Effets de la canneberge (Vaccinium Macrocarpon) sur le profil ...

GUILLAUME RUEL

EFFETS DE LA CANNEBERGE (VACCINIUM MACROCARPON) SUR LE PROFIL

CARDIOMÉTABOLIQUE CHEZ L'HOMME: LIPIDES, STRESS OXYDATIF, INFLAMMATION ET

FONCTION ENDOTHÉLIALE.

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de Doctorat en nutrition pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

DEPARTEMENT DE SCIENCE DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2010

©Guillaume Ruel, 2010

Résumé Au cours des cinquantes dernières années, la maladie cardiovasculaire (MCV) est la

principale cause de mortalité dans la plupart des pays industrialisées. En dépit des

améliorations du traitement pharmacologique de cette condition, des modifications

délétères dans les habitudes de vie des populations ont réduit leur impact sur la morbidité.

Par conséquent, l'amélioration des habitudes de vie est au cœur des stratégies visant la

prévention de la MCV. Les études épidémiologiques ont montré qu'une consommation

riche en fruits et légumes réduisait le risque de souffrir de MCV. Cependant, les

mécanismes d'action par lesquelles ces aliments exercent leurs bénéfices sont encore

méconnus. Dans le cadre de la présente thèse, nous tenterons de déterminer l'impact d'un

cocktail de jus de canneberges faible en calorie (CJC), un fruit reconnu pour son importante

capacité antioxydante, sur des marqueurs de différentes fonctions clés impliquées dans le

développement de l'athérosclérose. Brièvement, l'athérosclérose est initiée par une

accumulation de lipides qui, après oxydation, enclenchent une réaction inflammatoire qui

pourra entraîner une dysfonction endothéliale. Ensuite, peuvent succéder une augmentation

de la rigidité artérielle, une diminution de la fonction vasodilatoire et la formation d'une

chape fibreuse. La consommation de CJC n'a pas modifié les concentrations plasmatiques

de LDL-cholestérol, ni la taille de ces particules, mais a diminué les niveaux plasmatiques

des LDL oxydées. Les augmentations de la capacité antioxydante plasmatique observées

parallèlement à ces diminutions ne corrélaient pas avec ces dernières. La consommation de

CJC a également entraîné des diminutions de sICAM-1 et sVCAM-1, deux molécules

impliquées dans le recrutement des monocytes à Tendothélium vasculaire et la réaction

inflammatoire subséquente. La supplementation en CJC a diminué les concentrations

plasmatiques de MMP-9, un marqueur de stabilité de la plaque mais n'a pas modifié la

rigidité aortique ni la fonction vasodilatatoire. Finalement, la consommation de CJC a

augmenté les niveaux de HDL-cholestérol. Nous avons montré que la quercétine, un

composé antioxydant de la canneberge, augmentait l'efflux de cholestérol du macrophage

humain, suggérant un ralentissement dans la progression de l'athérosclérose. Les résultats

issus de la présente thèse apportent un éclairage nouveau sur les mécanismes potentiels par

lesquel le CJC et, par extrapolation, les fruits et légumes pourraient exercer leurs bénéfices

cardiométaboliques.

11

Abstract

During the last 50 years, cardiovascular disease (CVD) was the major cause of mortality in

industrialized country. Important deleterious change in life habits has reduced the impact

on CVD death of the breakthrough realized in the last 30 years on pharmalogical treatments

of this disease. Consequently, more emphasis has been put on life habits on CVD

prevention strategies. Epidemiological studies have shown that fruit and vegetable

consumption are associated to a decrease in CVD risk. However, the mechanisms

implicated in those cardiovascular benefits are not well understood. In this doctoral thesis,

we will analyze the impact of a low-calorie cranberry juice cocktail (CJC), a fruit rich in

antioxidant, on markers of different metabolic functions implicated in CVD

pathophysiology. Briefly, atherosclerosis, the major cause of CVD, is initiated by lipids

accumulation in arterial intima that, after oxidation, induces inflammation which could

cause endothelial dysfunction. Thereafter, an increase in arterial stiffness, a decrease in

vasodilation and the formation of a fibrous cap may occur. While daily CJC consumption

did not exert a significant effect on LDL-cholesterol level and LDL size, it reduced plasma

concentration of oxidized LDL. This decrease did not correlate with the concomitant

increase in plasma antioxidant capacity observed. CJC consumption caused significant

decrease in sICAM-1 and sVCAM-1, two molecules implicated in arterial recruitments of

monocytes and the subsequent inflammatory reaction. CJC supplementation also caused a

decrease in plasma concentration of MMP-9, a marker of atheromatous plaque stability but

did not exert any significant impact on arterial stiffness and vasodilation. Finally, CJC

consumption increased HDL-cholesterol in human and quercetin, one of his antioxidant

compounds, has been shown to increase cholesterol efflux from human THP-1

macrophages, suggesting a potential mechanism of CJC for a reduction in lipid

accumulation in the plaque. Results from this doctoral thesis bring a new light on the

mechanism potentially implicated in the cardiometabolic benefits associated with CJC

consumption and, by extension, fruits and vegetables.

Ill

Avant-Propos

Remerciements

D y a 7 ans, j 'ai entrepris mes études graduées sous la supervision du Dr. Couillard. En tant

que premier étudiant, je suis fier aujourd'hui de voir les nombreuses réalisations

accomplies dans ce laboratoire. Je suis fier des 7 articles que j 'ai publiés avec le Dr.

Couillard, des 5 études que nous avons conduites ensemble. Dr. Couillard possède une

plume parfaite. Sous son aile, j 'ai appris énormément et réussi à améliorer la qualité de ma

rédaction. Je le remercie car si aujourd'hui, je peux écrire adéquatement et utiliser

judicieusement un vocabulaire adéquat pour exprimer avec précision ma pensée, c'est par

son effort soutenu à mon égard. Je tiens à souligner la grande exposition scientifique que tu

m'as accordée et ce, dès mes débuts.

Bien entendu, je ne saurais passer sous silence mes examinateurs. Tout d'abord, Benoît

Lamarche qui a contribué de manière significative à ma formation. Je te remercie pour la

qualité des pistes de réflexion lors de révisions d'articles ainsi que pour l'enrichissement

que j 'ai su retiré de nos échanges scientifiques.

Mes remerciements se portent ensuite vers Christophe Garenc, avec qui j 'ai travaillé pour

réaliser l'article présenté dans le chapitre 13. Je te remercie bien spécialement car tu m'as

appris à quel point il fallait être créatif et fonceur en recherche. Ces après-midi et ces dîners

de questionnement, de réflexion et de création scientifique en ta compagnie m'ont

profondément marqué et je t'en suis reconnaissant du fond du cœur.

Je remercie Abdelouahed Khalil, un chercheur que je respecte énormément pour ces

accomplissements en recherche et qui a évalué ma thèse.

Je tiens également à remercier le fond de recherche en santé du Québec pour le financement

de mes études doctorales.

IV

Enfin, je ne saurais passer sous silence tous les membres présents et passés de l'équipe

Couillard ainsi que tout ceux que j 'ai côtoyés à l'Institut des nutraceutiques et des aliments

fonctionnels (INAF). J'ai eu du plaisir avec vous. Au cours des dernières années, j 'ai

développé un profond sentiment d'appartenance à l'INAF et je vous en remercie tous du

fond du cœur.

J'aimerais maintenant remercié mes amis qui m'ont permis de décrocher du travail. Merci à

mon frère Jean-Michel qui a su me prouver que peu importe les obstacles et le handicap

qui nous habite, la persévérance amène à la réussite. Merci à mon frère Patrice qui m'a

appris, entre autres choses, que ce n'est pas la durée qu'on met sur un travail qui importe

mais bien notre degré de concentration lorsqu'on le fait.

Mes parents sont pour moi une source d'inspiration et l'éducation qu'ils m'ont prodigué

tout au long des 29 dernières années ont fait de moi l'homme que je suis, un homme qui a

réussi à rédigé une thèse de doctorat. Je vous dois cette thèse pour vos efforts constants et

l'attention que vous m'avez donnée et je vous en serai éternellement reconnaissant.

Enfin, il me faut souligner la contribution de la femme qui compte le plus pour moi : Annie,

(et non maman, ce n'est pas toi...). Son calme, sa dévotion, son énergie, son amour et le

plaisir qu'on a d'être ensemble ont été indispensables à la réalisation de mes travaux, mais

aussi de mon épanouissement actuel.

Contributions

L'introduction générale du chapitre 1 détaille la physiopathologie de la maladie

cardiovasculaire (MCV). Nous nous intéresserons ensuite successivement à l'implication

des lipides (chapitre 2), de l'oxydation (chapitre 3), de l'inflammation (chapitre 4), de la

métalloprotéinase matricielle 9 (MMP-9, chapitre 5) puis de la fonction endothéliale

(chapitre 6) sur le développement de la maladie cardiovasculaire. Ensuite, au chapitre 7,

nous survolerons l'impact de l'alimentation et de certains antioxydants sur la MCV. Dans

cette dernière section, nous porterons une attention particulière à la canneberge, un fruit

reconnu pour son potentiel antioxydant important. Les hypothèses et les objectifs de la

thèse seront présentés au chapitre 8. Les chapitres 9 à 13 sont constitués de cinq manuscrits

sous formes d'articles scientifiques. Enfin, la conclusion est constituée d'un rappel des

principaux résultats obtenus et d'une analyse critique de leurs impacts et retombées pour la

population et les professionnels de la santé.

Les articles scientifiques présentés dans le cadre des chapitres 9 à 12 ont été réalisés dans le

cadre de 3 études cliniques dont l'investigateur principal est le Dr. Charles Couillard. Au

cours de ces études, le suivi médical des participants était assuré par le Dr. Patrick Couture

du Centre de recherche du centre hospitalier universitaire de Québec, pavillon CHUL

(CRCHUQ/CHUL). Le recrutement et les interventions nutritionnelles étaient supervisés

par Sonia Pomerleau. Les docteurs Patrick Couture, Benoît Lamarche et Simone Lemieux

ont également contribué à la rédaction des demandes de subventions.

Pour le manuscrit présenté au chapitre 13, les docteurs Christophe Garenc et Charles

Couillard étaient les investigateurs principaux et ont supervisé les différentes étapes du

projet. Dr Christophe Garenc et Jorge Barreto-Reyes ont fourni un soutien logistique et une

expertise scientifique dans la mise en place des mesures des niveaux d'expression des

ARNm et des abondances protéiques. Tous les co-auteurs ont participé activement à la

révision des manuscripts avant leur soumission aux journaux scientifiques.

À titre de permier auteur, j 'ai été impliqué à plusieurs niveaux dans ces projets. Tout

d'abord, j 'ai effectué toutes les mesures de capacité antioxydante ainsi que des

VI

concentrations plasmatiques de LDL oxydée, ICAM-1, VCAM-1, E-sélectine,

Nitrites/Nitrates et MMP-9 présentées dans le cadre des articles présentés aux chapitres 10,

11 et 12. En plus d'effectuer les mesures des niveaux d'expression des ARNm, j 'ai mis au

point les conditions expérimentales de mesures de l'abondance protéique et d'efflux de

cholestérol présentées au chapitre 13. Pour tous les articles, j 'ai réalisé les analyses

statistiques, effectué la revue de littérature et rédigé le premier jet des articles. J'ai ensuite

réuni les corrections des différents co-auteurs en vue de publication. De plus, j 'ai rédigé la

première ébauche de chacune des réponses aux réviseurs. J'ai également participé à titre de

co-auteur à deux articles portant sur les déterminants nutritionnels, anthropométriques et

lipidiques des concentrations plasmatiques de LDL oxydée et des molécules d'adhésion.

Enfin, une majeure partie des résultats présentés dans cette thèse sont synthétisés dans un

article de revue dont je suis le premier auteur.

vu

Je dédie cette thèse à Annie Arte au, la femme que j'aime

C'est une erreur capitale que de bâtir des théories tant qu'on n'a pas de données. Insensiblement, on se met à torturer les faits pour les faire cadrer

avec les théories, au lieu d'adapter les théories aux faits.

Sir Arthur Conan Doyle (1859-1930)

V l l l

Table des matières Résumé i

Avant-Propos iii

Table des matières viii

Liste des tableaux xi

Liste des figures xiii

Liste des abréviations xvi

Chapitre 1 19

Introduction générale 19

1.1 Prévention de la MCV et facteurs de risque 19 1.2 Étiologie de la MCV 20

1.2.1 Physiologie des vaisseaux sanguins 21 1.2.2 Cholestérol et MCV 22

Chapitre 2 23

Lipoprotéines et maladies cardiovasculaires 23

2.1 Chylomicrons 24 2.2 Lipoprotéine de très faible densité et de densité intermédiaire 25 2.3 Lipoprotéine de faible densité 26 2.4 Lipoprotéine de haute densité 27

2.4.1 Lipoprotéine de haute densité et efflux de cholestérol 29 2.4.2 Lipoprotéine de haute densité et efflux de cholestérol dans le macrophage 30

Chapitre 3 35

Oxydation et maladie cardiovasculaire 35

3.1 Oxydation des LDL 35 3.1.1 Processus de l'oxydation des LDL 35 3.1.2 Marqueurs d'oxydation des LDL dans le plasma humain 38 3.1.3 Relation entre la MCV et les marqueurs plasmatiques de l'oxydation des LDL40

3.2 Marqueurs de la capacité antioxydante 41 3.2.1 Marqueurs de la capacité antioxydante par transfert d'atome d'hydrogène (TAH) 41 3.2.2 Marqueurs de la capacité antioxydante par transfert d'électron (TE) 45 3.2.3 Mesure de la capacité antioxydante et maladie cardiovasculaire 48

Chapitre 4 51

Inflammation et maladie cardiovasculaire 51

4.1 Marqueurs de l'adhésion endothéliale 52 4.2 Description d'ICAM-1 53 4.3 Description de VCAM-1 55 4.4 Description de la E-sélectine 56

IX

4.5 Conclusion sur les molécules d'adhésion 57 Chapitre 5 58

MMP-9 et maladie cardiovasculaire 58

5.7 Généralités 58 5.2 MMP-9, MCV et facteur de risque de MCV 59

5.2.1 Implication de MMP-9 dans la formation de la cellule spumeuse 60 5.2.2 MMP-9 et remodelage vasculaire 61 5.2.3 MMP-9 et stabilité de la plaque d'athérosclérose 61

5.3 MMP-9 et traitement pharmacologique 63 5.4 Conclusion sur MMP-9 63

Chapitre 6 64 Fonction endothéliale et maladie cardiovasculaire 64

6.1 Généralités 64 6.2 Mesure de rigidité artérielle 65 6.3 Méthodes de mesure de la vasodilatation 67

6.3.1 Mesure de la vasodilatation par mesure du diamètre des artères 68 6.3.2 Mesure de la vasodilatation par tonométrie par aplanation 68

6.4 Index d'augmentation (AIx), MCV et facteur de risque de MCV 69 Chapitre 7 71

Nutrition et maladie cardiovasculaire 71

7.7 Évidences épidémiologiques 71 7.2 Relation entre la consommation de fruits et légumes et le risque cardiovasculaire ..72 7.3 Antioxydants: définition, classification et sources 74 7.4 Vitamines antioxydantes et risque de MCV 74

7.4.7 Consommation de vitamine E et risque cardiovasculaire 74 7.4.2 Consommation fl-carotène et risque cardiovasculaire 76 7.4.3 Consommation de vitamine C et risque cardiovasculaire 76

7.5 Études de supplementation en vitamines antioxydantes 77 7.5.7 Études de prévention primaire 78 7.5.2 Études de prévention secondaire 81 7.5.3 Conclusion sur les études de supplementation 83

7.6 Les polyphenols 84 7.6.7 Historique des polyphenols 85 7.6.2 Nomenclature des flavonoïdes 85 7.6.3 Absorption des flavonoïdes 87 7.6.4 Consommation de flavonoïdes et risque cardiovasculaire 92

7.7 La canneberge 98 7.7.7 Ea composition de la canneberge 98 7.7.2 Biodisponibilité des composantes de la canneberge chez l'humain 100 7.7.3 Mécanismes d'action des flavonoïdes de la canneberge 100

7.8 Effet de la canneberge sur différents marqueurs de la MCV 102 7.&7 Effets de la canneberge sur les lipides sanguins 102 7.8.2 Effets de la canneberge sur l'oxydation des LDL, l'adhésion endothéliale, MMP-9 et la fonction endothéliale 105

Chapitre 8 108

Description des objectifs de la thèse 108

Chapitre 9 112

Effet de la supplementation en jus de canneberges sur les concentrations plasmatiques de

LDL oxydées et la capacité antioxydante chez l'homme 112

Chapitre 10 141

La supplementation en cocktail de jus de canneberges réduit les concentrations

plasmatiques de LDL oxydées et de molécules d'adhésion chez l'homme 141

Daily CJC consumption 168

La supplementation en cocktail de jus de canneberges réduit les concentrations

plasmatiques de MMP-9 chez l'homme 174

Variables 199

Chapitre 12 205

Effets de la consommation de cocktail de jus de canneberges sur la rigidité artérielle chez

l'homme affichant un surpoids: Résultats d'une étude en chassé-croisé à double insu 205

Chapitre 13 232

La Quercétine mais pas la myricétine augmente l'efflux de cholestérol dans le macrophage

humain THP-1 232

Conclusions 251

Bibliographie des chapitres 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 et de la conclusion 257

XI

Liste des tableaux

Section I

Tableau 1 : Les 9 facteurs de risque modifiables expliquant 98,4 % des cas de MCV en Amérique du Nord 20

Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques des lipoprotéines 24 Tableau 3 : Comparaison des principales protéines impliquées dans l'efflux de cholestérol

31 Tableau 4 : Comparaison entre les différentes méthodes de mesures de LDL oxydée dans

le plasma 39 Tableau 5 : Récapitulatif de la comparaison entre les différentes méthodes de mesures

plasmatiques de la capacité antioxydante basé sur le transfert d'atome d'hydrogène (TAH) 43

Tableau 6 : Récapitulatif de la comparaison entre les différentes méthodes de mesures plasmatiques de la capacité antioxydante basé sur le transfert d'électron (TE) 46

Tableau 7 : Coefficients de corrélation entre les tests de TEAC, DPPH, ORAC et FRAP. 49 Tableau 8 : Résumé des caractéristiques des molécules d'adhésion 54 Tableau 9 : Principaux activateurs et inhibiteurs de MMP-9 dans les macrophages 60 Tableau 10 : Études prospectives portant sur la relation entre la consommation de fruits et

légumes et le risque cardiovasculaire 72 Tableau 11 : Études prospectives portant sur la relation entre la consommation de

vitamines et le risque cardiovasculaire 75 Tableau 12 : Études d'intervention portant sur la relation entre la consommation de

vitamines et le risque de décès cardiovasculaire 78 Tableau 13 : Effet sur l'absorption des combinaisons d'aliments et de flavonoïdes 91 Tableau 14 : Études investiguant la composition en polyphenols et la capacité antioxydante

de différents fruits et légumes 97 Tableau 15 : Composition en micro et macronutriments de la canneberge (Vaccinium

macrocarpon) 99 Tableau 16 : Contenu en flavonoïdes des canneberges 99 Tableau 17 : Études d'intervention clinique sur les bienfaits cardiovasculaires associés à la

consommation de jus de canneberges 103

XII

Section II

CHAPITRE 9

Tableau 1 : Baseline physical and metabolic characteristics of the subjects 135 Tableau 2 : Associations between baseline physical and metabolic characteristics 136 Tableau 3 : Changes in physical and metabolic characteristics following the intervention

137

CHAPITRE 10

Tableau 1 : Exclusion and inclusion criteria of the study 165 Tableau 2 : Detailed description of the content of a portion (125 mL) of placebo juice (PJ)

and low calorie cranberry juice cocktail (CJC) 166 Tableau 3 : Baseline physical and metabolic characteristics of the 30 men 167 Tableau 4 :Changes in lipids, blood pressure and heart beat during the intervention 168

CHAPITRE 11

Tableau 1 : Baseline characteristics of the 30 men 198 Tableau 2 : Blood pressure, MMP-9 and NOx values of the 30 men during the

intervention 199 Tableau 3 : Changes between baseline and 500 mL CJC/day in blood pressure, MMP-9

and NOx in men separated on the basis of baseline plasma NOx levels 200

CHAPITRE 12

Tableau 1 : Detailed description of the content of a portion (125 ml) of placebo juice (PJ) 224

Tableau 2 : Baseline physical and metabolic characteristics of the 35 men 225 Tableau 3 : Correlations between baseline AIx value and physical, metabolic as well as

hemodynamic variables prior to the beginning of the intervention of the 35 men 226 Tableau 4 : Changes in hemodynamic variables and AIx values in the 35 men 227

M i l

Liste des figures

Section I

Figure 1 : Physiologie d'une artère normale 21 Figure 2 : Structure de base des lipoprotéines 23 Figure 3 : Représentation schématique du métabolisme des lipoprotéines et de leurs rôles

dans le transport inverse du cholestérol 28 Figure 4 : Processus d'oxydation des acides gras polyinsaturés des LDL par les radicaux

libres 37 Figure 5 : Étapes de l'oxydation des LDL 37 Figure 6 : Illustration du recrutement des monocytes par Tendothélium vasculaire 52 Figure 7 : Image des premiers instruments de mesure de la fonction endothéliale 64 Figure 8 : Courbe typique des ondes radiale et aortique tel que mesurées par tonométrie de

l'artère radiale 66 Figure 9 : Formule chimique de base des polyphenols 86 Figure 10 : Principales classes de flavonoïdes 87 Figure 11 : Mécanismes intestinaux du transport des flavonoïdes 88

Section II

CHAPITRE 9

Figure 1: Plasma A) antioxidant capacity and B) oxidized LDL levels before (white bars) and after (black bars) 14-day cranberry juice supplementation in men 139

Figure 2 :Lack of association between changes in plasma antioxidant capacity and oxidized LDL concentrations following 14-day cranberry juice supplementation in men 140

XIV

CHAPITRE 10

Figure 1 : Changes in plasma oxidized LDL (OxLDL, p<0.0001 across doses) concentrations during the intervention 170

Figure 2 : Changes in plasma soluble vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1, p<0.05 across doses), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, p=0.0001) and E-selectin (p=0.66) concentrations during the intervention 171

Figure 3 : Associations between changes in plasma OxLDL and soluble VCAM-1, ICAM-1 as well as E-selectin concentrations over the course of the entire intervention 172

Figure 4 : Changes in plasma A) oxidized LDL, B) soluble intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and C) vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) concentrations in response the intervention in men with or without the metabolic syndrome 173

CHAPITRE 11

Figure 1 : Correlation between baseline and change after the 500 mL/day doses in plasma matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) concentrations 202

Figure 2 : Comparison between tertiles of plasma NOx value at baseline on plasma NOx concentrations at week 0 and 12 as well as their change after the 500 mL/day doses.

