Sigma Aldrich 58-89-9 0.9

Mirex Cerilliant 2385-85-5 0.5

a AccuStandard Inc. (New Haven, CT); Cerilliant Corp, (Round Rock, TX); Radian Corp. (Austin,

TX); Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). All product purity ≥ 98% except dieldrin 90%.

b Mix containing Aroclor 1260 (58.9%), Aroclor 1254 (39.3%), 2,4,4’-triclorobiphenyl (PCB 28;

1.0%), 2,2’,4,4’-tetrachlorobiphenyl (PCB 47; 0.8%), 3,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyl (PCB 126;

0.02%), and 3,3’, 4,4’-tetrachlorobiphenyl (PCB 77; 0.004%).

110

Table 2. Cell lines characteristics

Cell lines Cancer type Hormone

dependency Steroid receptors

ERα ERβ AR

CAMA-1 Adenocarcinoma + +++ + +++

T47D Ductal carcinoma + +++ + ++

MCF7 Adenocarcinoma + +++ + ++

MDAMB231 Adenocarcinoma - - + -

CV-1 - - - -

AR : androgen receptor

ER : estrogen receptor

111

Figure 1 : Proliferative effects induced by the OC mixture in different cell lines

0.0

0.5

1.0

1.5

fold

indu

ctio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

fold

iond

uctio

n

0.0

1.0

2.0

3.0

fold

indu

ctio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

fold

indu

ctio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

vehicle 100 50 20 10 5

OC mixture dilution (X1000)

fold

indu

ctio

n

A

B

C

D

E

*

**

***

** ******

** *** ***

***

Mix dilution (x 10-3 )

112

Figure 2 : Effect of the OC mixture on cell cycle entry of breast cancer cell lines

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00C

AM

A-1

G2/MSG0/G1

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

without ICI 182,720 with ICI 182,720

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

T47-

D

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

MC

F-7

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

vehi

cle 20 10 5

mix dilution ( X 1 000 )

MD

AM

B23

1

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

vehi

cle 20 10 5

mix dilution ( X 1 000 )

* **

* *

x 10-3x 10-3Mix dilution (x 10-3 ) Mix dilution (x 10-3 )

A E

FB

C G

HD

113

Figure 3 : Effect of the OC mixture on the proliferation of CAMA-1 cells in the presence of sex hormones

0

1

2

3

4

100 50 20 10 5

Mix (dilution X1000)

10 pM E2

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

4

5

100 50 20 10 5

Mix dilution (X1000)

100 pM E2

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

4

5

100 50 20 10 5

Mix dilution (X1000)

500 pM DHT

100pM E2

fold

indu

ctio

n

A

B

C

*

**

***

***

***

†




114

Figure 4 : Proliferative effects induced by constituents of the OC mixture in CAMA-1 cells in the absence (A-D) or presence of sex steroids (E-H).

E2 (100 pM) - + + + + + + + +DHT (500 pM) - - + + + + + + +Tested compound (µM) - - - 0.1 0.5 1 2 5 10TestCompound (µM)

0

1

2fo

ld in

duct

ion

0

1

2

fold

indu

ctio

n

0

1

2

fold

indu

ctio

n

0

1

2

vehi

cle

0.1

0.5 1 2 5 10

Concentration (µM)

fold

indu

ctio

np.p’-DDT

p.p’-DDD

p.p’-DDE

PCBs

***

*

*

A

B

C

D

0

1

2

3

4

5

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

4

5

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

4

5

6fo

ld in

duct

ion

0

1

2

3

4

5

fold

indu

ctio

n

p.p’-DDT

p.p’-DDD

p.p’-DDE

PCBs

†

†††

†

E

F

G

H

p,p’-DDT p,p’-DDT

p,p’-DDD p,p’-DDD

p,p’-DDE p,p’-DDE

115

Chapitre 3

Le p,p’-dichlorodiphényldichloroéthylène perturbe l’équilibre

entre les voies de communication estrogéniques et

androgéniques qui contrôlent la prolifération des cellules

tumorales mammaires hormono-dépendantes

116

Contribution Ce manuscrit a été accepté pour publication dans la revue Breast Cancer. Pour cette étude,

j’ai effectué la totalité des expériences et participé aux analyses statistiques. De plus, j’ai

rédigé le premier jet de l’article et participé à la rédaction de sa forme finale.

Résumé Les voies de signalisation influencées par les estrogènes et les androgènes exercent des

effets opposés sur la prolifération des cellules tumorales mammaires hormono-

dépendantes. Nous avons précédemment rapporté que des concentrations plasmatiques

élevées de p,p'- dichlorodiphényldichloroéthylène (p,p'-DDE), le principal métabolite de

l'insecticide DDT et un antagoniste reconnu du récepteur des androgènes, sont associées à

l'agressivité des tumeurs chez les femmes diagnostiquées avec un cancer de sein. Nous

avons tenté de déterminer la plausibilité biologique de cette association en examinant l'effet

du p,p'-DDE sur la prolifération des cellules CAMA-1, une lignée cellulaire tumorale du

sein qui exprime le récepteur des estrogènes alpha et le récepteur des androgènes (AR), en

présence de concentrations physiologiques d’estrogènes et d’androgènes dans le milieu de

culture cellulaire. La prolifération des cellules CAMA-1 a été déterminée dans des plaques

96 puits suivant un traitement de neuf jours avec le p,p'-DDE (0.1-10 µM) seul ou en

combinaison avec l'estradiol (E2; 100 pM) et la dihydrotestostérone (DHT ; 100, 500 ou

1000 pM). Nous avons également évalué les modifications induites par le p,p'-DDE dans

l'entrée du cycle cellulaire et dans l'expression de gènes dépendants des stéroïdes sexuels

ESR1, AR, CCND1 et TFF1/pS2 (mRNA et/ou protéine). Nous avons observé que le

traitement avec le p,p'-DDE résulte en une augmentation de la prolifération des cellules

CAMA-1 en fonction de sa concentration, en présence de concentrations physiologiques

d’estrogènes et d’androgènes. Cette activité n’est pas observée en l'absence des stéroïdes

sexuels dans le milieu de culture cellulaire. Un effet semblable du p,p'-DDE a été observé

sur la prolifération des cellules MCF7-AR1, une lignée cellulaire sensible aux estrogènes

qui a été modifiée génétiquement pour surexprimer AR. Lorsque la DHT a été ajoutée au

milieu de culture en présence de E2 il a diminué le recrutement des cellules CAMA-1 dans

la phase S et l'expression de ESR1 et CCND1 comparativement aux cellules traitées avec E2

seulement. Ces effets androgéniques ont été bloqués par le p, p'-DDE avec une efficacité

semblable à celle de l’hydroxyflutamide, un puissant antiandrogène. Nos résultats

suggèrent que le p,p'-DDE peut augmenter la progression des cancers du sein en s'opposant

à la voie des androgènes qui réduit la prolifération des cellules tumorales hormono-

118

dépendantes. L’implication possible des antiandrogènes environnementaux dans la

carcinogenèse mammaire mérite d'autres investigations.

119

p,p’-Dichlorodiphenyldichloroethylene disrupts the estrogen-androgen balance

regulating the growth of hormone-dependent breast cancer cells






Pierre Ayotte, PhD


945 avenue Wolfe


Phone: 418-650-5115

Fax: 418-654-2148


120

Abstract Estrogen and androgen signalling pathways exert opposing influences on the proliferation

of mammary epithelial and hormone-dependent breast cancer cells. We previously reported

that plasma concentrations of 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene (p,p’-DDE),

the main metabolite of the insecticide DDT and a potent androgen antagonist, were

associated with tumor aggressiveness in women diagnosed with breast cancer. We sought

to examine the biological plausibility of this association by testing the effect of p,p’-DDE

on the proliferation of CAMA-1 cells, a human breast cancer cell line that expresses the

estrogen receptor alpha (ERα) and the androgen receptor (AR), in the presence of

physiological concentrations of estrogens and androgens in the cell culture medium. The

proliferation of CAMA-1 cells was determined in 96-well plates following a 9-day

treatment with p,p’-DDE alone (0.1-10 µM) or in combination with estradiol (E2; 100 pM)

and dihydrotestosterone (DHT; 100, 500 or 1000 pM). We also assessed p,p’-DDE-induced

modifications in cell cycle entry and the expression of the sex-steroid dependent genes

ESR1, AR, CCND1 and TFF1 (pS2) (mRNA and/or protein). We found that treatment with

p,p’-DDE induced a dose-response increase in the proliferation of CAMA-1 cells when

cultivated in the presence of physiological concentrations of estrogens and androgens, but

not in the absence of sex steroids in the cell culture medium. A similar effect of p,p’-DDE

was noted on the proliferation of MCF7-AR1 cells, an estrogen responsive cell line that

was genetically engineered to over express the AR. DHT added together with E2 to the cell

culture medium decreased the recruitment of CAMA-1 cells in the S phase and the

expression of ESR1 and CCND1, by comparison with cells treated with E2 alone. These

androgen-mediated effects were blocked with similar efficacy by p,p’-DDE and the potent

antiandrogen hydroxyflutamide. Our results suggest that p,p’-DDE could increase breast

cancer progression by opposing the androgen signalling pathway that inhibits growth in

hormone-responsive breast cancer cells. The potential role of environmental antiandrogens

in breast carcinogenesis deserves further investigations.

121

Introduction Breast cancer is the most common cancer in women with more than 1,000,000 new cases

occurring in year 2000 worldwide [1]. Risk factors for the disease include high plasma

estrogen levels [2], high level of expression of estrogen receptors in mammary tissue [3,4]

and high breast density as revealed by mammography screening [5]. The administration of

antiestrogens constitutes the most useful treatment for hormone-dependent breast cancer

[6] and was shown to be effective in preventing breast cancer in clinical trials [7].

In view of the pivotal role of estrogens in the pathogenesis of breast cancer, exposure to

xenobiotics that possess estrogenic properties, referred to as xenoestrogens, has been

suggested to explain the increase in the incidence of breast cancer noted over the last four

decades in industrialized countries. In vitro studies revealed that loss of normal cell cycle

control in hormone-dependent breast cancer cells can result from treatment with

xenoestrogens, as indicated by increased cell proliferation and modulation of estrogen-

sensitive molecular parameters [8,9]. However, the sum of evidence from several

epidemiological studies that investigated the relation between breast cancer and exposure

to persistent organochlorines, some of them with known estrogenic properties, does not

support a link between any of these compounds and breast cancer risk [10,11].

Environmental compounds that bind the androgen receptor (AR) constitute another class of

endocrine disruptors that have received growing interest over the last decade [12,13].

Androgens control the proliferation of mammary epithelial cells in non-human primates

[14,15] as well as that of several breast cancer cell lines [16,17]. Androgens were shown to

be effective in complementing the treatment of hormone-dependent breast cancer [18].

Furthermore, androgenic compounds can induce a remission after failure of antiestrogenic

therapy (reviewed in [19]). One may therefore anticipate that exposure to antiandrogens

could increase breast cancer risk or favor its progression.

1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene (p,p’-DDE), the main DDT metabolite, is a

highly persistent molecule that accumulates in body fat with age [20] and a potent

androgen antagonist [12]. We previously reported in the course of a case-control study on

122

organochlorine and breast cancer that among cases, plasma p,p’-DDE concentrations were

associated with the aggressiveness of breast cancer [21]. We speculated that this relation

could be explained by the antiandrogenic action of the compound on breast cancer cells

that would favor their proliferation and in turn breast cancer progression. In order to test

this hypothesis, we used CAMA-1 breast cancer cells cultivated in the presence of

physiologically-relevant concentrations of sex hormones as an in vitro model of breast

cancer progression. Both estrogen receptor α (ERα) and AR are expressed in CAMA-1

cells; estrogens stimulate their proliferation whereas androgens oppose the estrogen-

induced proliferative effect [22]. Here we show that p,p’-DDE can markedly increase the

proliferation of CAMA-1 cells in conditions where estrogens and androgens are competing

for the control of cell cycle gene expression.

Materials and methods Reagents. 17β-estradiol (E2) was purchased from Sigma (St. Louis, MO) and

dihydrotestosterone (DHT) from Steraloids (Newport, RI), whereas OHF was kindly

donated by Schering-Plough (Kenilworth, NJ). These compounds were dissolved in

ethanol. p,p’-DDE was purchased from Cerilliant (Round Rock, TX) and was dissolved in

dimethylsulfoxide. Final concentrations of vehicles in the cell culture medium were 0.1%

(v/v). Aprotinin, leupeptin, phenylmethylsulfonyl fluoride, and sodium orthovanadate were

purchased from Sigma.

Cell proliferation assays. CAMA-1 and MCF-7 cells were purchased from American

Type Culture Collection (Manassas, VA). MCF7-AR1 cells were kindly provided by Dr.

Ana M. Soto (Tufts University). CAMA-1 cells were maintained in phenol red-free RPMI

medium supplemented with 10% (v/v) foetal bovine serum (FBS) from Wisent (St.-Bruno,

QC, Canada), 1.0 mM pyruvate, 2.0 mM L-glutamine, 0.1 µg/ml streptomycin and 0.1

U/ml penicillin in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C. 2x103 cells/well were

seeded in 200 µl phenol-red free RPMI-10% FBS in 96 wells plate (6 wells per treatment)

and were incubated during 24 h at 37°C. The complete medium was then substituted for

FBS-free medium for a 24-h period. On day 1 of the experiment, the FBS-free medium was

replaced by a medium containing 10% dextran-coated charcoal-treated FBS (DCC-FBS)

123

from Wisent, the hormones and test chemicals (or vehicles). Cells were grown over a 9-day

period with a medium replacement every 3 days. The medium was then removed and

nucleic acids were stained using the CyQuant® kit purchased from Molecular Probes

(Eugene, OR) as described by the manufacturer. Cell proliferation for the control treatment

was arbitrarily set at 1 and results were expressed as fold induction over the control.

MCF-7 and MCF7-AR1 cells were maintained in phenol red-free DMEM supplemented

with 10% (v/v) FBS, 1.0 mM pyruvate, 2.0 mM L-glutamine, 0.1 µg/ml streptomycin, 0.1

U/ml penicillin and 1 µg/ml insulin in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C. 1x103

cells/well were seeded in 200 µl phenol-red free DMEM-10% FBS in 96 wells plate (6

wells per treatment) and were incubated during 24 h at 37°C. The complete medium was

removed and cells were washed with PBS. Then a medium containing 10% DCC-FBS, the

hormones and test chemicals (or vehicles) were added. Cells were grown over a 6-day

period without medium replacement and proliferation was assessed as described above for

CAMA-1 cells.

Cell cycle analysis. 50x103 cells/well were seeded in 1 ml phenol red-free RPMI-10% FBS

in 24-well plates and incubated during 24 h at 37°C. The medium was replaced by FBS-

free medium during 48 h to promote G0/G1 synchronization [23]. FBS-free medium was

then replaced by a medium containing 10% DCC-FBS, hormones and test chemicals (or

vehicles) for a 24-h incubation period at 37ºC. Cells were harvested following

trypsinization, fixed in 70% ethanol for 30 min at -30ºC and then stained with propidium

iodide (50 µg/ml) in PBS containing 40 U/ml RNase A for 1 h at 37ºC. The DNA content

in each cell was determined by flow cytometry analysis using the Wallac 1420 Multilabel

Counter from Perkin-Elmer Life Sciences (Wellesley, MA).

Gene expression levels. 2 x 106 cells were seeded into 10-cm dishes in 10 ml phenol red-

free RPMI-10% FBS and were incubated during 24 h at 37°C. The complete medium was

then substituted for FBS-free medium for a 24-h period. The FBS-free medium was

subsequently replaced by a medium containing 10% DCC-FBS, the hormones and test

chemicals (or vehicles) and cells were grown over a 24-h period. Duplicate cell cultures

were used for each treatment: one dish was used for RNA and the other for total cell

124

extracts. RNA was isolated with TRIzol® from Gibco (Grand Island, NY) as described by

the manufacturer and diluted in 40 µl of diethyl pyrocarbonate-treated H2O. mRNAs were

reverse transcribed by Super Script II™ using Oligo(dt) primer from Gibco as described by

the manufacturer in a final volume of 50 µl. An amount of 500 ng of total RNA was

included as template for each reaction. The amount of cDNA used for PCR reaction was

adjusted for each target gene. To assess ESR1 mRNA (forward primer: 5’-

AATTCAGATAATCGACGCCAG-3’; reverse: 5’-GTGTTTCAACATTCTCCCTC-CTC-

3’; Tm=58ºC; 344 bp) [24], a 10-µl aliquot of cDNA was used compared to 1 µl for β-

actin (forward primer: 5'-CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC-3'; reverse: 5'-

CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3'; Tm=58ºC; 375 bp) [25], while 10 µl and 5 µl

of amplified product were loaded on a 8% polyacrylamide gel for ESR1 and β-actin,

respectively. To evaluate mRNAs for CCND1 (forward primer: 5'-

CGGAGGAGAACAAACAGATC-3'; reverse: 5'-GGGTGTGCAAGCCAGGTCCA-3';

Tm=55ºC; 350 bp) [26] and AR (forward primer: 5-GTCAAAAGCGAAATGGGCCCC-

3’; reverse: 5-CTTCTGGGTTGTCTCCTCAGT-3’; Tm=60ºC; 420 bp) [27], we used 5-µl

aliquots of cDNA for both genes and a 2-µl aliquot for β-actin, while 10 µl of amplified

products were loaded on the gel. To evaluate mRNAs for TFF1 (forward primer: 5'-

TTTGGAGCAGAGAGGAGGCAATGG-3'; reverse: 5'-

TGGTATTAGGATAGAAGCACCAGGG-3'; Tm=58ºC; 240 bp) [28], we used 2-µl

aliquots of cDNA and a 2-µl aliquot for β-actin, while 10 µl of amplified products were

loaded on the gel. Taq DNA polymerase and deoxynucleotides (Roche, Basel, Switzerland)

were used as described by the manufacturer in a 50-µl final volume. The PCR settings were

adjusted to complete each reaction within the linear portion of amplification. PCR

conditions were one 5-min cycle at 95°C, 25 (β-actin) or 30 cycles (target mRNAs) each

comprising a 30-sec step at 95°C, followed by a 30-sec step at primer specific annealing

temperature and a 45-sec step at 72°C, and one last cycle of 7 min at 72°C. Negative

controls were included for each reaction. PCR products were stained with ethidium

bromide and captured with a 16-bit camera. Densitometry was determined by Quantity One

1-D Software Analysis from Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) and normalized with β-

actin.

125

Immunoblotting. Floating cells were recovered with the medium and pooled with the

adherent cells that were harvested by scraping in 2 ml of ice-cold PBS, centrifuged and

then resuspended in 600 µl of lysis buffer containing 50 mM Hepes, pH 7.5; 1 mM EGTA,

pH 8; 150 mM NaCl; 1.5 mM MgCl2; 10 mM sodium pyrophosphate; 200 µM sodium

orthovanadate; 100 mM NaF; 1% Triton X-100; 10% glycerol and a protease inhibitor

cocktail from EMD Biosciences (San Diego, CA). Insoluble material was removed by

centrifugation (10 min at 13000 x g). 30 µg of the cellular extract was resolved on

PROTEAN® II (Bio-Rad) 10% SDS-polyacrylamide gels. The proteins were electroblotted

onto 0.45-µM polyvinyl difluoride membranes purchased from Millipore (Bedford, MA).

Membranes were blocked at room temperature for 1 h in PBS containing 5% (wt/v) dried

milk and incubated 2 h at 37°C with the specific antibody diluted in PBS containing 1%

(wt/v) dried milk. Antibodies against ERα, AR and cyclin D1 were purchased from Santa

Cruz (Santa Cruz, CA) and anti-actin was from Cederlane Laboratories (Hornby, ON,

Canada). Membranes were washed in PBS containing 0.1% (v/v) Tween 20 followed by a

1-h incubation with specific IgG horseradish peroxidase conjugated antibodies from

Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA) and then incubated in Immun

Star HRP Substrate (Bio-Rad) as described by the manufacturer. Signals were analysed as

described above for RT-PCR and were normalized for actin within the same membrane

according to the method of Liao et al. [29].

Statistical analyses. Concentration-response relationships were tested using linear

regression analysis. Group means were compared using an analysis of variance (ANOVA)

with specific contrasts or an ANOVA followed by the Bonferroni post hoc test. One–tail

tests were performed for cell proliferation experiments because of a priori hypotheses

regarding treatment effects i.e. inhibition for androgens and induction for antiandrogens).

All other tests were two-sided. All statistical analyses were performed using the SPSS for

Windows software (v. 11.5.0; SPSS Inc, Chicago, IL).

Results. Level of expression of ERα and AR in cell linesFigure 1 displays the relative

levels of ERα and AR in CAMA-1, MCF7-AR1 and wild-type MCF-7 cells. CAMA-1 and

MCF7-AR1 cells expressed respectively 6.5-fold (P < 0.01) and 7.5-fold (P < 0.01) more

126

AR proteins compared to wild-type MCF-7 cells, whereas ERα expression levels were not

different among the cell lines. Because of their high levels of expression of ERα and AR,

CAMA-1 and MCF7-AR1 cells were used to investigate the capacity of p,p’-DDE to

disrupt the estrogen-androgen balance and increase cell proliferation.

