République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l’Univers

Département de Biologie

Laboratoire :

Antibiotiques Antifongiques : physico-chimie, synthèse et activité biologique

Mémoire

En vue de l’obtention du diplôme de Master

En sciences biologiques

Option : Biochimie appliquée

Présenté

Par

BENBOUZIANE Meriem

Thème

Soutenu le 11 Juillet 2017

Devant le jury

Pr Boucherit-Otmani Zahia Université de Tlemcen Président

Dr Sari-Belkherroubi Lamia Université de Tlemcen Examinatrice

Dr Kazi-Tani Zahira Zakia Université de Tlemcen Promoteur

Année universitaire 2016-2017

Etude de la résistance à la colistine de souches hospitalières

d’Escherichia coli

Dédicace

Je dédie ce modeste travail

A

Mes chers parents que je remercie infiniment pour leurs conseils, encouragements et

leurs prières tout au long de mon cursus,

Papa, maman ; ce travail est le fruit de tous vos sacrifices, je vous aime,

Que Dieu vous garde pour nous

Mon mari BOUBAKEUR, qui m’a aidé et encouragé durant toute la période de ce

travail

Mes beaux-parents pour leurs encouragements

Mes sœurs FATIMA ZOHRA et KHADIJA

Mes frères MOHAMED et SALLAH EDDINE

Mes belles sœurs HADJER, FATIMA ZOHRA et AFAF

Mes beaux-frères FAYSAL et KHALED

Ma chère grand-mère

Mes cousines SABRINA, AMINA, FATIMA ZOHRA, MARWA et KAWTER.

La mémoire de ma tante ALIA et ma cousine FATIHA

Puisse Dieu tout puissant vous accorder sa clémence, sa miséricorde et vous

accueillir dans son saint paradis.

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Dieu le tout puissant et miséricordieux, qui nous a

donné la force et la patience d’accomplir ce modeste travail.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Mme Kazi Tani-Baba Ahmed Z.Z., Maître

de conférences classe B, au département de Biologie de la faculté des Sciences de la

Nature et de la Vie, Sciences de la Terre et de l’Univers de l’Université Aboubekr

Belkaïd Tlemcen, d’avoir accepté la charge de m’encadrer. Je la remercie vivement

pour l’aide scientifique précieuse et tous les conseils qu’elle a pu me fournir pendant

la durée de ce mémoire.

J’adresse mes vifs remerciements à Mme Boucherit-Otmani Z., Professeur au

département de Biologie de la faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, des

Sciences de la Terre et de l’Univers de l’Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen, pour

l’honneur qu’elle m’a fait en acceptant de présider ce jury. Qu’elle trouve ici l’assurance

de profond respect.

Mes remerciements s’adressent également à Mme Sari-Belkherroubi L., Maître de

conférences classe A au département de Biologie de la faculté des Sciences de la

Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l’Univers de l’Université Aboubekr

Belkaïd Tlemcen, pour l’honneur qu’elle m’a fait en acceptant de présider ce jury.

Qu’elle trouve ici l’assurance de ma respectueuse gratitude.

Je remercie également les doctorants du laboratoire "Antibiotiques Antifongiques

physico-chimie, synthèse et activité biologique", pour leur aide et conseils

Enfin, j'adresse mes plus sincères remerciements à toute personne qui a participé de

près ou de loin à l’accomplissement de ce modeste travail.