203 Figure 3 : Effect of baseline blood pressure status on plasma MMP-9 concentrations

measured at baseline and after 500 mL CJC/day as well as their variation 204

CHAPITRE 12

Figure 1 : Arterial stiffness (AIx) in the 35 men at baseline measured at rest as well as after salbutamol (SALB) and nitroglycerin (NTG) administration 229

Figure 2 : Associations between baseline measures of resting arterial stiffness (AIx) and those of the response to salbutamol and nitroglycerin administration 230

Figure 3 : Changes in arterial stiffness (AIx) measured at rest as well as following the administration and nitroglycerin in abdominal obese men below (top panel) or above (bottom panel) the age of 50 years old after CJC (black bars) and PJ (white bars) consumption 231

XV

CHAPITRE 13

Figure 1 : THP-1 PMA-differentiated macrophages have been incubated in absence or presence of vehicle alone (DMSO; 1/10,000), myricetin (2, 20, 50 and 100 mM), quercetin (2, 20, 50 and 100 mM) and quercetine 3-|3-D-glucoside (2, 20, 50 and 100 mM) or a LXRs specific agonist (GW3965) for 24 hours. Following RNA extraction and cDNA transcription RT-PCR was done on ABCA1, ABCG1 and SRBI. BTF3 was used as housekeepin gene. The results are from three separate experiments 248

Figure 2 : THP-1 PMA-differentiated macrophages have been incubated in absence or presence of vehicle alone (DMSO; 1/10,000), myricetin (100 mM), quercetin (100 mM) and quercetine 3-(3-D-glucoside (100 mM), a LXRs specific agonist (GW3965) or vehicle alone for 24 hours. One hundred pg of protein was loaded on a 8% polyacrylamide gel, transferred to a nitrocellulose membrane, and immunobloted for ABCA1, ABCG1 and SRBI. The a-tubuline was used as a control. The blot shown is representative of three separate experiments 249

Figure 3 : THP-1 PMA-differentiated macrophages have been incubated in absence or presence of vehicle alone (DMSO; 1/10,000), myricetin (100 mM), quercetin (100 mM) and quercetine 3-p-D-glucoside (100 mM) or a LXRs specific agonist as cholesterol efflux control (GW3965) for 48 hours. Then cells were labelled with 1,2-[3H] cholesterol for 24 hours and incubated in absence or presence of human apo-AI or HDL for 6 (upper pannel) or 12 hours ( lower pannel). Finally, radioactivity levels were measured in cells and media by liquid scintillation and cholesterol efflux calculated as relative to control. Significantly different from the Control (1), DMSO (2) inside the same cholesterol acceptor 250

XVI

Liste des abréviations

ABC Al : cassette de liaison à l'ATP AI (ATP binding cassette AI)

ABCG1 : cassette de liaison à l'ATP Gl (ATP binding cassette Gl)

Apo : apolipoprotéine

ATP : adenosine triphoshate

AMP : adenosine monophoshate

CETP : protéine de transfert des esters de cholestérol (cholesteryl ester transfer

protein)

CJC : cocktail de jus de canneberges

Coli : collaborateurs

DCV : décès des suites de la MCV

eNOS : synthetase de l'oxyde nitrique endothéliale (endothelial nitric oxyde syntase)

FMD : vasodilatation médiée par le flux sanguin (flow-mediated dilatation)

FRAP : capacité antioxydante du fer réduit (ferrie reducing ability of plasma)

GSH : glutathion réduit

HDL : lipoprotéine de densité élevée (high density lipoprotein)

H2O2 : peroxyde d'hydrogène

ICAM-1 : molécules d'adhésion cellulaire intercellulaire-1 (intercellular cell adhesion

molecule)

IDL : lipoprotéine de densité intermédiaire (intermediate density lipoprotein)

INAF : Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels

JAK2 : kinase janus 2 (janus kinase 2)

LCAT : lécithine : cholestérol acyltransférase

LDL : lipoprotéine de faible densité (low density lipoprotein)

LDLox : LDL oxydée

LRP: protéine réliée au récepteur LDL (LDL receptor-related protein)

LXR : récepteurs X hépatique (liver X receptor)

MCV : maladie cardiovasculaire

mmLDL : LDL légèrement oxydé (minimally modified LDL)

XVII

MMP : métalloprotéinase de la matrice (matrix metalloproteinase)

MRP : protéine associées à la résistance aux multidrogues (multidrug resistance

protein)

NADPH : nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NO : oxyde nitrique (nitric oxide)

O2 : oxygène

OH- : radical hydroxyle

ONOO- : péroxynitrite

PKA : protéine kinase A

PPAR : récepteurs activés par les inducteurs de la prolifération des peroxysomes

(peroxysome proliferator-activated receptor)

PS-PLA2 : phosphatidylsérine phospholipase A2

ROS : espèces réactives de l'oxygène (reactive oxygen species)

RXR : récepteur X rétinoïque

SGLT1 : transporteurs du glucose sodium dépendant-1 (sodium-glucose transport

protein-1)

SR-BI : récepteur d'épuration BI (scavenger receptor Bl)

SULT : sulfotransférase

TAS : capacité antioxydante totale (total antioxydant capacity)

TBARS : substances réactives à l'acide thiobarbiturique (thiobarbituric acid reactive)

TIMP : inhibiteur des MMP (tissue inhibitor of MMP)

TNF-a : facteur de nécrose des tumeurs a (tumor necrosis factor a)

UGT : UDP-glucuronlytransférase

VCAM-1 : molécules d'adhésion cellulaire vasculaire (vascular cell adhesion molecule)

VLDL : lipoprotéine de très faible densité (very low density lipoprotein)

XV111

Section I

43

Chapitre 1. Introduction générale

Durant la première moitié du 20e siècle, les maladies infectieuses étaient la principale cause

de mortalité. Cependant, l'amélioration des conditions sanitaires et la découverte de la

pénicilline ont permis de diminuer la prévalence des maladies infectieuses et d'augmenter

la longévité. Avec l'augmentation de la longévité, de nouvelles causes de mortalité

devinrent prépondérantes dans la population. La maladie cardiovasculaire (MCV) est

aujourd'hui une cause de mortalité majeure. Au Canada en 2005, près de 65 000 individus

sont mort des suites de MCV et cérébrovasculaires. Ce nombre correspond à 28.5 % des

décès répertoriés, ce qui classe la MCV (1) au second rang de toutes les causes de mortalité

au Canada (1-3).

1.1 Prévention de la MCV et facteurs de risque

Au cours des dernières décennies, de nombreux plans d'action gouvernementaux ont été

développés afin de mieux comprendre l'étiologie de la maladie vasculaire ainsi que d'en

ralentir la progression et d'en assurer le traitement. Plusieurs facteurs de risque de la MCV

ont été rapportés dans la littérature. Dans une vaste étude cas-contrôle internationale (4,5)

incluant plus de 12 000 cas d'infarctus du myocarde issus de 52 pays différents, parmi tous

les facteurs de risques suggérés, neuf facteurs expliqueraient jusqu'à 98,7 % des cas de

MCV en Amérique du Nord et 90,4% des cas à l'échelle mondiale. Ces facteurs de risque

sont le tabagisme, un ratio apoB/apoAI élevé, le diabète, l'hypertension, l'obésité

abdominale, les facteurs psychosociaux, la faible consommation de fruits et légumes, le

niveau de consommation d'alcool différent des recommandations (1 à 3 portions par jour)

et la sédentarité (tableau 1). Parmi ces derniers, plusieurs sont modifiables par un

changement des habitudes de vie, ce qui laisse entrevoir la possibilité d'intervenir en

prévention primaire. Plusieurs de ces facteurs sont traitables à coûts modiques lorsque

comparés à l'alternative pharmacologique. Un virage vers la prévention pour la société a

donc été préconisé par les gouvernements.

20

Tableau 1 : Les 9 facteurs de risque modifiables expliquant 98,4 % des cas de MCV en

Amérique du Nord

Prévalence Risque relatif (99% IC) ajusté pour l'âge et le sexe

Facteur de risque Contrôles (%) Cas (%) Tabagisme 26.76 45.17 2.95 (2.72-3.20) Diabète 7.52 18.45 3.08 (2.77-3.42) Hypertension 21.91 39.02 2.48 (2.30-2.68) Obésité abdominale 33.32 46.31 2.24 (2.06-2.45) (3V5.1) Index psychosocial - - 2.51 (2.15-2.93) Consommation de 42.36 35.79 0.70 (0.64-0.77) fruits et légumes Activité physique 19.28 14.27 0.72 (0.65-0.79) Apport en alcool 24.45 24.01 0.79 (0.73-0.86) Ratio apoB/Al 20.00 33.49 3.87 (3.39-4.42) (5 vs. 1) Tous les risques - - 129.20(90.24-combinés 184.99) Tiré de (5).

1.2 Étiologie de la MCV

La maladie cardiovasculaire regroupe un vaste ensemble de conditions pathologiques

touchant le coeur et le réseau circulatoire. Ces pathologies sont regroupées selon la

spécificité de leurs origines : valve cardiaque, muscle cardiaque, péricarde, etc. Les

maladies coronariennes qui regroupent l'angine de poitrine et l'infarctus du myocarde font

partie de la catégorie la plus commune dans les pays occidentaux (1-3). La maladie

coronarienne peut avoir plusieurs causes, mais la principale est l'athérosclérose.

L'athérosclérose est un processus pathologique complexe de dégénérescence fibreuse

artérielle impliquant une accumulation de lipides, de dépôts calcaires, de minéraux et de

macrophages activés ainsi qu'une migration des cellules musculaires lisses dans la paroi

vasculaire. L'athérosclérose peut se produire sur n'importe lequel segment vasculaire

artériel, mais a une propension à se développer aux bifurcations artérielles, lieu propice à

l'érosion endothéliale issu des pertubations du flux sanguins. Un changement dans la

rhéologie sanguine pourrait être en cause.

21

1.2.1 Physiologie des vaisseaux sanguins

La paroi des vaisseaux sanguins est subdivisée en trois parties (figure 1) : l'intima, la média

et l'adventice. L'intima est la partie interne d'un vaisseau composée des cellules

endothéliales qui assurent le lien entre la lumière et la média. Cette dernière est composée

de cellules musculaires lisses assurant les fonctions vasomotrices. Enfin, l'adventice est

principalement constitué de collagène et est peu impliqué dans le développement de

l'athérosclérose.

Figure 1 : Physiologie d'une artère normale

A : adventice; M : média; I : intima et L : lumière

Tirée de (6)

22

1.2.2 Cholestérol et MCV

En 1856, le pathologiste allemand Rudolph Virchow a suggéré que l'athérosclérose découle

d'une accumulation de lipides sanguins dans l'intima artérielle (7,8). À cette époque, sa

découverte passa relativement inaperçue. Il a fallu attendre jusqu'à la seconde moitié du 20e

siècle pour qu'un intérêt scientifique plus important soit porté sur la relation entre le

cholestérol et les MCV. Parmi les études clés, Thomas et coll. (9) ont montré qu'une

augmentation des concentrations sériques de cholestérol chez de jeunes truies favorisait la

prolifération de l'endothélium et des cellules musculaires lisses des artères.

Par la suite, des études ont investigué la relation entre les niveaux de cholestérol

plasmatique et la MCV chez l'humain (10-12). La découverte du récepteur LDL par le

célèbre duo Brown et Goldstein (13) a confirmé et cristallisé l'implication des LDL et du

cholestérol dans le développement de l'athérosclérose, ce qui les a menés à l'obtention d'un

prix Nobel.

23

Chapitre 2. Lipoprotéines et maladies cardiovasculaires

Les cellules humaines nécessitent pour leur métabolisme différents composés hydrophobes

et hydrophiles. Le système circulatoire permet directement le transport de la majorité des

composés hydrophiles jusqu'aux cellules. Cependant, les composés hydrophobes tels les

triglycérides (TG), les phospholipides et le cholestérol utilisent d'autres modes de transport.

Les principaux transporteurs des TG et du cholestérol sont les lipoprotéines (Figure 2). Ces

dernières comportent une enveloppe hydrophile composée de phospholipides, de

cholestérol libre (tête polaire) et d'apoprotéines (apo). La partie interne hydrophobe est

principalement composée de cholestérol estérifié et de TG. Plusieurs types de lipoprotéines

ont été répertoriés et possèdent différentes fonctions relatives à leur contenu et proportion

en lipides ainsi que les types d'apo qui la composent.

Apo protéine

Surface polaire

Cholestérol libre

Phospholipides

Apo protéine

Triglycérides

Cholestérol estérifié

Centre non polaire

Apoprotéine

Figure 2 : Structure de base des lipoprotéines Tiré de (14)

La nomenclature des lipoprotéines est basée sur leur densité (15,16). Les particules les plus

denses portent le nom de lipoprotéines de haute densité (HDL) alors que suivent dans

l'ordre décroissant de densité, les lipoprotéines de faible densité(LDL), de densité

24

intermédiaire (IDL) et de très faible densité (VLDL). Finalement, les chylomicrons sont les

moins denses. De manière générale, plus la taille des lipoprotéines est grande et moins elles

sont denses. L'ordre décroissant selon le contenu en TG est : les chylomicrons, les VLDL,

les IDL, les LDL et les HDL (Tableau 2). Pour sa part, la proportion du contenu en

cholestérol se retrouve comme suit : chylomicron < VLDL < HDL < IDL < LDL. Leur

physiologie et leurs rôles seront décrits afin de mieux cerner leur contribution individuelle à

la MCV.

Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques des lipoprotéines

Lipoprotéines Densité (g/dL) Diamètre Taux flot. Mobilité élect. I Jpides (%) (nm) (Sf)

0.95 75-1200 >400 Origine

TG Chol PL

Chylomicrons 0.95 75-1200 >400 Origine 80-95 2-7 3-9 VLDL 0.95- I.006 30-80 6 ( J M 0 0 Pre-beta 55-80 5-15 10-2 IDL 1.006--1.019 25-35 20-60 Broad beta 20-50 20-40 15-2 LDL 1.019--1.063 18-25 0-20 Beta 5-15 40-50 20-2 HDL 1.063--1.210 5-12 0-9 Alpha 5-10 15-25 20-30

Tiré de (14)

2.1 Chylomicrons

Les chylomicrons transportent le cholestérol et les TG exogènes du site d'absorption

intestinale jusqu'au foie par la veine porte. Ds participent également à la distribution des

TG dans l'organisme. Les chylomicrons contiennent une panoplie d'apo incluant les apo

AI, AU, AIV, B48, C I, CH, CHI et E. Les chylomicrons ont une densité approximative de

0.95 g/dL, une taille entre 800 et 5000 Â et sont composés d'environ 86% de TG, 7% de

phospholipides, 3% de cholestérol estérifié, 2% de cholestérol libre et 2% de protéines (15-

17). Rattachée à la paroi endothéliale, la lipoprotéine lipase (LPL), qui est régulée par les

apo Cil et CIII, hydrolysera une partie des TG en acides gras libres qui seront recaptés par

les tissus périphériques, dont le tissu adipeux qui l'emmagasinera après ré-estérification

sous forme de TG et le muscle qui les utilisera comme source énergétique. De plus, sous

25

l'action de la LPL, plusieurs constituants de surface dont l'apo AI, les apo C, le cholestérol

et certains phospholipides seront libérés et recyclés pour former des HDL. Les

chylomicrons appauvris en TG seront nommés résidus de chylomicrons (18). L'interaction

des apo AI, B48 et E avec différents récepteurs tels que la protéine relié au récepteur LDL

(LRP) ou le récepteur de l'apoE conduira à l'endocytose et au catabolisme des

chylomicrons et de leurs résidus dans le foie (19). Ces lipoprotéines assurent le transport

des TG et du cholestérol alimentaire provenant de l'intestin ; leur rôle majeur est

principalement limité à la période postprandiale. Comme les bilans lipidiques sont mesurés

à jeun, la concentration plasmatique de chylomicrons est donc à son plus bas à ce moment.

2.2 Lipoprotéine de très faible densité et de densité intermédiaire

Pour faire suite à l'internalisation hépatique des chylomicrons et à la captation des acides

gras libres plasmatiques, les hépatocytes produiront les VLDL à partir de l'apo B100. Bien

que l'apo E soit aussi produite au foie, elle n'est jamais incorporée directement à la VLDL,

mais lui parvient des HDL ou de la circulation. Les apo présentes sur les VLDL sont : les

apo AI, B-100, C-I, C-H, C-III et E. La VLDL a une densité de 0.95-1.010 g/dL, un

diamètre de 300 à 700 Â et est composée d'environ 55% de TG, 12% d'esters de

cholestérol, 7% de cholestérol libre, 18% de phospholipides et de 8% de protéines (15,16).

La principale fonction des VLDL est de transporter les TG vers les différents tissus

périphériques. Pour ce faire, les apo Cil qu'elle obtiendra des HDL favoriseront l'hydrolyse

des TG en acides gras libres par la LPL. Peu à peu, les VLDL perdront leur contenu en TG,

jusqu'à atteindre une taille d'environ 300 Â où on la nommera IDL. Cette dernière possède

une densité variant entre 1.008 et 1.019 g/dL, une taille de 272 à 300 Â avec une

composition approximative de 23% de TG, 29% d'ester de cholestérol, 9% de cholestérol

libre, 19% de phospholipides et 19% de protéines(15,16). L'apo E déplace l'apo Cil de la

surface de la LPL ; ce qui peut ralentir l'activité de la LPL et le processus de lipolyse. À cet

égard, l'apo CI modifie la liaison de l'apo E au foie ce qui réduit la recaptation hépatique

des VLDL et des IDL. En dépit de ses nombreuses interactions apolipoprotéiques, le

26

processus d'hydrolyse des TG se poursuivra sous l'action concertée de la LPL et de la

lipase hépatique (LH).

À cette étape, la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) jouera un rôle crucial

en permettant le transfert de TG du VLDL vers les HDL ainsi que des esters de cholestérol

de la HDL vers la VLDL ; ce qui favorisera la formation de VLDL enrichie en cholestérol.

Ces dernières possèdent une affinité moindre pour le récepteur LDL, responsable de leur

élimination au foie et aux tissus périphériques ce qui prolongera leur demi-vie en

circulation (figure 3) (20). Durant cette période, l'hydrolyse des TG se poursuivra jusqu'à

l'atteinte d'une proportion de 50% de cholestérol et une taille de 272 Â. À cette étape, les

apo A, E et C perdront leur affinité pour la lipoprotéine et seront transférées aux HDL. De

plus, la LDL obtenue aura perdu beaucoup de TG et de phospholipides. Seulement 30 à 40

% des VLDL produites au foie deviendront des LDL alors que les autres seront recaptées

au foie par les récepteurs aux apo B100 et E et catabolisées ou retournées dans la

circulation sous forme de VLDL. Les VLDL de petite taille et riches en cholestérol seront

plus susceptibles de devenir des LDL.