Cell proliferation. Before testing the effect of the environmental antiandrogen p,p’-DDE

on cell growth, we first assessed the proliferative response of CAMA-1 cells in the

presence of estrogens and androgens in the cell culture medium over a 9-day period. Figure

2a shows the concentration-response relationship for E2-induced proliferation of CAMA-1

cells. We used a 100-pM concentration of E2 which generates near maximal proliferation,

in combination with increasing concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and observed

an inverse dose-response relationship between androgen concentrations (log-transformed)

and cell proliferation (regression coefficient (β) = -0.887, P < 0.001; Fig. 2b). Combined

treatment with 100 pM, 500 pM or 1000 pM DHT reduced the E2-induced proliferative

response by respectively 27% (P < 0.05), 54% (P < 0.001) and 60% (P < 0.001).

In order to investigate the potential of p,p’-DDE to increase the proliferation of CAMA-1

cells cultivated in the presence of endogenous estrogens and androgens, increasing

concentrations of p,p’-DDE were added to the cell culture medium together with E2 and

DHT. p,p’-DDE induced concentration-related increases in CAMA-1 cell proliferation in

the presence of 100 pM E2 and DHT added at a concentration of either 100 pM (β = 0.674,

P < 0.001; Fig. 3a), 500 pM (β = 0.629, P < 0.001; Fig. 3b) or 1000 pM (β = 0.663, P <

0.001; Fig. 3c). Concentrations of p,p’-DDE as low as 2 µM caused a statistically-

significant increase in cell proliferation compared to the E2+DHT treatment (P < 0.01; Fig.

3a and 3b); the 5-µM concentration completely abolished the inhibitory effect of DHT on

cell proliferation. In the absence of sex steroid hormones, p,p’-DDE added to the cell

culture medium only induced a slight proliferative response (1.3 fold induction at 10 µM, P

< 0.01; Fig. 3d).

The capacity of p,p’-DDE to increase breast cancer cell proliferation in the presence of sex

steroids was also tested in MCF7-AR1 cells. Szelei et al., who genetically engineered these

127

cells that over express the AR, previously reported that DHT added together to E2

decreased the proliferation of MCF7-AR1 cells compared to treatment with E2 alone [30].

We observed that p,p’-DDE induced a concentration-related increase in MCF7-AR1

proliferation in the presence of 10 pM E2 and 100 pM DHT (β = 0.513, P = 0.01; Fig. 4a).

A 2-µM concentration of p,p’-DDE caused a 2-fold increase in cell proliferation compared

to the E2+DHT treatment (P < 0.05). In the absence of sex steroid hormones, p,p’-DDE

added to the cell culture medium also induced a significant proliferative response (2.9 and

3.6 fold induction at 5 and 10 µM respectively, P < 0.001; Fig. 4b).

Recruitment of CAMA-1 cells in S phase. In order to better characterize the proliferative

response induced by p,p’-DDE on CAMA-1 cells, we measured cell transition from the

G0/G1 to the S phase after a 24-h treatment with p,p’-DDE in the presence of sex steroid

hormones, and compared results to those obtained with the potent antiandrogen OHF.

Adding 1 nM DHT in combination with 1 nM E2 reduced by more than 50% (P < 0.05) the

percentage of cells in the S phase observed in the presence of 1 nM E2 alone (Fig. 5a). The

addition of either 10 µM p,p’-DDE or 1 µM OHF to the cell culture medium completely

abolished the androgen-mediated decrease in the percentage of CAMA-1 cells entering the

cell cycle (P < 0.05 vs E2+DHT treatment). Treatment-induced changes in the percentage

of cells in G0/G1 were of similar magnitude to those observed for the S phase but in the

opposite direction (Fig. 5b). The proportion of cells in the G2/M phase was slightly

increased by the 1-nM E2 treatment (P < 0.05) but adding DHT and antiandrogens in

combination with E2 did not modify the E2-induced response (Fig. 5c).

Modification of sex-steroid dependent gene expression by p,p’-DDE. To further

elucidate the mechanism underlying the induction of CAMA-1 cell proliferation by p,p’-

DDE, we studied the effect of a 24-h treatment with p,p’-DDE on the expression of sex

hormone-sensitive genes at the mRNA level, in presence of E2 and DHT, and compared the

results to those obtained by treating the cells with OHF in combination with the

endogenous hormones. The mean cyclin D1 mRNA level was increased by 50% (P < 0.01)

in E2-treated cells compared to that of the control cells (Fig. 6a), while 1 nM DHT

significantly reduced this estrogenic effect (P < 0.01 vs E2 alone). Treatment with either 10

128

µM p,p’-DDE or 1 µM OHF partly abolished the inhibition of cyclin D1 expression

induced by DHT, resulting in mean expression levels that are not significantly different

from that induced by E2 alone. Although E2 alone did not modulate ERα mRNA

expression, the E2+DHT treatment appeared to decrease the mean expression level

compared to that induced by E2 alone (Fig. 6b), while p,p’-DDE or OHF partly offset this

down regulation. However, differences between treatments did not reach statistical

significance. AR mRNA mean expression level was decreased by 27% following DHT

treatment compared to E2 treatment (P < 0.01; Fig. 6c) while treatment with either 10 µM

p,p’-DDE or 1 µM OHF completely antagonised this inhibition (P < 0.01 vs E2+DHT). pS2

mRNA mean expression level was increased by 50% (P < 0.01) following E2 treatment

compared to the control DHT (Fig. 6d). The E2+DHT treatment induced a slightly lower

expression of pS2 mRNA compared to that caused by E2 alone, but the difference was not

statistically significant. p,p’-DDE added together with E2 and DHT induced a greater pS2

mRNA expression than did the E2+DHT treatment (P < 0.05).

We also evaluated the modulation of cyclin D1, ERα and AR protein expression levels by

p,p’-DDE treatment in CAMA-1 cells in the presence of endogenous sex steroids. Cyclin

D1 level was increased by 80% (P < 0.01) in cells treated with 1nM E2 compared to the

vehicle-treated cells (Fig. 7a), while adding 1nM DHT in combination with E2 blocked this

increase (P < 0.01 vs E2 alone). The addition of either 10 µM p,p’-DDE or 1 µM OHF to

the cell culture medium together with E2 and DHT completely abolished this DHT

mediated inhibition of cyclin D1 expression (P < 0.01 vs E2+DHT). While E2 alone was

without effect, the combined E2+DHT treatment markedly decreased ERα protein level

(more than 50 %) as compared to that observed following E2 treatment or control (P <

0.05; Fig. 7b). p,p’-DDE or OHF treatment again abolished this androgen-mediated

inhibition (P < 0.01 vs E2+DHT). A different response pattern was observed for AR protein

expression (Fig. 7c). E2 treatment decreased by 28% (P < 0.05) the mean AR protein

expression level compared to control, while AR protein level was significantly increased

following the combined E2+DHT treatment, compared to the value noted following E2

129

treatment alone (P < 0.01). The androgen-mediated increase in AR protein level was

antagonized by adding OHF in the incubation medium (P < 0.05 vs E2+DHT) but not p,p’-

DDE (Fig. 7c).

Discussion. We tested the capacity of p,p’-DDE to stimulate the proliferation of CAMA-1

cells, a human breast adenocarcinoma cell line that expresses both the estrogen receptor

alpha and the androgen receptor. We showed that p,p’-DDE strongly induces the

proliferation of CAMA-1 cells in a concentration-dependent manner, but only when cells

are grown in the presence physiological concentrations of endogenous sex steroid

hormones. When concentrations of E2 and DHT are such that the androgen signalling

pathway partly counteracts the influence of the estrogen-signalling pathway on cell

proliferation, p,p’-DDE blocks the androgen receptor, resulting in CCND1 overexpression,

the recruitment of cells in the S phase and in turn increased cell proliferation.

The capacity of the androgen DHT to inhibit the proliferation of CAMA-1 breast cancer

cells was previously reported by Lapointe and Labrie [22]. Similarly to our results, these

authors reported a dose-dependent inhibition of cell proliferation and maximal inhibition of

E2-stimulated proliferation at the 1-nM DHT concentration. Other groups have reported

that androgens can inhibit the proliferation of several hormone-dependent breast cancer cell

lines including MCF-7, T47D and ZR-75-1 cells [16,17]. We tested these and other wild-

type breast cancer cell lines but in our hands only CAMA-1 cells responded strongly and

reproducibly to androgens. We therefore elected to use CAMA-1 cells grown in the

presence of estrogens and androgens as an in vitro model for investigating the role of

environmental antiandrogens in breast cancer progression.

p,p’-DDE also induced the proliferation of MCF7-AR1 cells, in the presence of E2 and

DHT in the cell culture medium. These stably transfected cells that overexpress the AR are

derived from MCF-7 cells [30], an estrogen-sensitive breast cancer cell line that has been

widely used in proliferation assays for testing the estrogenic potential of chemicals (E-

Screen). In contrast to results with CAMA-1 cells, p,p’-DDE also increased the

proliferation of MCF7-AR1 cells in the absence of sex hormones (Fig. 4b). This direct

proliferative effect which is likely due to the estrogenic potential of p,p’-DDE was similar

130

to that obtained by other groups with native MCF-7 cells [31-33]. Therefore, activation of

the estrogenic pathway could be responsible in part for the induction of proliferation

observed when MCF7-AR1 cells were co-treated with p,p’-DDE, E2 and DHT (Fig. 4a).

Interestingly, in the presence of E2 and DHT, the proliferation of MCF7-AR1 cells was

induced by lower concentrations of p,p’-DDE than those required in the absence of sex

steroids. This could be explained by the greater affinity of p,p’-DDE for AR than for ERα

[12], resulting in the predominance of the AR-signalling pathway at low concentrations.

p,p’-DDE and several other compounds possess both antiandrogenic and estrogenic

activities [34] and may therefore increase breast cancer cell proliferation through

interference with both estrogenic and androgenic pathways.

Our data suggest that one of the key event in the mechanism of action through which p,p’-

DDE increases CAMA-1 cell proliferation is the up-regulation of CCND1 expression.

Indeed, we observed concomitant increases in CCND1 expression and S phase entry

following treatment with p,p’-DDE in the presence of sex steroids, compared with

responses induced by the E2+DHT treatment. This mechanism is apparently common to

antiandrogens in general as similar results were observed with OHF. Cyclin D1 is a major

regulator of the G1/S phase transition and a rate limiting step in estrogen-induced

mammary cell proliferation [35,36]. This oncogene has been shown to transform breast

cells in transgenic mice [37] and is frequently overexpressed in primary breast cancer,

especially in invasive carcinomas [38,39]. In our experiments, cyclin D1 protein expression

pattern was remarkably similar to its corresponding mRNA expression pattern, suggesting

that cyclin D1 expression is mostly controlled at the mRNA level in CAMA-1 cells.

Our results also suggest that ESR1 expression is involved in the mechanism through which

antiandrogens increase the expression of CCND1 in CAMA-1 cells. Indeed, we observed

similar treatment-related effects for the expression of CCND1 and ESR1: DHT decreased

the expression of both genes while treatment with either p,p’-DDE or OHF increased their

expression, in the presence of E2 and DHT. ERα has been shown to be an important

transcription factor that acts indirectly on the CCND1 promoter [40-42]. That androgens

131

can down regulate the expression of ERα was previously reported in the ZR-75-1 breast

cancer cell line and in MCF7-AR1 cells [30,43].

We did not observe a reduction in ERα protein expression following treatment of CAMA-1

cells with E2. This result is in contrast to those reported in the literature showing that

estrogens induce a down regulation of the ERα protein in hormone-dependent breast

cancer cell lines as well as in transfected ER-negative cells lines [44-49]. The estrogen-

induced down regulation of ERα occurs mainly through the regulated degradation of the

receptor protein by the 26S proteasome [49,50]. Hence CAMA-1 cells appear different than

other breast cancer cell lines in that regard.

We found that the AR protein is down-regulated by estradiol, without any effect on the

corresponding mRNA level. Therefore this down regulation may occur either at the level of

translation or through a decrease in AR stability. In contrast, DHT caused a significant

increase in AR protein level in CAMA-1 cells. Similarly to our results, Ando et al.

observed that the activation of AR by DHT resulted in the inhibition of MCF-7 cell

proliferation; this effect was accompanied by an increase in AR protein cell content [51].

Our results are compatible with the existence of a cross-talk between androgen and

estrogen-signalling pathways that controls breast cancer cell proliferation, similarly to that

described by Lanzino et al. in MCF-7 cells [52]. These authors showed that AR activation

influences ERα signalling by reducing ERα cellular content and by competition to recruit

the coregulator ARA70, which although first described as a specific AR coregulator [53]

also increases the transcriptional activity of ERα [52]. We speculate that binding of p,p’-

DDE to the AR would increase the amount of ARA70 available to interact with ERα,

thereby increasing the estrogenic signalling pathway and in turn cell proliferation.

Additional experiments are needed to substantiate this mechanism of action in CAMA-1

cells.

Some evidence in the literature indicates that exposure to antiandrogens could increase

breast cancer risk through perturbation of the androgen-estrogen cross-talk in mammary

epithelial cells. Dimitrakakis et al. [15] have reported an increase in mammary epithelial

132

cell proliferation following treatment of female rhesus monkeys with flutamide (the

precursor of OHF). Furthermore, a down regulation of ERα expression and a decrease in

mammary epithelial cell proliferation were observed following treatment of ovariectomized

rhesus monkeys with a combined estradiol/testosterone treatment, compared to the group

treated with estradiol alone [15]. ERα is weakly expressed in normal mammary epithelial

cells and only a few cells express this gene [54], including the putative breast stem cells

[55]. A rigorous control must be exerted on ERα expression in order to limit the number of

“at risk” and precancerous cells in the breast [54], which may be compromised by

environmental antiandrogens.

Our results add biological plausibility to the association observed in our previous

epidemiological study between plasma levels of p,p’-DDE and the aggressiveness of breast

cancer. We observed that women with breast cancer who had higher plasma concentrations

of this compound were at greater risk of having a larger tumor and axillary lymph node

invasion than women with lower concentrations [21]. Although the information is

extremely limited, the association between organochlorines and disease severity and

progression is interesting and worthy of further investigation [11]. By blocking the

androgenic pathway, p,p’-DDE may favor the proliferation of normal and breast cancer

cells and accelerate breast cancer progression. Our results appear particularly relevant for

cases with tumors expressing high levels of ERα and AR. In that context, it is worth

mentioning that 70-90% of primary breast tumors express the AR (reviewed in [56]).

We also observed that p,p’-DDE increased the expression of pS2 in CAMA-1 cells (Fig.

6d), an estrogen dependent protein that increases the migration of hormone-dependent

breast cancer cells [57]. The failure of OHF to increase pS2 expression over the level

induced by the E2+DHT treatment suggests that this effect may be due to the estrogenic

activity of p,p’-DDE. Normal breast cells secrete low levels of this chemoattractant trefoil

protein [58]. This effect of p,p’-DDE could contribute to breast cancer aggressiveness.

Additional experiments with animal models are required to further support this hypothesis.

133

To our knowledge, this is the first report showing that p,p’-DDE can significantly stimulate

the proliferation of a breast cancer cell line in the presence of androgens and estrogens. Our

model is unique in that compounds are tested for their capacity to stimulate cell

proliferation in the presence of physiologically-relevant concentrations of sex steroids.

Although tests based on the proliferation of hormone-dependent breast cancer cells have

been used extensively in the past, none of them can detect compounds that perturb the

crosstalk between estrogenic and androgenic pathways [59]. This experimental model

could be used to screen for compounds that can increase breast cancer progression, either

because of their estrogenic potential, their antiandrogenic capacity or a combination of both

since many environmental estrogens are also androgen receptor antagonists [34].

Conclusions. Our study provides new evidence that environmental antiandrogens might

favor breast cancer progression. Figure 8 illustrates part of the mechanism through which

p,p’-DDE may induce the proliferation of hormone-dependent cells in the breast.

Additional investigations are underway to investigate the effect on breast cancer cell

proliferation of a complex mixture of environmental chemicals that comprises compounds

with estrogenic and antiandrogenic activities.

Reference List 1. Parkin DM, Bray FI, Devesa SS: Cancer burden in the year 2000. The global

picture. Eur J Cancer 2001, 37 Suppl 8: S4-66. 2. Missmer SA, Eliassen AH, Barbieri RL, Hankinson SE: Endogenous

estrogen, androgen, and progesterone concentrations and breast cancer risk among postmenopausal women. J Natl Cancer Inst 2004, 96: 1856-1865.

3. Kurebayashi J, Otsuki T, Kunisue H, Tanaka K, Yamamoto S, Sonoo H:

Expression levels of estrogen receptor-alpha, estrogen receptor-beta, coactivators, and corepressors in breast cancer. Clin Cancer Res 2000, 6: 512-518.

134

4. Khan SA, Rogers MA, Khurana KK, Siddiqui JF: Oestrogen receptor expression in normal breast epithelium. Eur J Cancer 2000, 36 Suppl 4: S27-S28.

5. Boyd NF, O'Sullivan B, Campbell JE, Fishell E, Simor I, Cooke G et al.:

Mammographic signs as risk factors for breast cancer. Br J Cancer 1982, 45: 185-193.

6. Wallgren A, Baral E, Glas U, Karnstrom L, Nordenskiold B, Theve NO et

al.: Adjuvant tamoxifen treatment in postmenopausal patients with operable breast cancer. J Steroid Biochem 1985, 23: 1161-1162.

7. Fisher B, Costantino JP, Wickerham DL, Redmond CK, Kavanah M, Cronin

WM et al.: Tamoxifen for prevention of breast cancer: report of the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project P-1 Study. J Natl Cancer Inst 1998, 90: 1371-1388.

8. Jorgensen M, Vendelbo B, Skakkebaek NE, Leffers H: Assaying

estrogenicity by quantitating the expression levels of endogenous estrogen-regulated genes. Environ Health Perspect 2000, 108: 403-12.

9. Diel P, Olff S, Schmidt S, Michna H: Effects of the environmental estrogens

bisphenol A, o,p'-DDT, p-tert-octylphenol and coumestrol on apoptosis induction, cell proliferation and the expression of estrogen sensitive molecular parameters in the human breast cancer cell line MCF-7. J Steroid Biochem Mol Biol 2002, 80: 61-70.

10. Lopez-Cervantes M, Torres-Sanchez L, Tobias A, Lopez-Carrillo L:

Dichlorodiphenyldichloroethane burden and breast cancer risk: a meta-analysis of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect 2004, 112: 207-214.

11. Mendez MA, Arab L: Organochlorine compounds and breast cancer risk .

Pure Appl Chem 2003, 75: 1973-2015. 12. Kelce WR, Stone CR, Laws SC, Gray LE, Kemppainen JA, Wilson EM:

Persistent DDT metabolite p,p'-DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature 1995, 375: 581-585.

13. Wilson VS, Lambright C, Ostby J, Gray LE, Jr.: In vitro and in vivo effects

of 17beta-trenbolone: a feedlot effluent contaminant. Toxicol Sci 2002, 70: 202-211.

14. Zhou J, Ng S, Adesanya-Famuiya O, Anderson K, Bondy CA: Testosterone

inhibits estrogen-induced mammary epithelial proliferation and suppresses estrogen receptor expression. FASEB J 2000, 14: 1725-1730.

135

15. Dimitrakakis C, Zhou J, Wang J, Belanger A, Labrie F, Cheng C et al.: A physiologic role for testosterone in limiting estrogenic stimulation of the breast. Menopause 2003, 10: 292-298.

16. Birrell SN, Bentel JM, Hickey TE, Ricciardelli C, Weger MA, Horsfall DJ

et al.: Androgens induce divergent proliferative responses in human breast cancer cell lines. J Steroid Biochem Mol Biol 1995, 52: 459-467.

17. Ortmann J, Prifti S, Bohlmann MK, Rehberger-Schneider S, Strowitzki T,

Rabe T: Testosterone and 5 alpha-dihydrotestosterone inhibit in vitro growth of human breast cancer cell lines. Gynecol Endocrinol 2002, 16: 113-120.

18. Tormey DC, Lippman ME, Edwards BK, Cassidy JG: Evaluation of

tamoxifen doses with and without fluoxymesterone in advanced breast cancer. Ann Intern Med 1983, 98: 139-144.

19. Colleoni M, Coates A, Pagani O, Goldhirsch A: Combined chemo-endocrine

adjuvant therapy for patients with operable breast cancer: still a question? Cancer Treat Rev 1998, 24: 15-26.

20. Guttes S, Failing K, Neumann K, Kleinstein J, Georgii S, Brunn H:

Chlororganic pesticides and polychlorinated biphenyls in breast tissue of women with benign and malignant breast disease. Arch Environ Contam Toxicol 1998, 35: 140-147.

21. Demers A, Ayotte P, Brisson J, Dodin S, Robert J, Dewailly E: Risk and

aggressiveness of breast cancer in relation to plasma organochlorine concentrations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000, 9: 161-166.

22. Lapointe J, Labrie C: Role of the cyclin-dependent kinase inhibitor

p27(Kip1) in androgen-induced inhibition of CAMA-1 breast cancer cell proliferation. Endocrinology 2001, 142: 4331-4338.

23. Leung BS, Potter AH: Mode of estrogen action on cell proliferative kinetics

in CAMA-1 cells. I. Effect of serum and estrogen. Cancer Invest 1987, 5: 187-194. 24. Enmark E, Pelto-Huikko M, Grandien K, Lagercrantz S, Lagercrantz J,

Fried G et al.: Human estrogen receptor beta-gene structure, chromosomal localization, and expression pattern. J Clin Endocrinol Metab 1997, 82: 4258-4265.

