Effets du stress oxydant sur le fonctionnement des...

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N°: 2005-ISAL-00123 année 2005 THESE Présentée DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Pour obtenir LE GRADE DE DOCTEUR Formation doctorale: Biochimie Ecole doctorale interdisciplinaire sciences-santé Par Anísio Francisco SOARES EFFETS DU STRESS OXYDANT SUR LE FONCTIONNEMENT DES ADIPOCYTES : ADIPONECTINE ET PROSTAGLANDINES Soutenance le 13 décembre 2005 Jury de thèse : M. le Dr. C. CARPENE (Rapporteur) M. le Pr. M. LAGARDE (Président) M. le Dr. C.L. LEGER (Rapporteur) M. le Dr. A. GELOËN (Directeur de thèse) M. le Pr. J.M. PEQUIGNOT (Examinateur) Cette thèse a été préparée au laboratoire de Physiopathologie des Lipides et des Membranes de l’INSA (INSERM UMR585)

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N°: 2005-ISAL-00123 année 2005

THESE Présentée

DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR

Formation doctorale: Biochimie

Ecole doctorale interdisciplinaire sciences-santé

Par

Anísio Francisco SOARES

EFFETS DU STRESS OXYDANT SUR LE FONCTIONNEMENT DES ADIPOCYTES :

ADIPONECTINE ET PROSTAGLANDINES

Soutenance le 13 décembre 2005

Jury de thèse : M. le Dr. C. CARPENE (Rapporteur)

M. le Pr. M. LAGARDE (Président)

M. le Dr. C.L. LEGER (Rapporteur)

M. le Dr. A. GELOËN (Directeur de thèse)

M. le Pr. J.M. PEQUIGNOT (Examinateur)

Cette thèse a été préparée au laboratoire de Physiopathologie des Lipides et des Membranes de l’INSA (INSERM UMR585)

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Novembre 2003 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK A. Professeurs : AMGHAR Y. LIRIS AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASKURT A. LIRIS BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSE P. LAMCOS BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUFFIERE J-Y. GEMPPM*** BUREAU J.C. CEGELY* CAMPAGNE J-P. PRISMA CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHAMPAGNE J-Y. LMFA CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COURBON GEMPPM COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUBUY-MASSARD N. ESCHIL DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES FAZEKAS A. GEMPPM FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLEURY E. CITI FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE

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GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION Novembre 2003 JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI**** NELIAS D. LAMCOS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORMAND B. GEMPPM NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PECORARO S. GEMPPM PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE RETIF J-M. CEGELY* REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RICHARD C. LGEF RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS**

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VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** VERGNE P. LaMcos Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : KOBAYASHI T. PLM PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

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SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

CHIMIE DE LYON

M. Denis SINOU Université Claude Bernard Lyon 1 Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622 Bât 308 2ème étage 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.44.81.83 [email protected]

E2MC

ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS

M. Alain BONNAFOUS Université Lyon 2 14 avenue Berthelot MRASH Laboratoire d’Economie des Transports 69363 LYON Cedex 07 Tél : 04.78.69.72.76 [email protected]

E.E.A.

ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

M. Daniel BARBIER INSA DE LYON Laboratoire Physique de la Matière Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.64.43 [email protected]

E2M2

EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2

M. Jean-Pierre FLANDROIS UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive Equipe Dynamique des Populations Bactériennes Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP 1269600 OULLINS Tél : 04.78.86.31.50 [email protected]

EDIIS

INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE http://www.insa-lyon.fr/ediis

M. Lionel BRUNIE INSA DE LYON EDIIS Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.60.55 [email protected]

EDISS

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE http://www.ibcp.fr/ediss

M. Alain Jean COZZONE IBCP (UCBL1) 7 passage du Vercors 69367 LYON Cedex 07 Tél : 04.72.72.26.75 [email protected]

MATERIAUX DE LYON http://www.ec-lyon.fr/sites/edml

M. Jacques JOSEPH Ecole Centrale de Lyon Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des Matériaux et des Surfaces 36 Avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél : 04.72.18.62.51 [email protected]

Math IF

MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE http://www.ens-lyon.fr/MathIS

M. Franck WAGNER Université Claude Bernard Lyon1 Institut Girard Desargues UMR 5028 MATHEMATIQUES Bâtiment Doyen Jean Braconnier Bureau 101 Bis, 1er étage 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.27.86 [email protected]

MEGA

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE http://www.lmfa.ec-lyon.fr/autres/MEGA/index.html

M. François SIDOROFF Ecole Centrale de Lyon Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8 36 avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél :04.72.18.62.14 [email protected]

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A mes parents et à mes frères et soers,

Pour l’amour qu’ils m’apportent et leur soutien.

A Beatriz et Vinícius,

Les meilleurs cadeaux que la vie m’a apporté.

A Célia

Pour ton amour, ta tendresse, ta compréhension et tes encouragements

de tous les jours pendant toute cette épreuve et tout le reste…

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REMERCIEMENTS

Les recherches qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisées au sein de l’unité mixte INSERM

585-INSA de Lyon « Physiopathologie des Lipides et Membranes » dirigée par le Professeur

Michel LAGARDE. Je lui suis reconnaissant de m'avoir accueilli au sein de son unité de recherche.

Je voudrais témoigner ma reconnaissance au Docteur Alain GELOEN pour avoir encadré cette

thèse. Je le remerci particulièrement pour sa rigueur scientifique, son exigence, sa disponibilité et

ses encouragements, en me faisant partager son expérience et ses connaissances scientifiques, et

aussi pour m'avoir supporté durant ces années.

J'exprime ensuite mon estime et mes remerciements aux membres de mon jury :

Le Docteur Christian CARPENE et Docteur Claude Louis LEGER qui m'ont fait l'honneur de

juger ce travail de thèse et de me faire ainsi bénéficier de leurs compétences et de leurs

connaissances.

Le Professeur Jean Marc PEQUIGNOT pour sa collaboration efficace à ce travail, ses

explications pertinentes et sa participation à mon jury de thèse.

Je voudrais remercier le Gouvernement Brésilien, plus précisément la CAPES pour m’avoir soutenu

financièrement.

Je souhaite également remercier très chaleureusement tous les membres du laboratoire, et plus

particulièrement à :

A Bader, sans qui ces deux dernières années auraient été bien mornes. Toujours prêt à nous rendre

service, avec sa bonne humeur et sa profonde gentillesse.

A Amal, Hiba et Saïda, pour leur générosité et leur patience face à mon incompréhension

linguistique et tous les bons moments qu’on a partagé. Merci.

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A Delphine, pour son acceuille chaleureux, les grosses manips qu’on enduré et pour son amitié.

Aux anciens thésards (les Dr. Laurent, Pierre, Sandrine, Olivier, Elodie, Karen) qui m’ont fait

profiter de leur expérience.

A Christophe et Marie-caroline, pour leur gentillesse leur soutien et tout simplement pour le

travail qu’on a accomplie ensemble.

A Patrick, pour sa patience, générosité et ses conseils informatiques.

A Annie-France, Catherine, Evelyne, Georges, Madeleine Dubois, Martine, Michel

Guichardant, pour les discussions et conseils scientifiques et surtout pour leur cordialité.

A Véronique, Laurence et Nathalie pour leur calme, gentillesse et disponibilité de toujours.

A Isabelle, Madeleine Pick pour les repas très agréable.

A Valérie pour les cours intensifs de français, pour l’amitié, les conseils domestique, les pauses

café.

A Olga, pour sa vivacité et la bonne humeur qu’elle diffuse autour d’elle.

A Salam, bon courage et bonne chance pour la suite.

A Salim pour son humour, sa disponibilité et ces bonnes blagues.

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TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ........................................................................................................................................................ 7 TABLE DES MATIERES................................................................................................................................................ 9 INDEX DES FIGURES ET TABLEAU ....................................................................................................................... 12 AVANT-PROPOS .......................................................................................................................................................... 15 ABRÉVIATIONS ........................................................................................................................................................... 17 RESUME......................................................................................................................................................................... 19 SUMMARY..................................................................................................................................................................... 20 I INTRODUCTION.................................................................................................................................................... 21 II RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................................................................... 23

II.1 LE TISSU ADIPEUX .......................................................................................................................................... 24 II.1.1 Le tissu adipeux blanc.......................................................................................................................... 24 II.1.2 Le tissu adipeux brun ........................................................................................................................... 25 II.1.3 L’adipocyte .......................................................................................................................................... 26

II.1.3.1 Morphologie .....................................................................................................................................................26 L'adipocyte blanc est composé d'une gouttelette de lipides. Le noyau est refoulé en périphérie de la cellule et le cytoplasme est limité à une mince couronne autour des lipides intracellulaires. .....................................................................................26 II.1.3.2 Les triglycérides ...............................................................................................................................................26 II.1.3.3 Les acides gras .................................................................................................................................................27 II.1.3.4 Lipogenèse - Synthèse des triglycérides............................................................................................................28 II.1.3.5 La lipolyse ........................................................................................................................................................29

II.1.4 L’adipocyte, cellule sécrétrice ............................................................................................................. 31 II.1.4.1 Les adipokines ..................................................................................................................................................31

II.1.4.1.1 Leptine ........................................................................................................................................................31 II.1.4.1.2 Adiponectine ...............................................................................................................................................32 II.1.4.1.3 Résistine ......................................................................................................................................................33

II.2 LE STRESS OXYDANT ...................................................................................................................................... 35 II.2.1 Définition ............................................................................................................................................. 35 II.2.2 Mécanismes pro oxydants .................................................................................................................... 36 II.2.3 Mécanismes anti-oxydants ................................................................................................................... 37

II.2.3.1 Les Enzymes : ...................................................................................................................................................37 II.2.3.1.1 Les superoxydes dismutases (SOD)............................................................................................................37 II.2.3.1.2 Les catalases ...............................................................................................................................................37 II.2.3.1.3 Les peroxydases ..........................................................................................................................................38

II.2.3.1.3.1 Glutathion peroxydase à sélénium (GPx) .............................................................................................38 II.2.3.1.3.2 La glutathion peroxydase cytosolique ..................................................................................................38 II.2.3.1.3.3 La glutathion peroxydase plasmatique .................................................................................................38 II.2.3.1.3.4 La glutathion peroxydase membranaire (HPGPx) ...............................................................................39

II.2.3.1.4 La thiorédoxine (TRX) ...............................................................................................................................39 II.2.3.2 Les molécules antioxydantes.............................................................................................................................40

II.2.3.2.1 La vitamine C..............................................................................................................................................40 II.2.3.2.2 La vitamine E..............................................................................................................................................40 II.2.3.2.3 Le sélénium.................................................................................................................................................40 II.2.3.2.4 Le zinc.........................................................................................................................................................41

II.3 LE STRESS OXYDANT ET LES MALADIES METABOLIQUES: ............................................................................... 41 II.3.1 Le stress oxydant et l’obésité. .............................................................................................................. 41

II.4 LE STRESS OXYDANT DANS LA CELLULE......................................................................................................... 42 II.5 LE STRESS OXYDANT DANS L'ADIPOCYTE: LA PRODUCTION DE ROS. ............................................................. 43 II. 6 LES PROSTAGLANDINES.................................................................................................................................. 44

II.6.1 Synthèse et dégradation des cyclooxygénases...................................................................................... 45 II.6.2 Biologie fonctionnelle des prostaglandines. ........................................................................................ 45 II.6.3 Prostaglandines et adipocytes.............................................................................................................. 47

II.7 LE STRESS OXYDANT ET LE METABOLISME DES ACIDES GRAS POLYINSATURES. ............................................. 47 III MATERIEL ET METHODES............................................................................................................................. 50

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III.1 MATERIELS GENERALES ................................................................................................................................. 51 III.1.1 Produits pour la culture cellulaire....................................................................................................... 51 III.1.2 Réactifs et solvants pour le dosage de prostaglandine ........................................................................ 51 III.1.3 Réactifs, solvants et solutions pour les Western blotting ..................................................................... 52 III.1.4 Réactifs et solvants pour les RT-PCR .................................................................................................. 52 III.1.5 Appareils .............................................................................................................................................. 53

III.2 METHODES ..................................................................................................................................................... 54 III.2.1 Les adipocytes 3T3-L1 ......................................................................................................................... 54 III.2.2 Culture cellulaire ................................................................................................................................. 54

III.2.2.1 Différenciation des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes.....................................................................................55 III.2.2.2 L’induction du stress oxydant avec la glucose oxydase ....................................................................................55 III.2.2.3 L’incubation des adipocytes 3T3-L1 avec 4-HNE ............................................................................................55

III.2.3 Dosage de l’adiponectine..................................................................................................................... 56 III.2.4 Dosage de la production de peroxyde d’hydrogène............................................................................. 56 III.2.5 Evolution de la concentration de glucose en présence de glucose oxydase......................................... 56 III.2.6 Dosage de Lactate................................................................................................................................ 56 III.2.7 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976) .................................................................. 57 III.2.8 Préparation des échantillons pour l’électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). ......... 57

III.2.8.1 Electrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et "western-blotting". ...............................................58 III.2.9 Mesure de l’expression des gènes par RT-PCR :................................................................................. 59

III.2.9.1 Extraction des ARN ..........................................................................................................................................59 III.2.9.2 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR)........................................................59 III.2.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose .....................................................................................................................60

III.2.10 Dosage du 4-HNE par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). .... 60 III.2.11 Dosage des prostaglandines E2, D2, F2α et 6 céto-F1α par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GC- MS ............................................................................................................................. 61

III.2.11.1 Extraction des prostaglandines à partir des adipocytes en culture .................................................................61 III.2.11.2 Séparation des prostaglandines par chromatographie en couche mince (CCM) .............................................62 III.2.11.3 Dérivation chimique des prostaglandines : E2, D2, F2α et 6-céto-PGF1α ........................................................63 III.2.11.4 Analyse des prostaglandines par GC-MS .........................................................................................................63 III.2.11.5 Chromatographie en phase gazeuse (GC) ........................................................................................................64 III.2.11.6 Structure et analyse des prostaglandines..........................................................................................................64 III.2.11.7 Limite de détection du GC-MS..........................................................................................................................66

III.2.12 Dosage de la Prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 par GC-MS et GC-MS-MS. .............................. 66 III.2.12.1 Extraction, séparation, dérivation et l’analyse de la 15dPGJ2.........................................................................66 III.2.12.2 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS ...........................................................................................................68

III.2.13 Liaison covalente de la prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 et son récepteur nucléaire le peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARgamma) ...................................................................... 68

III.2.13.1 Incubation de la 15dPGJ2 avec PPARgamma ................................................................................................68 III.2.13.2 Extraction et analyse au GC-MS ......................................................................................................................68 III.2.13.3 Analyse de binding radioligand ........................................................................................................................69 III.2.13.4 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)...................69

III.2.14 Analyse statistique................................................................................................................................ 70 IV RESULTATS ......................................................................................................................................................... 71

IV.1 CELLULES....................................................................................................................................................... 72 IV.1.1 Effet du stress oxydant sur les adipocytes ............................................................................................ 72 IV.1.2 Effet de la glucose oxydase sur la dégradation du............................................................................... 72 IV.1.3 Effet de la glucose oxydase sur la production du peroxyde d’hydrogène :.......................................... 74 IV.1.4 Chromatogramme du 4-HNE en GC-MS après dérivation au PFB-TMS ............................................ 74 IV.1.5 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la production du 4-HNE dans les adipocytes 3T3-L1 :................................................................................................................................................. 75 IV.1.6 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 :................................................................................................................................................. 77 IV.1.7 Comptage des adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations croissantes de glucose oxydase par fluorescence CyQuant. ............................................................................................................................................ 79 IV.1.8 Effet de la glucose oxydase et de la catalase sur la production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. ............................................................................................................................................................. 79 IV.1.9 Effet de la glucose oxydase dénaturée sur la production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.80 IV.1.10 Effet du 4-HNE sur production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. ........................................ 81 IV.1.11 Expression des ARNm codant l’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 soumises à un stress oxydant. ............................................................................................................................................................. 83 IV.1.12 Evolution de la concentration cellulaire en prostaglandines dans les adipocytes 3T3-L1 en réponse à des concentrations croissantes de glucose oxydase. ............................................................................................... 85 IV.1.13 Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au 4-HNE. ........................................... 89

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IV.2 ANIMAL.......................................................................................................................................................... 91 IV.2.1 Production des prostaglandines PGF2α, PGD2, PGE2, 6 Céto PGF1α et 15dPGJ2 dans les tissus adipeux épididymal et rétropéritonéal chez le rat Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines. ................................. 91 IV.2.2 Dosage de la prostaglandine 15dPGJ2 dans l’urine de rat Lou C âgés de 4 et 8 semaines. ............... 97

IV.3 ETUDES IN VITRO............................................................................................................................................. 98 IV.3.1 Prostaglandine 15d PGJ2 et liaison covalente..................................................................................... 98 IV.3.2 Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma .................................................................................... 99 IV.3.3 Cinétique de dissociation de différents agonistes de PPAR............................................................... 100 IV.3.4 Analyse de spectrométrie de masse au MALDI-TOF......................................................................... 100 IV.3.5 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS............................................................................................. 102

V DISCUSSION .................................................................................................................................................. 106 VI CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................................................... 114 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................................................................... 116 PUBLICATIONS.......................................................................................................................................................... 133

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INDEX DES FIGURES ET TABLEAU

Figure 1: Représentation schématique d’un adipocyte blanc …………………………………………………………. 26

Figure 2: Représentation schématique de l’hydrolyse des triglycérides (TG) du tissu adipeux………………………. 30

Figure 3: Relation existant entre les radicaux issus de l’oxygène (en rouge) et ceux issus de l’azote (en vert)………35

Figure 4: Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs métalliques

(d’après Matés, 1999)……………………………………………………………………………………………………39

Figure 5: Voie de synthèse des prostaglandines à partir de l’acide arachidonique (modifié d’après Chew, 2005)…..49

Figure 6: Structure de prostaglandines analysées………………………………………………………………………65

Figure 7: Structure de la 15dPJ2 et 15dPJ2 derivée……………………………………….…………………………...67

Figure 8: Dosage du glucose dans le milieu de culture des adipocytes 3T3-L1 incubées avec des concentrations

croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………………………….. 73

Figure 9: Dosage du peroxyde d'hydrogène dans le milieu de 3T3-L1 après 30 minutes en présence de

concentrations croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………….74

Figure 10: Chromatogramme du 4-HNE par GC-MS après dérivation au PFB-TMS. Deux pics apparaissent

correspondant aux isomères syn et anti…………………………………………………………………………………75

Figure 11: Production de 4-HNE par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations croissantes de glucose

oxydase pendant 16 heures d’incubation à j17 après le début de la différentiation……………………………………76

Figure 12: Sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 exposés pendant 16 heures à des concentrations

croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………………………….. 77

Figure 13: Sécrétion d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 en culture. L’adiponectine a été mesurée par western

blotting…………………………………………………………………………………...………………………………. 78

Figure 14: Quantification du nombre de cellules en présence de concentrations croissantes de glucose oxydase…...79

Figure 15: Effets de la glucose oxydase et de la glucose oxydase plus catalase sur la sécrétion d’adiponectine par les

adipocytes 3T3-L1………………………………………………………………………………………………………...80

Figure 16: Effet de la glucose oxydase et de la glucose oxydase dénaturée sur la production d’adiponectine par les

cellules 3T3-L1, à j17 après la différenciation…………………………………………………………………………..81

Figure 17: Production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 exposés à des concentrations croissantes de 4-HNE

pendant 16 heures………………………………………………………………………………………………………...82

Figure 18: Corrélation entre la production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 soumis à des concentrations

croissantes de glucose oxydase et la concentration intracellulaire en 4-HNE…………………………………………83

Figure 19: Inhibition de l’expression des ARNm codant l’adiponectine dans les adipocytes 3T3-L1 exposés à des

concentrations croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………....84

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Figure 20: Concentrations en prostaglandine E2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation) exposées à

deux concentrations de glucose oxydase………………………………………………………………………………...85

Figure 21: Concentrations en prostaglandine D2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation) exposées à

deux concentrations de glucose oxydase………………………………………………………………………………...86

Figure 22: Concentrations en prostaglandine F2 alpha dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation)

exposées à deux concentrations de glucose oxydase…………………………………………………………………….87

Figure 23: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation)

exposées à deux concentrations de glucose oxydase…………………………………………………………………….88

Figure 24: Production basale de lactate par les adipocytes 3T3-L1, effet d’un stress oxydant (100mU/mL) sur la

production de lactate et d’une supplémentation en acide lipoïque (10-4M), pendant deux heures…………………….89

Figure 25: Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations croissantes de 4-HNE

pendant 2 heures………………………………………………………………………………………………………… 90

Figure 26: Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4

et 8 semaines……………………………………………………………………………………………………………...92

Figure 27: Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés

de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………………………...92

Figure 28: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4

et 8 semaines ……………………………………………………………………………………………………………..93

Figure 29: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés

de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………………………...93

Figure 30: Concentrations en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4

et 8 semaines……………………………………………………………………………………………………………. .94

Figure 31: Concentrations tissulaires en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et

Wistar âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………….. 94

Figure 32: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux épidydimal de rats Lou C et Wistar

âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………………….. 95

Figure 33: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et

Wistar âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………….. 95

Figure 34: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14 prostaglandine J2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et

Wistar âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………….. 96

Figure 35: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14-prostaglandine J2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou

C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines……………………………………………………………………………………... 96

Figure 36: Concentrations urinaires en 15dPGJ2 de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines…………………..97

Figure 37: Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma après prè-incubation avec différentes concentrations de

15dPGJ2 el lavage. ………………………………………………………………………………………………………..99

Figure 38: Cinétique de dissociation de deux ligands de PPARgamma : pioglitazone et 15dPGJ2………………… 100

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Figure 39: Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des produits de digestion à la trypsine d’un fragment du

domaine de liaison (Ligand Binding Domain) de PPARgamma couplé à la GST…………………………………...101

Figure 40: Chromatogramme obtenu par GC-MS-MS du standard interne de la 15dPGJ2 dérivé sous forme de PFB-

TMS …………………………………………………………………………………………….………………………103

Figure 41: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction des adipocytes et sa

dérivation sous forme de PFB-TMS….…………………………………………………………….………………….104

Figure 42: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction des l’urine humaine et sa

dérivation sous forme de PFB-TMS..…………………………………………….……………………………………105

Tableau 1: Prostaglandine 15 désoxy-delta12,14-J2 libre dosée par GC-MS …………..………………………….……98

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AVANT-PROPOS

Publications scientifiques :

- Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Delphine Cozzone, Natalie Bernoud-Hubac, N Bouzaïd-

Tiali, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effects of oxidative stress on adiponectin secretion and lactate

production in 3T3-L1 adipocytes.

Free Radic Biol Med., 2005 Apr 1;38(7):882-9.

- Anísio F. Soares, Olivier Nosjean, Delphine Cozzone, D. D’Orazio, Michel Becchi, Michel

Guichardant, G. Ferry, J.A. Boutin, Michel Lagarde, Alain Géloën. Covalent binding of 15-deoxy-

delta 12,14-prostaglandin J2 to PPARγ .

Biochem Biophys Res Commun., 2005 Nov (337): 521-525.

- Marie-Caroline Michalski, Anísio F. Soares, Christelle Lopez, Nadine Leconte, Valérie Briard,

Alain Géloën. The supramolecular structure of milk fat affects plasma triacylglycerol and fatty acid

profile in the rat.

European Journal of Nutrition., 2006 (In press).

- Christophe Soulage, Anísio F. Soares, Catherine Girotti, G. Paire, F.E. Demarne, Michel Lagarde,

Alain Géloën. Antioxidant effect of cirsimarin, a flavonoid extacted from Microtea debilis

(Phytolaccaceae)

Planta medica., (soumis à publication).

- Bader Zarrouki, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. COX

expressions and activities in 3T3-L1 adipocytes in response to oxidative stress. (en préparation).

Communication orale:

- Anísio F. Soares. Adipocytes et obésité. Les ingrédients minceur: dernières avancées scientifiques

dans le domaine de la perte de poids. Société Française des Antioxydants, Paris, France, 1-2 juin,

2005.

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Communications affichées:

- Bader Zarrouki, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effet du

stress oxydant sur l’expression des cyclooxygénases dans les adipocytes 3T3-L1. 2émé Congrès

annuel de la nouvelle Société Française d’Athérosclérose. Biarritz, France, 9-11 juin, 2005.