Sommaire

Première partie : Synthèse bibliographique ……………………………………………..... 1

Deuxième partie : Matériels et méthodes ………………………………………………….. 5

1. Matériel .………………………………………………………………………………… 6

1.1. Souches bactériennes ………………….………………………………………….. 6

1.2. Milieux de culture…………………………………………………………............... 6

1.3. Tests biochimiques et antibiotiques……………………………………................ 6

2. Méthodes…………………….………………………………………………………… 6

2.1. Identification ……………………..………………………………………………….. 6

2.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques …………………………………………. 7

2.2.1. Antibiogramme……………………………………………………...……………... 7

2.2.2. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice ………………………. 7

Troisième partie : Résultats et discussion ………………………………………..….......... 8

1. Identification biochimique ……………………………….…………………………… 9

2. Sensibilité aux antibiotiques…………………………….……………………………. 10

Quatrième partie : Conclusion …………………………………………………………….... 15

Cinquième partie : Références bibliographiques …………………………………........... 17

Sixième partie : Annexes ………………………………………………………………........ 24

Liste des abréviations

L-Ara4N : 4-amino-4-désoxy- L arabinose

pEtN : phosphatidyléthanolamine

BLSE : β-lactamases à spectre élargi

LPS : Lipopolysaccharide

CTX-M: cefotaxime hydrolyzing capabilities

NDM: New Delhi métallo-beta-lactamase

OXA: oxacillin hydrolyzing capabilities

AAC : aminoglycosides acétyltransférases

aac : aminoglycosides acétyltransférases

sul: sulfamide

qnr : quinolone resistance gene

pmr : polymyxin resistance operon

Dab : acide L-α, γ-diaminobutyrique

mcr : mobilized colistin resistance gene

MCR : mobilized colistin resistance proteine

bla : β-lactamase gene

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

CLSI : Clinical and laboratory standard institute

UFC : Unité Formant Colonie

Liste des figures

Figure 1. Structure chimique de la colistine………………………………... 2

Figure 2. Mécanisme de résistance chromosomique acquise à la

colistine…………………………………………………………………………. 3

Figure 3. Identification d’une souche d’Escherichia coli (Ec2) par la

galerie API 20 E………………………………………………………………... 9

Figure 4. Résultat du E-test pour la colistine………………………………. 13

Figure 5. Phénotype de résistance d’une souche d’Escherichia coli

(Ec15) aux antibiotiques………………………………………………………. 14

Liste des tableaux

Tableau 1. Résultats d’antibiogramme des 15 souches d’Escherichia

coli vis-à-vis des molécules de β-lactamines ……………………………… 11

Tableau 2. Résultats d’antibiogramme des 15 souches d’Escherichia

coli vis-à-vis des antibiotiques testés ………………………………………. 12

Première partie

Synthèse bibliographique

Première partie Synthèse bibliographique

- 1 -

La résistance aux antimicrobiens continue d’être un problème de santé publique

grave tant en Algérie qu’à l’étranger. Elle soulève la possibilité que des infections

courantes et traitables redeviennent des infections mortelles, particulièrement

illustrées par la dissémination d’entérobactéries productrices de cabapénémases

(Dortet et coll., 2016).

Escherichia coli est une bactérie à Gram négatif, appartenant à la famille des

Enterobacteriaceae (Tenaillon et coll., 2010), anaérobie facultative, en forme de

bâtonnet, oxydase négative, nitrate positive, fermente le glucose et produit l’indole

en présence de trypthophane (Kaper et coll., 2004). Elle est considérée comme un

hôte normal, c'est-à-dire commensal, de la microflore digestive de l’homme et de la

plupart des animaux à sang chaud. La niche écologique de cette bactérie se trouve

dans la couche du mucus secrétée par l’épithélium du côlon (Russo et Johnson,

2000). Cependant, il existe des souches d’Escherichia coli pathogènes qui se

distinguent des souches commensales par l’acquisition de propriétés de virulence à

l’égard de l’hôte. Ces propriétés leur permettent de s’affranchir des mécanismes de

défense de l’hôte afin de s’établir dans de nouvelles niches écologiques et d’exprimer

leur pathogénicité (Sylvie, 2010). Selon les facteurs de virulence acquis, adhésines

ou toxines (Kaper et coll., 2004), les souches d’Escherichia coli pathogènes peuvent

être à l’origine d’infections du tractus digestif, de l’arbre respiratoire et du tractus

urinaire, mais également de méningites et de septicémies (Sylvie, 2010).

Escherichia coli est caractérisée par une aptitude particulière à acquérir les

résistances à des antibiotiques habituellement actifs (Oteo et coll., 2002).

La résistance aux β-lactamines est dominée par la production de β-lactamases à

spectre élargi (BLSE) et de carbapénémases (Chouchani et coll., 2011).

En Algérie, seules les BLSE de type CTX-M3 et CTX-M15 ont été identifiées chez

Escherichia coli (Baba Ahmed-Kazi Tani et Arlet, 2014). Ces enzymes confèrent

une résistance à la quasi-totalité des β-lactamines, excepté les céphamycines et les

carbapénèmes. Elles sont inhibées par les inhibiteurs de β-lactamases comme

l’acide clavulanique, le tazobactam et sulbactam (Bradford, 2001). Les gènes codant

pour ces enzymes sont principalement situés sur des éléments génétiques mobiles

expliquant la rapidité de leur diffusion (Partidge, 2011). Concernant la résistance aux

aminosides et aux quinolones, elle est marquée par la dissémination de nouveaux

déterminants de résistance tels les méthylases de l’ARN 16S(16S-RMTase), les

gènes qnr ou encore l’enzyme bi-fonctionnelle AAC(6’)-1b-cr (Baba Ahmed-Kazi

Première partie Synthèse bibliographique

- 2 -

Tani et Arlet, 2014). En Algérie, les gènes codant les aminoglycosides

acétyltransférases aac(3’)-II et aac(6’)-Ib ont été identifiés sur des plasmides

associés aux gènes de résistance aux β-lactamines (blaCTX-M) et aux quinolones

(qnrB) (Meradi et coll., 2011). La résistance aux sulfamides et au triméthoprime a

été liée à la présence d’intégrons de classe 1 portant les gènes sul1 et dfr-like et au

gène sul2 (Baba Ahmed-Kazi Tani et coll., 2013).