25. Lipman ML, Stevens AC, Bleackley RC, Helderman JH, McCune TR,

Harmon WE et al.: The strong correlation of cytotoxic T lymphocyte-specific serine protease gene transcripts with renal allograft rejection. Transplantation 1992, 53: 73-79.

136

26. Willey JC, Crawford EL, Jackson CM, Weaver DA, Hoban JC, Khuder SA et al.: Expression measurement of many genes simultaneously by quantitative RT-PCR using standardized mixtures of competitive templates. Am J Respir Cell Mol Biol 1998, 19: 6-17.

27. Ito K, Suzuki T, Akahira J, Moriya T, Kaneko C, Utsunomiya H et al.:

Expression of androgen receptor and 5alpha-reductases in the human normal endometrium and its disorders. Int J Cancer 2002, 99: 652-657.

28. Gillesby BE, Zacharewski TR: pS2 (TFF1) levels in human breast cancer

tumor samples: correlation with clinical and histological prognostic markers. Breast Cancer Res Treat 1999, 56: 253-265.

29. Liao J, Xu X, Wargovich MJ: Direct reprobing with anti-beta-actin antibody

as an internal control for western blotting analysis. Biotechniques 2000, 28: 216-218.

30. Szelei J, Jimenez J, Soto AM, Luizzi MF, Sonnenschein C: Androgen-

induced inhibition of proliferation in human breast cancer MCF7 cells transfected with androgen receptor. Endocrinology 1997, 138: 1406-1412.

31. Andersen HR, Andersson AM, Arnold SF, Autrup H, Barfoed M, Beresford

NA et al.: Comparison of short-term estrogenicity tests for identification of hormone-disrupting chemicals. Environ Health Perspect 1999, 107 Suppl 1: 89-108.

32. Payne J, Jones C, Lakhani S, Kortenkamp A: Improving the reproducibility

of the MCF-7 cell proliferation assay for the detection of xenoestrogens. Sci Total Environ 2000, 248: 51-62.

33. Rasmussen TH, Nielsen F, Andersen HR, Nielsen JB, Weihe P, Grandjean

P: Assessment of xenoestrogenic exposure by a biomarker approach: application of the E-Screen bioassay to determine estrogenic response of serum extracts. Environ Health 2003, 2: 12.

34. Sohoni P, Sumpter JP: Several environmental oestrogens are also anti-

androgens. J Endocrinol 1998, 158: 327-339. 35. Zwijsen RM, Klompmaker R, Wientjens EB, Kristel PM, van der BB,

Michalides RJ: Cyclin D1 triggers autonomous growth of breast cancer cells by governing cell cycle exit. Mol Cell Biol 1996, 16: 2554-2560.

36. Lukas J, Bartkova J, Bartek J: Convergence of mitogenic signalling cascades

from diverse classes of receptors at the cyclin D-cyclin-dependent kinase-pRb-controlled G1 checkpoint. Mol Cell Biol 1996, 16: 6917-6925.

137

37. Wang TC, Cardiff RD, Zukerberg L, Lees E, Arnold A, Schmidt EV: Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-cyclin D1 transgenic mice. Nature 1994, 369: 669-671.

38. Zhang SY, Caamano J, Cooper F, Guo X, Klein-Szanto AJ:

Immunohistochemistry of cyclin D1 in human breast cancer. Am J Clin Pathol 1994, 102: 695-698.

39. Bartkova J, Lukas J, Muller H, Lutzhoft D, Strauss M, Bartek J: Cyclin D1

protein expression and function in human breast cancer. Int J Cancer 1994, 57: 353-361.

40. Planas-Silva MD, Shang Y, Donaher JL, Brown M, Weinberg RA: AIB1

enhances estrogen-dependent induction of cyclin D1 expression. Cancer Res 2001, 61: 3858-3862.

41. Cicatiello L, Addeo R, Sasso A, Altucci L, Petrizzi VB, Borgo R et al.:

Estrogens and progesterone promote persistent CCND1 gene activation during G1 by inducing transcriptional derepression via c-Jun/c-Fos/estrogen receptor (progesterone receptor) complex assembly to a distal regulatory element and recruitment of cyclin D1 to its own gene promoter. Mol Cell Biol 2004, 24: 7260-7274.

42. Eeckhoute J, Carroll JS, Geistlinger TR, Torres-Arzayus MI, Brown M: A

cell-type-specific transcriptional network required for estrogen regulation of cyclin D1 and cell cycle progression in breast cancer. Genes Dev 2006, 20: 2513-2526.

43. Poulin R, Simard J, Labrie C, Petitclerc L, Dumont M, Lagace L et al.:

Down-regulation of estrogen receptors by androgens in the ZR-75-1 human breast cancer cell line. Endocrinology 1989, 125: 392-399.

44. Valley CC, Metivier R, Solodin NM, Fowler AM, Mashek MT, Hill L et al.:

Differential regulation of estrogen-inducible proteolysis and transcription by the estrogen receptor alpha N terminus. Mol Cell Biol 2005, 25: 5417-5428.

45. Fan M, Nakshatri H, Nephew KP: Inhibiting proteasomal proteolysis

sustains estrogen receptor-alpha activation. Mol Endocrinol 2004, 18: 2603-2615. 46. Petrel TA, Brueggemeier RW: Increased proteasome-dependent degradation

of estrogen receptor-alpha by TGF-beta1 in breast cancer cell lines. J Cell Biochem 2003, 88: 181-190.

47. Lonard DM, Nawaz Z, Smith CL, O'Malley BW: The 26S proteasome is

required for estrogen receptor-alpha and coactivator turnover and for efficient estrogen receptor-alpha transactivation. Mol Cell 2000, 5: 939-948.

138

48. Wormke M, Stoner M, Saville B, Safe S: Crosstalk between estrogen

receptor alpha and the aryl hydrocarbon receptor in breast cancer cells involves unidirectional activation of proteasomes. FEBS Lett 2000, 478: 109-112.

49. Nawaz Z, Lonard DM, Dennis AP, Smith CL, O'Malley BW: Proteasome-

dependent degradation of the human estrogen receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96: 1858-1862.

50. Alarid ET, Bakopoulos N, Solodin N: Proteasome-mediated proteolysis of

estrogen receptor: a novel component in autologous down-regulation. Mol Endocrinol 1999, 13: 1522-1534.

51. Ando S, De Amicis F, Rago V, Carpino A, Maggiolini M, Panno ML et al.:

Breast cancer: from estrogen to androgen receptor. Mol Cell Endocrinol 2002, 193: 121-128.

52. Lanzino M, De Amicis F, McPhaul MJ, Marsico S, Panno ML, Ando S:

Endogenous coactivator ARA70 interacts with estrogen receptor alpha (ERalpha) and modulates the functional ER alpha/androgen receptor interplay in MCF-7 cells. J Biol Chem 2005, 280: 20421-20430.

53. Yeh S, Chang C: Cloning and characterization of a specific coactivator,

ARA70, for the androgen receptor in human prostate cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93: 5517-5521.

54. Shoker BS, Jarvis C, Sibson DR, Walker C, Sloane JP: Oestrogen receptor

expression in the normal and pre-cancerous breast. J Pathol 1999, 188: 237-244. 55. Clarke RB: Human breast cell proliferation and its relationship to steroid

receptor expression. Climacteric 2004, 7: 129-137. 56. Birrell SN, Butler LM, Harris JM, Buchanan G, Tilley WD: Disruption of

androgen receptor signaling by synthetic progestins may increase risk of developing breast cancer. FASEB J 2007, 21: 2285-2293.

57. Prest SJ, May FE, Westley BR: The estrogen-regulated protein, TFF1,

stimulates migration of human breast cancer cells. FASEB J 2002, 16: 592-594. 58. Luqmani YA, Campbell T, Soomro S, Shousha S, Rio MC, Coombes RC:

Immunohistochemical localisation of pS2 protein in ductal carcinoma in situ and benign lesions of the breast. Br J Cancer 1993, 67: 749-753.

59. Lackey BR, Gray SL, Henricks DM: Crosstalk and considerations in

endocrine disruptor research. Med Hypotheses 2001, 56: 644-647.

139

Figure legends Figure 1 Expression of sex-steroid receptors ERα and AR in CAMA-1, MCF-7 and

MCF7-AR1 breast cancer cell line at the protein level. Cell extracts were prepared during

exponential proliferation in maintenance medium containing 10% FBS. Immunoblots were

performed as described in materials and methods. (a) A representative immunoblot. (b)

Relative expression of sex-steroid receptors quantified to actin content. Each bar represents

the mean ± SEM of four independent experiments. Double asterisk indicates P < 0.01 vs

wild type MCF-7 cells as determined by an ANOVA followed by a Bonferroni post hoc

test.

Figure 2 Effects of E2 and DHT on the proliferation of CAMA-1 cells. E2 induces cell

proliferation in a concentration-dependent manner (a) while increasing concentrations of

DHT inhibit the proliferative response triggered by 100 pM E2 (b). Cell proliferation was

assessed after 9 days of treatment. Each bar represents the mean ± SEM of three (a) and

four (b) independent experiments. Asterisk indicates P < 0.05, double asterisk P < 0.01

and triple asterisk P < 0.001 versus E2 treatment by an ANOVA followed by a one-tail

Bonferroni post hoc test.

Figure 3 p,p’-DDE increases the proliferation of CAMA-1 cells in the presence of E2 and

DHT. E2 was added at a concentration of 100 pM and DHT at either 100 pM (a), 500 pM

(b) or 1000 pM (c). p,p’-DDE alone has little impact on CAMA-1 proliferation (d). Cell

proliferation was assessed after 9 days of treatment. Each bar represents the mean ± SEM

of four independent experiments. Double asterisk indicates P < 0.01 versus E2+DHT

treatment and †† indicates P < 0.01 versus 0.1 µM p,p’-DDE as determined by an ANOVA

followed by a one-tail Bonferroni post hoc test.

140

Figure 4 p,p’-DDE increases the proliferation of MCF7-AR1 cells in the presence of E2

and DHT (a) or when added alone to the cell culture medium (b). Cell proliferation was

assessed after 6 days of treatment. Each bar represents the mean ± SEM of four

independent experiments. A single asterisk indicates P < 0.05 vs E2+DHT treatment and

††† indicates P < 0.001 vs 0.1 µM p,p’-DDE as determined by an ANOVA followed by a

one-tail Bonferroni post hoc test.

Figure 5 p,p’-DDE increases G0/G1-S transition of CAMA-1 cells in the presence of E2

and DHT. Treatment-related changes are shown for the percentage of cells in S (a), G0/G1

(b) and G2/M (c) phases. Synchronization of the cells - 90% of cells in G0/G1 and less than

3% in S phase - was induced by a 48-h serum deprivation period. Cells were subsequently

treated during 24 h with hormones and antiandrogens (or their vehicles). Each bar

represents the mean ± SEM of four independent experiments in duplicate. Asterisk

indicates P < 0.05, double asterisk P < 0.01 and triple asterisk P < 0.001 vs control, †

indicates P < 0.05 vs E2 treatment and ‡ indicates P < 0.05 vs E2+DHT treatment as

determined by an ANOVA with specific contrasts.

Figure 6 p,p’-DDE modulates the expression of sex-steroid dependent genes in CAMA-1

cells at the mRNA level. mRNA levels were determined by a semi-quantitative PCR after a

24-h treatment with hormones and antiandrogens (or vehicles) as described in materials and

methods. mRNAs for CCND1 (a), ESR1 (b), AR (c) and TFF1 (d) were quantified relative

to β-actin mRNA. A representative gel electrophoresis is shown below each panel. Each

bar represents the mean ± SEM of six independent experiments. Double asterisk indicates

P < 0.01 vs control, †† indicates P < 0.01 vs E2 treatment, ‡ and ‡‡ indicate respectively P

< 0.05 and P < 0.01 vs E2+DHT treatment as determined by an ANOVA with specific

contrasts.

141

Figure 7 p,p’-DDE modulates the expression of sex-steroid dependent genes in CAMA-1

cells at the protein level. Immunoblots were performed after a 24-h of treatment with

hormones and antiandrogens (or vehicles) as described in materials and methods. Cyclin

D1 (a), ERα (b) and AR (c) protein levels were quantified relative to actin content. Each

bar represents the mean ± SEM of six independent experiments. A representative

immunoblot is shown below each panel. Asterisk indicates P < 0.05 and double asterisk P

< 0.01 vs control, † and †† indicate respectively P < 0.05 and P < 0.01 vs E2 treatment and

‡ and ‡‡ indicate respectively P < 0.05 and P < 0.01 vs E2+DHT treatment as determined

by an ANOVA with specific contrasts.

Figure 8 A proposed mechanism for p,p’-DDE induced proliferation of hormone-

dependent cells. Lipophilic p,p’-DDE is stored in adipocytes and can diffuse to reach

hormone-dependent cells. p,p’-DDE confers a proliferative advantage to precancerous

hormone-dependent cells by blocking the androgen receptor (AR) signalling pathway that

represses cell growth. Tumour development is favored through the up-regulation of the

oncogene CCND1, a key molecular event in the deregulation by p,p’-DDE of the crosstalk

between ERα and the AR. E2: 17 β-estradiol; DHT: dihydrotestosterone.

142

Figure 1 : Expression of sex-steroid receptors ERα and AR in CAMA-1, MCF-7 and MCF7-AR1 breast cancer cell line at the protein level.

a)

b)

0

0,5

1

1,5

CA

MA

-1

MC

F-7

MC

F7-A

R1

ER-alpha

AR

CA

MA

-1

MC

F-7

MC

F7-A

R1

AR

ER α

Actin

** **

Rel

ativ

e re

cept

orex

pres

sion

(a)

(b)

143

Figure 2 : Effects of E2 and DHT on the proliferation of CAMA-1 cells

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

n

E2 (pM) - 1 10

25 50 100 500 1000

E2 (100 pM) - + + + + +

DHT (pM) - - 10 100 500 1000

*

******

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

n

(a)

(b) (b)

**

****** ***

***

144

Figure 3 : p,p’-DDE increases the proliferation of CAMA-1 cells in the presence of E2 and DHT

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

n

0123

456

fold

indu

ctio

n

E2 (100 pM) - + + + + + + + + DHT - - + + + + + + + DDE (µM) - - - 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0

DDE (µM) - 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0

(a)

**DHT 100 pM **

**

DHT 500 pM

**

**

**

(c)

**DHT 1000 pM

**

††

DDE alone

(b)

(d)

145

Figure 4 : p,p’-DDE increases the proliferation of MCF7-AR1 cells in the presence of E2 and DHT

DDE (µM) - 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

n

DDE alone D

0

1

2

3

4

5

6

fold

indu

ctio

nDHT 100 pM A

E2 (10pM) - + + + + + + + + DHT (100pM) - - + + + + + + + DDE (µM) - - - 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0

††† †††

(a)

* *

(b)

DDE (µM)

146

Figure 5 : p,p’-DDE increases G0/G1-S transition of CAMA-1 cells in the presence of E2 and DHT

E2 (1 nM) - + + + +

DHT (1 nM) - - + + +

DDE (10 µM) - - - + -

OHF (1 µM) - - - - +

0

5

10

15

20

% o

f cel

ls in

S p

hase

†

‡* * ‡

147

Figure 6 : p,p’-DDE modulates the expression of sex-steroid dependent genes in CAMA-1 cells at the mRNA level

E2 (1 nM) - + + + +

DHT (1 nM) - - + + +

DDE (10 µM) - - - + -

OHF (1 µM) - - - - +

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8C † †

‡ ‡ ‡ ‡

A

B

cyclin D1 β-actin

ERα β-actin

AR β-actin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

D

β-actin

† † * *

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8* * ‡

pS2

(a)

(b)

(c)

(d)

148

Figure 7 : p,p’-DDE modulates the expression of sex-steroid dependent genes in CAMA-1 cells at the protein level

E2 (1 nM) - + + + +

DHT (1 nM) - - + + +

DDE (10 µM) - - - + -

OHF (1 µM) - - - - +

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AR

† †

§

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

cycl

in D

1

† †

* * ‡ ‡ ‡ ‡

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

ERα

‡ ‡

†

‡ ‡

cyclin D1 (36 kD)

ERα (68 kD)

AR (110 kD)

Actin (42 kD)

A

B

loading control

*

†

C

‡

(a)

(b)

(c)

149

Figure 8 : A proposed mechanism for p,p’-DDE induced proliferation of hormone-dependent cells

150

Conclusion générale La plausibilité biologique est un critère important pour établir une relation de cause à effet

entre l’exposition aux substances toxiques de l’environnement et le développement d’une

maladie [399]. Depuis plus d’une décennie de nombreuses études ont rapporté un lien entre

le cancer du sein et l’exposition aux OCs sans clairement déterminer quelles sont les voies

métaboliques les plus susceptibles d’en être responsables. Nous avons voulu apporter des

explications biologiques à l’implication des contaminants environnementaux dans la

carcinogenèse mammaire.

L’identification des voies de signalisation cellulaire qui sont modifiées suite à la

perturbation endocrinienne produite par les xénohormones représente une étape importante

pour valider l’implication de ces substances dans la carcinogenèse mammaire. De

nombreux essais in vivo et in vitro suggèrent que les xénohormones possèdent un potentiel

cancérigène mais l’hypothèse d’une association entre l’exposition aux xénohormones et le

cancer du sein est encore le sujet d’une controverse [400,401].

Nous avons utilisé un mélange complexe d’organochlorés dont la composition a été

déterminée à partir des teneurs d’échantillons biologiques humains. Nous avons évalué le

potentiel du mélange à induire un gène rapporteur contrôlé par le récepteur des androgènes,

des estrogènes ou des hydrocarbures aromatiques. Nous avons ensuite testé la capacité du

mélange à stimuler la prolifération de lignées de cellules tumorales du sein. Finalement

nous avons tenté de déterminer quels sont les mécanismes cellulaires qui sont débalancés

par les xénohormones et qui sont susceptibles d’expliquer les changements de phénotypes

observés suite à l’exposition au mélange.

Activités endocriniennes évaluées par l’activation d’un gène rapporteur

Les essais in vitro pour caractériser le potentiel d’interférence du mélange avec la

signalisation endocrinienne nous ont permis de détecter trois activités sur la signalisation

hormonale. Il est évident suite aux essais basés sur l’induction d’un gène rapporteur

contrôlé par les récepteurs AR, ERα ou le récepteur AhR que le mélange d’OCs agit sur

plusieurs voies de signalisation endocriniennes.

151

Selon les comparaisons avec E2, nos résultats montrent que les xénoestrogènes sont

beaucoup moins puissants que l’hormone naturelle par un facteur de 104 (soit par quatre

ordres de grandeur) lorsqu’ils sont testés individuellement. En effet, des concentrations de

l’ordre de 10 µM des OCs estrogéniques sont nécessaires pour activer le gène ER-

dépendant à un niveau semblable à l’effet produit par 1 nM E2 et ceci est en accord avec les

résultats d’autres auteurs [175,402-404].

Le mélange complexe induit également le gène rapporteur ER-dépendant. Plusieurs des

substances testées individuellement possèdent une activité estrogénique qui pourrait

contribuer aux effets produits par le mélange. En effet, le p,p’-DDT testé seul induit une

plus faible activité du gène rapporteur ER-dépendant que lorsqu’il est inclus dans le

mélange à des concentrations équivalentes. La EC50 du mélange se situe à une

concentration équivalente à 0,6 ± 0.2 µM de p,p’-DDT tandis que celle du p,p’-DDT seul à

4,8 ± 0.9 µM. On a donc besoin de 12.5% seulement de la concentration de p,p’-DDT

présente dans le mélange comparativement à la concentration nécessaire lorsqu’il est testé

seul. Ces résultats suggèrent qu’il y a une contribution des autres substances estrogéniques

au potentiel estrogénique global du mélange. La contribution de plusieurs xénoestrogènes

comme le p,p´-DDE, le β-HCH, le toxaphène et le p,p´-DDT ainsi que diverses autres

xénohormones à un effet endocrinien global a déjà été rapportée [122,125,405,406].

L’activité estrogénique du mélange peut théoriquement avoir un effet sur la prolifération

des lignées tumorales du sein ER+, des cellules mammaires ER+ et sur la prolifération des

tumeurs mammaires primaires aussi ER+.

Les effets antiandrogéniques du mélange sont similaires à celui du p,p’-DDE, un des plus

puissants antagonistes du AR faisant partie du mélange, testé seul et aux mêmes

concentrations que lorsqu’il est inclus dans le mélange. Nous concluons que les influences

des autres composantes du mélange sont négligeables, qu’elles n’atténuent pas et

n’augmentent pas le potentiel du p,p’-DDE. Bien que le p,p’-DDD, le p,p’-DDT, les BPCs

et la dieldrine soient capables d’inhiber l’activation de AR, leurs effets ne semblent pas

s’additionner à celui du p,p’-DDE dans nos essais. Contrairement à nos résultats, des

expériences in vivo et in vitro ont déjà montré que l’activité antiandrogénique des

152

pesticides peut s’additionner dans un mélange pour augmenter l’effet global

comparativement à l’effet des composés testés seuls [407]. Il se pourrait qu’en ajustant nos

concentrations d’androgènes et celles des xénohormones nous puissions trouver des

conditions pour montrer une additivité entre les effets antiandrogéniques des OCs testés.