2.3 Lipoprotéine de faible densité

La LDL est principalement responsable du transport et de la distribution du cholestérol aux

tissus périphériques. La LDL ne possède que les apo B100 et E. Sa densité se situe entre

1.019 et 1.060 g/dL pour une taille de 220 à 272 Â et une composition à 42% de cholestérol

estérifié, 22% de phospholipides, 22% de protéines, 8% de cholestérol libre et 6% de TG

(15,16,21). On estime qu'une LDL contient environ 3000 molécules d'acides gras dont près

de la moitié sont des polyinsaturés (22). Jusqu'à 75% des LDL nouvellement formées

seront catabolisées au foie par interaction des apo E ou B avec le récepteur des LDL (20).

Les autres LDL seront captées par les différents tissus extra hépatiques. Bien que sa

composition puisse varier, une seule molécule d'apo B est présente par molécule de LDL.

Les LDL, sous l'action de la CETP, transférerons une partie de leur cholestérol vers les

HDL, un processus qui augmentera leur proportion de TG. Cette variation de la

27

composition combinée à l'augmentation de leur susceptibilité à l'hydrolyse par la LH

favorisera la formation de particules LDL plus petites et denses (23,24). Ces dernières ont

une affinité réduite pour le récepteur LDL ce qui prolonge leur demi-vie en circulation. Une

des principales conséquences de cette prolongation est une augmentation de leur rétention

dans l'intima vasculaire, de leur oxydation et, éventuellement, du risque cardiovasculaire.

Puisque l'apo B100 est un meilleur indicateur de la quantité de particules LDL et VLDL en

circulation que le cholestérol, il fait l'objet de recherches intensives et il s'avère être un

excellent marqueur de la MCV (25-27).

2.4 Lipoprotéine de haute densité

Comme les différents tissus peuvent produire du cholestérol en plus d'en capter, il arrive

qu'il y ait un surplus de cholestérol. Certains types cellulaires, comme le macrophage, ne

peuvent cataboliser le cholestérol et ont besoin d'un moyen pour l'éliminer afin de ne pas

souffrir de ces effets cytotoxiques (28). Le principal rôle de la HDL est de transporter le

cholestérol vers le foie où il sera éliminé via les sels biliaires. Contrairement aux autres

lipoprotéines, la HDL n'est pas produite dans une cellule, mais plutôt dans la lumière du

système circulatoire à partir de certaines composantes issues de la dégradation des

chylomicrons. Les apo AI, Ail, Cil, CIII et E qui composeront la HDL naissante sont

produites par les cellules hépatiques et intestinales. Les apo et phospholipides

(sphyngomyéline et phosphatydilcholine) contenues dans les HDL naissantes proviennent

de l'hydrolyse des VLDL et des chylomicrons.

La HDL naissante accumulera du cholestérol par diffusion bidirectionnelle et interaction

protéique unidirectionnelle à partir de la lipolyse d'autres lipoprotéines ainsi que de

différents récepteurs que nous détaillerons au chapitre 2.4.2. La HDL naissante échangera

ses apo Cil, CIII et E aux lipoprotéines riches en TG (chylomicrons et VLDL) en échange

des apo AU et AIV ; ce qui provoquera un changement de conformation. Ce passage d'une

forme aplanie à sphérique marque le point de formation des HDL2 et HDL3 (29). Les HDL2

28

CHYLO

Résidus de chylo

Constituants de CHYLO et VLDL

%

^ ^ HDL immature

LH. EL

Figure 3 : Représentation schématique du métabolisme des lipoprotéines et de leurs rôles dans le transport inverse du cholestérol

La particule HDL immature de forme discoïdale sera formée au niveau héptique à partir

de l'apoAI produite à l'intestin et au foie ainsi qu'avec l'incorporation de certaines

composantes des chylomicrons et des VLDL. La HDL immature se chargera de cholestérol

aux tissus périphériques sous l'effet d'ABCAl (30). Pour sa part, l'enzyme LCAT, activée

par l'ApoAI contribuera à estérifier le cholestérol libre, favorisant ainsi sa migration au

centre de la HDL. La HDL formée prend le nom de HDL3 et adopte une forme sphérique.

Sous l'action combinée de la LCAT qui l'enrichira en cholestérol et de la CETP qui

l'enrichira en TG, mais réduira son contenu en cholestérol, la HDL3 grossira et deviendra

une HDL2 (30). Cette dernière pourra, sous l'effet des lipases hépatiques et endothéliales,

réduire son contenu en TG et retourner au stade de HDL3. Les interactions entre les HDL3

et SRBI au foie permettront l'élimination du cholestérol.

Tiré de (14).

29

ont une taille de 90 à 100 Â, une densité de 1.063 à 1.125 g/dL et présentent une

composition d'environ 5% de TG, 17% de cholestérol estérifié, 5% de cholestérol libre,

55% de phospholipides et 40% de protéines (15,16). La HDL2 compte plusieurs enzymes à

sa surface telles que la paraoxonase qui lui confère des propriétés antioxydantes (31) et la

lécithine cholestérol acyl transferase (LCAT) qui estérifié le cholestérol libre de la surface

des lipoprotéines (32). Sous l'action de la CETP, la HDL2 donnera du cholestérol et recevra

des TG des VLDL et IDL (33). Ce transfert de TG augmente la taille et accélère le

catabolisme hépatique de la HDL2. Cet enrichissement en TG contribuera aussi à faire de la

HDL2 un meilleur substrat pour la lipase hépatique et à un moindre égard la lipase

endothéliale. Ces lipases permettront l'hydrolyse des TG et PL de la HDL2 ce qui réduira sa

taille jusqu'au niveau de la HDL3 (34).

Les HDL3 sont caractérisées par une taille s'échelonnant entre 70 et 90 Â, une densité de

1.125 à 1.210 g/dL et une composition d'environ 55% de protéines, 25% de

phospholipides, 13% de cholestérol estérifié, 4% de cholestérol libre et 3% de TG. Notons

que l'augmentation de la proportion de cholestérol contenu dans les HDL3 par rapport à

celle des HDL2 contribue à réduire leur catabolisme et à prolonger leur demi-vie en

circulation. La HDL3 possède une affinité accrue pour le récepteur SRBI des hépatocytes et

des cellules stéroïdiennes qui videra la HDL3 de son contenu en cholestérol et la retournera

dans le cycle du transport inverse du cholestérol. Pour ces raisons, les HDL3 semblent avoir

un potentiel cardioprotecteur plus important que les HDL2. La HDL3 compte plusieurs

enzymes à sa surface telles que la paraoxonase qui lui confère des propriétés antioxydantes

(31). Finalement, les apo AI libres seront métabolisées aux reins (34,35).

2.4.1 Lipoprotéine de haute densité et efflux de cholestérol

La relation inverse entre les concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol et la maladie

coronarienne est connue depuis très longtemps (10,36,37) et différents traitements tels que

les statines, les fibrates et la niacine sont reconnus pour augmenter les niveaux de HDL-

cholestérol avec des niveaux de succès variables (38,39). Des élévations de HDL avaient

toujours été considérées comme cardioprotectrices jusqu'à l'avènement de l'étude

30

ILLUMINATE. Dans cette étude, le Torcetrapib, un inhibiteur de la CETP, a augmenté de

72.1% les concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol, mais l'étude a été interrompue

prématurément des suites d'une augmentation de la mortalité cardiovasculaire causée par

l'utilisation du médicament (RR : 1.25 ; IC95% : 1.09-1.44) (40). En réponse à ces

résultats, un changement de paradigme a été observé dans la communauté scientifique. La

recherche préalablement axée sur l'augmentation des HDL devient désormais centrée sur

l'augmentation du transport inverse du cholestérol. Les mécanismes de l'efflux du

cholestérol, un déterminant majeur du transport inverse seront revus dans la présente

section. Notre revue se limitera aux macrophages/cellules spumeuses puisqu'ils

représentent le type cellulaire majoritairement impliqué dans l'accumulation du cholestérol

dans la paroi vasculaire.

2.4.2 Lipoprotéine de haute densité et efflux de cholestérol dans le macrophage

Le passage du cholestérol ou des oxystérols du macrophage à la circulation s'effectue

principalement par des interactions avec l'albumine, l'apoAI délipidée et la HDL. Il existe

une diffusion passive du cholestérol vers l'albumine et le milieu, un efflux associé à la

sécrétion de l'apoE, un efflux médié par le récepteur d'épuration Bl (SRBI) et finalement

un transport actif et unidirectionnel par les cassettes de liaison à l'ATP Al (ABCA1) et Gl

(ABCG1) (41). Cependant, il a été montré dans les modèles murins d'inactivation génique

d'ABC Al et ABCG1 que ces deux transporteurs étaient responsables de 60 à 100% de

l'efflux de cholestérol (42-45). En accord avec les résultats observés chez la souris, des

diminutions des concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol et de l'efflux de

cholestérol sont notées chez les porteurs humains de la maladie de Tangier, caractérisés par

une diminution du niveau d'expression d'ABCAl (46-48). De plus, la Copenhagen City

Heart Study a raporté qu'environ 10% des individus avec des niveaux de HDL-cholestérol

faibles avaient une mutation hétérozygote dans le gène ABC Al (49). Enfin, une étude in

vivo suggère que SRBI aurait aussi un rôle important à jouer dans l'efflux de cholestérol

dans le tableau 3 (50). Vous trouverez un résumé des différents transporteurs impliqués

dans l'efflux de cholestérol

31

Tableau 3 : Comparaison des principales protéines impliquées dans l'efflux de cholestérol

ABCA1 Ref ABCG1 Ref SRBI Ref Localisation 9q31 (51) 21q22.3 (52) 12q24.2 (53) chromosomale Nombre 50 (51) 23 (52) 13 (53) d'exons # acides 2261 (51) 23 (52) 509 (54) aminés Taille (KDa) 220 (55) 64-79 (55) 82 (54) Accepteur de Apo AI (55) HDL (55) HDL, LDL (56) lipides sans lipide

Agoniste LXRs (55) LXRs (55) LXRs (57) AMPc (55) Pas stimulé (58) oxystérols par AMPc

Adapté de (59)

2.4.2.1 ABC Al et efflux de cholestérol

Le gène ABCA1, localisé en position 9q31, comporte 50 exons et encode 2261 acides

aminés (51). Le transport de cholestérol dépendant d'ABCAl est principalement associé à

la formation des apoAI et des HDL-naissantes. En effet, la lipidation de l'apoAI inhibe les

liaisons avec ABCA1 tant au niveau membranaire qu'intracellulaire, confirmant

qu'ABCAl est impliqué dans la formation de petite particule de HDL (60,61). Des

évidences s'accumulent concernant l'endocytose et la resécrétion de l'apoAI dans ce type

d'efflux de cholestérol (62,63). Parmi ces évidences, la colocalisation de l'apoAI et

d'ABCAl dans l'endosome est pertinente (64). Dans cette étude, il a aussi été montré

qu'ABCAl se déplace entre l'endosome tardif et la membrane plasmatique. Une autre

étude a récemment montré que l'apoAI favorise le déplacement d'ABCAl de la membrane

plasmatique à l'endosome et que l'excrétion des molécules formées s'effectue 4 fois plus

rapidement à partir de l'endosome que par dissociation de la membrane plasmique (65).

Chez l'humain, des mutations dans le gène de l'ABC Al causent la maladie de Tangier

laquelle est caractérisée par des concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol très

faibles, une accumulation rapide du cholestérol dans les macrophages et cellules spumeuses

ainsi qu'une augmentation du risque cardiovasculaire (46,66-68).

32

Le gène ABCA1 est activé en réponse à plusieurs stimuli tels que certains oxystérols et

l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Plus spécifiquement, l'expression d'ABCAl

est induite par les récepteurs X du foie (LXR) a et (3 ainsi que par le récepteur X rétinoïque

(RXR) qui s'hétérodymérisent avant d'être activés par les oxystérols et les acides

rétinoïques respectivement (69). Pour sa part, l'expression des LXR est stimulée par les

récepteurs activés du proliférateur de peroxysomes (PPARs) (70,71). La phosphorylation

de la protéine ABC Al par la kinase Janus 2 (JAK2) et la protéine kinase A (PKA)

contribue également à son activation (72,73). Dans les macrophages, le 27-

hydroxycholestérol (27-OH), qui est majoritairement produit par la 27-cholestérol

hydroxylase du cytochrome P450 (CYP27) est aussi un activateur. Les niveaux de 27-OH

contient avec les niveaux plasmatiques de cholestérol ce qui explique la rétroactivation

positive de l'expression d'ABCAl qui augmente l'efflux de cholestérol, lorsque le

macrophage accumule du cholestérol (74).

2.4.2.2 ABCG1 et efflux de cholestérol

Le gène de l'ABCGl se situe en position 21q22.3, est composé de 23 exons et possède

plusieurs transcrits (52). Alors qu'ABCAl ne lie que l'apoAI pauvre en lipides (60,61),

ABCG1 semble agir en augmentant l'affinité de la membrane pour différents transporteurs

de cholestérol (75). Contrairement à l'ABCAl, ABCG1 crée donc un efflux de cholestérol

vers une pléiade d'accepteurs de cholestérol tels que les vésicules de phospholipides ainsi

que les particules HDL et LDL (75). Notons aussi qu'ABCGl a une avidité importante

pour les sterols modifiés en position 7 tel que le 7-kétocholestérol, un oxystérol impliqué

dans l'apoptose et la nécrose des macrophages (76). La lipidation induite par ABCA1 rend

la molécule prête à interagir avec ABCG1 (77-79). ABCG1 est, comme ABCA1, stimulée

par les agonistes LXRs (55) mais ne l'est pas par l'AMPc (58).

33

2.4.2.3 SRBI et efflux de cholestérol

SRBI est composé de 12 exons et se situe en position 12q24.2 (53). C'est une glycoprotéine

composée de 55 acides aminés et de masse moléculaire de 82 KDa (53,54,80). Elle se

retrouve dans les calvéolines de la membrane plasmique (81). Contrairement aux membres

de la famille ABC, SRBI effectue un échange bidirectionnel. Les principaux ligands de

SRBI sont les LDL oxydées et acétylées, les VLDL et les phospholipides. Il est exprimé

préférentiellement dans les sites importants du transport inverse du cholestérol comme les

hépatocytes et les macrophages (82). Ses fonctions principales sont de favoriser l'entrée du

cholestérol HDL dans les cellules indépendamment des apoprotéines ainsi que d'effectuer

un échange bidirectionnel du cholestérol non estérifié et des phospholipides entre les HDL

et les cellules (56).

Les modèles murins d'inactivation de SRBI n'ont montré aucune variation dans l'excrétion

fécale de cholestérol. Cependant, une augmentation à court terme (83,84) et une

diminution à long terme du risque cardiovasculaire (84,85) étaient observées. Cette relation

est logique si l'on considère que SRBI échange le cholestérol sur la base des gradients de

concentrations; il apporte du cholestérol aux cellules en contenant une faible quantité et en

retire à celles qui en contiennent beaucoup. Contrairement à ce qui est observé pour

ABCG1, la lipidation induite par ABCA1 ne favorise pas les interactions avec SRBI (79).

De plus, SRBI inhibe ABCG1 ; ce qui suggère que lors de l'activation du transport

bidirectionnel, le transport actif unidirectionnel est réduit (86).

Le contenu en phospholipides des particules régule de façon marquée le type d'efflux. Par

exemple, une surexpression de la lipase endothéliale favorise l'hydrolyse des

phospholipides des HDL matures ; ce qui favorise l'efflux ABC Al dépendant et réduit

celui de SRBI (87). Toutefois, une surexpression de la phosphatidylserine phospholipase

A2 (PS-PLA2) augmente la composition en phospholipide des HDL, ce qui augmente

l'efflux SRBI-dépendant et réduit l'efflux ABCA1-dépendant (87). Supportant le rôle

prépondérant des phospholipides dans l'efflux du cholestérol (88), il a été rapporté que les

34

phospholipides sont un meilleur marqueur de l'influx de cholestérol des HDL vers les

hépatocytes que les quantités de cholestérol des HDL (89). L'utilisation des concentrations

plasmatiques de phospholipides des HDL a récemment été montrée comme un meilleur

marqueur de la présence et de la sévérité de la maladie coronarienne que le HDL-

cholestérol (90,91). Cependant, ces résultats devront être validés dans le cadre d'études

incluant de plus grandes populations.

35

Chapitre 3. Oxydation et maladie cardiovasculaire

L'augmentation de la demi-vie de la LDL en circulation contribue à favoriser son

oxydation, un phénomène qui amplifie son athérogénicité. Plusieurs causes peuvent

engendrer ce phénomène, mais nous porterons notre attention sur les deux principales et sur

le processus qui en découle.

3.1 Oxydation des LDL

Tout d'abord, le chimiste autrichien Hermann Esterbauer a observé que la réaction des

acides gras polyinsaturés (AGPI) des particules LDL avec les radicaux libres produits par

réaction entre les ions métalliques et le peroxyde d'hydrogène (H2O2) forme des aldéhydes

proathérogènes (92). De plus, ce groupe de recherche a aussi montré que suite à

l'oxydation des AGPI en aldéhydes, des modifications des résidus lysines de l'apoB

modifiaient les propriétés intrinsèques de la particule LDL. Enfin, ils ont aussi montré ex

vivo que les antioxydants tels que les vitamines E et C (22,93) permettaient de réduire la

réaction d'oxydation de la LDL in vitro.

Pour leur part, le groupe de Daniel Steinberg a montré que l'incubation de LDL en présence

de macrophages en culture amenait des changements oxydatifs dans les LDL et que ces

changements les empêchaient d'être reconnues par le récepteur hépatique des LDL (94,95).

Ce sont les premières évidences expérimentales du lien de causalité unissant le système

immunitaire et le développement de l'athérosclérose.

3.1.1 Processus de l'oxydation des LDL

Le phénomène d'oxydation des LDL est progressif et se produit en plusieurs étapes. Ces

étapes ont mené à une caractérisation plus précise des LDL (96). La première étape est un

ensemencement de la LDL par des lipides préalablement oxydés provenant soit de

36

l'alimentation ou soit des tissus périphériques est rapporté dans la littérature (97,98).

Notons qu'à cette étape, la LDL n'a pas été directement en contact avec des oxydants, mais

avec des produits dérivés de l'oxydation. Lors de la seconde étape, la LDL est mise en

présence d'un agent oxydant et elle utilisera ces défenses endogènes comme la vitamine E.

Parmi les agents oxydants les plus reconnus, citons: la xanthine oxydase (99,100), le

péroxynitrite (101,102), la myeloperoxydase (103,104), la lipoxygenase (105) et bien

d'autres agents. Différents facteurs peuvent augmenter le stress oxydatif comme le

vieillissement, l'activité physique intense, une détérioration du profil lipidique (106-109)

ainsi que le diabète, une maladie inflammatoire chronique, l'obésité abdominale et le

cancer (109-111).

La première rencontre entre les agents oxydants et une LDL formera une LDL légèrement

oxydée (mmLDL). Les composantes lipidiques seront premièrement ciblées, plus

spécifiquement les phospholipides et les acides gras polyinsaturés (AGPI). Le processus

d'oxydation des AGPI est détaillé dans la figure 4.

Brièvement, la deuxième étape ou l'initiation se produit au moment où un composé

radicalaire réagit avec un AGPI qui deviendra à son tour instable et très réactif. Le produit

résultant réagira avec une molécule d'oxygène (O2) pour former un aldéhyde

proathérogène. Dans le cadre de la troisième étape de propagation, cet aldéhyde radicalaire

échangera son radical avec un AGPI intact. Cette AGPI réagira à son tour avec une

molécule d'Û2 pour former un aldéhyde radicalaire qui à son tour réagira avec un AGPI

intact, favorisant la propagation de l'oxydation des AGPI de la LDL. Ainsi théoriquement,

une seule molécule oxydante aurait le potentiel d'oxyder tous les AGPI d'une LDL, soit

plus de 55% de la molécule. Heureusement, ce cycle d'oxydation peut être arrêté lorsqu'un

AGPI oxydé sera réduit par un antioxydant. À cet égard, les antioxydants ont pour les

oxydants une affinité différente qui est basée sur leur potentiel oxydoréducteur. La vitamine

E est selon certaines études, le principal briseur de chaîne liposoluble dans le plasma

humain (112). Les étapes de l'oxydation de la LDL sont retrouvées dans la figure 5.