- Bader Zarrouki, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effets du

stress oxydatif sur l’expression d’adiponectine et des cyclooxygénases dans les adipocytes 3T3-L1.

9émé Journée Scientifique du EDISS, Villeurbanne, 7 avril, 2005.

- Anísio F. Soares, Bader Zarrouki, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effets du

stress oxydatif sur l’expression d’adiponectine et des cyclooxygénases dans les adipocytes 3T3-L1.

5ème Journée Scientifique du IMB, Villeurbanne, France, 13 septembre, 2004.

- Anísio F. Soares, Delphine Cozzone, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.

Oxidative stress decreases adiponectin production by 3T3-L1. 6ème Journée Scientifique du IMBL,

Villeurbanne, France, 25 novembre, 2003.

- Delphine Cozzone, Anísio F. Soares, Nathalie Bernoud-Hubac, Michel Guichardant, Michel

Lagarde, Alain Géloën. Production of 15-deoxy-∆12,14-prostaglandin J2 a PPARγ natural ligand, by

3T3-L1 adipocytes. 44th International Conference on the Bioscience of Lipids – ICBL, Oxford,

United Kingdom, 7-11 septembre, 2003.

- Delphine Cozzone, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.

Production de 15-désoxy-∆12,14-prostaglandine J2, un ligand endogène de PPARγ, au cours de la

diffèrenciation adipocytaire des cellules 3T3-L1. Congrès du GERLI, Paris, France, 2-5 septembre,

2003.

- Anísio F. Soares, Delphine Cozzone, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.

Oxidative stress decreases adiponectin production by 3T3-L1 Federation of European Biochemical

Societes 2003 – FEBS, Brussels, Belgique, 3-8 juillet, 2003.

- Anísio F. Soares, Delphine Cozzone, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.

Oxidative stress decreases adiponectin production by 3T3-L1. 7ème journée de l’ Ecole Doctorale

Interdisciplinaire Sciences et Santé - EDISS, Villeurbanne, France, 16 avril, 2003.

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ABRÉVIATIONS

AA : Acide arachidonique ou 20:4n-6 ACS : Acyl-CoA synthétase AGPIs : Acides gras polyinsaturés AG : Acide gras ARNm : Acide ribonucléique messager ATGL : Adipose triglycéride lipase ATP : Adénosine triphosphate BF3 : Trifluorure de bore BSA : Albumine sérique bovine BSTFA : N,O-Bis-(triméthylsilyl)-trifluoroacétamide CCM : Chromatographie sur couche mince COX : Cyclooxygénase DAG : Diacylglycérol DGAT: Diacylglycérol transférase DHA : Acide docosahexaénoïque ou 22:6n-3 DMSO : Diméthylsulfoxyde ECL : Enhanced chemiluminescence EDTA : Acide éthylènediamine tétra acétique FABP : “Fatty acid binding protein” FAT : “Fatty acid translocase” (ou FAT/CD36) FATP : Protéine de transport des acides gras EGTA : acide éthylèneglycol tétra acétique GC : Chromatographie en phase gazeuse GC-MS : Chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse G6PDH : Glucose 6 phosphate déshydrogénase GPx : Glutathion peroxydase GSH : Glutathion GR : Glutathion réductase HIF: “Hypoxia induced factor” HO : Radical hydroxyle H2O2 : Peroxyde d'hydrogène 15-HETE : 15-hydroxyéicosatétraénoïque 13-HODE : 13-hydroxyoctadécadiénoïque 15-HpETE : 15-hydroperoxyeicotétraénoique 13-HpODE : 13-hydroperoxyoctadécadiénoïque 4-HNE : 4-hydroxynonénal LCFA : Acides gras à longues chaînes LHS : Lipase hormono-sensible LPL : Lipoprotéines lipase NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate (Forma réduite) MAO : Monoamine oxydase NICI : Ionisation chimique négative NO : Monoxyde d’azote ONOOH : Nitroperoxyde PAGE : Electrophorèse en gel de polyacrylamide PG : Prostaglandine

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PGH synthase: Prostaglandine H synthase PIPES : Acide pepérazine-N-N’-bis [2-éthanesulfonique] PIP2 : Phosphatidylinositol 4,5-diphosphate PIP3 :Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate PKC : Protéine kinase C PLA2 : Phospholipase A2 PLD : phospholipase D PPAR : Peroxisome proliferator-activated receptor ROO : Radicaux peroxyles ROS : Espèces réactives dérivés de l’oxygène (ou ‘reactive oxygen species’) SSAO: Semicarbazide-sensitive amine oxidase SDS : dodécylsulfate de sodium SI : Standard interne SOD : Superoxyde dismutase TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine 1,2-bis(dimethylamino)ethane TG : Triglycérides TRX : Thiorédoxine TNF : “Tumor Necrosis Factor” Ucp-1 : Protéine découplante-1 VEGF : “Vascular endothelial cell growth factor” VLCFA : Acides gras à très longue chaîne

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RESUME

Le stress oxydant est impliqué dans de nombreuses pathologies: athérosclérose, diabète de

type 2, maladies neurodégénératives ainsi que dans le vieillissement. Il favorise le développement

de la résistance à l’insuline dans les tissus impliqués dans le métabolisme énergétique. Les

prostaglandines sont issues de l’action des cyclooxygénases (COX) sur l’acide arachidonique libéré

à partir des membranes cellulaires par la phospholipase A2. Elles jouent un rôle important dans la

différenciation adipocytaire, par l’intermédiaire de la 15dPGJ2, le ligand endogène le plus efficace

de PPARgamma, un récepteur nucléaire dont l’activation induit la différenciation en cellule

adipeuse. Notre objectif était de mesurer l’effet du stress oxydant sur la différenciation et le

fonctionnement adipocytaire. Nous avons mesuré la sécrétion d’adiponectine, l’expression de ses

ARNm, le 4 hydroxynonénal (4-HNE) dans les adipocytes 3T3-L1 en réponse à un stress oxydant

produit par la glucose oxydase. Une part importante de notre travail a été consacrée à la

quantification de la 15dPGJ2, à la mise en évidence de son rôle dans la différenciation des cellules

3T3-L1 et dans le tissu adipeux de rats. Nous avons également dosé les prostaglandines: PGD2,

PGE2, 6-céto-PGF1α, et PGF2α au cours du développement des tissus adipeux épididymal et

rétropéritonéal. Parmi les résultats les plus importants, nous avons démontré que le stress oxydant

induit par la glucose oxydase, objectivé par la libération de 4-HNE, diminue la production

d’adiponectine, une adipokine insulino-sensibilisante produite principalement par les adipocytes.

Nous avons également mis en évidence l’existence d’une liaison covalente entre la prostaglandine

15dPGJ2 et PPARgamma. Cette observation a de nombreuses implications sur, non seulement le

rôle de cette prostaglandine, mais également sur les moyens à mettre en oeuvre pour étudier son

rôle. En conclusion, nos travaux soulignent l’importance du stress oxydant dans le développement

du diabète de type 2, en diminuant la production d’adiponectine. La mise en évidence d’une liaison

covalente entre la 15dPGJ2 et PPARgamma atteste de l’importance de cette prostaglandine. Cette

observation amènera à reconsidérer le rôle physiologique de cette prostaglandine, rôle jusqu’à

présent sous-estimé sous prétexte que les concentrations en 15dPGJ2 libre mesurées sont très

faibles.

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SUMMARY

Oxidative stress has been suspected to play a major role in numerous pathophysiological

states, such as : atherosclerosis, type 2 diabetes, neurodegenerative deseases as well as ageing. It is

involved in the development of insulin resistance in peripheral tissues involved in energy

metabolism. Prostaglandins are produced by cyclooxygenases (COX) from arachidonic acid

released from cell membrane by phospholipase A2. Prostaglandins are key players in adipose cell

differentiation through 15dPGJ2, the most efficient endogenous ligand to PPARgamma, a nuclear

receptor which is able to induce adipose cell differentiation. Our main goal was to measure the

effects of oxidative stress on adipose cell differentiation and functions. We measured adiponectin

production, the expression of mRNA coding adiponectin and 4 hydroxy-nonenal (4-HNE) a marker

of lipid peroxidation, in 3T3-L1 adipocytes in response to oxidative stress induced by glucose

oxidase. An important part of the present work was dedicated to the quantification of 15dPGJ2, the

demonstration of its role in 3T3-L1 adipose cell differentiation and in adipose tissue of rats. We

also measured the prostaglandins of the 2 series: PGD2, PGE2, 6 céto-PGF1α, and PGF2α during the

development of epididymal and retroperitoneal adipose tissues. Amongst the most important results,

we show that oxidative stress induced by glucose oxidase, increased 4-HNE production and

decreased adiponectin secretion, an adipokin mainly produced by adipocytes which improves

insulin sensitivity. We also showed that 15dPGJ2 covalently binds PPARgamma. That observation

has numerous implications, not only concerning the role of that prostaglandin but also on the

methods required to fully elucidate its functions. In conclusion, our results underline the importance

of oxidative stress in the development of type 2 diabetes through the decreased production of

adiponectin by adipose cells. The demonstration of a covalent binding between 15dPGJ2 and

PPARgamma points out the important physiological role of that prostaglandin. That observation

may result in the reconsideration of its physiological role, which has been under estimated since its

tissular free concentrations were found to low to be efficient.

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I INTRODUCTION

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L’oxygène n’était pas présent dans l’atmosphère originelle de la terre. La production

d’oxygène libre a commencé il y a environ 3,5 milliards d’années avec l’arrivée des premières

bactéries capables de faire de la photosynthèse, les cyanobactéries. La production d’O2 a permis la

formation de la couche d’ozone (O3) bloquant les rayons ultraviolets (U.V.). Cette couche d'ozone a

alors servi d'écran protecteur en interceptant les U.V. nocifs et permis le développement de formes

pluricellulaires aérobies même en dehors des océans.

L’histoire a retenu le nom de Joseph Priestley comme découvreur de l’oxygène, mais il avait

été découvert quelques temps auparavant par le pharmacien Carl Wilhelm Scheele en 1772. Antoine

Laurent Lavoisier l'a nommé en 1774. Le mot oxygène est formé du grec oxys (acide) et gennan

(engendrer) et provient du fait qu’en brûlant du soufre au feu de l'oxygène on obtient de l'acide

sulfurique et qu'en brûlant du phosphore on obtient de l'acide phosphorique. À cause de son

électronégativité, l'oxygène établit facilement des liaisons chimiques avec de nombreux autres

éléments (ce qui est à l'origine de la définition initiale du terme oxydation).

Indispensable à la vie aérobie, l’oxygène est utilisé par les mitochondries pour produire de

l’énergie. Les conséquences de l’activité mitochondriale sont doubles et paradoxales. D'une part, les

mitochondries fournissent à la cellule, grâce à l’oxygène, une source d'énergie importante sous

forme d'adénosine triphosphate (ATP) à haut potentiel énergétique. D’autre part, une faible fraction

de l’oxygène (environ 0,4 à 4%) n’est pas correctement convertie en eau suite à des imperfections

de la chaîne respiratoire mitochondriale. L'oxygène donne alors naissance à des espèces oxygénées

activées parmi lesquelles figurent des radicaux libres comme l'anion superoxyde ou le radical

hydroxyle. Un radical libre est un atome ou une molécule dont la structure chimique est caractérisée

par la présence d'un électron libre rendant cette espèce chimique beaucoup plus réactive que l'atome

ou la molécule dont il (elle) est issu(e). D'autres entités non radicalaires de l'oxygène peuvent être

produites comme le peroxyde d'hydrogène ou l'oxygène singulet. Les radicaux libres réagissent

avec de nombreux composés des cellules : protéines, lipides, ADN. Le stress oxydant ainsi généré

a été au cours des dernières années de plus en plus impliqué dans des pathologies diverses telles que

les cancers, l’hypertension, le diabète de type 2, l’obésité… La fréquence de l’obésité, qui

correspond à un excès de tissu adipeux, augmente considérablement dans les pays aux modes de vie

occidentalisé. L’objectif de notre travail de recherche était de mettre en évidence les effets du stress

oxydant sur le fonctionnement des cellules adipeuses dont le rôle est de stocker l’énergie

métabolique excédentaire sous forme de triglycérides. Notre hypothèse expérimentale, issue des

données de la littérature, était que le stress oxydant pourrait jouer un rôle dans les complications

métaboliques associées à l’obésité.

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II RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

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II.1 Le tissu adipeux

Chez les Mammifères les adipocytes sont organisés en multi dépôts appelés tissus adipeux. Ce

tissu est spécialisé dans la mise en réserve d’énergie. C’est un réservoir d’énergie régulé par des

nerfs, des hormones, des nutriments, organisés en mécanismes autocrines et paracrines. Le tissu

adipeux représente la principale réserve énergétique des organismes. Il joue un rôle essentiel dans le

maintien de la vie en permettant aux organismes de se protéger des variations journalières en

apports alimentaires. Lorsque les apports énergétiques sont supérieurs aux dépenses de l’organisme,

l’excès calorique est mis en réserve sous forme de triglycérides stockés dans les différents dépôts

adipeux. A l’inverse, lorsque les apports caloriques sont insuffisants, les acides gras du tissu

adipeux sont mobilisés et mis en circulation dans l’organisme où ils sont oxydés dans les tissus

consommateurs d’énergie.

Il existe deux types de tissus adipeux bien distincts, le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux

brun. Le premier constitue la plus grande réserve d’énergie de l’organisme, son rôle essentiel est

d’assurer le maintien de l’équilibre énergétique, le second est présent chez presque tous les

endothermes nouveau-nés, son rôle majeur est de produire de l’énergie sous forme de chaleur à

partir des triglycérides mis en réserve ou des acides gras provenant du tissu adipeux blanc.

II.1.1 Le tissu adipeux blanc

Ces cellules sont caractérisées par une grande et unique vacuole contenant les lipides (aspect

uniloculaire). Les quantités relatives et la distribution des tissus adipeux blanc dépendent des états

de contrainte, d'âge, de sexe, d’environnement et d’alimentation (Cinti, 2001). Ce tissu possède des

fonctions biochimiques spécialisées, comme la synthèse et le stockage des triglycérides (lipogenèse)

et la production d’acides gras (lipolyse).

Fonctionnellement le rôle principal du tissu adipeux blanc est le stockage et la mobilisation de

l'énergie mise en réserve. Les localisations du tissu adipeux blanc changent selon le sexe. Les

hommes accumulent la majeure partie des graisses dans la région abdominale (au-dessus des

vertèbres lombaires L4-L5). Chez les femmes, le tissu adipeux est surtout localisé dans la partie

inférieure de l’organisme (en dessous des vertèbres L4-L5: hanches, bassin, cuisses). Ces

différences ont probablement eu une signification fonctionnelle pendant l’évolution. En plus d’une

localisation différente, il faut noter que les femmes ont environ 50% plus de tissu adipeux que les

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hommes. Chez les femmes, le tissu adipeux fournit l’énergie nécessaire au développement du fœtus,

principalement pendant la dernière partie de la gestation. L'homme pré-historique, étant chasseur-

cueilleur, était soumis à des périodes aléatoires plus ou moins longues de disettes. Egalement

soumis à la prédation, il devait développer des mécanismes d’apports énergétiques rapides

indispensables à son système locomoteur lui permettant d’échapper aux prédateurs. En son temps,

cette capacité de mise en réserve de l’énergie a sans aucun doute constitué un avantage adaptatif,

cible d’une sélection génique. De nos jours, le tissu adipeux d'une personne normale contient assez

d’énergie pour jeûner plus de deux mois (Björntorp, 2000).

II.1.2 Le tissu adipeux brun

Ce tissu est présent chez tous les Mammifères, y compris l’espèce humaine. Il joue un rôle

important à la naissance, qui représente un choc thermique, en assurant une production de chaleur

importante, permettant ainsi l’homéothermie. Le tissu adipeux brun joue un rôle déterminant chez

les espèces hibernantes, chez lesquelles la température corporelle diminue au cours de l’hibernation.

Il assure le réchauffement de l’organisme au cours des épisodes de réveil, correspondant à un

changement de température corporelle de 4°C à 37°C. De plus, les Mammifères de petites tailles

sont contraints d’avoir un métabolisme énergétique important car les déperditions caloriques

dépendent du rapport surface volume qui est très défavorable aux espèces de petites tailles (petit

volume, grande surface), car les pertes caloriques dépendent de la surface de l’organisme. Chez ces

espèces, le tissu adipeux brun joue un rôle décisif tout au long de la vie. Heldmaier (2004)

considère que jusqu’à 10 kilogrammes de masse corporelle, le tissu adipeux brun joue un rôle

important dans le maintien de l’homéothermie. A la différence du tissu adipeux blanc, le tissu

adipeux brun est fortement vascularisé et les adipocytes bruns sont directement innervés par des

fibres sympathiques. Les adipocytes bruns contiennent plusieurs gouttelettes de graisse, ce qui leur

confère un aspect multiloculaire et sont principalement caractérisés par la présence d’un très grand

nombre de mitochondries dans leur cytoplasme. Cette observation indique que ces cellules ont une

forte capacité d’oxydation des substrats (Nicholls et Locke, 1984) et donc de production de chaleur

grâce à la présence d’une protéine découplante-1 (Ucp-1) appelée de la sorte car elle assure le

découplage entre oxydations et phosphorylations.

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II.1.3 L’adipocyte

II.1.3.1 Morphologie

L'adipocyte blanc est composé pour l’essentiel d'une gouttelette de lipides. Le noyau est

refoulé en périphérie de la cellule et le cytoplasme est limité à une mince couronne autour des

lipides intracellulaires. La membrane plasmique possède de nombreux récepteurs dont les

récepteurs α et β adrénergiques. Les récepteurs α2-adrénergiques sont anti-lipolytiques tandis que

les récepteurs β-adrénergiques sont lipolytiques. Les adipocytes mettent en réserve les acides gras

libres sous forme de triglycérides qui sont stockés dans une gouttelette lipidique (lipogenèse). La

taille des adipocytes est capable de varier grandement, jusqu’à 20 fois. A l’inverse en cas de besoin

énergétique, les triglycérides sont hydrolysés, ce qui libère des acides gras libres dans la circulation

(lipolyse). Les adipocytes stockent essentiellement des triglycérides représentant plus de 90% de la

fraction lipidique. Le tissu adipeux contient aussi de 5-15% d'eau et une faible quantité de protéines

cellulaires et protéines formant la trame conjonctive (Girard et al., 1988).

Figure 1 : Représentation schématique d’un adipocyte blanc.

L'adipocyte blanc est composé d'une gouttelette de lipides. Le noyau est refoulé en périphérie de la

cellule et le cytoplasme est limité à une mince couronne autour des lipides intracellulaires.

II.1.3.2 Les triglycérides

Les triglycérides sont des formes de mise en réserve hautement concentrée d’énergie. Le

rendement de l’oxydation complète des acides gras est d’environ 9 kcal/g, par comparaison aux 4

kcal/g environ des glucides et des protéines. La raison de cette grande différence de rendement

calorique est que les acides gras sont beaucoup plus réduits. De plus, les triglycérides sont très

polaires et ainsi sont-ils mis en réserve sous une forme pratiquement anhydre, tandis que les

Noyau

Cytoplasme

Gouttelette lipidique

Membrane plasmique

Noyau

Cytoplasme

Gouttelette lipidique

Membrane plasmique

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protéines et les glucides sont beaucoup plus apolaires et donc beaucoup plus hydratés. Les

triglycérides sont constitués de trois molécules d’acides gras reliées à un glycérol par des liaisons

esters. Ils diffèrent selon la nature et la position des acides gras estérifiés que les constituent. Les

triglycérides (triacylglycérols) n’ont aucune charge et sont insolubles dans l’eau, fusionnant en

gouttelettes, qui occupent presque tout le volume cellulaire des adipocytes. Les triglycérides

représentent 95% de la fraction lipidique, à côté de composés mineurs, saponifiables ou non (Girard

et al., 1988). Ces gouttelettes se réunissent pour former un gros globule qui occupe la plus grande

partie du volume de la cellule. Les cellules adipeuses sont spécialisées dans la synthèse et la mise en

réserve des triglycérides et dans leur mobilisation sous forme d’acides gras libres qui sont

transportés vers d’autres tissus par le sang. L’événement initial dans l’utilisation des graisses

comme source d’énergie est l’hydrolyse des triglycérides par des lipases, qui produisent du glycérol

et des acides gras libres.

II.1.3.3 Les acides gras

Une molécule d’acide gras possède deux régions distinctes : une longue chaîne hydrocarbonée

hydrophobe (de 4 à 36 carbones) chimiquement peu réactive, et un groupement acide carboxylique

ionisé en solution, extrêmement hydrophile formant facilement des esters et des amides. En fait, la

quasi-totalité des molécules d’acides gras d’une cellule sont liées de manière covalente à d’autres

molécules par leur groupement carboxyle. Les nombreux acides gras différents trouvés dans les

cellules se distinguent par la longueur de leur chaîne hydrocarbonée, le nombre et la position de

leurs doubles liaisons. Dans certains acides gras, cette chaîne est totalement saturée et non ramifiée,

dans d’autres elle contient une ou plusieurs doubles liaisons. Une nomenclature simplifiée de ces

composés indique la longueur de chaîne et le nombre de doubles liaisons séparées par deux points,

par exemple l’acide palmitique; saturé à 16 carbones, est abrégé par 16:0, et l’acide oléique à 18

carbones, avec une double liaison par 18:1.

Les acides gras, dont la dégradation peut produire, pour le même poids, plus du double

d’énergie sous forme d’ATP que le glucose, constituent une source alimentaire précieuse. Ils sont

stockés dans le cytoplasme de nombreuses cellules sous la forme de gouttelettes de triglycérides,

formées de trois chaînes d’acides gras chacune liée à une molécule de glycérol. En cas de besoin,

les acides gras sont libérés des triglycérides et dégradés en unités à deux carbones. Ces unités à

deux carbones, représentant le groupement acétyle d’une molécule appelée acétyl CoA, subissent

des dégradations ultérieures au cours des diverses réactions produisant de l’énergie.

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II.1.3.4 Lipogenèse - Synthèse des triglycérides

Dans les cellules adipeuses, la synthèse de novo d’acides gras est très faible (Sjöström, 1972).

La source principale des acides gras est issue de l’activité des lipoprotéines lipases (LPL) qui

hydrolysent les lipoprotéines plasmatiques riches en triglycérides pour produire des acides gras et

du monoacylglycérol. Les LPL sont synthétisées dans l’adipocyte, sécrétées et transportées sur la

paroi interne des capillaires où se produit l’hydrolyse des triglycérides. Les mécanismes impliqués

dans le transport transmembranaire des acides gras à longues chaînes (LCFA) sont encore

controversés (Hamilton, 1998). Il est suggéré que les LCFA sont capturés passivement par les

cellules en fonction de l’intensité de leur métabolisme, par un mécanisme de flip-flop dans la

bicouche de phospholipides membranaires, correspondant à un mécanisme de diffusion passive

(Trigatti et Gerber, 1996; Civelek et al., 1996). Par ailleurs, certains travaux suggèrent l’existence de

protéines spécifiques dont le rôle est de faciliter le mouvement des LCFA à travers la membrane

plasmique (Stremmel, 1988). En effet, un traitement des cellules avec des protéases diminue

fortement la capture des acides gras. De plus, le transport des acides gras présente les

caractéristiques cinétiques d’un transport facilité (Abumrad et al., 1984). Trois protéines distinctes

ont été identifiées et caractérisées dans le transport des LCFA: une acide gras translocase (FAT =

fatty acid translocase, aussi appelée FAT/CD36), une protéine membranaire de transport des acides

gras (FABP-pm) et une protéine de transport des acides gras (FATP) (Stremmel et al., 1985;

Abumrad et al., 1993; Schaffer et Lodish, 1994). La protéine FAT/CD36 a été observée sur la

membrane mitochondriale, ce qui suggère un nouveau rôle pour cette protéine (Campbell et al.,

2004). Concernant les FATP, il serait plus juste de parler de famille de protéines. En effet, jusqu’à

présent 6 protéines ont été identifiées et nommées FATP1-6. Les FATP1, 2 et 6 possèdent une

région de fixation de l’AMP très conservée qui participe à l’activation des acides gras à très longues

chaînes (VLCFA) en dérivés acyl-CoA (Pohl et al., 2004). Les mécanismes par lesquels les FATP

transportent les LCFA ne sont pas encore bien compris mais certains travaux suggèrent que le

transport transmembranaire est étroitement associé à l’activité acyl-CoA synthétase. Les protéines

de transports membranaires d’acides gras sont différentes des protéines de transport des acides gras

(FABP = fatty acid binding proteins). Les FABPs appartiennent à une famille de protéines

cytosoliques de petites tailles (14-16kDa) capables de fixer avec une forte affinité de nombreux

ligands hydrophobes comme des acides gras, des éicosanoïdes, des rétinoïdes. Les FABPs

possèdent des sites de fixations spécifiques des acides gras, ce qui n’a pas été mis en évidence pour

les transporteurs membranaires.