L’expression du gène de la luciférase AhR-dépendant est activée seulement par les BPCs et

aucune autre substance du mélange ne produit cet effet. Ces résultats sont en accord avec

les informations relevées de la littérature car les BPCs sont pratiquement les seuls

composés du mélange pour lesquels un potentiel d’activation du AhR a été démontré [134]

à l’exception du HCB [408]. Toutefois certains composés semblent interférer avec la

réponse du gène rapporteur induite par le mélange. La baisse significative d’efficacité pour

activer le gène rapporteur lorsque les BPCs sont inclus dans le mélange avec les autres

composés s’observe uniquement pour la plus forte concentration testée. Ceci peut être

causé par les effets toxiques du mélange ou par la compétition de faibles agonistes comme

le HCB. Ce dernier est capable de lier le AhR et induire une faible expression des gènes

qu’il contrôle [408].

Le mélange d’OC possède donc des propriétés hormonales estrogéniques,

antiandrogéniques et semblables à celles de la dioxine. Il faut souligner que le potentiel

hormonal du mélange s’explique en bonne partie par la contribution d’une ou de quelques

composantes. À l’exception des substances estrogéniques, il n’y a pas d’interaction entre

les substances qui augmente ou réduise grandement le potentiel du mélange dans les

systèmes utilisant un gène rapporteur. Nous avons ensuite évalué les propriétés du mélange

sur la prolifération de lignées cellulaires tumorales mammaires.

Prolifération des lignées cellulaires hormono- et non hormono-dépendantes Nous avons testé le potentiel du même mélange d’organochlorés à stimuler la prolifération

de plusieurs lignées cellulaires tumorales du sein. Ces essais de prolifération cellulaire nous

ont permis de mettre en évidence des influences majeures de la composition hormonale du

milieu de culture et du type cellulaire sur l’activité du mélange.

153

Parmi les cellules hormono-dépendantes testées, seule la prolifération des MCF-7 a été

augmentée par le mélange sans ajouts d’hormones dans le milieu de culture. Le mélange

seul n’a donc pas induit la prolifération des autres lignées hormono-dépendantes soit les

CAMA-1 et les T47D. Par ailleurs, le mélange a augmenté l’entrée en phase S du cycle

cellulaire seulement chez les MCF-7 et cet effet a été bloqué par le ICI 182,780, un

antagoniste spécifique aux ERs. Les résultats concernant l’augmentation de la prolifération

et de l’entrée dans le cycle cellulaire des MCF-7 combinés à ceux de la première partie de

cette thèse concernant l’induction du gène rapporteur ER-dépendant, établissent clairement

que le mélange possède un potentiel estrogénique. L’augmentation de la prolifération des

MCF-7 par le mélange résulte probablement des propriétés estrogéniques des composantes

du mélange comme le p,p’-DDT et le p p’-DDD. Ces deux composés ont induit

significativement la prolifération des cellules CAMA-1 lorsqu’ils ont été testés seuls sans

la présence d’hormones. Ces organochlorés sont des agonistes du ERα et des

xénoestrogènes reconnus. Ils sont capables de lier le ERα et induire son activité de

transcription [402,403]. Selon nos résultats présentés dans le chapitre 1, le p,p’-DDE, le

toxaphène, le β-HCH, l’aldrine et la dieldrine possèdent également des propriétés

estrogéniques qui peuvent contribuer à l’effet global du mélange sur l’activité de ERα.

Chez les cellules non hormono-dépendantes MDAMB231 et CV-1, qui sont en croissance

exponentielle dans le milieu de culture cellulaire appauvri en hormones endogènes, le

mélange n’a pas augmenté la prolifération. Au contraire, nous avons mesuré une baisse

marquée de la prolifération des cellules témoins non-tumorales CV-1 et des cellules

tumorales du sein non hormono-dépendantes MDAMB231 en fonction de la concentration

du mélange. De plus, la prolifération des cellules CAMA-1 exposées à E2 (10 ou 100 pM) a

elle aussi été réduite en fonction de la concentration du mélange.

Les xénohormones peuvent activer différemment les récepteurs des estrogènes selon la

séquence génomique où se trouve l’élément de réponse cis du gène cible, selon

l’expression des coactivateurs dans les cellules cibles et selon l’affinité de la substance

pour le récepteur ERα ou ERβ [287,409,410]. Ces caractéristiques changent d’une lignée

154

cellulaire à l’autre et sont susceptibles d’influencer la réponse proliférative induite par les

xénohormones.

Une activité antiestrogénique sur ERα pourrait être responsable des effets anti-prolifératifs

chez les CAMA-1. En effet, les BPCs sont une composante majeure du mélange et les

propriétés anti-estrogéniques des BPCs ont déjà été mises en évidence dans un système de

gène rapporteur et par des essais de prolifération avec les cellules MCF-7 [356,411].

Cependant, dans notre étude, le mélange ou ses composantes testées individuellement n’ont

pas généré d’effet antiestrogénique mesurable dans le système de gène rapporteur. Des

expériences de prolifération identiques à celles que nous avons réalisées mais qui

incluraient un inhibiteur spécifique à ERβ permettraient peut-être de déterminer si ce

récepteur est médiateur de la diminution de la prolifération que nous avons observée chez

les CAMA-1 en présence de E2 et chez les MDAMB231. En effet, des inhibiteurs

spécifiques à ERβ sont en cours de développement [412,413].

L’influence des xénoestrogènes sur la prolifération des cellules hormono-dépendantes peut

être négative (semblable à un antiestrogène) chez les cellules qui expriment le récepteur

ERβ. Il existe donc la possibilité que les effets antiprolifératifs soient en partie produits par

l’activation de ERβ (sauf chez les CV-1). En effet, une fois activé ERβ diminue la

sensibilité des cellules aux effets prolifératifs des estrogènes ainsi qu’aux effets

prolifératifs des xénoestrogènes qui activent ERα [414-416]. Toutefois l’expression de

ERβ est diminuée dans les lignées tumorales mammaires ce qui en principe, limite son

activité [417] et chez les CV-1 aucun récepteur des stéroïdes sexuels n’est exprimé.

Il y a également l’activation du AhR par un agoniste qui peut engendrer des effets

semblables à ceux produits par un anti-estrogène. Dans les cellules tumorales du sein T47D

et MCF-7, le TCDD entraîne une dégradation de ERα protéasome-dépendante [418].

Certains congénères des BPCs ont des propriétés semblables à la TCDD tel qu’observé

dans nos essais avec le AhR et ils pourraient donc provoquer la dégradation de ERα.

Bien qu’un mécanisme endocrinien puisse être impliqué dans certaines lignées cellulaires,

il est davantage probable que la cytotoxicité du mélange ait contribué à réduire la

155

prolifération. L’inhibition de la prolifération des cellules non hormono-dépendantes CV-1

et MBAMB231 laisse croire qu’un effet cytotoxique du mélange représente la meilleure

hypothèse pour expliquer l’inhibition de la prolifération des différentes lignées cellulaires.

Il s’agit probablement du mécanisme principal et commun à tous les types de cellules.

Les tests de contrôle de la toxicité que nous avons effectués sur les cellules après 24 ou 48

heures d’exposition étaient négatifs pour les dilutions plus élevées que 5 000X. Également,

les résultats des analyses du cycle cellulaire que nous avons effectuées après 24 ou 48

heures d’exposition indiquent que les cellules sont viables pour les dilutions mentionnées

plus haut. Il est important de noter qu’à la plus faible dilution du mélange (5 000X), la

plupart des cellules étaient très endommagées après l’exposition de 9 jours nécessaire aux

tests de prolifération. Nous avons réalisé des essais avec cette dilution dans toutes nos

expériences afin de s’assurer de mesurer des effets maximaux et avoir une fenêtre

d’observation la plus large possible. Il est toutefois clair que des effets cytotoxiques sont

engendrés par une telle concentration du mélange sur les cellules exposées pendant une

période prolongée. Lin et Lin ont rapporté des effets cytotoxiques et une augmentation de

la formation de radicaux libres dans les cellules T47D et MDAMB231 exposées au BPCs

[419].

Chez les CAMA-1, l’augmentation de la prolifération en présence d’hormones provient

probablement des effets antiandrogéniques du mélange. En effet, le mélange n’a pas induit

la prolifération des CAMA-1 en absence de E2 et de DHT. Étant donné le potentiel

antiandrogénique du p,p’-DDE et des BPCs mesurés dans le système de gène rapporteur et

leur forte concentration dans le mélange, ils sont sans doute responsables de l’induction de

la prolifération produite par le mélange chez les CAMA-1 en renversant l’effet inhibiteur

produit par le DHT. En plus, le p,p’-DDE et les BPCs ont induit la prolifération des

CAMA-1 lorsqu’ils ont été testés individuellement, en présence de E2 et de DHT.

L’exposition des cellules CAMA-1 au mélange d’organochlorés en présence d’hormones

endogènes est davantage représentatif de l’environnement des cellules mammaires in vivo.

Chez le singe rhésus, l’administration d’un antiandrogène augmente la sensibilité des

cellules épithéliales mammaire aux effets prolifératifs des estrogènes [315].

156

Il est permis de s’interroger sur les conséquences à long terme que pourrait engendrer

l’augmentation de la prolifération cellulaire induite par le mélange d’OC. En plus de

posséder des activités estrogéniques et antiandrogéniques, le mélange peut modifier

l’activation de l’AhR grâce aux BPCs « dioxin-like » qu’il contient. Ceci peut augmenter la

concentration des radicaux libres qui sont produits par le métabolisme cellulaire [333]. Il

serait intéressant de vérifier cette hypothèse. Les cellules MDAMB231 et CV-1 étaient en

croissance exponentielle lorsqu’elles ont été exposées au mélange. Cette prolifération

continue expose le matériel génétique des cellules aux agents génotoxiques lors de la

mitose et les rend plus susceptibles aux effets génotoxiques que pourrait engendrer

l’activation de l’AhR par les BPCs [419].

Nos essais se déroulent sur une période de 9 jours d’exposition seulement et les cellules ne

subissent aucun passage pendant cette période de culture cellulaire. Après plusieurs

passages, auront-elles subi des effets génotoxiques causés par une surexpression des

cytochromes P450 produite par les BPCs? Pour vérifier cela, il faudrait que l’expérience se

poursuive sur une période de quelques mois ou une année et plus afin d’observer si des

mutations génétiques accélérées affecteront les cellules exposées au mélange.

Mécanisme d’induction de la prolifération Notre troisième étude avait pour but d’investiguer les mécanismes cellulaires à la base de

l’effet prolifératif induit par le p,p’-DDE sur les cellules CAMA-1 cultivées en présence

d’hormones sexuelles. Les cellules CAMA-1 ont été choisies comme modèle parce qu’elles

répondent fortement aux androgènes et aux estrogènes [374]. Chez ces cellules tout comme

pour la seconde lignée étudiée, les MCF-7-AR1, les androgènes renversent l’effet

prolifératif induit par les estrogènes. Nos résultats suggèrent que le principal mécanisme

endocrinien s’opposant à l’induction de la prolifération des cellules tumorales mammaires

hormono-dépendantes, c’est-à-dire l’activation du AR, est inhibé par le p,p’-DDE. De plus,

chez les CAMA-1, nous avons montré que l’effet inhibiteur était proportionnel à la

concentration de p,p’-DDE dans le milieu de culture et que le niveau d’expression de la

cycline D1 était fortement augmenté, causant un recrutement anormalement élevé des

cellules en phase S.

157

Bien que la concentration effective de p,p’-DDE utilisée dans nos expériences in vitro soit

environ dix fois plus élevée que les concentrations mesurées chez les femmes les plus

exposées dans différentes études épidémiologiques (revue de littérature par Snedeker et al.

[153]), nos essais se déroulent sur une courte période d’exposition alors que les femmes

sont exposées durant toute leur vie au p,p’-DDE. Les essais de prolifération in vitro ne

permettent pas de poursuivre une expérience au-delà d’une confluence sous-maximale

(environ 80-85%), laquelle est rapidement atteinte car la croissance cellulaire est

exponentielle. Puisque dans nos essais, la réponse des cellules mammaires au p,p’-DDE

varie en fonction de la concentration, il est probable que in vivo, de plus faibles

concentrations conduisent à de plus faibles variations du niveau de prolifération mais

qu’elles puissent néanmoins engendrer des effets importants sur de longues périodes

d’exposition. Nos résultats supportent cette possibilité car les mécanismes perturbés par le

p,p’-DDE contrôlent directement le cycle cellulaire, un élément important de la

carcinogenèse mammaire (voir revue de littérature réf. [420]).

La Figure 8 du chapitre 3 résume comment les résultats que nous avons tirés de notre

troisième étude sur le potentiel endocrinien du p,p’-DDE pourraient être extrapolés au tissu

mammaire in vivo. Le microenvironnement formé par les adipocytes du tissu mammaire

entourant les cellules ER+ relargue du p,p’-DDE dans la circulation interstitielle qui diffuse

passivement dans les cellules ER+. Une fois dans le cytoplasme des cellules hormono-

dépendantes, le p,p’-DDE bloque le AR et cet effet antagoniste se répercute sur la voie de

signalisation des estrogènes en augmentant l’expression et l’activité de ERα et finalement

l’expression de la cycline D1. Il en résulte que la prolifération des cellules hormono-

dépendantes avec un phénotype ER+/AR+ est accrue ce qui augmente le nombre de cellules

à risques d’induire un cancer du sein et augmente la croissance des tumeurs primaires qui

sont principalement ER+ tel que mentionné dans la section 4.3.1. Ce modèle est en accord

avec les observations de Shoker et al. qui ont rapporté que dans un tissu mammaire sain, les

cellules ER+ sont minoritaires et se retrouvent entourées de cellules ER- alors que dans les

lésions précancéreuses cette proportion est fortement augmentée, atteignant jusqu’à 90%

des cellules présentant un phénotype ER+ [237]. Ces auteurs concluent que l’augmentation

des cellules ER+ précède l’expression anormalement élevée de cycline D1 et d’autres

158

protéines du cycle cellulaire, qui sont les premières à être surexprimées dans les lésions

cancéreuses. Cette boucle de signalisation passant par la voie des estrogènes assure

vraisemblablement l’homéostasie de la glande mammaire et représente un point très

sensible aux effets des xénohormones.

Il découle de nos observations que des antagonistes du AR pourraient être impliqués dans

la carcinogenèse mammaire, notamment à l’étape de progression du cancer. Cette

possibilité provient de leur potentiel à induire la prolifération de certaines lignées de

cellules tumorales du sein et surtout des effets globaux qu’ils engendrent sur l’activité de

ERα et de la cycline D1. Nos travaux ont permis d’identifier une partie des mécanismes

cellulaires impliqués dans la perturbation endocrinienne causée par le p,p’-DDE. Nos

résultats supportent l’hypothèse de l’implication du p,p’-DDE dans l’agressivité du cancer

du sein [246]. Bien que dans nos essais les concentrations de p,p’-DDE (≥2.0 µM) capables

d’augmenter la prolifération des cellules CAMA-1 soient au moins 20 fois plus élevées que

les niveaux maximaux mesurés dans le plasma de femmes exposées (0.1 µM) [421,422],

les expériences de prolifération in vitro se déroulent sur un période qui est extrêmement

courte comparativement à l’exposition des cellules mammaires in vivo pendant toute une

vie. Suite à plusieurs années d’exposition au p,p’-DDE, l’induction d’une augmentation de

la prolifération, si faible soit elle, peut signifier une surproduction d’un nombre très élevé

de cellules filles, ce qui augmente le risque de cancer du sein. En effet, il est généralement

reconnu que le cancer origine d’un dérèglement dans le contrôle de la prolifération et/ou de

l’apoptose suite à l’accumulation de dommages génétiques qui favorisent l’expression de

proto-oncogènes ou l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs [423,424].

L’activation de la cycline D1 à elle seule peut favoriser le développement

d’adénocarcinomes mammaires et jouer un rôle d’oncogène dans le tissu mammaire [425].

Tel que nous l’avons observé dans la seconde et la troisième études, outre les cellules

MCF-7, les cellules susceptibles d’accroître leur prolifération suite à une exposition au

p,p’-DDE ou au mélange d’organochlorés sont celles qui sont sensibles aux effets

combinés des androgènes et des estrogènes. Ces cellules sont nécessairement ER+ et AR+,

un phénotype commun des tumeurs mammaires [274].

159

Les habitudes adoptées par les scientifiques d’associer les androgènes au cancer de la

prostate et les estrogènes au cancer du sein demeurent bien ancrées et peuvent biaiser les

efforts réalisés pour comprendre les causes environnementales du cancer du sein. Il en

résulte que les androgènes et le récepteur des androgènes sont négligés dans les études

cliniques tout comme en recherche fondamentale [375]. Toutefois notre apport dans

l’identification des mécanismes impliqués permet de mieux comprendre l’influence des

xénohormones aux propriétés antiandrogéniques qui ont peut être un rôle important dans la

carcinogenèse mammaire. Étant donné qu’environ 50% des cancers du sein ne sont

associés à aucun facteur de risque bien défini, qu’ils produisent des métastases et que

l’incidence augmente presque partout dans le monde, des interventions pour sa prévention

sont nécessaires [426].

Les multiples modes d’actions des xénohormones, leur ubiquité, la fréquence des

expositions et l’exposition prolongée peuvent avoir des effets importants sur l’homéostasie

des glandes mammaires et sur l’induction de la carcinogenèse ou l’agressivité des cancers

du sein. L’identification de xénohormones doit se poursuivre et plus d’attention devrait être

portée aux composés avec des activités antiandrogéniques en relation avec le cancer du

sein. De nombreuses études publiées pendant les dernières années ne laissent aucun doute

sur le rôle des androgènes dans le maintien de l’homéostasie des glandes mammaires et une

perturbation de l’activité du récepteur aux androgènes pourrait en partie expliquer la hausse

draconienne des cas de cancer du sein depuis 1940.

Perspectives L’implication de l’exposition aux estrogènes comme facteur de risque du cancer du sein est

maintenant reconnue. Chez les femmes ménopausées ce facteur de risque était suspecté

depuis les années ‘70 [427] et fait consensus depuis la réalisation d’études prospectives

[67]. Peut-être qu’un jour pas très lointain il y aura un consensus sur l’implication des OCs

dans la carcinogenèse mammaire et plus de prévention sur l’utilisation de ces composés

pourra être réalisée. Nous pourrions tester le potentiel du mélange d’OCs à induire des

tumeurs mammaires chez des souris à partir de xénogreffes constituées des cellules

160

utilisées dans ce travail. Vérifier les propriétés cancérigènes du mélange in vivo pourrait

apporter encore plus de crédibilité aux résultats présentés dans cette thèse.

161

Bibliographie

1. Canadian Cancer Society NCIoCSCPTCRHC: Canadian Cancer Statistics. Toronto, Canada: Canadian Cancer Society; 2003.

2. Newman B, Austin MA, Lee M, King MC: Inheritance of human breast cancer: evidence for autosomal dominant transmission in high-risk families. Proc Natl Acad Sci U S A 1988, 85: 3044-3048.

3. Claus EB, Risch N, Thompson WD: Genetic analysis of breast cancer in the cancer and steroid hormone study. Am J Hum Genet 1991, 48: 232-242.

4. Levy-Lahad E, Friedman E: Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br J Cancer 2007, 96: 11-15.

5. Risch HA, McLaughlin JR, Cole DE, Rosen B, Bradley L, Fan I et al.: Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J Natl Cancer Inst 2006, 98: 1694-1706.

6. Ziegler RG, Hoover RN, Pike MC, Hildesheim A, Nomura AM, West DW et al.: Migration patterns and breast cancer risk in Asian-American women. J Natl Cancer Inst 1993, 85: 1819-1827.

7. Stanford JL, Herrinton LJ, Schwartz SM, Weiss NS: Breast cancer incidence in Asian migrants to the United States and their descendants. Epidemiology 1995, 6: 181-183.

8. Katanoda K, Marugame T: Comparison of Time Trends in Cancer Incidence (1973-1997) in East Asia, Europe and USA, from Cancer Incidence in Five Continents Vol. IV-VIII. Jpn J Clin Oncol 2007, 37: 157-159.

9. Lawson JS, Field AS, Champion S, Tran D, Ishikura H, Trichopoulos D: Low oestrogen receptor alpha expression in normal breast tissue underlies low breast cancer incidence in Japan. Lancet 1999, 354: 1787-1788.

10. Yamamoto S, Sobue T, Kobayashi M, Sasaki S, Tsugane S: Soy, isoflavones, and breast cancer risk in Japan. J Natl Cancer Inst 2003, 95: 906-913.

11. Monninkhof EM, Elias SG, Vlems FA, van dT, I, Schuit AJ, Voskuil DW et al.: Physical activity and breast cancer: a systematic review. Epidemiology 2007, 18: 137-157.

12. Matthews CE, Fowke JH, Dai Q, Leon BH, Jin F, Shu XO et al.: Physical activity, body size, and estrogen metabolism in women. Cancer Causes Control 2004, 15: 473-481.

162

13. Zhu BT, Conney AH: Functional role of estrogen metabolism in target cells: review and perspectives. Carcinogenesis 1998, 19: 1-27.