La multirésistance d’Escherichia coli aux antibiotiques a engendré le retour de la

colistine comme traitement de dernier recours, abandonné dans les années 80 en

raison de sa toxicité rénale et neurologique [(Abass et coll., 2012) ; (Biswas et coll.,

2012)]. Cet antibiotique appartient à la famille des polymyxines du groupe E.

Il est produit par Bacillus polymyxa subspecies colistinus (Frasca et coll., 2008).

Il est constitué d’un mélange complexe d’au moins 30 composés, dont les deux

majeurs sont la colistine A et la colistine B. Chaque composé de ce polypeptide est

un décapeptide cyclique lié à un acide gras (Figure 1) [(Turkoglu et coll., 2012) ;

(Li et coll., 2006)].

Figure 1. Structure chimique de la colistine (Li et coll., 2006)

La colistine exerce son activité antibactérienne en se liant au lipide A du

lipopolysaccharide (LPS), par interaction électrostatique entre les résidus d’acide

L-α-γ-diaminobutyrique (Dab) chargés positivement de la colistine et les groupes

phosphates chargés négativement du lipide A (Velkov et coll., 2009). Elle déplace

Première partie Synthèse bibliographique

- 3 -

par la suite de manière compétitive les cations divalents calcium (Ca 2+) et

magnésium (Mg 2+) qui stabilisent le LPS (Yahav et coll., 2012). La colistine forme

des pores dans la membrane externe, ce qui favorise son absorption dans la cellule

et permet le passage de molécules différentes (Fathy Mohamed et coll., 2016). Cela

conduit à la lyse de la cellule, la fuite du contenu intracellulaire et la mort cellulaire

(Rhouma et coll., 2016).

La résistance acquise d’Escherichia coli à la colistine est principalement liée à des

mutations chromosomiques conduisant à des modifications de charge du LPS

(Dortet et coll., 2016) par addition de phosphatidyléthanolamine (pEtN)

et/ou du 4-amino-4-désoxy- L-arabinose (L -Ara4N) (Bergen et coll., 2012).

Ces modifications impliquent l’activation des systèmes de régulation à deux

composants PhoP/PhoQ et PmrA/PmrB (Dortet et coll., 2016) en présence de

stimuli environnementaux ou par des mutations spécifiques (Figure 2) (Olaitan et

coll., 2014 ).

Figure 2. Mécanisme de résistance acquise chromosomique à la colistine

(Dortet et coll., 2014).

Le système PhoP/PhoQ est régulé par la protéine transmembranaire MgrB (Dortet

et coll., 2016). En condition de faible concentration en Mg2+, le récepteur

transmembranaire PhoQ phosphoryle PhoP. Ce dernier se lie au niveau de l’ADN et

induit la transcription de pmrD (Velkov et coll., 2014). Le gène mgrB exerce un

rétrocontrôle négatif sur le système PhoP/PhoQ en stimulant l’activité phosphatase

Première partie Synthèse bibliographique

- 4 -

de PhoQ, limitant ainsi l’activation de PhoP (Lippa et Goulian, 2009). Une délétion

au niveau du gène mgrB conduit à la régulation positive des gènes régulés par PhoP

(Cannatelli et coll., 2013). Le récepteur transmembranaire PmrB s’autophosphoryle

en présence de concentrations micromolaires de Fe3+, de Al3+ et d’un pH légèrement

acide (Prost et coll., 2007). Il transfère ses groupements phosphoryles à PmrA qui

se lie aux promoteurs des opérons arnBCADTEF (également nommé pmrHFIJKLM)

et pmrCAB (également nommé eptA), médiateurs de la synthèse du PEtN et de la L-

Ara4N ainsi que de leur transfert sur le lipide A (Olaitan et coll., 2014).

Récemment, des gènes de résistance plasmidique à la colistine, mcr-1 et mcr-2,

ont été décrits chez Escherichia coli [(Yi et coll., 2016) ; (Xavier et coll., 2016)].

Les protéines MCR font partie de la famille des phosphoéthanolamines transférases

dont l’expression aboutit à l’addition de pEtN sur le lipide A et conduit à une

diminution de sensibilité à la colistine (Liu et coll., 2016). Les modifications du LPS

par l’ajout de pEtN, confère un niveau de résistance à la colistine plus faible que ceux

conférés par l’ajout de L-Ara4N (Tamayo et coll., 2005). La protéine MCR-2 ne

possède que 81% d’identité en acides aminés avec MCR-1 suggérant une origine

différente des gènes mcr-1 et mcr-2 (Liu et coll., 2016). En Algérie, des études

récentes ont permis d’établir la présence du gène mcr-1 chez des souches

d’Escherichia coli d’origine clinique en 2011 (Berrazeg et coll., 2016) et d’origine

animale en 2015 (Yanat et coll., 2016).

