ETUDE DE LA 5ULFO-O'i{YDATIONDANS LES SOLSFO~MES .

SUR ALLUVIONS FLUVIO~MARiNfSEl\! MILIEU TROPlCi~L

OFFICE DE LA RECHERCHE SCIENTIQUE ET TECHNIQUE OUTRE-MER

CENTRE DE DAKAR - HANN

J. BALDEN5PERGER

Luboratoire deMicrobiologie des Sols

DAKAR

Décembre 1969

ETUDE DE LA SULFO-OXYDATION

DANS LES SOLS FOm.ŒS SUR ALLUVIONS FLUVIO-MARINES

EN lULIEU TROPI C.AL

(Sols de mangroves et de tannes de Basse-Casamance)

Jacques BALDENSPERGER

Rapport de Stage

Centre ORSTOM-DAKAR-HANN

1968 - 1969

ETUDE DE LA SULFo-OXYDATION DANS LES SOLS FORMES SUR

ALLUVIONS FLUVIo-MARlNES EN MILIEU TROPICAL

(Sols de mangroves et de Tannes de Basse-Casamance)

1) - INTRODUCTION

II) - ETUDE EXPE1UMENTALE DE LA SULFo-OXYDATION DANS LE SOL

AI METHODOLOGIE :

1) Les formes du soufre dans le sol

- Soufre total- Soufre réduit attaquable par HCl 4 N- Soufre élémentaire extrait par l'acétone- Sulfates solubles- Soufre lié à la matière organique- Soufre oxydable par H202

2) Aspects microbiologiques du cycle du soufre

- Les comptages de bactéries oxydant le soufre

3) Les mesures respirométriques sur le sol

- Calcul des constantes par des abaques.

4) L'échantillonnage et le traitement des échantillons

BI LES CARACTERISTIQUES PHYSlCO-ClID!TIQUES DES SOLS DE LASEQUENCE MANGROVE-T.ANNE.

1) La chronoséquence de Balingore

2) Mesures de pH et de rH in situ

3) Variations saisonnières des formes du soufre dans lessols de la ohronoséquence

cl INCU:BATION AEROBlE AVEC DESSECHEMENT LENT

1) Protocole d'essai

2) Effet de l'incubation sur le pH et les formes du soufre?action d'un inhibiteur de la respiration.

DI INCUBATION AEROBIE A UNE HUMIDITE CONSTANTE

1) Protocole d'essai

2) Influenoe de l'humidité d'incubation sur l'oxydation descomposés soufrés.

3) Action de l'incubation à l'humidité optimum

4) Enrichissement en soufre élémentaire

5) Enrichissement en thiosulfate

6) Action de quelques inhibiteurs, agents bactéricides etbactériostatiques

El MESURES DE LA RESPIRATION DU SOL EN WARBURG

1) Mesures sur le sol tel queltséché à l'air et réhumidifié,lyophilisé et réhumidifiéo

2) Effet de l'azoture sur la respiration

3) ~sure respirométrique de l'oxydation de divers composéssoufrés par le sol.

FI ESSAI DE PERCOLATION DU SOL

1) Construction d'un appareil simple pour la percolation

2) Premiers résultats

III) - ETUDE MICROBIOLOGIQUE DE LA SULFO-oXYDATION

AI ISOIIEMENT DES SOUCHES

BI ETUDE l[oRPHOLOGIQUE DES SOUCHES

1) Coloration de Gram

2) Coloration des flagelles

cl ETUDE DE LA CROISSANCE

1) Courbe de croissance

2) Consommation de thiosulfate et production de sulfate aucours de la croissance.

3) Chromatographie des thionates

DI CROISSANCE AVEC DIVERS COMPOSES SOUFRES

El MESURElS RESPIROlr.ETRIQUES SUR "BESTING CELLS"

1) Oxydation des composés soufrés en aérobiose

2) Oxydation en anaérobiose et dénitrification

IV) - CONCLUSIONS GENERALES

V) - m13LIOGRAPHIE

- 1 -

1) - INTRODUCTION

L'assainissement et la poldérisation des sols de mangroves envue de la rizioulture entrâine la transformation de leurs caractéristiquesphysico-ohimiques, en partioulier leur aoidifioation.

De nombreux auteurs ont montré la relation existant entre lesphénomènes de sulfo-oxydation et la baisse du pH du sol au oours de sondrainage, et ont été oondui ts à étudier le rôle des microorganismes dans leprocressus d'oxydation des oomposés soufrés.

Nous oiterons en partioulier les études faites en milieu tropi­oal par HART (1,2,3), VIEILLEFON (4,5,6) BLOOMFIELD et al. (7) et les étudesplus générales oonoernant l'oxydation du soufre dans le sol de LA RIVIERE(8),STARKEY (9), RARWARD et al. (10) et FRENEY (11).

: ',:

Le présent travail a été mené en étroite oollaboration avecJ. VIEILLEFON sur une séquenoe de sols qu'il a reoonnue et étudiée depuisplusieurs années. Les deux études pédologiques et miorobiologiques sontoomplémentaires dans leurs moyen;s et dans leurs buts, et prennent placedans le oadre plus général de la collaboration interdisoiplinaire souhaitéeet prévue dans le thème C de reoherohe sur les sols hydromorphes.

Nous remeroions tout partioulièrement Mr. Y. DOMMERGUES quia permis la définition de oe programme et J. VIEILLEFON pour les oonseilsqu'il nous a donnés tout au long de sa réalisation.

Nous remeroions également l'ensemble du personnel du labora­toire de miorobiologie des sols de DAKAR qui nous a effioaoement seoondédans oe travail.

- 2 -

II) ETUDE EXPERDŒNTALE DE LA SULFO-OXYDATION DANS LE SOL -

AI METHOIOLOGIE

1) Les formes du soufre dans le sol

Le soufre entre dans la composition d'un grand nombre de com-'posés minéraux et organiques du sol. Sans entrer dans le détail du cycle dusoufre dans le sol étudié par plusieurs auteurs (8,9,10,11) nous en rappel­lerons simplement deux aspects principaux.

- Le degré d'oxydation du soufre varie de - 2 à + 6. De oe point devue le cycle du soufre est très semblable à celui de l'azote qui comporteégalement de nombreux degrés d'oxydation. Voir à ce sujet :LA RIVIEBE (8).

La forme des composés soufrés est cependant différente, tous lesproduits gazeux étant très solubles dans l'eau. En conséquence le cyole selimite aux échanges entre deux phases: liquide (gaz en solution et composéssolubilisés) et solide (composés solubles, peu solubles ou insolubles).

Les techniques d'extraction et de dosage des formes du sou­fre dans le sol étant variées (voir VIEILLEFON 12), les fractions définiespar ces techniques le sont également, à chaque technique correspondant unecertaine fraction.

Le choix d'une technique est fonction des buts recherchés,mais aussi des protocoles d'essai envisagés. Nous avons donc choisi souventdes techniques différentes de celles employées par J. VIEILLEFON, car allesdevaient pouvoir être employées sur des échantillons plus petits pour lesessais d'incubation, d'inhibition, de respiration, etc •••

Nous donnerons seulement les références et les remarques cor­respondant à chaque technique utilisée.

~~e total: modification de la méthode CHAUDHRY et OORNFIELD(13).

L'échantillon (10 g de sol) est attaqué par une solution deK N03 au bain de sable, puis au four à 5500. Le résidu est repris par H N0325 %, filtré, les sulfates précipités par BaC12 et dosés par gravimétrie.

Cette technique assez longue également employée par VIEIL­LEFON, nous a donné des résultats reproductibles.

Cependant la technique d'oxydation au four à 1000° suivantBOUYSSE et al. (14) expérimentée récemment par VIEILLEFON smmble donner desrésultats très légèrement supérieurs. Il est donc possible que la totalitédu soufre de l'échantillon ne soit pas transformée en sulfates par le mélan­ge K NO3 et H NO3

Nous remplacerons donc pour les essais ultérieurs la méthodeCHAUDHRY et OORNFIELD par la méthode BOUISSE d'oxydation au four par le mélan­ge oxyde tungstique, oxyde cuivreux et oxyde ferrique, plus rapide que laprécédente.

- 3 -

Soufre des monosulfures: sulfures attaquables par H Cl 4N sui­------------ vrant CHAUDHRY et CORNFIED (15) modifiée.

S= est déplacé sous forme de H2S par H Cl 4N bouillant, le sul­fure est ensuite dosé par colorimétrie par réaction avec le p-amino dimé­thyl-aniline formant du bleu de méthylène. Cette réaction très sensible per­met de doser de faibles teneurs en soufre-sulfure.

La méthode originale indique une température d'attaque de60D pendant 10 minutes.

Au cours des premiers essais nous avons constaté qu'à cettetempérature, le dégagement d'H2S pouvait durer beaucoup plus longtemps, etqu'il était difficile de trouver un temps limite pour le dégagement. Ncusavons alors mené les attaques à l'ébullition. De cette façon toute la frac­tion est déplacée au bout de 15 minutes environ, aucun dégagement n'ayantli~~ ~près ce temps, même si l'ébullition est maintenue pendant 90 minutes.

Enfin signalons que la fraction ainsi extraite ne représentedans le sol de mangrove qu'une faible partie du soufre total, et semble indé­pendante de la concentration de l'acide chlorhydrique employé.

Ces concentrations varient d'ailleurs suivant les auteursde H Cl pur (JOUIX et LECACHEUX, 16), à H Cl 6N (SMITTENBERG et al. 17) àH Cl 4N comme dans cette méthode, ou encore H Cl N (BOUISSE et al., 14).

Le soufre élémentaire est extrait d'un gramme de sol secbroyé au mortier par 40 ml d'acétone à froid. On opère direotement dans untube de centrifugeuse, la suspension est alors centrifugée 5 minutes àBOOO t/m. Le soufre dissous dans une partie aliquote précipite finementquand l'acétone est dilué dans l'eau (dilution maximum 20 %), est dosé parnéphélométrie par référence à une courbe étalon.

Cette méthode rapide et simple nous a toujours donné detrès bons résultats. Les essais d'enrichissement du sol en soufre suivisd'extraction permettent de retrouver la quantité de soufre ajoutée à 5 %près. Les résultats ont toujours été concotdants aveo ceux de VIEILLEFONqui emploie la méthode BDUYSSE et al. (14) d'extraction à l'aoétone à chaudpendant 4 heures, beaucoup plus longue, et qui risque d'ailleurs d'intégrerune fraction du soufre organique.

L'article de HART (18) indique que l'échantillon doit êtreséché sous vide en présence de pyrogallol alcalin, ceci afin d'éviter touteoxydation préalable au dosage. Il est en effet nécessaire que l'humidité del'échantillon ne dépasse pas 4 %. Des essais sur échantillon simplementséché à l'air (10 %environ d'humidité) ont donné de mauvais résultats. Laprésence d'eau, même en faible quantité, empêohe la dissolution complète dusoufre élémentaire et son extraction par l'acétone.

Cependant nous verrons ultérieurement que le séchage rapide~ous une lampe Infra-rouge donne finalement de meilleurs résultats que leséchage sous vide avec le pyrogallol, en général plus lent.

Sulfates solubles:

- 4-

méthode MASSOUMI et CORNFIELD (19)

,,';

Les sulfates dissous dans une fraction aliquote de l'extraitacqueux 1/40 sont précipités par BaC12 et dosés par néphélométrie, par réfé­rence à une courbe étalon. Cette technique sensible permet d'employer de fai­bles quantités de sol ( 1 g ). Cependant en raison des ooncentrations impor­tantes de sulfates solubles dans oes sols, 1 ml d'extrait 1/40 suffit pourle dosage final. Il faut dono manipuler avec préoision.

De plus, la relation Densité optique/Concentration en sulfa­tes cesse d'être linéaire à partir de 5 ppm dans la cuve de coloration, gequi correspond à une déviation d'environ 35 au Jean et Constant, à 4400 Apour une cuve de 20 mm d'épaisseur. Il ne faut pas dépasser cette valeur.

Malgré cette très grande sensibilité, les résultats ont tou­jours été reproductibles.

Soufre lié à la matière organique: d'après EVANS et--------------- - ROST (20).

La fraotion humique est extraite par NH40H 4 %. Sur une frao­tion aliquote on oxyde le soufre sous forme de sulfates par RN03 et K N03, onprécipite par BaC12 et on dose par gravimétrie les sulfates formés. Par dif­férenoe aveo les sulfates présents dans l'extrait avant le traitement on ob­tient la fraction du soufre liée à l'humus.

Cette technique a été essayée avec succès sur un éohantillonavant et après inoubation. Les résultats seront indiqués plus loin.

L'action de l'eau oxygénée a été étudiée pour essayer decaractériser une fraction oxydable du soufre. Le sol est traité par des con­centrations oroissantes ( de ° à 30 %) d'eau oxygénée, les sulfates pro­duits sont dosés par néphélométrie suivant la méthode de MASSOtThU et CORNFIELD(19). Les résultats qui seront examinés plus loin diffèrent sensiblement deoeux obtenus par HAm1SEN sur ses échantillons.

2) Aspects microbiologiques du cyole du soufre

Les microorganismes interviennent aux différents stades duoycle du soufre. Pour une vue d'ensemble de ce sujet, voir les artioles deKAISER (22), LA RIVIERE (8), SENEZ et FROMAGEOT (23), SENEZ (24), CABET (25),GAJENDRAGADKAR (26), et BAAS BECKING et al. (27).

Pour se limiter aux Phénomènes d'oxydation, objets de oetteétude, indiquons simplement que les mioroorganismes oxydant le soufre peuventêtre répartis en trois grands groupes:

- 5 -

OXYDATION OXYDATION OXYDATIONDISSIMILATRI CE ASSIMILATRICE INCIDENTE

Thiobacilles Nombreux hétérotrophes, Très nombreux hété-

et autres bactéries bactéries rouges et rotrophes par axem-

incolores du soufre vertes, pIe: PseudomonasChromatium MioroooocuBThiospirillum SphaerotilusChlorobium

L'appréciation de l'importance relative de l'activité de cesdifférents groupes varie suivant les auteurs. On conçoit également qu'ellepuisse varier suivant les biotopes aussi les proportions indiquées par desauteurs ayant travaillé en milieu tempéré ne seront pas retenues pour lessols de mangroves tropicales.