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Le transport des acides gras à travers la membrane plasmique est un processus bidirectionnel.

En activant les LCFA en acyl-CoA esters, l’acyl-CoA synthétase (ACS) joue un rôle important dans

le métabolisme des acides gras car elle empêche l’efflux de ces derniers. L’ACS est présente dans

différents organites cellulaires: les microsomes, les peroxisomes, les mitochondries. Les acyl-CoA

esters sont associés au glycérol sous la forme de glycérol-3-phosphate. Ce dernier est formé à

partir du dihydroxyacétone issu de la glycolyse. Les adipocytes ont besoin de glucose pour former

des triglycérides. L’absence de glycérokinase dans les adipocytes blancs empêche l’utilisation et le

recyclage du glycérol. Les acyl-CoA forment des lysophosphatidates en se combinant avec le

glycérol-3-phosphate, puis des phosphatidates qui en perdant le phosphate deviennent des

diacylglycérides. La dernière étape de formation des triacylglycérols à partir des diacylglycérols est

contrôlée par l’acyl-CoA: diacylglycérol transférase (DGAT), un enzyme membranaire présent dans

les microsomes (Cases et al., 1998). Deux enzymes DGAT1 et DGAT2 sont présentes, codées par

des gènes appartenant à des familles différentes. Les deux gènes sont exprimés de façon ubiquiste et

les enzymes ont les mêmes spécificités de substrats (Cases et al., 2001). Les souris DGAT1-/- ont

une croissance normale et sont résistantes à l’obésité induite par le régime. Ces souris ont une

sensibilité à l’insuline et à la leptine augmentée et une diminution du contenu en triglycérides ce qui

suggère que DGAT1 joue un rôle important dans l’homéostasie énergétique (Chen et al., 2004).

Les souris DGAT2-/- présentent une forte réduction en triglycérides et en acides gras libres dans

l’organisme, suggérant un rôle critique de cet enzyme dans la lipogenèse, cependant les rôles

physiologiques de DGAT2 chez l’adulte n’ont pas été élucidés car les souris transgéniques

n’exprimant pas ce gène meurent rapidement après la naissance (Stone et al., 2004).

II.1.3.5 La lipolyse

Les triglycérides du tissu adipeux blanc sont hydrolysés lorsque les besoins énergétiques de

l’organisme ne sont pas satisfaits par l’alimentation. Le catabolisme des triglycérides (lipolyse)

aboutit à la libération des 3 acides gras et d’un glycérol. Jusqu’à très récemment, le paradigme de

cette régulation donnait à la lipase hormono-sensible (LHS) un rôle clé dans l’hydrolyse des

triglycérides. L’activation de la lipolyse est mise en jeu par les hormone ou médiateurs activants le

système adénylate cyclase (adrénaline, noradrénaline, glucagon) entraînant l’augmentation de la

concentration intracellulaire en AMPcyclique qui phosphoryle une protéine kinase A qui à son tour

active en phosphorylant la LHS et les périlipines, protéines entourant la gouttelette de lipides. La

présence d’une lipase autre que la LHS a été démontrée par trois équipes indépendantes travaillant

sur des souris dont le gène codant pour la LHS a été inhibé (Jenkins et al., 2004; Villena et al.,

2004; Zimmermann et al., 2004). Ainsi, adipose triglycéride lipase, desnutrin et iPLA2ζ doivent

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être considérés comme synonymes. L’inhibition de l’expression de la LHS chez la souris se traduit

par une accumulation de diacylglycérols au lieu de triacylglycérols. Ceci suggère que, bien que la

LHS soit capable d’hydrolyser les triglycérides, son substrat essentiel sont les diacylglycérols. Ces

données sont corroborées par le fait que l’affinité de la LHS est dix fois supérieure pour les

diacylglycérols que pour les triacylglycérols (Fredrikson et al., 1981).

L’inhibition simultanée de l’adipose triglycéride lipase (ATGL) et de la LHS se traduit par

une inhibition de plus de 90% de l’hydrolyse des triglycérides dans le tissu adipeux (Zimmermann

et al., 2004). L’activité transacylase de ATGL suggère un rôle dans la resynthèse des

triacylglycérides. Si ceci est confirmé elle pourrait jouer un rôle décisif dans le recyclage des acides

gras et des triglycérides. Selon les derniers travaux, l’hydrolyse des triglycérides est d’abord et

majoritairement dépendante de l’ATGL et accessoirement sous la dépendance de la LHS,

l’hydrolyse des diacylglycérol est assurée par la LHS puis une monoacylglycéride lipase produit le

dernier acide gras et un glycérol. Il est admis que la monoacylglycéride lipase représente l’étape

limitante de la libération de glycérol et d’acide gras libre.

Figure 2 : Représentation schématique de l’hydrolyse des triglycérides (TG) du tissu adipeux.

La triglycéride lipase du tissu adipeux (adipose triglycéride lipase, ATGL) hydrolyse les

triglycérides. Les diglycérides sont hydrolysés par la lipase hormono-sensible (LHS). La dernière

étape de la lipolyse est assurée par une monoglycéride lipase qui libère le dernier acide gras et le

glycérol. (Modifié d’après Zechner et al., 2005).

Les mécanismes de régulation de l’expression et de l’activation de l’ATGL sont pour

l’essentiel à découvrir. La LHS est activée par une phosphorylation catalysée par une protéine

kinase AMPc dépendante. Le gène de la LHS est situé sur le chromosome 19 sur lequel sont

également localisés les gènes de la régulation du métabolisme lipidique (apos C1, C2, E et récepteur

des LDL) et de l'insuline. Un consensus règne pour reconnaître que l’intensité de la lipolyse est

directement dépendante de la concentration intracellulaire en AMPcyclique (Honnor et al., 1985;

Londos et al., 1985). Cette concentration est elle-même dépendante de l’activité du système

Lipolyse : TG

AG AGAG

ATGLLHS

DAG MGLHS MGL

Glycérol Lipolyse : TG

AG AGAG

ATGLLHS

DAG MGLHS MGL

Glycérol

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adénylate cyclase qui intègre les nombreuses influences stimulatrices (récepteurs béta

adrénergiques) et inhibitrices (récepteurs alpha 2 adrénergiques, adénosine, prostaglandines E1, E2)

auxquelles les adipocytes sont soumis. Cet aspect de la régulation ne faisant pas partie de nos

travaux ne sera pas développé ici, pour revue consulter (Lafontan, 2005; Lafontan et Berlan, 1995).

Il est également important de souligner le rôle déterminant de l’insuline qui exerce son effet anti-

lipolytique en activant la phosphodiestérase responsable de la dégradation de l’AMPcyclique et en

inhibant une PKA responsable de la phosphorylation des périlipines (Eriksson et al., 1995; Carey,

1988).

II.1.4 L’adipocyte, cellule sécrétrice

Le rôle du tissu adipeux blanc a, depuis les origines de la biologie, été considéré

essentiellement du point de vue de la mise en réserve et de la mobilisation des acides gras. De ces

travaux est émergé l’idée que ce tissu était métabolique peu actif à l’exception du métabolisme des

graisses. Plus récemment il est apparu que les interrelations entre les tissus se faisaient

principalement à travers les échanges d’acides gras qui pouvaient induire dans les autres tissus des

dysfonctionnements par accumulation d’acides gras ou de triglycérides. Actuellement, il est évident

que le tissu adipeux interagit avec les autres organes et tissus par l’intermédiaire de molécules

sécrétées, désignées sous l’appellation générale d’adipokines. Ces molécules ont des effets sur les

métabolismes glucidiques et lipidiques, sur l’homéostasie énergétique et la sensibilité à l’insuline.

Selon les auteurs une distinction est faite entre adipokines produites principalement par les

adipocytes et les adipocytokines regroupant les cytokines produites par les adipocytes.

II.1.4.1 Les adipokines

II.1.4.1.1 Leptine

La leptine est une protéine de 16kDa. Le gène codant la leptine a été identifié comme la cause

de l’obésité chez la souris ob/ob (Zhang et al., 1994). L’administration centrale de leptine diminue

la prise alimentaire et augmente la dépense énergétique, ce qui se traduit par une diminution des

triglycérides et des acides gras plasmatiques chez le rat (Dobbins et al., 2003). La leptine stimule la

lipolyse d’adipocytes de souris, cet effet n’est pas observé sur des adipocyte de souris dépourvues

de récepteurs à la leptine (Fruhbeck et al., 1997). Une surexpression de la leptine diminue

l’expression de l’acétyl CoA carboxylase (Bai et al., 1996), montrant de la sorte un effet

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périphérique de la leptine résultant en une diminution de la masse grasse. La leptine augmente

l’oxydation des acides gras et inhibe la lipogenèse dans les tissus autres que le tissu adipeux. Elle

agit par l’intermédiaire de son récepteur qui est couplé au système Jak/Stat ou directement sur la

stimulation de la 5’-AMP activated protein kinase (AMPK) qui phosphoryle et inhibe l’acétyl CoA

carboxylase (Minokoshi et al., 2002) La leptine inhibe également l’expression du sterol response

element binding protein-1c (SREB-1c) dans le foie, le pancréas et le tissu adipeux, inhibant de la

sorte la lipogenèse dans ces tissus (Kakuma et al., 2000).

II.1.4.1.2 Adiponectine

L’adiponectine (ACRP30, adipoQ, apM1 ou GBP28) a été identifiée comme le produit d’un

gène dont l’expression est induite au cours de la différenciation adipocytaire (Arita et al., 1999).

C’est une protéine de 30kDa synthétisée principalement et sécrétée par le tissu adipeux. Un

domaine collagénase est présent sur son extrémité N-terminale, suivie par un domaine C-terminal

globulaire capable de s’organiser en homotrimérisation (Pajvani et al., 2003). L’adiponectine

circule dans le plasma sous forme de trimère, d’hexamère (également appelé forme de faible masse

moléculaire, LMW) ou sous forme multimèrique de 12 ou 18 sous-unités (appelée forme de forte

masse moléculaire HMW). La forme de forte masse moléculaire peut être clivée pour produire des

formes de faibles masses moléculaires qui peuvent elles-mêmes donner des éléments plus légers

capables d’induire les effets de l’adiponectine aux cellules, en particulier aux hépatocytes (Pajvani

et al., 2003). Par ailleurs, la partie globulaire de l’adiponectine peut augmenter l’oxydation des

acides gras dans le muscle de souris, probablement par une activation de AMPK (Fruebis et al.,

2001; Yamauchi et al., 2003).

Trois récepteurs différents pour l’adiponectine ont été clonés, un principalement dans le foie,

un autre dans les muscles squelettiques et un dans les cellules endothéliales et les muscles lisses

(Yamauchi et al., 2003; Hug et al., 2004). Les agonistes de PPARgamma augmentent, tandis que

TNF alpha et l’interleukine 6 inhibent l’expression du gène codant l’adiponectine (Maeda et al.

2001; Bruun et al., 2003). Des souris déficientes en adiponectine deviennent résistantes à l’insuline

en réponse à un régime hyperlipidique (Maeda et al., 2002). L’expression transgénique

d’adiponectine dans le tissu adipeux se traduit par une inhibition de la production hépatique de

glucose et une meilleure tolérance au glucose (Combs et al., 2004). L’administration d’adiponectine

à des souris lipodystrophiques ou obèses diminue les concentrations plasmatiques en acides gras et

en triglycérides (Combs et al., 2004). La concentration plasmatique en adiponectine est élevée

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comparée à celles des autres adipokines. Elle diminue chez les obèses, les patients résistants à

l’insuline, diabétiques ou dyslipidémiques (Artia et al., 1999; Kadowaki et al., 2003).

L’adiponectine est anti-athérogène et anti-inflammatoire (Glodstein et Scala 2004). Elle

augmente la vasodilatation (Tan et al., 2004) et joue un rôle dans la réorganisation tissulaire

cardiaque après ischémie (Ishikawa et al., 2004). La concentration plasmatique en adiponectine est

inversement corrélée à celle de la C-réactive protéine (Ouchi et al., 2003). Une adiponectinémie

élevée est associée à un faible risque d’infarctus du myocarde chez l’homme (Pischon and Girman

2004). Une hypoadiponectinémie est un facteur de risque d’hypertension (Iwashima et al., 2004).

Une mutation du gène codant l’adiponectine a été identifiée comme un facteur de maladie

cardiovasculaire et de syndrome métabolique (Ohashi et al., 2004). Ces effets sont sans doute en

partie dus au fait que l’adiponectine diminue la transformation des macrophages en cellules

spumeuses dans la plaque d’athérome (Ouchi et al., 2001).

II.1.4.1.3 Résistine

La résistine est une protéine de 12kDa synthétisée et sécrétée par le tissu adipeux. Elle a été

découverte chez la souris en étudiant les gènes inhibés par l’activation de PPARgamma (Steppan et

al., 2001). Elle tient son nom du fait qu’elle induit une résistance à l’insuline. L’administration de

résistine recombinante à des souris augmente la résistance à l’insuline. Elle augmente la production

hépatique de glucose pendant un clamp hyperinsulinémique-euglycémique chez le rat (Rajala et al.,

2003). Bien que les effets de la résistine soient très probants chez les modèles animaux, ses effets

sur l’obésité et la résistance à l’insuline chez l’homme sont moins évidents. Il n’y a que 64%

d’homologie entre les résistines humaine et murine (Steppan et al., 2001). Le rôle de la résistine

dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline n’est pas clairement établi chez l’homme.

II.1.4.2 Les Adipocytokines

Les réponses d’un organisme à une infection ou une blessure se caractérisent par un

changement de la répartition des substrats énergétiques comprenant des augmentations de la

glycémie, des triglycérides et des acides gras plasmatiques, accompagnées d’une résistance à

l’insuline. Il est admis que cette réponse métabolique aigue est initiée au moins en partie par des

cytokines pro inflammatoires. Par ailleurs, une inflammation chronique a été décrite au cours des

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dyslipidémies, de la résistance à l’insuline, de l’athérosclérose, de l’obésité (Weisberg et al., 2003;

Furukawa et al., 2004). Les cytokines ne sont pas seulement produites par les cellules du système

immunitaire. Les adipocytes sont capables d’en sécréter une grande variété (d’où le nom

d’adipocytokines). Parmi les plus significatives, citons le TNFalpha, l’interleukine 6. Citons

également IL 1, IL 8, IL 10.

Les activités sécrétrices des adipocytes ne se limitent pas à ces derniers, en effet, au cours de

dernières années de nombreuses molécules produites par les adipocytes ont été identifiées : alpha1-

acid glycoprotéine (AGP), plasminogen activator inhibitor-1, monocyte chemo attractant protein 1

(MCP-1), fibrinogène, adipsine (complement factor D), complement factor B and C3, 24p3 , Neu

related calin (NRL), neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) (member of lipocalin

family), macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1 alpha), nerve growth factor (NGF),

haptoglobin, zinc alpha2 glycoprotéine (ZAG).

Il n’est pas de notre propos de faire le point sur l’importance relative de ces molécules

produites par les adipocytes. Nous tenons simplement à souligner l’importance (sans doute encore

actuellement sous-estimée) du rôle sécréteur des adipocytes.

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II.2 Le stress oxydant

II.2.1 Définition

Dans les systèmes biologiques, le stress oxydant est la conséquence d'un déséquilibre entre la

production de radicaux libres et leur destruction par des systèmes de défenses anti-oxydantes. Les

radicaux libres peuvent engendrer des dommages importants sur la structure et le métabolisme

cellulaire en dégradant de nombreuses cibles: protéines, lipides et acides nucléiques. Les radicaux

libres sont une forme particulière d’espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent un

électron célibataire (ou non apparié). Le champ magnétique créé par sa rotation, ou spin, n’est donc

pas compensé par la rotation en sens inverse d’un électron apparié. Cette propriété rend les radicaux

libres aptes à réagir avec différentes molécules, notamment lors de réactions en chaîne dont

l’exemple le plus connu est celui de la peroxydation des lipides. La réactivité des radicaux de

l'oxygène ne doit pas non plus être exagérée car elle est très variable selon la nature du radical.

Ainsi parmi les radicaux formés chez les êtres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2°-), comme

le monoxyde d'azote (°NO) ne sont pas très réactifs mais constituent des radicaux précurseurs

pouvant être activés en d'autres espèces plus réactives.

Figure 3 : Relations existant entre les radicaux issus de l’oxygène (en rouge) et ceux issus de

l’azote (en vert).

Les espèces à l’état radicalaire sont désignées par un point symbolisant l’électron célibataire.

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La faible réactivité de ces deux radicaux O2°- et NO° permet d'ailleurs leur utilisation par

l'organisme comme médiateurs régulant des fonctions biologiques telles la respiration et la

vasodilatation capillaire (Angelos et al., 2005; Wolin et al., 2005; Wolin, 1996). Par contre des

radicaux comme les radicaux peroxyls (ROO°) ou surtout le radical hydroxyl (HO°) sont

extrêmement réactifs, et ce avec la plupart des molécules des tissus vivants. D'autres espèces

dérivées dites « espèces actives de l'oxygène » comme le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou le

nitropéroxyde (ONOOH) ne sont pas des radicaux mais sont elles aussi réactives et peuvent être des

précurseurs de radicaux. L'ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est souvent appelé

« espèces réactives de l'oxygène ».

Les dommages liés à un stress oxydant se traduisent par diverses altérations biochimiques

intracellulaires telles que l’oxydation de l’ADN (Wiseman et Halliwell, 1996; Marnett, 2000;

Cooke et al., 2003), des protéines (Satdtman et Oliver 1991; Refsgaard et al., 2000; Davies 2003), la

pertubation de l’homéostasie du calcium intracellulaire (Farber et al., 1990) ou encore la

peroxydation des lipides.

II.2.2 Mécanismes pro oxydants

Une production continue d’anions superoxydes se produit lorsque la chaîne respiratoire

mitochondriale fonctionne. Si cette production de radicaux superoxydes reste faible et ne concerne

que quelques pourcents de l’oxygène utilisé par la respiration, elle peut s’amplifier lorsque la

respiration devient plus intense (effort physique) ou lorsque intervient des désordres

mitochondriaux génétiques, inflammatoires ou nutritionnels. L’inflammation est par ailleurs une

source importante de radicaux oxygénés produits directement par les cellules phagocytaires activées

soumises à un phénomène appelé explosion oxydative et qui consiste en l’activation du complexe

de la NADPH oxydase capable d’utiliser de l’oxygène pour produire de grandes quantités d’anion

superoxyde dans la membrane cellulaire. D’autres cellules comme les lymphocytes B possèdent sur

leur membrane des systèmes NADPH oxydase similaires produisant des radicaux en quantité plus

faible comme médiateurs intercellulaires. De plus, les cellules inflammatoires et immunes peuvent

produire des cytokines comme le TNFα qui est capable de faire produire des radicaux par la

mitochondrie des cellules cibles.

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II.2.3 Mécanismes anti-oxydants

II.2.3.1 Les Enzymes :

II.2.3.1.1 Les superoxydes dismutases (SOD)

La SOD est un enzyme antioxydant primaire essentiel qui réagit en défense de l’organisme

contre les produits toxiques du métabolisme cellulaire. Il est capable d’éliminer l’anion superoxyde

par une réaction de dismutation. Son rôle est de transformer dans les mitochondries, les radicaux

superoxydes en peroxydes d’hydrogène, ce dernier, étant beaucoup moins réactifs (Moumen et al.,

1997). Il existe différents cofacteurs sur son site actif, qui sont classés par isoenzymes, dont la

structure d’ensemble est très bien conservée lors de l’évolution. Les isoenzymes forment un puit

hydrophobe au centre de la protéine, dans lequel se glisse l’anion superoxyde. Le mécanisme

réactionnel est catalysé par un métal situé au centre de l’enzyme dont la nature permet de distinguer

les différentes SODs : la SOD à Cuivre-Zinc (CuZn-SOD), possèdent deux sous-unités identiques

avec une structure moléculaire de 32 kDa, les atomes de Cu et Zn sont liés par un pont dans la

position His 61 (Banci et al., 1998). Les CuZn-SOD sont aussi classées selon leur rôle dans

l’organisme en (cCuZn-SOD) protégeant le cytosol, (ecCuZn-SOD) située sur la face externe de la

membrane des cellules endothéliales, l’espace interstitiel des tissus et les fluides extracellulaires, et

encore (pCuZn-SOD) pour celle présente dans le plasma sanguin (Kaynar et al., 2005). La SOD à

manganèse (Mn SOD) et au Fer (Fe SOD) sont homologues avec un hème tétramère de 96 kDa qui

contient un atome de manganèse ou de fer par sous unité, son rôle biologique est la protection de la

mitochondrie (Fridovich, 1998), et la SOD au nickel (Ni-SOD), (Barondeau et al., 2004).

II.2.3.1.2 Les catalases

Les catalases sont présentes dans un grand nombre de tissus mais sont particulièrement

abondantes dans le foie et les globules rouges. Parmi les enzymes connus c’est un des plus

efficaces. Ce sont des enzymes tétramériques, chaque unité portant une molécule d’hème et une

molécule de NADPH, avec une masse moléculaire de 240 kDa. Elles catabolisent les peroxydes

d’hydrogènes en molécules d’eau pour prévenir la formation de radicaux hydroxyles (Matés et al.,

1999).

La réaction se fait en deux étapes:

1) 2 H2O2 Catalase → 2H2O + O2

2) ROOH + AH2 Catalase → H2O + ROH + A

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II.2.3.1.3 Les peroxydases

II.2.3.1.3.1 Glutathion peroxydase à sélénium (GPx)

Ces enzymes ont en commun une structure tétramèrique, chaque tétramère possédant un

atome de sélénium dans son site actif, très fortement fixé à la chaîne peptidique, puisque incorporé

sous forme de sélénocystéine dans la séquence primaire. L’introduction du sélénium se faisant selon

un mécanisme particulier dit péri-traductionel. La GPx est inactivée par H2O2, le

terbutylhydroperoxyde, et HO- quand elle est incubée sans glutathion. L’enzyme natif n’est pas

sensible à la trypsine ni à la chymotrypsine. Cet enzyme fait 80 kDa, sa sensibilité à la protéolyse

augmente après traitement par des radicaux ou des peroxydes. Le rôle de la glutathion peroxydase à

sélénium est très important dans la plupart des tissus où elle réalise la quasi-totalité de l’élimination

de H2O2 comme dans les globules rouges ou les plaquettes.

II.2.3.1.3.2 La glutathion peroxydase cytosolique

Il s’agit d’un tétramère dont chaque sous unité porte une molécule de sélénocystéine sur son

site actif. Le fonctionnement de l’enzyme nécessite un flux de glutathion recyclé par la coopération

de plusieurs enzymes dont la glutathion réductase (GR) qui réduit le glutathion oxydé en

consommant du NADPH, lui-même régénéré grâce à la glucose 6 phosphate deshydrogénase

(G6PDH) alimentée par le shunt des pentose phosphates (Matés et al., 1999).

II.2.3.1.3.3 La glutathion peroxydase plasmatique

La glutathion peroxydase présente dans le plasma et dans le cytosol sont différentes et

proviennent des globules rouges ou des cellules endothéliales, les séquences et le poids moléculaire

sont différents, 23 kDa pour la sous unité GPx plasmatique, contre 22 kDa pour la sous unité

érythrocytaire. Le mécanisme d’action est identique, mais il y a un effet plus fort du zinc sur la GPx

plasmatique.

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II.2.3.1.3.4 La glutathion peroxydase membranaire (HPGPx)

Cette glutathion peroxydase est capable de réduire les peroxydes membranaires, seulement,

après action de la phospholipase A2. Elle agit sur les acides gras hydroperoxydés. La HPGPx réduit

directement les hydroperoxydes du cholestérol, des cholestéryl-esters, et des phospholipides

présents dans les membranes des globules rouges oxydées ou des lipoprotéines oxydées.