La découverte du gène mcr-1 en Algérie nous a conduits à étudier le profil de

résistance à la colistine d’une collection de souches hospitalières d’Escherichia coli.

Deuxième partie

Matériels et méthodes

Deuxième partie Matériel et Méthodes

- 6 -

1. Matériel

1.1. Souches bactériennes

Une collection de quinze souches d’Escherichia coli du Laboratoire "Antibiotiques

Antifongiques : physico-chimie, synthèse et activité biologique" isolées au service de

réanimation du CHU de Tlemcen, a fait l’objet de notre étude. Ces souches ont été

entretenues par repiquage régulier et conservées à 4°C sur gélose nutritive.

La souche de référence Escherichia coli ATCC 25922 a été utilisée comme contrôle

interne.

1.2 Milieux de culture

• Bouillon nutritif (BN) (Institut Pasteur d’Algérie)

• Bouillon cœur cerveau (BHIB) (Fluka)

• Gélose Mac Conkey (Fluka)

• Gélose Mueller Hinton (Fluka)

1.3. Tests biochimiques et antibiotiques

• Galerie API 20 E (Bio Mérieux), disques d’oxydase (HIMEDIA)

• Ticarcilline (75µg), Ticarcilline / acide clavulanique (85µg), Céfamandol

(30µg), Céfoxitine (30µg), Céftazidime (30µg), Aztréonam (30µg), Imipenème

(10µg), Gentamicine (10µg), Tobramycine (10µg), Amikacine (30µg),

Ciprofloxacacine (5µg), Rifampicine (5µg), Colistine (10µg), Triméthoprime /

sulfamethoxasole (25μg).

2. Méthodes

2.1. Identification

L’identification des souches a été réalisée par galerie API 20E et test d’oxydase.

La galerie API 20E est une version miniaturisée et standardisée des techniques

biochimiques conventionnelles pour l’identification des entérobactéries.

L’ensemencement des 20 microtubes de la galerie a été réalisé par une suspension

bactérienne équivalente à 0,5 Mc Farland. La lecture des réactions produites pendant

la période d’incubation a été réalisée en se référant au tableau de lecture(Annexe 1)

et d’identification (Annexe 2).

Deuxième partie Matériel et Méthodes

- 7 -

Le test d’oxydase a été réalisé en ajoutant un disque d’oxalate N-diméthylphénylène-

diamine à une suspension bactérienne dense en eau physiologique. Les réactions

d’oxydation se sont traduites par une coloration violette.

2.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques

2.2.1. Antibiogramme

L’activité de 14 antibiotiques a été déterminée par la méthode de diffusion en gélose

Mueller Hinton. Un inoculum de 106 UFC/ml, obtenu à partir d’une dilution au 1/100

d’une culture de 18 heures en bouillon cœur cerveau (BHIB), a été ensemencé par

écouvillonnage à la surface du milieu gélosé. Les milieux ont été incubés à 37 C̊

pendant 18 à 24 heures. Les souches ont été catégorisées sensibles (S),

intermédiaires (I) ou résistantes (R) selon les diamètres critiques du Clinical and

Laboratory Standard Institut (CLSI, 2016)

2.2.2. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice de la colistine

Les CMIs ont été déterminées par les méthodes de dilution et de diffusion (E-Test)

de la colistine en gélose Mueller Hinton selon les recommandations du CLSI (2016).

Les inoculums utilisés étaient de 104 UFC/spot et de 106 UFC/ml respectivement.

Pour la méthode de dilution, la colistine a été incorporée au milieu gélosé à des

concentrations croissantes de raison 2 comprises entre 0,125 et 32 μg/ml

(Courvalin et coll., 2006) (Annexe 3). Après incubation des milieux à 37 ̊C pendant

18 à 24 heures, la CMI a été définie comme la plus petite concentration de colistine

inhibant toute croissance bactérienne visible. Pour la méthode de diffusion, la valeur

de la CMI correspondait au point d’intersection entre la limite de la zone d’inhibition

et la bande E-test.

Troisième partie

Résultats et discussion

Troisième partie Résultats et Discussion

- 9 -

1. Identification biochimique

Les résultats d’identification biochimique ont montré que les 15 souches étudiées

présentaient une béta-galactosidase, une lysine décarboxylase et une ornithine

décarboxylase ; elles fermentaient les sucres et donnaient une réponse négative aux

tests ADH, CIT, H2S, TDA, VP, GEL et uréase. A l’aide de ces résultats et en se

référant au catalogue d’identification API 20E (Annexe 1), les souches ont été

assignées au genre espèce Escherichia coli (Figure 3).