Le problème du comptage des bactéries oxydant le soufre seheurte au départ au fait que l'activité des hétérotrophes oxydant incidem­ment le soufre réduit ne peut pas être déterminée puisque cette activitén'est pas sélective.

Les seuls groupes oxydant pouvant faire l'objet de compta­ges sont les bactéries photosynthétiques (voir KAISER, 22) et les Thiobacil­les, pour lesquels on dispose de milieux sélectifs.

Nous ne retiendrons pour cette étude que les Thiobacilles,car l'étude des bactéries photosynthétiques fait appel à des techniques trèsparticulières et leur activité est limitée de facto à la surface même dusol.

Dans un article de POSTGATE (28), donnant des formules d~

milieux pour les bactéries du soufre, l'auteur signale que le problème ducomptage' des Thiobacilles n'est pas résolu, aucune correlation valable n' eXie­tant entre les comptages directs dans un milieu de croissance, le comptage ~

des colonies développées sur le même milieu gélosé, et les comptages pardilutions.

Les différences peuvent provenir de la grande sensibilité de~

Thiobacilles au potentiel d'oxydo-réduction, les milieux liquides n'étantpas toujours assez aérés, et du caractère autotrophe de la plupart des espè­ces, un inoculum important étant alors nécessaire pour obtenir la croissance~

Pour cette étude nous avons essayé la technique de suspension­dilution de POCHON - et TARDIEU (29) qui ne nous a pas donné de bons résul- 'tats. La technique classique d'étalement sur milieu gélosé d'une suspension- +'dilution, suivie du compatage des colonies ~QRàa~ 3 semaines, s'est révé-lée plus reproductible, bien que les chiffres puissent varier d'un essai àl'autre du simple au triple pour un même échantillon. Notons que cette tech-nique a été employée par plusieurs auteurs, ATTOE et al. (30) et SWABY etal. (31).

- 6 -

Nous avons donc utilisé cette méthode au cours des essaisd'incubation, avec les résultats décrits plus loin. Le milieu utilisé étaitle milieu au thiosulfate décrit au chapitre III, § A.

Les filtres MILLIPORE ont été également employés par certainsauteurs pour le comptage des Thiobacilles (TILTON et al., 32). Le filtre estdéposé sur le surfaoe d'une boite de milieu gélosé. Nos essais n'ont pas étéconcluants.

M. MOURARET nous a communiqué recemment un test qualitatifpermettant d'apprécier le nombre des bactéries oxydant le soufre. Cette tech­nique s'applique aux extraits acqueux du sol.

Une fraction aliquote est filtrée sur MILLIPORE stérile0,45i{. Le filtre est ensuite déposé à la surface d'un support-filtre depapier, au centre duquel on a préalamlement fait séché une goutte de ~~éthy­

1orange , imbibé du milieu pour Thiobacilles selon STARKEY (rapporté parPOSTGATE 28).

L'ensemble est saupoudré de fleur de soufre et placé àl'incubation. On note le temps néoessaire au virage de l'indicateur (soitpH 4,4 à 3) montrant la formation de sulfate à partir du soufre. Un témoinsans soufre montre que l'acidification obtenue n'est pas due aux bactériescellulolytiques qui peuvent aussi se développer dans la boite.

Les premiers résultats énoncés plus loin sont encourageants,et la simplicité de la technique permettra son emploi pour de nombreux tests.

3) Les mesures respirométriques sur le sol

Nous avons largement employé les meBures de respiration pouroaractériser l'activité microbiologique du sol, ou l'oxydation d'un substrat.Deux types de fioles de mesures ont été utilisées:

Pour des mesures de contrôle sans addition de substrat, les fiolesspéciales cylindriques type GARCIA (33).

- Pour des mesures d'activité oxydante avec des substrats ou desinhibiteurs, des fioles ovoides de 100 ml, à deux diverticules.

Le oalcul des coefficients de ces coupes pour des mesuresfaites avec les sols est assez long et fastidieux, puisque le coefficientvarie presque pour chaque expérience en fonction du volume fiole + manomè­tre, du poids de sol dans la fiole, de l'humidité du sol, de la densitéréelle du sol.

Nous avons donc préféré exprimer la constante K en fonctionde ces variables, puis tracer des abaques qui permettent très rapidement detrouver la valeur de K pour toute la gamme de poids de sol, humidité et den­sité utilisables.

- 7 -

Rappelons que K est donné par l' expression suivante

K =Vg

T

Po

+ VI 0\

où Vg =VI =0( =

To =T

=volume de la phase gazeusevolume da la phase liquidecoefficient de solubilité du gaz dans l'eauenviron 0 7 9 à 30°C.

En remplaçant ces paramètres par les seules variables~

= volume total fiole + manomètre en mm 3

poids de sol sec en grammes

densité réelle du sol

humidité du sol en %volume du liquide dans le puits central en ml.

il vient g

K = ( 10000 A - B - C ). (0 7 9) à 30° C.

où

A== P donné par les abaques 1,2 et 3 pour p va-10 driant do 5 à 50 grammes

B==P.h ( 0< T 1 ) donné par les abaques 4 et

1000 T 5 pour p variant de 5 à 500 grammes

C ==VKOH ( 0< T

- 1), c'est-à-dire pour l'oxygène10 T

0 et l'azoteg

c == VKOH • 0,0970 pour l'oxygène

C == VKOH .. 0,0985 pour l'azote

( le plus souvent VKOH = 1 dans les expériences).

- 8 -

L'utilisation de ces abaques simplifie grandement les calculs g

1 - déterminer le volume total, en mm 3, fiole + manomètre.ce volume est constant pour un système donné.

2 - lire sur l'abaque 1, 2 ou 3 la valeur de A en fonction de p~

poids de sol en grammes, et de d~ densité réelle. (Pour despoids de sol inférieurs à 5 grammes~ prendre la valeur pour10 p et diviser ensuite le chiffre lu par 10).

3 - lire sur l'abaque 4 ou 5 la valeur de B correspondant à p,poids de sol en grammes et d, densité réelle.Utiliser l'échelle correspondant au gaz présent dans la coupe.

4- déterminer c. On emploie en général 1 ml de potasse ou detout autre absorbant dans ces fioles.

alors g C = 0,0970 pour l'oxygène

C = 0,0985 pour l'azote

s'il n'y a pas d'absorbant, C = O.

5 - ajouter A + B + C.

6 - soustraire oe total de Vt

10000( exprimé en mm 3)

7 - diviser le résultat obtenu par 0~9 pour avoir la constanteà 30°.

0IH- ABAQUE N° 11

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9 -

4) L'échantillonnage et le traitement des échant~Jlons.

L'observation des profils des sols de mangroves et de tannes montr~

une hétérogénéité assez importante du matériau dans un même horizon, et unpassage graduel entre horizons, ceux-ci ne diffèrent souvent que par delégères variations dans l'enracinement et les taches. (Voir la descriptiondes profils de la séquence dans VIEILLEFON, 5).

Une première série de dosages sur chaque profil à différentes pro­fondeurs jusqu'à 1 mètre nous a montré que l'hétérogénéité des horizonsempêche toute interprétation valable des différences observées pour ohaquetraitement entre les horizons d'un même profil.

Nous avons donc préféré homogénéiser le prélàvement 0 - 40 cm, etprendre cet échantillon comme type du profil étudié. Toutes les mesures ontété faites sur ces prélèvements.

Pour la plupart des essais il était nécessaire de disposer del'échantillon sec. De nombreux auteurs utilisent le sol séché à l'air etpassé au tamis 2 mm. Les modifications des caractères physioo-chimiqueslors du séchage ne sont pourtant pas négligeables, puisqu'ils font juste­ment l'objet des préoocupations des pédologues pour la riziculture.

Nous avons cherché quel était le meilleur moyen pour disposer d'unéchantillon sec dont les caractères ne soient pas trop éloignés de ceux dusol in situ. Comme nous le verrons plus loin, ce sont les échantillons demangrove (profils 57, 56, et 55) qui subissent le plus de transformationsau cours du séchage. Trois traitements de séchage ont été essayés surun échantillon de mangrove (échantillon 55)

le séchage à l'air rapide, en étalant une mince couche de solssous une lampe Infra-rouge, avec une ventilation puissante pourempêcher la température de dépasser 40°.

le séchage sous vide, en présence de pyrogallol alcalin (préconi­sé par HART, 8).

la lyophilisation (grâoe à l'obligeanoe des servioes de l'Elevagedu Sénégal, nous avons pu disposer d'une petite quantité d'échan­tillon lyophilisé).

- 10 -

Les résultats sont figurés dans le tableau ci-dessous.

SECHE A SECHE SOUS ,TEL QUEL VIDE AVEC LYOPHILISELIA l R

PYROGALLOL,:

pH pâte 1/1 6,4 3,9 4,1 4,511

1

S total 34 34,2 34 33,9 111,

Sulfures Hel' 4N 0,04 ° 0,01 °1

1

Soufre élémentaire - - 0,3 0,6 0,4 11,

Sulfates solubles 1,09 2,7 2,2 2,0 1,1,1

Soufre lié à la 1

1

matière organique 1,9 4,7 - - 2,31

Soufre oxydable paz ,1

H202 30 % 20 32 - - 21,3

QO 1,2 ,

en 23 57 63 79 !1p .... 1 1g sec/h1

Tous les résultats sont donnés en poids de Soufre, en %0 de sol sec.

- 11 -

On remarque que dans tous les cas le séchage provoque une baisseimportante du pH. L'échantillon ayant conservé les caractères les plusvoisins de la vase est l'échantillon lyophilisé. Malheureusement nous n'endisposons que de faibles quantités pour des essais ultérieurs.

Nous souhaitons pouvoir utiliser cependant cette méthode de séchagesi nous disposons d'un lyophilisateur au nouveau laboratoire de Bel-Air.

Les caractéristiques des échantillons séchés à la lampe I.R. ou so~s

vide sont très voisins. Le premier procédé étant de beaucoup plus rapide etpermettant de traiter des quantités importantes de sol a été employé parla suite.

La figure 1 montre l'effet du traitement par des conoentrationsoroissantes d'eau oxygénée des échantillons de vase non séchée, séchée àl'air et lyophilisée. Là encore l'échantillon lyophilisé se rapproche leplus de l'échantillon non séché. Dans les deux cas 45 %environ du soufretotal ne sont pas oxydables par H202 30 %. Dans l'échantillon séché à l'air,par oontre, la presque totalité du soufre est oxydable par H202 30 %.

Cette différence importante montre que le séchage même rapide a ren~

du oxydable une fraction résistante dans le sol non traité. Le simple sé­ohage provoque donc un ohangement profond de la nature de l'échantillon, queles dosages de sulfures, soufre et sulfates ne laissaient pas supposer.

BI LES CARACTERISTIQUES PHYSICO-CHIMIQUES DES SOLS DE LA SEQUENCEMANGROVE-TANNE

1) La chronoséquenoe de Balingore:

Nous donnons ,dans la figure II un schéma de la topographie et do lavégétation de la zone pilote, permettant de situer les profils étudiés. Serapporter à l'étude de VIEILLEFON (6) pour les détails concernant cetteséquence.

Le tableau page suivante résume les relations génétiques existantentre les sols de la chaîne. L'éohantillon de vase nue )7 ne provient pasde Balingore même, où le dépôt ne se produit plus, et où les bancs de vasesont déjà colonisés par la mangrove. Cependant les matériaux des dépôtsvaseux sont assez homogènes dans l'ensemble du bassin versant de la Casa­mance et l'éohantillon 57 peut être considéré comme le matériau originelde la séquence de Balingore.

2) Mesures du pH et du rH in situ

Nous donnons les valeurs moyennes à deux périodes de l'année: finde la saison sèche, et fin de la saison des pluies. Le détail de l'évolu­tion du pH et du rH au cours de l'année a été étudié par VIEILLEFON (4)et nous n 'y reviendrons pas.

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57 56 55 53 52 51

POSITION DES PROFILS

dans la chai ne de sols

Rh1lophora Ayicennio HeleQ(ha~Îi .--

__________ SENS DE L 'EVOLUTION .>~

Profil nO 57 56 et 55 53 52 51

Tanne herbacé etMorphologie :Banc de vase nue Mangrove Mangrove Tanne vif rizière

Facteur Dominant Sédimentation Rhizophora Avicennia + Régime Régime hydrique Drainagehydrique + évaporation

Processus Tassement + Enrichissement en Tassement + Dessication + Dessalement +anaérobiose 1,[.0. et s= salinisation Acidification Lessivage

Classification Sol minéral brut Sol hydromorphe Sol hydromorphe Sol halomorphe Sol hydromorphedes sols d'apport marin moyennement orga.- minéral à gley salin acidifié minéral à pseudo-

1nique à gley salé gley à taches

- 13 -

" IlProfil nO ~rofondeur \1 fin saison sèche Fin saison des pluies

ii ii

Il pH rHIl

pH rH11 ;;

20 cm Il 6,7 15,3 ( - ) 6,8 10,4 ( - )!!57 Il

100 cm Il 7,0 12,8 ( - ) 7,0 10,0 ( - )\1

- -- -- - - - Il - - - - - - - ---2O 6,8 17 ,4 ( ) Il 6,3 9,7 ( )cm Il - Il -

56 Il Il

Il ii100 cm Il 6,7 10,2 ( - ) Il 6,9 7,4 ( - )Il Il============ ==========~======== ======== ========~======== ======== ==========

20 cm Il 6,8 15,0 ( +) Il 7 5 9,0 ( - )Il

55 Il - 11 '

100 cm Il 6,4 10,6 ( - ) Il 6,0 7,4 ( - )Il Il

============ ==========~======= ======== ========*======== ======== ==========20 cm Il 6,1 27,5 ( +) Il 6,5 12,5 ( - )

53 !! .!IIl Il100 cm Il 5,1 26,9 ( - ) Il 5 8,6 ( - )Il Il============ ==========1r======= 1========= ========~======== ========= F=========

20 cm Il 5,3 28,3 (+) l: 6,9 18,1 ( - )52 Il Il

ii ii100 cm Il 4,3 24,2 ( -) Il 6,4 13,1 ( - )===========. Il F======== Il ========= ====================~======== p========w========

Il 29,3 (+) 1! 7,5 15,2 ( - )20 cm Il 5,551 ii

100 cm Il 4,3 26,3 ( - ) III 6,3 14,4 ( - )Il Il

======================~=================i::========~========~========~=========

( + ) = milieu apparemment oxydant

( - ) = milieu apparemment réducteur

Les valeurs de pH et de rH sont d'autant plus élevées que l'onpasse des mangroves aux tannes. On constate que la saison des pluies, périodede l'année pendant laquelle les différentes zones voient leurs conditionshydriques s'uniformiser amène un regroupement des valeurs du pH et du rH.