II.2.3.1.4 La thiorédoxine (TRX)

Cet enzyme a une structure proche de celle de la glutathion réductase. Il consomme aussi du

NADPH dans son fonctionnement. Il joue un rôle protecteur contre une grande variété de stress

oxydatifs grâce à ses propriétés de capture des radicaux libres. Des données biochimiques montrent

que les thiorédoxines réduisent des protéines clefs pour le développement, la division cellulaire ou

la réponse au stress oxydatif (Reichheld et al., 2005).

Figure 4: Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs

cofacteurs métalliques (d’après Matés, 1999).

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II.2.3.2 Les molécules antioxydantes

II.2.3.2.1 La vitamine C

La vitamine C (ou acide ascorbique) n’est pas synthétisée par l’organisme. Elle est

hydrosoluble à la concentration physiologique. La vitamine C empêche l’oxydation des LDL

produites par divers systèmes générateurs d’espèces réactives de l'oxygène (ROS) (neutrophiles

activés, cellules endothéliales activées, myéloperoxydase). Lors de son oxydation en acide

déhydroascorbique, elle passe par une forme radicalaire intermédiaire (radical ascorbyl) qui joue un

rôle essentiel dans la régénération de la vitamine E oxydée (Chen et al., 2000).

II.2.3.2.2 La vitamine E

La vitamine E est le nom commun utilisé pour toutes les molécules possédant des activités

biologiques identiques à celles de la famille des tocophérols. La forme naturelle de la vitamine E

inclut quatre tocophérols isomères α, β, γ, δ, avec une activité antioxydante variable. L’alpha-

tocophérol (α-TocH) est la forme la plus active de la classe des tocophérols. Sa structure

moléculaire comporte une extrémité hydrophile et une extrémité hydrophobe. Il est admis que les

radicaux tocophéryles sont régénérés par l'acide ascorbique et que, sans cette synergie, les

tocophérols sont inactifs (Carr et al., 2000). Lors de l’initiation de la peroxydation lipidique, suite à

une attaque radicalaire, l’α-TocH, connu comme inhibiteur de la propagation lipidique, cède son

hydrogène situé dans le noyau phénolique, réduisant ainsi le radical RO2, et constitue par ce biais le

seul antioxydant liposoluble assurant cette protection (Khalil 2002).

II.2.3.2.3 Le sélénium

Le sélénium est un constituant de la glutathion péroxydase, enzyme qui joue un rôle

intracellulaire antioxydant, voisin de celui de la vitamine E. Cet effet antioxydant est capital dans la

détoxication des radicaux libres produits par le métabolisme cellulaire. Cet effet de détoxication

serait responsable des effets anti-cancéreux et anti-vieillissement, attribués au sélénium (Wolters et

al., 2005).

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II.2.3.2.4 Le zinc

Cet oligo-élément est un des co-facteurs essentiels de la SOD. La prise de zinc conduit à long

terme à l’induction de protéines antioxydantes comme les métallothionéines. Le zinc protège

également les groupements thiols des protéines. Le zinc peut inhiber partiellement les réactions de

formation d’espèces oxygénées induites par le fer ou le cuivre (Mezzetti et al., 1998).

II.3 Le stress oxydant et les maladies métaboliques:

Des travaux récents ont mis en évidence que le stress oxydant est impliqué dans de

nombreuses pathologies, incluant l'obésité (Suzuki et al., 2003; Urakawa et al., 2003), le diabète

de type 2 (Elmerson et al., 2003), l’athérosclérose (Stentz et al., 2004). Le rôle du stress oxydant

a également été évoqué dans des processus physiologiques tel que le vieillissement

(Holzenberger et al., 2003). Notre objectif est de mesurer les effets du stress oxydant sur le

fonctionnement adipocytaire et les répercussions de ce stress sur l'homéostasie énergétique et les

complications métaboliques associées à l'obésité.

II.3.1 Le stress oxydant et l’obésité.

Le stress oxydant systémique augmente avec le degré d'obésité. En effet, les augmentations

des TBARs et de la 8-epi-prostaglandine F2alpha dans le plasma sont corrélées avec l'indice de

masse corporelle et le tour de hanche (Keany et al., 2003; Olusi, 2002). De même, la

concentration plasmatique en adiponectine, une protéine produite par les adipocytes et possédant

des propriétés anti-inflammatoire et protectrice des vaisseaux, est inversement corrélée aux

indicateurs du stress oxydant (Furukawa et al., 2004).

La production de H2O2 est augmentée seulement dans le tissu adipeux blanc de souris

KKAy obèses et pas dans les autres tissus (foie, muscle, aorte) suggérant que le tissu adipeux est

le site principal de production de ROS (Furukawa et al., 2004). L'utilisation d'inhibiteurs

spécifiques de la NADPH oxydase diminue la production de ROS dans le tissu adipeux de souris

KKAy et améliore l'hyperinsulinémie, l'hyperglycémie, l'hypertriglycéridémie et la stéatose

hépatique; de même on observe une diminution du TNFalpha et une augmentation de l'expression

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d'adiponectine, suggérant que la diminution du stress oxydant pourrait améliorer la production de

cytokines par le tissu adipeux.

II.4 Le stress oxydant dans la cellule.

Le stress oxydant se définit comme un déséquilibre entre les espèces chimiques pro-

oxydantes et les systèmes de défenses antioxydantes, avec comme conséquences des altérations

du fonctionnement cellulaire. Le stress oxydant a plusieurs origines. Il peut provenir de

l'environnement. Exposition prolongée au soleil, à l'ozone, tabagisme, consommation excessive

d'alcool, contact avec des agents cancérigènes, consommation de médicaments, pollution, sont

autant de situations qui génèrent un stress oxydant. Par ailleurs, plusieurs systèmes biochimiques

de l'organisme sont à l'origine de la production d'agents pro-oxydants. C'est la découverte en

1969 de la superoxyde dismutase (SOD) (McCord et Fridovich, 1969), un enzyme qui dégrade le

peroxyde d'hydrogène, qui a fait prendre conscience que la production de ROS est le corollaire

inévitable de la vie en aérobie. La production de peroxyde d'hydrogène par les mitochondries

avait été démontrée auparavant (Jensen, 1966; Hinkle et al., 1967), amenant à citer une fuite de la

chaîne mitochondriale comme la source probable de ROS. En effet, il est généralement accepté

que le complexe III mitochondrial est un générateur important d’anion superoxyde (O2.- ) dans la

cellule et que le changement d'activité de la chaîne respiratoire altère la production de ce radical

libre (Poderoso et al., 1996). Cependant pour certains auteurs, la production de O2.- a une

constante d'équilibre très en défaveur de sa production, qui est donc thermodynamiquement

défavorable, ce qui signifie que la production de O2.- n'est pas spontanée, contrairement à ce qui

est généralement affirmé (Furchgott, 1999) et ne peut survenir que lorsque l'équilibre est déplacé

par le couplage à une seconde réaction comme la dismutation de O2.- en H2O2. Ainsi, O2

.- est un

intermédiaire éphémère alors que la production de H2O2 est catalysée par la SOD. La production

de H2O2 par les mitochondries est dépendante de la concentration en oxygène. L'augmentation de

la production de H2O2 n'est observée que pour des concentrations en oxygène très supérieures

aux concentrations physiologiques. Par ailleurs, la fixation de NO sur la cytochrome c oxydase

inhibe le flux d'électron à travers le complexe III ce qui augmente la réduction à travers la chaîne

respiratoire et accroît la production de O2.-. La production de O2

.- par les mitochondries a

traditionnellement été considérée comme incontrôlée et O2.- perçu comme un sous-produit

toxique de la respiration.

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De faibles concentrations en NO se fixent sur la cytochrome c oxydase ce qui peut

augmenter l'oxygène dans la membrane interne des mitochondries et stimuler la production de

O2.- par la réduction du complexe III. Mais si la concentration en NO augmente, il peut réagir

avec O2.-, ce qui est plus rapide que la dismutation en H2O2, et produire du peroxynitrite. Il a

également été suggéré que le peroxynitrite et NO peuvent inhiber le complexe III et de la sorte

augmenter la production de O2.- et de H2O2. Cette dernière est une molécule de signalisation aux

propriétés variées dont une des propriétés est sa diffusibilité dans la cellule. Elle a d'ailleurs été

impliquée dans plusieurs systèmes de signalisation (Bogoyevitch et al., 2000; Iles et al., 2002;

Ramachandran et al., 2002). La question reste posée de savoir si le H2O2 produit par les

mitochondries correspond ou non à un système de signalisation. La relation entre NO et la

production de radicaux oxygénés par les mitochondries reste pour l'essentiel incomprise.

II.5 Le stress oxydant dans l'adipocyte: la production de ROS.

Des travaux récents ont montré que la production de radicaux oxygénés très réactifs

augmente en réponse à l'hypoxie. Ces travaux ont mis en évidence une augmentation des facteurs

de transcription HIFalpha 1 et 2 (hypoxia induced factor), qui modulent les adaptations à

l'hypoxie par une inhibition de l’hydroxylation des résidus proline et asparagine des HIF ce qui

augmente leur stabilité et leur transcription (Lando et al., 2002). En effet, l’hypoxie (1%

d’oxygène) stimule fortement la production de radicaux libres par les mitochondries de

préadipocytes 3T3-F442A en culture, et augmente fortement l’expression de HIF1alpha, ce qui

inhibe fortement la différenciation cellulaire en adipocytes. Les effets de l’hypoxie sont

partiellement inhibés en réponse au traitement par des antioxydants (Carrière et al., 2004).

Cependant, EPAS 1 (endothelial PAS protein1, également appelée HIF2alpha, HLF, MOP2) qui

est fortement exprimé dans les cellules endothéliales et dans le tissu adipeux est entre autre

impliqué dans la maintenance des ROS (Scortegagna et al., 2003). Or une étude récente suggère

que HIF2alpha est un facteur de transcription important de la différenciation adipocytaire

(Shimba et al., 2004).

Par ailleurs, des travaux récents ont mis en évidence la présence d'une NADPH oxydase sur

la membrane des adipocytes (protéines NOX, Krieger-Brauer et al., 1997). Le complexe NADPH

oxydase est constitué d'un flavocytochrome b558 membranaire composée des protéines pg91phox

et p22phox et des protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. L'expression des ARNm

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codant chacune de ces sous-unités a été observée dans le tissu adipeux. L'expression de ces

ARNm a été trouvée augmentée spécifiquement dans le tissu adipeux de souris obèses (KKAy)

comparé à d'autres tissus (foie, muscle squelettique). Il en est de même pour les ARNm codant

PU.1 un facteur de transcription connu pour stimuler la transcription de la NADPH oxydase qui

joue un rôle important dans la production de H2O2 (Mahadev et al., 2004). L'expression d’ARNm

codant NOX4 est augmentée dans le tissu adipeux de souris obèses.

Dans l’adipocyte, la production de peroxyde d'hydrogène par les adipocytes est utilisée

comme un signal de transduction de l'insuline (Mahadev et al., 2004), produite par la

semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) qui dégrade les amines endogènes et exogènes

(Visentin et al., 2003) et par la NADPH oxydase présente sur la membrane des adipocytes

(Krieger-Brauer et Kather, 1992 ; Krieger-Brauer et Kather, 1995), comme nous venons de le

voir. Toutes ces études suggèrent un rôle important du stress oxydant dans le fonctionnement

adipocytaire. Si le stress oxydant est aussi important pour les adipocytes que les travaux

précédents le suggèrent, d'autres processus cellulaires doivent être altérés par ce stress,

notamment la peroxydation lipidique. La NADPH oxydase étant membranaire, les lipides

membranaires devraient être directement exposés à la production de ROS. Parmi les lipides

membranaires les plus réactifs aux ROS se trouvent les plasmalogènes et les acides gras

polyinsaturés et notamment l'acide arachidonique qui est à l'origine des prostaglandines dont les

effets sont impliqués dans de nombreuses régulations cellulaires.

II. 6 Les prostaglandines

Les prostaglandines jouent un rôle important dans le développement du tissu adipeux

blanc. La voie de synthèse des prostaglandines commence par une étape initiale qui comprend la

libération d’acide arachidonique des phospholipides de la membrane plasmique par l’action

d’une phospholipase A2. L’acide arachidonique est ensuite converti en PGG2 puis en PGH2 par

des activités cyclooxygénase et peroxydase au sein d’enzymes appelées PGH synthase ou

cyclooxygénase. Il existe deux formes de PGH synthase, une forme constitutive (PGH synthase 1

ou COX 1) et une forme inductible (PGH synthase 2 ou COX 2). L’expression de la COX 2 est

inductible par des cytokines pro inflammatoires. COX 2 est un site d’action majeur des anti-

inflammatoires non stéroïdiens comme l’aspirine et l’indométacine. On admet que l’expression

des deux isoformes de COX est régulée et qu’elles jouent un rôle essentiel dans la synthèse à

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long terme des prostanoïdes (Smith et Dewitt, 1996). La structure cristalline des deux isoformes

a été établie, COX 2 possède un site actif plus large que celui de COX 1 ce qui est en accord avec

la moindre spécificité de COX 2 pour les substrats. En effet, COX 2 métabolise des substrats tels

que l’anandamide et l’acide linoléique (Picot et al., 1994; Kurumbail et al., 1996). Une troisième

isoforme de COX (COX 3) a été récemment clonée et possède un site catalytique présentant les

caractéristiques identiques à ceux de COX 1 et COX 2. Les prostaglandines sont produites par

l’action de synthases spécifiques PGE2, PGD2 PGF2alpha synthases. PGH2 peut également être

convertie en thromboxane (TxA2) ou en prostacycline (PGI2).

II.6.1 Synthèse et dégradation des cyclooxygénases.

Les gènes codant COX 1 et COX 2 sont finement régulés. Le gène de COX 1 est

généralement induit par la quiescence cellulaire et la différenciation tandis que celui de COX 2

est induit par une variété de stimuli comprenant des hormones, des facteurs de croissance, des

cytokines, des effets de cisaillements (Hla et al., 1993). On observe une diminution rapide des

ARNm codant COX 2 en réponse à la dexaméthasone, à cause d’une déstabilisation des ARNm

(Ristimaki et al., 1996). Plusieurs protéines, ligands d’ARN ont été décrites comme des

régulateurs de la stabilité des ARNm. Il reste à définir par quels mécanismes moléculaires la

stabilité des ARNm codant COX 2 peut-être régulée et comment ces régulations affectent

l’expression du gène en conditions physiologiques et physiopathologiques.

II.6.2 Biologie fonctionnelle des prostaglandines.

Dans les conditions de repos, les cellules expriment COX 1 tandis que COX 2 est induite

en réponse à une activation cellulaire ou par des stimuli pathologiques. Dès que PGH2 est

produite, elle est rapidement convertie en prostaglandines plus stables telles que PGE2, PGD2,

PGI2, PGF2alpha par des isomérases spécifiques des différents tissus. Ces médiateurs sont

rapidement secrétés dans le milieu extracellulaire par des transporteurs spécifiques (Schuster

1998).

De nombreuses prostaglandines agissent par l’intermédiaire de récepteurs membranaires

couplés aux protéines G. Ces récepteurs interagissent à leur tour avec des systèmes de

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signalisations cytosoliques pour provoquer de nombreuses réponses physiologiques rapides

comme l’agrégation plaquettaire, la relaxation/contraction des muscles lisses, la plasticité

neuronale, la perméabilité vasculaire. Par exemple la PGE2 est un facteur angiogénique puissant.

Dans l’arthrite rhumatoïde, l’activation de COX 2 est corrélée avec une angiogenèse synoviale

importante, un processus pathologique très destructeur. PGE2 active ses récepteurs sur les

fibroblastes synoviaux et augmente l’expression de VEGF (vascular endothelial cell growth

factor) qui est un angiogéne puissant. Le récepteur de sous-type EP2 des récepteurs de PGE

active des protéines Gs/cAMP et les protéines kinases A, qui vraisemblablement augmentent la

transcription de VEGF (Ben-Av et al., 1995). A l’inverse des prostaglandines comme la 15-

désoxy-delta12,14-prostaglandine J2 (15dPGJ2) agissent à l’intérieur de la cellule en se fixant sur

des récepteurs nucléaires comme les peroxisome proliferator activated receptor (PPAR). Après

leur activation par des ligands endogènes telle que la 15dPGJ2, les PPAR s’hétérodimérisent avec

RXR pour induire des réponses transcriptionnelles spécifiques. Certains travaux ont montré que

l’activation nucléaire par certaines prostaglandines inhibe la réplication virale (Santoro et al.,

1980) et la croissance tumorale (Negeshi et al., 1995). Des travaux plus récents ont également

mis en évidence le rôle des PPAR et de la 15dPGJ2 dans la différenciation des cellules

spumeuses en réponse aux LDL oxydés (Tontonoz et al., 1998) et l’inhibition de gènes pro-

inflammatoires, NFkB-dépendants dans les monocytes (Jiand et al., 1998). Dans l’endothélium

vasculaire, l’activation de la voie des PPAR provoque l’apoptose, suggérant que cette voie de

signalisation est un médiateur de la blessure vasculaire. Le fait que la 15dPGJ2 soit le ligand

endogène le plus efficace des PPAR suggère que la voie COX / PGD synthase est responsable de

l’activation des PPAR. Cependant, d’autres acides gras et éicosanoïdes sont également des

ligands de PPAR. Il est important pour le futur de définir si COX 1 et/ ou COX 2 sont impliqués

dans la régulation des PPAR.

Les prostaglandines sont des modulateurs de nombreux processus physiologiques et

physiopathologiques tels que l’inflammation, la réponse immunitaire, l’arthrite, les cancers. Des

travaux récents montrent également que des prostaglandines jouent un rôle déterminant dans la

différenciation des cellules en adipocytes.

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II.6.3 Prostaglandines et adipocytes.

Le rôle des différentes prostaglandines dépend du stade de différenciation des cellules.

Ainsi, la prostacycline (PGI2) a été positivement associée à la différenciation terminale des

adipocytes (Reichert et Eick, 1999). L’analogue stable de PGI2, la carbaprostacycline induit la

différenciation terminale des adipocytes en augmentant la concentration cellulaire en

AMPcyclique et la libération intracellulaire de calcium (Aubert et al. 2000) De plus, PGI2

augmente l’expression de C/EBP β et δ des préadipocytes. Les effets de la PGE2 sur

l’adipogenèse ont été décrits comme stimulateur (Shillabeer et al., 1998) ou inhibiteur (Lepak et

Serrero, 1993), alors que cette prostaglandine exerce des effets lipolytiques sur les adipocytes

différenciés (Richelsen, 1991). Récemment Fajas et al., (2003) ont suggéré que l’inhibition de

COX 2 inhibe la différentiation des adipocytes en inhibant la phase d’expansion clonale qui

précède la différenciation cellulaire. La 15dPGJ2 a été décrite comme exerçant des effets

stimulateurs sur la différenciation adipocytaire. Ces effets sont médiés par l’intermédiaire des

récepteurs nucléaires PPARgamma.

II.7 Le stress oxydant et le métabolisme des acides gras polyinsaturés.

Le stress oxydant induit une peroxydation lipidique des acides gras polyinsaturés des séries

n-6 et n-3. Les acides gras de la famille des n-6 sont des précurseurs de ligands de PPARgamma.

Le plus important, l’acide arachidonique (20:4n-6) peut être converti par la cyclooxygénase en

prostaglandines. Parmi celles-ci, la PGD2 est le précurseur de la 15dPGJ2, ligand naturel qui se

fixe avec une forte affinité aux PPARgamma. Cette fixation est une étape préliminaire de

l’activation de ces récepteurs nucléaires qui induisent l’expression des gènes de la différenciation

adipocytaire.

Les acides arachidonique et linoléique peuvent aussi être transformés par la 15-

lipoxygénase respectivement en acides 15-hydroperoxyeicotétraénoique (15-HpETE) et en 13-

hydroperoxyoctadécadiénoïque (13-HpODE). Ces composés sont normalement réduits par la

glutathion peroxydase en leurs acides gras monohydroxylés correspondants: les acides 15-

hydroxyéicosatétraénoïque (15-HETE) et 13-hydroxyoctadécadiénoïque (13-HODE) qui sont

tous deux des ligands de PPARs et notamment de PPARgamma.

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Plus globalement, les acides gras polyinsaturés (n-3 et n-6), qu’ils soient libres ou estérifiés

dans les phospholipides, peuvent s’oxyder chimiquement ou par voie enzymatique via les

lipoxygénases pour former différents hydroperoxydes toxiques pour les cellules. Ces composés

sont normalement réduits en acides gras monohydroxylés correspondant par les glutathions

peroxydases, mais leur durée de vie s’accroît si ces peroxydases sont moins actives comme

observé dans le diabète par exemple. Les hydroperoxydes se décomposent alors spontanément

pour former des aldéhydes tels que le 4-hydroxynonénal (4-HNE) (Pryor et Porter, 1990; Porter

et al., 1995). L’acide docosahexaénoïque (DHA-22:6n-3) est particulièrement oxydable du fait de

la présence de 6 doubles liaisons. L’un de ses produits d’oxydation est l’aldéhyde 4-

hydroxyhexénal (4-HHE) (Van Kuijk et al., 1990; Van Kuijk et al., 1995).

Le 4-HNE se lie de façon covalente aux aminophospholipides et en particulier aux

phosphatidyléthanolamines (PE) pour former des produits d’addition, identifiés par

chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (Guichardant et al., 1998;

Guichardant et al., 2001) comme étant des adduits de Michael et des bases de Schiff cyclisées ou

non. Les adduits de Michael qui sont majoritairement formés ne sont pas substrats de différentes

phospholipases (phospholipase C de bactérie, phospholipase D de chou) et mauvais substrats de

la phospholipase A2 de venin (Guichardant et al., 2001). La formation de tels adduits dans les

adipocytes pourrait donc avoir pour conséquence une diminution de la disponibilité du 20:4n-6

pour la synthèse des ligands de PPARgamma (15dPGJ2 et 15-HETE).

En résumé, tous ces composés porteurs d’un groupement carbonyle très réactif, aussi bien

avec les résidus aminés qu’avec les thiols, sont susceptibles d’apparaître lors d’un stress oxydant.

Ils peuvent alors agir de différentes façons en modifiant des récepteurs, des enzymes, en

perturbant la synthèse de ligands de PPARs. Nous faisons l’hypothèse qu’ils pourraient modifier

le fonctionnement des adipocytes.

L’équilibre redox intracellulaire peut être facilement rompu lors d’un stress oxydant et

entraîner une élévation des hydroperoxydes (13HpODE, 15HpETE). Ces derniers sont connus pour

stimuler l’activité cellulaire/cytosolique des phospholipases A2 et les enzymes clé de la

peroxydation lipidique spécifique (cyclooxygénase et lipoxygénase). Ils peuvent ainsi accroître la

quantité de ligands de PPARgamma. A l’inverse, un stress oxydant plus important conduit à une

formation encore accrue d’hydroperoxydes qui s’accumulent. Ces derniers, très instables, se

dégradent et forment des aldéhydes très réactifs (4-HNE, 4-HHE) qui devraient diminuer la

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production de ligands naturels de PPARγ si les phospholipides réservoir d’acides gras polyinsaturés

(n-6) sont modifiés par les aldéhydes.

Figure 5 : Voie de synthèse des prostaglandines à partir de l’acide arachidonique (modifié

d’après Chew, 2005).

La cyclooxygénase convertit l’acide arachidonique (20:4n-6) en endoperoxyde cyclique de

prostaglandine, PGG2, qui est aussitôt réduit en dérivé 15-Hydroxylé correspondant, PGH2, par

une hydroperoxydase. Les activités cyclooxygénases et hydroperoxydases sont portées par une

même protéine, la PGH synthase. La PGH2 formée est ensuite transformée en plusieurs composés :

le thromboxane A2 (TxA2) par la thromboxane synthétase, la prostaglandine 6-céto PGF1α par la

prostacycline synthétase, la prostaglandine F2α (PGF2α) par la PGFα synthétase et les

prostaglandines E2 et D2 (PGE2 et PGD2) par les PGE et PGD isomérase. La 15dPGJ2 est un

produit de la déshydratation de la PGJ2, elle-même issue de la PGD2.