Étape 1 : Ensementcement

37

Étape 2 : Initiation R 2 N 2 ^ 2 R +N2

R*+02-* ROO*

ROO' + L H ^ ROOH + L*

Étape 3 : Propagation L + 0 2 ^ LOO

LOO' + L H ^ LOOH + L*

Etape 4 : Inhibition LOO + AH -> LOOH + A

Étape 5 : Terminaison LOO + A —► produit non radicalaire

LOO + LOO —* produit non radicalaire

Figure 4 : Processus d'oxydation des acides gras polyinsaturés des LDL par les radicaux libres

(L= acide gras polyinsaturé; OO = fonction aldéhyde radicalaire; H= un atome d'hydrogène Adapté de Huang et coll. (113)

LDL Intacte

i Ensemencée

Légèrement oxydée i

Oxydée et modifiée

Oxydation Aucune

Phospholipides et AGPI en faible quantité

Phospholipides et AGPI

Phospholipides, AGPI et Apo B100

Figure 5 : Étapes de l'oxydation des LDL

38

Lors de l'étape de formation de la mmLDL, les défenses antioxydantes ne sont pas

épuisées, mais l'oxydation des AGPI et des phospholipides est déjà bien présente. Parmi les

lipides oxydés, plusieurs auront des caractéristiques proathérogéniques. Citons notamment

une induction de la chimiotaxie des monocytes par activation de MCP-1 (114) et une

meilleure pénétration intimale des monocytes recrutés par induction des molécules

d'adhésion endothéliale intercellulaire-1 (ICAM-1) et vasculaire-1 (VCAM-1) (115,116).

Parmi les autres effets proathérogènes possibles des mmLDL, des impacts sur la

prolifération cellulaire (117,118), la dysfonction endothéliale (119,120) ainsi qu'un effet

procoagulant (121) ont notamment été rapportés dans la littérature.

L'étape suivante est la LDL oxydée et modifiée. Lorsque les défenses antioxydantes sont

épuisées, le processus d'oxydation s'accélère et, après avoir réagi avec la majorité des

lipides, il ciblera les protéines présentes sur la LDL (122). Les modifications protéiques

seront principalement apportées aux résidus lysines ce qui entraînera son incapacité à être

reconnue par le récepteur hépathique des LDL et à être éliminée efficacement. L'organisme

doit donc recourir à une autre stratégie pour éliminer ces composés hautement oxydés. Pour

ce faire, les LDL oxydées seront reconnues par différents récepteurs d'épuration exprimés à

la surface des macrophages et des cellules musculaires lisse qui internaliseront avidement

ces LDL oxydées et formeront les cellules spumeuses, la première étape de l'athérosclérose

(123). Les apo B100 oxydées entraîneront une induction de l'expression de l'interleukine-1

par le macrophage (124) ainsi qu'une génération d'anticorps contre l'apoBlOO oxydée

(125).

3.1.2 Marqueurs d'oxydation des LDL dans le plasma humain

Bien que l'implication des modifications oxydatives dans le processus athérosclérotique

soit connue depuis longtemps, ce n'est qu'au cours des 15 dernières années qu'un anticorps

monoclonal contre la LDL oxydée a été produit et utilisé in vivo chez l'humain (126). Telle

qu'exposée au début du chapitre 3, l'oxydation des LDL est complexe et comporte

l'oxydation de plusieurs molécules lipidiques et protéiques menant à une diversité d'agents

oxydants. Par conséquent, les anticorps monoclonaux utilisés dans le cadre des tests de

39

détermination des LDL oxydées plasmatiques sont très spécifiques, sélectifs et exclusifs.

Plusieurs anticorps dirigés contre les composés oxydés des particules LDL ont été produits.

Quatre anticorps desquels découlent 6 méthodes sont davantage utilisés, seront décrits dans

le cadre du présent chapitre et sont résumés dans le tableau 4.

Tableau 4 : Comparaison entre les différentes méthodes de mesures de LDL oxydée dans le plasma

Antigène DLH3 E06 ML25-1H11 4E6 phosphatidylcholine phosphorylcholine LDL modifié par Apo B oxydé malondialdhéyde modifié

Type d'ELISA

Unité reconnue

Niveau d'oxydation Mécanismes associés

Références

Sandwich

une LDL oxydée

Faible

NF-kB,...

(127-129)

Double sandwich Sandwich

Phosphorylcholines une LDL oxydée

Faible et Moyen Faible

NF-kB NF-kB

(130-132) (133,134)

Compétition

une Apo B oxydée Élevée

LOX-1 et formation cellule spumeuse (134-136)

Les quatre anticorps sont DLH3, un antiphosphatidylcholine oxydé; E06, un

antiphosphorylcholine (137,138), ML25-1H11, un anti-LDL modifiée par le

malondialdhéyde (133) ainsi que 4E6, un anti-apoB oxydée. Comme les trois premiers se

lient de manière non spécifique aux lipides, ils lient aussi les lipides oxydés des autres

constituants cellulaires tels que les HDL, les VLDL, etc. Par conséquent, ce manque de

spécificité pour le LDL force l'utilisation d'une méthode ELISA de type sandwich qui

utilise un second anticorps qui liera l'apoB. Dans le cas de l'anticorps E06, il peut y avoir

ou non séparation des LDL par ultracentrifugation précédant le test, mais les deux

méthodes contient très peu entre elles (1^=0.151) (139). Dans la méthode plasmatique, les

concentrations plasmatiques de LDL oxydées conèlent avec celles de cholestérol total

(r2=0.303) (129) ; ce qui n'est pas le cas lors de la séparation par ultracentrifugation. En

plus de la divergence d'épithète antigénique, les méthodes E06 et DLH3 divergent au

niveau de leur référence. Alors que le DLH3 utilise les deux anticorps dans le même puits,

40

celui du E06 utilise deux puits : un pour le marqueur d'oxydation et l'autre pour l'apo B.

Considérant qu'une seule molécule d'apo B est présente par molécule de LDL et, par le fait

même, un seul site de liaison à l'anticorps, avec le E06, le nombre de particules de LDL

oxydées est compté alors qu'avec le DLH3, un dénombrement de la quantité totale de

molécules oxydées sur la quantité totale de particules de LDL (i.e. apo B100) est effectué.

Ainsi, l'information fournie par les deux méthodes est différente. Les méthodes DLH3 et

ML25-1H11 basent leur détection sur la présence d'une molécule oxydée par particule de

LDL et seraient plus sensibles aux niveaux faibles d'oxydation alors que celle d'E06 le

sera à tous les niveaux. Les trois premières méthodes ont recours à un second anticorps

pour identifier la particule LDL qui pounait toutefois ne pas reconnaître les LDL

lourdement oxydées. L'oxydation de l'apo B100 occupe plusieurs rôles dans

l'athérosclérose. Pour sa part, la méthode 4E6 ne mesure que les LDL fortement oxydées,

car comme décrit dans la section 3.1.1, l'oxydation de l'apo B se produit bien après

l'oxydation lipidique.

3.1.3 Relation entre la MCV et les marqueurs plasmatiques de l'oxydation des LDL

Les LDL oxydées sont détectées dans la plaque athéromateuse (140,141) et ce,

indépendamment de l'anticorps utilisé. Des concentrations plasmatiques de LDL oxydées

sont également élevées dans les cas de maladie coronarienne et d'athérosclérose lorsque

comparées à des sujets sains (127-132,134-136). Toutefois, aucune de ces méthodes n'a

permis d'identifier la LDL oxydée comme un marqueur indépendant du risque

cardiovasculaire. Une étude a montré une augmentation des concentrations plasmatiques de

LDL oxydée suite à une intervention coronarienne percutanée chez l'humain (142). Ces

résultats suggèrent donc qu'un relargage de LDL oxydée se produit lorsque la plaque

athérosclérotique est instable. L'absence de variations plasmatiques significatives des

marqueurs d'inflammation supporte cette hypothèse. Par conséquent, une diminution des

concentrations de LDL oxydées pounait provenir d'une diminution de la perméabilité de la

plaque athérosclérotique instable : phénomène couramment associé aux proteases des

matrices (MMPs).

41

3.2 Marqueurs de la capacité antioxydante

Bien que plusieurs marqueurs de l'oxydation des LDL aient été présentés, il existe

plusieurs marqueurs de la capacité antioxydante plasmatique. Une liste non exhaustive des

principaux marqueurs de la capacité antioxydante selon leur classification sera présentée.

Notons que les mesures de l'activité enzymatique et de la capacité antioxydante de

molécules impliquées dans les défenses endogènes antioxydantes seront volontairement

omises afin d'éviter d'alourdir le texte.

Les différentes méthodes utilisées afin de calculer la capacité antioxydante sont

généralement séparées selon le mécanisme d'action de la réaction chimique impliquée dans

le test. Le premier groupe est basé sur le transfert d'atome d'hydrogène (TAH) alors que le

second se rapporte aux réactions de transfert d'électron (TE). Brièvement, afin de bien

saisir la nuance entre ces concepts, une analogie peut être faite avec le pouvoir acide qui

peut être défini, d'une part, comme un donneur d'hydrogène et, d'autre part, comme un

accepteur d'électron. Pour sa part, le donneur d'hydrogène implique le déplacement d'une

molécule, ce qui n'est pas nécessairement le cas pour le transfert d'électron. Ainsi, de

manière générale, le test TE impliquera une seule réaction redox et le marqueur sera

généralement la molécule oxydante réduite. Par ailleurs, le test de type TAH utilise un

générateur de radicaux libres, un marqueur oxydable ainsi qu'un antioxydant qui entrera en

compétition avec les antioxydants de l'échantillon. Ainsi les antioxydants du TE sont très

spécifiques à la réaction étudiée alors que ceux du TAH couvrent un éventail généralement

plus large d'antioxydants puisqu'ils peuvent aussi réagir directement avec le générateur de

radicaux libres.

3.2.1 Marqueurs de la capacité antioxydante p a r transfert d 'atome d'hydrogène (TAH)

L'étude de la cinétique de la réaction de transfert d'hydrogène sans utilisation d'ozone par

le groupe de Griffin au début des années 70 a contribué à paver la voie vers l'ensemble des

méthodes de type TAH utilisées aujourd'hui (143). Les différentes méthodes d'analyses des

42

TAH seront ici présentées selon l'ordre chronologique de leur découverte. Un résumé de

ces méthodes se retrouve également dans le tableau 5.

3.2.1.1 Méthode de l'inhibition de la séquestration d'oxygène (IOU)

La première méthode servant à déterminer la capacité antioxydante a été mise au point par

le groupe d'Ingold en 1981 et fut d'abord utilisée pour caractériser la vitamine E (144).

Cette dernière utilise le styrène comme substrat et l'azobutylnitrile (AIBN) comme

producteur de radicaux libres. Ce modèle de capacité antioxydante n'a pas été très utilisé

dans la littérature. Cet état de fait est probablement dû aux limitations méthodologiques

associées à cette méthode. Par exemple, la collecte de données doit se faire sous pression

très élevée et la sensibilité ne semble pas être suffisante pour la mesure de la capacité

antioxydante dans les aliments (145).

3.2.1.2 Méthodes de l'inhibition de T autooxydation lipidique (IAL)

Un peu plus tard, Pryor et coll. ont développé une nouvelle méthode. Cette méthode est

basée sur l'induction de l'oxydation de l'acide linoléique ou de la LDL par l'ion cuivrique

(Cu2+) ou un composé azo, plus fréquemment : le dichloryde de 2,2v-azobis (2-

amidinopropane) (AAPH) (146,147). Les variations de l'oxydation dans les composés azo

sont mesurées par absorbance UV (148) alors que pour l'oxydation initiée par l'ion

cuivrique, la chromatographic en phase gazeuse est utilisée (149). Dans les deux cas, une

phase d'oxydation rapide se produit suivis d'une période de stabilisation. C'est au cours de

cette période que l'oxydation des lipides s'effectue. La durée de la période de stabilisation

est proportionnelle à la protection antioxydante alors que le degré de la pente est

inversement proportionnel. Dans le cas de la méthode par azo, plusieurs produits de

décomposition des composés phénoliques provenant des aliments comme les

hydroquinones et les catechols absorbent à la même longueur d'onde que l'AAPH et

réagissent avec les radicaux libres, créant ainsi de l'interférence (150).

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Pour sa part, la méthode par ion cuivrique mesure principalement l'hexanal. Ce dernier

étant un des nombreux produits de dégradation de la particule LDL oxydée, cela jette un

doute sur la validité de la mesure. De plus, l'ion cuivrique favorise la production de

radicaux libres en oxydant la vitamine E et en l'utilisant comme agent oxydant. Ainsi, la

contribution à la capacité antioxydante de la vitamine E est inversée. Par exemple, les gens

avec de faibles niveaux de vitamine E dans leur LDL, en utilisant cette méthode, pounaient

avoir une augmentation de leur capacité antioxydante due à une production de radicaux

libres moindre. L'ajout de vitamine E dans la méthodologie permet de pallier partiellement

à cette dernière limitation.

3.2.1.3 Capacité d'absorption des radicaux oxygénés (ORAC)

Initialement développée en 1993 par Cutler et Cao, (151) puis modifiée par Ou et al. (152),

la méthode ORAC utilise l'AAPH (voir chapitre 3.1.1.1.2) comme générateur de radicaux

libres et la fluorescéine comme traceur. Un des avantages de la fluorescéine est qu'elle

permet une mesure d'échantillon lipophile et hydrophile (153). La mesure de l'ORAC est

basée sur le calcul de l'aire sous la courbe comparée à un standard connu, généralement le

Trolox. Cette méthode est aujourd'hui l'une des plus répandues et est utilisée fréquement

en combinaison avec celle de l'essai total phénolique (154,155).

3.2.1.4 Essai du blanchiment de la crocine (EBC)

Dans ce test, les propriétés de la crocine, un membre de la famille des caroténoïdes, qui

change de couleur de l'orange au blanc suite à son oxydation par l'AAPH est mise de

l'avant (156,157). Il est ensuite possible de quantifier par colorimétrie les variations

observées dans le temps. Par contre, plusieurs molécules, particulièrement des

caroténoïdes, sont reconnues pour absorber à la même longueur d'onde. L'utilisation d'une

solution contrôle avec l'échantillon sans crocine peut partiellement éliminer cette

interférence.

45

3.2.1.5 Piégeage des radicaux peroxyls totaux (TRAP)

Comme la plupart des autres méthodes de détection de type TAH, le TRAP utilise le AAPH

comme producteur de radicaux libres. Cependant, il utilise la R-phycoerythréine comme

sonde fluorescente (158). Contrairement à la méthode EBC, la méthode TRAP ne tient pas

compte du pouvoir antioxydant des molécules individuelles, mais seulement de leur

quantité (157). Par conséquent, cette méthode surestimerait la contribution des molécules

avec un pouvoir antioxydant faible au détriment de celles avec un pouvoir antioxydant plus

élevé.

3.2.2 Marqueurs de la capacité antioxydante p a r transfert d'électron (TE)

Contrairement à la méthode du transfert d'atome d'hydrogène, qui requiert un producteur

de radicaux libres, celle du transfert d'électron n'a besoin que d'un oxydant et d'un

antioxydant ; la sonde étant la molécule oxydante qui sera réduite par l'antioxydant.

Généralement, la molécule oxydante change de couleur suite à sa réduction, ce qui facilite

la quantification de la capacité antioxydante. Cette donnée est comparée avec une courbe

standard de Trolox ou d'acide gallique. Dans ces méthodes, aucun radical libre n'est

produit et la capacité antioxydante est synonyme de capacité de réduction. De plus,

contrairement au TEAC, la proximité des mécanismes d'action de ces molécules fait que

ces méthodes conèlent généralement bien entre elles (159). Un résumé des principales

caractéristiques de ces méthodes est retrouvé dans le tableau 6.

3.2.2.1 Mesure des composés phénoliques totaux par Folin-Ciocalteu (FCR)

Initialement, le réactif a été caractérisé par Folin et Ciocalteu en 1927 pour ces capacités à

lier les groupements phénols et indoles retrouvés respectivement sur les acides aminés

tyrosine et tryptophane (160). Lowry et coll. en 1951 en ont fait le réactif de leur test de

détection protéique dont la publication (161) est encore aujourd'hui la plus citée dans

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47

l'ensemble de la littérature scientifique (162). Ce réactif a aussi été utilisé par le groupe de

Mangas pour la détermination des « composés polyphénoliques » totaux dans le jus de

pommes (163). Bien qu'il soit nommé comme une mesure des composés phénoliques

totaux, ce test détecte aussi la plupart des agents réducteurs comme la vitamine C, les

composés phénoliques, etc.... En contrepartie, ce test est très simple et reproductible ce qui

en fait un test de la capacité antioxydante des plus utilisés.

3.2.2.2 Capacité antioxydante en équivalent Trolox (TEAC)

Ce test utilise le 2,2 azinobis (3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulfonique) (ABTS2) qui

passe du bleu foncé à incolore selon son état d'oxydation (164,165). Ce test est simple,

pratique et conèle bien avec la mesure des composés phénoliques totaux. Cependant,

quelques incongruités ont été notées entre les coefficients stoechiométriques et la capacité

antioxydante. Par exemple, les flavonoïdes quercetine et kaempferol ont des valeurs TEAC

de 3.00 et 1.00 respectivement alors qu'ils sont très comparables en ce qui concerne leur

pouvoir réducteur. La réaction avec l'ABTS2" présente possiblement quelques subtilités non

encore élucidées qui pounont éventuellement expliquer ces variations observées entre les

coefficients stoechiométriques et les valeurs du test.

3.2.2.3 Puissance antioxydante par réduction de l'ion ferrique (FRAP)

La méthode du FRAP utilise, pour sa part, le sel fenique de Herein ou le FE(III)( 2-4-6-

tripyridyl-5-triazine)2Cl3 comme agent oxydant (166). Le potentiel oxydoréducteur du

FE(III)( TPTZ)2C13 est similaire à celui de l'ABTS (0.70 V vs. 0. 68 V respectivement).

Une des limitations de cette méthode provient des chélateurs métalliques, qui sont

généralement présents dans les extraits alimentaires et qui peuvent former des complexes

avec le fer et interférer avec la réaction chimique. D est à noter que les polyphenols

contrairement à plusieurs autres antioxydants réagissent en deux temps. Une première pente

plus abrupte est suivie d'une plus pente lente qui peut s'échelonner sur plusieurs heures.

Puisqu' aucun consensus scientifique sur la standardisation de la durée de la lecture de la

mesure, il devient plus difficile de comparer différents essais entre eux. En dépit de cette

48

limitation, ce test est tout de même couramment utilisé et cité dans la littérature

scientifique.

3.2.2.4 Capacité antioxydante par utilisation du Cu (II)

Ce test est très similaire au FRAP à l'exception que le pouvoir oxydant du fer est remplacé

par celui du cuivre. Le bathocuproine (2,9 dimethyl-4,7 diphényl-1, 10-phénanthroline) est

utilisé pour les vitamines (167,168) alors que le tetrabenzo( 1,5,9,13)

tetraazacyclohexadecine-Cu(II) est utilisé pour les produits végétaux (169). Cette méthode

permet de pallier à la faiblesse du FRAP mais n'a toutefois pas fait l'objet d'une

investigation poussée.

3.2.2.5 Capacité d'accepteur de radicaux libres par le DDPH

Le 2,2 diphényl-1 piérylhydrazyle (DDPH) est un des seuls oxydants avec un groupement

azoté (170). Cette distinction propre à cette méthode est aussi sa principale limitation, car le

DPPH est un radical azoté à longue durée de vie contrairement à l'oxyde nitrique (ONOO')

qui est très réactif et transitoire. Par conséquent, il est possible que certains antioxydants

qui réagissent rapidement avec l'oxyde nitrique réagissent lentement ou encore ne

réagissent pas avec le DPPH. Par exemple, l'eugénol et certains polyphenols avec des

structures similaires ne réagissent pas avec le DPPH (171). Est-ce représentatif d'une

absence de réaction de ces molécules avec l'oxyde nitrique ou simplement d'une lacune de

détection tributaire de la méthode?

3.2.3 Mesure de la capacité antioxydante et maladie cardiovasculaire

Dans le cadre de l'oxydation de la LDL, on sait que la propagation de l'oxydation des

AGPI présents dans la particule est un phénomène qui peut être anêté par un antioxydant.