14. Rich-Edwards JW, Goldman MB, Willett WC, Hunter DJ, Stampfer MJ, Colditz GA et al.: Adolescent body mass index and infertility caused by ovulatory disorder. Am J Obstet Gynecol 1994, 171: 171-177.

15. Hankinson SE, Willett WC, Manson JE, Hunter DJ, Colditz GA, Stampfer MJ et al.: Alcohol, height, and adiposity in relation to estrogen and prolactin levels in postmenopausal women. J Natl Cancer Inst 1995, 87: 1297-1302.

16. Simpson E, Rubin G, Clyne C, Robertson K, O'Donnell L, Davis S et al.: Local estrogen biosynthesis in males and females. Endocr Relat Cancer 1999, 6: 131-137.

17. Bulun SE, Simpson ER: Competitive reverse transcription-polymerase chain reaction analysis indicates that levels of aromatase cytochrome P450 transcripts in adipose tissue of buttocks, thighs, and abdomen of women increase with advancing age. J Clin Endocrinol Metab 1994, 78: 428-432.

18. Bulun SE, Price TM, Aitken J, Mahendroo MS, Simpson ER: A link between breast cancer and local estrogen biosynthesis suggested by quantification of breast adipose tissue aromatase cytochrome P450 transcripts using competitive polymerase chain reaction after reverse transcription. J Clin Endocrinol Metab 1993, 77: 1622-1628.

19. Utsumi T, Harada N, Maruta M, Takagi Y: Presence of alternatively spliced transcripts of aromatase gene in human breast cancer. J Clin Endocrinol Metab 1996, 81: 2344-2349.

20. Rice S, Whitehead SA: Phytoestrogens and breast cancer--promoters or protectors? Endocr Relat Cancer 2006, 13: 995-1015.

21. Limer JL, Speirs V: Phyto-oestrogens and breast cancer chemoprevention. Breast Cancer Res 2004, 6: 119-127.

22. Hsieh CY, Santell RC, Haslam SZ, Helferich WG: Estrogenic effects of genistein on the growth of estrogen receptor-positive human breast cancer (MCF-7) cells in vitro and in vivo. Cancer Res 1998, 58: 3833-3838.

23. Allred CD, Allred KF, Ju YH, Virant SM, Helferich WG: Soy diets containing varying amounts of genistein stimulate growth of estrogen-dependent (MCF-7) tumors in a dose-dependent manner. Cancer Res 2001, 61: 5045-5050.

24. Gallo D, Ferlini C, Fabrizi M, Prislei S, Scambia G: Lack of stimulatory activity of a phytoestrogen-containing soy extract on the growth of breast cancer tumors in mice. Carcinogenesis 2006, 27: 1404-1409.

163

25. Shao ZM, Wu J, Shen ZZ, Barsky SH: Genistein exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells. Cancer Res 1998, 58: 4851-4857.

26. McMichael-Phillips DF, Harding C, Morton M, Roberts SA, Howell A, Potten CS et al.: Effects of soy-protein supplementation on epithelial proliferation in the histologically normal human breast. Am J Clin Nutr 1998, 68: 1431S-1435S.

27. Jakes RW, Duffy SW, Ng FC, Gao F, Ng EH, Seow A et al.: Mammographic parenchymal patterns and self-reported soy intake in Singapore Chinese women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002, 11: 608-613.

28. Boyd NF, Guo H, Martin LJ, Sun L, Stone J, Fishell E et al.: Mammographic density and the risk and detection of breast cancer. N Engl J Med 2007, 356: 227-236.

29. Atkinson C, Warren R, Bingham SA, Day NE: Mammographic patterns as a predictive biomarker of breast cancer risk: effect of tamoxifen. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999, 8: 863-866.

30. Akiyama T, Ishida J, Nakagawa S, Ogawara H, Watanabe S, Itoh N et al.: Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. J Biol Chem 1987, 262: 5592-5595.

31. Graziani Y, Erikson E, Erikson RL: The effect of quercetin on the phosphorylation activity of the Rous sarcoma virus transforming gene product in vitro and in vivo. Eur J Biochem 1983, 135: 583-589.

32. Hamajima N, Hirose K, Tajima K, Rohan T, Calle EE, Heath CW, Jr. et al.: Alcohol, tobacco and breast cancer--collaborative reanalysis of individual data from 53 epidemiological studies, including 58,515 women with breast cancer and 95,067 women without the disease. Br J Cancer 2002, 87: 1234-1245.

33. Feigelson HS, Calle EE, Robertson AS, Wingo PA, Thun MJ: Alcohol consumption increases the risk of fatal breast cancer (United States). Cancer Causes Control 2001, 12: 895-902.

34. Dorgan JF, Longcope C, Stephenson HE, Jr., Falk RT, Miller R, Franz C et al.: Relation of prediagnostic serum estrogen and androgen levels to breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1996, 5: 533-539.

35. Ginsburg ES, Walsh BW, Shea BF, Gao X, Gleason RE, Barbieri RL: The effects of ethanol on the clearance of estradiol in postmenopausal women. Fertil Steril 1995, 63: 1227-1230.

36. Fan S, Meng Q, Gao B, Grossman J, Yadegari M, Goldberg ID et al.: Alcohol stimulates estrogen receptor signaling in human breast cancer cell lines. Cancer Res 2000, 60: 5635-5639.

164

37. Brunet JS, Ghadirian P, Rebbeck TR, Lerman C, Garber JE, Tonin PN et al.: Effect of smoking on breast cancer in carriers of mutant BRCA1 or BRCA2 genes. J Natl Cancer Inst 1998, 90: 761-766.

38. Ishibe N, Hankinson SE, Colditz GA, Spiegelman D, Willett WC, Speizer FE et al.: Cigarette smoking, cytochrome P450 1A1 polymorphisms, and breast cancer risk in the Nurses' Health Study. Cancer Res 1998, 58: 667-671.

39. Prescott J, Ma H, Bernstein L, Ursin G: Cigarette smoking is not associated with breast cancer risk in young women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007, 16: 620-622.

40. Sadri G, Mahjub H: Passive or active smoking, which is more relevant to breast cancer. Saudi Med J 2007, 28: 254-258.

41. Johnson KC, Hu J, Mao Y: Passive and active smoking and breast cancer risk in Canada, 1994-97. Cancer Causes Control 2000, 11: 211-221.

42. Band PR, Le ND, Fang R, Deschamps M: Carcinogenic and endocrine disrupting effects of cigarette smoke and risk of breast cancer. Lancet 2002, 360: 1044-1049.

43. Baron JA: Beneficial effects of nicotine and cigarette smoking: the real, the possible and the spurious. Br Med Bull 1996, 52: 58-73.

44. Lannigan DA, Notides AC: Estrogen receptor selectively binds the "coding strand" of an estrogen responsive element. Proc Natl Acad Sci U S A 1989, 86: 863-867.

45. Clemons M, Goss P: Estrogen and the risk of breast cancer. N Engl J Med 2001, 344: 276-285.

46. Love RR, Philips J: Oophorectomy for breast cancer: history revisited. J Natl Cancer Inst 2002, 94: 1433-1434.

47. Kauff ND, Satagopan JM, Robson ME, Scheuer L, Hensley M, Hudis CA et al.: Risk-reducing salpingo-oophorectomy in women with a BRCA1 or BRCA2 mutation. N Engl J Med 2002, 346: 1609-1615.

48. Wirk B: The role of ovarian ablation in the management of breast cancer. Breast J 2005, 11: 416-424.

49. Kelsey JL, Gammon MD, John EM: Reproductive factors and breast cancer. Epidemiol Rev 1993, 15: 36-47.

50. Key TJ, Verkasalo PK, Banks E: Epidemiology of breast cancer. Lancet Oncol 2001, 2: 133-140.

165

51. MacMahon B, Trichopoulos D, Brown J, Andersen AP, Cole P, deWaard F et al.: Age at menarche, urine estrogens and breast cancer risk. Int J Cancer 1982, 30: 427-431.

52. Apter D, Reinila M, Vihko R: Some endocrine characteristics of early menarche, a risk factor for breast cancer, are preserved into adulthood. Int J Cancer 1989, 44: 783-787.

53. Shantakumar S, Terry MB, Teitelbaum SL, Britton JA, Millikan RC, Moorman PG et al.: Reproductive factors and breast cancer risk among older women. Breast Cancer Res Treat 2006.

54. Beral V, Reeves G: Childbearing, oral contraceptive use, and breast cancer. Lancet 1993, 341: 1102.

55. Layde PM, Webster LA, Baughman AL, Wingo PA, Rubin GL, Ory HW: The independent associations of parity, age at first full term pregnancy, and duration of breastfeeding with the risk of breast cancer. Cancer and Steroid Hormone Study Group. J Clin Epidemiol 1989, 42: 963-973.

56. Ewertz M, Duffy SW, Adami HO, Kvale G, Lund E, Meirik O et al.: Age at first birth, parity and risk of breast cancer: a meta-analysis of 8 studies from the Nordic countries. Int J Cancer 1990, 46: 597-603.

57. Bernier MO, Plu-Bureau, Bossard N, Ayzac L, Thalabard JC: Breastfeeding and risk of breast cancer: a metaanalysis of published studies. Hum Reprod Update 2000, 6: 374-386.

58. Dewailly E, Ayotte P, Brisson J: Protective effect of breast feeding on breast cancer and body burden of carcinogenic organochlorines. J Natl Cancer Inst 1994, 86: 803.

59. Kurz KM, Habicht JP, Rasmussen KM: Influences of maternal nutrition and lactation on length of post-partum amenorrhoea. J Trop Pediatr 1991, 37 Suppl 1: 15-18.

60. Russo J, Tay LK, Russo IH: Differentiation of the mammary gland and susceptibility to carcinogenesis. Breast Cancer Res Treat 1982, 2: 5-73.

61. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer: Breast cancer and hormonal contraceptives: collaborative reanalysis of individual data on 53 297 women with breast cancer and 100 239 women without breast cancer from 54 epidemiological studies. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer. Lancet 1996, 347: 1713-1727.

62. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer: Breast cancer and hormone replacement therapy: collaborative reanalysis of data from 51

166

epidemiological studies of 52,705 women with breast cancer and 108,411 women without breast cancer. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer. Lancet 1997, 350: 1047-1059.

63. Magnusson C, Baron JA, Correia N, Bergstrom R, Adami HO, Persson I: Breast-cancer risk following long-term oestrogen- and oestrogen-progestin-replacement therapy. Int J Cancer 1999, 81: 339-344.

64. Siddiqui NI, Rahman S, Mia AR, Shamsuzzaman AK: Evaluation of hormone replacement therapy. Mymensingh Med J 2005, 14: 212-218.

65. Mueck AO: [Hormone replacement therapy for internal risk patients]. Gynakol Geburtshilfliche Rundsch 2006, 46: 174-190.

66. Mastorakos G, Sakkas EG, Xydakis AM, Creatsas G: Pitfalls of the WHIs: Women's Health Initiative. Ann N Y Acad Sci 2006, 1092: 331-340.

67. Key TJ, Verkasalo PK: Endogenous hormones and the aetiology of breast cancer. Breast Cancer Res 1999, 1: 18-21.

68. Hankinson SE: Endogenous hormones and risk of breast cancer in postmenopausal women. Breast Dis 2005, 24: 3-15.

69. Key TJ: Hormones and cancer in humans. Mutat Res 1995, 333: 59-67.

70. Bernstein L: Epidemiology of endocrine-related risk factors for breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2002, 7: 3-15.

71. Lipworth L, Adami HO, Trichopoulos D, Carlstrom K, Mantzoros C: Serum steroid hormone levels, sex hormone-binding globulin, and body mass index in the etiology of postmenopausal breast cancer. Epidemiology 1996, 7: 96-100.

72. Hankinson SE, Willett WC, Manson JE, Colditz GA, Hunter DJ, Spiegelman D et al.: Plasma sex steroid hormone levels and risk of breast cancer in postmenopausal women. J Natl Cancer Inst 1998, 90: 1292-1299.

73. Sasco AJ, Kaaks R, Little RE: Breast cancer: occurrence, risk factors and hormone metabolism. Expert Rev Anticancer Ther 2003, 3: 546-562.

74. Adly L, Hill D, Sherman ME, Sturgeon SR, Fears T, Mies C et al.: Serum concentrations of estrogens, sex hormone-binding globulin, and androgens and risk of breast cancer in postmenopausal women. Int J Cancer 2006, 119: 2402-2407.

75. Labrie F: Intracrinology. Mol Cell Endocrinol 1991, 78: C113-C118.

76. Santen RJ, Leszczynski D, Tilson-Mallet N, Feil PD, Wright C, Manni A et al.: Enzymatic control of estrogen production in human breast cancer: relative

167

significance of aromatase versus sulfatase pathways. Ann N Y Acad Sci 1986, 464: 126-137.

77. Yue W, Wang JP, Hamilton CJ, Demers LM, Santen RJ: In situ aromatization enhances breast tumor estradiol levels and cellular proliferation. Cancer Res 1998, 58: 927-932.

78. Vermeulen A, Deslypere JP, Paridaens R, Leclercq G, Roy F, Heuson JC: Aromatase, 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase and intratissular sex hormone concentrations in cancerous and normal glandular breast tissue in postmenopausal women. Eur J Cancer Clin Oncol 1986, 22: 515-525.

79. Eliassen AH, Missmer SA, Tworoger SS, Spiegelman D, Barbieri RL, Dowsett M et al.: Endogenous steroid hormone concentrations and risk of breast cancer among premenopausal women. J Natl Cancer Inst 2006, 98: 1406-1415.

80. Migliaccio A, Castoria G, Di Domenico M, de Falco A, Bilancio A, Lombardi M et al.: Sex steroid hormones act as growth factors. J Steroid Biochem Mol Biol 2002, 83: 31-35.

81. Key T, Appleby P, Barnes I, Reeves G: Endogenous sex hormones and breast cancer in postmenopausal women: reanalysis of nine prospective studies. J Natl Cancer Inst 2002, 94: 606-616.

82. Missmer SA, Eliassen AH, Barbieri RL, Hankinson SE: Endogenous estrogen, androgen, and progesterone concentrations and breast cancer risk among postmenopausal women. J Natl Cancer Inst 2004, 96: 1856-1865.

83. Zeleniuch-Jacquotte A, Shore RE, Koenig KL, Akhmedkhanov A, Afanasyeva Y, Kato I et al.: Postmenopausal levels of oestrogen, androgen, and SHBG and breast cancer: long-term results of a prospective study. Br J Cancer 2004, 90: 153-159.

84. Kaaks R, Rinaldi S, Key TJ, Berrino F, Peeters PH, Biessy C et al.: Postmenopausal serum androgens, oestrogens and breast cancer risk: the European prospective investigation into cancer and nutrition. Endocr Relat Cancer 2005, 12: 1071-1082.

85. Micheli A, Muti P, Secreto G, Krogh V, Meneghini E, Venturelli E et al.: Endogenous sex hormones and subsequent breast cancer in premenopausal women. Int J Cancer 2004, 112: 312-318.

86. MacGregor JI, Jordan VC: Basic guide to the mechanisms of antiestrogen action. Pharmacol Rev 1998, 50: 151-196.

87. Gustafsson JA: Therapeutic potential of selective estrogen receptor modulators. Curr Opin Chem Biol 1998, 2: 508-511.

168

88. Fisher B, Costantino JP, Wickerham DL, Redmond CK, Kavanah M, Cronin WM et al.: Tamoxifen for prevention of breast cancer: report of the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project P-1 Study. J Natl Cancer Inst 1998, 90: 1371-1388.

89. Tsuchiya Y, Nakajima M, Yokoi T: Cytochrome P450-mediated metabolism of estrogens and its regulation in human. Cancer Lett 2005, 227: 115-124.

90. Liehr JG: Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen? Endocr Rev 2000, 21: 40-54.

91. Yager JD, Davidson NE: Estrogen carcinogenesis in breast cancer. N Engl J Med 2006, 354: 270-282.

92. Cavalieri EL, Stack DE, Devanesan PD, Todorovic R, Dwivedy I, Higginbotham S et al.: Molecular origin of cancer: catechol estrogen-3,4-quinones as endogenous tumor initiators. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94: 10937-10942.

93. Longcope C: Adrenal and gonadal androgen secretion in normal females. Clin Endocrinol Metab 1986, 15: 213-228.

94. Burger HG: Selective oestrogen receptor modulators. Horm Res 2000, 53 Suppl 3: 25-29.

95. Davison SL, Davis SR: Androgens in women. J Steroid Biochem Mol Biol 2003, 85: 363-366.

96. Labrie F: Dehydroepiandrosterone, androgens and the mammary gland. Gynecol Endocrinol 2006, 22: 118-130.

97. Labrie F, Belanger A, Simard J, Van L, Labrie C: DHEA and peripheral androgen and estrogen formation: intracinology. Ann N Y Acad Sci 1995, 774: 16-28.

98. Bulbrook RD, Hayward JL, Spicer CC: Relation between urinary androgen and corticoid excretion and subsequent breast cancer. Lancet 1971, 2: 395-398.

99. Zumoff B, Levin J, Rosenfeld RS, Markham M, Strain GW, Fukushima DK: Abnormal 24-hr mean plasma concentrations of dehydroisoandrosterone and dehydroisoandrosterone sulfate in women with primary operable breast cancer. Cancer Res 1981, 41: 3360-3363.

100. Secreto G, Toniolo P, Berrino F, Recchione C, Di Pietro S, Fariselli G et al.: Increased androgenic activity and breast cancer risk in premenopausal women. Cancer Res 1984, 44: 5902-5905.

169

101. Berrino F, Muti P, Micheli A, Bolelli G, Krogh V, Sciajno R et al.: Serum sex hormone levels after menopause and subsequent breast cancer. J Natl Cancer Inst 1996, 88: 291-296.

102. Dimitrakakis C, Jones RA, Liu A, Bondy CA: Breast cancer incidence in postmenopausal women using testosterone in addition to usual hormone therapy. Menopause 2004, 11: 531-535.

103. Somboonporn W, Davis SR: Testosterone effects on the breast: implications for testosterone therapy for women. Endocr Rev 2004, 25: 374-388.

104. Staub NL, De Beer M: The role of androgens in female vertebrates. Gen Comp Endocrinol 1997, 108: 1-24.

105. Turusov V, Rakitsky V, Tomatis L: Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT): ubiquity, persistence, and risks. Environ Health Perspect 2002, 110: 125-128.

106. Preston DL, Mattsson A, Holmberg E, Shore R, Hildreth NG, Boice JD, Jr.: Radiation effects on breast cancer risk: a pooled analysis of eight cohorts. Radiat Res 2002, 158: 220-235.

107. Little MP, Muirhead CR, Haylock RG, Thomas JM: Relative risks of radiation-associated cancer: comparison of second cancer in therapeutically irradiated populations with the Japanese atomic bomb survivors. Radiat Environ Biophys 1999, 38: 267-283.

108. Rudel RA, Attfield KR, Schifano JN, Brody JG: Chemicals causing mammary gland tumors in animals signal new directions for epidemiology, chemicals testing, and risk assessment for breast cancer prevention. Cancer 2007, 109: 2635-2666.

109. Vogel JM: Perils of paradigm: complexity, policy design, and the Endocrine Disruptor Screening Program. Environ Health 2005, 4: 2.

110. Colborn T, vom Saal FS, Soto AM: Developmental effects of endocrine-disrupting chemicals in wildlife and humans. Environ Health Perspect 1993, 101: 378-384.

111. Fry DM: Reproductive effects in birds exposed to pesticides and industrial chemicals. Environ Health Perspect 1995, 103 Suppl 7: 165-171.

112. Jobling S, Nolan M, Tyler C, Brighty G, Tyler C: Widespread sexual disruption in wild fish. Environ Sci Technol 1998, 32: 2498-2506.

113. Guzelian PS: Comparative toxicology of chlordecone (Kepone) in humans and experimental animals. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1982, 22: 89-113.

170

114. Dalvie MA, Myers JE: The relationship between reproductive outcome measures in DDT exposed malaria vector control workers: a cross-sectional study. J Occup Med Toxicol 2006, 1: 21.

115. Golden RJ, Noller KL, Titus-Ernstoff L, Kaufman RH, Mittendorf R, Stillman R et al.: Environmental endocrine modulators and human health: an assessment of the biological evidence. Crit Rev Toxicol 1998, 28: 109-227.

116. Sharpe RM, Skakkebaek NE: Are oestrogens involved in falling sperm counts and disorders of the male reproductive tract? Lancet 1993, 341: 1392-1395.

117. Fisher JS: Are all EDC effects mediated via steroid hormone receptors? Toxicology 2004, 205: 33-41.

118. Whitehead SA, Rice S: Endocrine-disrupting chemicals as modulators of sex steroid synthesis. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2006, 20: 45-61.

119. Kavlock RJ: Overview of endocrine disruptor research activity in the United States. Chemosphere 1999, 39: 1227-1236.

120. Lorenz S: Toxicology. E.U. shifts endocrine disrupter research into overdrive. Science 2003, 300: 1069.

121. Reiter LW, DeRosa C, Kavlock RJ, Lucier G, Mac MJ, Melillo J et al.: The U.S. federal framework for research on endocrine disruptors and an analysis of research programs supported during fiscal year 1996. Environ Health Perspect 1998, 106: 105-113.

122. Silva E, Rajapakse N, Kortenkamp A: Something from "nothing"--eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environ Sci Technol 2002, 36: 1751-1756.