Phospholipase A2Acide Arachidonique

PGG/H synthases

Cyclooxygénases 5-, 12-, ou 15-

Lipoxygénases

Cytochrome P-450

Epoxygénase

PGG2

PGH2

Prostanoïdes

Acide hydroperoxy-eicosatétraénoïque

(HPETEs)

202

2e-

O2 O2

NADPH

5,6-, 8,9-, 11,12-, ou 14,15

Acide époxy-eicosatriénoïque

(EETs)

Leucotriènes

PGD2

Isomérase

PGE2

isomérase

PGFα

synthétase

Pros

tacy

clin

esy

nthé

taseThromboxa

ne

synthé

tase

PGD2

PGE2PGF2α6-cétoPGF1α

TxA2

PGJ2

15 désoxy-∆12,14-PGJ2

Phospholipase A2Acide Arachidonique

PGG/H synthases

Cyclooxygénases 5-, 12-, ou 15-

Lipoxygénases

Cytochrome P-450

Epoxygénase

PGG2

PGH2

Prostanoïdes

Acide hydroperoxy-eicosatétraénoïque

(HPETEs)

202

2e-

O2 O2

NADPH

5,6-, 8,9-, 11,12-, ou 14,15

Acide époxy-eicosatriénoïque

(EETs)

Leucotriènes

PGD2

Isomérase

PGE2

isomérase

PGFα

synthétase

Pros

tacy

clin

esy

nthé

taseThromboxa

ne

synthé

tase

PGD2

PGE2PGF2α6-cétoPGF1α

TxA2

PGJ2

15 désoxy-∆12,14-PGJ2

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III MATERIEL ET METHODES

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III.1 Matériels générales

Kit CyQUANT cell proliferation assay (C7026) Molecular Probes

Kit Glucose Reagent (671640) Beckman Coulter

Kit Hydrogen Peroxide Assay (706011) Cayman Chemicals

Kit RIA pour l’adiponectine, coffret 125 tubes (MAD-60HK) Linco Research, Inc/USA

4 hydroxynnonénal (4-HNE) – Prof. Doutheau (Chimie Organique INSA-Lyon)

III.1.1 Produits pour la culture cellulaire

Acide ascorbique (Sigma A4034)

Adipocytes 3T3-L1 obtenue par American Type Culture Collection (ATCC CL-173).

Déxamethazone (Sigma D2915)

D (-) fructose (sigma F0127)

Flasque 75 mL (Falcon)

Glutamine (Sigma G7513)

Hepes (Sigma H0887)

IBMX - 3-isobutyl,1-méthylxanthine (Sigma I7018)

Insuline (Novo-Nordisk Actrapid 100UI/mL)

Milieu de culture «Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium» (Sigma D5671)

Pest – (SigmaA5955)

Plaque 6 puits pour culture cellulaire, fond plat. (Falcon 353046)

Sérum de veau nouveau-né (Sigma N4637)

III.1.2 Réactifs et solvants pour le dosage de prostaglandine

Acétate d’éthyle, Acétone, Diéthyl éther, Ethanol, Méthanol, Hexane,(SDS)

Acétonitrile CH3CN (Aldrich 27100-A)

Acide phosphomolybidique (Riedel-de Haën ACS31426)

Hexane (Aldrich 29609-0)

Methoxylamine hydrochloride (MOX) (Aldrich 22690-4)

N-éthyl diisopropylamine (DIPE) (Fluka Chemica 03440)

N,N-Dimethylformamide (DMF) (Aldrich 200-679-5)

N,O-Bis(trimethyl)trifuorocetamide (BSTFA) (Fluka Chemica 15198)

PentaFluoroBenzylbromide (PFB) (Fluka Chemica 17910)

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Plaque de chromatographie sur couche mince - silica gel 60 (Merk 200x200x0,25mm)

Prostaglandine D2 (Cayman Chemical 12010)

Prostaglandine D2-d4 (Cayman Chemical 312010)

Prostaglandine E2 (Cayman Chemical 14010)

Prostaglandine E2-d4 (Cayman Chemical 314010)

Prostaglandine 6 céto F1α (Cayman Chemical 15210)

Prostaglandine 6 céto F1α-d4 (Cayman Chemical 315210)

Prostaglandine F2α (Cayman Chemical 16010)

Prostaglandine F2α-d4 (Cayman Chemical 316010)

Prostaglandine 15-deoxy-∆12,14-J2 (Cayman Chemical 18570)

Prostaglandine 15-deoxy-∆12,14-J2-d4 (Cayman Chemical 318570)

III.1.3 Réactifs, solvants et solutions pour les Western blotting

CellyticTM-M (C2978) Sigma

Solution stock acrylamide/BIS (30%) prête à l’emploi

Solution SDS 10%

Solution persulfate d’ammonium 10%

Tampon Tris-HCl 1,5 M pH 8.8

Tampon Tris-HCl 0,5 M pH 6.8

Tampon de migration

Tampon de dépot

III.1.4 Réactifs et solvants pour les RT-PCR

Amorces d’adiponectine sens et antisens (n° U37222) 5’-AAGGACAAGGCCGTTCTCT–3’

et 5’–TATGGGTAGTTGCAGTCAGTTGG–3’ Invitrogen.

Amorces de β-actine sens et antisens (n° X03672) 5’–CCAGGGTGTGATGGTGGGAATG–

3’ et 5’–CGCACGATTTCCCTCTCAGCTG–3’. Invitrogen

Eau Rnase free

Tampon 5x Qiagen

dNTP Mix

Enzyme Mix

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III.1.5 Appareils

Centrifugeuses Jouan

Centrifugeuse réfrigérée Bioblock Scientific

Evaporateur rotatif Bioblock Scientific

Incubateur BB16 Heraeus

Lecteur RIASTAR Packard Instrument Co.

Lecteur de microplaques FLUOstar BMG Labtechnologies

Lecteur de plaques multipuits PowerWavex Bio-Tek Instruments

pH-mètre Radiometer Copenhagen/Tacussel

Spectrophotomètre Kontron Instruments

Système d’électrophorèse Mini-protein II et d’électrotransfert Mini-Trans Blot Bio-rad

Système d’imagerie ImageMaster VDS-CL (logiciel Imagem Quant) Amersham Pharmacia

Système de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

(Chromatrographe en phase gazeuse Hewlett Packard Séries 6890, colonne capillaire silice

(HP-5MS) (30m x 0,25 mm), gaz vecteur : hélium (0,5 bar), Spectromètre de masse

quadrupolaire Hewlett Packard Séries 5973, gaz réactant : méthane, système informatique

(pilotage, acquisition en traitement de données)).

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III.2 Méthodes

III.2.1 Les adipocytes 3T3-L1

Les cellules utilisées sont des fibroblastes issus d’embryons murins. Elles proviennent d’une

lignée cellulaire: 3T3-L1 obtenue chez American Type Culture Collection (ATCC CL-173). Ces

fibroblastes sont capables de se différencier spontanément en adipocytes, c’est pourquoi ils sont

aussi appelés préadipocytes. Cette différenciation spontanée concerne 5% des cellules au bout de 6

jours et plus de 60% à 28 jours. Les fibroblastes sont des cellules polygonales qui adhèrent au fond

des boites de culture et forment un tapis cellulaire monocouche et jointif à confluence. Lorsque la

confluence est atteinte, la différenciation en adipocytes peut être stimulée. Les adipocytes sont

caractérisés par la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et la forme arrondie des

cellules. Deux jours après la fin de la stimulation de la différenciation, 50% des cellules présentent

une à deux gouttelettes lipidiques et huit jours plus tard 80% des cellules présentent cinq à dix

gouttelettes lipidiques. De la même façon, Fong et al., (1999) observent 90% de cellules

différenciées 8 jours après la fin du traitement.

III.2.2 Culture cellulaire

Les fibroblastes 3T3-L1 sont mis en culture dans un milieu constitué de DMEM (Dulbecco’s

Modified Eagle’s Medium Sigma D5671) à 85%, de sérum de veau fœtal (Sigma N4762) à 10%,

d’insuline (Novo-Nordisk Actrapid 100UI/mL) à 40nM, de D(-) fructose (sigma F0127) à 10 mM,

de tampon Hepes (Sigma H0887) à 10 mM, d’acide L-ascorbique (Sigma A4034) à 25µg/mL et

d’une solution anti-biotique et anti-mycotique (Sigma A5955). Les cellules se divisent dans des

flasques de 75 cm2 à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2. Lorsque les cellules sont à

confluence (arrêt de la division cellulaire dû à l’inhibition de contact), elles sont rincées par 5 mL

de DMEM sans sérum et trypsinées à raison de 9 mL de trypsine (Trypsine-EDTA 1x Sigma

T3924) pour une flasque. La réaction a lieu pendant 5 minutes sous agitation douce et en vérifiant

sous microscope que les cellules sont décollées. La réaction est stoppée par l’ajout de 9 mL de

sérum de veau nouveau-né (sigma NA4637) à une concentration finale de 10%. On récupère le

milieu que l’on centrifuge à 1400t/min pendant 5 minutes, on ôte le surnageant et on suspend le

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culot dans 4 mL de milieu de culture. Les cellules sont réensemencées à raison de 100 µL par puits

de plaque de 6 puits, dans 1,5 mL de milieu par puits.

III.2.2.1 Différenciation des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes

Lorsque les fibroblastes sont à confluence, on induit leur différenciation en adipocytes en les

incubant pendant 72 heures dans du milieu de culture supplémenté en insuline (20 µg/mL), IBMX

(3-isobutyl, 1-méthylxanthine, Sigma I7018) à 1 mM, et déxamethazone (dexamethazone water

soluble, Sigma D2915) à 20 µM. L’état de différenciation des adipocytes est contrôlé au

microscope optique en vérifiant l’apparition de gouttelettes lipidiques très réfringentes, dans le

cytoplasme des cellules en culture. Toutes ces manipulations doivent être réalisées stérilement sous

une hotte à flux laminaire et les plaques doivent être conservées dans un incubateur à 37°C.

III.2.2.2 L’induction du stress oxydant avec la glucose oxydase

Dix-sept jours après la fin de la différenciation, les adipocytes 3T3-L1 ont été incubés pendant

16 heures avec différentes concentrations de glucose oxydase (GO: 0, 1, 5, 12.5, 25, 50 et 100

mU/mL). Pour cela, le milieu de culture a été enlevé et les cellules rincées deux fois avec du

tampon krebs. Les cellules sont alors incubées avec l’enzyme dans du tampon Krebs ou du tampon

Krebs seul pour les témoins. La glucose oxydase produit du peroxyde d’hydrogène; celui-ci génère

du 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) en peroxydant les lipides (hydroperoxydes d’acides gras 4-

HNE). Le stress oxydant a été quantifié par la mesure du 4-HNE par GC-MS.

III.2.2.3 L’incubation des adipocytes 3T3-L1 avec 4-HNE

Nous avons également testé les effets du 4-HNE (0 ; 0,1 ; 1 ; 10 ; 25 et 50 µM). Pour cela, le

milieu de culture a été enlevé et les cellules rincées deux fois avec du tampon krebs. Les cellules

sont alors incubées avec du 4-HNE dans du tampon Krebs pendant 16 heures. L’adiponectine

libérée pendant l’incubation a été mesurée dans le surnageant.

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III.2.3 Dosage de l’adiponectine

Nous avons utilisé le surnageant dans lequel les adipocytes ont été incubés pour doser

l’adiponectine sécrétée et libérée pendant la période d’incubation. L’adiponectine a été dosée à

l’aide d’un kit RIA (LINCO) selon les recommandations du fabricant.

III.2.4 Dosage de la production de peroxyde d’hydrogène

Le dosage du peroxyde d’hydrogène (H202) est réalisé par un Kit (Cayman biochemicals), le

principe est basé sur l’oxydation de l’ion ferreux Fe2+ en ion ferrique Fe3+ en présence de H202.

L’ion Fe3+ réagit avec le réactif xylenol orange pour former un composé coloré stable mésuré à 595

nm. Le dosage se fait dans les plaques 96 puits dans volume total de 230 µL par puits, dont 200 µL

de réactif, 20 µL d’échantillon et 10 µL de glutathion peroxydase. La gamme étalon et les réactifs

sont préparés selon les recommandations du fournisseur. Après 30 minutes d’incubation des cellules

avec des concentrations croisssantes de glucose oxydase, 20 µL du milieu de culture sont prélevés

pour doser le H202.

III.2.5 Evolution de la concentration de glucose en présence de glucose

oxydase

La glucose oxydase utilise le glucose présent dans le milieu de culture des adipocytes 3T3-L1.

Afin de s’assurer que les cellules ne sont pas soumises à des concentrations trop faibles de glucose,

nous avons mesuré sa concentration à l’aide d’un analyseur de glucose (Glucose Analyser Beckman

II).

III.2.6 Dosage de Lactate

Le lactate est dosé par une méthode fluorimètrique qui consiste à mesurer l’apparition de

NAPDH provenant de la réaction suivante :

LACTATE + NAD+ ↔ PYRUVATE + (NADH+H+)

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Cette enzyme transfère deux atomes d’hydrogène sur le NAD qui acquiert des propriétés de

fluorescence pour une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et pour une longueur d’onde

d’émission de 460 nm. La solution de dosage se compose de 10% de 2-amino-2-méthyl propanol,

5% de solution d’hydrazyne, 2% de solution de nicotinamide adénine dinucléotide et de 83% d’eau

ultra pure. Cette procédure de dosage est basée sur la mesure de la formation de NADH due à

l’oxydation du lactate catalysée par la LDH et utilisant l’hydrazine comme agent de captation du

pyruvate (Gutmann et Wahlefeld 1974). Les mesures sont effectuées à l’aide d’un fluorimètre

automatisé dans des plaques 96 puits. Chaque puits continent 200 µL de la solution de dosage, 20

µL d’échantillon à doser et 10 µL de l’enzyme c’est-à-dire la LDH. Sur la plaque de mesure, nous

réalisons une courbe standard de lactate préparée à partir d’une solution de lactate standard (Sigma

826-10) d’une concentration initiale de 400 mg/L. L’incubation est faite sous agitation douce

pendant 30 min à 37°C. Les résultats de l’analyse sont collectés par un ordinateur couplé au

fluorimétre. Le logiciel donne les résultats en unité arbitraire de fluorescence qui sont ensuite

transformées en concentration de lactate à partir de la courbe standard.

III.2.7 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976)

Pour réaliser ce dosage, on utilise le kit “Bio-rad’s protein assay”. Ce dosage est basé sur le

changement de coloration du bleu de Coomassie en présence de concentrations variables de

protéines. Une fraction aliquote de la solution à doser est prélevée et complétée à 50 µL avec de

l’eau ou le tampon constituant la solution à doser. On ajoute 200 µL de solution “BioRad protein

assay” diluée 5 fois dans l’eau. Après agitation, la densité optique à 595 nm est lue en microplaque

96 puits à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (powerWave X, BIOTEK

INSTRUMENTS) et la concentration est déterminée par comparaison à une gamme étalon

d’albumine sérique bovine (1-20 µg de protéines) réalisée dans les mêmes conditions.

III.2.8 Préparation des échantillons pour l’électrophorèse en conditions

dénaturantes (SDS-PAGE).

Les adipocytes 3T3-L1, sont cultivés dans des plaques de 6 puits, puis traités ou non à la

glucose oxydase pendant 16 heures. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du PBS à 37°C

puis récoltées. Ensuite, elles sont lysées dans du tampon de lyse (Cellytic M Sigma) supplémenté en

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inhibiteur des protéases (Sigma) (1/4 v/v), à raison de 120 à 150 µL/puits pendant 15 min à 4°C et

sous agitation. Les homogénats cellulaires sont centrifugés à 14000g pendant 15 min. Le surnageant

est récupéré. Le dosage des protéines (par méthode de Bradford) est réalisé sur un aliquote de

chaque échantillon. 20 µg de protéines, sont repris dans du tampon de Laemmli (composition finale

: Tris 125mM, pH=6,8, saccharose 10%, SDS 2%, mercaptoéthanol 1% et bleu de bromophénol

0,05%), la dénaturation se fait pendant 5 min à 100°C.

III.2.8.1 Electrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et

"western-blotting".

Les électrophorèses sont réalisées sur un gel de polyacrylamide dont la concentration dépend

de la taille des protéines à séparer, en présence de 0,1% de SDS grâce à un appareil

d’électrophorèse pour minigels Biorad. Brièvement, pour deux mini gels on prépare le gel de

séparation en mélangeant dans un tube 4ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 2,5ml de Tris 1,5M

pH8,8, 0,10ml de SDS 10%, 0,10ml d'ammonium persulfate 10% et 0,004ml de TEMED. Le

mélange est vortexé avant d'être coulé. Après polymérisation, on prépare un gel de concentration en

mélangeant dans un tube 2,7ml d'eau, 0,67ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 0,5ml de Tris 1M

pH6,8, 0,04ml de SDS 10%, 0,04ml d'ammonium persulfate 10% et 0,004ml de TEMED. Le gel de

concentration est coulé au-dessus du gel de séparation. Après polymérisation les gels sont placés

dans la cuve de migration du système. Les échantillons préparés comme décrit précédemment sont

déposés dans les puits. La migration électrophorétique s’effectue sous une tension de 120V à

voltage constant. La migration peut être suivie grâce au dépôt de marqueurs moléculaires précolorés

dans un puits de référence. Les masses moléculaires des protéines étudiées sont déterminées en

référence à ces marqueurs moléculaires. L’électrotransfert sur membrane de nitrocellulose

(Amersham) est effectué pendant 1 heure à 140 V et ampérage constant de 300 mA, dans du

tampon de transfert réfrigéré (25mM de TrisHCl, pH=8,3, 0,19 M de glycine, 20% de méthanol). Le

transfert effectué, les marqueurs de masse moléculaire sont également transférés et peuvent servir

de contrôle d’efficacité du transfert. La membrane est rincée par un tampon salin TBS-T 1% (Tris-

HCl 20mM, NaCl 137mM, pH=7,6, Tween 20 à 0,1%) puis saturée dans un bain TBS-T/BSA 1%

pendant une nuit à 4°C. La membrane est ensuite rincée trois fois par du TBS-T 1% durant 10 min,

puis incubée à température ambiante avec l'anticorps primaire dilué mille fois, pendant 1 heure. Elle

est rincée 5 fois par du TBS-T 1% puis incubée avec l'anticorps secondaire anti-IgG couplé à la

peroxydase à la concentration (1 /10000) pendant 1 heure. La membrane est soumise à une dernière

série de lavages avant révélation spécifique des protéines par chimiluminescence (kit ECL

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Amersham). La lecture se fait par caméra VDS et les bandes sont quantifiées par un densitomètre en

utilisant le logiciel Image Quant.

III.2.9 Mesure de l’expression des gènes par RT-PCR :

III.2.9.1 Extraction des ARN

Les ARN totaux des cellules sont extraits à l'aide de la solution d'extraction Tri Reagent

(SIGMA). Les cellules sont placées dans un tube eppendorff et centrifugées 5 min à 350 g. Le culot

cellulaire est repris dans 1ml de réactif Tri Reagent le tout est homogénéisé par pipettage. Les

homogénats obtenus sont laissés 5 min à température ambiante pour dissocier l'ensemble des

complexes nucléoprotéiques. On ajoute ensuite 20 µL de chloroforme avant agitation vigoureuse

pendant 15 sec. Les échantillons sont laissés 15 min à température ambiante puis centrifugés à

12000g pendant 15 min à 4°C. Le mélange se sépare alors en une phase organique rouge contenant

les protéines, une interphase contenant les ADN et une phase aqueuse incolore contenant les ARN.

La phase aqueuse est transférée dans un autre tube à laquelle on ajoute 500 µL d'isopropanol

pendant 5 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés à 12000g pendant 10 min à

4°C. L'ARN précipité forme un culot au fond du tube. Le surnageant est éliminé et le culot est lavé

avec 1ml d'éthanol 75%. L'échantillon est de nouveau centrifugé à 7500 g, le surnageant est éliminé

et le culot est séché à l'air, avant d'être repris dans un volume minimum d'eau stérile. La

quantification des ARN se réalise par dilution dans l'eau stérile et par lecture à la longueur d'onde

de 260nm et 280 nm. Afin de vérifier la pureté des ARNm le rapport DO 260/DO 280 est mesuré et

doit être entre 1,7 et 2 pour estimer qu’il n’y a pas de contamination par de l’ADN. Les ARNm sont

ensuite conservés à -80°C.

III.2.9.2 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase

(RT-PCR)

La réaction est réalisée en utilisant le Kit One-step de Qiagen, dans un volume total de 50 µL.

Dans des eppendorfs de 250 µL on rajoute 10 µL Tampon 5x Qiagen, 2 µL dNTP 400 µM de

chaque dNTP Mix , 3 µL d’amorce sens 0.6 µM , 3 µL d’amorce antisens 0.6 µM, 2 µL Enzyme

Mix, un volume correspondant à 1 µg des ARN étudiés et de l’eau Rnase free pour compléter le

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volume à 50 µL. Les amorces spécifiques pour l’amplification des transcrits d’adiponectine ont été

préparées sur la base de séquences publiées. Les amorces sens et antisens sont : (n° U37222) 5’-

AAGGACAAGGCCGTTCTCT–3’ et 5’–TATGGGTAGTTGCAGTCAGTTGG–3’

respectivement. Le transcrit de la β-actine a été amplifié en utilisant les amorces sens et antisens

(n° X03672) 5’–CCAGGGTGTGATGGTGGGAATG–3’ et 5’–

CGCACGATTTCCCTCTCAGCTG–3’ respectivement. L’appareil de PCR est préchauffé à 50°C

avant de placer les tubes. Ensuite la réaction, se fait suivant deux étapes : une première étape de

transcription inverse, qui se fait 30 min à 50°C. Ensuite une deuxième étape d’inactivation de la

transcriptase inverse et initiation de la réaction de PCR se fait à 95°C pendant 15 min et 40 cycles.

Cela consiste en une dénaturation à 94°C pendant 30 sec, hybridation à 61°C pendant 45 sec, et

l’extension à 72°C pendant 10 min. L’amplification et le nombre de cycles ont été déterminés au

cours d’essais préliminaires.

III.2.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose

Les différents fragments d’ADN complémentaires issus de l’amplification par PCR sont

séparés par électrophorèse sur gel d’agarose 2% contenant 0,005% de bromure d’éthidium (10 mg/

mL) dans du tampon TAE (Tris 40 mM, sodium acétate 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3). Les

échantillons sont préparés dans une solution de dépôt (0,25% de bleu de Bromophénol, 30% de

glycérol, 0,75% SDS) puis déposés dans les puits du gel d’agarose. La migration se fait sous tension

constante à raison d’environ 5 Volts/cm de gel, et en présence d’un marqueur de taille. La position

des fragments d’ADN ayant fixé du bromure d’éthidium (BET) est révélée sous UV (310 nm), et le

gel est photographié à l’aide d’une caméra CCD (ImageMaster VDS-CL, Amersham Biotech) .

III.2.10 Dosage du 4-HNE par chromatographie gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse (GC-MS).

Cette méthode mesure le 4-hydroxynonénal (4-HNE) libre formé au cours du stress oxydant.

15 ng de 4-HNE deutéré (4-HNE-CD3), utilisé comme standard interne, est ajouté à 500 µL du

milieu d’incubation des adipocytes. L’échantillon est dérivé par 1 mL d’hydrochlorure de

pentafluorobenzyl hydroxylamine (PFBHA, HCl) préparé à 50 mM dans un tampon PIPES 0,1 M,

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pH = 6.5, pendant 30 min sous agitation (Van Kuijk et al., 1995, Bacot et al., 2003). Cette réaction

convertit les groupements carbonyles en pentafluorobenzyloximes (O-PFB-oximes).

Les protéines sont précipitées par 2,5 mL de méthanol et les aldéhydes dérivés sous forme de

PFB oximes sont extraits par 5 mL d’hexane pestipur. L’excès de réactif est détruit par 60 µL

d’acide sulfurique concentré. Le surnageant récupéré après centrifugation de 5 min à 900 g est

évaporé à sec. Le résidu est traité par 100 µL de N,O-bis-(triméthylsilyl)-trifluoroacétamide

(BSTFA) pendant 24h à température ambiante afin de convertir les groupements hydroxylés en

triméthylsilyléthers (TMS). Le 4-HNE dérivé sous forme de O-pentafluorobenzyl oxime,

trimethylsilyléther- (O-PFB-TMS-4-HNE) est mesuré par GC-MS, en mode Selective Ion

Monitoring (SIM) et Ionisation chimique négative (NICI).