Pendant la saison sèche au contraire la dessication et l'aérationdes tannes provoquent un élargissement de l'éventail des valeurs.

3) Variations saisonnières de formes du soufre dans les sols dela. séquence.

Les dosages des formes du soufre ont été faits sur àes échantil­lons fraîchement prélevés. Nous donnons ci-dessous un tableau des valeursmoyennes permettant d'apprécier l'amplitude des variations entre les deuxvaleurs extrèmesg fin de la saison sèche et fin de la saison des pluies.

- 14 -

5,4

4,1

2,5

2,4

li

1,3

6,8

52

53

55

-~-51

1/ Il 1/ n Il ilIl 1/ Il JI Il v

57 0-4011 8 M 1 110,3 N1,2 115,2 112,7 ' 4,5======F=====:M:=======II====I====:Il:===== ======11=====: ===='II'=====F===~====F==== =======

1/ Il Il Il Il Il\1 Il Il Il Il Il

0-401: 37 38 Il ° ~ 9 0, 5::0, ° 1 ° , ° 5 112 1 ~ 4 9 :11 7 1 7, 5Il Il Il Il Il IlIl Il Il Il Il IlIl Il Il 1\ Il Il

100 ll33 28 111 0,7\\0,02 0,03 112,3 1,5 113 9 ~oIl Il Il Il Il Il

======~=====~======1F=======*===== =====~===== ====*=====F===~====I===== =======Il Il Il Il Il IlIl Il Il /1 /1 Il

'0-40:134 30 Il 0,8 0,311°,04 0,01 :1°,4 0,2 ::4 4 1: 2 ,8 3,6Il Il Il Il Il IlIl Il Il Il Il IlIl Il, Il Il /1 Il 6

100 lPO 27111,- 0,7110,05 0,02 11°,8 0,7:17 7 ::4,9 5,Il Il Il Il Il Il

======~=====*===~==~~===F===.=====F=====~===== ====F=====F===~====~==== ======:Il Il U Il Il IlIl Il Il Il Il Il

0-4011 4 411 0,2 0~2110,01 0,01 110,05 0,1 111 1 l10,7 0,7Il Il Il Il Il IlU Il Il Il Il IlIl Il Il Il Il Il

100 1\ 20 27 Il 1,2 1 1\ ° ,04 0,03 111 1 II 6 7 114 5 2,5Il Il Il Il Il Il

======~=====~===~==~===~===~=====F=====~=====F====~====~F===*====F====F=======Il Il Il Il Il Il

0-4011 4 2111 0,5110 ° 110,03 ° 112 1,211 1 0,7 4,1Il Il Il Il Il nIl Il Il Il Il IlIl Il,.. Il Il 1/ Il

100 1:12 28l11,~ 1,411°,05 0,03 n1 0,1 ,\16 6 113 4,5 2,9Il Il Il Il Il Il

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0-40:: 4 10 111,i 0,7110 0,01 nO ° 111 2 :10Il Il Il Il 1/ IlIl Il Il 1/ Il 1/1/ Il Il Il Il \1

100 1115 24:: 2,~ 1,8110 0,04 110,1 0,2114 6 ~,1,4 4~ 11 Il Il !! !!

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H

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Fin

Fin

sai son sèche.

saison des pluies.

- 15 -

Les différentes fraotions ont été obtenues par le traitement suivantg

~. ECHANTILIDN

k:SULFATES (52)

lSULFURES (53)

HO... N

1~

SOUFREELEMENTAIRE (54)

FRAIS .. - -' -- ... -----> 5\.

.\

\par séohage

\\.

""''\..

~SULFATES (55)

TOTAL (51)

Une fraotion 56, oorrespondant au Soufre diffioi1ement oxydableoxydé par le séohage est estimée par différenoe à

Tous les résultats sont donnés en mg de soufre élément par g. desol seo, o'est-à-dire en S f~.

Le soufre total, les sulfures solubles dans HC1 sont dosés par lesméthodes déorites plus haut. Les sulfates sont estimés par gravimétrie, lesoufre élémentaire extrait au soxh1et par l'aoétone à chaud est reouei11isous forme de CUS et dosé en H2S (méthode BOUYSSE et al., 14).

Nous avons également porté sur le tableau les valeurs du pH de ceséchantillons après séohage à l'air.

Sans entrer dans le détail des oomparaisons des valeurs annuelles,objet de l'étude de J. VIEILLEFON, nous oonstaterons simp1ementg

Que la mangrove est enrichie en soufre par rapport à la vase nue.La forme de stockage du soufre est probablement une forme po1ysu1~

fures et non organique, oomme les expériences ultérieures d'in­oubation semblent le montrer.

- Que tous les échantillons subissent une aoidifioation au séchage.Elle est d'autant moins forte que l'on passe des mangroves auxtannes, c'est-à-dire que le stook de soufre total s'épuise.

- Que la forme monosu1fure, attaquable par HC1, est pratiquementnégligeable, même dans la mangrove à Avicennia. Elle disparaîtcomplètement par séohage. Nous n'en tiendrons pas oompte par lasuite.

6

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non traité

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- 16 -

Que le soufre se trouve dans la mangrove à Rhizophora sous uneforme peu accessible à l'oxydation. La fraction S6, c'est-à-direle soufre difficilement oxydable oxydé par séchage, est plusabondante en fin de saison des pluies, mais ne forme que 15 à 20%au maximum du soufre total de l'éohantillon.

- Que la diminution du soufre total quand on passe de la mangroveau tanne peut s'expliquer par l'épuisement progressif du stockde sulfures peu oxydables, les alternances d'aération-asséohe­ment et d'engorgement provoquant l'oxydation d'une fraotion deceux-ci à chaque saison sèche. Les sulfates produits peuventalors être lessivés hors du profil pendant la saison des pluiesou s'accumuler sous forme de sulfates basiques de fer, peu solu­bles, jarosite et natrojarosite.

cl INCUBATION AEROBIE AVEC DESSECHEMENT LEET

1) Protocole d'essai

L'échantillon fraiohement prélevé est homogénéisé et réparti parfractions de 50 g. dans une série de grandes boites de Pétri. L'épaisseur dela couche de sol ne dépasse pas 5 mm, permettant une bonne aération.

Les boites sont alors placées dans un dessiccateur sans boucherle sommet du oouvercle pour laisser passer l'air mais réduire l'évaporation,et incubées à 30°. Le sol est remué chaque jour pour augmenter l'aération.

Pour mettre en évidenoe la sulfo-oxydation biologique, nous avonsutilisé un inhibiteur de la respiration bactérienne, l'azoture de sodium àla concentration de 2. 10-3•

Le choix de l'azoture a été fait par référence aux travaux de HART(1 et 2) qui a étudié l'effet de l'azoture sur la baisse du pH. D'autresauteurs (TAYLOR et al., 34) ont également employé l'azoture comme inhibiteurdes enzymes de la sulfo-oxydation. Nous verrons ultérieurement en détail quel~

sont les effets de l'azoture sur la respiration et nous comparerons sonaction avec celle d'autres inhibiteurs.

Toutes les techniques 4e mesure ont été exposées préoédemment(voir chapitre Ai, A2 et A3).

2) L'effet de l'incubation aérobie sur le pH et les formes dusoufre. Action d'un inhibiteur de la respiration.

Les résultats sont présentés sous forme de schémas dans les fi­gures III, IV et V. Sont notées l'évolution du pH. des sulfates solubles.du soufre élémentaire,de l'intensité respiratoire et du loG. du nombre deThiobacilles, estimé par comptage sur boites de milieu au thiosulfate.L'humidité en %de poids sec est portée sur l'échelle inféDieure pourchacune des mesures effectuées.

- 17 -

La baisse du pH et l'augmentation du taux de sulfates sont con­commitantes et débutent dès le commencement de l'aération, bien que l'humi­dité soit encore très forte. Dès le 12ème jour environ l'oxydation est ter­minée, le pH a atteint sa valeur extrèmo de 4,4.

Le soufre élémentaire diminue au oours de l'aération. A la fin del'incubation, 65 %du soufre total de l'échantillon de vase nue se trouventsous forme de sulfates solubles. Cette fraction se trouvait donc sous uneforme assez facile à oxyder, mais n'est pas constituée de monosulfuresdéplaçables par HCl 4 N.

Le nombre des Thiobacilles augmente très rapidement, le niveau dedépart étant assez bas. La respiration ne suit pas les mêmes variations.

La sulfo-oxydation est presque totalement inhibée pendant toutela durée de l'expérience. Le pH reste élevé, le soufre élémentaire n'est pasoxydé. On note cependant une légère augmentation du taux de sulf~tes solu­bles.

Contrairement aux autres échantillons (voir plus loin) il sembleque l'effet de l'azoture soit durable dans la vase nue.

La baisse du pH et l'augmentation du taux de sulfates, en rapportavec l'accroissement du nombre des Thiobacilles, sont importants mais pluslents que dans l'échantillon 57.

Le soufre élémentaire augmente légèrement au cours de l'incuba­tion. A la fin de l'expérience 25 %du soufre total de l'échantillon sontpassés. sous forme de sulfates.

L'effet de l'azoture est net au début de l'incubation. Le pH etles sulfates évoluent peu, pendant que le soufre élémentaire augmente trèsfortement. Dès le 10ème jour, l'inhibition cesse, le nombre de Thiobacillesaugmente ainsi que la respiration. On voit alors descendre le PH et augmenterle taux de sulfates. Nous verrons aux ohapitres D5 et E2 que l'azoture estdécomposé dans le sol de mangrove, et n'agit effioacement que les premiersjours.

Il a alors surtout pour effet de bloquer l'oxydation du soufreélémentaire, qui s'accumule dans l'échantillon pour être ensuite consomméquand l'aotion de l'azoture cesse.

IV

non traité

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- 18 -

La nature biologique de l'oxydation du soufre élémentaire estbien mise en évidence.

Cet échantillon n'évolue pas sensiblement au cours du séchage.Nous avions déjà mis ce résultat en rapport avec la faible teneur en soufretotal (4 %0), nous remarquons que le nombre de Thiobacilles augmente légère­ment mais reste bien plus faible que dans l'échantillon de mangrove 56.!!~E~~~~_~r 1 '~~~~ ne modifie pas les résultats, sauf pour les comp­tages de thiobacilles.

Conclusions de l'essai

Cette première expérience nous confirme le fait que l'acidifica­tion est en rapport avec le taux de sulfates solubles, et que le pH finaldépend de la quantité de soufre total présent dans l'échantillon.

Les figures VI et VII résument ces conclusions, les variations depH et de sulfates y sont comparées au cours du séchage pour les échantillons57 (vase nue), 56 (mangrove à Rhizophora) et 53 (ancienne mangrove à Avicen­nia), en comparant les échantillons non traités et traités par l'azoture2 100.

Enfin la figure YIII montre les relations entre pH et taux desulfates pour ces échantillons. La corrélation est bonne pour les échantil­lons de vase nue et de mangrove mais n'est plus vérifiée pour l'échantil-lon 53, où nous avons vu que les modification au cours du séchage sont faibles.

DI INCUBATION AEROBIE A UNE HUMIDITE CONSTANTE

1) Protocole d'essai

Pour l'ensemble des expériences d'incubation à une humidité cons­tante nous avons utilisé l'échantillon 55, c'est-à-dire un sol de mangroveà Rhizophora.

Comme nous l'avons vu les échantillons 56 et 55 sont ceux qui con­tiennent le plus de soufre total et qui subissent l'acidification la plusforte au cours du séchage.

Nôus avons préféré l'échantillon 55 qui est moins chargé en débrisvégétaux

EchantillonC%

Teneur en eauà pF = 0 (enpoids sec)

5610

245 %

554

150 %

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ReLATioN ENTRE Ui~.-rH

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- 19 -

La consistance de l'horizon 0 - 40 du profil 56 est très spon­gieuse, il contient près de 50 %de fibres et racines gorgées d'eau. Dansle profil 55 le même horizon est moins fibreux et plus argileux.

L'échantillon fraîchement prélevé est séché à l'air sous une lampeà Infra-rouges, avec une ventilation importante pour augmenter l'évaporation.La teneur en eau descend à 8 %environ en 24 heures, si on remue le sol aucours du séchage.

Nous avons vu que cette opération n'était pas sans mo~fier

l'échantillon (voir figure l et chapitre A4). Le séchage est cependant néces­saire pour la préparation de traitements comparatifs. De nombreux auteursont ainsi étudié la sulfo-oxydation sur le sol séché à l'air et passé autamis 2 mm~ HART (1 et 2), ATTOE et al. (30), l-WSER et OLSON (35), CHAUDHRYet OOUFIELD (36), LI et CALDWELL (37), BLOOMFIELD (38).