123. Arcaro KF, Vakharia DD, Yang Y, Gierthy JF: Lack of synergy by mixtures of weakly estrogenic hydroxylated polychlorinated biphenyls and pesticides. Environ Health Perspect 1998, 106 Suppl 4: 1041-1046.

124. Mumtaz MM, Tully DB, El Masri HA, De Rosa CT: Gene induction studies and toxicity of chemical mixtures. Environ Health Perspect 2002, 110 Suppl 6: 947-956.

125. Payne J, Scholze M, Kortenkamp A: Mixtures of four organochlorines enhance human breast cancer cell proliferation. Environ Health Perspect 2001, 109: 391-397.

126. Desaulniers D, Leingartner K, Russo J, Perkins G, Chittim BG, Archer MC et al.: Modulatory effects of neonatal exposure to TCDD, or a mixture of PCBs, p,p'-

171

DDT, and p-p'-DDE, on methylnitrosourea-induced mammary tumor development in the rat. Environ Health Perspect 2001, 109: 739-747.

127. Schrader TJ, Cooke GM: Effects of Aroclors and individual PCB congeners on activation of the human androgen receptor in vitro. Reprod Toxicol 2003, 17: 15-23.

128. Desaulniers D, Cooke GM, Leingartner K, Soumano K, Cole J, Yang J et al.: Effects of postnatal exposure to a mixture of polychlorinated biphenyls, p,p'-dichlorodiphenyltrichloroethane, and p-p'-dichlorodiphenyldichloroethene in prepubertal and adult female Sprague-Dawley rats. Int J Toxicol 2005, 24: 111-127.

129. Goerke H, Weber K, Bornemann H, Ramdohr S, Plotz J: Increasing levels and biomagnification of persistent organic pollutants (POPs) in Antarctic biota. Mar Pollut Bull 2004, 48: 295-302.

130. Thornton J: Pandora's Poison : Chlorine, Health, and a New Environmental Strategy. Cambridge, Mass.: 2000.

131. La RC, Mantovani A: From environment to food: the case of PCB. Ann Ist Super Sanita 2006, 42: 410-416.

132. Yang M, Park MS, Lee HS: Endocrine disrupting chemicals: human exposure and health risks. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev 2006, 24: 183-224.

133. De SS, Sergeant H, Piette M, Bruneel N, Van d, V, Van PC: Monitoring of polychlorinated biphenyls in Belgian human adipose tissue samples. Chemosphere 2005, 58: 953-960.

134. Safe SH: Polychlorinated biphenyls (PCBs): environmental impact, biochemical and toxic responses, and implications for risk assessment. Crit Rev Oncog 1994, 24: 87-149.

135. Santé Canada. Étude sur les poissons et fruits de mer. Santé Canada . 2002. Ref Type: Electronic Citation

136. Carpenter DO: Polychlorinated biphenyls (PCBs): routes of exposure and effects on human health. Rev Environ Health 2006, 21: 1-23.

137. Knerr S, Schrenk D: Carcinogenicity of "non-dioxinlike" polychlorinated biphenyls. Crit Rev Oncog 2006, 36: 663-694.

138. Fielden MR, Chen I, Chittim B, Safe SH, Zacharewski TR: Examination of the estrogenicity of 2,4,6,2',6'-pentachlorobiphenyl (PCB 104), its hydroxylated metabolite 2,4,6,2',6'-pentachloro-4-biphenylol (HO-PCB 104), and a further chlorinated derivative, 2,4,6,2',4',6'-hexachlorobiphenyl (PCB 155). Environ Health Perspect 1997, 105: 1238-1248.

172

139. Ma R, Sassoon DA: PCBs exert an estrogenic effect through repression of the Wnt7a signaling pathway in the female reproductive tract. Environ Health Perspect 2006, 114: 898-904.

140. U.S.Department of Health and Human Services PHSNTP, .. Report on Carcinogens, Eleventh Edition. 2004. Ref Type: Music Score

141. Walker K: Cost-comparison of DDT and alternative insecticides for malaria control. Med Vet Entomol 2000, 14: 345-354.

142. Rehwagen C: WHO recommends DDT to control malaria. BMJ 2006, 333: 622.

143. Rogan WJ, Chen A: Health risks and benefits of bis(4-chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane (DDT). Lancet 2005, 366: 763-773.

144. Beard J: DDT and human health. Sci Total Environ 2006, 355: 78-89.

145. Travis CC, Arms AD: Bioconcentration of organics in beef, milk, and vegetation. Environ Sci Technol 1988, Vol. 22: 271-274.

146. Kutz FW, Wood PH, Bottimore DP: Organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls in human adipose tissue. Rev Environ Contam Toxicol 1991, 120: 1-82.

147. Muir DC, Wagemann R, Hargrave BT, Thomas DJ, Peakall DB, Norstrom RJ: Arctic marine ecosystem contamination. Sci Total Environ 1992, 122: 75-134.

148. Schildkraut JM, mark-Wahnefried W, DeVoto E, Hughes C, Laseter JL, Newman B: Environmental contaminants and body fat distribution. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999, 8: 179-183.

149. Trotter WJ, Dickerson R: Pesticide residues in composited milk collected through the U.S. Pasteurized Milk Network. J AOAC Int 1993, 76: 1220-1225.

150. Waliszewski SM, Pardio VT, Waliszewski KN, Chantiri JN, Infanzon RM, Rivera J: Detection of some organochlorine pesticides in cow's milk. Food Addit Contam 1996, 13: 231-235.

151. Wong SK, Lee WO: Survey of organochlorine pesticide residues in milk in Hong Kong (1993-1995). J AOAC Int 1997, 80: 1332-1335.

152. Yu HF, Zhao XD, Zhao JH, Zhu ZQ, Zhao Z: Continuous surveillance of organochlorine pesticides in human milk from 1983 to 1998 in Beijing, China. Int J Environ Health Res 2006, 16: 21-26.

153. Snedeker SM: Pesticides and breast cancer risk: a review of DDT, DDE, and dieldrin. Environ Health Perspect 2001, 109 Suppl 1: 35-47.

173

154. Frigo DE, Burow ME, Mitchell KA, Chiang TC, McLachlan JA: DDT and its metabolites alter gene expression in human uterine cell lines through estrogen receptor-independent mechanisms. Environ Health Perspect 2002, 110: 1239-1245.

155. Robison AK, Sirbasku DA, Stancel GM: DDT supports the growth of an estrogen-responsive tumor. Toxicol Lett 1985, 27: 109-113.

156. Kelce WR, Stone CR, Laws SC, Gray LE, Kemppainen JA, Wilson EM: Persistent DDT metabolite p,p'-DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature 1995, 375: 581-585.

157. Arctic monitoring and assessment program: AMAP Assesment report: article pollution issues. Olso, Norway: 1998.

158. Chlordane. Environmental Protection Agency . 2007. Ref Type: Electronic Citation

159. Mattina MJ, Iannucci-Berger W, Dykas L: Chlordane uptake and its translocation in food crops. J Agric Food Chem 2000, 48: 1909-1915.

160. Eitzer BD, Iannucci-Berger W, Mattina MI: Volatilization of weathered chiral and achiral chlordane residues from soil. Environ Sci Technol 2003, 37: 4887-4893.

161. Offenberg JH, Naumova YY, Turpin BJ, Eisenreich SJ, Morandi MT, Stock T et al.: Chlordanes in the indoor and outdoor air of three U.S. cities. Environ Sci Technol 2004, 38: 2760-2768.

162. Sun P, Backus S, Blanchard P, Hites RA: Temporal and spatial trends of organochlorine pesticides in Great Lakes precipitation. Environ Sci Technol 2006, 40: 2135-2141.

163. Hoekstra PF, O'Hara TM, Karlsson H, Solomon KR, Muir DC: Enantiomer-specific biomagnification of alpha-hexachlorocyclohexane and selected chiral chlordane-related compounds within an Arctic marine food web. Environ Toxicol Chem 2003, 22: 2482-2491.

164. de Geus HJ, Besselink H, Brouwer A, Klungsoyr J, McHugh B, Nixon E et al.: Environmental occurrence, analysis, and toxicology of toxaphene compounds. Environ Health Perspect 1999, 107 Suppl 1: 115-144.

165. Purdue MP, Hoppin JA, Blair A, Dosemeci M, Alavanja MC: Occupational exposure to organochlorine insecticides and cancer incidence in the Agricultural Health Study. Int J Cancer 2007, 120: 642-649.

166. Stern GA, Muir DCG, Ford CA, Grift NP, Dewailly E, Bidleman TF et al.: Isolation and identification of two major recalcitrant toxaphene congeners in aquatic biota. Environ Sci Technol 1992, 26(9): 1838-1840.

174

167. Ramamoorthy K, Wang F, Chen IC, Norris JD, McDonnell DP, Leonard LS et al.: Estrogenic activity of a dieldrin/toxaphene mixture in the mouse uterus, MCF-7 human breast cancer cells, and yeast-based estrogen receptor assays: no apparent synergism. Endocrinology 1997, 138: 1520-1527.

168. The Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Draft toxicologiacal profil for toxaphene. 1994. U.S Department of health and human services, Atlanta. Ref Type: Report

169. Whaley DA, Keyes D, Khorrami B: Incorporation of endocrine disruption into chemical hazard scoring for pollution prevention and current list of endocrine disrupting chemicals. Drug Chem Toxicol 2001, 24: 359-420.

170. Bidleman TF, Kylin H, Jantunen LM, Helm PA, Macdonald RW: Hexachlorocyclohexanes in the Canadian archipelago. 1. Spatial distribution and pathways of alpha-, beta- and gamma-HCHS in surface water. Environ Sci Technol 2007, 41: 2688-2695.

171. Steinmetz R, Young PC, Caperell-Grant A, Gize EA, Madhukar BV, Ben-Jonathan N et al.: Novel estrogenic action of the pesticide residue beta-hexachlorocyclohexane in human breast cancer cells. Cancer Res 1996, 56: 5403-5409.

172. Wong PS, Matsumura F: Promotion of breast cancer by beta-Hexachlorocyclohexane in MCF10AT1 cells and MMTV-neu mice. BMC Cancer 2007, 7: 130.

173. Jorgenson JL: Aldrin and dieldrin: a review of research on their production, environmental deposition and fate, bioaccumulation, toxicology, and epidemiology in the United States. Environ Health Perspect 2001, 109 Suppl 1: 113-139.

174. Scheele JS: A comparison of the concentrations of certain pesticides and polychlorinated hydrocarbons in bone marrow and fat tissue. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1998, 17: 65-68.

175. Soto AM, Chung KL, Sonnenschein C: The pesticides endosulfan, toxaphene, and dieldrin have estrogenic effects on human estrogen-sensitive cells. Environ Health Perspect 1994, 102: 380-383.

176. Erdogrul O, Covaci A, Kurtul N, Schepens P: Levels of organohalogenated persistent pollutants in human milk from Kahramanmaras region, Turkey. Environ Int 2004, 30: 659-666.

177. Chiuchiolo AL, Dickhut RM, Cochran MA, Ducklow HW: Persistent organic pollutants at the base of the Antarctic marine food web. Environ Sci Technol 2004, 38: 3551-3557.

175

178. Charlier C, Foidart JM, Pitance F, Herman P, Gaspard U, Meurisse M et al.: Environmental dichlorodiphenyltrichlorethane or hexachlorobenzene exposure and breast cancer: is there a risk? Clin Chem Lab Med 2004, 42: 222-227.

179. Fisher BE: Most unwanted. Environ Health Perspect 1999, 107: A18-A23.

180. Hickey JP, Batterman SA, Chernyak SM: Trends of chlorinated organic contaminants in great lakes trout and walleye from 1970 to 1998. Arch Environ Contam Toxicol 2006, 50: 97-110.

181. Warner W: Inhibitory effect of chlordecone and mirex on steroid synthesis in Y-1 cells. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1987, 7: 47-54.

182. Anderson DR, Fisher R: Sources of dioxins in the United Kingdom: the steel industry and other sources. Chemosphere 2002, 46: 371-381.

183. National Library of Medicine. ChemIDplus. 2007. Ref Type: Internet Communication

184. Hays SM, Aylward LL: Dioxin risks in perspective: past, present, and future. Regul Toxicol Pharmacol 2003, 37: 202-217.

185. Charnley G, Doull J: Human exposure to dioxins from food, 1999-2002. Food Chem Toxicol 2005, 43: 671-679.

186. Rifkind AB: CYP1A in TCDD toxicity and in physiology-with particular reference to CYP dependent arachidonic acid metabolism and other endogenous substrates. Drug Metab Rev 2006, 38: 291-335.

187. Vorderstrasse BA, Fenton SE, Bohn AA, Cundiff JA, Lawrence BP: A novel effect of dioxin: exposure during pregnancy severely impairs mammary gland differentiation. Toxicol Sci 2004, 78: 248-257.

188. Ikonomou MG, Fernandez MP, Hickman ZL: Spatio-temporal and species-specific variation in PBDE levels/patterns in British Columbia's coastal waters. Environ Pollut 2006, 140: 355-363.

189. Santé Canada. Rapport sur l'état des connaissances scientifiques sous-jacentes à une évaluation préalable des effets sur la santé. 2006. Ref Type: Report

190. Stoker TE, Cooper RL, Lambright CS, Wilson VS, Furr J, Gray LE: In vivo and in vitro anti-androgenic effects of DE-71, a commercial polybrominated diphenyl ether (PBDE) mixture. Toxicol Appl Pharmacol 2005, 207: 78-88.

176

191. Tsumura Y, Kaihara A, Ishimitsu S, Yoshii K, Tonogai Y: [Contents of plasticizers in cap-sealing for bottled food and their migration into food]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi 2002, 43: 377-384.

192. vom Saal FS, Hughes C: An extensive new literature concerning low-dose effects of bisphenol A shows the need for a new risk assessment. Environ Health Perspect 2005, 113: 926-933.

193. Kang JH, Katayama Y, Kondo F: Biodegradation or metabolism of bisphenol A: from microorganisms to mammals. Toxicology 2006, 217: 81-90.

194. Wittassek M, Wiesmuller GA, Koch HM, Eckard R, Dobler L, Muller J et al.: Internal phthalate exposure over the last two decades--a retrospective human biomonitoring study. Int J Hyg Environ Health 2007, 210: 319-333.

195. Schettler T: Human exposure to phthalates via consumer products. Int J Androl 2006, 29: 134-139.

196. Dalsenter PR, Santana GM, Grande SW, Andrade AJ, Araujo SL: Phthalate affect the reproductive function and sexual behavior of male Wistar rats. Hum Exp Toxicol 2006, 25: 297-303.

197. Latini G, Del VA, Massaro M, Verrotti A, De FC: Phthalate exposure and male infertility. Toxicology 2006, 226: 90-98.

198. Lee BM, Koo HJ: Hershberger assay for antiandrogenic effects of phthalates. J Toxicol Environ Health A 2007, 70: 1365-1370.

199. Cikim AS, Ozbey N, Sencer E, Molvalilar S, Orhan Y: Associations among sex hormone binding globulin concentrations and characteristics of the metabolic syndrome in obese women. Diabetes Nutr Metab 2004, 17: 290-295.

200. Colon I, Caro D, Bourdony CJ, Rosario O: Identification of phthalate esters in the serum of young Puerto Rican girls with premature breast development. Environ Health Perspect 2000, 108: 895-900.

201. Guenther K, Heinke V, Thiele B, Kleist E, Prast H, Raecker T: Endocrine disrupting nonylphenols are ubiquitous in food. Environ Sci Technol 2002, 36: 1676-1680.

202. Keith TL, Snyder SA, Naylor CG, Staples CA, Summer C, Kannan K et al.: Identification and quantitation of nonylphenol ethoxylates and nonylphenol in fish tissues from Michigan. Environ Sci Technol 2001, 35: 10-13.

203. Kannan K, Keith TL, Naylor CG, Staples CA, Snyder SA, Giesy JP: Nonylphenol and nonylphenol ethoxylates in fish, sediment, and water from the Kalamazoo River, Michigan. Arch Environ Contam Toxicol 2003, 44: 77-82.

177

204. Shao B, Hu J, Yang M, An W, Tao S: Nonylphenol and nonylphenol ethoxylates in river water, drinking water,and fish tissues in the area of Chongqing, China. Arch Environ Contam Toxicol 2005, 48: 467-473.

205. Preuss TG, Gehrhardt J, Schirmer K, Coors A, Rubach M, Russ A et al.: Nonylphenol isomers differ in estrogenic activity. Environ Sci Technol 2006, 40: 5147-5153.

206. Bechi N, Ietta F, Romagnoli R, Focardi S, Corsi I, Buffi C et al.: Estrogen-like response to p-nonylphenol in human first trimester placenta and BeWo choriocarcinoma cells. Toxicol Sci 2006, 93: 75-81.

207. Monteiro-Riviere NA, Van Miller JP, Simon G, Joiner RL, Brooks JD, Riviere JE: Comparative in vitro percutaneous absorption of nonylphenol and nonylphenol ethoxylates (NPE-4 and NPE-9) through human, porcine and rat skin. Toxicolz Ind Health 2000, 16: 49-57.

208. Vanderford BJ, Pearson RA, Rexing DJ, Snyder SA: Analysis of endocrine disruptors, pharmaceuticals, and personal care products in water using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Anal Chem 2003, 75: 6265-6274.

209. Vanderford BJ, Snyder SA: Analysis of pharmaceuticals in water by isotope dilution liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Environ Sci Technol 2006, 40: 7312-7320.

210. Westerhoff P, Yoon Y, Snyder S, Wert E: Fate of endocrine-disruptor, pharmaceutical, and personal care product chemicals during simulated drinking water treatment processes. Environ Sci Technol 2005, 39: 6649-6663.

211. Darbre PD: Aluminium, antiperspirants and breast cancer. J Inorg Biochem 2005, 99: 1912-1919.

212. Cravedi JP, Zalko D, Savouret JF, Menuet A, Jegou B: [The concept of endocrine disruption and human health]. Med Sci (Paris) 2007, 23: 198-204.

213. Gorski J, Welshons W, Sakai D: Remodeling the estrogen receptor model. Mol Cell Endocrinol 1984, 36: 11-15.

214. Reel JR, Lamb IV JC, Neal BH: Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam Appl Toxicol 1996, 34: 288-305.

215. Shelby MD, Newbold RR, Tully DB, Chae K, Davis VL: Assessing environmental chemicals for estrogenicity using a combination of in vitro and in vivo assays. Environ Health Perspect 1996, 104: 1296-1300.

178

216. Nagel SC, vom Saal FS, Thayer KA, Dhar MG, Boechler M, Welshons WV: Relative binding affinity-serum modified access (RBA-SMA) assay predicts the relative in vivo bioactivity of the xenoestrogens bisphenol A and octylphenol. Environ Health Perspect 1997, 105: 70-76.

217. Bitman J, Cecil HC, Harris SJ, Fries GF: Estrogenic activity of o,p'-DDT in the mammalian uterus and avian oviduct. Science 1968, 162: 371-372.

218. Bitman J, Cecil HC: Estrogenic activity of DDT analogs and polychlorinated biphenyls. J Agric Food Chem 1970, 18: 1108-1112.

219. Soto AM, Sonnenschein C, Chung KL, Fernandez MF, Olea N, Serrano FO: The E-SCREEN assay as a tool to identify estrogens: an update on estrogenic environmental pollutants. Environ Health Perspect 1995, 103 Suppl 7: 113-122.

220. Starek A: Estrogens and organochlorine xenoestrogens and breast cancer risk. Int J Occup Med Environ Health 2003, 16: 113-124.

221. Howell A: Pure oestrogen antagonists for the treatment of advanced breast cancer. Endocr Relat Cancer 2006, 13: 689-706.

222. Pliska V: Partial agonism: mechanisms based on ligand-receptor interactions and on stimulus-response coupling. J Recept Signal Transduct Res 1999, 19: 597-629.

223. Longnecker MP, Gladen BC, Cupul-Uicab LA, Romano-Riquer SP, Weber JP, Chapin RE et al.: In utero exposure to the antiandrogen 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene (DDE) in relation to anogenital distance in male newborns from Chiapas, Mexico. Am J Epidemiol 2007, 165: 1015-1022.

224. Kavlock R, Cummings A: Mode of action: inhibition of androgen receptor function--vinclozolin-induced malformations in reproductive development. Crit Rev Toxicol 2005, 35: 721-726.

225. Sultan C, Balaguer P, Terouanne B, Georget V, Paris F, Jeandel C et al.: Environmental xenoestrogens, antiandrogens and disorders of male sexual differentiation. Mol Cell Endocrinol 2001, 178: 99-105.

226. Wong CK, Keung WM: Bovine adrenal 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase (E.C. 1.1.1. 145)/5-ene-4-ene isomerase (E.C. 5.3.3.1): characterization and its inhibition by isoflavones. J Steroid Biochem Mol Biol 1999, 71: 191-202.

227. Makela S, Poutanen M, Lehtimaki J, Kostian ML, Santti R, Vihko R: Estrogen-specific 17 beta-hydroxysteroid oxidoreductase type 1 (E.C. 1.1.1.62) as a possible target for the action of phytoestrogens. Proc Soc Exp Biol Med 1995, 208: 51-59.