Pour ce faire, il est nécessaire que l'antioxydant transfère un atome d'hydrogène qui se

fixera sur la structure du radical peroxyde présent sur l'acide gras pour le neutraliser. Tel

qu'illustré précédement (figure 4, page 34), il s'agit d'une étape clé pour terminer la

49

propagation de l'ion radicalaire. Les méthodes de la catégorie TAH sont davantage

représentatives de l'inhibition de l'oxydation des AGPI présents sur la LDL par un

antioxydant. Pour sa part, la réaction de type TE mesurera une réaction de neutralisation

des radicaux libres, et ce, indépendamment de la capacité à terminer la propagation de

l'oxydation des AGPI. Cependant, il pouna être un indicateur de la capacité à neutraliser un

plus vaste éventail de réactions d'oxydation. Notamment, il peut éliminer les espèces

réactives de l'oxygène (ROS) et chélater les métaux qui favorisent le processus oxydatif

ainsi que le pouvoir réducteur des enzymes antioxydants des échantillons testés.

Indépendamment de ses importantes différences méthodologiques, les différents tests de TE

conèlent généralement très fortement entre eux. Par exemple, des coefficients de

conélation s'échelonnant de 0.87 à 0.99 ont été rapportés entre les méthodes du FCR, de

TEAC, de FRAP et de DPPH (172). De plus, une récente étude de Dudonné et coll. a

montré une excellente association entre les tests de TEAC, de DPPH, d'ORAC et de FRAP

(Tableau 7) en utilisant un échantillon de plus de 30 types d'extraits de plantes différents.

Les conélations s'échelonnaient de 0.618 entre le FRAP et l'ORAC à 0.966 entre le TEAC

et le FCR. Notons que les tests de type TEC conèlent bien entre eux, mais moins bien avec

celui d'ORAC (159).

Tableau 7 : Coefficients de conélation entre les tests de TEAC, DPPH, ORAC et FRAP.

DPPH TEAC FRAP FCR

TEAC 0.906 FRAP 0.822 0.946

FCR 0.939 0.966 0.906

ORAC 0.852 0.760 0.618 0.831

Adapté de Dudonné et collaborateur (159)

Bien que le rôle de l'oxydation dans le développement de la MCV fasse consensus au

niveau scientifique et que l'hypothèse antioxydante en prévention et traitement

cardiovasculaire soit l'objet de recherches scientifiques intensives, peu d'études

épidémiologiques se sont penchées sur la relation entre les marqueurs de la capacité

50

antioxydante et l'incidence de maladie cardiovasculaire. Une des principales raisons à cette

lacune provient probablement du fait que les méthodes de mesures nécessitent des

échantillons frais ; ce qui empêche l'utilisation d'études rétrospectives pour générer des

données. En fait, les études de types cas-contrôle se prêtent mieux à ce genre d'analyse,

mais encore là, peu de cohortes ont été mises sur pied. Par exemple, l'étude de Noriji et

coll. a montré que les sujets avec MCV avaient des niveaux plus faibles de TEAC que les

sujets sains (173). De plus, des analyses de régression ont montré que c'est le TEAC qui

était le paramètre antioxydant le plus associé à la MCV parmi une pléiade d'autres incluant

les niveaux sériques d'acide urique, de vitamine E et C, de caroténoïdes. Une autre étude

produite par Skalska et Grodzicki en 2009 (174) a montré une conélation de 0.36 entre le

FRAP et l'épaisseur de l'intima et de la média de carotides de patients âgés et hypertendus.

Par ailleurs, des indices de l'ensemble du stress oxydatif ont récemment vu le jour. L'oxy-

score est l'un de ceux-ci. Ce dernier est un indice combinant la mesure des concentrations

plasmatiques de malondialdéhyde totale et libre, la gluthatione, les a et y-tocophérol, les

isoprostanes urinaires et la capacité antioxydante. Bien que prometteuses, ces approches

demanderont une investigation poussée dans le futur (175-177).

51

Chapitre 4. Inflammation et maladie cardiovasculaire

La première mention d'une association entre la calcification des artères et un processus

inflammatoire date de 1823 et nous provient d'un pathologiste français du nom de Rayer

(7,178). Plus tard, au cours de la décennie 1850-1860, le pathologiste Virchow a observé

(7,178) la présence d'inflammation dans la plaque athéromateuse et a suggéré que

l'accumulation de lipides découlait de l'inflammation. Néanmoins, la preuve scientifique

de l'hypothèse inflammatoire est survenue 40 ans plus tard suite aux expériences du duo

français Gilbert et Lion (179). Ces derniers ont montré en 1889 qu'une blessure mécanique

mineure du mur artériel aortique combinée à une infection pathogène au B. typhosus

favorisait l'apparition de scléroses lipidiques chez le lapin, créant ainsi le premier modèle

expérimental d'induction d'athérosclérose. En dépit de résultats prometteurs, l'hypothèse

inflammatoire tomba en désuétude à partir des années 1930 au profit de l'hypothèse

lipidique décrite au chapitre 2 (180). Néanmoins, l'hypothèse inflammatoire ressurgit au

début des années 70 lorsque Benditt & Benditt (181) démontrent le caractère monoclonal

de l'athérosclérose et suggérèrent le caractère primordial de la transformation d'un type de

cellule dans le développement de la maladie vasculaire athérosclérotique. Cette étude

combinée aux travaux sur la prolifération de la cellule musculaire lisse dans

l'athérosclérose du célèbre Dr Russell Ross (182) a pavé la voie à la naissance de

l'hypothèse de la réponse à une insulte comme principale cause de l'athérosclérose. Cette

hypothèse développée à la fin des années 70 suggère que la blessure à Tendothélium,

aujourd'hui appelée dysfonction endothéliale, est la première étape de initiatrice du

développement de l'athérosclérose (183). Selon cette hypothèse, plusieurs causes peuvent

engendrer cette blessure. Par exemple, une hyperlipidémie chronique (10,184), une

hyperhomocystéinémie (185), l'urémie (186), une infection (183), une réponse immunitaire

(187,188) ainsi qu'un stress mécanique (179,189,190). Un peu plus tard, M. Genity a mis

en lumière le rôle crucial des monocytes dans l'athérosclérose (191). Brièvement, les

lipides, principalement issus des LDL, vont s'accumuler préférentiellement aux

52

embranchements artériels, là où le flot sanguin est soumis à des variations de trajectoire, ce

qui engendre la dysfonction endothéliale. Le stress résultant favorise une érosion

endothéliale propice à la pénétration des LDL dans l'intima vasculaire tel que suggérée par

la colocalisation des lieux à haut stress artériel laminaire avec l'accumulation des LDL et

l'initiation des lésions athéromateuses (140,141). La stimulation des cellules endothéliales

par les LDL oxydées induira la chimiotaxie et le recrutement des monocytes, phénomènes

essentiels au développement de l'athérosclérose (122,123).

4.1 Marqueurs de l'adhésion endothéliale

Deux des étapes clé de l'initiation de la réaction inflammatoire athérosclérotique sont le

recrutement et l'activation des macrophages aux sites caractérisés par un stress laminaire

élevé. Le recrutement s'effectue par les molécules de l'adhésion endothéliale tel qu'illustré

dans la figure 6.

Roulement Recrutement Adhésion ferme Migration

e-Sélectine

Activation des intégrines

O ICAM-1 VCAM-1

Endothelium

Figure 6 : Illustration du recrutement des monocytes par Tendothélium vasculaire

Initialement, les cellules immunitaires enent de manière entropique dans la circulation

provoquant ainsi des contacts aléatoires avec la paroi vasculaire. Une première migration

53

vers le site d'intérêt proviendra de la chimiotaxie induite principalement par la protéine de

chimiotaxie des monocytes 1 (MCP-1). Un premier recrutement de ces cellules s'effectue

via un processus de roulement initié par des molécules de la famille des sélectines (P-

sélectine, E-sélectine). Ensuite, des interactions entre intégrines (aX/|32, a4/fjl, ocL/p2) et

immunoglobulines (ICAM-1 à 5 et VCAM-1) renforceront l'adhésion des cellules immunes

à la paroi jusqu'à immobilisation complète (192,193). Enfin, d'autres immunoglobulines

(PECAM-1) permettront l'infiltration de ces cellules sous Tendothélium. Cette migration

des cellules immunes à l'intérieur de l'intima artériel favorisera leur activation ainsi que

l'initiation de la réponse inflammatoire. Certains agents pro-inflammatoires tels que le

facteur nécrosant des tumeurs -a (TNF-a), les lipopolisaccharides (LPS), la LDL oxydée et

Tinterleukine-1 (IL-1) activent l'expression de ces molécules d'adhésion; ce qui entraîne

leur migration à la surface des cellules endothéliales. Suite à leur interaction avec les

cellules immunes, la plupart des sélectines et des immunoglobulines se décrochent de la

paroi et/ou sont clivées par des métalloprotéinases. Ces modifications favorisent leur

solubilité dans le plasma, ce qui permet leur quantification in vivo chez l'homme (194).

Nous restreindrons notre revue de littérature à E-sélectine, ICAM-1 et VCAM-1, une

sélectine et deux immunoglobulines bien caractérisées. Les principales caractéristiques de

ces molécules d'adhésion sont décrites dans le tableau 8.

4.2 Description d'ICAM-1

Suite à sa découverte en 1986 par Rohtlein (195), ICAM-1 a connu une fulgurante hausse

de popularité. Le gène codant pour ICAM-1 est localisé en position 13.2 du chromosome

19, ne contient qu'un exon et cinq domaines immunoglobulines. Bien qu'ICAM-1 soit

reconnue pour détenir un rôle clé dans le développement du système nerveux, son rôle

principal est de permettre la stabilisation sur la paroi cellulaire endothéliale des monocytes

et des lymphocytes via leur interaction avec Tintégrine aL|32 (LFA-1 ou CD1 la/CD 18) et

aMp2 (MAC-1 ou CDllb/CD18) en vue d'une pénétration inter-cellulaire (196). ICAM-1

est préférentiellement exprimée dans les leucocytes, les cellules endothéliales, les

fibroblastes ainsi que les cellules musculaires lisses des lésions athérosclérotiques (197).

54

Certains facteurs pro-inflammatoires ainsi que le peroxyde d'hydrogène sont reconnus pour

augmenter l'expression de cette molécule (198,199). Par exemple, il a été montré que

l'expression d'ICAM-1 est augmentée de manière dose-dépendante par TNF-a, IL-ip et les

lipopolysaccharides (LPS) (199). Quelques études ont investigué la relation entre les

molécules d'adhésion et les LDL oxydées. Ces dernières, même en absence de stimuli

inflammatoires, ont rapporté une induction de l'expression des molécules d'adhésion (199-

201).

Tableau 8 : Résumé des caractéristiques des molécules d'adhésion

Molécules d'adhésion

E-sélectine VCAM-1 ICAM-1

Lieu d'expression Endothelium

vasculaire

et Strie lipidique

Stimulateurs Cytokine

proinflammatoire

Expression Entre 3 et 4 heures

maximale

Effet de la deletion bénéfique

sur la MCV

Références (199,202-205)

Endothelium

vasculaire (site

d'athérosclérose)

LDL oxydée,

Cytokine

inflammatoire

Entre 12 et 18 heures

bénéfique

(203,206,207)

Endothelium

vasculaire

LDL oxydée,

Cytokine pro-

inflammatoire

Entre 18 et 24

heures

bénéfique

(195,197-

199,203,207)

Les souris dont le gène de Tapolipoprotéine E est inactivé développent de l'athérosclérose

de manière précoce. Ainsi lorsque la deletion de l'apo E chez les souris est combinée à

celle d'ICAM-1 ces dernières développent toujours spontanément l'athérosclérose.

Cependant, il faut noter que l'étendue de la zone de lésion aortique est réduite lorsqu'on la

compare aux souris apoE -/- (207,208). Notons qu'un mécanisme compensatoire via

VCAM-1 pounait minimiser le rôle d'ICAM-1 dans l'athérosclérose.

55

4.3 Description de VCAM-1

La caractérisation d'ICAM-1 a créé un engouement qui, trois ans plus tard, en 1989, a

permis la découverte de VCAM-1 (209). Pour sa part, le gène codant pour VCAM-1 se

situe en position chromosomique lp31-32, fait ~ 25kb, se compose de neuf exons et son

expression est modulée par épissage alternatif. VCAM-1 est exprimée préférentiellement

sur Tendothélium vasculaire aux sites potentiellement à risque de développer des lésions

athérosclérotiques (206). La colocalisation entre VCAM-1 et les stries lipidiques suggèrent

une implication de cette molécule d'adhésion dans l'initiation de l'athérosclérose.

Les expressions d'ICAM-1 et de VCAM-1 à la surface de Tendothélium se succèdent dans

le temps. Autrement dit, un traitement aux cytokines pro-inflammatoires augmente

l'expression de VCAM-1 et d'ICAM-1 qui atteindrait un maximum entre 12 et 18h pour le

premier et entre 18 et 24 heures pour le second (203). Ces résultats suggèrent que suite au

roulement impliquant les sélectines, VC AM-1 médierait une adhésion des monocytes et des

lymphocytes T alors quTCAM-1 renforcerait cette première adhésion et faciliterait

l'infiltration subséquente. Les résultats des études d'expression pounaient compléter ceux

des modèles d'inactivation de gènes. L'adhésion initiale, médiée par VCAM-1, serait

possiblement cruciale au développement de l'athérosclérose.

Contrairement à ICAM-1, l'inactivation totale du gène de VCAM-1 chez la souris est

léthale (207). Néanmoins, en retirant l'exon quatre liant Mac-1, l'animal est viable et

possède un profil lipidique et un poids normal. Puisque les souris, dont TapoE est inactivée,

sont un excellent modèle animal développant spontanément l'athérosclérose, il devient

pertinent de déterminer le potentiel protecteur d'une inactivation des molécules d'adhésion

sur le développement de l'athérosclérose. Les souris dont TapoE et VCAM-1 (exon 4) ont

été conjointement inactivées ne développent pas spontanément l'athérosclérose inhérente

aux souris apoE-/-. En résumé, VCAM-1 semble davantage impliquée dans l'initiation de la

pathologie athérosclérotique et de la dysfonction endothéliale, alors qu'ICAM-l Test

davantage dans la poursuite de ces pathologies ainsi que dans l'inflammation systémique.

56

4.4 Description de la E-sélectine

Les sélectines (CD62) sont une famille de trois récepteurs d'adhésion dépendants du

calcium et sont classées selon leur localisation. Par exemple, la L-sélectine est exprimée

constitutivement par les lymphocytes, tandis que la E-sélectine est exprimée exclusivement

par les cellules endothéliales activées. La partie extracellulaire de chaque sélectine est

constituée de trois domaines différents; un domaine lectine de type C de 120 acides aminés

en N-terminal, un domaine de type EGF de 35-40 acides aminés et de 2 à 9 courtes

répétitions consensus (-60 acides aminés) qui sont retrouvées dans les protéines

régulatrices du complément (CRP). La E-sélectine est exprimée rapidement et

transitoirement suite à des stimuli pro-inflammatoires tels que la thrombine, le TNF-a,

TIL-lp, et le LPS (199,202). L'expression de la E-sélectine est habituellement maximale

dans les 3 à 4 heures suivant la stimulation, pour retourner à un niveau basai en 16 à 24

heures. Le promoteur de la E-sélectine contient quatre éléments de régulation : trois sites de

liaison à NF-KB et un site activateur du facteur transcription (ATF). Lorsque les cellules

sont stimulées par le TNF-a, trois voies convergent vers l'activation du promoteur du gène

de la E-sélectine; la voie NF-KB, les voies des kinases JNK et p38. Ces deux dernières

permettent la phosphorylation des facteurs de transcription c-Jun et ATF2, menant à

l'expression de la E-sélectine (202,210).

La E-sélectine, lors de son contact avec son ligand, activera une cascade de signalisation

intracellulaire laquelle entraînera une modification de la forme de la cellule endothéliale

(211) ainsi que le clivage ultérieur de la partie extra-cellulaire et soluble de la E-sélectine.

La E-sélectine soluble peut activer des neutrophiles directement en augmentant la

production des espèces réactives de l'oxygène et en synergie avec le facteur PAF ( platelet-

activating factor ) pour activer Tintégrine P2 (212). Ces résultats suggèrent un possible

contrôle de l'état d'activation du neutrophile selon le répertoire des molécules d'adhérence

impliquées. Une inactivation du gène de la E-sélectine par deletion ralentit la progression

de l'athérosclérose chez la souris avec (204) et sans co-délétion de l'apo E (205).

57

4.5 Conclusion sur les molécules d'adhésion

Notre groupe de recherches a publié sur les associations entre les molécules d'adhésion et

différents marqueurs d'adiposité, le bilan lipidique et Tinsulinémie (213). sICAM-1 et

sVCAM-1 étaient associées à l'adiposité mais pas au bilan lipidique. Des analyses de

régression multiples ont permis de quantifier la contribution indépendante de ces variables

au niveau des molécules d'adhésion et de la LDL oxydée. L'accumulation de tissu adipeux

viscéral expliquait le mieux les niveaux plasmatiques de LDL oxydée alors que la taille des

particules LDL expliquait sVCAM-1. Pour leur part, sICAM-1 et sE-sélectine semblaient

être très liées Tune à l'autre. Enfin, l'étude ARIC a montré que des concentrations

plasmatiques élevées d'ICAM-1 et de E-sélectine mais pas de VCAM-1 étaient

indépendamment associées à une augmentation du risque coronarien (214).

Les différentes molécules d'adhésion semblent avoir chacune leurs particularités. Par

exemple, ICAM-1 est exprimée dans une plus vaste gamme de site et semble viser

davantage la réaction inflammatoire en général alors que VCAM-1 semble plus spécifique à

l'initiation de la strie lipidique. De plus, leur expression dans le temps est logique puisque

l'expression optimale de la E-sélectine se produit avant celle des IGAM-1 et VCAM-1 ce

qui conespond à son rôle précoce d'initier le roulement des leucocytes dans le cadre de leur

recrutement. À la lumière de leurs effets physiologiques et des résultats des études de

deletions géniques, nous pouvons affirmer que toutes ses molécules sont impliquées dans la

pathogenèse de l'athérosclérose. De plus, toutes ces molécules sont clivées suite à leur

liaison avec leur ligand et peuvent par conséquent être mesurées dans le plasma sous forme

soluble.

58

Chapitre 5. MMP-9 et maladie cardiovasculaire

La plaque d'athérosclérose subit un processus progressif de calcification et de destruction

de la matrice extracellulaire (215). Cette dernière est une cause majeure de rupture de la

plaque d'athérosclérose. Les macrophages activés et les zones de la matrice extracellulaire

à faible proportion de collagène sont colocalisés (216-219). La destruction du collagène est

majoritairement régulée par différentes proteases comme les serine proteases, les

cathepsines et les métalloprotéinases des matrices (MMPs) (220). Nous porterons notre

attention sur les MMPs puisqu'elles sont mieux caractérisées. Les 23 MMPs sont des

protéines transmembranaires partageant un mécanisme catalytique impliquant une molécule

de zinc (221). Ces enzymes, à l'instar des caspases, sont activées par cascade de clivages

protéolytiques généralement médiées par d'autres MMPs. L'inactivation des MMPs se

produit suite à l'action d'inhibiteurs spécifiques (TIMPs). De plus, ces MMPs sont

principalement produites par le macrophage activé. Les capacités protéolytiques des MMPs

s'appliquent aussi à certaines protéines présentes à la surface cellulaire. Plus

spécifiquement, certaines cytokines et chimiokines sont aussi modulées ; ce qui élargit le

potentiel d'action de cette famille de molécules (222).

L'activation de MMP-9 est Tune des dernières observées dans la cascade d'activation des

MMPs. De plus, cette MMP détient un rôle important dans le cadre de la MCV, car elle

prend part à plusieurs mécanismes de l'athérosclérose. Par conséquent, nous nous

intéressons plus spécifiquement à son implication dans cette maladie au cours du prochain

chapitre.

5.7 Généralités

La MMP-9/gélatinase Bêta est une collagénase de type 4 de 92 kDa dont le gène est

positionné entre les Mb 44.07 et 44.08 du 20e chromosome. Le gène de la MMP-9 est

59

exprimé principalement par les cellules musculaires lisses, les cellules endothéliales, le

macrophage, les lymphocytes T, les mastocytes ainsi que les fibroblastes de l'adventice.

Son expression est induite rapidement par toutes blessures mécaniques des artères (223-

226) et occuperait un rôle central dans le remodelage subséquent (227). Ces fonctions

confèrent à MMP-9 un rôle dans le développement de l'hypertension ainsi que dans la

rigidité et la stabilité de la plaque athéromateuse.