Il nous est apparu à la suite de ce travail que le procédé deréhumectation présentait de sérieux inconvénients~

1) - Dans l'échantillon séché (teneur en eau 8 %environ) qui setrouve à peu près au point de flétrissement, des capillaires très fins ontété vidés. Nous savons que pour pH 4,2 les capillaires dont le diamètre estsupérieur à 92}l sont séchés. Certains composés organiques ont alors acquisen séchant des caractères hydrophobes irréversibles. Au moment de la réhu­mectation, l'eau ne pénètre plus dans la porosité fine qu'elle remplissaitavant le séchage. Pour une même teneur en eau, la porosité humide n'est doncplus la même. Autrement dit, le pF correspondant à une teneur en eau sera ­plus faible dans l'échantillon séché et rébumidifié que dans l'échantillonfrais.

Une étude comparative est actuellement entreprise, ces phénomènesprésentant une grande importance pour les sols de mangroves, riches en ma­tière organique et n'ayant jamais subi un séchage important. Les résultatsferont l'objet d'une publication ultérieuœe.

2) - Nous verrons au chapitre E que les phénomènes d 'hystérésisque nous venons de décrire sont bien mis en évidence par les mesures derespiration du sol. Il âtait alors nécessaire, étant donné la précision desmesuras, de réhumidifier l'échantillon sous vide, pour que l'eau retrouvela porosité qu'elle occupait avant séchage.,

3) - Quand cela est possible, le meilleur procédé pour obtenir unéchantillon à une teneur en eau donnée est d'appliquer à l'échantillon lapression correspondant au pF pour cette teneur en eau. L'étude du rapportpF/teneur en eau en fonction des traitements, actuellement en cours, estdonc importante.

4) - Malgré ces réserves, les conclusions générales des essaisexposés restent valables, les phénomènes de sulfo-oxydation étant possiblesdans une large gamme d'humidités, comme nous allons le constater (voirégalement FRENEY, 11).

- 20 -

2) Influence de l'humidité d'incubation sur l'oxydation descomposés soufrés.

MOSER et OLSON (35) ont montré que dans les sols qu'ils étudiaientla sulfo-oxydation était possible de pF 1 à pF 4,5, avec un optimum situévers pF 1,5 à 2.

Nos essais d'incubation d'échantillons réhumidifiés à différentesteneurs en eau ont donné les résultats suivants: (nous donnons seulement lepH et le taux de sulfates atteints après 40 jours d'incubation, bien que lesmesures systématiques décrites au chapitres 02 aient été faites chaque se­maine) •

TENEUR EN EAU soit environ pH final so'4 final(% poids sec ) pF ( en S %0)

20 % 1,8 2,3 6,6

30 % 1,2 1,6 " 7,8

40 % 0,8 1,4 8,2

60 % 0,4 2,8 5,4

80 % 0,2 3,2 4,4

'f00 % 0 3,4 2,9

Au déput de l'incubation: pH = ],0

Nous constatons que la sulfo-oxydation reste active dans une largegamme d 'humidi tés, l'optimum se si tuant autour de 40 %de teneur en eau pourl'échantillon réhumidifié, soit pF = 0,8.

Les essais suivants ont donc été conduits à cette humidité.

3) Action de l'incubation à l'humidité optimum

Le tableau ci-dessous permet de comparer les différentes fractionsdu soufre avant et après l'incubation.

DEBUT DE FIN DEL'ICUBATION L' INetmATION

pH 4,2 1,4

SH2 (HOI 4 N) 0 0

Soufre élémentaire 0,5 3,5

Sulfates solubles 3,0 8,2

Soufre lié à la matière4,7 10,3organique

Total de ces formes 8,2 22,0

Les résultats sont donnés en soufre élément pour mille de poids se~.

- 21 -

Rappelons que le soufre lié à la matière organique a été estimésuivant la méthode EVANS et ROST décrite au chapitre Ai et né contient pasles sulfates solubles. Si on ajoute à cette forme le soufre élémentaire etles sulfates de l'échantillon, on obtient environ 65 ~ du soufre total aprèsincubation contre seulement 25 %dans le sol séché à l'air.

L'oxydation aérobie a donc fait passer 40 %du soufre total sousune forme facilement accessible aux microorganismes: soufre élémentaire,sulfates ou soufre lié à la matière organique.

La figure IX montre l'effet du traitement par des concentrationscroissantes d'eau oxygénée du sol avant et après l'incubation (le sol nonséché est indiqué en rappel).

Sur la courbe obtenue avec le sol après incubation, le palier obse.­vé pour les concentrations de 4, 6, 8 et 10 %nous montre qu'une fraction aété rendue oxydable par l'eau oxygénée 4 %. Cette fraction correspond à en­viron 30 %du soufre total de l'échantillon.

En cumulant sur la même courbe (figure X) les sulfates extraitspar H202 et le soufre élémentaire de l'échantillon on constate qu'après incu­bation ou séchage la totalité du soufre est soit sous forme élémentaire soitsous forme oxydable en sulfates par l'eau oxygénée 30 %, contre seulement60 %du soufre total dans la vase non séohée. L'oxydation a donc eut poureffet non seulement de produire des sulfates, mais de faire rentrer dans lecycle du soufre une partie du stock de soufre total.

L'absence de technique d'analyse permettant de doser le soufre despolysulfures nous empêche actuellement de connaître avec certitude la formesous laquelle le soufre est stocké dans la mangrove. Nous pensons cependantque l'eau oxygénée à 30 %à chaud aurait oxydé une forme organique, et quela fraction résistant à ce traitement dans la vase (figure IX) sa trouveprobablement sous forme de polysulfures très difficilement oxydables.H.ARMSEN(21) arrive aux mêmes conclusions dans les polders de Hollande.

Une oxydation biologique lente permettrait l'entrée de ces compo­sés dans le cycle pendant l'aération et le drainage des mangroves. Cettehypothèse est à confirmer par la suite en réalisant des expériences d'oxy­dation de divers p~lysulfures.

Des essais d'aération et de lessivages répétés seront égalementmenés pour suivre les quantités de soufre ainsi libérées, et déterminer lesformes résistantes.

4) Enriohissement en soufre élémentaire

Les concentrations en soufre utilisées dans des expériences desulfo-oxydation varient suivant les auteurs entre 10 %0 (SWABY et al., 31)et 0,7 %0 (BLOOMFIELD, 38). LI ET CALDWELL (37) étudiant l'influence deoette concentration sur le rendement de l'oxydation rapportent que ce ren­dement est indépendant de la quantité de soufre ajouté, dès que oette quan­tité excède 0, 1 %0.

Nous avons ohoisi un enrichissement de 6 %0 par de la fleur desoufre Prolabo passée au tamis 0,2 mm. L'article de LI et CALDWELL indiqueune sulfo-oxydation optimum pour des grains d'environ 0,15 mm (soit 100 mesh).

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- 22 -

Le sol séché est mélangé intimement au soufre, humidi~ié à 40 %deteneur de eau, et réparti dans de grandes boites de Petri, en couche mince.Les boites sont placées en dessiccateur fermé pour éviter l'évaporation. Leséchantillons sont remués chaque jour, les mesures de pH, sulfates, etc •••faites à divers intervalles pendant un mois.

Les résultats sont représentés sur la figure XI, le témoin étantle sol non enrichi. On constate que leur interprétation est difficile, lesvaleurs finales étant assez semblables (si on retranche le soufre ajouté àl'enrichissement, soit 6 %0). Assez paradoxalement, l'effet de l'enrichis­sement en soufre est plus net dans l'échantillon incubé à 100 %de teneuren eau (figure XII), surtout en ce qui concerne le pH.

Bien que placés dans les conditions optima pour la sulfo-oxydation,nous n'avons donc pas réussi à apprécier l'oxydation du soufre ajouté dansle sol. Ce résultat négatif peut être expliqué de deux façons g

10 Nous craignons que la fleur de soufre ne convienne pas en temps quesubstrat pour la sulfo-oxydation bactérienne. Il est possible que lesgrains soient recouverts par une fine pellicule hydrophobe. Les diffi­cultés de croissance des souches pures sur milieu à la fleur de soufresemblent confifmer cette hypothèse. C'est pourquoi l'essai sera reprisavec du soufra sublimé Merck dès que nous recevrons ce produit.

2° - Contrairement aux échantillons utilisés par les différents auteurs ci­tés plus haut, le stock de soufre total est ici très important dansl'échantillon témoin. On peut donc supposer que la concentration ensoufre n'est pas un facteur limitant. Rappelons que LI et CALDWELL ontmontré que le rendement de la sulfo-oxydation est indépendant de laconcentration en soufre, dès que celle-ci dépasse 0,1 %0, chiffre trèslargement dépassé dans le témoin.

Un enrichissement même important en soufre élémentaire est doncen quelque sorte masqué, l'équilibre des différentes formes du soufre étantun équilibre dYnamique. L'observation des variations du taux de soufre élé­mentaire et du nonbro de Thiobacilles (voir figure XI) semble oonfiroer oett~hypothèse

Dans les premiers jours le nombre de thiobacilles est en netteaugmentation dans l'échantillon enrichi, alors que le taux de soufre élé­mentaire reste stationnaire. Dans le témoin au contraire, le soufre élémen­taire augmente sensiblement au cours de la même période.

- .Dès le 16ème jour l'équilibre est rétalli, le nombre de Thioba­oilles étant identique dans les deux traitements, et le taux de soufre élé­mentaire augmentant alors dans l'échantillon traité pour atteindre la mêmevaleur que dans le témoin, si on soustrait le soufre ajouté par l'enrichis­smment.

5) Enrichissement en thiosulfate

Le sol séohé à l'air est réhumidifié par une solution de thiosul­fate, de façon à obtenir un enrichissement final de 4~0, calculé en poidsde seufre élément.

Les mesures habituelles sont effectuées comme précédemment, lesrésultats sont représentés sur les figures XIII et XIV.

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- 23 -

L'influence d'un enrichissement en thiosulfate est plus nette. A40 %de teneur en eau, nous obtenons 1 ~ de sulfates (toujours exprimé enS élément) en plus dans le sol enrichi, et une dmmi unité pH en moins quedans le témoin.

L'effet du thiosulfate sur la respiration est très net et faitl'objet d'un développement ultérieur (voir chapitre E 3). Nous verrons qu'ilest sensible le premier jour de l'enrichissement, nous retrouvons là le mêmqeffet d'équilibre observé avec le soufre élémentaire, les évolutions deséchantillons traités et non traités étant rapidement identiques.

A 100 %de teneur en eau, on observe une remontée du pH du soltraité. Celle-ci ne peut malheureusement pas être mise en relation avec lestaux de soufre ou de sulfate. Le nombre de Thiobacilles est plus nettementinfluencé par l'apport de thiosulfate que dans l'échantillon à 40 %de te­neur en eau.

Conclusions générales

Nous avions espéré mieux de ces essais. Il semble que pour suivre,l'oxydation de composés soufrés dans les sols étudiés cette méthode globaledonne des résultats difficilement exploitables.

Nous préférerons la méthode respirométrique, plus fine (voir cha­pitre E) ou une méthode de peroolation, essayée récemment et dont nous don­nons les premiers résultats au chapitre F2.

6) Action de quelques inhibiteurs, agents baotéricides ou bacté­riostatiques.

L'idée d'utiliser des inhibiteurs ou de stériliser le sol par desagents bactéricides pour distinguer les phénomènes biologiques de sulfo-oxy~

dation des réaotions ohimiques est très séduisante.

Nous avons vu (chapitre C2) que l'azoture de sodium déjà employépar HART (1 et 2) bloquait pendant les premiers jours l'oxydation biologi­que du soufre élémentaire, en produisant une accumulation de ce produit dansle sol, et une chute de pH moins forte que dans le témoin.

Nous n'avens pas trouvé mention d'autres travaux dans oe sens.L'action d'inhibiteurs sur la sulfo-oxydation des souches pures de Thioba­oilles a ét~ étudiée par TAYLOR et UMBREIT (34) et KODAMA et MORI (39).Ces auteurs ont essayé le N-ethyl maleimide (~~), le p-Chloromercuriben­zoate (CMB), l'acide monoiodoaoétiqua, et le cyanure de potassium, lesproduits les plus actifs étant le NEM et l'aoide monoiodoacétique.

Ne disposant pas aotuellement de CMB et d'acide monoiodoacétique(en oommande), les produits suivants ont été essayés:

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- 24 -

Concentration finale

Inhibiteu~des oytochromes KeN 5. 10-3NaN3 5· 10-3

Inhibiteurs des groupements HgCl2 'JO-2thiols mI 10-3

Antibiotiques Actidione 10-3

Chlortétraoyoline 10-3

Dénaturant de la paroi Phénol 5.10-3ba.ctérienne

Protocole d'essai

Le sol séché à l'air est réhurnidifié à 40 %de teneur en eau parles solutions des produits indiqués, pour obtenir les concentrations finale~

voulues. On répartit ensuite an grandes boîtes de pétri, les boîtes placées'en dessiocateur fermé à l'étuve à 30°. L'aération est augmentée en remuantle sol chaque jour dans les boites. Les mesures usuelles (pH, soufre élémen~

taire, sulfates, respiration) sont faites à intervalles réguliers pendant18 jours, l'action des inhibiteurs n'étant plus sensible sur la respirationaprès oe délai.

Rappelons que la respiration est mesurée en utilisant les fiolescylindriques modèle GARCIA, 8g de sol humide étant placés sur le plateau.

La respiration en présence d'azoture ne figure pas dans le tableaudes résultats, nous l'examinerons en détail au ohapitre E2.

Voir le tableau des résultats pages suivantes.

Les deux antibiotiques essayés ont une faible action en débutd'expérience, qui oesse pratiquement dès le 8ème jour. GOTTLIEB (40) a mcn­tré que les antibiotiques sont inaotivés par l'argile et dégradés par lemicroflore normale du sol.

Le cyanure et le chlorure mercurique ralentissent la respirationet la baisse du pH dans les premiers jours, mais les résultats de find'expérienoe ne sont pas interprétables.

Trois produits ont une action plus nette~

- Le phénol qui après 18 jours inhibe encore la respiration à 43 %0 LepH est plus élevé d'une unité, le taux de sulfates sensiblementinférieur. Le taux de soufre élémentaire reste également plusfaible que dans le témoin: nous pouvons en oonolure que le phénolinhibe l'oxydati on "en amont" du stade soufre é l ém entaire (oxy­dation des sulfures) au moins aussi fortement que l'oxydation dusoufre élémentaire lui-même.