179

228. Younglai EV, Holloway AC, Lim GE, Foster WG: Synergistic effects between FSH and 1,1-dichloro-2,2-bis(P-chlorophenyl)ethylene (P,P'-DDE) on human granulosa cell aromatase activity. Hum Reprod 2004, 19: 1089-1093.

229. Allera A, Lo S, King I, Steglich F, Klingmuller D: Impact of androgenic/antiandrogenic compounds (AAC) on human sex steroid metabolizing key enzymes. Toxicology 2004, 205: 75-85.

230. Sanderson JT, Boerma J, Lansbergen GW, Van den BM: Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells. Toxicol Appl Pharmacol 2002, 182: 44-54.

231. Kester MH, Bulduk S, Tibboel D, Meinl W, Glatt H, Falany CN et al.: Potent inhibition of estrogen sulfotransferase by hydroxylated PCB metabolites: a novel pathway explaining the estrogenic activity of PCBs. Endocrinology 2000, 141: 1897-1900.

232. Kester MH, Bulduk S, van TH, Tibboel D, Meinl W, Glatt H et al.: Potent inhibition of estrogen sulfotransferase by hydroxylated metabolites of polyhalogenated aromatic hydrocarbons reveals alternative mechanism for estrogenic activity of endocrine disrupters. J Clin Endocrinol Metab 2002, 87: 1142-1150.

233. Zhang Y, Gaikwad NW, Olson K, Zahid M, Cavalieri EL, Rogan EG: Cytochrome P450 isoforms catalyze formation of catechol estrogen quinones that react with DNA. Metabolism 2007, 56: 887-894.

234. Danzo BJ: Environmental xenobiotics may disrupt normal endocrine function by interfering with the binding of physiological ligands to steroid receptors and binding proteins. Environ Health Perspect 1997, 105: 294-301.

235. Dechaud H, Ravard C, Claustrat F, de la Perriere AB, Pugeat M: Xenoestrogen interaction with human sex hormone-binding globulin (hSHBG). Steroids 1999, 64: 328-334.

236. Kang SC, Lee BM: DNA methylation of estrogen receptor alpha gene by phthalates. J Toxicol Environ Health A 2005, 68: 1995-2003.

237. Shoker BS, Jarvis C, Sibson DR, Walker C, Sloane JP: Oestrogen receptor expression in the normal and pre-cancerous breast. J Pathol 1999, 188: 237-244.

238. Khan SA, Rogers MA, Khurana KK, Siddiqui JF: Oestrogen receptor expression in normal breast epithelium. Eur J Cancer 2000, 36 Suppl 4: S27-S28.

239. Grunfeld HT, Bonefeld-Jorgensen EC: Effect of in vitro estrogenic pesticides on human oestrogen receptor alpha and beta mRNA levels. Toxicol Lett 2004, 151: 467-480.

180

240. Safe SH: Endocrine disruptors and human health--is there a problem? An update. Environ Health Perspect 2000, 108: 487-493.

241. Markey CM, Luque EH, Munoz De TM, Sonnenschein C, Soto AM: In utero exposure to bisphenol A alters the development and tissue organization of the mouse mammary gland. Biol Reprod 2001, 65: 1215-1223.

242. Braun MM, Ahlbom A, Floderus B, Brinton LA, Hoover RN: Effect of twinship on incidence of cancer of the testis, breast, and other sites (Sweden). Cancer Causes Control 1995, 6: 519-524.

243. Hilakivi-Clarke L, de AS: Fetal origins of breast cancer. Trends Endocrinol Metab 2006, 17: 340-348.

244. Schrager S, Potter BE: Diethylstilbestrol exposure. Am Fam Physician 2004, 69: 2395-2400.

245. Mendez MA, Arab L: Organochlorine compounds and breast cancer risk . Pure Appl Chem 2003, 75: 1973-2015.

246. Demers A, Ayotte P, Brisson J, Dodin S, Robert J, Dewailly E: Risk and aggressiveness of breast cancer in relation to plasma organochlorine concentrations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000, 9: 161-166.

247. Lanzino M, De Amicis F, McPhaul MJ, Marsico S, Panno ML, Ando S: Endogenous coactivator ARA70 interacts with estrogen receptor alpha (ERalpha) and modulates the functional ERalpha/androgen receptor interplay in MCF-7 cells. J Biol Chem 2005, 280: 20421-20430.

248. Matthews J, Gustafsson JA: Estrogen receptor and aryl hydrocarbon receptor signaling pathways. Nucl Recept Signal 2006, 4: e016.

249. Chou PH, Matsui S, Misaki K, Matsuda T: Isolation and identification of xenobiotic aryl hydrocarbon receptor ligands in dyeing wastewater. Environ Sci Technol 2007, 41: 652-657.

250. Bain DL, Heneghan AF, Connaghan-Jones KD, Miura MT: Nuclear receptor structure: implications for function. Annu Rev Physiol 2007, 69: 201-220.

251. Wierman ME: Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Adv Physiol Educ 2007, 31: 26-33.

252. Oostenbrink BC, Pitera JW, van Lipzig MM, Meerman JH, van Gunsteren WF: Simulations of the estrogen receptor ligand-binding domain: affinity of natural ligands and xenoestrogens. J Med Chem 2000, 43: 4594-4605.

181

253. Pike AC, Brzozowski AM, Hubbard RE, Bonn T, Thorsell AG, Engstrom O et al.: Structure of the ligand-binding domain of oestrogen receptor beta in the presence of a partial agonist and a full antagonist. EMBO J 1999, 18: 4608-4618.

254. Pratt WB, Toft DO: Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr Rev 1997, 18: 306-360.

255. Watanabe M, Yanagisawa J, Kitagawa H, Takeyama K, Ogawa S, Arao Y et al.: A subfamily of RNA-binding DEAD-box proteins acts as an estrogen receptor alpha coactivator through the N-terminal activation domain (AF-1) with an RNA coactivator, SRA. EMBO J 2001, 20: 1341-1352.

256. Pedram A, Razandi M, Sainson RC, Kim JK, Hughes CC, Levin ER: A conserved mechanism for steroid receptor translocation to the plasma membrane. J Biol Chem 2007.

257. Powell CE, Soto AM, Sonnenschein C: Identification and characterization of membrane estrogen receptor from MCF7 estrogen-target cells. J Steroid Biochem Mol Biol 2001, 77: 97-108.

258. Pedram A, Razandi M, Levin ER: Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane. Mol Endocrinol 2006, 20: 1996-2009.

259. Falkenstein E, Tillmann HC, Christ M, Feuring M, Wehling M: Multiple actions of steroid hormones--a focus on rapid, nongenomic effects. Pharmacol Rev 2000, 52: 513-556.

260. Bulayeva NN, Watson CS: Xenoestrogen-induced ERK-1 and ERK-2 activation via multiple membrane-initiated signaling pathways. Environ Health Perspect 2004, 112: 1481-1487.

261. Watson CS, Bulayeva NN, Wozniak AL, Finnerty CC: Signaling from the membrane via membrane estrogen receptor-alpha: estrogens, xenoestrogens, and phytoestrogens. Steroids 2005, 70: 364-371.

262. Hall JM, McDonnell DP: The estrogen receptor beta-isoform (ERbeta) of the human estrogen receptor modulates ERalpha transcriptional activity and is a key regulator of the cellular response to estrogens and antiestrogens. Endocrinology 1999, 140: 5566-5578.

263. Lorenzo J: A new hypothesis for how sex steroid hormones regulate bone mass. J Clin Invest 2003, 111: 1641-1643.

264. Cowley SM, Hoare S, Mosselman S, Parker MG: Estrogen receptors alpha and beta form heterodimers on DNA. J Biol Chem 1997, 272: 19858-19862.

182

265. Speirs V, Skliris GP, Burdall SE, Carder PJ: Distinct expression patterns of ER alpha and ER beta in normal human mammary gland. J Clin Pathol 2002, 55: 371-374.

266. Thornton JW: Evolution of vertebrate steroid receptors from an ancestral estrogen receptor by ligand exploitation and serial genome expansions. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98: 5671-5676.

267. Chen Z, Katzenellenbogen BS, Katzenellenbogen JA, Zhao H: Directed evolution of human estrogen receptor variants with significantly enhanced androgen specificity and affinity. J Biol Chem 2004, 279: 33855-33864.

268. Sand P, Luckhaus C, Schlurmann K, Gotz M, Deckert J: Untangling the human estrogen receptor gene structure. J Neural Transm 2002, 109: 567-583.

269. Walter P, Green S, Greene G, Krust A, Bornert JM, Jeltsch JM et al.: Cloning of the human estrogen receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1985, 82: 7889-7893.

270. Clarke R, Skaar T, Baumann K, Leonessa F, James M, Lippman J et al.: Hormonal carcinogenesis in breast cancer: cellular and molecular studies of malignant progression. Breast Cancer Res Treat 1994, 31: 237-248.

271. Lemieux P, Fuqua S: The role of the estrogen receptor in tumor progression. J Steroid Biochem Mol Biol 1996, 56: 87-91.

272. Ferguson AT, Davidson NE: Regulation of estrogen receptor alpha function in breast cancer. Crit Rev Oncog 1997, 8: 29-46.

273. Watts CK, Handel ML, King RJ, Sutherland RL: Oestrogen receptor gene structure and function in breast cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 1992, 41: 529-536.

274. Wenger CR, Beardslee S, Owens MA, Pounds G, Oldaker T, Vendely P et al.: DNA ploidy, S-phase, and steroid receptors in more than 127,000 breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 1993, 28: 9-20.

275. Kurebayashi J, Otsuki T, Kunisue H, Tanaka K, Yamamoto S, Sonoo H: Expression levels of estrogen receptor-alpha, estrogen receptor-beta, coactivators, and corepressors in breast cancer. Clin Cancer Res 2000, 6: 512-518.

276. Frasor J, Danes JM, Komm B, Chang KC, Lyttle CR, Katzenellenbogen BS: Profiling of estrogen up- and down-regulated gene expression in human breast cancer cells: insights into gene networks and pathways underlying estrogenic control of proliferation and cell phenotype. Endocrinology 2003, 144: 4562-4574.

277. Hong EJ, Park SH, Choi KC, Leung PC, Jeung EB: Identification of estrogen-regulated genes by microarray analysis of the uterus of immature rats exposed to endocrine disrupting chemicals. Reprod Biol Endocrinol 2006, 4: 49.

183

278. Piva R, Rimondi AP, Hanau S, Maestri I, Alvisi A, Kumar VL et al.: Different methylation of oestrogen receptor DNA in human breast carcinomas with and without oestrogen receptor. Br J Cancer 1990, 61: 270-275.

279. Falette NS, Fuqua SA, Chamness GC, Cheah MS, Greene GL, McGuire WL: Estrogen receptor gene methylation in human breast tumors. Cancer Res 1990, 50: 3974-3978.

280. Mosselman S, Polman J, Dijkema R: ER beta: identification and characterization of a novel human estrogen receptor. FEBS Lett 1996, 392: 49-53.

281. Treeck O, Pfeiler G, Horn F, Federhofer B, Houlihan H, Vollmer A et al.: Novel estrogen receptor beta transcript variants identified in human breast cancer cells affect cell growth and apoptosis of COS-1 cells. Mol Cell Endocrinol 2007, 264: 50-60.

282. Enmark E, Pelto-Huikko M, Grandien K, Lagercrantz S, Lagercrantz J, Fried G et al.: Human estrogen receptor beta-gene structure, chromosomal localization, and expression pattern. J Clin Endocrinol Metab 1997, 82: 4258-4265.

283. Leygue E, Dotzlaw H, Watson PH, Murphy LC: Altered estrogen receptor alpha and beta messenger RNA expression during human breast tumorigenesis. Cancer Res 1998, 58: 3197-3201.

284. Roger P, Sahla ME, Makela S, Gustafsson JA, Baldet P, Rochefort H: Decreased expression of estrogen receptor beta protein in proliferative preinvasive mammary tumors. Cancer Res 2001, 61: 2537-2541.

285. Skliris GP, Munot K, Bell SM, Carder PJ, Lane S, Horgan K et al.: Reduced expression of oestrogen receptor beta in invasive breast cancer and its re-expression using DNA methyl transferase inhibitors in a cell line model. J Pathol 2003, 201: 213-220.

286. Kuiper GG, Carlsson B, Grandien K, Enmark E, Haggblad J, Nilsson S et al.: Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta. Endocrinology 1997, 138: 863-870.

287. Routledge EJ, White R, Parker MG, Sumpter JP: Differential effects of xenoestrogens on coactivator recruitment by estrogen receptor (ER) alpha and ERbeta. J Biol Chem 2000, 275: 35986-35993.

288. Hall JM, Korach KS: Analysis of the molecular mechanisms of human estrogen receptors alpha and beta reveals differential specificity in target promoter regulation by xenoestrogens. J Biol Chem 2002, 277: 44455-44461.

184

289. Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, Corton JC, Safe SH, van der Saag PT et al.: Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology 1998, 139: 4252-4263.

290. Lemaire G, Mnif W, Mauvais P, Balaguer P, Rahmani R: Activation of alpha- and beta-estrogen receptors by persistent pesticides in reporter cell lines. Life Sci 2006, 79: 1160-1169.

291. Omoto Y, Eguchi H, Yamamoto-Yamaguchi Y, Hayashi S: Estrogen receptor (ER) beta1 and ERbetacx/beta2 inhibit ERalpha function differently in breast cancer cell line MCF7. Oncogene 2003, 22: 5011-5020.

292. Strom A, Hartman J, Foster JS, Kietz S, Wimalasena J, Gustafsson JA: Estrogen receptor beta inhibits 17beta-estradiol-stimulated proliferation of the breast cancer cell line T47D. Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101: 1566-1571.

293. Saji S, Hirose M, Toi M: Clinical significance of estrogen receptor beta in breast cancer. Cancer Chemother Pharmacol 2005, 56 Suppl 1: 21-26.

294. Misrahi M, Atger M, d'Auriol L, Loosfelt H, Meriel C, Fridlansky F et al.: Complete amino acid sequence of the human progesterone receptor deduced from cloned cDNA. Biochem Biophys Res Commun 1987, 143: 740-748.

295. Horwitz KB, Zava DT, Thilagar AK, Jensen EM, McGuire WL: Steroid receptor analyses of nine human breast cancer cell lines. Cancer Res 1978, 38: 2434-2437.

296. Mockus MB, Lessey BA, Bower MA, Horwitz KB: Estrogen-insensitive progesterone receptors in a human breast cancer cell line: characterization of receptors and of a ligand exchange assay. Endocrinology 1982, 110: 1564-1571.

297. Aupperlee M, Kariagina A, Osuch J, Haslam SZ: Progestins and breast cancer. Breast Dis 2005, 24: 37-57.

298. Conneely OM, Mulac-Jericevic B, DeMayo F, Lydon JP, O'Malley BW: Reproductive functions of progesterone receptors. Recent Prog Horm Res 2002, 57: 339-355.

299. Graham JD, Yeates C, Balleine RL, Harvey SS, Milliken JS, Bilous AM et al.: Characterization of progesterone receptor A and B expression in human breast cancer. Cancer Res 1995, 55: 5063-5068.

300. Mote PA, Bartow S, Tran N, Clarke CL: Loss of co-ordinate expression of progesterone receptors A and B is an early event in breast carcinogenesis. Breast Cancer Res Treat 2002, 72: 163-172.

185

301. Jacobsen BM, Richer JK, Sartorius CA, Horwitz KB: Expression profiling of human breast cancers and gene regulation by progesterone receptors. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2003, 8: 257-268.

302. Said TK, Conneely OM, Medina D, O'Malley BW, Lydon JP: Progesterone, in addition to estrogen, induces cyclin D1 expression in the murine mammary epithelial cell, in vivo. Endocrinology 1997, 138: 3933-3939.

303. Yu Q, Geng Y, Sicinski P: Specific protection against breast cancers by cyclin D1 ablation. Nature 2001, 411: 1017-1021.

304. Arnold A, Papanikolaou A: Cyclin D1 in breast cancer pathogenesis. J Clin Oncol 2005, 23: 4215-4224.

305. Aupperlee MD, Haslam SZ: Differential hormonal regulation and function of progesterone receptor isoforms in normal adult mouse mammary gland. Endocrinology 2007, 148: 2290-2300.

306. El Etreby MF, Liang Y: Effect of antiprogestins and tamoxifen on growth inhibition of MCF-7 human breast cancer cells in nude mice. Breast Cancer Res Treat 1998, 49: 109-117.

307. Klijn JG, Setyono-Han B, Sander HJ, Lamberts SW, de Jong FH, Deckers GH et al.: Pre-clinical and clinical treatment of breast cancer with antiprogestins. Hum Reprod 1994, 9 Suppl 1: 181-189.

308. Nishino Y, Schneider MR, Michna H: Enhancement of the antitumor efficacy of the antiprogestin, onapristone, by combination with the antiestrogen, ICI 164384. J Cancer Res Clin Oncol 1994, 120: 298-302.

309. Poole AJ, Li Y, Kim Y, Lin SC, Lee WH, Lee EY: Prevention of Brca1-mediated mammary tumorigenesis in mice by a progesterone antagonist. Science 2006, 314: 1467-1470.

310. Klotz DM, Arnold SF, McLachlan JA: Inhibition of 17 beta-estradiol and progesterone activity in human breast and endometrial cancer cells by carbamate insecticides. Life Sci 1997, 60: 1467-1475.

311. Klotz DM, Ladlie BL, Vonier PM, McLachlan JA, Arnold SF: o,p'-DDT and its metabolites inhibit progesterone-dependent responses in yeast and human cells. Mol Cell Endocrinol 1997, 129: 63-71.

312. Scippo ML, Argiris C, Van De WC, Muller M, Willemsen P, Martial J et al.: Recombinant human estrogen, androgen and progesterone receptors for detection of potential endocrine disruptors. Anal Bioanal Chem 2004, 378: 664-669.

186

313. Trapman J, Klaassen P, Kuiper GG, van der Korput JA, Faber PW, van Rooij HC et al.: Cloning, structure and expression of a cDNA encoding the human androgen receptor. Biochem Biophys Res Commun 1988, 153: 241-248.

314. Jaworski T: Degradation and beyond: Control of androgen receptor activity by the proteasome system. Cell Mol Biol Lett 2006, 11: 109-131.

315. Dimitrakakis C, Zhou J, Wang J, Belanger A, Labrie F, Cheng C et al.: A physiologic role for testosterone in limiting estrogenic stimulation of the breast. Menopause 2003, 10: 292-298.

316. Isola JJ: Immunohistochemical demonstration of androgen receptor in breast cancer and its relationship to other prognostic factors. J Pathol 1993, 170: 31-35.

317. Brys M, Wojcik M, Romanowicz-Makowska H, Krajewska WM: Androgen receptor status in female breast cancer: RT-PCR and Western blot studies. J Cancer Res Clin Oncol 2002, 128: 85-90.

318. Soreide JA, Lea OA, Varhaug JE, Skarstein A, Kvinnsland S: Androgen receptors in operable breast cancer: relation to other steroid hormone receptors, correlations to prognostic factors and predictive value for effect of adjuvant tamoxifen treatment. Eur J Surg Oncol 1992, 18: 112-118.

319. Kemppainen JA, Lane MV, Sar M, Wilson EM: Androgen receptor phosphorylation, turnover, nuclear transport, and transcriptional activation. Specificity for steroids and antihormones. J Biol Chem 1992, 267: 968-974.

320. Birrell SN, Hall RE, Tilley WD: Role of the androgen receptor in human breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 1998, 3: 95-103.

321. Bryan RM, Mercer RJ, Bennett RC, Rennie GC, Lie TH, Morgan FJ: Androgen receptors in breast cancer. Cancer 1984, 54: 2436-2440.

322. Kuenen-Boumeester V, Van der Kwast TH, Claassen CC, Look MP, Liem GS, Klijn JG et al.: The clinical significance of androgen receptors in breast cancer and their relation to histological and cell biological parameters. Eur J Cancer 1996, 32A: 1560-1565.

323. Agoff SN, Swanson PE, Linden H, Hawes SE, Lawton TJ: Androgen receptor expression in estrogen receptor-negative breast cancer. Immunohistochemical, clinical, and prognostic associations. Am J Clin Pathol 2003, 120: 725-731.

324. Schippinger W, Regitnig P, Dandachi N, Wernecke KD, Bauernhofer T, Samonigg H et al.: Evaluation of the prognostic significance of androgen receptor expression in metastatic breast cancer. Virchows Arch 2006, 449: 24-30.

187

325. Hosokawa S, Murakami M, Ineyama M, Yamada T, Yoshitake A, Yamada H et al.: The affinity of procymidone to androgen receptor in rats and mice. J Toxicol Sci 1993, 18: 83-93.

326. Wong C, Kelce WR, Sar M, Wilson EM: Androgen receptor antagonist versus agonist activities of the fungicide vinclozolin relative to hydroxyflutamide. J Biol Chem 1995, 270: 19998-20003.

327. Lee HJ, Chattopadhyay S, Gong EY, Ahn RS, Lee K: Antiandrogenic effects of bisphenol A and nonylphenol on the function of androgen receptor. Toxicol Sci 2003, 75: 40-46.

328. Wilson VS, Cardon MC, Gray LE, Jr., Hartig PC: Competitive binding comparison of endocrine-disrupting compounds to recombinant androgen receptor from fathead minnow, rainbow trout, and human. Environ Toxicol Chem 2007, 26: 1793-1802.