Le standard interne correspond à la molécule native marquée au deutérium, elle est constituée

d’une masse de 3 g/mole plus important que la molécule non marquée. Cette différence engendre

une augmentation du rapport masse/charge (m/z), détectée en spectrométrie de masse, de 3 unités

par rapport au 4-HNE ce qui permet de les différencier lors de l’analyse en GC-MS. L’effet

isotopique engendre ainsi, pour les molécules deutérées, un temps de rétention en chromatographie

en phase gazeuse plus court que pour les molécules non marquées. Leur structure chimique et les

fragments caractéristiques une fois le 4-HNE dérivé au (O-PFB-TMS-4-HNE), sont: ion m/z 423

correspond à l’ion moléculaire, ion m/z 403 correspond au [M-20] perte du l’acide fluorhydrique

(HF), ion m/z 333 correspond au [M-90] perte TMSOH, ion m/z 313 correspond [M-110] perte

TMSOH et HF et ion m/z 283 correspond au [313-30] perte HCOH.

III.2.11 Dosage des prostaglandines E2, D2, F2α et 6 céto-F1α par

chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GC-

MS

III.2.11.1 Extraction des prostaglandines à partir des adipocytes en

culture

Le tapis cellulaire de chacun des cinq puits d’une plaque de culture cellulaire est rincé deux

fois avec 1mL de tampon Krebs, puis incubé pendant 30 minutes à 37°C dans 1,5mL de tampon

Krebs contenant de l’acide acétylsalicylique à 2 10-4M pour inhiber les cyclooxygénases et stopper

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la synthèse des prostaglandines avant la récolte du tapis cellulaire. Après avoir éliminer le Krebs

contenant l’acide acétylsalicylique, les tapis cellulaires sont décollés avec 0,5mL de tampon Krebs

chacun, puis transvasés dans un tube en verre, le sixième puits est conservé à -80°C pour doser les

protéines.

Les standards internes nécessaires à la quantification en GC-MS sont ajoutés à la suspension

cellulaire, à raison de 300 pg par µL finaux injectés en GC-MS, de PGE2 deutérée, de PGD2

deutérée, de PGF2α deutérée et de 6-céto-PGF1α deutérée, plus l’acétate d’éthyle (AE). Les

prostaglandines sont extraites de la suspension cellulaire avec AE à raison de 5 mL par mL de

suspension. Le mélange cellules-AE est agité puis centrifugé à 750 g pendant 10 min à température

ambiante. La phase organique supérieure est alors récupérée et la phase aqueuse restante est

réextraite 2 fois comme précédemment.

III.2.11.2 Séparation des prostaglandines par chromatographie en

couche mince (CCM)

Une fois regroupée, les phases organiques sont évaporées à sec sous azote avant d’être

reprises dans 250µL d’AE pour être déposées sur une plaque de silice de chromatographie en

couche mince (CCM) préalablement lavée au méthanol. Les standards de migration sont déposés

simultanément à raison de 4 µg pour chaque prostaglandine étudiée (PGD2, PGE2, PGF2α et 6-céto-

PGF1α), sur le bord de la plaque de silice. La migration, a lieu dans un mélange de solvants :

diéthyléther / hexane / méthanol 50:40:15 (v/v/v). La révélation des standards de migration se fait

par vaporisation de molybdate puis chauffage à 50°C. Les standards de migration apparaissent ainsi

sous la forme de tâches bleues sur la plaque. La zone de silice correspondant au dépôt et située à la

même hauteur que le standard de migration plus 1 cm au dessus et au dessous est récupérée par

grattage. La silice est réhydratée par 2mL d’AE afin d’extraire les prostaglandines de la silice.

L’échantillon est centrifugé à 650 g pendant 5 min à température ambiante. La phase organique

supérieure est récupérée dans un tube conique L’extraction est répétée trois fois. Les phases

organiques sont rassemblées et évaporées à sec.

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III.2.11.3 Dérivation chimique des prostaglandines : E2, D2, F2α et 6-

céto-PGF1α

Ces prostaglandines subissent trois dérivations successives : 1) une dérivation de leur

groupement carbonyle (C=O); 2) une dérivation de leur fonction carboxylique (COOH) ; et 3) une

silylation de leur groupement hydroxyle (OH) au TMS.

Pour la dérivation du groupement C=O, les échantillons secs sont incubés 45 min à

température ambiante avec 300 µL de méthoxylamine hydrochloride (MOX) à 3% dans l’eau et 75

µL d’acétonitrile. Pour extraire, on ajoute 1 mL d’AE, puis on agite vigoureusement chaque

échantillon avant d’éliminer la phase aqueuse inférieure. La phase organique restante est ensuite

évaporée à sec. Pour la dérivation de la fonction COOH, les échantillons secs sont incubés avec 60

µL d’acétonitrile, 20 µL de pentafluorobenzylbromide (PFB), à 35% dans l’acétonitrile et 20 µL de

N-éthyl diisopropylamine (DIPE), qui permet de capter les protons formés par la réaction. La

réaction a lieu pendant 30 min entre 38°C et 40°C. Enfin, la silylation des groupements OH, les

échantillons sont incubés pendant 60 min à 60°C en présence de 8 µL de N,N-dimethylformamide

(DMF) et 20 µL de N,O-bis(trimethyl)trifuorocetamide (BSTFA). Les échantillons sont évaporés à

sec et repris dans 50 µL de mélange hexane (pur et anhydre) /BSTFA 9:1 (v:v) et vigoureusement

agités avant d’être transvasés dans des tubes spécifiques pour l’injection en GC-MS.

III.2.11.4 Analyse des prostaglandines par GC-MS

Les échantillons de prostaglandines sont analysés en GC-MS en introduisant 1 µL dans un

injecteur split-splitless. La colonne capillaire HP-5MS utilisée a une longueur de 30 m et un

diamètre de 0,25 mm. Elle est recouverte d’un film de phase stationnaire apolaire (phényl méthyl

siloxane) de 0,25 µm d’épaisseur. Le gaz vecteur utilisé est l’hélium avec un débit de 1 mL/min.

Les injections sont réalisées à 260°C, la température du four étant maintenue à 57°C pendant 2

minutes puis elle augmente jusqu’à 180°C à raison de 20°C/min et jusqu’à 280°C à raison de

4°C/min. Cette température est maintenue constante pendant 15 minutes.

La température de la zone de transfert entre la GC et la MS, la température à la source de la

MS, et celle du quadripôle sont respectivement fixées à 280°C, 150°C et 106°C. Les

prostaglandines sont analysées en mode de sélection d’ion (SIM) qui permet de collecter les ions

d’intérêt : m/z 524.2 et 528.2; m/z 569.2 et 573.2 ; et m/z 614.2 et 618.2 formés au cours de

l’ionisation chimique négative.

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III.2.11.5 Chromatographie en phase gazeuse (GC)

L’échantillon est injecté à travers un septum à fermeture automatique. La chambre d’injection,

chauffée, vaporise l’échantillon qui est entraîné dans la colonne par un gaz vecteur. Il traverse alors

la colonne de chromatographie en phase gazeuse qui permet de séparer le mélange en ses divers

composants, puis arrive dans le four dont la température permet d’optimiser la résolution des

composés d’un échantillon donné. L’interface entre la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la

spectrométrie de masse (MS) assure le transfert du couple échantillon-gaz vecteur d’une pression

élevée à l’intérieur de la colonne, à une très basse pression dans le spectromètre de masse.

Le système de spectrométrie de masse est placé sous vide car la diminution de la pression

permet d’augmenter la distance entre les molécules et de minimiser le nombre de collisions

intermoléculaires à l’intérieur de la source d’ions. En effet, lorsqu’il traverse la source d’ions,

l’échantillon est soumis à un flux d’électrons, qui casse et ionise les molécules qui la composent.

Les ions produits sont dirigés vers le quadripôle qui sépare les fragments ionisés en fonction de leur

rapport masse/charge. Le système de détection mesure alors la quantité de chaque ion traversant le

quadripôle, dont le signal est amplifié puis enregistré sous forme de spectre de masse.

III.2.11.6 Structure et analyse des prostaglandines

Pour chaque prostaglandine étudiée, le standard interne correspond à la molécule native

marquée au deutérium, et présente une masse de 4 g/mole plus important que la prostaglandine non

marquée (Figure 5). Cette différence engendre une augmentation du rapport masse/charge (m/z),

détectée en spectrométrie de masse, de 4 unités par rapport à la PGD2 et la PGE2 (524.2 contre

528.2), à la PGF2α (569.2 contre 573.2) et à la 6 cétoPGF1α (614.2 contre 618.2) ce qui permet de

les différencier lors de l’analyse en GC-MS.

L’effet isotopique engendre ainsi, pour les molécules deutérées, un temps de rétention en

chromatographie en phase gazeuse plus court que pour les molécules non marquées. Les différentes

prostaglandines sont analysées en mode sélection d’ion SIM qui permet de collecter uniquement les

ions d’intérêt et donc d’augmenter la sensibilité de la méthode. Les signaux de chacun des ions sont

intégrés et la quantité de prostaglandine est calculée à l’aide de la formule : M= (Aire de l’ion de la

prostaglandine deutérée / Aire de l’ion de la prostaglandine non marquée présente dans l’échantillon

dosé) x quantité de standard interne.

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Figure 6 : Structure des prostaglandines analysées. La prostaglandine à gauche et la prostaglandine deuterée à droite (3,4 d4- PG)

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III.2.11.7 Limite de détection du GC-MS

Les limites de détection de chaque molécule au GC-MS à partir de son standard interne est de

10 pg pour la 15dPGJ2 ; 100 fg pour la PGF2α et 500 fg pour la PGD2, PGE2 et pour la 6 cétoPGF1α.

III.2.12 Dosage de la Prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 par GC-MS et

GC-MS-MS.

III.2.12.1 Extraction, séparation, dérivation et l’analyse de la 15dPGJ2

La 15dPGJ2 a été dosée dans l’urine humaine à partir de 5mL, dans des échantillons de tissu

adipeux de 20 mg et dans des cellules 3T3-L1 en culture. Pour l’urine, nous avons ajouté à 5 mL

d’urine du matin, 5 mL du l’acétate d’éthyle par mL d’échantillon puis le standard interne, la

15dPGJ2.d4 (200 pg par µL final injecté). Les adipocytes 3T3-L1 sont initialement traités comme

décrit dans le paragraphe III.2.11.1.. Ensuite, on ajoute le standard interne, la 15dPGJ2.d4 (200 pg

par µL finaux injecté), et 5 mL d’AE par mL d’échantillon. Le mélange cellules-AE ou urine-AE

est agité puis centrifugé à 750 g pendant 10 min à température ambiante. La phase organique

supérieure est alors récupérée et la phase aqueuse restante est réextraite 2 fois comme

précédemment. Les phases organiques sont réunies et évaporées, ensuite les prostaglandines sont

séparées par chromatographie en couche mince, comme décrit dans le paragraphe III.2.11.2. Le

standard de migration pour la séparation de la 15dPGJ2 en CCM, est de 4 µg de 15dPGJ2 par

plaque. La fonction COOH de la 15dPGJ2 est dérivée au PFB. Pour cela, les échantillons secs sont

incubés avec 60 µL d’acétonitrile, 20 µL de PFB, à 35% dans l’acétonitrile et 20 µL de DIPE. La

réaction a lieu pendant 30 min entre 38°C et 40°C. Les échantillons sont évaporés à sec et repris

dans 50 µL de mélange hexane (pur et anhydre)/BSTFA 9:1 (v:v) et vigoureusement agités avant

d’être transvasés dans des tubes spécifiques pour l’injection en GC-MS ou GC-MS-MS.

Les échantillons de 15dPGJ2 sont analysés par GC-MS, selon les même principe présenté dans

le paragraphe III.2.11.4. La 15dPGJ2.d4 est la molécule deutérée qui présente une masse moléculaire

de 4 g/mole de plus que la 15dPGJ2 native. Cette différence engendre un rapport de la masse sur la

charge (m/z) détecté en spectrométrie de masse plus grand de 4 unités par rapport à la 15dPGJ2

(319.2 contre 315.2) ce qui permet de les différencier. L’effet isotopique engendre un temps de

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rétention en chromatographie gazeuse pour la 15dPGJ2 deutérée plus court d’environ sept centièmes

de minutes (35.55 min contre 35.62 min) par rapport à la 15dPGJ2. Les signaux de chacun des ions

sont intégrés et la quantité de prostaglandine est calculée à l’aide de la formule : M= (aire de l’ion

de la prostaglandine deutérée / aire de l’ion de la prostaglandine non marquée présent dans du

échantillon dosé) x quantité de standard interne.

a)15dPGJ2 :

b) 15dPGJ2-PFB (molécule dérivée) :

c) Standard interne 15dPGJ2 deutérée et dérivée :

Figure 7 : Structure de la 15dPGJ2 et derivée. La 15dPGJ2 et dérivée et la réaction avec le pentafluorobenzylbromide (PFB).

O

C

O

OH

C

O

CH2O

F

FF

F

F

O

D D

DDC

O

CH 2O

F

FF

F

F

O

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III.2.12.2 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS

La chromatographie en tandem se caractérise par rapport à la GC-MS par le fait que les

fragments de molécules obtenus en soumettant la molécule d’intérêt à un champ d’électrons, au lieu

d’être analysé sont de nouveau soumis à un champ d’électron qui va les casser en fragments plus

petits, plus nombreux, ceci permet de mieux caractériser la molécule d’intérêt.

III.2.13 Liaison covalente de la prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 et son

récepteur nucléaire le peroxisome proliferator-activated receptor-

gamma (PPARgamma)

III.2.13.1 Incubation de la 15dPGJ2 avec PPARgamma

La 15dPGJ2 dissoute dans l’AE est icubée avec le PPARγ-LBD (ligand-binding domain) (0,06

nmol) préparé dans un tampon pH 7,9 contenant KCl 100 mM, Tris-HCL 20 mM, mercaptoéthanol

0,2 mM EDTA, et du glycérol. La réaction a lieu pendant 60 min à 37°C. Le ratio entre 15dPGJ2 et

PPAR-LBD est 2,5/1.

III.2.13.2 Extraction et analyse au GC-MS

La 15dPGJ2.d4 est extraite du mélange 15dPGJ2/PPAR-LBD, en ajoutant 500 µL d’AE et 100

µL d’eau ultra pure. On agite puis on centrifuge à 750 g pendant 10 min à température ambiante. La

phase organique supérieure est alors récupérée et la phase aqueuse restante est réextraite 2 fois

comme précédemment. Ensuite, la fonction COOH de la 15dPGJ2 est dérivée au PFB. Pour cela, les

échantillons secs sont incubés avec 60 µL d’acétonitrile, 20 µL de PFB, à 35% dans l’acétonitrile et

20 µL de DIPE. La réaction a lieu pendant 30 min entre 38°C et 40°C. Les échantillons sont

évaporés à sec et repris dans 40 µL du l’hexane (pur et anhydre), vigoureusement agités avant d’être

transvasés dans des tubes spécifiques pour l’injection en GC-MS

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III.2.13.3 Analyse de binding radioligand

Les essais de binding avec du PPAR-GST (glutathion S-transferase), ont été réalisés selon les

conditions décrites par Dang et al., (2003) et adaptées pour les analyses de cinétique de dissociation.

Le PPAR-GST a été incubé à 4°C pendant 90 min avec la 15dPGJ2 ou d’autre ligands dans 100 µL

du tampon de binding, pH 8,2 contenant Tris 10 mM, KCl 50 mM et DTT 1 mM. Les échantillons

ont ensuite été centrifugés pendant 5 minutes à 4000 g. Le surnageant a été enlevé et le culot repris

avec le même volume de tampon de binding, auquel a été ajouté la rosiglitazone [3H] 12 nM. La

quantité de membrane utilisée par essai était de 32 µg de protéines. Après l’incubation les

échantillons ont été filtrés avec un système Filtermate GF/B (Packard). L’inclusion a été rincée

trois fois avec 2 mL du tampon de filtration à pH 7,4 et Tris 50 mM. Ensuite 30 µL/puits de la

solution de scintillation (Microscint 20, Packard) ont été ajoutés. La radioactivité a été mesurée au

compteur à scintillation β (Top-Count NXT, Packard). Les échantillons témoins ne contenaient ni

15dPGJ2 ni aucun autre ligand au départ, l’incubation finale était faite en présence de rosiglitazone

[3H] (100% du binding total) ou avec addition de rosiglitazone à 10-5 M (0%, binding non-

spécifique). Les constantes d’inhibition (Ki) ont été déterminées comme décrit par (Dang et al.,

2003). Les résultats ont été rapportés au pourcentage des valeurs témoins.

III.2.13.4 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass

spectrometry (MALDI-TOF MS)

L’analyse MALDI-TOF est une technique couplant l’électrophorèse bidimensionnelle à la

sensibilité et à la précision de la spectrométrie de masse. La molécule repérée sur un gel

d'électrophorèse bidimensionnelle après coloration à l'argent, est digérée par la trypsine à l'intérieur

même du gel de polyacrylamide. Le spectromètre de masse utilisé est un MALDI-TOF

(Applied Biosystems Applera Voyager STR MALDI-TOF). Le GST-LDB de PPARgamma a été

préparé selon Ferry et al., (2001). Cinq µM de GST-LDB ont été incubé avec ou sans 100 µM de la

15dPGJ2 à 4°C pendant 90 min dans un tampon de binding. Après l’incubation, la digestion a été

réalisée avec 20 µL de la trypsine [0,025 µg/µL] dans du tampon NH4HCO3 50mM à 37°C pendant

90 minutes. Les peptides ont été analysés par MALDI-TOF MS.

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70

III.2.14 Analyse statistique

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne +/- SEM. La significativité a été calculée

au seuil de p<0,05 par une analyse de variance ANOVA suivie d’un test post-hoc Fisher protected

least-significant difference (plsd), à l’aide d’un logiciel Statview pour MacIntosh.

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71

IV RESULTATS

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72

IV.1 Cellules

IV.1.1 Effet du stress oxydant sur les adipocytes

Nous avons choisi comme stress oxydant d’utiliser la glucose oxydase car cet enzyme produit

en permanence du peroxyde d’hydrogène. Ceci nous est apparu comme une méthode beaucoup plus

physiologique que d’ajouter aux cellules une concentration forte mais éphémère de peroxyde

d’hydrogène. L’utilisation de la glucose oxydase a nécessité quelques expérimentations contrôles,

comme par exemple la mesure de la concentration en glucose. En effet, la glucose oxydase

produisant du peroxyde d’hydrogène à partir de la transformation du glucose, il était indispensable

de s’assurer que la concentration en glucose du milieu de culture restait dans des limites

compatibles avec la culture des cellules.

IV.1.2 Effet de la glucose oxydase sur la dégradation du glucose

La glucose oxydase diminue la concentration du glucose présent dans le milieu de culture en

l’oxydant. La diminution de la concentration de glucose est proportionnelle à la concentration en

glucose oxydase. A partir de 25 mU/mL de glucose oxydase, la concentration du glucose chute

rapidement, mais il reste encore du glucose à 16 heures d’incubation quelque soit la concentration

utilisée (Figure 8). Pour les plus fortes concentrations (50 et 100 mU/mL), il reste environ 2 mM de

glucose, après 16 heures d’incubation.

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73

0

1

2

3

4

5

6

7

0 4 8 12 16

Temps d'incubation (heures)

Glu

cose

(mM

)

0

1

5

12,5

25

50

100

abcd

e

ff

Figure 8 : Dosage du glucose dans le milieu de culture des adipocytes 3T3-L1 incubés avec des

concentrations croissantes de glucose oxydase.

L’analyse statistique montre que l’effet de la glucose oxydase sur la dégradation du glucose est

significatif à partir de 1 mU/mL de glucose oxydase. Il n’y a pas de différence significative entre les

concentrations 50 et 100 mU/mL de glucose oxydase.

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74

IV.1.3 Effet de la glucose oxydase sur la production du peroxyde

d’hydrogène :

L’action de la glucose oxydase sur le glucose permet de générer du peroxyde d’hydrogène, qui

atteint des concentrations significatives à partir de 5 mU/mL de glucose oxydase. A 25 mU/mL la

concentration en H2O2 au bout de 30 minutes d’incubation est d’environ 30µM. (Figure 9). Figure 9 : Dosage du peroxyde d'hydrogène dans le milieu de 3T3-L1 après 30 minutes en

présence de concentrations croissantes de glucose oxydase.

Une étoile indique une différence significative (p<0,05) par rapport au témoin.

IV.1.4 Chromatogramme du 4-HNE en GC-MS après dérivation au PFB-

TMS

Après dérivation du PFB-TMS, le 4-HNE apparaît sous forme de deux pics, élués vers 13

minutes qui correspondent aux isomères syn et anti (Figure 10A). La surface de deux pics est

prise en compte pour la quantification.

Des isomères identiques sont produits à partir du standard interne de 4-HNE deutéré

(Figure 10B).

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 20 40 60 80 100

Glucose oxydase (mU/mL)

Pero

xyde

d'h

ydro

gène

(µM

)

***

**

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75

Figure 10 : Chromatogramme du 4-HNE par GC-MS après dérivation au PFB-TMS. Deux

pics apparaissent correspondant aux isomères syn et anti.

(A) Les pics élués à 13.07 et 13.35 correspondent au 4-HNE produit à partir de l’incubation des

adipocytes 3T3-L1 avec la glucose oxydase. (B) Les pics élués à 13.05 et 13.33 correspondent

au 4-HNE-CD3 utilisé comme standard interne.

IV.1.5 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la

production du 4-HNE dans les adipocytes 3T3-L1 :

La glucose oxydase engendre une production de 4-HNE par les cellules. Après 16 heures

d’incubation, la concentration en 4-HNE a été dosée par GC-MS dans les 3T3-L1 incubées avec

différentes concentrations de glucose oxydase (Figure 11). La production de 4-HNE est

significativement augmentée à partir de 12,5 mU/mL de glucose oxydase. La glucose oxydase

stimule la production de 4-HNE par les cellules. A partir de 12,5 mU/mL, la concentration en 4-

HNE augmente en fonction de la concentration de glucose oxydase.

0

20000300004000050000

Time-->

Abundance

13.07

13.35

11 11 12 12 13 13 14 14 15 15

11 11 12 12 13 13 14 14 15 150

20000300004000050000

Time-->

Abundance

13.05

13.33

A

B

0

20000300004000050000

Time-->

Abundance

13.07

13.35

11 11 12 12 13 13 14 14 15 15

11 11 12 12 13 13 14 14 15 15

11 11 12 12 13 13 14 14 15 15

11 11 12 12 13 13 14 14 15 150

20000300004000050000

Time-->

Abundance

13.05

13.33

A

B

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76

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60 80 100 120

Glucose oxydase (mU/mL)

4-H

NE

(pm

ol/m

g pr

otéi

ne)

* * **

Figure 11 : Production de 4-HNE par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations

croissantes de glucose oxydase pendant 16 heures d’incubation à j17 après le début de la

différenciation.

La concentration en 4-HNE dans les adipocytes 3T3-L1 est augmentée à partir d’une concentration

en GO de 12,5 mU/mL. L’étoile indique une différence significative par rapport au témoin (n=4).

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77

IV.1.6 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la

sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 :

Afin de mesurer les effets du stress oxydant sur les cellules adipeuses, nous avons choisi une

fonction cellulaire directement reliée aux implications du tissu adipeux dans le diabète de type 2.

Nous avons choisi la production d’adiponectine qui est directement impliquée dans la sensibilité à

l’insuline. La sécrétion d’adiponectine est significativement réduite à partir de 25 mU/mL de

glucose oxydase par RIA (Figure 12). Par western blotting, on constate que la sécrétion

d’adiponectine est significativement réduite à partir de 12,5 mU/mL de glucose oxydase (Figure

13).

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120Glucose oxydase (mU/mL)

Adi

pone

ctin

e (n

g/m

g pr

otéi

ne)

* **

Figure 12 : Sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 exposés pendant 16 heures à

des concentrations croissantes de glucose oxydase.

L’adiponectine a été mesurée dans le liquide extracellulaire. Les résultats sont exprimés sous

forme de moyenne ± SEM (n=4). Une étoile indique une différence significative au seuil de

p<0,05.

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78

0

25

50

75

100

125

0 1 5 12,5 25 50 100Glucose oxydase (mU/mL)

% c

ontô

le

**

**

Figure 13 : Sécrétion d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 en culture. L’adiponectine a

été mesurée par western blotting.

Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage par rapport aux témoins. On observe une

diminution significative de la production d’adiponectine à partir de 5mU/mL de glucose oxydase.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± déviation standard (n=3 à 5). Une étoile

indique une différence significative au seuil de p<0,05.

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79

IV.1.7 Comptage des adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations

croissantes de glucose oxydase par fluorescence CyQuant.

Afin de nous assurer que la diminution de la production d’adiponectine n’est pas causée en

partie par une mort cellulaire induite par un stress oxydant excessif, nous avons entrepris de

compter les cellules en réponse au stress oxydant (Figure 14).

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

Glucose oxydase (mU/mL)

Nom

bre

de c

ellu

les

(% d

u co

ntrô

le)

Figure 14 : Quantification du nombre de cellules en présence de concentrations croissantes de

glucose oxydase.

Les cellules ont été quantifiées en utilisant le marqueur CyQuant. Les mesures de fluorescence

ont été réalisées à l’aide d’un lecteur de plaque à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et

d’émission de 538 nm. Les résultats sont exprimés sous forme de % des valeurs mesurées dans

les conditions témoins (n=3). Le seuil de significativité statistique était de p<0,05.

IV.1.8 Effet de la glucose oxydase et de la catalase sur la production

d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.

Afin de vérifier que la diminution de la sécrétion d’adiponectine est bien causée par le

peroxyde d’hydrogène et non par un sous produit de la réaction causée par la glucose oxydase, ou

par un contaminant présent avec celle-ci, nous avons incubé des cellules 3T3-L1 en présence de

glucose oxydase et de catalase qui dégrade le peroxyde d’hydrogène. Dans ces conditions, nous

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80

observons que la production d’adiponectine est totalement restaurée en présence de catalase

(Figure 15). Cette expérience montre que seul le peroxyde d’hydrogène induit la diminution de la

production d’adiponectine.

50

60

70

80

90

100

0 GO 50 mU/mL GO 50 mU+Cat50U/mL

Adi

pone

ctin

e (n

g/m

g pr

otéi

ne)

*

Figure 15 : Effets de la glucose oxydase et de la glucose oxydase plus catalase sur la sécrétion

d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.

La diminution de la production d’adiponectine provoquée par l’addition de glucose oxydase est

totalement inhibée par l’addition de catalase qui dégrade le peroxyde d’hydrogène. L’étoile

indique une différence significative au seuil de p<0,05.

IV.1.9 Effet de la glucose oxydase dénaturée sur la production

d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.

Une autre façon de tester la spécificité des effets du peroxyde d’hydrogène est d’incuber

les cellules avec de la glucose oxydase dénaturée. Dans ces conditions on ne devrait observer

aucun effet sur la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. C’est en effet ce qui est

observé (Figure 16). Cette expérience montre qu’aucun composé autre que le peroxyde

d’hydrogène n’altère la sécrétion d’adiponectine, ce qui aurait pu être le cas d’impureté présentes

avec la glucose oxydase.

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81

50

60

70

80

90

100

0 GO 50 mU/mL GO 50 mU/mLdenaturée

Adi

pone

ctin

e (n

g/m

g pr

otei

ne)

*

Figure 16: Effet de la glucose oxydase et de la glucose oxydase dénaturée sur la production

d’adiponectine par les cellules 3T3-L1, à j17 après la différenciation.

La glucose oxydase intacte diminue très significativement la sécrétion d’adiponectine, alors

qu’une fois dénaturée la glucose oxydase n’a aucune influence (n=6). L’étoile indique une

différence significative au seuil de p<0,05.

IV.1.10 Effet du 4-HNE sur la production d’adiponectine par les

adipocytes 3T3-L1.

Nous avons vu précédemment que le stress oxydant généré par la glucose oxydase

augmente la production de 4-HNE dans les adipocytes. Il n’y a en cela rien de très

révolutionnaire car il est connu que le 4-HNE est produit par peroxydation lipidique à partir des

acides gras polyinsaturés n-6. Cet aldéhyde est par ailleurs connu pour sa forte réactivité qui en

fait un médiateur du stress oxydant impliqué dans de nombreuses pathologies (Poli et Schaur,

2000; Parola et al., 1999). Nous avons testé les effets du 4-HNE, avec l’idée qu’il pourrait être un

intermédiaire important dans la diminution de la production d’adiponectine. En effet, la Figure

17 montre que la production d’adiponectine diminue à l’exposition de 4-HNE. Cette diminution

n’est observée que pour les concentrations les plus élevées : 25 et 50 µM.

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82

50

60

70

80

90

100

0 0.1 1 10 25 50

4-HNE (µM)

Adi

pone

ctin

e (n

g/m

g pr

otéi

ne)

**

Figure 17 : Production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 exposés à des concentrations

croissantes de 4-HNE pendant 16 heures.

On observe un effet inhibiteur du 4-HNE aux concentrations les plus élevées sur la production

d’adiponectine. L’étoile indique une différence significative au seuil de p<0,05, (n=6).

Ces résultats sont renforcés par l’observation d’une corrélation négative très significative

entre la quantité d’adiponectine produite par les adipocytes 3T3-L1 soumis à des concentrations

croissantes de glucose oxydase et la concentration en 4-HNE dans ces mêmes cellules (Figure

18).

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83

y = -0,1603x + 15,915R2 = 0,8579

0

2

4

6

8

10

45 50 55 60 65 70 75

Adiponectine (ng/mg protéine)

4-H

NE

(pm

ol/m

g P

roté

ine)

Figure 18 : Corrélation entre la production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 soumis

à des concentrations croissantes de glucose oxydase et la concentration intracellulaire en 4-

HNE.

On observe une corrélation négative très significative (r=0.9262, p<0,05). Les résultats sont

exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4).

IV.1.11 Expression des ARNm codant l’adiponectine par les

adipocytes 3T3-L1 soumises à un stress oxydant.

Un stress oxydant diminue la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. Nous

avons recherché si cette baisse de la sécrétion d’adiponectine est due à une diminution de la

synthèse d’ARNm codant l’adiponectine. Les ARNm codant l’adiponectine ont été mis en

évidence par RT-PCR. La Figure 19A représente un exemple représentatif de produits de PCR

séparés sur gel d’agarose. Les valeurs obtenues pour l’adiponectine sont normalisées par rapport

à celles obtenues pour la béta-actine. La Figure 19B montre la quantification moyenne à partir de

trois expériences indépendantes. On observe une diminution significative de la production

d’ARNm codant l’adiponectine en réponse à la plus petite concentration de glucose oxydase à

laquelle les cellules ont été exposées (1mU/mL).

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84

A

B

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100 120Glucose oxydase (mU/mL)

Ratio

Adip

onec

tine

/ Act

ine

**

* **

*0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Figure 19 : Inhibition de l’expression des ARNm codant l’adiponectine dans les adipocytes

3T3-L1 exposés à des concentrations croissantes de glucose oxydase.

(A) Gel d’électrophorèse des produits de RT-PCR. (B) Analyse densitométrique des bandes

correspondant aux ARNm codant l’adiponectine. Les ARNms codant pour l’adiponectine ont été

normalisés par rapport à ceux de la béta-actine. Les résultats sont exprimés sous forme de

moyenne ± SEM (n=3). L’étoile indique une différence significative au seuil de p<0,05.

0 1 5 12.5 25 50 100GO (mU/mL)

Β-Actine

Adiponectine

0 1 5 12.5 25 50 100GO (mU/mL)

Β-Actine

Adiponectine

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85

IV.1.12 Evolution de la concentration cellulaire en prostaglandines dans

les adipocytes 3T3-L1 en réponse à des concentrations croissantes

de glucose oxydase.

Précédemment nous avons vu que le stress oxydant généré par la glucose oxydase

augmente la production de 4-HNE dans les adipocytes. Notre équipe a démontré aussi que ce

stress augmente l’expression de la COX2, pour cela nous avons mesuré la concentration cellulaire

en prostaglandines clés dont la synthèse dépend des COX. Nos résultats montrent que la synthèse

de PGE2 dans les adipocytes 3T3-L1 ne change pas en réponse au stress oxydant (Figure 20).

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Témoin 5mU/mL 25mU/mL

Glucose Oxydase

PG

E2

(ng/

mg

prot

éine

s)

Figure 20 : Concentrations en prostaglandine E2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la

différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5).

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86

Parallèlement, dans les mêmes échantillons, nous avons mesuré la PGD2. On observe pour

cette prostaglandine une augmentation de la concentration en réponse au stress oxydant. Cette

augmentation est dose dépendante puisque les concentrations mesurées sont significativement

différentes en présence de 5 et 25mU/mL de GO (Figure 21).

Figure 21: Concentrations en prostaglandine D2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la

différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Témoin 5mU/mL 25mU/mL

Glucose Oxydase

PG

D2

(n

g/m

g p

roté

ine

s)

a

b

c

a

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87

La Figure 22 représente la concentration en PGF2α dans des cellules non traitées et des

cellules exposées à deux concentrations de GO. On observe une augmentation de la concentration

en PGF2α en réponse à l’exposition à la GO. Cette augmentation est importante car elle

représente prés de 50% de celle des témoins en réponse à la concentration de GO la plus élevée.

Figure 22: Concentrations en prostaglandine F2α dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la

différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

Témoin 5mU/mL 25mU/mL

Glucose Oxydase

PGF2

alph

a (n

g/m

g pr

otéi

nes)

ab

c

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88

La Figure 23 montre qu’il n’y a aucun effet du stress oxydant sur la production de 6 céto-

PGF1α par les adipocytes 3T3-L1.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Témoin 5mU/mL 25mU/mL

Glucose Oxydase

6 cé

to P

GF1

alph

a (n

g/m

g pr

otéi

nes)

Figure 23: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la

différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5).

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89

IV.1.13 Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au 4-HNE.

Le 4-HNE est connu pour réagir avec l’acide lipoïque, un cofacteur essentiel au

fonctionnement de l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase et de la pyruvate déshydrogénase

(Humphries et al., 1998; Humphries et Sweda, 1998). Pour cette raison nous avons examiné la

production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au stress oxydant et à une

supplémentation avec de l’acide lipoïque. Les résultats montrent que le stress oxydant augmente

la production de lactate alors que la supplémentation en acide lipoïque renverse partiellement cet

effet (Figure 24). L’exposition des adipocytes à des concentrations croissantes de 4-HNE pendant

seulement deux heures stimule la production de lactate par les cellules 3T3-L1.

0

100

200

300

400

500

600

Control GO GO + lipoate

Prod

uctio

n d

e La

ctat

e (µ

M/h

eure

) a b c

Figure 24 : Production basale de lactate par les adipocytes 3T3-L1, effet d’un stress oxydant

(100mU/mL) sur la production de lactate et d’une supplémentation en acide lipoïque (10-4M),

pendant deux heures.

Les résultats montrent que le stress oxydant augmente la production de lactate par les adipocytes.

Cet effet est partiellement corrigé par l’addition d’acide lipoïque. Les résultats sont exprimés sous

forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettes différentes indiquent des différences significatives au

seuil de p<0,05.

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90

0

50

100

150

200

250

1 2 3 4

4-HNE concentration -log[M]

Prod

uctio

n de

Lac

tate

(µM

/heu

re)

control 6 5 4

cbcaba

Figure 25: Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations

croissantes de 4-HNE pendant 2 heures.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettes différentes indiquent

des différences significatives au seuil de p<0,05.

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91

IV.2 Animal

Une part importante de notre travail expérimental a porté sur la mise en évidence du rôle de

la 15dPGJ2 dans la différenciation adipocytaire. Notre hypothèse était que cette prostaglandine,

décrite comme le ligand endogène le plus efficace de PPARgamma, pourrait jouer le rôle de

facteur de différenciation des cellules souches en adipocytes. Pour tester cette hypothèse nous

avons utilisé les rats Lou C qui présentent la caractéristique de rester très maigre au cours de leur

existence, à la différence des rats Wistar qui sont généralement utilisés comme animaux témoins

bien qu’ils présentent une adiposité sans cesse croissante au cours de leur vie, jusqu’à en faire

des animaux obèses (Newby et al., 1990).

IV.2.1 Production des prostaglandines PGF2α, PGD2, PGE2, 6 Céto PGF1α et 15dPGJ2 dans les tissus adipeux épididymal et rétropéritonéal chez le rat Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Nous avons étudié des rats Lou C et Wistar de 4 et 8 semaines, chez lesquels nous avons

mesuré les concentrations en différentes prostaglandines. La figure 26 montre qu’il n’y a pas de

différence significative dans les concentrations de PGF2α entre les tissus adipeux épididymaux de

rats Lou C et de Wistar, chez les animaux de même âge. Mais on observe une réduction

significative de la synthèse de cette même prostaglandine chez les rats Wistar âgés.

La Figure 27 montre qu’il n’y a pas de différence significative, entre les concentrations de

PGF2α dans les tissus adipeux rétropéritonéaux de rats Lou C et Wistar âgés de 4 semaines. Par

contre, la concentration en PGF2α diminue chez les animaux âgés de 8 semaines comparés à ceux

de 4 semaines.

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92

PGF2 alfa Epididydimal

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Age en semaines

PGF2

alfa

(ng/

mg

tissu

) Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

aab

abb

Figure 26 : Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux épididymal de rats

Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

PGF2 alfa Rétropéritonéal

0

1

2

3

4

5

1 2Age en semaines

PGF2

alfa

(ng/

mg

tissu

)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

b

b

a a

Figure 27: Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats

Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

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93

La concentration en PGD2 n’est pas différente dans les tissus épididymaux de rats Lou C et

Wistar de même âge. Par contre on observe une différence entre les âges 4 et 8 semaines (Figure

28) chez le rat Wistar seulement. Aucune différence n’existe entre les concentrations en PGD2

dans le tissu rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar de même âge. Par contre on observe une

augmentation entre les âges 4 et 8 semaines (Figure 29) chez le rat Wistar seulement.

PGD2 Epididymal

0

1

2

3

4

5

6

1 2Age en semaines

PGD2

(ng/

mg

tissu

)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

aba

b b

Figure 28: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou

C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

PGD2 Rétropéritonéal

0

1

2

3

4

5

6

1 2Age en semaines

PGD2

(ng/

mg

tissu

)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

ab

b

bb

Figure 29: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats

Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

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94

La Figure 30 montre qu’il n’y a aucune différence significative entre les concentrations de

PGE2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe par

contre une forte augmentation de la concentration tissulaire en PGE2 chez les animaux de 8

semaines. Aucune différence significative n’existe entre les concentrations de PGE2 dans le tissu

adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe par contre une forte

augmentation de la concentration tissulaire en PGE2 chez les animaux de 8 semaines (Figure 31).

PGE2 Epididymal

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

1 2Age en semaines

PGE2

(ng/

mg

tissu

)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

a a

b b

Figure 30: Concentrations en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou

C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sou forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes indiquent

des différences significatives au seuil de p<0,05.

PGE2 Rétropéritonéal

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2Age en semaines

PGE2

(ng/

mg

tissu

)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

aa

b b

Figure 31: Concentrations tissulaires en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux

rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sou forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes indiquent

des différences significatives au seuil de p<0,05.

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95

Il n’y a pas de différences entre les concentrations en 6-céto-PGF1α dans le tissu

épididymal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe une forte augmentation entre les

animaux de 4 et 8 semaines (Figure 32). Il n’y a pas de différences entre les concentrations en 6

céto-PGF1α dans le tissu rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe une

forte augmentation entre les animaux de 4 et 8 semaines (Figure 33)

6-céto PGF1 alfa Epididymal

0

1,5

3

4,5

6

7,5

9

1 2Age en semaines

6 Cét

o PG

F1 al

fa (n

g/m

g tis

su)

Lou CWistar

4-5 semaines 8 semaines

a a

b b

Figure 32: Concentrations en 6 céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux épididymal de

rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

6-céto PGF1 alfa Rétropéritonéal

0

1,5

3

4,5

6

7,5

9

1 2Age en semaines

6 Cét

o PG

F1 al

fa (n

g/m

g tis

su)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

a a

bb

Figure 33: Concentrations en 6 céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux rétropéritonéal

de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes

indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.

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96

La Figure 34 montre qu’il n’y a pas de différence significative entre les concentrations en

15dPGJ2, dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar de même âge. La

concentration tissulaire en 15dPGJ2 a tendance à augmenter chez les rats Lou C en fonction de

l’âge alors qu’elle tend à diminuer chez les rats Wistar. Les mêmes différences s’observent dans

le tissu adipeux rétropéritonéal (Figure 35), que dans le tissu épididymal, les différences ne sont

cependant pas significatives.

15dPGJ2 Epididymal

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2Age en semaines

15dP

GJ2

(ng/

mg

tissu

)

Lou C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

Figure 34: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14 prostaglandine J2 dans le tissu adipeux

épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4).

15dPGJ2 Rétropéritonéal

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2Age en semaines

15dP

GJ2

(ng/

mg

tissu

)

LOU C

Wistar

4-5 semaines 8 semaines

Figure 35: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14-prostaglandine J2 dans le tissu adipeux

rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.

Les résultats sont exprimés sous formes de moyenne ± SEM (n=4).

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97

IV.2.2 Dosage de la prostaglandine 15dPGJ2 dans l’urine de rat Lou C âgés de 4 et 8 semaines.

La Figure 36 montre qu’il n’existe aucune différence entre les concentrations de 15dPGJ2

d’urines provenant des rats Lou C et Wistar de mêmes âges. Par contre on observe une très forte

diminution de la concentration en 15dPGJ2 en fonction de l’âge chez les deux souches de rats.

Figure 36: Concentrations urinaires en 15dPGJ2 de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8

semaines.

Les résultats sont exprimés sous formes de moyenne ± SEM (n=4). L’étoile indique une

différence significative au seuil de p<0,05 par rapport aux aux animaux âgés de 4 semaines.

Concentration urinaire en 15dPGJ2

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

4 semaines 8 semainesAges en semaines

15dP

GJ2 (

ng/m

molcr

éatin

ine)

Lou CWistar

**

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98

IV.3 Etudes in vitro

IV.3.1 Prostaglandine 15d PGJ2 et liaison covalente

Nous avons dans un premier temps dosé la quantité de la 15dPGJ2 libre (nmoles) après

l’incubation avec son récepteur nucléaire, le PPARgamma.

Tableau 1 : Prostaglandine deoxy-delta12,14-J2 libre dosée par GC-MS. Les valeurs sont

exprimés en moyenne ± SEM.

15dPGJ2 + PPARγ Sans incubation

(n=10)

15dPGJ2 + PPARγ Avec incubation

(n=10)

0,151 ±0,01

0,111 ±0,03 *

*P<0,05

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99

IV.3.2 Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma

Au cours de ces expérimentations, PPARgamma a été incubé en présence de différentes

concentrations de 15dPGJ2. Dans ces conditions, on observe après lavage que la fixation

postérieure de rosiglitazone est d’autant plus faible que la concentration de 15dPGJ2 était élevée

lors de la pré incubation. Ces résultats suggèrent que la 15dPGJ2 se fixe de façon irréversible sur

le domaine de liaison du PPARgamma, empêchant la rosiglitazone de se fixer ultérieurement, car

les domaines de fixation sont déjà occupés par la 15dPGJ2. De façon très intéressante, on observe

que la constante d’inhibition de la fixation de 15dPGJ2 sur PPARgamma n’est pas modifiée par

l’addition de rosiglitazone après la pré-incubation, lorsque celle-ci est remplacée par un lavage.

Figure 37: Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma après pré-incubation avec différentes

concentrations de 15dPGJ2 et lavage.

Gauche: PPARgamma a été pré-incubé pendant 90 min avec de la 15dPGJ2 à 10-8M (triangles),

10-7M (cercles), 10-6M (carrés) or 10-5M (triangles inversés). Droite: représentation logarythmique

de la liaison. La prostaglandine non fixée a été éliminée par centrifugation et les sites de fixation

inoccupés ont été mesurés par la [3H]-Rosiglitazone. L’évolution temporelle indique que la fixation

de la rosiglitazone sur PPARgamma après élimination de l’excès de prostaglandine, est rapide et

dépendante de la concentration initiale en 15dPGJ2. Droite Les valeurs finales de la constante de

dissociation de la [3H]-Rosiglitazone sont reportées selon la concentration initiale de 15dPGJ2

concentration. Dans ces conditions, la constante de dissociation est Ki = 453nM, ce qui est

comparable à celle trouvée par une méthode de fixation classique (Ki = 470 nM).

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

20

40

60

80

100

120

140

Time (min)

boun

d [3 H

]-R

osig

litaz

one

(%)

-8 -7 -6 -5 -40

20

40

60

80

100

120

140

log [15d-PGJ2] (M)

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100

IV.3.3 Cinétique de dissociation de différents agonistes de PPAR

Lorsque PPARgamma est pré incubé en présence de deux agonistes différents (pioglitazone

ou 15dPGJ2), on observe que la rosiglitazone occupe la totalité des sites de fixation de PPAR

malgré la pré-incubation avec la pioglitazone, alors que sa fixation est très réduite après la pré-

incubation avec la 15dPGJ2. Ces résultats suggèrent l’existence d’une liaison irréversible entre la

15dPGJ2 et le PPARgamma.

Figure 38: Cinétique de dissociation de deux ligands de PPARgamma: pioglitazone et 15dPGJ2.

La fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma a été mesurée après pré-incubation du

PPARgamma avec deux agonistes.

Les conditions d’incubation sont identiques à celles de la figure 1. PPARγ a été incubé en présence

de 10-5M de pioglitazone (triangles) ou de 15dPGJ2 à 10-5M (triangles inversés). La constante de

dissociation du 15dPGJ2 sur PPARgamma est très faible, tandis que celle de la pioglitazone est

rapide et complète.

IV.3.4 Analyse de spectrométrie de masse au MALDI-TOF

Puisque ces deux séries d’expériences suggèrent l’existence d’une liaison irréversible entre

15dPGJ2 et PPARgamma, nous avons testé cette hypothèse en recherchant en utilisant la

spectrométrie de masse MALDI-TOF, l’existence d’adduit entre PPARgamma et la 15dPGJ2.

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

25

50

75

100

125

15d-PGJ2 10-5M

Pioglitazone 10-5M

Time (min)

boun

d [3 H

]-Ros

iglit

azon

e (%

)

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101

A

B Figure 39: Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des produits de digestion à la

trypsine d’un fragment du domaine de ligation (Ligand Binding Domain) de PPARgamma

couplé à la GST.

(A) Le fragment de GST-LBD (5µM) a d’abord été incubé en absence, (B) puis en présence de

15dPGJ2 (100µM). Une flèche indique la présence (B) d’un fragment correspondant à l’addition

d’une molécule de 15dPGJ2 par protéine, caractérisé l’ion m/z = 1314,699 (998,481 + 316,203).

699.0 1106.6 1514.2 1921.8 2329.4 2737.0Mass (m/z)

0

1.0E+

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC[BP = 2327.1, 9955]

2327.1272

2200.1120

1509.7424

1984.0093

998.48362329.13531314.6986

699.0 1106.2 1513.4 1920.6 2327.8 2735.0Mass (m/z)

0

6485.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC[BP = 2327.1, 6486]

2327.1213

1983.99811509.7447 2200.10751293.7377

998.4807

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102

La première partie (A) de la Figure 39 représente les fragments de digestion du domaine de

liaison de PPARgamma seul c’est-à-dire en absence de 15dPGJ2, par la trypsine. Dans la seconde

partie (B) de la Figure 39 un nouveau peptide (m/z = 1314,699) apparaît qui correspond à

l’association d’un peptide de rapport m/z= 998,481, présent dans la partie A, plus la masse de la

15dPGJ2 (m/z=316,203). La seule explication possible de la présence de ce nouveau peptide est

qu’il existe une liaison forte entre la 15dPGJ2 et ce fragment issu de la digestion du domaine de

liaison de PPARgamma. Ces dernières expériences démontrent l’existence d’une liaison

covalente entre 15dPGJ2 et PPARgamma. D’une façon très intéressante, la masse du peptide

liant la 15dPGJ2 correspond aux effets de la trypsinolyse et produit la séquence IFQGCQFR qui

contient une cystéine pouvant former un adduit de Michael avec 15dPGJ2.