- 25 -

Jour Jour Jour Jour Jour0 3 8 12 18

pH 3,9 2~9 2 1,8 1~ 1

i S élémentaire 0~4 1,4 1,1 2,2 2,70H121 Sulfates 2,9 3~1 4~8 5,5 6~9

Qo2 Ji 1/go/ho 37 33 22 19 15

Inhibition % X X X X X:=== -- - --========= =========== ~========= ::::=::=====c= 1========== =========:::;;::;

pH 3,9 3~6 3 2,8 2~5

~ S élémentaire 0~4 0~6 0,8 0~9 0,9Q

l2l Sulfates 2,9 3~3 3~7 4,7 5,1

Qo2 ).Ll/g./h. 14,5 25 23 20 13

Inhibition % 61 25 0 0 0====: ===================== ========== ::::======== 1========== F========= 1==========

pH 3~9 3~4 2~9 2,6 2~5

S élémentaire 0~4 3,6 6,5 5,5 4~8

~l2l Sulfates 2~9 3~2 3,8 4~7 5~6VJ

Q20 ){.1/go/ho X X X X X

Inhibition % X X X X X====: ==================::=: =========== =======::::= ========= 1========== :=========

pH 4,0 3~4 2,8 2,5 2,4

t!:I S élémentaire 0,4 4~8 5,9 6,2 5~8

~ Sulfates 2~9 3~4 3,9 5~O 5,3:s:

Q20 .J{1/go/ho 18 21 16 14,5 12

Inhibition % 51 35 26 24 20

- 26 -

Jour Jour Jour Jour Jour

° 3 8 12 18

lJ:l pH 4,0 3,2 1,9 2,0 2,1Otl

S élémentaire 0,4 0,5 0,9 1 1,2(')1-'

1\) Sulfates 2,9 3,2 3,8 4,4 5,4

Qo2 J{1/g./h. 2 16 . 19 18 16

Inhibition % 94 52 12 5 °- - - - - - - - -pH 3,9 3,4 2,3 2,1 2

>~ S élémentaire 0,4 0,8 0,9 1,1 1,3Ht:::JH0 Sulfates 2,9 3,2 4,0 4,8 5,3~

Qo2 -k l/g./ho 20 28 21 19 .15

Inhibition % 46 15 ° ° °==.=====:: ================== ========== =;======= 1=========== ==========1===========

~pH 3,9 3,2 2 2 2,1

~ S élémentaire 0,4 1,2 1,5 1,2 11-3g! Sulfates 2,9 3,3 4,4 5,7 6,6~

J{,l/g./h.(') Qo2 21 29 23 20 151::'"H

~ Inhibition % 43 12 ° ° °======== ================== 1=========== ~=========' ==========' ====:::====:: =========pH 3,9 3,6 2,8 2,6 2,7

I-(j

; S élémentaire 0,4 0,3 0,6 0,6 0,4g

Sulfates 2,9 3,0 3,2 3,8 4,5

Qo2 .~ 1/g./h. 12 12 9 9 8,5

Inhibition % 66 64 59 50 43

- 27 -

L'azoture et le mm~ ont à l'inverse une action au niveau de l'oxydationdu soufre élémentaire. En effet celui-ci s'accumule dans l'échan­tillon traité. La production finale de sulfates n"est pas négli­geable~ l'inhibiti0n n'est peut-être pas totale, ou les sulfatessont produits sans passer par le stade du soufre élémentaire.

Conclusions ~

Si nous avons montré qualitativement la nature biologique de l'oxy­dation des sulfures et du soufre élémentaire dans le sol, il semble trèsdifficile d'apprécier quantitativement la part relative des phénomènes bio­logiques par l'emploi des produits utilisés. Nous reprendrons au laboratoiredes essais avec les produits actuellement manquants:

m~B ( p-Chloromercuribenzoate)

acide monoiodcacétique

Chloroforme.

Suivant les conseils de Mr. DOMMERGUES, nous envisageons de rap­porter en France des échantillons frais de mangrove lors du prochain congépour les stériliser par les rayons gamma. Cette technique doit permettro dedisposer d'un échantillon de référence pour tout essai d'enrichissement oud'ensemencement par des souches de bactéries sulfo-oxydantes, échantillonn'ayant subi aucune transofrmation et qui sera conservé en athmosphèreinerte.

El MESURES DE LA RESPlRil.TION DU SOL EN WABBURG

1) Mesures sur le sol non séché, séché à l'air et rébumidifié,lyophilisé et réhumidifié.

Nous avons employé la très classique "méthode directe" de Warburg,décrite par UMBREIT et al. (41). Le gaz carbonique dégagé au cours de larespiration aércbie est absorbé par la potasse du puits central:

002 + 2 K 0 il

En plaçant 1 ml de potasse 40 %dans 10 puits central, on peutabsorber théoriquement 400 ml de gaz carbonique. Nous pouvons donc consi­dérer que l'absorbtion est pratiquement instantannée pour les premiers40.000 ,A(, 1 dégagés (soit 1/10ème) 0 Comme le dégagement de gaz carboniqueest à peu près égal à la consommation d'oxygène pendant la respirationaérobie, on peut mesurer la consommation de 40.000 li 1 d.'oxygène sans avoirà changer la potasse du puits central, ce qui est amplement suffisant pour10 à 20 g de sol.

Nous rappelerons les intensitésrespiratoires du sol de mangrove55 en aérobiose pour différents traitements de préparation:

- 28 -

Sol non séché, humidité naturelle •••••••••••.•••••23séché réhumidifié à 40 % 33 (moyenne)idem réhumidifié sous vide •••••••••••••••••• ; •••• 57lyophilisé, réhumidifié 40 %sous vide •••••••••••79séché avec pyrogallol, réhumidifié 40 %sous vide.63

Toutes ces mesures ont été faites sur une mince couche de solbien aéré déposée sur les plateaux des coupes cylindriques type GARCIA.

On remarque:

- Que la respiration du sol non séché encore gorgé d'eau n'estpas négligeable. L'aération provoque le commencement des phénomènes d'oxy­dation à des teneurs en eau élev~es (veisins de 0).

- Que la mesure de la respiration du sol séché et réhumidifié àla pression athmosphérique n'est pas reproductible, et dans tous les casinférieure à la même mesure sur un échantillon réhumidifié sous vide. Nousretiendrons l'explication suivante: la dessiccation a provoqué dans le solde mangrove l 'apparition do caractères hydrophc'bes irréversibles à courtterme. Si la réhumectation est conduite à la pression normale, une partiedu sol reste à l'état sec et ne participe pas à la respiration. Les résul­tats ne sont plus reproductibles. Au contraire, la réhumectation en dessic­cateur sous vide permet à l'eau de pénétrer dans les capillaires fins vidéspar le séchage. L'ensemble du sol est alors humidifié de façon homogène, lamesure de la respiration est fidèle.

Nous avons toujours utilisé cette technique dans les essaissuivants.

- Que l'œntensité respiratoire de l'éohantillon lyophilisé estplus élevéeque celle du sel séché à l'air. Ce résultat expérimental peuts'expliquer par le fait que le pH ~este assez voisin de la neutralité pen­dant la lyophilisation, alors qu'il décroît sensiblement au cours du sécha­ge à Itair :

pH pâte 1/1 sol lyophilisé •••••••••••••••••••••••••• 5,5pH pâte 1/1 sol séché à l'air ••••••••••••• entre 4,5 et 3,5

suivant la durée du séchage. (ce pH peut continuer à décroître si l'on con­serve longtemps l'échantillon sec en sac plastique).

Certains groupes bactériens peuvent être affeotés par cettechute du pH. Enfin la mesure de la respiration du sol lyophilisé montre quela lyophilisation n'a pas diminué l'activité microbienne. Nous pouvonsdonc envisager comme au chapitre A4 d'utiliser dans la mesure du possiblela lyophilisation comme moyen de séchage des échantillons de mangrove,meilleur procédé pour respecter les caractères physico-ohimique.

2) Effet de l'azoture sur la respiration

Au oourS des essais d'inhibition par l'azoture décrits au ohapitreC2, nous avions caloulé l'inhibition de la respiration par l'azoture. Les

- 29 -

chiffres obtènus étaient très encourageants, puisque nous trouvions desinhibitions de 95 et même 100 %. (donœ très supérieures aux inhibitionsobtenues avec les autres produits, voir chapitre D6).

Nous avons donc pensé utiliser le traitement à l'azoture commetémoin pour mettre en évidence l'oxydation ryiologique d'un certain nombrede composés soufrés.

L'aspect curieux de la courbe de respiration du sol traité à l'a:zoture et enrichi en thiosulfate (voir figure XV courbe en traits pleins,croix) nous a incité à refaire une série d'expériences avec le sol stéri­lisé à l'autoclave à 120°, 3 fois 1 heure à 3 jours d'intervalle. Aprèsavoir vérifié que les caractéristiques physico-chimiques n'avaient pas ététrop modifiées par l'autoclavage, nous avons constaté à l'expérience qu'ilse produisait un dégagement gazeux quand l'azoture est ajouté au sol (voirfigure XVI). Après équilibration thermique, l'azoture est versé sur lesol par le diverticule, toutes conditions étant égales.

Nous avons alors constaté avec plusieurs échantillons de solsayant des Q02 différents que dans tous les cas l'inhibition apparente dueà l'azoture était le résultat de la différence:

(Gaz produit par l' azoture avec) - (Re spiration sans azoture)le sol stérile du sol non stérile

Nous donnons dans la figure XV les courbes de respiration ainsiobtenues avec le sol 55

trait plein le sol non stérilisé- trait pointillé le sol stérilisé à l'autoclave.

On peut vérifier que:

(mesure avec azoture du sol)non stérile

= (mesure sans azoture) - (mesure avec azotu-du sol non stérile re du sol stérile)

La figure XVI donne le détail des courbes obtenues aveo le solstérile, elle permet de mesurer l'importance du dégagement avec l'azoture.

2 e+2 (N3) - )~

Nous avons cherché à expliquer ce dégagement.Le gaz produit n'estpas soluble dans la potasse, ni dans le permangana~e acide absorbant lebioxyde d'azote NO • Nous pensons qu'il s'agit d'un dégagement d'azote,suivant la formule générale.

la dégradation chimique de l'azoture est possible en présenoe de thiosul-fate comme catalyseur: t

2Na N l catalysé par 7' 2 INa + 3N2J+ 2 thiosulfate

+nitrogenase )- + -+ 3H + 2e

l'azoture peut également être réduit enzymatiquement par la nitrogenase= (DOMMERGUES, communication personnelle).

nous pouvions craindre que cette réduction se fasse chimiquement avec lesélectrons cédés par le thiosulfate =

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- 30 -

Nous avons vérifié qu'auoune réaotion ohimique ne seproduisait entre le thiosulfate et l'azoture en menant l'expérience surdu quartz lavé et en dosant le. thiosulfate après 3 heures de contaot avecl 'azoture •

Enfin la mesure de la respiration, très faible, du sol stérili­sé par autoolavage en présenoe de thiosulfate nous a mont ré que le thio­sulfate n'est pas déoomposé quand il est ajouté seul au sol de mangrov~.

En conolusion nous pensons que l'azoture subit au contact du solde mangrove une décomposition enzymatique avec dégagement d'azote etd'ammoniaque.

Rappelons que nous avions déjà constaté au chapitre C2 que l'effet del'azoture était de oourte durée. Cette décomposition accompagnée d'un dé­gagement gazeux interdit l'utilisation de l'azoture dans les expériencesmanométriques. Le témoin peut-être estimé par comparaison aveo le mesure"sol stérile".

3) Mesures respirométriques de l'oxydation de divers oomposéssoufrés par le sol.

Les mesures sont faites sur le sol réhumidifié sous vide. Lesubstrat oxydable (thiosulfate, soufre élémentaire, tétrathionate, sul­fite ••• ) est placé en solution ou suspension acqueuse dans les diverti­oules de la ooupe, la teneur en eau finale étant de 40 %. Après équili­bration thermique, le oontenu des diverticules est renversé dans la coupeau temps O. Le puits oentral oontient 1 ml de potasse 40 %.

2!l..d.!ti~~~iosulfa ~~E~! .1~_~L22

On place dans le diverticule 0,5 mM de thiosulfate. Les courbesde respiration pour le sol 55 séohé à l'air ou lyophilisé sont reproduitesdans la fi gure XVII.

On oonstate que la respiration est fortement augmentée pendantles 15 premiers heures. La consommation totale pour 10 g de sol sec at­teint alors 16.000 ~l d'oxygène (sol lyophilisé). L'infléohissement dela courbe des différences cumulées entre respiration avec thiosulfateet témoin (figure XVIII) n'est donc pas due à la saturation de la potassedu puits central, théoriquement atteinte à 400.000 ftl seulement.

Cette oourbe montre que l'oxydation est pratiquement terminéeau bout de 16 heures. Elle est beauooup plus importante dans le sol lyo­philisé, probablement pour les raisons exposées au chapitre E1.

En supposant que le thiosulfate soit oxydé entièrement jusqu'austade sulfate ;

+ + 2

l'oxydation de 0,5 mM de thiosulfate correspond à la consommation de22.400~1 d'oxygène.

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- 31 -

Nous mesurons une consommation de 4.400 ""'LI avec le sol séché àl'air, de 1.900.~1 avec le sol lyophilisé. Le rendement d'oxydation ensulfate est donc a' environ :

20 % pour le sol séché à l'air35 % pour le sol lyophilisé.

Il est cependant possible que le thiosulfate ne soit pas totalement oxydéen sulfate, mais que plusieurs composés intermédiaires subsistent après16 heures d'oxydation (trithionate, tétrathionate, soufre élémentaire,etc ••• ). Ces composés sont oxydés beaucoup plus lentement.

Dans un travail ultérieur nous essayerons de caractériser l'ap­parition de composés intermédiaires au cours de l'oxydation du thiosulfatedans le sol, en utilisant des techniques chromatographiques, que nousavons employées avec les souches pures (voir chapitre III, C3).