Figure 3. Identification d’une souche d’Escherichia coli (Ec2) par galerie API 20 E

La comparaison des biotypes, déterminés sur la base des réactions biochimiques

caractéristiques du genre Escherichia, nous a permis de classer les souches en 3

groupes. Le premier est représenté par le biotype 5144572 et regroupe 4 souches

(Ec1, Ec12, Ec13, Ec18). Le second correspond au biotype 5044572 et est

représenté par une seule souche (Ec2), alors que le troisième, représenté par le

biotype 5144552, comprend 10 souches (Annexe 5). L’appartenance des 10

souches au même biotype suggère un caractère clonal. L’utilisation des biotypes

comme marqueur phénotypique constitue un des premiers outils dont dispose le

laboratoire dans les investigations épidémiologiques. Cependant, démontrer ou

infirmer l’existence d’une souche clonale nécessite d’utiliser plusieurs approches afin

d’être certain de l’identité ou de la différence des souches (Bidet et Bingen, 2012).

Les souches d’Escherichia coli identifiées dans cette étude appartiennent au

laboratoire "Antibiotiques Antifongiques physico-chimie, synthèse et activité

biologique". Elles ont été isolées au service de réanimation du CHU de Tlemcen.

Dans ce service, le développement de mutants d’Escherichia coli responsables

d’infections nosocomiales s’est accéléré au cours des dix dernières années. Le

traitement de ces infections reste souvent difficile, de par la résistance naturelle et

acquise à de cette espèce à de nombreux antibiotiques (Oteo et coll., 2002).

Troisième partie Résultats et Discussion

- 10 -

2. Sensibilité aux antibiotiques

L’étude de la sensibilité des souches aux antibiotiques a été réalisée selon les

recommandations du CLSI (2016).

Toutes les souches d’Escherichia coli ont été testées par la méthode de diffusion en

milieu gélosé vis-à-vis de 14 molécules d’antibiotiques appartenant à différentes

familles, dont 7 β-lactamines ,3 aminosides, une fluoroquinolone, une rifamycine, une

polymixine et à l’association triméthoprime / sulfamethoxasole.

Les résultats d’antibiogramme vis-à-vis de la famille des β-lactamines ont montré que

les 15 souches étudiées étaient résistantes (R+I) à la ticarcilline et à l’association

ticarcilline / acide clavulanique. Quatorze (14) souches présentaient une résistance

au céfamondole, à la céftazidime et à l’aztréonam, et (10) souches à la céfoxitine

(Tableau 1).

Ces résultats sont en accord avec ceux des études précédentes réalisées sur les

souches d’Escherichia coli isolées au service de réanimation du CHU de Tlemcen

[(Baba Ahmed Kazi-Tani et coll., 2012) ; (Ayad et coll., 2016)] et ceux rapportés

par le 16ème rapport d’évaluation de la surveillance de la résistance des bactéries aux

antibiotiques publié par le ministère de la santé de la population et de la réforme

hospitalière d’Algérie (2015) (Rahal et coll., 2017).

L’utilisation croissante des antibiotiques au niveau du service de réanimation du CHU

de Tlemcen a contribué à l’émergence et à la diffusion de souches résistantes à la

quasi-totalité des β-lactamines. En effet, une résistance marquée à l’imipénème (15

souches) a été rapportée dans cette étude. Le mécanisme essentiel de cette

résistance peut être dû soit à une résistance enzymatique par production de

carbapénémases, soit à l’association de mécanismes tels une imperméabilité et une

céphalosporinase (Nordmann et Poirel, 2014).

Troisième partie Résultats et Discussion

- 11 -

Tableau1. Résultats d’antibiogramme des 15 souches d’Escherichia coli vis-à-vis

des molécules de β-lactamines.

R : Résistance ; S : Sensible ; I : Intermédiaire. TIC : Ticarcilline ; TCC : Ticarcilline + acide

clavulanique ; CM : Céfamandole ; FOX : Céfoxitine ; ATM : Aztréonam ; IPM : Imipénème.

Le problème de la résistance aux antibiotiques chez Escherichia coli en Algérie est

aggravé par l’émergence des nouveaux déterminants de résistance aux aminosides,

aux quinolones et aux polymixines. Les souches les produisant sont généralement

multirésistantes et peuvent souvent être sources d’impasses thérapeutiques [(Baba

Ahmed-Kazi Tani et Arlet, 2014) ; (Berrazeg et coll. 2016)]. Dans cette étude, la

résistance aux aminosides a concerné la tobramycine (14), la gentamycine (11) et

l’amikacine (9). Pour les autres classes d’antibiotiques,(15) souches étaient

résistantes à la rifampicine, (13) à l’association triméthoprime / sulfamethoxasole et

(12) à la ciprofloxacine (Tableau 2).

Souches TIC TCC CM FOX CAZ ATM IPM

EC 1 R I R S R R R

EC 2 R R R S R R R

EC 3 R I R S R R R

EC 4 R R R R R R R

EC 5 R R R R R R I

EC 6 R R R R R R R

EC 7 R R R R R R R

EC 8 R R R R R R R

EC 9 R R R R R R R

EC 10 R R R R R R R

EC 11 R R R R R R R

EC 12 R R R R R R R

EC 13 R I S S S S R

EC 15 R R R R R R R

EC 18 R R R S R R R

Nombre de R +I 15 15 14 10 14 14 15

Troisième partie Résultats et Discussion

- 12 -

Tableau 2. Résultats d’antibiogramme des 15 souches d’Escherichia coli vis-à-vis

des antibiotiques testés.