5.2 MMP-9, MCV et facteur de risque de MCV

La colocalisation in vivo des macrophages et de la diminution du collagène de la matrice

extracellulaire au site des stries lipidiques et de la plaque athéromateuse (216-219) suggère

une implication des MMPs dans Tathérogénèse. En plus d'être induite par des blessures

mécaniques, MMP-9 est aussi induite dans les cellules endothéliales par différents stimuli

pro-inflammatoires (TNF-a, ILl-a , CD 40...) ou une coculture avec des macrophages

(223-226,228,229). Ainsi, une interaction avec le macrophage induit l'expression de MMP-

9 par la cellule endothéliale (230), un phénomène qui impliquerait certaines molécules

d'adhésion (231). D'ailleurs, une forte conélation est notée entre l'expression des ARN

messagers (r= 0.524, p<0.01) et des protéines (r= 0.524, p<0.01) d'ICAM-1 avec celle de

MMP-9 dans des cellules musculaires lisses et les macrophages alvéolaires humains (232).

Dans le cadre de la MCV, MMP-9 est majoritairement produite par le macrophage et il

semble être le membre de la famille des MMP le plus abondant dans ce type cellulaire

(230). La differentiation du monocyte en macrophage induit une augmentation de la

production de MMP-9 (201,233). Par ailleurs, différents stimuli pro-inflammatoires (TNF-

a, IL18, CD 40) induisent l'expression de MMP-9 dans la cellule endothéliale. En

parallèle, MMP-9 est activée par nitrosylation dans les cellules neuronales (234). La

nitrosylation dépend de la présence, d'une part, du NO et, d'autre part, des ROS. Les ROS

normalement produites par les cellules spumeuses sont, tout comme les LDL oxydées,

reconnues pour activer MMP-9 (229,235-240). Une liste détaillée des principaux

activateurs et inhibiteurs de la production de MMP-9 pour les monocytes est disponible

dans le tableau 9.

60

5.2.1 Implication de MMP-9 dans la formation de la cellule spumeuse

En lien avec les observations précédemment rapportées, Kojimo et coll. ont rapporté en

février 2010 qu'une co-inhibition de MMP-9 et de MMP-2 permettait d'atténuer la

formation de cellules spumeuses à partir de cellules THP-1 différenciées et stimulées par

des LDL oxydée (241). De plus, l'utilisation de siRNA dirigé contre MMP-9 permet

l'inhibition de la formation de cellules spumeuses et l'entrée de cholestérol dans ce même

modèle cellulaire. Une partie de ces effets pounait provenir d'une inhibition de

l'expression du SRAI et de LOX-1 aussi rapportée dans l'étude. Enfin, notons que la mise

en culture de cellules spumeuses issues de lapins nounis avec une diète riche en cholestérol

auront la capacité de produire MMP-9 sur une très longue période (242,243).

Tableau 9 : Principaux activateurs et inhibiteurs de MMP-9 dans les macrophages

Type de cellule Monocyte Activateurs Inhibiteurs Références U937 PMA, cAMP, IL-

la, Acide rétinoïque, PDGF, TNF-a, S.aureus

Vitamine D3 (244-246)

THP-1 PMA, S.aureus, CD40L, IFNy, Cellules T, HUVEC, mmLDL

Anti-CD40L (230,246) (233,247)

Monocyte conA, S.aureus, Anti-CD40L, (201,231,233,237,244,246-humain PGE2, CD40L, Vitamine D3, Acide 253) circulant IFNy, Cellules T, rétinoïque,

Ac-LDL, mm-LDL, indométacine, IL-oxLDL GMCSF, 10.L-161982 collagène ou laminine + plaquette ou P-sélectine, LPS, IL-18, TNF-a, IL-1P

PMA : phorbol-ester myriacétate; PDGF, facteurs de croissance dérivés des plaquettes; conA : concavaline A; PGE2 : Prostaglandine E2; GMCSF : Granulocyte monocyte colony stimulating factor; LPS : Lipopolysaccharides Adapté de (254)

61

Ces résultats suggèrent que MMP-9 serait initialement nécessaire à la formation de la

cellule spumeuse. Ce nouveau mécanisme d'action étant relativement récent, une validation

par d'autres groupes de recherche devra cependant être réalisée.

5.2.2 MMP-9 et remodelage vasculaire

Des augmentations de la production et de l'activation de MMP-9 sont notées dans les

heures suivant les blessures chirurgicales et la formation néointimale de veine saphène

humaine en culture d'organe (225). De plus, la transcription de MMP-9 est induite suite

aux blessures d'angioplastie par ballonnet dans les artères de rats (223,255), de souris

(256,257), de babouins (258), de cochons (226) et de lapins (259). L'induction de MMP-9

est aussi observée ex vivo pour la veine saphène humaine blessée par distension

hydrostatique (225). Une importante limite de cette étude est l'utilisation d'un modèle

veineux qui ne possède pas la même physiologie que le modèle artériel. Afin de mieux

comprendre le rôle des augmentations de MMP-9 suite aux blessures vasculaires, révisons

les modèles de surexpression et d'inactivation de MMP-9. D'une part, le modèle de

surexpression dans la cellule musculaire lisse de rat a permis une augmentation de la

capacité de migration de ces cellules sans toutefois modifier leurs proliférations, ce qui a

pour effet de réduire la matrice extracellulaire et de favoriser la vasodilatation (260).

D'autre part, le modèle d'inactivation avait des quantités de cellules similaires au contrôle

bien que le collagène était en plus grande quantité (261). Cependant, les auteurs ont observé

une augmentation des niveaux de MMP-2 compensatoire à l'inactivation de MMP-9. De

nombreuses évidences de l'implication de MMP-9 dans le remodelage vasculaire sont donc

rapportées dans la littérature.

5.2.3 MMP-9 et stabilité de la plaque d'athérosclérose

Plusieurs études chez l'humain ont rapporté des conélations entre la maladie coronarienne

instable, les concentrations plasmatiques de MMP-9 et les différents génotypes de MMP-9

(262-266) bien que ce ne soit pas le cas pour toutes (142). En complément de son rôle

62

potentiel de marqueur de la plaque instable, MMP-9 serait un excellent marqueur de risque

indépendant de rupture de la plaque athérosclérotique, peu importe son niveau de stabilité

initial (263).

À l'aide d'une méthode innovatrice, Roberston et coll. ont montré, suite à une intervention

coronarienne percutanée chez le patient atteint d'un syndrome coronarien aigu, des

augmentations de la concentration plasmatique de MMP-9 (264), résultats confirmés

ultérieurement (267). De plus, il a été suggéré que MMP-9 serait un bon marqueur de

l'infarctus du myocarde en situation aigu (142).

Afin de mieux comprendre l'influence de MMP-9 sur la stabilité de la plaque, il est

nécessaire de revoir la composition de la plaque instable. Cette dernière est typiquement

composée d'une grande proportion de lipides et de macrophages ainsi que d'une faible

quantité de cellules musculaires lisses et de collagène. La fonction enzymatique principale

de MMP-9 est de dégrader le collagène qui assure la stabilité des différentes composantes

de la plaque. Dans les cellules des zones à risque élevé de rupture, la quantité de MMP-9

est augmentée significativement lorsque comparée aux zones à risque faible (268,269).

Les individus porteurs d'un polymorphisme favorisant l'activation du promoteur du gène

de MMP-9 avaient des concentrations plasmatiques de MMP-9 augmentées (265) ainsi

qu'une augmentation de la sévérité de la maladie coronarienne (270,271). Dans Tune de ces

études, le polymorphisme n'avait aucun impact sur l'incidence de décès chez les patients

avec histoire de maladie coronarienne. Cependant, les niveaux plasmatiques élevés de

MMP-9 étaient associés à un risque coronarien augmenté (265). Une inactivation de MMP-

9 chez la souris augmente la dimension de la plaque athérosclérotique (272). Cependant,

une inactivation du gène de MMP-9 chez la souris Apo E déficiente a permis de diminuer

la taille de la plaque ainsi que son contenu en macrophage et en collagène (273). Ces études

montrent bien l'importance des interactions gène-gène dans l'évaluation d'un phénotype.

Davantage d'études permettront éventuellement d'éclaircir ce point.

63

5.3 MMP-9 et traitement pharmacologique

L'activation du LXR inhibe la production de MMP-9 par les macrophages stimulés avec

des lipopolysaccharides (LPS), TNF-a où IL1-P (274). Compte tenu des interactions entre

les voies des LXR et des PPAR (70,71), il devient pertinent de voir l'impact des agonistes

PPAR sur l'expression de MMP-9. Les ligands de PPAR-a et PPAR-y inhibent la sécrétion

de MMP-9 par les monocytes THP-1 induite par un traitement au phorbol-ester (275), des

cellules musculaires lisses (276) et des macrophages issus de monocytes différenciés en

culture (277). De plus, des diminutions des concentrations plasmatiques de MMP-9 ont été

observées chez des diabétiques traités avec l'agoniste PPAR-y rosiglitazone (278).

L'antibiotique Doxycycline réduit également MMP-9 de 20% au cours des 12 heures

suivant son administration (279,280). Pour leur part, les statines sont reconnues pour

stabiliser la plaque athéromateuse (281). Concomitamment à cette observation, les statines

sont de très puissants inhibiteurs de la sécrétion de MMP-9 par les cellules musculaires

lisses (282) et les macrophages (282-284).

5.4 Conclusion sur MMP-9

En résumé, MMP-9 est impliquée dans la formation des cellules spumeuses, dans le

remodelage vasculaire et dans la stabilité de la plaque athérosclérotique. Une partie des

effets pléiotropes associés à plusieurs médicaments utilisés en prévention et en traitement

de la MCV pounait provenir d'une réduction de la production ou de l'activité de MMP-9.

64

Chapitre 6. Fonction endothéliale et maladie cardiovasculaire

Le processus de formation de la plaque d'athérosclérose est reconnu pour induire une

solidification et une augmentation de la rigidité des artères. Ces modifications physiques de

la paroi vasculaire influencent le flot sanguin ce qui a un impact sur la fonction cardiaque.

Plusieurs outils ont été mis au point pour tenter de mesurer et de quantifier cet impact.

6.1 Généralités

En 1827, le Dr William Bright rapportait déjà une dysfonction endothéliale selon la

« dureté » du pouls (285). C'est un peu plus tard, au milieu du 19e siècle que le Dr

Frederick Akbar Mahomed inventa le premier sphygmographe (figure 7a) permettant une

mesure plus rigoureuse de la fonction endothéliale (286).

Figure 7 : Image des premiers instruments de mesure de la fonction endothéliale 7 a) un sphygmographe; 7 b) un sphygmomanomètre.

Tirée de (287)

65

Cette innovation permit, d'une part, de déterminer le pouls artériel et, d'autre part, de

visualiser les variations de pression du flot artériel (waveform). C'est d'ailleurs à cette

époque que Mohamed décrit l'impact de Tâge sur la dégénérescence artérielle (288), une

information que les compagnies d'assurance de l'époque ont rapidement incorporée dans

leurs calculs de risque (289). Cet outil tomba en désuétude au début du 20e siècle suite à

l'invention du sphygmomanomètre qui permet de mesurer la pression artérielle (figure 7b).

Par la suite, la majorité des études ont utilisé cette méthode pour montrer que

l'hypertension était associée à une augmentation de la taille du ventricule gauche et à la

mortalité coronarienne secondaire à cette condition (290,291). Récemment, des méthodes

sont venues compléter l'information sur la fonction endothéliale. Bien que plusieurs des

méthodes invasives permettent d'apporter une information pertinente, nous occulterons ces

méthodes par souci de simplification. Il est possible de prendre la mesure de fonction

endothéliale sur plusieurs artères, mais la revue de littérature se limitera aux méthodes

utilisant les artères radiale et brachiale. Nous analyserons donc brièvement quelques-unes

des méthodes non invasives étudiant les artères radiale et brachiale et nous porterons

principalement notre attention sur la tonométrie par aplanation.

6.2 Mesure de rigidité artérielle

La plupart des mesures de la tension artérielle non-invasives sont effectuées au niveau des

artères brachiales et radiales. Toutefois, la tension artérielle à l'aorte ascendante est

directement liée à l'augmentation de la taille du ventricule gauche, un facteur important de

mortalité cardiovasculaire, mais cet endroit est difficilement accessible par une méthode

non invasive. Avec l'aide de l'informatique, il est devenu possible d'estimer le flot artériel

aortique à partir de celui mesuré au niveau radial. C'est ainsi qu'en établissant cette

équation, les professeurs Michael O'Rourke et Wilmer Nichols ont réinventé le

sphygmographe (292). La principale méthode de mesure de la forme de Tonde de la

pression est la tonométrie par aplanation. Brièvement, un manomètre (senseur) comprime

légèrement l'artère et mesure les variations de pression au cours du cycle cardiaque. Un

exemple de mesure effectuée par tonométrie de l'artère radiale est illustré dans la figure 8.

66

PCTpheraJT1.T2.Ali 91 n i . 227ms. Gl X CENTRAL HAEMODYNAMIC PARAMETERS

Heart Rate. Period 64 bpm. 938 ms PI Height (PI - Dp) 30 mmHg BuckbetgSEVR (Ad/At) 155* (3113/2002) Electa! Duration 316 «s . 34X Augmentation 7 mmHg MP. (Systole. Diastole) 99. 78 mmHg Aortic T1.T2.Ti 9 5 . 1 9 6 . 1 2 6 ms AlxlAG/PP.P2/P11 1 8 Z . 1 2 2 X End Svstofc Pressure 96n*nHq

AortcAlx (AG/PP)@HR75 1 3 *

Figure 8 : Courbe typique des ondes radiale et aortique tel que mesurées par tonométrie de l'artère radiale.

Tiré des manipulations présentées dans le cadre du chapitre 12.

On retrouve à gauche, Tonde radiale et à droite Tonde calculée au niveau aortique. Le

niveau le plus élevé de Tonde est la tension systolique et le plus bas, la tension diastolique.

Dans Tonde aortique, on remarque tout d'abord la pression qui augmente jusqu'à un

premier épaulement. Le point d'inflexion conespond au point de fusion entre Tonde

propagée et réfléchie sur les vaisseaux sanguins. Plus l'artère est rigide, plus la réflexion

arrivera tardivement ce qui conespond au niveau de tension le plus élevé de Tonde. La

différence entre les tensions de Tonde réfléchie et propagée est un indice de la rigidité

artérielle, mais aussi de la pression aortique que doit subir le ventricule gauche. En résumé,

la différence de pression entre ce point d'inflexion et la pression systolique conespond à

l'augmentation. Une valeure élevée d'augmentation indiquera une artère rigide et/ou une

pression aortique élevée au ventricule gauche. L'augmentation est normalisée en la divisant

par la pression du pouls, soit la différence entre les tensions systolique et diastolique.

L'index d'augmentation obtenu est aussi fréquemment ajustée pour le pouls, car cette

dernière mesure peut avoir une influence dessus.

http://PCTpheraJT1.T2.Ali

http://T1.T2.Ti

67

Il est possible d'estimer la rigidité artérielle périphérique par la vélocité de Tonde puisée

par tonométrie par aplanation. Pour mesurer la vélocité de Tonde puisée, la distance

parcourue par la pression du pouls est divisée par la période de temps nécessaire pour faire

le trajet entre deux points de mesure différents. Rappelons que la pression du pouls

conespond à la différence entre la tension diastolique et le point d'inflexion du premier

épaulement. Cette mesure est principalement utilisée pour calculer la rigidité artérielle

périphérique (293,294).

6.3 Méthodes de mesure de la vasodilatation

Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer la vasodilatation. L'aplanométrie et le

diamètre des artères sont les méthodes les plus couramment utilisées. Néanmoins, un rappel

du processus physiologique de vasodilatation s'impose afin de comprendre les nuances

dans les méthodes. La vasodilatation est un processus physiologique contrôlé

majoritairement par les cellules endothéliales qui, suite à différents stimuli tels que la

pression ou certains agonistes, activeront la synthetase de l'oxyde nitrique endothéliale

(eNOS) laquelle produira, à partir de L-arginine, l'oxyde nitrique qui stimulera les cellules

musculaires lisses et entraînera une vasodilatation. L'oxyde nitrique (NO) a ceci de

particulier qu'il peut être proathérogénique et antiathérogénique dépendamment de

l'enzyme le produisant et de sa concentration. À faible dose, lorsqu'il est produit par la

eNOS, il favorise la vasodilatation. Lors de l'activation de la forme inductibles de la NOS

(iNOS) du macrophage, une production importante de NO s'ensuit. Ce dernier réagira

rapidement avec différentes molécules et deviendra pro-inflammatoire. La biodisponibilité

du NO, qui permet d'assurer la vasodilatation, peut être diminuée soit par une réduction de

la production ou par une accélération de son catabolisme. La présence de facteurs de risque

cardiovasculaire est associée à une augmentation de la génération de T anion superoxyde

(O2) qui réagira rapidement avec le NO pour former le péroxynitrite (ONOO ), ce qui

diminue la biodisponibilité du NO (295). Le péroxynitrite va se fixer sur les protéines ce

qui permettra d'en mesurer les concentrations plasmatiques. D s'agit donc d'un indice

composite de la disponibilité de NO et de la génération de stress oxydatif. Parallèlement,

les antagonistes et les agonistes NO ont été montrés pour activer et inhiber l'expression de

MMP-9, respectivement (296-299).

68

Les méthodes de mesure de la fonction vasodilatoire utilisent toutes des stimuli basés sur le

NO. La découverte d'agoniste du NO a permis de distinguer les mécanismes NO-

dépendants de ceux qui en sont indépendants (300). La méthode indépendante permet

d'avoir une idée de la fonction totale possible du vaisseau alors que la méthode dépendante

permet d'obtenir la capacité de Tendothélium à produire du NO et ainsi stimuler la

vasodilatation. Portons maintenant notre attention aux principales méthodes de mesures de

la vasodilatation.

6.3.1 Mesure de la vasodilatation p a r mesure du diamètre des artères

Introduite en 1992 par le groupe de Celermajer (301), cette méthode permet de mesurer par

sonde à ultrason, le diamètre des artères avant et après stimuli vasodilatoires. La méthode

de mesure de la vasodilatation NO-dépendante la plus utilisée est certainement celle qui

consiste à induire une augmentation du stress sur les vaisseaux par hyperhémie ce qui

permet un relargage du NO par les cellules endothéliales et une augmentation du diamètre

des artères (302). Une méta-analyse incluant plus de 2500 patients souffrant de maladie

coronarienne athérosclérotique ou à risque élevé de maladie cardiovasculaire a révélé que la

vasodilatation induite par hyperémie est un marqueur indépendant du risque

cardiovasculaire (303). Cependant, une grande variabilité est observée entre les individus

pour cette méthode ce qui limite son utilisation dans le cadre d'études qui ne sont pas en

chassé-croisé à moins d'avoir une grande puissance statistique (304).

6.3.2 Mesure de la vasodilatation p a r tonométrie p a r aplanation

La méthode par tonométrie peut aussi être utilisée pour mesurer la vasodilatation. Pour ce

faire, Thyperhémie peut être utilisée, mais l'emploi du salbutamol, un agoniste p2

adrénergique, est également préconisée pour la mesure de la vasodilatation NO-dépendante.

L'utilisation de salbutamol permet une réduction de l'index d'augmentation dans les 20

minutes suivant son administration par inhalation (305,306). Cette méthode conèle très

bien avec celle par mesure du diamètre des artères suivant hyperémie afin d'identifier les

69

individus souffrant de dysfonction endothéliale (307). En dépit de ces conélations, la

méthode par mesure du diamètre des artères est moins variable que celle par aplanation

(307,308). La nitroglycérine, un agent producteur de NO, est utilisée pour évaluer la

vasodilatation indépendante de Tendothélium (309).

6.4 Index d'augmentation (AIx), MCV et facteur de risque de MCV

Dans une récente méta-analyse (310), Vlachopoulos montre qu'une augmentation de TAIx

central de 10% est associée à une hausse du risque relatif de MCV de 31.8% (1.318; 1.093-

1.588). Une relation similaire est observée avec la mortalité totale (RR : 1.384; 1.192-

1.606) (310). Parmi les études citées, la plupart utilisaient Taplanométrie, mais une seule

l'utilisait au niveau radial puis dérivait ces calculs au niveau aortique. Cette étude a montré

des augmentations significatives de 80% du risque relatif de souffrir de décès, d'infarctus

du myocarde ou de resténose (1.80; 1.18-2.76) entre le premier et le dernier tertile d'AIx

(311). Enfin, dans la cohorte de Framingham, aucune association n'a été observée entre

TAIx et la mortalité coronarienne (312). Il a été montré que TAIx est augmenté chez les

individus ayant subi un ACV ischémique aigu, lorsque comparé à des sujets appariés pour

Tâge, le sexe, les facteurs de risque cardiovasculaire et les antécédents de morbidité

cardiovasculaire (313). De plus, ces résultats montraient des divergences entre les différents

types d'ACV ; ce qui suggère que TAIx peut aussi être un indicateur beaucoup plus

complexe qu'envisagé initialement. Enfin, un risque élevé de diabète est lui aussi associé à

une augmentation de TAIx et ce, même après ajustement pour la pression sanguine, le

tabagisme, la résistance à l'insuline, l'hémoglobine glyquée Aie, le cholestérol et les

triglycérides (314). Une association similaire est retrouvée aussi chez les enfants avec

diabète de type 1 lorsque comparés aux enfants sans la maladie (315). Cependant, lorsque

comparés à des enfants avec le diabète de type 2, ceux souffrant du diabète de type 1 ont

des niveaux plus faibles d'AIx (316).