329. Le HT, Schaldach CM, Firestone GL, Bjeldanes LF: Plant-derived 3,3'-Diindolylmethane is a strong androgen antagonist in human prostate cancer cells. J Biol Chem 2003, 278: 21136-21145.

330. Roy AK, Tyagi RK, Song CS, Lavrovsky Y, Ahn SC, Oh TS et al.: Androgen receptor: structural domains and functional dynamics after ligand-receptor interaction. Ann N Y Acad Sci 2001, 949: 44-57.

331. Wong CI, Zhou ZX, Sar M, Wilson EM: Steroid requirement for androgen receptor dimerization and DNA binding. Modulation by intramolecular interactions between the NH2-terminal and steroid-binding domains. J Biol Chem 1993, 268: 19004-19012.

332. Dolwick KM, Schmidt JV, Carver LA, Swanson HI, Bradfield CA: Cloning and expression of a human Ah receptor cDNA. Mol Pharmacol 1993, 44: 911-917.

333. Wilson CL, Safe S: Mechanisms of ligand-induced aryl hydrocarbon receptor-mediated biochemical and toxic responses. Toxicol Pathol 1998, 26: 657-671.

334. Jeuken A, Keser BJ, Khan E, Brouwer A, Koeman J, Denison MS: Activation of the Ah receptor by extracts of dietary herbal supplements, vegetables, and fruits. J Agric Food Chem 2003, 51: 5478-5487.

335. Henry EC, Bemis JC, Henry O, Kende AS, Gasiewicz TA: A potential endogenous ligand for the aryl hydrocarbon receptor has potent agonist activity in vitro and in vivo. Arch Biochem Biophys 2006, 450: 67-77.

336. Nebert DW, Roe AL, Dieter MZ, Solis WA, Yang Y, Dalton TP: Role of the aromatic hydrocarbon receptor and [Ah] gene battery in the oxidative stress response, cell cycle control, and apoptosis. Biochem Pharmacol 2000, 59: 65-85.

188

337. Gonzalez FJ, Nebert DW: Evolution of the P450 gene superfamily: animal-plant 'warfare', molecular drive and human genetic differences in drug oxidation. Trends Genet 1990, 6: 182-186.

338. Dalton TP, Puga A, Shertzer HG: Induction of cellular oxidative stress by aryl hydrocarbon receptor activation. Chem Biol Interact 2002, 141: 77-95.

339. Ohtake F, Takeyama K, Matsumoto T, Kitagawa H, Yamamoto Y, Nohara K et al.: Modulation of oestrogen receptor signalling by association with the activated dioxin receptor. Nature 2003, 423: 545-550.

340. Kuil CW, Brouwer A, van der Saag PT, van der BB: Interference between progesterone and dioxin signal transduction pathways. Different mechanisms are involved in repression by the progesterone receptor A and B isoforms. J Biol Chem 1998, 273: 8829-8834.

341. Thomsen JS, Wang X, Hines RN, Safe S: Restoration of aryl hydrocarbon (Ah) responsiveness in MDA-MB-231 human breast cancer cells by transient expression of the estrogen receptor. Carcinogenesis 1994, 15: 933-937.

342. Lucier GW, Tritscher A, Goldsworthy T, Foley J, Clark G, Goldstein J et al.: Ovarian hormones enhance 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-mediated increases in cell proliferation and preneoplastic foci in a two-stage model for rat hepatocarcinogenesis. Cancer Res 1991, 51: 1391-1397.

343. Wyde ME, Wong VA, Kim AH, Lucier GW, Walker NJ: Induction of hepatic 8-oxo-deoxyguanosine adducts by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in Sprague-Dawley rats is female-specific and estrogen-dependent. Chem Res Toxicol 2001, 14: 849-855.

344. Liu S, Abdelrahim M, Khan S, Ariazi E, Jordan VC, Safe S: Aryl hydrocarbon receptor agonists directly activate estrogen receptor alpha in MCF-7 breast cancer cells. Biol Chem 2006, 387: 1209-1213.

345. Matthews J, Wihlen B, Thomsen J, Gustafsson JA: Aryl hydrocarbon receptor-mediated transcription: ligand-dependent recruitment of estrogen receptor alpha to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-responsive promoters. Mol Cell Biol 2005, 25: 5317-5328.

346. Gray LE, Jr., Kelce WR, Wiese T, Tyl R, Gaido K, Cook J et al.: Endocrine Screening Methods Workshop report: detection of estrogenic and androgenic hormonal and antihormonal activity for chemicals that act via receptor or steroidogenic enzyme mechanisms. Reprod Toxicol 1997, 11: 719-750.

347. Clode SA: Assessment of in vivo assays for endocrine disruption. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2006, 20: 35-43.

189

348. Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J et al.: The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect 2007, 115: 671-678.

349. Seo HS, Journe F, Larsimont D, Sotiriou C, Leclercq G: Decrease of estrogen receptor expression and associated ERE-dependent transcription in MCF-7 breast cancer cells after oligomycin treatment. Steroids 2003, 68: 257-269.

350. Taylor-Papadimitriou J, Berdichevsky F, D'Souza B, Burchell J: Human models of breast cancer. Cancer Surv 1993, 16: 59-78.

351. Amadori D, Bertoni L, Flamigni A, Savini S, De GC, Casanova S et al.: Establishment and characterization of a new cell line from primary human breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat 1993, 28: 251-260.

352. Brooks SC, Locke ER, Soule HD: Estrogen receptor in a human cell line (MCF-7) from breast carcinoma. J Biol Chem 1973, 248: 6251-6253.

353. Rasmussen TH, Nielsen JB: Critical parameters in the MCF-7 cell proliferation bioassay (E-Screen). Biomarkers 2002, 7: 322-336.

354. Soto AM, Maffini MV, Schaeberle CM, Sonnenschein C: Strengths and weaknesses of in vitro assays for estrogenic and androgenic activity. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2006, 20: 15-33.

355. Rajapakse N, Silva E, Scholze M, Kortenkamp A: Deviation from additivity with estrogenic mixtures containing 4-nonylphenol and 4-tert-octylphenol detected in the E-SCREEN assay. Environ Sci Technol 2004, 38: 6343-6352.

356. Oh SM, Ryu BT, Lee SK, Chung KH: Antiestrogenic potentials of ortho-PCB congeners by single or complex exposure. Arch Pharm Res 2007, 30: 199-209.

357. Okubo T, Yokoyama Y, Kano K, Kano I: ER-dependent estrogenic activity of parabens assessed by proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and expression of ERalpha and PR. Food Chem Toxicol 2001, 39: 1225-1232.

358. Chen H, Xiao J, Hu G, Zhou J, Xiao H, Wang X: Estrogenicity of organophosphorus and pyrethroid pesticides. J Toxicol Environ Health A 2002, 65: 1419-1435.

359. Lacroix M, Leclercq G: Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res Treat 2004, 83: 249-289.

360. Castronovo V, Taraboletti G, Liotta LA, Sobel ME: Modulation of laminin receptor expression by estrogen and progestins in human breast cancer cell lines. J Natl Cancer Inst 1989, 81: 781-788.

190

361. Koga M, Sutherland RL: Retinoic acid acts synergistically with 1,25-dihydroxyvitamin D3 or antioestrogen to inhibit T-47D human breast cancer cell proliferation. J Steroid Biochem Mol Biol 1991, 39: 455-460.

362. Classen S, Possinger K, Pelka-Fleischer R, Wilmanns W: Effect of onapristone and medroxyprogesterone acetate on the proliferation and hormone receptor concentration of human breast cancer cells. J Steroid Biochem Mol Biol 1993, 45: 315-319.

363. Fernandez P, Burghardt R, Smith R, Nodland K, Safe S: High passage T47D human breast cancer cells: altered endocrine and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin responsiveness. Eur J Pharmacol 1994, 270: 53-65.

364. Angus WG, Campaigne LM, Jefcoate CR: TCDD elevates erbB2 expression and signaling in T47D cells by reversing serum potentiation of estrogen receptor activity, independent of estrogen levels and enhanced ER down-regulation. Mol Cell Endocrinol 2000, 170: 1-13.

365. Elstner E, Williamson EA, Zang C, Fritz J, Heber D, Fenner M et al.: Novel therapeutic approach: ligands for PPARgamma and retinoid receptors induce apoptosis in bcl-2-positive human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2002, 74: 155-165.

366. Oenga GN, Spink DC, Carpenter DO: TCDD and PCBs inhibit breast cancer cell proliferation in vitro. Toxicol In Vitro 2004, 18: 811-819.

367. Leung BS, Potter AH, Qureshi S: Interaction of prolactin, estrogen and progesterone in a human mammary carcinoma cell line, CAMA-1 - I Cell growth and thymidine uptake. J Steroid Biochem 1981, 15: 421-427.

368. Yu WC, Leung BS, Gao YL: Effects of 17 beta-estradiol on progesterone receptors and the uptake of thymidine in human breast cancer cell line CAMA-1. Cancer Res 1981, 41: 5004-5009.

369. Leung BS, Qureshi S, Leung JS: Response to estrogen by the human mammary carcinoma cell line CAMA-1. Cancer Res 1982, 42: 5060-5066.

370. Leung BS, Potter AH: Mode of estrogen action on cell proliferation in CAMA-1 cells: II. Sensitivity of G1 phase population. J Cell Biochem 1987, 34: 213-225.

371. Leung BS: Mode of estrogen action on cell proliferation in CAMA-1 cells: III. Effect of antiestrogen. Anticancer Res 1987, 7: 219-225.

372. Leung BS, Potter AH: Mode of estrogen action on cell proliferative kinetics in CAMA-1 cells. I. Effect of serum and estrogen. Cancer Invest 1987, 5: 187-194.

191

373. Thomsen JS, Nissen L, Stacey SN, Hines RN, Autrup H: Differences in 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-inducible CYP1A1 expression in human breast carcinoma cell lines involve altered trans-acting factors. Eur J Biochem 1991, 197: 577-582.

374. Lapointe J, Labrie C: Role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1) in androgen-induced inhibition of CAMA-1 breast cancer cell proliferation. Endocrinology 2001, 142: 4331-4338.

375. Moe RE, Anderson BO: Androgens and androgen receptors: A clinically neglected sector in breast cancer biology. J Surg Oncol 2006.

376. Hanahan D, Weinberg RA: The hallmarks of cancer. Cell 2000, 100: 57-70.

377. Desmedt C, Sotiriou C: Proliferation: the most prominent predictor of clinical outcome in breast cancer. Cell Cycle 2006, 5: 2198-2202.

378. Russo J, Russo IH: Cellular basis of breast cancer susceptibility. Oncol Res 1999, 11: 169-178.

379. Massague J: G1 cell-cycle control and cancer. Nature 2004, 432: 298-306.

380. Sutherland RL, Hamilton JA, Sweeney KJ, Watts CK, Musgrove EA: Expression and regulation of cyclin genes in breast cancer. Acta Oncol 1995, 34: 651-656.

381. Bartkova J, Lukas J, Muller H, Lutzhoft D, Strauss M, Bartek J: Cyclin D1 protein expression and function in human breast cancer. Int J Cancer 1994, 57: 353-361.

382. Gillett C, Fantl V, Smith R, Fisher C, Bartek J, Dickson C et al.: Amplification and overexpression of cyclin D1 in breast cancer detected by immunohistochemical staining. Cancer Res 1994, 54: 1812-1817.

383. Eeckhoute J, Carroll JS, Geistlinger TR, Torres-Arzayus MI, Brown M: A cell-type-specific transcriptional network required for estrogen regulation of cyclin D1 and cell cycle progression in breast cancer. Genes Dev 2006, 20: 2513-2526.

384. MacIndoe JH, Etre LA: Androgens inhibit estrogen action in MCF-7 human breast cancer cells. Life Sci 1980, 27: 1643-1648.

385. Birrell SN, Bentel JM, Hickey TE, Ricciardelli C, Weger MA, Horsfall DJ et al.: Androgens induce divergent proliferative responses in human breast cancer cell lines. J Steroid Biochem Mol Biol 1995, 52: 459-467.

386. Tormey DC, Lippman ME, Edwards BK, Cassidy JG: Evaluation of tamoxifen doses with and without fluoxymesterone in advanced breast cancer. Ann Intern Med 1983, 98: 139-144.

192

387. Ingle JN, Twito DI, Schaid DJ, Cullinan SA, Krook JE, Mailliard JA et al.: Combination hormonal therapy with tamoxifen plus fluoxymesterone versus tamoxifen alone in postmenopausal women with metastatic breast cancer. An updated analysis. Cancer 1991, 67: 886-891.

388. Labrie F, Simard J, de Launoit Y, Poulin R, Theriault C, Dumont M et al.: Androgens and breast cancer. Cancer Detect Prev 1992, 16: 31-38.

389. Zhou J, Ng S, Adesanya-Famuiya O, Anderson K, Bondy CA: Testosterone inhibits estrogen-induced mammary epithelial proliferation and suppresses estrogen receptor expression. FASEB J 2000, 14: 1725-1730.

390. Lapointe J, Fournier A, Richard V, Labrie C: Androgens down-regulate bcl-2 protooncogene expression in ZR-75-1 human breast cancer cells. Endocrinology 1999, 140: 416-421.

391. Ando S, De Amicis F, Rago V, Carpino A, Maggiolini M, Panno ML et al.: Breast cancer: from estrogen to androgen receptor. Mol Cell Endocrinol 2002, 193: 121-128.

392. Birrell SN, Butler LM, Harris JM, Buchanan G, Tilley WD: Disruption of androgen receptor signaling by synthetic progestins may increase risk of developing breast cancer. FASEB J 2007, 21: 2285-2293.

393. Hackenberg R, Luttchens S, Hofmann J, Kunzmann R, Holzel F, Schulz KD: Androgen sensitivity of the new human breast cancer cell line MFM-223. Cancer Res 1991, 51: 5722-5727.

394. Dauvois S, Geng CS, Levesque C, Merand Y, Labrie F: Additive inhibitory effects of an androgen and the antiestrogen EM-170 on estradiol-stimulated growth of human ZR-75-1 breast tumors in athymic mice. Cancer Res 1991, 51: 3131-3135.

395. de LY, Dauvois S, Dufour M, Simard J, Labrie F: Inhibition of cell cycle kinetics and proliferation by the androgen 5 alpha-dihydrotestosterone and antiestrogen N,n-butyl-N-methyl-11-[16' alpha-chloro-3',17 beta-dihydroxy-estra-1',3',5'-(10')triene-7' alpha-yl] undecanamide in human breast cancer ZR-75-1 cells. Cancer Res 1991, 51: 2797-2802.

396. Ortmann J, Prifti S, Bohlmann MK, Rehberger-Schneider S, Strowitzki T, Rabe T: Testosterone and 5 alpha-dihydrotestosterone inhibit in vitro growth of human breast cancer cell lines. Gynecol Endocrinol 2002, 16: 113-120.

397. Greeve MA, Allan RK, Harvey JM, Bentel JM: Inhibition of MCF-7 breast cancer cell proliferation by 5alpha-dihydrotestosterone; a role for p21(Cip1/Waf1). J Mol Endocrinol 2004, 32: 793-810.

193

398. Sohoni P, Sumpter JP: Several environmental oestrogens are also anti-androgens. J Endocrinol 1998, 158: 327-339.

399. Foster KR, Bernstein DE, Huber PW: Science and the toxic tort. Science 1993, 261: 1509, 1614.

400. Davidson NE: Environmental estrogens and breast cancer risk. Curr Opin Oncol 1998, 10: 475-478.

401. Witorsch RJ: Endocrine disruptors: can biological effects and environmental risks be predicted? Regul Toxicol Pharmacol 2002, 36: 118-130.

402. Kojima H, Katsura E, Takeuchi S, Niiyama K, Kobayashi K: Screening for estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ Health Perspect 2004, 112: 524-531.

403. Blair RM, Fang H, Branham WS, Hass BS, Dial SL, Moland CL et al.: The estrogen receptor relative binding affinities of 188 natural and xenochemicals: structural diversity of ligands. Toxicol Sci 2000, 54: 138-153.

404. Korach KS, Sarver P, Chae K, McLachlan JA, McKinney JD: Estrogen receptor-binding activity of polychlorinated hydroxybiphenyls: conformationally restricted structural probes. Mol Pharmacol 1988, 33: 120-126.

405. Rajapakse N, Silva E, Kortenkamp A: Combining xenoestrogens at levels below individual no-observed-effect concentrations dramatically enhances steroid hormone action. Environ Health Perspect 2002, 110: 917-921.

406. Heneweer M, Muusse M, Van den BM, Sanderson JT: Additive estrogenic effects of mixtures of frequently used UV filters on pS2-gene transcription in MCF-7 cells. Toxicol Appl Pharmacol 2005, 208: 170-177.

407. Birkhoj M, Nellemann C, Jarfelt K, Jacobsen H, Andersen HR, Dalgaard M et al.: The combined antiandrogenic effects of five commonly used pesticides. Toxicol Appl Pharmacol 2004, 201: 10-20.

408. Gorman N, Trask HS, Robinson SW, Sinclair JF, Gerhard GS, Smith AG et al.: Hexachlorobenzene stimulates uroporphyria in low affinity AHR mice without increasing CYP1A2. Toxicol Appl Pharmacol 2007, 221: 235-242.

409. Pennie WD, Aldridge TC, Brooks AN: Differential activation by xenoestrogens of ER alpha and ER beta when linked to different response elements. J Endocrinol 1998, 158: R11-R14.

410. Matthews J, Celius T, Halgren R, Zacharewski T: Differential estrogen receptor binding of estrogenic substances: a species comparison. J Steroid Biochem Mol Biol 2000, 74: 223-234.

194

411. Kramer VJ, Helferich WG, Bergman A, Klasson-Wehler E, Giesy JP: Hydroxylated polychlorinated biphenyl metabolites are anti-estrogenic in a stably transfected human breast adenocarcinoma (MCF7) cell line. Toxicol Appl Pharmacol 1997, 144: 363-376.

412. Zimmermann J, Liebl R, von AE: 2,5-Diphenylfuran-based pure antiestrogens with selectivity for the estrogen receptor alpha. J Steroid Biochem Mol Biol 2005, 94: 57-66.

413. Barker S: Non-steroidal anti-estrogens in the treatment of breast cancer. Curr Opin Investig Drugs 2006, 7: 1085-1091.

414. Liu MM, Albanese C, Anderson CM, Hilty K, Webb P, Uht RM et al.: Opposing action of estrogen receptors alpha and beta on cyclin D1 gene expression. J Biol Chem 2002, 277: 24353-24360.

415. Lindberg MK, Moverare S, Skrtic S, Gao H, hlman-Wright K, Gustafsson JA et al.: Estrogen receptor (ER)-beta reduces ERalpha-regulated gene transcription, supporting a "ying yang" relationship between ERalpha and ERbeta in mice. Mol Endocrinol 2003, 17: 203-208.

416. Matthews J, Wihlen B, Tujague M, Wan J, Strom A, Gustafsson JA: Estrogen receptor (ER) beta modulates ERalpha-mediated transcriptional activation by altering the recruitment of c-Fos and c-Jun to estrogen-responsive promoters. Mol Endocrinol 2006, 20: 534-543.

417. Shaaban AM, O'Neill PA, Davies MP, Sibson R, West CR, Smith PH et al.: Declining estrogen receptor-beta expression defines malignant progression of human breast neoplasia. Am J Surg Pathol 2003, 27: 1502-1512.

418. Wormke M, Stoner M, Saville B, Safe S: Crosstalk between estrogen receptor alpha and the aryl hydrocarbon receptor in breast cancer cells involves unidirectional activation of proteasomes. FEBS Lett 2000, 478: 109-112.

419. Lin CH, Lin PH: Induction of ROS formation, poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation, and cell death by PCB126 and PCB153 in human T47D and MDA-MB-231 breast cancer cells. Chem Biol Interact 2006, 162: 181-194.

420. Caldon CE, Daly RJ, Sutherland RL, Musgrove EA: Cell cycle control in breast cancer cells. J Cell Biochem 2006, 97: 261-274.

421. Zumbado M, Goethals M, varez-Leon EE, Luzardo OP, Cabrera F, Serra-Majem L et al.: Inadvertent exposure to organochlorine pesticides DDT and derivatives in people from the Canary Islands (Spain). Sci Total Environ 2005, 339: 49-62.

195

422. Cruz S, Lino C, Silveira MI: Evaluation of organochlorine pesticide residues in human serum from an urban and two rural populations in Portugal. Sci Total Environ 2003, 317: 23-35.

423. Farber E: The multistep nature of cancer development. Cancer Res 1984, 44: 4217-4223.

424. Wren BG: The origin of breast cancer. Menopause 2007.

425. Wang TC, Cardiff RD, Zukerberg L, Lees E, Arnold A, Schmidt EV: Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-cyclin D1 transgenic mice. Nature 1994, 369: 669-671.

426. Russo IH, Russo J: Primary prevention of breast cancer by hormone-induced differentiation. Recent Results Cancer Res 2007, 174: 111-130.

427. Zumoff B, Fishman J, Bradlow HL, Hellman L: Hormone profiles in hormone-dependent cancers. Cancer Res 1975, 35: 3365-3373.

ÉTUDE DES EFFETS ENDOCRINIENS PRODUITS PAR LES ... · iii Nos résultats appuient donc ceux de...

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