R : Résistance ; S : Sensible ; I : Intermédiaire. GN : Gentamycine ; TM : Tobramycine ; AK :

Amikacine ; CIP : Ciprofloxacine ; RIF : Rifampicine ; SXT : triméthoprime/

sulfamethoxasole ; CS : Colistine.

Les résultats d’antibiogrammes vis-à-vis des aminosides, de la ciprofloxacine, de la

rifampicine et de l’association triméthoprime / sulfamethoxasole sont en accord avec

ceux retrouvés par Ayad et ses collaborateurs (2016) sur une collection de souches

d’Escherichia coli isolées au service de réanimation du CHU de Tlemcen.

Cependant, les taux de résistance retrouvés dans notre étude étaient supérieurs à

ceux rapportés par Bentorki et ses collaborateurs (2012) lors d’une étude réalisée

à Guellema.

Les résultats d’antibiogrammes vis-à-vis de la colistine ont révélé une sensibilité de

toutes les souches étudiées (Diamètre allant de 11 à 13 mm).

Souches GN TOB AK CIP RIF SXT CS

EC 1 R R S S R S S

EC 2 S R I R R R S

EC 3 I I I S R S S

EC 4 R R S R R R S

EC 5 R R S R R R S

EC 6 S I R R R R S

EC 7 R R S R R R S

EC 8 R R R R R R S

EC 9 R R R R R R S

EC 10 R R R R R R S

EC 11 S I R R R R S

EC 12 R R R R R R S

EC 13 S S S S R R S

EC 15 R R R R R R S

EC 18 R R S R R R S

Nombre de

R+I 11 14 9 12 15 13 0

Troisième partie Résultats et Discussion

- 13 -

La détection de la résistance à la colistine étant difficile par la méthode de diffusion

en milieu gélosé (Dortet et coll., 2016), la détermination des concentrations

minimales inhibitrices (CMIs) a été réalisée pour l’ensemble des souches étudiées

par la méthode de dilution en gélose Mueller Hinton. Les valeurs de CMI obtenus

(1 à 2µg/ml) nous ont permis d’assigner les souches à la catégorie sensible.

La détermination des CMIs vis-à-vis de la colistine a également été réalisée par la

méthode du E-test pour trois souches (Ec2, Ec3, Ec13). Les CMIs obtenus

(0.75 µg/ml) nous ont permis de catégoriser les souches sensibles (Figure 4).

Figure 4. Résultat du E-test pour la colistine

Les valeurs de CMIs obtenus ont révélé une bonne concordance avec les profils

d’antibiogrammes et nous ont permis de confirmer la sensibilité des souches étudiées

vis-à-vis de la colistine.

En Algérie, la prévalence de la résistance à la colistine reste basse avec seulement

deux études rétrospectives qui ont rapporté l’existence d’une résistance plasmidique

à la colistine parmi des souches d’Escherichia coli isolées en milieu hospitalier dont

deux de l’ouest algérien [(Berrazeg et coll. 2016); (Yanat et coll. 2016)].

La pression de sélection exercée au niveau des établissements de soins intensifs,

notamment lorsque seuls les antibiotiques les plus performants demeurent encore

actifs et utilisables, contribue probablement à faire évoluer les souches bactériennes

vers les pires phénotypes de résistance, ceux résistants “a tout” ou presque (Jeannot

Troisième partie Résultats et Discussion

- 14 -

et Plésiat, 2006). En effet, dans notre étude, les souches sensibles à la colistine,

étaient résistantes à au moins 5 antibiotiques. Quatre (4) étaient résistantes à 11

antibiotiques, (7) à 12 antibiotiques et une souche (Ec15) à 13 antibiotiques (Figure

5). Il en résulte que au niveau du service de réanimation du CHU de Tlemcen,

circulent des souches multirésistantes, clonales ou non, contre lesquelles les options

thérapeutiques s’avèrent très limitées.

Figure 5. Phénotype de résistance d’une souche d’Escherichia coli (Ec15)

aux antibiotiques.

TIC : Ticarcilline ; TCC : Ticarcilline + acide clavulanique ; CM : Céfamandole ; FOX :

Céfoxitine ; ATM : Aztréonam ; IPM : Imipénème ; GN : Gentamycine ; TM : Tobramycine ;

AK : Amikacine ; CIP : Ciprofloxacine ; RIF : Rifampicine ; SXT : triméthoprime/

sulfamethoxasole ; CS : Colistine.