IV.3.5 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS

Nous avons détecté la 15dPGJ2 par GC-MS-MS. Cette technique est basée sur l’isolement

d’un ion parent [M-181]- (ion m/z 315). L’énergie de cet ion est ensuite augmentée afin d’induire

sa fragmentation par collision avec l’hélium présent dans la source d’ionisation. On observe

alors, dans la Figure 40A un ion fils majoritaire à m/z 271. En parallèle nous avons mesuré l’ion

275 qui est formé à partir de la 15dPGJ2 deuterée utilisée comme standard interne. La Figure 40B

représente les chromatogrammes des ions fils m/z 271 et m/z 275 correspondant respectivement à

la 15dPGJ2 et à la 15dPGJ2 deuterée. Ce chromatogramme montre bien le faible signe de la

15dPGJ2 par rapport à la molécule deuterée et en plus accompagné d’autres signes moins intense.

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103

A

B

Figure 40: Chromatogramme obtenu par GC-MS-MS du standard interne 15dPGJ2 dérivé sous

forme de PFB-TMS.

(A) Le spectre de masse correspond aux ions fils qui résultent de la fragmentation de l’ion parent

m/z 315; l’ion 271 correspond au ion majoritaire pour la 15dPGJ2. (B) Les chromatogrammes des

ions fils m/z 271 et m/z 275 correspond respectivement à la 15dPGJ2 et à la 15dPGJ2 deuterée,

utilisée comme standard interne.

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104

Dans la Figure 41, on observe les chromatogrammes des ions fils majoritaire à m/z 271 et m/z

275 correspondant respectivement à la 15dPGJ2 contenu dans les adipocytes 3T3-L1, et à la

15dPGJ2 deuterée, utilisée comme standard interne Dans ce chromatogramme on constate que le pic

est faible et qu’il se trouve avec d’autres petits pics, ce qui rend difficile la quantification de la

molécule.

Figure 41: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction des

adipocytes et sa dérivation sous forme de PFB-TMS.

Le dosage a été réalisé à partir d’adipocytes 3T3-L1 différenciés à j10.

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105

La Figure 42 montre les chromatogrammes des ions fils majoritaire à m/z 271 et m/z 275

correspondant respectivement à la 15dPGJ2 contenue dans l’urine humaine, et à la 15dPGJ2

deuterée, utilisée comme standard interne Sur la partie supérieure de cette figure (échantillon

biologique), on observe la présence de deux pics aux temps de rétention voisins. Il n’y a pas de

doute que ces deux pics de même masse (271) ne sont pas diférenciés en GC-MS. Dans la partie

inférieure (correspondant aux ions de masse 275), on n’observe qu’un seul pic.

Figure 42: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction de

l’urine humaine et sa dérivation sous forme de PFB-TMS.

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V DISCUSSION

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Pendant des années, les adipocytes ont été considérés comme des cellules ayant une faible

activité métabolique. En effet, ces cellules semblaient seulement capables d’augmenter ou de

réduire leur taille en accord avec leur métabolisme lipidique global, résultant de l’équilibre entre

lipogenèse et lipolyse. Plus récemment, avec l’augmentation de la prévalence de l’obésité dans la

population occidentale, la recherche sur les tissus adipeux a connu un essor important. Parmi les

plus importantes découvertes, il a été montré que les adipocytes produisent de nombreux facteurs de

régulation dont des protéines parmi lesquelles les plus connues sont la leptine et l’adiponectine. Il

est intéressant de noter que ces protéines produites par le tissu adipeux agissent sur des tissus cibles

différents de leur site de production, ce qui correspond à la définition des hormones. Le tissu

adipeux a donc récemment acquis le statut de tissu sécréteur.

En premier lieu, nos résultats montrent que les adipocytes sont des cellules très réactives au

stress oxydant. Une première partie de notre travail expérimental a consisté en la validation du

stress oxydant dans les conditions de la culture cellulaire. Nous avons décidé de privilégier

l’utilisation de la glucose oxydase car elle permet une production régulière, prolongée et

parfaitement quantifiable de peroxyde d’hydrogène. Cette approche nous a semblé très supérieure à

l’addition directe de peroxyde d’hydrogène qui aurait nécessité des concentrations initiales

importantes qui auraient rapidement disparues au cours du temps. La glucose oxydase utilise le

glucose du milieu de culture sans toutefois priver les cellules de ce substrat essentiel (Figure 8). Elle

assure une production de peroxyde d’hydrogène dépendante de sa concentration initiale, ce qui

permet de générer un stress oxydant parfaitement quantifiable (Figure 9). Les effets de ce stress

oxydant ont été objectivés par la production de 4-HNE (Figure 11), un aldéhyde très réactif issu de

l’oxydation des acides gras de la série de n-6 (acides arachidonique et linoléique).

Le plus important résultat de cette étude montre que le stress oxydant diminue la production

d’adiponectine de manière dose-dépendante. Ce résultat a été confirmé peu de temps après notre

publication par Hattori et al., (2005). L’adiponectine est une adipokine produite principalement par

les adipocytes (Pineiro et al., 2005) et circulante dans le sang en concentration élevée.

L’adiponectine est anti-inflammatoire et possède des propriétés athéroprotectives et insulino-

sensibilisante. Sa concentration plasmatique est diminuée chez les patients et les modèles animaux

d’obésité (Arita et al., 1999), de diabète (Hotta et al., 2000) et ceux atteints de maladies cardio-

vasculaires (Kumada et al., 2003). Sachant que l’adiponectine exerce des effets protecteurs des

vaisseaux (Ouchi et al., 2001; Arita et al., 2002; Matsuda et al., 2002; Okamoto et al., 2002; Kubota

et al., 2002), on peut faire l’hypothèse que la diminution de l’adiponectinémie observée chez les

obèses et les diabétiques de type 2, participe aux complications vasculaires fréquentes chez ces

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patients. Nos résultats montrent que le stress oxydant est responsable de la diminution de

production d’adiponectine par les adipocytes. Cette conclusion est confortée par l’augmentation du

stress oxydant observée chez les obèses (Furukawa et al., 2004) et les diabétiques de type 2

(Dandona et al., 2005).

La diminution de la production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au stress

oxydant est confirmée par l’observation que cette diminution se produit également en réponse au 4-

HNE. En effet, une corrélation inverse entre la production de 4-HNE et la sécrétion d’adiponectine

a été trouvée. Nous avons montré que la production de cet aldéhyde très réactif est augmentée en

réponse à la glucose oxydase, ce qui pourrait faire de ce dernier un médiateur du stress oxydant.

Supposant que le volume intracellulaire des adipocytes soit de l’ordre de 8 µL/mg de protéines

(Whitesell et al., 1990), la concentration cellulaire en 4-HNE dans les conditions basales serait de

l’ordre de 0,1 à 1 µM. Selon nos résultats, elle serait presque doublée en réponse à la glucose

oxydase. Il est important de réaliser qu’avec la méthode que nous avons utilisée, seulement le 4-

HNE libre a été mesurée. Attendu que le 4-HNE est une molécule très réactive, il est probable que

la concentration mesurée soit sous-estimée par rapport à la quantité totale produite par cellule. Le 4-

HNE à 25 et 50 µM réduit sensiblement la production d’adiponectine, mais l’addition de 4-HNE en

une dose unique à l’extérieur de la cellule est de loin moins efficace que le 4-HNE produit sans

interruption à l’intérieur de la cellule. Par ailleurs, des travaux rapportent que les concentrations

plasmatiques de 4-HNE sont de l’ordre du micromolaire (0,47 ± 0,12 µM Selley et al., 1998; 0,65 ±

0,39 µM Strohmaier et al., 1995), ce qui est en accord avec nos résultats.

Les cellules adipeuses sont capables de produire de faibles concentrations de peroxyde

d’hydrogène, par exemple en réponse à l’insuline (Czech et al., 1974, May et al., 1977). Les

adipocytes possèdent une NADHP oxydase produisant du peroxyde d’hydrogène en réponse

l’insuline, mécanisme semblant faire partie de la propagation du signal insulinique (Krieger-Brauer

et Kather, 1992). D’autres types cellulaires produisent du peroxyde d’hydrogène en réponse à

différents facteurs de croissance et cytokines (Finkel, 2000). Du peroxyde d’hydrogène est

également produit par la semicarbazide sensitive amine oxydase (SSAO) et la monoamine oxydase

(MAO) présentes dans les adipocytes dont les activités sont capables de modifier la capture du

glucose par ces cellules (Visentin et al., 2005). De même qu’une activation prolongée de ces

systèmes peut générer des excès de peroxyde d’hydrogène et les altérations métaboliques qui s’en

suivent (Carpené et al., 2003), on peut faire l’hypothèse qu’un excès de peroxyde d’hydrogène

exogène est capable de générer des altérations métaboliques majeures comme une diminution de la

capture de glucose voire une diminution de la lipolyse.

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Dans nos travaux, nous avons privilégié le 4-HNE qui est produit par la peroxydation des

hydroperoxydes des acides gras polyinsaturés de la famille des n-6. En réponse au stress oxydant,

les cellules produisent des hydroperoxydes d’acides gras à partir des AGPIs, principalement l’acide

arachidonique et l’acide linoléique. Parmi les dérivés hydroperoxydes, le 15-HpETE et le 13-

HpODE sont spontanément dérivés en 4-HNE. Le 4-HNE exogène peut aussi être capté par les

cellules, cela a été confirmé en utilisant des anticorps fluorescents contre le 4-HNE-His dans des

hépatocytes (Parola et al., 1998). L’incorporation de l’aldéhyde dans la cellule est réalisée en 5-10

min, avec le temps, il est possible de démontrer un tropisme nucléaire de l’aldéhyde (Parola et al.,

1998, Leonarduzzi et al., 2000). Un effet transcriptionel direct du 4-HNE ne peut pas être exclu, car

nos résultats démontrent une inhibition de l’expression des ARNm d’adiponectine en réponse au

stress oxydant. Le 4-HNE existe dans les conditions basales (Figure 10). Il s’agit de la première

démonstration que le 4-HNE est présent dans les cellules adipeuses et augmente en réponse au

stress oxydant. Le 4-HNE est un aldéhyde très réactif (Esterbauer et al., 1991) qui peut réagir de

multiples façons sur de nombreux sites cellulaires. Notamment, sa forte réactivité pour les

groupements SH et NH2 le prédestine à des interactions fortes avec certaines biomolécules.

Le 4-HNE est lipophile et rapidement diffusible. Quand il atteint le milieu extracellulaire où

lorsqu’il est produit par la membrane plasmique en réponse au stress oxydant, il est capable de

moduler l’expression génique (Poli et al., 2003). Le 4-HNE module l’activité de protéines kinases C

dans tous les types cellulaires où une migration intracellulaire a été observée. Le 4-HNE active la

voie de signalisation des MAP kinases, soit par l’intermédiaire des protéines kinases C soit par

l’activation des récepteurs EGF. La modulation de l’activator protein 1 (AP1) et peut-être la

fixation du 4-HNE sur NF-kB sont responsables de la modulation de l’expression de nombreux

gènes dont COX2 (Poli et al., 2003).

Des études précédentes ont montré que le 4-HNE joue un rôle d’inhibition de la respiration

mitochondriale liée au NADH, d’autre part il est établi que l’acide lipoïque est un cofacteur

commun à l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase et à la pyruvate déshydrogénase. Les études de

spectrométrie de masse ont suggéré que le 4-HNE réagit avec l’acide lipoïque pour former des

adduis de Michael (Humphries et Szweda, 1998). L’insuffisance en pyruvate déshydrogénase

provoqué par l’interaction de l’acide lipoïque avec le 4-HNE, pourrait résulter dans une

augmentation de la synthèse de lactate à partir du pyruvate, comme a été observé dans notre étude

(Figure 24). L’addition d’acide lipoïque dans les adipocytes 3T3-L1 diminue significativement la

production du lactate. Nos résultats apportent des évidences sur le mécanisme cellulaire proposé par

Humphries et Szweda, (1998). Plus généralement, l’acide lipoïque libre peut interagir sur des

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nombreuses voies biochimiques (Bustamante et al., 1998). Des études récentes in vivo ont démontré

qu’une supplémentation en acide lipoïque, empêche le développement de l’hypertension et

l’hyperglycémie (Midaoui et al., 2003) ce qui suggère l’importance du stress oxydant dans les

complications de l’obésité.

La concentration plasmatique en adiponectine est significativement inférieure chez les patients

atteints de pathologies coronaires comparée aux témoins (Ouchi et al., 1999), de même chez les

sujets obèses comparés aux personnes normo-pondérées (Arita et al., 1999). Une perte de poids

entraîne une augmentation de la concentration plasmatique en adiponectine (Hotta et al., 2000). De

plus, une étroite corrélation a été observée entre l’adiponectinémie, l’obésité et la résistance à

l’insuline (Hotta et al., 2001; Weyer et al., 2001; Yamauchi et al., 2001). Par ailleurs, des doses

physiologiques d’adiponectine et leptine corrigent totalement la résistance à l’insuline de souris

lipoatrophiques (Yamauchi et al., 2001). La raison pour laquelle la concentration plasmatique en

adiponectine est réduite chez les patients obèses est encore inconnue. Le rôle du stress oxydant a été

suggéré dans de nombreux états pathologiques, parmi lesquels la résistance à l’insuline dans les

adipocytes et d’autres types cellulaires (Tirosh et al., 2001). Nos résultats démontrent que le stress

oxydant réduit nettement la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. Plusieurs études

suggèrent l’existence d’un stress oxydant lié à l’obésité (Dandona et al., 2002; Dobrian et al., 2001;

Furukawa et al., 2004). Nos résultats soulignent le rôle du stress oxydant dans les complications de

l’obésité comme la résistance à l’insuline, le diabète du type 2, l’hypertension et l’athérosclérose,

ce qui pourrait être une cible thérapeutique importante, pour la prévention de telles complications.

Le stress oxydant est une importante cause du vieillissement (Holzenberger et al., 2003). Il est

impliqué dans la plupart des maladies métaboliques dégénératives comme les maladies

cardiovasculaires, le diabète de type 2 (Davi et al., 2004) et le cancer (Larsson et al., 2004).

L’obésité représente un important facteur de risque pour les maladies métaboliques, d’autre part, le

stress oxydant et l’inflammation sont liés aux pathologies associées à l’obésité. L’augmentation de

la concentration plasmatique en acides gras libres est une caractéristique des patients obèses. Une

concentration élevée en acides gras libres induit une inflammation chez les individus sains

(Tripathy et al., 2003). Parmi les nombreuses cytokines qui sont produites par le tissu adipeux, le

TNFα induit la lipolyse dans les adipocytes (Boeck et al., 1993; Green et al., 1994) et réduit la

concentration plasmatique d’adiponectine en diminuant l’expression du gène d’adiponectine. Dans

les adipocytes 3T3-L1 le traitement avec le TNFα mène à une translocation nucléaire du NF-kB

avec des effets sur l’expression sélective du gène (Ruan et al., 2002). En effet, le stress oxydant

peut activer le NF-kB par la phosphorylation de Ik, lequel est dissocié de sa forme active (Zhang et

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al., 2001). Nos résultats ont démontré une diminution des ARNm en présence d’un stress oxydant

obtenu par ce modèle d’étude.

L’impossibilité pour les ligands de PPARgamma comme la rosiglitazone de se fixer sur ceux-

ci après une pré-incubation avec la 15dPGJ2 suggère une fixation irréversible de la 15dPGJ2 sur ce

PPARgamma. La démonstration indiscutable d’une liaison covalente entre PPARgamma et la

15dPGJ2 est apportée par la mise en évidence, après digestion à la trypsine, à l’aide de la

spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, d’un adduit formé entre un peptide de 8 acides

aminés (IFQGCQFR) et la prostaglandine. Cet octapeptide contient la seule cystéine du domaine de

liaison de PPARgamma, ce qui suggère que la prostaglandine se fixe probablement sur cet acide

aminé. Le fait que la 15dPGJ2 forme une liaison covalente avec une autre molécule n’est pas

exceptionnel, d’autres cas sont connus dans la littérature. Ainsi la 15dPGJ2 se lie de façon covalente

avec des protéines aussi différentes que IkB (Rossi et al., 2000), la sous-unité p50 de NF-kB

(Cernuda-Morollon et al., 2001), la thiorédoxine réductase (Moos et al., 2003), la thiorédoxine

(Shibata et al., 2003), et AP1 (Perez-Sala et al., 2003). Cette capacité de former des liaisons

covalentes est probablement due à la présence d’un centre électrophile de la 15dPGJ2 qui possède

une fonction cétone insaturée qui permet à la molécule de former un adduit de Michael avec les

résidus thiols (Murphy et Zazani et al., 2002). Nos résultats, comme ceux de la littérature montrent

que la fixation de la 15dPGJ2 par liaison covalente n’est pas un phénomène rare, ce qui souligne les

effets pléïotropes de cette prostaglandine.

Il est important de souligner que le dosage de la 15dPGJ2 ne prend en compte que la fraction

libre de cette prostaglandine. Il n’est en aucun cas possible de mesurer la fraction liée de 15dPGJ2

sans étapes spéciales visant à casser la liaison covalente formée. Il s’agit là d’une cause importante

de sous-estimation de la concentration cellulaire de 15dPGJ2, qui pourrait rendre compte de valeurs

très faibles trouvées par Bell-Parikh et al., (2003). La mise en évidence d’une liaison covalente de la

15dPGJ2 est de nature à reconsidérer le rôle de cette prostaglandine.

La fixation d’un ligand induit un changement de conformation de PPARgamma qui permet

son association avec RXR. L’existence d’une liaison covalente entre la 15dPGJ2 et PPARgamma

implique que ce changement de conformation est irréversible, ce qui laisse au récepteur nucléaire

plus de temps pour s’associer avec RXR. Bien que la constante d’association de la 15dPGJ2 sur

PPARgamma reste très informative, la liaison irréversible de la 15dPGJ2 sur PPARgamma change

considérablement les relations entre cette prostaglandine et les autres ligands de PPARgamma. En

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effet, les ligands classiques qui ne se lient pas de façon covalente, peuvent être déplacés par d’autres

agonistes, ce qui n’est pas le cas de la 15dPGJ2.

Les différentes thialozidinediones en se fixant sur PPARgamma induisent l’expression de

nombreux gènes qui ne sont pas toujours les mêmes (Camp et al., 2000). Cette observation a donné

naissance au concept d’activation sélective modulée des PPARs (« selective PPAR modulator

model »), sans qu’une hypothèse ait été émise sur les mécanismes possibles d’une telle activation

sélective après la fixation de ligand sur PPARgamma (Olefsky, 2000). Nos résultats suggèrent que

selon la nature de la liaison entre PPARgamma et un ligand (par une liaison covalente ou non) les

activations des expressions géniques soient différentes. Ceci pourrait être possible soit par un

changement de conformation de PPAR différent selon la nature de la liaison avec le ligand

spécifique ou en assurant au complexe PPARgamma/ligand une durée de vie prolongée. Enfin,

l’existence d’une liaison covalente entre PPARgamma et son ligand pose la question de l’arrêt de

l’activation de PPARgamma et de son recyclage.

Une énergie importante a été dépensée au cours de notre travail de thèse pour doser la

15dPGJ2. Il s’est avéré après de nombreux dosages de prime abord satisfaisants que le signal que

nous obtenions n’était pas uniquement dépendant de cette prostaglandine (Figure 40). L’intérêt de

cette prostaglandine est d’avoir été décrite comme le ligand endogène de PPARgamma le plus

efficace. Ce PPARgamma est lui-même d’une efficacité redoutable car il est capable non seulement

d’induire la différenciation de fibroblastes en adipocytes mais également de provoquer la

dédifférenciation de myoblastes pour les faire se différencier en adipocytes. Notre hypothèse initiale

était que la 15dPGJ2 soit le signal de différenciation des cellules adipeuses souches. En effet,

l’augmentation de la masse grasse est le résultat de deux mécanismes intimement dépendants,

l’augmentation de la taille des adipocytes (mais cette augmentation ne peut pas être indéfinie) et

l’augmentation du nombre des adipocytes. Lorsque les adipocytes différenciés ont atteint une taille

critique, on observe une prolifération puis une différenciation des cellules souches jusqu’alors

dormantes. Une partie des cellules souches se différencie alors en préadipocytes qui se transforment

ensuite en adipocytes. Ces mécanismes de prolifération et de différenciation sont coordonnés. Le(s)

signal(ux) de prolifération et de différenciation sont jusqu’à présent inconnus. Les effets majeurs de

la 15dPGJ2 sur la différenciation adipocytaire faisaient de cette prostaglandine un candidat potentiel

pour la régulation in vivo de la différenciation adipocytaire. C’est pour cette raison que nous avons

entrepris de mesurer la 15dPGJ2 et d’autres prostaglandines dans les tissus adipeux de rats Lou C et

Wistar. Les rats Lou C ont la particularité de rester maigres et d’avoir des dépôts adipeux peu

développés, à la différence des rats Wistar qui deviennent obèses en vieillissant. Les résultats de ce

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travail n’ont pas été totalement concluants, car il apparaît que le dosage de la 15dPGJ2 n’est pas

totalement fiable. En effet, les mesures en GC-MS-MS de cette prostaglandine montrent que le pic

obtenu après séparation n’est pas constitué d’une seule molécule (Figure 39). Il n’est donc pas

possible de certifier la quantité de 15dPGJ2 mesurée. Cependant, la présence de la 15dPGJ2 est

attestée par la présence des ions caractéristiques. Il s’agit d’un résultat important, surtout après ceux

de Bell-Parikh et al., (2003) qui a conclu que la 15dPGJ2 n’étant pas produite en quantité suffisante

ne devait pas être considérée comme un ligand de PPARgamma. Cette conclusion de Bell-Parikh

est à reconsidérer car les dosages ne prennent pas en compte la fraction de 15dPGJ2 qui se lie de

façon covalente au PPARgamma. Les travaux de quantification tissulaire de la 15dPGJ2 devront

être repris en faisant appel à des techniques plus sophistiquées que la simple GC-MS, comme par

exemple la GC-MS-MS.

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VI CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

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Notre premier résultat significatif concerne la diminution de la production d’adiponectine par

les adipocytes 3T3-L1 en réponse au stress oxydant. Cette observation permet de proposer pour la

première fois une hypothèse pour expliquer la diminution de l’adiponectinémie chez les obèses. En

effet, l’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux, l’adiponectine étant produite

principalement par les adipocytes, la diminution de l’adiponectinémie apparaît paradoxale.

L’existence d’une inflammation chronique de faible intensité accompagnée d’un stress oxydant

chez l’obèse conforte nos résultats et place le stress oxydant dans les acteurs majeurs des

complications métaboliques associées à l’obésité. La poursuite de ces travaux nécessitera de

mettre en évidence les voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la diminution de

l’adiponectine en réponse au stress oxydant. A plus long terme, la mise au point d’un modèle in

vivo de stress oxydant permettrait de mesurer ses effets métaboliques indépendamment des

complications dues à l’obésité. La mesure des effets du stress oxydant sur des sujets maigres et

obèses permettrait d’objectiver l’importance de la masse grasse dans les complications

métaboliques induites par le stress oxydant. Le second apport de nos travaux réside dans la

démonstration d’une liaison covalente entre la 15PGJ2 et PPARgamma. Cette démonstration

souligne l’importance de cette prostaglandine dont le rôle est minoré depuis les travaux

de Bell-Parikh et al. (2003) qui ont mesuré des concentrations très éloignées de la concentration

efficace. Dans la mesure où les méthodes de mesure de chromatographie gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse ne permettent de mesurer que la fraction libre de la prostaglandine, il est

probable que la quantité de 15dPGJ2 produite soit très fortement sous-évaluée, d’autant que

cette prostaglandine forme des liaisons covalentes avec de nombreuses molécules présentes dans la

cellule. A court terme, il semble très difficile d’espérer pouvoir mesurer la fraction fixée de

15dPGJ2 car ceci nécessiterait des traitements pour briser les liaisons covalentes avec, de toute

évidence, des rendements aléatoires et de toute façon difficiles à évaluer. Par ailleurs le

dosage de la 15dPGJ2 dans les milieux biologiques n’est pas encore totalement satisfaisant.

L’utilisation de technologies plus avancées du type spectrométrie de masse en tandem pourra peut-

être résoudre les problèmes rencontrés. Il nous apparaît au terme d’un travail important sur le

dosage des prostaglandines, qui n’a malheureusement pas pu être concrétisé en terme de

publication, que la pleine mesure de l’importance du rôle physiologique des prostaglandines ne sera

acquise que par une approche de type lipidomique, c’est–à-dire en prenant en compte les évolutions

des concentrations de toutes les prostaglandines, de leurs précurseurs et de leurs métabolites, dans

un contexte physiologique et/ou physiopathologique donné.

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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