Les essais ont été faits avec le sol 57 (vase nue) 55 (mangrovejeune à Rhizophora) et 53 (mangrove en cours d'oxydation, à Avicennia).

Les résultats sont indiqués sur les figures XIX (courbes de res­piration) et XX (différences cumulées entre la respiration avec thiosul­fate et témoin eau).

Nous constatons que les "rendement s d'oxydation en sulfate" sontinférieurs pour les sols 57 et 531

••• 00 Il _ ••••••••

Rendem<mtRendement

pourpour

lele

solsol

51.0 0 •••• 0

5312 %5 %

D'autre part les courbes des différences cumulées (figure XX)montrent que la consommation dûe au thiosulfate, inférieure à la consom­mation pour le 55, se poursuit plus longtemps dans le cas du sol 51 et 53.

Ces résultats concordent avec ceux obtenus par l'essai d'aéra­tion à une humidité constante (chapitre D), où l'ensemble des résultatsindiquait que la "capacité oxydant e" du sol de mangrove 55 était supé­rieure à celle des autres sols.

La technique respirométrique est donc un moyen rapide d'évaluerla capacité sulfo-oxydante d'un sol, par la mesure différentielle de larespiration avec le thiosulfate et le témoin eau. Nous en développeronsl'utilisation dans les essais ultérieurs.

~Xl-dation d'autr~~~~~ufré!L-!~bition

. ( N ethyl maleimide).

par le NEM---.-----

Nous avons employé la même technique avec d'autres substrats:

Soufre élémentaire •••••••••••••••- Tétrathionate de potassium •••••••- Sulfite de sodium .0 ••••••••••••••

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Le tétrathionate et le sulfite ne donnent pas une augmentation sensiblode la respiration.

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- 32 -

Le soufre élémentaire donne de meilleurs résultats, mais ils sonttout de même trop faibles pour que la technique respirométrique permette desuivre l'oxydation du soufre dans le sol. Rappelons que HART (2) avait éga­lement obtenu une légère augmentation de la respiration avec le soufre élé­mentaire. D'autres essais seront faits avec le soufre sublimé Merck, quandnous disposerons de ce produit (voir les réserves faites sur l'emploi dusoufre Prolabo, chapitre II D 4).

Dans une autre série de mesures, nous avons utilisé le NEM (Nethyl maleimide) en solution aoqueuse pour réhumidifier le sol, la concen­tration finale de NEM étant de 1 mM de Nm! peur 15 g de sol humide (ooncen­tration maximum possible en raison de la faible solubilité du produit).

Le thiosulfate est renversé dans la coupa au temps O. Ces mesuressont donc différentes de oelles effectuées au chapitre D 6, où le thiosul­fate était mélangé au sol avant le début des mesures.

Nous avons porté sur la figure XXI l'ensemble des résultatsobtenus

- respiration avec 2 mM de soufre élémentairerespiration avec 0,;mM de thiosulfate

- témoin eau- respiration aveo 2 mM de soufre élémentaire + 1 w{ NEM

respiration avec 0,5JWi[ thiosulfate + 1 mM NEM- respiration eau + 1 m},i[ NEM:.

On constate que 1 'inhibition obtenue par "f m1I~ de NEM est de 50 %pour lethiosulfate, de 30 %seulement pour le soufre élémentaire. Le témoin eau +NEM montre que l'inhibiteur a peu d'effet sur le respiration de base dusol non enrichi. L'inhibition est donc assez spéoifique.

Conclusions: Nous avons montré que la technique respirométrique est utili­sablëPëüF"caraotériser la capacité de sulfo-oxydation d'un sol. Le thio­sulfate semble être le meilleur substrat pour ce test. L'inhibition par leNEM de la sulfo-oxydation est assez spécifique, mais en raison de la faiblesolubilité du produit elle ne dépasse pas 50 %dans le meilleur cas.

F/ ESSAI DE PERCOLATION DU SOL

1) Construction d'un appareil simple de percolation.

Les difficultés rencontrées lors de l'isolement des souches deThiobacilles ont conduit oertains auteurs à enrichir le sol par percola­tion de solutions de thiosulfates. Nous étant heurtés aux mêmes diffi­cultés (voir plus loin), nous avons cherché à mettre au point un appareil­lage qui permettrait de réaliser simultanément la peroolation de plusieurséohantillons.

Nous avons dono construit l'appreil représenté sur la figureXXII. L'échantillon de sol (1 ou 0,5 g) est mélangé à 5 g environ de quartzlavé aux aCides, pour augmenter sa perméabilité et éviter le colmatage. ~e

mélange est placé dans un petit tube de verre, bouché à ses extrémités pardu ooton de verre. Le tube est alors relié à un tuyau de plastique pourformer une bouole de 20 oM de diamètre environ. Une quanti té connue deliquide de percolation est enfermée dans la boucle (en générai )0 ml pourun tube de diamètre 20 mm). Quand on fait tourner la boucle le liquidepercole l'échantillon.

ANNEAU DE PERCOLATION

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APPAREIL POU'R' PERCOLATION

- 33 -

Les bouoles sont placées sur un cylindre ~ui tourne à raison de1/2 tour par minute~ Le cylindre peut recevoir 20 boucles de tuyau diamè­tre 20 mm.

Cet appareillage simple réalise la percolation simultanée de 20échantillons, à raison de 30 ml toutes les deux minutes.

Initialement construit dans le but d'isoler des souches sur desmilieux différents, il est rapidement apparu ~ue cet appareil pouvait ser­vir à de nombreux essais :

percolation du sol par de l'eau, avec mesure du pH, de laconcentration en sulfates, et comptage des Thiobacilles dansle percolat.

percolation du sol par des solutions de différents produitssoufrés: thiosulfate, sulfure, etc ••• (ou percolation du solenrichi de soufre élémentaire par de l'eau), avec mesure dupH, sulfates, nombre de Thiobacilles dans le percolat.

- percolation du sol par des suspensions de bactéries isoléesen souches pures, comparaison de l'évolution des caractèresdécrits avec un témoin eauo

Les premiers résultats montrent ~ue nous pouvons espérer utili­ser oette techni~ua avec succès. De plus il est très facile d'y associerle test d'évaluation des bactéries sulfo-oxydantes employé par MOURARET(non publié) où une quantité connue d'eau contenant les bactéries est fil­trée sur Millipore, le filtre placé en contact avec un milieu au soufreet l'acidification mise en évidence par le virage d'un indicateur coloré(voir chapitre II, A2).

2) Premiers résultats

Nous avons fait l'essai comparatif suivant sur le sol 55 (man­grove actuelle à Rhizophora) :

0,5g de sol sont percolés par :

de l'eau distillée

une solution de thiosulfate calculée pour obtenirun enrichissement final de 10 %0 en soufre du solsec. (soit pour le percolat une concentrationenthisulfate de 776 mg/l).

Les mesures suivantes sont effectuées tous les deux jours pen­dant 12 jours: pH, concentration en sulfates du percolat, test de sulfo­oxydation sur 5 ml de percclat.

La figure XXIII montre l'évolution des concentrations en sulfatespour les deux traitements. On voit que l'enrichissement en thiosulfateaugmente la vitesse de formation des sulfates.

Le test de sulfo-oxydation donne les résultats rapportés dans letableau ci-dessous où sont indiqués le nombre de jours nécessaires pourobtenir le virage de l'indicateur, en fonction de la durée de la percola­tion (virage du méthylorange pH = 4,4 à 3).

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- 34-

Temps de percolation 2 4 6 8 10 12(jours)

Percolat eau 17 16 15 15 13 13

Percolat thiosulfate 12 12 10 8 7 6

L'enrichissement en thiosulfate a donc nettement augmenté 10nombre des bactéries suIfe-oxydantes.

Conclusi ons ~

Nous continuons l'utilisation de cette technique utilisant oon­jcintement la percolation et le test de sulfo-oxydation pour la caraoté­risation de la "oapacité sulfo-oxydante des sols de la séquence", et lfétu­de de l'oxydation de divers substrats. Les mesures en cours feront l'objetd'un rapport ultérieur.

- 35-

III) ETUDE MICROBIOLOGIQUE DE LA. SUL:ro-OXYDATION

Nous avons vu dans la prem1ere partie (Chapitre II, A2) queplusieurs groupes de mioroorganismes oxydent les composés minéraux dusoufre (voir références à ce chapitre).

Cependant cette oxydation se trouve être la source d'énergieutilisée par les bactéries du genre Thiobacillus, et les auteurs s'ac­cordent à donner à ce groupe une part importante dans les phénomènesde sulfo-oxydation dans le sol. Les principaux articles de revue surles Thiobecilles sont ceux de VISHNIAC et SANTER (42) et de TRUDINGER(43). Au cours du stage au Laboratoire de chimie bactérienne du ProSENEZ, à Marseille, nous avons fait une revue bibliogra.phique de cesujet (44).

Dans cette première étude sur les sols de mangrove, nousavons choisi de nous intéresser aux Thiobacilles autotrophes, sansque ce choix soit restrictif pour le développement ultérieur de notretravail.

Les Thiobacilles sont des bactéries chimiolithotrophes quitirent l'énergie nécessaire à leur croissance de l'oxydation des com­posés minéraux soufrés. Leur métabolisme a fait l'objet de nombreuxtravaux depuis leur découverte, mais les mécanisme s biochimiques étu­diés sont très controversés. La plus grande difficultés previent dufait qu'il n'existe pas de méthode fine d'analyse des produits inter­médiaires formés, et que ces produits ont une fâoheuse tendance àréagir chimiquement entre eux dans les milieux de culture. Nous sou­haitons oontribuer à ces études en utilisant un matériel biologiqueprovenant du milieu particulier qu'est le sol de mangrove, riche encomposés soufrés. On doit donc s'attendre à rencontrer dans ce mi­lieu une grande variété d'espèces présentant des caractéristiquesphysiolcgiques intôressantes.

L'emp~~ des techniques de chromatographie et des composésmarqués par le S peut faciliter les études et nous souhaitons nousfamiliariser avec ces techniques lors du prochain congé en France.

A.I ISOLEMENT DES SOUCHES

Nous avons pratiqué des cultures d'enrichissement en milieuliquide pour isoler les souches. En effet les colonies développées diree­temen~ en milieu solide au thiosulfate lors des comptages sur boitesn'ont jamais pu être reprises et iransférées sur milieu liquide. Nouspensons que la croissance des souches sauvages en milieu sélectif soli­de donne des inoculums insuffisants pour le démarrage de la croissanceen milieu liquide. Nous verrons que la vitesse de croissance et le ren­dement des souches isolées s'améliore au cours des premiers repiquages,et qu'il faut attendre environ dix passages sur milieu liquide pour quel'étalement sur boite donne des colonies capables de repartir en milieuliquide.

- 36 -

Plusieurs milieux de culture ont été indiqués par les auteurssuivant les espèces isolées (voir POSTGATE, 28; VISHNIAC et SANTER, 42;BAALSRUD, 45). Ces milieux comportent comme substrat soufré soit le thio­sulfate, soit le soufr~ élémentaire, avec une nette préférence des au­teurs pour le thiosulf"l.te, soluble dans l'eau. Nous avons constaté queces milieux classiques avaient le grave défaut de précipiter au contactdu sol de mangrove, probablement pour âes raisons de concentrations sali­nes et de pH.

Après plusieurs ser1es infructueuses d'enrichissements, nousavons cherché dans la littérature les formules qui pourraient convenir ànotre cas particulier.

Nous avons finalement choisi le milieu de base décrit parSKERMAN (46) dans son ouvrage général sur l'identification des bactéries.Pour obtenir un milieu finalement tamponné à pH 6,8 après addition dubicarbonate, nous avons ajusté la base minérale à pH 4,5. Cette base peutêtre stérilisée à l'autoclave et conservée très longtemps.

Au moment de l'emplOi les composés suivants sont ajoutés stéri­lement par filtration:

Concentration finale

1,5 g/l

10 g/l

pour les milieux anaérobies:

KN03 3 gjl

Pour obtenir un milieu au seufre élémentaire, celui-ci est stérilisé avecle milieu de base à raison de 10 gjl.

Enfin des enrichissements on été conduits en anaérobiose surun milieu ne comportant pas d'autre source d'azote que le nitrate (dans labase minérale normale figure de l'azote ammoniacal). Ce milieu permet d'iso~

1er des bactéries qui respirent et assimilent le nitrate.

et 53:Les enriChissements suivants ont été tentés avec les sols 57, 55

Thiosulfate pH 6,8A6robiose •••••••••••••••

Soufre pH 4

Thiosulfate, nitrate seul.pH 6,8Anaérobiose .

Thiosulfate, N (NH+ )4

pH 6,8

Pour l'enrichissement en aérobiose, 5 g de sol sont recouvertspar une couche de 2 cm d~ milieu liquide, en erlen de 750 ml. Les isole­ments en anaérobiose sont conduits dans des ballons de 250 ml, remplisjusqu'à la moitié du col, et bouchés par de la paraffine coulée. En effetsi l'on fait le vide dans un ballon contenant le milieu de culture, lapression partielle de C02 diminuant le bicarbonate se trouve décomposé:

--.J'NaH C03 ~>~ C02 + NaOH

- 31 -

3t le pH du milieu augmente parfois jusqu'à pH 8,5. La décomposition dubicarbonate nous empêche donc de réaliser l'anaérobiose en faisant le videdans les ballons de culture.

Résultats: Malgré de nombreux essais en variant la quantité de sol ajoutéou les composés soufrés, nous n'avons jamiis obtenu de croissance dans lesisolements en aérobiose. Cet échec est probablement du au manque d'aéra­tion du milieu. Ne disposant pas d'un dispositif pour l'agitation des bal­lon" il est alors très difficile d'obtenir une bonne aération. Nous re­prendrons des isolements en aérobiose avec l'agitateur demandé pour lelaboratoire actuellement en construotion à Bel-Air.

On peut également penser que l'échec des isolements en aérobioseprovienne du caractère anaérobie des sols de mangrove. Le biotope partiou­lier a séleotionné les espèoes pouvant se maintenir en anaérobiose.