Quatrième partie

Conclusion

Quatrième partie Conclusion

- 16 -

Escherichia coli est la première espèce d’entérobactérie impliquée en pathologie

infectieuse en milieu hospitalier. Cette bactérie est caractérisée par une aptitude

particulière à acquérir des mécanismes de résistances à des antibiotiques

habituellement actifs.

Les résultats des tests de sensibilité réalisés au cours de cette étude ont permis de

révéler d’importants taux de résistance aux β-lactamines y compris à l’imipénème.

Pour les autres classes d’antibiotiques, les résistances les plus élevées ont

concernées la rifampicine, l’association triméthoprime / sulfaméthoxazole suivies de

la gentamycine et de la ciprofloxacine. Seule la colistine était active sur toutes les

souches étudiées.

Cet antibiotique, initialement abandonné en réanimation, en raison d’une toxicité

supposée, revient en première ligne pour le traitement des infections dues à des

souches d’Escherichia coli multirésistantes. Une prescription abusive de cette

molécule pourrait contribuer à faire évoluer ces souches vers les phénotypes de

résistance à tous les antibiotiques.

Il serait donc important d’entreprendre une action de sensibilisation au bon usage

des antibiotiques et d’instaurer des réseaux de surveillance afin de limiter

l’émergence et la diffusion des souches multirésistantes et de préserver les

molécules les plus actives.

Cinquième partie

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Cinquième partie Références bibliographiques

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Sixième partie

Annexes

Sixième partie Annexes

- 23 -

Annexe 1. Tableau de lecture de la galerie API 20 E

Tests Substrats Réactions/enzymes Résultats

Négatif Positif

ONPG 2-nitrophényl-β-

galactoside β-galactosidase Incolore Jaune

ADH L-arginine Arginine dihydrolase Jaune Rouge

LDC L-lysine Lysine Jaune Rouge-orangé

ODC L-ornithine Ornithine

décarboxylase Jaune Rouge-orangé

CIT Trisodium citrate Utilisation citrate Vert pale Bleu-vert

H2S Sodium thiosulfate Production de H2S Incolore-grisâtre Dépôt noir

URE Urée Uréase Jaune Rouge-orangé

TDA L-tryptophane Trypthophane

désaminase Jaune Marro-rougeâtre

IND Production d’indole Production d’indole Incolore-vert pale-

jaune Rose

VP Sodium pyruvate Production d’acétoine Incolore-rose pale Rose-rouge

GEL Gélatine

(origine bovine)

Gélatinase Non diffusion Noir

GLU D-glucose Fermentation -

oxydation Bleu/bleu vert Jaune/jaune gris

MAN D-mannitol Fermentation-

oxydation Bleu/bleu vert Jaune

INO Inositol Fermentation-

oxydation Bleu /bleu vert Jaune

SOR D-sorbitol Fermentation-

oxydation Bleu / bleu vert Jaune

RHA L-rhamnose Fermentation-

oxydation Bleu / bleu-vert

Jaune

SAC D-saccharose Fermentation-

oxydation Bleu / bleu vert Jaune

MEL D-mélobiose Fermentation-

oxydation Bleu / bleu vert Jaune

AMY Amygladine Fermentation-

oxydation Bleu / bleu vert Jaune

ARA L-arabinose Fermentation-

oxydation Bleu / bleu vert Jaune

Sixième partie Annexes

- 24 -

Annexe 2. Tableau d’identification du catalogue analytique API 20 E

Sixième partie Annexes

- 25 -

Annexe 3. Concentrations critiques, diamètres critiques et règles de lecture

interprétative de l’antibiogramme pour Eschreichia coli (CLSI, 2016).

Familles

d’antibiotiques

Antibiotiques

testés Signe

Charge

des

disques

Concentrations

Critiques

(mg/ml)

Diamètres

Critiques (mm)

S R S R

Β-lactamines

Ticarcilline TIC 75 µg ≤ 16 ≥ 128 ≥ 24 ≤ 15

Ticarcilline +

Acide clavulanique TCC 75 µg ≤ 16/2 ≤128/2 ≥ 20 ≤ 14

Céftazidime CAZ 30 μg ≤ 4 ≥ 16 ≥ 21 ≤ 17

Aztréonam ATM 30 μg ≤ 4 ≥ 16 ≥ 21 ≤ 17

Céfamandole CM 30 μg ≤ 8 ≥ 32 ≥ 18 ≤ 14

Céfoxitine FOX 30 μg ≤ 8 ≥ 32 ≥ 18 ≤ 14

Imipéneme IPM 10 μg ≤ 1 ≥ 4 ≥ 23 ≤19

Aminosides

Tobramycine TOB 10 μg ≤ 4 ≥ 16 ≥ 15 ≤ 12

Gentamycine GN 10 μg ≤ 4 ≥ 16 ≥ 15 ≤ 12

Amikacine AK 30 μg ≤ 16 ≥ 64 ≥ 17 ≤ 14

Fluoroquinolone Ciprofloxacine CIP 5 µg ≤ 1 ≥ 4 ≥ 21 ≤ 15

Rifamycine Rifampicine RIF 5 µg ≤ 1 ≥ 4 ≥ 16 ≤ 16

Sulfamide Trimethoprime +

sulfamethoxazole SXT 25 µg ≤ 2/38 ≤ 4/76 ≥ 16 ≤ 10

Polymyxine Colistine CS 10 μg ≤ 2 ≥ 4 ≥ 11 ≤ 10

Sixième partie Annexes

- 26 -

Annexe 4. Préparation des solutions d’antibiotiques (Courvalin et coll., 2006).