Contrairement aux mesures basales d'AIx, la période de temps nécessaire pour calculer la

vasodilatation par aplanométrie est une limite importante qui restreint le nombre d'études

portant sur le sujet. Cependant, une étude a montré que suite à une stimulation au

70

sablutamol, les diminutions de l'index d'augmentation étaient significativement plus faibles

chez les individus atteints de maladie coronarienne que chez les sujets sains ; ce qui

suggère une diminution de l'efficacité de la vasodilatation concomitante à la détérioration

de la santé cardiovasculaire (306).

La conélation positive entre Tâge et TAIx a été rapportée très rapidement, mais jusqu'à

tout récemment, bien peu d'études s'étaient intéressées à la relation entre l'index

d'augmentation et d'autres marqueurs de la maladie cardiovasculaire. Ces études ont

rapporté que l'index d'augmentation conèle avec le sexe, les tensions systolique et

diastolique, TIMC, l'hémoglobine glyquée Aie, la surface des plaques carotidiennes,

l'hypertrophie ventriculaire gauche ainsi que les concentrations plasmatiques de cholestérol

total, TG, HDL-cholestérol et LDL-cholestérol (313,314,317-320). Ces études montrent

une association et non une relation de cause à effet. Pour illustrer cette nuance, prenons un

exemple concret: l'index d'augmentation conèle très bien avec TIMC (313,314,321),

cependant, une étude rapporte qu'une perte de poids n'a pas entraîné de diminution

significative de TAIx (322).

Les études mettant en relation TAIx et les marqueurs émergents des MCV sont peu

nombreuses. Une étude n'a montré aucune conélation entre la vasodilatation et les

molécules d'adhésion (323). Cependant, une faible capacité antioxydante plasmatique est

associée à une augmentation d'AIx (324). En résumé, TAIx est un indice de la rigidité

aortique et de la taille du ventricule gauche ainsi qu'un facteur de risque indépendant de la

MCV ce qui en fait un candidat intéressant comme marqueur émergeant de cette maladie.

71

Chapitre 7. Nutrition et maladie cardiovasculaire

Au cours des dernières années, les gouvernements fédéral et provincial ont entrepris des

réformes favorisant l'atteinte de saines habitudes de vie par la population. Des 9 facteurs de

risques présentés au chapitre 1 (tableau 1, p. 19), deux facteurs, le tabagisme et la

sédentarité, ont été ciblés par les gouvernements au cours des dernières années. En 2003,

l'adoption d'une loi (325) au parlement qui interdit l'usage du tabac dans les lieux publics

vise une réduction du tabagisme et des effets néfastes qu'il entraîne sur la santé

cardiorespiratoire. La sédentarité (326) a fait l'objet d'une vaste campagne publicitaire

provinciale dont le slogan est : « Vas-y, fais le pour toi.». La Seven Country Study (12) a

démontré que l'apport en acides gras saturés (AGS) était conélé positivement avec les

concentrations plasmatiques de cholestérol ainsi qu'avec l'incidence de MCV fatal. Les

acides gras trans (AGT) ont également été montrés pour avoir des effets délétères sur la

santé cardiovasculaire (327). Les AGT et AGS ont d'ailleurs ont été ciblés dans le cadre

d'une politique américaine sur le contrôle de T hypercholestérolémie (328). Cependant, un

groupe de recherche a récemment mis en évidence que le remplacement de la

consommation d'AGS par celle de carbohydrate pounait être aussi néfaste pour la santé

cardiovasculaire (329,330). Plus récemment, le gouvernement canadien est allé plus loin en

mettant de l'avant un projet de loi qui bannira les acides gras trans industriel de

l'alimentation (331). Comme la prévention occupe une importance croissante dans le cadre

de notre système de santé, il devient opportun d'orienter les recherches scientifiques afin

d'identifier et de mieux caractériser les facteurs de risque de MCV.

7.1 Évidences épidémiologiques

De nombreux facteurs de risque de la MCV sont identifiés. La nutrition regroupe plusieurs

de ces facteurs, dont la consommation insuffisante de fruits et légumes. Plus

spécifiquement, plus de 62,4 % des Canadiens ne consomment pas sur une base journalière

72

au moins 5 portions de fruits et légumes (2). La section suivante s'attardera plus

spécifiquement à réviser les évidences épidémiologiques portant sur la relation entre la

consommation journalière de fruits et légumes et le risque cardiovasculaire.

7.2 Relation entre la consommation de fruits et légumes et le risque cardiovasculaire

Selon l'étude INTERHEART (4,5), la consommation journalière restreinte de fruits et

légumes est un des 9 facteurs de risque indépendants expliquant mondialement plus de 90%

des cas de MCV (RR : 0.70 ; 0.64-0. 0.77). Un résumé des principales études prospectives

s'étant intéressées à la relation entre la consommation de fruits et légumes et le risque de

souffrir de MCV est présenté dans le tableau 10. L'étude avec le plus grand nombre de

participants provenait de la combinaison de la Nurses Health Study (NHS) et de la Health

Professionnal Follow-up Study (HPFS). Cette étude a observé une réduction du risque

coronarien (RR 0.80 ; 0.69-0.93) chez les consommateurs de fruits et légumes du premier

quintile par rapport à ceux du dernier (332). De plus, les hommes (RR 0.96; 0.93-0.99)

semblaient bénéficier davantage de l'augmentation d'une portion de fruits et légumes/jour

que les femmes (RR 0.97; 0.93-1.00).

Tableau 10 : Études prospectives portant sur la relation entre la consommation de fruits et légumes et le risque cardiovasculaire

Références Etude n Suivi

(ans)

RR (95%, IC) Type

d'incident

(332) NHS+HPFS 123 000 = 12 0.80; 0.69-0.93 ICM

(333) NHS+HPFS 123 000 = 12 0.69; 0.52-0.92 AVC

(334) NAHNES 9608 19 0.73; 0.58-0.92 ICM

(335) WHS 39 127 5 0.68; 0.51-0.92 ICM

(336) PHS 15 220 12 0.77; 0.60-0.88 ICM

(337) Méta-analyse nd 0.82; 0.76-0.89 ICM

AVC= Accident vasculaire cérébral; ICM= Incident coronarien majeur; RR= risque relatif entre les groupes les plus élevé et les plus faibles de consommation et nd: non disponible.

73

Une réduction du risque d'accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques (RR 0.69;

0.52-0.92) était aussi observée entre le premier et le dernier quintiles de consommations de

fruits et légumes (332,333). Dans la National Health and Nutrition Examination Survey

Epidemiologic Follow-up Study I (NHANES I) (334), 9608 participants ont été répartis en

groupes selon leur consommation journalière de fruits (supérieur à 3 ou inférieur à 1), et ces

groupes furent comparés entre eux. Une réduction significative (p=0.05) de 15% (RR 0.85 ;

0.72-1.00) de la mortalité totale a été notée chez les plus grands consommateurs de fruits et

légumes. Cette réduction provient d'une diminution de la mortalité cardiovasculaire de 27%

(RR 0.73 ; 0.58-0.92). Plus précisément, la réduction dans le risque de mortalité

cardiovasculaire provient principalement de la combinaison des diminutions non

significatives des risques de décès par AVC fatal (RR 0.58 ;0.33-1.02) et de maladie du

cœur ischémique (RR 0.76 : 0.56-1.03). Une autre étude, la Women Health Study (WHS)

(335) regroupant plus de 39 127 professionnelles de la santé américaines a rapporté un

risque cardiovasculaire de 0.68 (RR 0.51-0.92) et un risque d'infarctus du myocarde de

0.47 (0.28-0.79) chez les femmes du premier quintile qui avait une consommation médiane

de 10.2 portions de fruits et légumes par jour lorsque comparées au dernier quintile

(médiane: 2.6 portions). La Physicians Health Study (PHS) (336) regroupe quant à elle plus

de 15 220 hommes et a révélé une baisse du risque coronarien de 23% (RR 0.77 : 0.60-

0.98) chez les sujets consommant plus de 2.5 légumes/jour (principalement feuillus et

verts) comparativement au consommateur de moins de 1 légume/jour. Une méta-analyse

incluant dix études de cohortes prospectives a permis d'obtenir un estimé du risque relatif

de souffrir de MCV de 0.82 entre les consommations élevé et faible de fruits et légumes

(0.76-0.89) (337).

En résumé, les évidences épidémiologiques basées sur les différentes études prospectives

montrent clairement que la consommation élevée de fruits et légumes est associée à une

réduction du risque cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes sous-jacents à cette

diminution demeurent inconnus. Parmi les hypothèses mises de l'avant, les antioxydants

des fruits et légumes pounaient être responsables, du moins en partie, des effets bénéfiques

observés. Plus spécifiquement, les antioxydants pounaient ralentir le processus d'oxydation

au cœur du développement de la MCV (338).

74

7.3 Antioxydants: définition, classification et sources

Un antioxydant est une molécule pouvant retarder ou prévenir l'oxydation d'un substrat

(339). Les antioxydants sont séparés en deux catégories selon leur origine : les endogènes

qui sont issus de l'organisme (96) et les exogènes issus de l'extérieur du corps. D existe

plusieurs catégories d'antioxydants endogènes dont les principaux sont les thiols

(glutathion), les enzymes (catalase, superoxyde dismutase, paraoxonase), les hormones

(oestradiol) de même que Tubiquinone et le coenzyme Q10. Pour les antioxydants

exogènes, les principales catégories sont les phénols (acides phénoliques, flavonoïdes...) et

les vitamines (A, C et E). La principale source d'antioxydants exogènes provient de

l'alimentation.

7.4 Vitamines antioxydantes et risque de MCV

Les vitamines sont les antioxydants les plus étudiés dans le cadre de la MCV. Les

vitamines antioxydantes les mieux caractérisées sont la vitamine C (acide ascorbique), la

vitamine E (a et y-tocophérol) et la P-carotène (pro-vitamine A). Nous limiterons notre

analyse aux études les concernant. Plusieurs études épidémiologiques (340-346) se sont

intéressées à la relation entre les apports alimentaires de ces trois antioxydants et le risque

de souffrir de MCV. Le tableau 11 résume les principaux résultats de ces études.

7.4.1 Consommation de vitamine E et risque cardiovasculaire

L'étude NHS (342) regroupait plus de 85 000 infirmières suivies sur une période moyenne

de 8 ans. Une réduction de 34% du risque de souffrir d'événements coronariens majeurs

était notée (0.66 ; 0.50-0.87) entre le premier et le dernier quintiles de consommation de

vitamine E. Cette relation n'était plus significative (0.95; 0.72-1.23) lorsque les

consommateurs de suppléments de vitamine E étaient exclus des analyses. De plus, des

analyses subséquentes ont montré que les consommateurs de suppléments lorsque

comparés aux non-consommateurs ont une réduction du risque coronarien de 43% ce qui

75

suggère un bénéfice potentiel de la supplementation en vitamine E. La Iowa Women Health

Study (347) a montré une association entre les quintiles d'apports en vitamine E et la

maladie cardiovasculaire. Des résultats similaires ont été obtenus dans le cadre de l'étude,

HPFS (340) réalisée sur un échantillon de plus de 38 000 professionnels de la santé.

Tableau 11 : Études prospectives portant sur la relation entre la consommation de vitamines et le risque cardiovasculaire

Auteur Etude n Suivi

(ans)

Antioxydant

(vitamine) RR (95%, IC) Type

d'incident

(342) NHS 85 000 8 E 0.66; 0.50-0.87 ICM

(347) Iowa Women's

Health Study

41 836 f 9 E 0.40; 0.20-0.80 IMA

(340) HPFS 39 9101 4 E 0.64; 0.49-0.83 ICM

(340) HPFS 39 9101 4 P-carotène 0.71; 0.53-0.96 ICM

(340) HPFS fumeurs 4 P-carotène 0.30;0.11-0.82 ICM

(348) NHS 85 000 8 P-carotène 0.74; 0.59-0.93 ICM

(349) MHCPS 1299 4.75 P-carotène 0.54; 0.34-0.86 MCV

(350) Cas-contrôle 433 9 P-carotène 0.50; 0.30-0.80 IMA

(346) Rotterdam study 5197 6.4 P-carotène 0.78; 0.55-1.11 AVC

(346) Rotterdam study 5197 6.4 C 0.86; 0.59-1.26 AVC

(341) NHANES 11 348 h 10 C 0.58; 0.41-0.78 MCV fatal

(341) NHANES 11 348 f 10 C aliments

+ plasma

0.75; 0.55-0.99 MCV fatal

(351) NHS 85 000 8 C 0.73; 0.57-0.94 ICM

(340) HPFS 39 910 4 C 0.89; 0.68-1.16 ICM

(352) EPIC-Norfolk 19496 4 C aliments

+ plasma

0.70; 0.60-0.82 MCV et

ICM

F= femmes; t= tabagisme; h= homme; AVC= Accident vasculaire cérébral; ICM= Incident coronarien majeur; IMA= Infarctus du myocarde aigu; MCV

76

7.4.2 Consommation /3-carotène et risque cardiovasculaire

L'étude HPFS (340) s'est aussi intéressée à la relation entre le risque de souffrir

d'événements coronariens majeurs et l'apport en p-carotène. Les chercheurs ont observé

une réduction du risque entre les consommateurs du premiet et du dernier quintile (0.71;

0.53-0.96). L'analyse des sous-groupes révélait que les fumeurs étaient les seuls à

bénéficier de cette réduction. La NHS a aussi observé une réduction du risque coronarien

entre le quintile de consommation de P-carotène le plus élevé lorsque comparé au plus

faible (0.74; 0.59-0.93) (348). Plusieurs autres études effectuées chez les utilisateurs de

tabac ont associé une réduction du risque cardiovasculaire proportionnelle à la

consommation de P-carotène (349,350). Le tabagisme favorise l'atteinte d'une condition

prooxydative propice au développement de la MCV (353). À cet égard, les antioxydants

pounaient jouer un rôle de premier plan dans la lutte face à ces agents oxydatifs (353).

Cependant, plusieurs études n'ont pas observé d'association entre les apports en P-carotène

et le risque cardiovasculaire. Par exemple, la Rotterdam Study (RS) (346), une étude

incluant 5197 Hollandais suivis durant en moyenne 6.4 ans, n'a observé aucune association

entre le risque d'AVC ischémique et l'apport en P-carotène.

7.4.3 Consommation de vitamine C et risque cardiovasculaire

La Rotterdam Study (346) a également mis en relation la consommation de vitamine C et la

réduction du risque de souffrir d'AVC ischémique. Une autre étude (NHANES I) (341)

d'une durée de 10 ans et portant sur plus de 11 000 Américains a observé une réduction du

risque coronarien chez les hommes ayant un apport élevé en vitamine C (0.75, 0.53-0.97)

lorsque comparée à ceux avec un apport faible. Une récente révision de la NHS (351), une

étude réalisée sur une période de suivi de 16 ans a mis en lumière une relation inverse entre

la consommation de vitamine C et la maladie coronarienne (0.73; 0.57-0.94 pour le quintile

le plus élevé par rapport au plus faible) contrairement à la première analyse qui n'en

détectait pas après un suivi de 8 ans. Ce contraste entre les résultats observés illustre la

lenteur du développement de la MCV. En considérant ce résultats, les études

77

épidémiologiques portant sur la vitamine C devraient s'étendre sur de longues périodes.

L'étude prospective EPIC-Norfolk est allée un peu plus loin en regardant l'impact des

concentrations plasmatiques d'acide ascorbique sur le risque de mortalité cardiovasculaire

(352). Ds ont montré une importante réduction du risque de maladie cardiovasculaire avec

un risque relatif de 0.70 (0.60-82) entre les quintiles extrêmes et en ajustant pour Tâge, le

sexe, le cholestérol, la tension systolique, TIMC, le tabagisme, le diabète et l'utilisation de

suppléments. De plus, cette étude a aussi montré qu'une augmentation des concentrations

plasmatiques de vitamine C de 20 pmol/L, soit l'équivalent d'une consommation

supplémentaire de 50 grammes de fruits et/ou légumes par jour, était associée à une

réduction de 20% du risque de mortalité, et ce, indépendamment des facteurs cités

précédemment. Mis à part ces trois dernières études, très peu ont établi de relation entre la

consommation de vitamine C et une réduction du risque cardiovasculaire.

En résumé, les études épidémiologiques associent une réduction du risque cardiovasculaire

à un apport élevé en vitamine E dans la population en général, en P-carotène chez les

fumeurs et en vitamine C dans une étude à long terme.

7.5 Etudes de supplementation en vitamines antioxydantes

En raison du nombre restreint d'études d'intervention alimentaire s'intéressant à l'effet des

vitamines A, E et C sur le risque à long terme de souffrir de la MCV seules les études de

supplementations seront analysées. Dans les études d'intervention alimentaire, des

variations dans les sources de nutriments peuvent amener une pléiade de conutriments

pouvant agir en synergie avec les antioxydants sur le profil de risque cardiovasculaire. Les

vitamines étant prises indépendamment des aliments qui les contiennent naturellement et

qui peuvent en favoriser la biodisponibilité, il s'agit d'une importante limitation des études

de supplementation. Par souci de simplification, seules les études impliquant plus de 2000

sujets supplémentés durant plus de 3 ans seront décrites dans le cadre de la présente thèse.

De plus, comme ces études comportent toutes un groupe placebo, ce dernier fera office de

groupe de référence pour le calcul des risques relatifs.

78

7.5.1 Études de prévention primaire

Au cours de la prochaine section nous réviserons les études de prévention primaire puis les

études de prévention secondaire. Un résumé de ces études se retrouve dans le tableau 12.

Tableau 12 : Études d'intervention portant sur la relation entre la consommation de vitamines et le risque de décès cardiovasculaire

Référence Etude n Suivi

(ans)

Antioxydants RR (95%, IC) Type

d'incident

Etudes de prévention primaire

(354) SUVIMAX 12 375 7.5 Multi 0.63 (0.42-0.93) MCV

(355) ATBC 20 000 T 6.1 Vitamine E 1.02(0.95-1.09) DCV

(356) ATBC 20 000 T 6.1 p-carotène 1.75(1.16-2.64) DCV

(357) CARET 18000T 4 P-carotène et

rétinol

1.26(0.99-1.61) DCV

(358) HOPE2 14641H 8 Vitamine E 1.07(0.90-1.28) DCV

(358) HOPE2 14641H 8 Vitamine C 1.02(0.85-1.21) DCV

(359) CCPS 29584 5 Sélénium,

Vitamine E et

bêta-carotène

0.90(0.76-1.07) DCV

Études de prévention secondaire

(360) CHAOS 2002 1.4 Vitamine E 1.18(0.62-2.27) DCV

(360) CHAOS 2002 1.4 Vitamine E 0.23(0.11-0.47) IMNF

(361) GISSI 11324 3.5 Vitamine E 0.80 (0.65-0.99) DCV

(362) HOPE 9541 4.5 Vitamine E 1.05(0.90-1.22) DCV

(363) HPS 20 536 5 Vitamines A,E,C 1.05(0.95-1.15) DCV

(364) SPACE 196 1.4 Vitamine E 0.61 (0,28-1.30) DCV

Multi= mélange de vitamine E et C ainsi que p-carotène, sélénium et zinc ; T= Population avec tabagisme ; H= patients hemodialyses IMNF= infarctus du myocarde non fatal. DCV=décès cardiovasculaire

79

7.5.1.1 L'étude SUVIMAX

L'étude Supplementation en vitamines et minéraux antioxydants (SUVIMAX) s'est

intéressée à l'effet d'une combinaison d'antioxydants incluant 125 mg de vitamine C, 30

mg de vitamine E, 6 mg de P-carotène, 100 pg de sélénium et 20 mg de zinc sur le risque

cardiovasculaire de 12 375 Françaises et Français âgés de 35 à 60 ans (354). Après 7.5 ans

d'intervention, aucun effet cardioprotecteur n'a été noté dans l'ensemble de la cohorte.