Enfin rappelons que dans ce premier travail nous n'avons pascherché à isoler les espèces hétérotrophes, qui sont peut-être les plusactives. Leur étude qui demande un matériel et des installations stériles.sera entreprise au nouveau laboratoire de Bel-Air.

En anaérobiose, nous avons isolé plusieurs souches sur les diffé~

rents sols de la séquence. Après éuude nous en avons finalement choisi deuxqui présentent des caractères mifférents et intéressants, que nous appel­lerons dans oe rapport les souches 1 et 2.

La souche 1 est isolée et maintenue sur milieu au thiosulfate,nitrate et azote ammoniacal. La souche 2 est isolée avec le nitrate oommeseule source d'azote.

Après une série de repiquages en milieu liquide, où nous avonsoonstaté que la vitesse de croissance augmentait à ohaque repiquage(oroissance terminée en 8 à 10 jours au début, en 3 jours seulement aprèsle dixième repiquage), les bactéries ont été étalées sur boîtes de milieuau thiosulfate solidifié par 3 %d'agar. Après 5 à 6 jours d'inoubationà 30° des oolonies blanchâtres apparaissent. Trois passages en stries àl'Oëse à partir d'une colonie isolée sont suffisants pour assurer la puretédes souches. On vérifie alors qu'aucune croissanoe n'a lieu sur milieuriche sans thiosulfate (test de pureté)

Les bactéries se conservent en tube d'agar au thiosulfate pendant1 mois. Il faut cependant repasser en milieu liquide anaérobie tous les de~

mois. Nous avons en effet oonstaté que les bactéries ne peuvent plus déma~

rer en anaérobiose si elles sont oonservées plus de 4 mois uniquement enmilieu solide aérobie. Les propriétés dénitrifiantes sont perdues par 3repiquages en milieu solide aérobie.

"BI ETUDE MORPHOLOGIQUE DES SOUCHES

Souche 1 -

Les oolonies sur boîte de milieu au thiosulfate sont petites,rondes, légèrement~mbées;-bIano-jaunâtreopaque. Il est très diffioiled'obtenir des oolonies bien espaoées: si l'on épuise l'inooulum de l'Oësepar des stries répétées sur plusieurs boîtes, les oolonies sont d'abord

- 38 -

jointives, puis légèrement espacées, enfin auoune oolonie ne pousse sansque l'on observe de stries ne comportant que quelques colonies.

Aspect morphologique : Il diffère légèrement si la baotérie estcultivée en-mIïieu ÊÎollae-ëüliIquide.

- En milieu solide, on observe à l'état frais des petites baoté­ries isolées, 0, 5...At X 1/tt, environ, assez mobiles. Elles sont intimementmélangées à des grains de soufre élémentaire très réfringeants, de mêmetaille environ que les bactéries elles-mêmes.

- En milieu liquide, les baotéries sont un peu plus grandes,toutes très mobiles, parfois associées par deux ou trois individus encourtes ohaînes. Au début de la croissanoe on ne remarque pas de soufreélémentaire dans le milieu. En fin de croissance seulement des grainsabondant s apparai ssent •

Coloration de GRAM faite d'après la méthode décrite parSKERMAN (4~J:-La souche Test Gram néga.tive.

~oration_~~!la~!!~:La méthode de BAlLEY, modifiée parFISEER et CONN, et rapportée dans ''Manual of microbiologioal methods" (47)avait été employée avec succès sur les souches isolées au Laboratoire deChimie Baotérienne à Marseille. Cette teohnique donne assez facilementde bons résultats, la ooloration des flagelles étant oonsidérée souventcomme délioate.La souohe 1 est mobile par un seul flagelle polaire.

Souohe 2

Isolée et maintenue sur milieu au thirsulfate, le nitrate étant lla seule source d'azote.

Les colonies sur boîtes sont petites, rondes, aplaties, blan­ches et opaques.-oomme poür-ïa-Souche 1 il est diffioile d'obtenir des co­lonies espacées.

!spe~t morph~!~~: En milieu solide, l'aspect est analogueà celui de la souche 1. Par contre en milieu liquide, les baotéries sontassez allongées, taille 0, 5.1t x 1, 5 ..~ et même 2)-l. Les ohaînes de deuxou trois iniividus sont fréquentes. Toutes les baotéries sont très mobiles.

Q:!~!!~~~...Q~_~~œ:~

~~!latio~~~ir~~un seul flagelle

L'ensemble de ces caractères morphologiques et le milieu decroissance de oes bactéries permettent de les identifier comme apparte­nant à l'espèoe THIOBACILLUS DENITRIFICANS, décrite par BElJERINCK (48).

- 39 -

C/ ETUDE DE LA CROISSANCE

1)Courbe de croissance

L'établissement de la courbe de croissance d'une bactérie permetde calculer son temps de division en présence du substrat. On mesure ladéviation optique du liquide au cours de la croissance au spectrophotomètreJean et Constant à 450 m/",,\.-. '

La croissance est ici étudiée en milieu anaérooie, car les résul~

tats de l'essai en milieu aérooie n'ont ~as été satisfaisants. Les figuresXXIV et XXV reproduisent les courbes obtenues avec les souohes 1 et 2 res­pectivement.

Souche 1

(figure XXIV). La phase de latence dure environ 24 heures, pen­dant lesquelles la déviation optique du milieu augmente lentement. La phas~

exponentielle est atteinte après 30 heures, et se poursuit pendant 15 heuresenviron. La croissance diminue alors, les mesures sont gênées par le soufr~

qui précipite dans le milieu.

Temps de division pour la souche 1 = 5 heures 3/4.

Scuche 2 (Figure XXV)

Croissanc~UE~ilieu avec~~~~~~~~! (milieu A)

La 90urbe de croissance est très seoblaole à celle de la souohe 1 sur lemême milieu, la phase de latence est plus longue de 7 heures environ.

Temps de division avec le milieu A = 5 heures 3/4.

Q!~!~~~~~_!!1!!~~~~~~!~~~~~~!(milieu B)La phase de latence est encore prolongée et dure 26 heures. La phaseexponentielle est aussi moins rapide.

Temps de division aveo le milieu B = 6 heures.

L'apport d'azote ammoniacal a donc favorisé la croissanoe de lasouohe 2, entretenue sur milieu au nitrate seul.

2) Consommation de thiosulfate et production de sulfate pendantla croissanoe •

Nous avons mesuré la consommation de thiosulfate et la produc­tion de sulfate au cours des expériences de croissance décrites plus haut.

Signalons que des études semblaoles ont été faites par WOOLEYet al. (49), DE KRUYF.F et al. (50) sur des souohes de 1hiobaoillus déni­trifi cans, Th. Thicparus, et Th. thiocyanoxidans.

Les résultats sont portés sur les figures XXVI et XXVII. On peutconstater que la consommation de thiosulfate oommence dès l'ensemence­ment (temps 0) et augmente au cours de la phase exponentielle soit après)0 heures pour la souche 1 et 35 heures pour la souche 2.

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- 40 -

La production de sulfate débute plus lentement, et l'infléchis­sement de la oourbe au début de la phase exponentielle est plus net.

Le rapport molaire sulfate formé augmente net-thiosulfate consommé

tmment au cours de la phase exponentielle. Ces rapports sont respective­ment pour les souches 1 et 2 :

Phase exponentielle •••••

Phase de latence •••••••

Souche 1

0,50,7

Souche 2

0,2

0,1

On constate que si les consommationsle rapport molaire sulfate formé

thiosulfate consommésouohes pendant la phase exponentielle.

absolues sont différentes,est le même pour les deux

La valeur de ce rapport nous conduit à l'6quation

4 + ( 5 S )

c'est-à-dire que 4 molécules de thiosulfate produisent 3 molécules desulfate. Il reste 5 atomes de soufre sous forme de produits intermédiairesnon dosés (polythionates, soufre élémentaire, etc ••• ).

3) Chromatographie des polythionates

De nombreux auteurs ont Gtudié les voies mttaboliques de l'oxy­dation du thiosulfate par les thiobacilles. Sans donner ici mention del'ensemble des travaux, nous rappeDarons que trois voies principales ontété reconnues:

la voie des polythionates: le thiosulfate est oxydé en sulfatepar l'intermédiaire de polythionates, au oours de réactionsenzymatiques ou chimiques abondantes. Voir à ce sujet lesarticles de VISBNIAC et SANTER (42), WOOLEY et al. (49),TRUDINGER (43), KODAMA et MORI (51), JONES et HAPPOLD (52),SINHA et WALDEN (53).

- la voie de l'APS réductase sans polythionates, reconnue parPECK (54)

- une voie en~Eatique sans polythionates et sans APS réductase,étudiée par SUZUKI (55).

La voie des polythionates a été reconnue chez Thiobacillus dén~

trificans par WOOLEY et aL (49).

Dans un premier essai nous avons voulu mettre en évidence la for­mation de tétrathionate dans le milieu en fin de croissance des souches 1et 2. Nous avons utilisé la technique de chromatographie ascendante décri tepar SINHA et WALDEN (53).

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SOUCHE 1~ILIEU A

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- 41 -

Après 60 heures de culture à 30°, le milieu est clarifié parcentrifugation et concentré 10 fois par évaporation sous vide à 40°. Letémoin utilisé est le tétrathionate de potassium Merck.

Les figures XXVIII et XXIX reproduisent les taches obtenues enrévélant par le nitrate d'argent. On constate la présence de tétrathiona­te dans le milieu de croissance de la souche 1.

Avec 6J~1 de dépose une tache supplémontaire apparaît, proba­blement due à un thionate supérieur (SsP6 par exemple). Le milieu de crois­sance de la souche 2 au contraire ne contient pas de tétrathionate aumoment du prélèvement.

Nous avons surtout voulu expérimenter cette technique. Elle seraemployée dans des essais ultérieurs tout au long de la croissance des sou­ches, car il est possible que les polythionates intermédiaires disparais­sent en fin de croissance au profit d'autres formes. Une difficulté pro­vient du fait que l'on ne trouve pas de trithionate et de pentathionatedans le commerce. Ces produits sont synthétisés par les auteurs suivantles oesoins. Malheureusement nous ne disposons pas actuellement du maté­riel nécessaire à leur fabrication.

Quoiqu'il en soit nous avons montré que le tétrathionate estun métabolite intermédiaire de l'oxydation du thiosulfate par la souche 1.

D/ CROISSANCE AVEC DIVERS OOl\~POSES SOUFRES

Ce test de croissance est mené à 300 avec les substrats suivantss

Concentration finale

Na2S203 ••••••••

K2S406 ••••••••

Sa ••••••• o •• 0

Na2S03 •••••••••

KCNS ••••••••• 0.

10 g/l

10 ,yI

10 g/l

5 g/l

8 g/l

Nous appellerons base A le milieu salin de base avec de l'azote ammonia­cal, et base B le même milieu sans azote ammoniacal.

Dans tous les cas le milieu final contient 1,5 g/l de NaH C03'pour l'anaérooiose on ajoute K N03 à raison de 3,yl.

L'anaérobiose est conduite dans des tubes de 22, remplisjusqu'en haut et bouchés par de la paraffine coulée. La croissance aéro­bie est réalisée dans 10 ml de milieu en tube de 22 bouché par du coton.Les tubes sont ensemencés à l'Oëse par des cultures jeunes sur milieuau thiosulfate et nitrate solidifiées par 3 %d'agar.

L'anaérobiose est comparativement étudiée avec ou sans azoteaotmoniacal dans le milieu, l'aérobiose est toujours cc'nduite avec azoteammoniacal.

Les résultats sont indiqués dans les tableaux suivants.(veir pages suivantes).

TEST DE CROISSANCE ANAEROBIE

-42-

Base N03 Substrat Souche pH Croiss.Gaz

pHdébut visible fin

A + S203 1 7,1 40 h. 6,9+++

B + S203 1 1,1 ° ° ---- -- -- --== =========== ======= ===:::=== ==========: ========: ===========

A + S203 2 7,2 45 h. 6,9+++

B + 52°3 2 1,2 60 h. ++ 6,1

======== ~======= 1=========== ======= i======== ========== ========: ==========A + S406 1 7,2 1O jours + 6,9

 + S406 2 1,2 ° ° -======== 1======== 1=========== ======= 1======== 1=========== ========= ==========

A + SO 1 1,3 5 jours ++ 6,5

B + SO 2 1,3 6 jours ++ 6,6

======== 1======== F========== ======:::: 1======== 1=========== ====::=== ==========A + S03 l' 1,9 ° ° -

B + S03 2 8 ° ° -======== =;1===== i=========== ====-===::: 1======== 1=========== ======== ==========

A + KCNS l' 1,5 15 jours + 7,2

B + KCNS 2 7,4 ° ° -======== ;.======= F========== ======== F======= i::========== ======== 1===========

A - KCNS l' 1,2 ° ° -B - KCNS 2 1,2 ° ° -

==::===:::= F======= 1=========== ~======= i======== =========== 1========= F==========lA. - S203 1 1 ° ° -B - S203 2 7 ° ° -

TEST DE CROISSANCE l..EROBIE

- 43 -

Substr. Souche pH Croiss. pHdébut visible fin

S203 1 6,8 45 h. 6,2

S203 2 7,1 54 ho 6

-- ---- -- - -- ------ - ------- -- - ------ --:=:---- ---S406 1 7 10 jours 6,5

S406 2 7,1 ° -=== :---= -= -=-==-==;::=- =-====-=--= .....==-==-= = -====-=-==-=

SO 1 7,2 7 jours 5,5

SO 2 7,1 8 jours 5,7

1::====-==-=-== -==- == --- =--=--=-===- -=- =-==-=- -=- -====- =KCNS 1 7,3 15 jours 6,8

KCNS 2 7,2 ° -

- '+4 -

Quelques commentaires:

- la souche 1 isolée sur base A (NH4) ne pousse pas en anaérobiose surla base B (absence de NH~).

- on vérifie que la croissance anaérobie n'est pas possible sans nitrate

- le tétrathionate est utilisé seulement par la souche 1, de même que lethi~cyanate, la orcissance étant faible.