Solution initiale

(μg/ml )

Solution

mère

(ml)

Eau distillée

(ml)

Concentration

Obtenue

(μg/ml)

Concentration

finale dans le

milieu (μg/ml)

5120 2 2 2560 256

5120 1 3 1280 128

5120 0.5 3.5 640 64

5120 0.5 7.5 320 32

320 2 2 100 16

320 1 3 80 8

320 0.5 3.5 40 4

320 0.5 7.5 20 2

20 2 2 10 1

20 1 3 5 0.5

20 0.5 3.5 2.5 0.25

Sixième partie Annexes

- 27 -

Annexe 5. Résultats de l’identification des 15 souches d’Escherichia coli par le

système API 20 E.

Tests

ON

PG

AD

H

LD

C

OD

C

CIT

H2S

UR

E

TD

A

IND

VP

GE

L

GLU

MA

N

INO

SO

R

RH

A

SA

C

ME

L

Te

st

D’o

xydase

Biotypes

EC1 + - + + - - - - + - - + + - + + + + -

5144572 EC12 + - + + - - - - + - - + + - + + + + -

EC13 + - + + - - - - + - - + + - + + + + -

EC18 + - + + - - - - + - - + + - + + + + -

EC 3 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

5144552

EC4 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC 5 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC6 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC7 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC8 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC 9 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC 10 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC 11 + - + - - - - - + - - + + - + + - + -

EC 15 + - + + - - - - + - - + + - + + - + -

EC 2 + - + - - - - - + - - + + - + + + + - 5044572

ملخص

ينتمون لاشيريشيا كولي سلالة 15 من لمجموعة مضاد حيوي 14لـ للبكتيريا المضاد النشاط تقييم إلى الدراسة هذه هدفت

قابلية ) بطريقة التحليل "البيولوجي النشاط و الفيزيائية، الكيمياء: الفطريات ومضادات يويةالح المضادات" مختبر إلى

E-test-) وفقا للمعايير المقترحة من قبل و التخفيف في وسط صلبCLSI . من كبيرة معدلات النتائج أظهرت

نسب الحيوية، المضادات من الأخرى ا يخص الفئاتالإيميبينيمن. و فيم ذلك في بما اكتام الحيوية بيتا للمضادات المقاومة

نشطة كوليستين فقط. وسيبروفلوكساسين التوبراميسين سلفاميثوكسازول/ ميثوبريم ثم ريفامبين، شملت قد العليا المقاومة

.المدروسة السلالات جميع على

مقاومة. –تخفيف –مضادات حيوية –تحليل –ا نشاط مضاد للبكتيري –Escherichia coli :الكلمات المفتاحية

Résumé

Cette étude avait pour but d’évaluer l’activité antibactérienne de 14 antibiotiques pour

une collection de 15 souches d’Escherichia coli appartenant au laboratoire

"Antibiotiques Antifongiques : physico-chimie, synthèse et activité biologique" par les

méthodes de diffusion (antibiogramme, E-Test) et de dilution en milieu gélosé (CLSI

2016). Les résultats obtenus ont révélé d’importants taux de résistance aux β-

lactamines y compris à l’imipénème. Pour les autres classes d’antibiotiques, les

résistances les plus élevées ont concernées la rifampicine, l’association

triméthoprime / sulfaméthoxazole suivies de la tobramycine et de la ciprofloxacine.

Seule la colistine était active sur toutes les souches étudiées.

Mots clés : Escherichia coli- activité antibactérienne-diffusion-antibiotiques-dilution-

résistance.

Abstract

The aim of this study was to evaluate the antibacterial activity of 14 antibiotics for a

collection of 15 strains of Escherichia coli belonging to the laboratory "Antibiotics

Antifungals : physico-chemistry, synthesis and biological activity" by diffusion

methods (antibiogram, E -Test) and dilution in agar medium (CLSI 2016). The results

obtained revealed high levels of resistance to β-lactams including imipenem. For the

other classes of antibiotics, the highest resistances were rifampicin, trimethoprim /

sulfamethoxazole followed by tobramycin and ciprofloxacin. Only colistin was active

on all strains studied.

Keywords : Escherichia coli - antibacterial activity -diffusion-antibiotics-dilution-

resistance.