- il n'y a pas de croissanoe anaérobie sur thiooyanate sans nitrate: oeoaractère différentie les souohes 1 et 2 de l'espèce Thiobacillus thio­cyanoxidans qui peut utiliser le thiooyanate comme source d'énergie,d'azote et de carbone.

- Enfin la croissanoe aérobie est possible sur les mêmes substrats ets'acccmpagne d'une baisse de pH plus sensible: en effet l'acidité pro­duite par l'oxydation du thiosulfate est compensée en anaérobiose parla fcrmation de base pendant la dénitrification:

2 K NO3 + H20 >~ + 2 K OH + 5/2°2

E/ 1,ŒSURES RESPIROMETRIQUES SUR RESTING CELLS

Protooole d'essai

Les bactéries sont cultivées en milieu anaérobie thiosulfate etnitrate. Six litres de milieu sont nécessaires pour obtenir une quantitésuffisante de cellules pour une série de mesures en Warburg, le rende­ment moyen étant de 150 à 200 mg. poids sec de bactéries pour 6 litres,o 'est-à-dire environ 25 mg. par litre.

Le ballon de six litres est ensemenoé par 150 ml d'une oultureliquide en phase exponentielle de croissance. Après 40 à 45 heures lesbaotéries sont réooltées à la oentrifugeuse ]ŒE en pots de 250 ml. Lacentrifugeuse en oontinu SHARPLES commandée pour le laboratoire noussera d'un grand seoours pour traiter des quantités aussi importantes deculture, nous l'attendons avec intérêt.

Les cellules sont alors lavées trois fois par oentrifugationdans du tampon phosphate pH 6,5 à 0,025 M.(conditions ~ptimales suivantles conolusions de EAALSRUD (45) étudiant Thiobacillus denitrificans).

Après chaque centrifugation on ne reoueille que la partie supé­rieure du culot. En effet nous avons vu que des grains de soufre élémen­taire apparaissent dans le milie au moment de la phase exponentielle.Les baotéries doivent être débarrassées de ce substrat oxydable qui pro­duit des effets parasites au moment d.es lectures en Warburg. Cette dif­ficulté a été rencontrée par BAALSRUD (45) qui propose d'agiter les cel­lules dans de l'eau avec une athmosphère de prct0xyde d'azote N20, lesbactéries oxydant alors le soufre présent dans la suspension.

Ce procédé a été essayé au Laboratoire de Chimie Bactériennede Marseille et nous avons constaté que si les bactéries o%ydent effecti­vement le soufre, le phéncmène est assez lent et l'acidificati0n produitediminue l'activité en Warburg.

- 45-

Nous préférons procéder par centrifugation différentie11eg lesgrains de soufre étant d'une densité supérieure à oe11e des bactéries(densité du soufre environ 2) sédimentent plus rapidement au cours de lacentrifugation. Le soufre se retrouve au fond du culot sous forme d'undépôt blanchâtre, les bactéries sent à la surface, couleur beige fonoé.On peut vérifier par examen au microscope que le soufre ne contient quetrès peu de baotéries et que les bactéries sont peu chargées en soufreaprès une première centrifugation. En répétant l'opération trois fois,on élimine presque totalement le seufre, comme on peut le vérifier enmesurant la respiration des cellules sans apport de substrat (voir fi­gure XXXI).

On perd une quantité non négligeable de baotéries dans ces opé­rations, mais il suffit de partir d'un volume assez important de milieu.Les bactéries ainei récoltées ont une activité oxydante et nitrate-réduc­trice importante.

Le culot final peut être conservé quelques heures au réfrigéra­teur. Il est remis en suspension au ~oment de l'emploi dans de l'eaudistillée, à raison de 15 à 20 mg poids sec de bactéries par ml.

Toutes les mesures sont faites dans des fioles de 13 ml envi­ron, le volume final dans la coupe étant de 3 ml pour la phase liquide.Suivant les références de BAALSRUD on opère à pH 6,5, conoentration detampon dans la coupe 0,05 M, et à 30°. Il est bien entendu que l'in­fluence du pH et de la concentration du tampon feront l'objet d'essaisultérieurs.

Après équilibration thermique le substrat placé dans le diver­ticule est "tipé" dans la coupe au temps O.

1) Oxydation des composés soufrés en aérobiose

Activité spécifique thicsulfate oxydante des souches------------------------

Les oeurbes de respiration rapportées à 1 mg poids sec de bac­téries sont reproduites sur la figure XXX. On peut calculer g

pour le thiosu1fate s(',uche 1

souche 2= 44..Pc. 1/ IDgjh

38/ <-CI 1/ mgjh

Ces valeurs sont voisines de celles trouvées par les auteurspour les souches de Thiobaci11us th1oparus,Th. denitrificans, cu Th.thiooxidans qu'ils ont étudiées.

La courbe portée à la figure XXXI montre la respiration de 8 mgpoids sec de bactéries en présence de 5,kLM de thiosulfate. On constate~e cette courbe s'infléchit à partir d'une consommation de 220~1

d'oxygène, elle suit alors la resp iration du témoin à l'eau (correspon­dant à l'oxydation des traces de soufre élémentaire restant avec les bac­téries). Il convient donc de soustraire la respiration de base pendant lemême temps pour connaître la consommation d'oxygène due à ~M de thiosu1­fate.

Le ca1ou1 donne 210~1, soit 9Jt'M d'oxygène.

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-46-

L'oxydation aérobie du thiosulfate se fait donc suivant laformule générale g

5 520) + 9 02 ? x (804) + y (B03) + polythionates + z (80)

sans qu'il nous soit possible aotuellement de déterminer la proportionentre les métabolites formés.

Des auteurs ayant travaillé sur des Bouches de Thiobacillusthioparus et Th. thiooxidans ont calculé des équations différentes.Aucune référence ne concerne Thiobacillus denitrificans

Inhibition de l'oxydation du thiosulfate~----- -------

L'inhibition est totale par KeN, NaN3 et NEM employés à la con­centration 10-3 M dans la coupe (voir les résultats figure XXXI).

Oxydation d'autres composés (figure XXXII)--...----------On constate que l'activité est beaucoup moins forte avec le

soufre élémentaire, le sulfite, le thiocyanate et le tétrathionate,employés aux conoentrations finales indiquées sur la figure.

La respiration est cependant supérieure en présence de oessubstrats qu'avec le témoin à l'eau.

Par référence aux travaux de KODAMA et MORI (39) et (51), deLANDESMAN et al. (56) et de LONroN et RITTENEERG (57), il semble que lesvitesses d'oxydation du tétrathionate et du sulfite soient voisines decelles des souches que ces auteurs ont étudiées. Le soufre est oxydémoins rapidement par la souche 1 que par la scuche de KODM'lA et MORI.

Nous n'avons pas trouvé de références concernant la vitessed'oxydation du thiocyanate.

Nous mesurerons par la suite les respirations avec différentssubstrats sur des souches cultivées sur un milieu comportant le mêmesubstrat (rappelons que toutes les souches ont été cultivées sur milieuau thiosulfate). Nous verrons peut-être apparaître des phénomènes d'adap­tation, parfois décrits par les auteurs.

Effet de l'addition de Yeast extract (figure XXXIII ) •

On trouve mentionné dans le BERGEY que Thiobacillus denitri­ficans est considéré par certains auteurs comme hétérotrophe faculta­tive (58).

Nous n'avonspas essayé de croissance en milieu enrichi auY.E., mais vérifié que la bactérie ne pousse pas sur milieu riche sansthiosulfate (test de pureté). Nous préférons en effet bénéficier desnouvelles installations de Bel-Air pour entreprendre des études en hété­rotrophie qui demandent des conditions rigoureuses d'aseptieg la crois­sance des Thiobacilles étant beaucoup plus lente que celle des contami­nants éventuels, la contamination est fréquente quand les locaux ne per­mettent pas des conditions de stérilité suffisantes.

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- 41 -

Cependant un essai en Warburg sur la souohe 1, oultivée sur lemilieu minéral olassique au thiosulfate, nous montre que la respirationest augmentée par l'addition de Y.E. dans la ooupe (figure XXX III).

La baotérie respire même le Y.E. seul. Ce résultat important etinattendu est à confirmer par des études nutritionnelles rigoureuses.

La croissanoe hérétrophe de Thiobaoillus denitrifioans est rap­portée par le déoouvreur de l' espèoe, BElJERINCK (48) et par TRAUTWEIN(59) en 1924, mais n'a jamais été retrouvée par la suite.

Ce caractère d'hétérotrophie faoultative rapproohe la souoheétudiée de l'ampèce Thicbaoillus intermedius, déorite par LONDON (60 et61). Cet auteur a obtenu des résultats très voisins de oeux que nous avonsobservés avec la souohe 1.

Une autre espèce hétérotrophe facultative est déorite. parSANTER et al. -(62), mais ses oaraotères sont plus éloignés de oeux dela souche 1.

2) Oxydation en anaérobiose et dénitrifioation

Les courbes de dégagement de gaz avec nitrate et nitrite sontreproduites à la figure XXXIV :

trait plein

pointillé o.potasse dans le puits central

permanganate aoide dans le puits oentril.

Le permanganate aoide est un absorbant spécifique du bioxyded'azote NO, il avait été employé dans un précédent rapport (BALDENSPERGER,63) pour caraotériser l'apparition de oe gaz au oours de la réduotion desoomposés azotés.

Nous remarquons qua l'aotivité réduotrice est nettement plusforte aveo le nitrate qu'avec le nitrite. Rapporté au mg poids seo debaotéries, nous caloulons l'aotivité spéoifique suivante

14,5 IM~l N2 dégagés/mg.seo/h.

ou enoore 1, 3 /'!'v M NO3 rédui ts/mg. seo/h.

La réduction du nitrite est 2 fois plus lente.

En fin d'expérienoe la réduotion de 16)·tlli de nitrate a produit 145A ld'azote, alors que le caloul laisse prévoir 119;\1. La réduotion estdonc presque oomplète après une heure de oontaot.

Si nous oomparons l'aotivité spécifique de la souche à cellesdes souohes isolées et étudiées par GARCIA (64), nous oonstatons que lasouohe 1 est deux fois plus aotive que la souohe K3 qui semblait être lameilleure souohe de GARCIA. Nous sommes oependant loin des aotivités dessouohes de Miorooocous denitrifioans de PICHINOTY (65), qui possèdent desaotivités spécifiques de 5ft,M de nitrate réduit/mao/ho Notons que cessouohes sont entretenues et cultivées sur milieu au nitrate depuis plu­sieurs années, elles sont très améliorées par rapport aux souohes sauva­ges.

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-48-

Enfin nous remarquons sur la figure XXXIV que les dégagementsobtenus en présence de permanganate acide (absorbant le NO) et de potassesont pratiquement identiques. Ceci peut indiquer :

- soit que le bioxyde d'azote n'est pas un métabolite intermé­diaire de la réduction du nitrate et du nitrite chez la souche1.

- soit que la vitesse de réduction de ce gaz est supérieur à savitesse de formation, et qu'il n'apparaisse pas à l'état libredans la coupa.

Le dégagement intermédiaire de bioxyde d'azote avait été mis enévidence chez une souche de Thiobacillus denitrificans isolée au Labora­toire de Chimie Bactérionne de Marseille (voir BALDENSPERGER, 63). Nousreproduisons figure XXXV les résultats obtenus avec cette souche C2.

On voit que le dégagement avec nitrite est très important si onne place pas de permanganate acide dans le puits central (courbe en traitplein) et qu'il est réduit par la présence de permanganate acide (courbepointillée). Il n'y a pas de différence appréciable avec le nitrate. Pardes essais de production de N0 dans la coupe nous avions montré que cegaz est effectivement réduit par la bactérie en azote.

Sur la figure XXXvI nous avons représenté comparativement lesdégagements de gaz pour les deux souches:

- trait plein avec le nitrate

- pointillé avec le nitrite,la scuche C2 en présence de permanganate, la souche 1 avec simplement dela potasse. L'allure générale des courbes est identique, le protoxyded'azote ne peut pas être mis en évidence dans la réduction du nitrite parla souche 1.

Des études comparatives de ce type permettront de mieux définirles caractères physiologiques des souches isolées à partir des sols demangrove.

Il semble que les premiers résultats soient très prometteurs,les caractères particuliers du biotope d'isolement ayant probablementsélectionné des souches intéressantes.

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IV) CONCLUSIONS GENERALES

L'originalité du milieu d'étude choisi nous a conduit dans unepremière partie à adapter les techniques usuelles de dosages chimiques età mettre au point des méthodes nouvelles d'étude globaie de la sulfo-oxy­dation dans le sol. Ce travail va nous permettre d'étudier comparativementun nombre important d'échan~illons de sols de mangrove à ses différentsstades d'évolution vers les tannes, et d'éohantillons prélevés dans lepolder de Medina, installé en Basse-Casamanoe par l'ILACO.

Cette même originalité du milieu nous permettra aussi d'isoleret d'étudier des souohes de baotéries sulfo-oxydantes présentant desoaraotéristiques physiologiques spéoiales, voir même nouvelles.

Ainsi la souohe 2 identifiée oomme appartenant à l'espèoeThlobaoillus denitrifioans présente la partioularité, jamais enoor~ dé­ori~e, de se développer dans un milieu ne oomportant pas d'autre souroed'azote que le nitrate. Elle possèderait dono les deux enzymes de ladénitrifioation définis et étudiés par PICHINOTY (66), oe que nous es­sayerons de oonfirmer lors d'un proohain stage au Laboratoire de ChimieB~ctériennes de Marseille où travaille oet auteur.

Ainsi la souohe 1 semble avoir des oaraotères d'hétérotrophiefaoultative, disoutés ohez Thiobaoillus denitrifioans.

Indépendamment de l'intérêt purement bactériologique de tellesvbservations, l'étude des partioularités physiologiques des organismesisolés à partir de la mangrove peut aider à la oompréhension des phéno­mènes de sulfo-cxydation dans oe biotope.

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