Cependant, une réduction significative du risque cardiovasculaire était notée chez les

femmes (0.31; 0.14-0.68). Chez les hommes, une augmentation du risque cardiovasculaire

non significative (1.38; 0.96-2.00) a été observée. La surconsommation de vin semblait

responsable des effets négatifs observés dans la cohorte masculine alors que les effets

positifs dans la population féminine proviendrait de la consommation de thé et de chocolat.

7.5.1.2 L'étude ATBC

Dans l'Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Trial (ATBC) (365,366), 20 000 fumeurs

Finlandais ont consommé quotidiennement 50 mg d'à-tocopherol ou 20 mg de P-carotène

pendant une période moyenne de suivi de 6.1 ans. Dans le groupe supplémenté en a-

tocophérol, aucune modification dans la mortalité cardiovasculaire n'a été observée (1.02;

0.95-1.09). Une analyse subséquente a cependant permis de noter une diminution modeste

du risque de développer de l'angine de poitrine dans ce groupe (0.91,0.83-0.99) (355).

Cependant, le groupe supplémenté avec la P-carotène a eu davantage d'événements

coronariens fatals que le groupe témoin (1.75; 1.16-2.64) (356). Comme le développement

de la MCV s'échelonne sur plusieurs décennies, les auteurs ont suggéré que la courte durée

du suivi a pu expliquer l'absence d'effet bénéfique au cours de l'étude.

7.5.1.3 L'étude CARET

La Beta-Carotene and Retinol Efficacity Trial (CARET) (357) s'est intéressé à la

combinaison de 30 mg de P-carotène et de 25 000 IU de rétinol par jour sur l'incidence de

80

cancer chez 18 000 fumeurs/euses au cours d'une période de 4 ans. Cependant, les analyses

secondaires ont révélé une augmentation presque significative de 26% du risque

cardiovasculaire (1.26; 0.99-1.61).

7.5.1.4 L'étude HOPE2

L'étude HOPE2 utilise un devis factorielle 2 par 2 pour étudier l'effet de la

supplementation en vitamine E et C sur la mortalité cardiovasculaire chez 14 641 médecins

entre 1997 et 2007 durant une moyenne de 8 ans (358). Brièvement, le groupe des

consommateurs de vitamine E avait un risque relatif de décès des suites d'événements

cardiovasculaires de 1.07 (0.90-1.28) lorsque comparé au groupe placebo. Les analyses

secondaires ont ensuite mis en lumière une augmentation du risque de souffrir d'accident

vasculaire cérébral hémonagique de 74% (1.74; 1.04-2.91) chez les consommateurs de

vitamine E. Pour leur part, les consommateurs de vitamine C avaient un risque relatif de

décès cardiovasculaire de 1.02 (0.85-1.21). En résumé, cette étude n'a montré aucune

variation significative du risque de décès d'origine cardiovasculaire tant pour la vitamine C

que pour la vitamine E.

7.5.1.5 La Chinese Cancer Prevention Study (CCPS)

Dans le cadre de cette étude, plus de 29 584 Chinois ont été assignés à une des 4

combinaisons de vitamines et composés antioxydants afin de vérifier l'impact sur

l'incidence de cancer (359). Parmi ces traitements, une supplementation combinée en bêta-

carotène, vitamine E et sélénium était étudiée. Dans les analyses secondaires, aucun effet de

cette supplementation sur l'incidence de décès liés aux maladies cardiovasculaires n'a été

observé (0.90; 0.76-1.07).

81

7.5.2 Études de prévention secondaire

Les études principales de prévention primaire sur la supplementation en vitamine A, C et E

n'ont montré aucun bénéfice cardiovasculaire et même certains risques associés à leur

consommation ce qui est contraire aux études d'observation précédemment rapportées. La

prochaine section portera sur les études de prévention secondaire.

7.5.2.1 L'étude CHAOS

La cohorte de la Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS) (360) regroupe 2 002

Anglais avec maladie coronarienne qui ont reçu un placebo, 400 ou 800 IU de vitamine E

par jour pour une durée moyenne de 510 jours. Comparé au groupe placebo, le groupe des

consommateurs de 800 IU/jour avaient une réduction (0.53; 0.34-0.83) de leur indice de

risque cardiovasculaire, une mesure regroupant l'infarctus du myocarde non fatal et la mort

cardiovasculaire. Une réduction du risque d'infarctus du myocarde non fatal de 77% (0.23;

0.11-0.47) était majoritairement responsable de l'effet observé, car une élévation non

significative de 18% du risque de décès de cause cardiovasculaire était observée (1.18 ;

0.62-2.27). Une limite de l'étude est que le groupe placebo contenait davantage d'hommes,

moins de diabétiques et des niveaux plus faibles de cholestérol et de tension systolique que

le groupe traitement. Ces différences suggèrent que le groupe placebo serait en meilleure

santé cardiovasculaire que le groupe traitement ce qui pounait avoir eu un impact sur le

nombre d'infarctus du myocarde chez le groupe plus à risque.

7.5.2.2 L'étude GISSI

Dans le Gruppo Italiano per lo Studio délia Sopravvivenza nell'Infarto miocardico (GISSI),

11 324 Italiens avec histoire personnelle récente d'infarctus du myocarde ont été recrutés

pour une étude d'une durée moyenne de 3.5 ans (361). Un plan d'étude factoriel

investiguant l'impact des acides gras oméga-3 et de la vitamine E (300 mg/jour) sur

82

différents événements cardiovasculaires a été réalisé. Un indice regroupant la mort suite à

un événement cardiovasculaire, l'infarctus du myocarde non fatal et la défaillance non

fatale n'a pas été significativement modifié (0.98;0.87-1.10) par la consommation de

vitamine E. Contrairement à l'étude CHAOS, la supplementation en vitamine E seule dans

cette cohorte a réduit le risque de décès cardiovasculaire d'environ 20% (0.80; 0.65-0.99).

7.5.2.3 L'étude HOPE

Plus de 9 541 sujets avec antécédents de MCV ou de diabète accompagné d'au moins un

autre facteur de risque cardiovasculaire ont pris part à l'étude Heart Outcomes Prevention

Evaluation (HOPE) (362). L'étude avait un devis factoriel 2 par 2 où les participants

consommaient quotidiennement 400 Ul de vitamine E et/ou de l'hypotenseur Ramipril au

cours d'une période moyenne de 4.5 ans. Aucune réduction du risque d'événement

cardiovasculaire incluant l'infarctus du myocarde, l'accident vasculaire cérébral et la mort

cardiovasculaire n'a été notée (1.05; 0.95-1.16) suite à la supplementation en vitamine E.

7.5.2.4 La Heart Protection Study

Dans la Heart Protection Study (HPS) (363), 20 536 adultes avec maladie coronarienne,

occlusion artérielle ou diabète ont été randomisés en deux groupes, l'un consommant

quotidiennement un cocktail d'antioxydants incluant 600 mg de vitamine E, 250 mg de

vitamine C ainsi que 20 mg de P-carotène et l'autre un placebo. Après un suivi d'une durée

de 5 ans, aucune différence significative n'a été notée sur l'incidence d'événements

cardiovasculaires majeurs (1.00; 0.94-1.06) ainsi qu'entre les décès cardiovasculaires

(1.05 ; 0.95-1.15) des deux groupes.

83

7.5.2.5 L'étude SPACE

Cette étude portait sur une population hémodialysée souffrant de MCV et s'intéressait aux

effets de la supplementation en vitamine E de 800 IU/jour sur les risques de récidives

d'événement coronarien (364). Bien que des réductions dans les événements

cardiovasculaires soient notées (0.46; 0.27-0.78), la mortalité cardiovasculaire n'a pas varié

entre les deux groupes (0.61; 0,28- 1.30). La divergence entre ces deux indices

cardiovasculaires provient majoritairement d'une réduction significative de 77% des

infarctus du myocarde non fatals.

7.5.3 Conclusion sur les études de supplementation

Bien que les études d'association accordent un rôle aux vitamines dans la prévention des

MCV, les études d'intervention n'ont pas réussi à démontrer un effet favorable des

vitamines sur le risque cardiovasculaire. Parmi les hypothèses souvent relevées pour

expliquer l'absence d'effets de la supplementation en vitamine, il est fréquemment observé

que le développement de l'athérosclérose est un processus s'échelonnant sur plusieurs

décennies et que les bénéfices de la supplementation pounaient apparaître plus tard. En

réponse à cet argument, les études de suivi sur les premières cohortes de supplementation

n'ont pas démontré d'amélioration à plus long terme (367).

84

7.6 Les polyphenols

Les études épidémiologiques associant la consommation de fruits et légumes à la MCV

présentées au chapitre 7.2 utilisent des journaux alimentaires ou des questionnaires de

fréquence pour déterminer les apports en nutriments des participants. À partir de banques

de données regroupant la composition des aliments en nutriments, il est possible calculer la

quantité de nutriments présente dans l'alimentation des participants. Comme les nutriments

sont mesurés de manière indirecte, il est possible que d'autres substances présentes dans

ces mêmes aliments soient responsables des bienfaits cardiovasculaires rapportés dans ces

études. Ce phénomène, caractérisant la présence de plusieurs composés actifs dans un

même aliment, se nomme la multicolinéarité et limite les conclusions pouvant être tirées

des différentes études épidémiologiques. Cette observation nous mène à la notion de

composés bioactifs (339). Ces derniers, à l'instar des nutriments, se retrouvent en faible

quantité dans les aliments, mais contrairement aux nutriments, ils ne sont pas essentiels à

la vie. Les composés bioactifs présentent des bénéfices pour la santé et peuvent réduire le

risque de souffrir de certaines maladies. Théoriquement, un apport suffisant en nutriments

préviendrait les carences qui causent ces maladies, mais sans affecter le risque de contracter

la maladie par d'autres sources que la carence. Puisque les études d'intervention basées sur

les nutriments ne se sont pas avérées concluantes, nous porterons une attention particulière

aux composés bioactifs des fruits et légumes pouvant réduire le risque cardiovasculaire.

Parmi les grandes catégories, les mieux caractérisées sont ; les stilbènes, les caroténoïdes,

les organosulfurés, les fibres solubles, les acides phénoliques, les monoterpènes, les tannins

hydrolysables et les flavonoïdes (368). Les acides phénoliques, les stilbènes (resvératrol) et

les flavonoïdes font partie de la très grande famille des composés phénoliques comportant

un cycle aromatique auquel est attaché au moins un groupement hydroxyle. Lorsque deux

de ces cycles sont présents sur une même molécule, il s'agit d'un polyphenol. Les

polyphenols feront l'objet du chapitre 7.6.

85

7.6.1 Historique des polyphenols

La vitamine P a été identifiée en 1936 par les scientifiques hongrois Rusznyak 8c Szent-

Gyôrgi. La vitamine P est une substance issue de la pelure de lime réduisant la perméabilité

capillaire et pouvant traiter le Purpura (369). D'ailleurs, le terme vitamine P provient de la

perméabilité qu'elle induirait. Un peu plus tard, la vitamine P fut mieux caractériser , ce qui

permit de mettre en évidence sa composition faite de différentes molécules antioxydantes.

Au cours des années 50, ces molécules antioxydantes globalement renommées polyphenols

perdirent leur titre de vitamine. À partir de ce moment, ils furent considérés comme des

antinutriments parce qu'il a été montré qu'ils inhibent l'absorption des protéines et de

certains ions (fer, cuivre) (370). Par souci de simplification, nous passerons outre les acides

phénoliques pour nous attarder directement aux flavonoïdes.

7.6.2 Nomenclature des flavonoïdes

Les flavonoïdes forment une des 10 classes de polyphenols existants. Des 8000 composés

phénoliques connus, 5000 sont des flavonoïdes. Il n'est donc pas surprenant que ces

derniers soient les composés polyphénoliques les plus présents dans les plantes. Dans le

règne végétal, ces pigments colorés sont impliqués dans la reproduction, la croissance ainsi

que la résistance aux pathogènes et aux prédateurs (371). Ils protègent également les

protéines, les hydrates de carbone, les lipides et l'ADN des dommages causés par les

radicaux libres issus des rayons ultraviolets de la lumière solaire (370). La structure

commune des polyphenols inclue deux noyaux aromatiques liés entre eux par trois

carbones qui typiquement forment un hétérocycle oxygéné (figure 9).

86

Figure 9 : Formule chimique de base des polyphenols

Tirée de (372)

De manière générale, les hétérocycles permettent aux flavonoïdes d'exprimer un caractère

hydrophobe. Pour leur part les différents groupements hydroxyles (phénols) qui sont

répartis sur les différents carbones de la structure de base confèrent une fonction d'acide

faible aux flavonoïdes. Cette fonction acide est hydrophile ce qui fait des flavonoïdes des

molécules amphipathiques. Dépendamment de la localisation et du nombre des

groupements hydroxyles, les flavonoïdes exprimeront un caractère plus ou moins

hydrophile. Les flavonoïdes se répartissent en 6 classes définies selon leur degré de

polymérisation et la nature de leur groupement : flavonols, flavanols, flavones, flavanones,

anthocyanines ainsi que les isoflavones.

Les différences structurales entre les classes de flavonoïdes sont illustrées dans la figure 10.

Dans les aliments, les flavones et les flavonols sont les plus communs (373). Les

flavonoïdes se retrouvent sous formes libres ou liées. La liaison s'effectue principalement

avec des sucres et le plus fréquent est le glucose. Toutefois, la majorité des sucres simples

présents dans les plantes peuvent se lier aux groupements hydroxyles des flavonoïdes. Des

liaisons à des acides glucuroniques, des groupements méthyles et des composés sulfatés ont

aussi été rapportées et ces formes sont nommées respectivement glucuronide, méthyl et

sulfate. Par convention, la forme libre des flavonoïdes est dite aglycone. Pour les formes

liées le nom du groupement est ajouté suite au nom du flavonoïde.

87

OH O

R, = OH.R, - R, = H Utemffmnl R, • R, • OH, « j • H. Quercetin R, = R; *R , = OH Ktyricebr,

Isoflavones

h3

R, - H . R , « O H AptgerW) R, = fi,* OH U«Bo*n

R , " H - Oaidiw, R. m Oh Gentêe*

Anthocyanidines

R, ■ K' R, » OH : Nanngerm R , = R , = OH: Enodcryol R, • OH.R , ' OCH, Hetperetm

R, = RS = H : PalargomJm R.-ÔH R, = H CjWirbVi R, •RJ.»OHOa»j/»«foW] R, = OCH, ; R, = OH . fltfunnSn R, ■ Rj ■ OCH,. JUWWoVn

R, = H, = OH. fi» = H. Cslechra R, * R, = R, = OH • GeBoctlechîr,

Figure 10 : Principales classes de flavonoïdes Tirée de (373)

Toutefois, les exceptions à cette nomenclature sont fréquentes. Par exemple, la quercetine

sous forme méthylée se nomme isohamnétine. Les formes aglycones et glycosylées des

flavonoïdes sont celles principalement retrouvées dans les plantes alors que les autres sont

plutôt des modifications métaboliques fréquement impliqué dans leur catabolisme.

7.6.3 Absorption des flavonoïdes

L'absorption des flavonoïdes s'effectue majoritairement au niveau du petit intestin à

l'exception des isoflavones aglycones (374,375) et, à un moindre niveau, la quercetine

(376) qui sont absorbées dans l'estomac. La vitesse d'absorption des différents flavonoïdes

88

est très variable et l'absorption peut s'effectuer en moins de 3 minutes pour certains

isoflavones aglycones (374). L'hypothèse actuelle du transport des flavonoïdes par

l'épithélium intestinal est illustrée à la figure 11 présentée ci-bas.

j Q k F F Fg+Fs

Figure 11 : Mécanismes intestinaux du transport des flavonoïdes

FG : flavonoïde glycosylé ; BSPG : p-glucosidase ; FLH : lactase phloridizin hydrolase ;

Fg : flavonoïde glucuronide ; Fs flavonoïde sulfaté ; SGLT1 : transporteur du glucose

sodium dépendant-1 ; UGT : UDP-glucuronlytransférase ; SULT : sulfotransférase et

MRP : protéine associée à la résistance aux multidrogues.

Tirée de (377)

7.6.3.1 Mécanismes d'absorption des flavonoïdes

Pour une majorité de flavonoïdes, l'absorption est plus efficace pour les résidus glycosylés.

Le rôle du transporteur du glucose sodium dépendant-1 (SGLT1) a été soulevé pour

expliquer l'efficacité accrue du transport des formes glycosylés (378,379). La présence de

flavonoïdes glycosylés ralentit l'absorption du glucose dans le jéjunum de porc ; ce qui

suggère une compétition pour le récepteur SGLT1 (380). Selon cette hypothèse, l'entrée

cellulaire des flavonïdes glycosylés serait facilitée par ce transporteur, ce qui n'est pas le

cas pour les formes aglycones qui doivent entrer par diffusion simple, un processus

nettement moins rapide. Différentes glycosydases tel que des P-glucosidase (BSPG) et la

89

lactase phloridizin hydrolase (FLH) peuvent convertir la forme glycosylée en forme

aglycone et, ainsi, ralentir l'absorption de certains flavonoïdes. Par ailleurs, la quercétine-3-

glucoside intestinale se retrouve après absorption dans le plasma majoritairement sous

forme glucuronidée (381) ou sulfatée (377). L'UDP-glucuronlytransférase (UGT) et la

sulfotransférase (SULT) produisent respectivement les flavonoïdes glucuronides et sulfatés

retrouvés au niveau plasmatique (377). Une proportion importante des flavonoïdes liés sont

renvoyés dans la lumière intestinale par la protéine associée à la résistance aux

multidrogues-2 (MRP-2) alors que leur excrétion plasmatique s'effectue par MRP-3.

7.6.3.2 Facteurs influençant l'absorption des flavonoïdes

On estime que par ce système, environ 5% des flavonoïdes ingérés se retrouveront dans le

sang. Par conséquent, il est pertinent de comprendre les facteurs régissant leur

biodisponibilité. Ces facteurs seront détaillés dans la prochaine section

7.6.3.2.1 Le degré de glycosylation des flavonoïdes

Le groupement liant un flavonoïde est un déterminant majeur de sa biodisponibilité. En

dépit de la diversité des groupes de liaison aux flavonoïdes, cette section portera

exclusivement sur les glycosides puisqu'ils sont les plus communs. Des différences

notables dans l'absorption du flavonoïde sont observées selon la nature du sucre lié. Par

exemple, la combinaison des formes de quercetine P-glucoside et rutinoside présente dans

les oignons est absorbée plus rapidement que la combinaison des formes P-glucoside et P-

xyloside de la pomme (382). Par ailleurs, les concentrations plasmatiques de la forme

glucosylée sont 20 fois plus élevées que pour la forme rutinoside. Finalement, les formes

avec un rhamnose ne sont pas absorbées par l'intestin grêle, mais sont dégradées par la

microflore colonique.

90

7.6.3.2.2 La composition de la microflore intestinale

Les formes glycosylées et aglycones sont absorbées différemment et tout élément du tube

digestif pouvant modifier l'intégrité ou le degré de glycosylation d'un flavonoïde peut

moduler l'absorption de ce dernier. De manière générale, il semblerait qu'une majorité de

flavonoïdes conserverait leur intégrité suite au traitement acide de l'estomac (376).

Toutefois, la microflore intestinale pounaient moduler l'intégrité d'une majorité de

flavonoïdes (383). Ce phénomène est prépondérant chez les membres de la famille des

anthocyanines (384,385) et des isoflavones (386). La forme glycosylée de la pelargonidine,

un anthocyanidine, est dégradée par la microflore intestinale chez le rat (387). Cette

dégradation amène une augmentation de l'acide p-hydroxyphényllactique urinaire. Plusieurs

produits de dégradations des cyanidines comme les acides protocatéchuiques sont absorbés

et se retrouvent en circulation (384). Ce phénomène complexifie l'identification des

composés actifs des flavonoïdes de la famille des anthocyanines. De plus, les espèces et la

proportion des bactéries de la microflore intestinale varient entre les populations (388). De

plus, la microflore d'un individu varie avec l'âge, l'alimentation et les infections. La

diversité des produits de dégradation et la variabilité de la microflore rendent complexe

l'identification des molécules absorbées par l'intestin et le colon.

7.6.3.2.3 Les interactions entre flavonoïdes

La co-administration chez le rat des formes glycosylées du flavonol quercetine et du

flavanol catéchine réduit leur absorption respective (389). Les auteurs ont suggéré qu'une

compétition pour SGLT-1 pounait causer ces diminutions. Par ailleurs, la préincubation

avec la naringénine a permis d'augmenter de 208% les concentrations plasmatiques

maximales de quinine (390). Une saturation de la voie MRP-2, impliquée dans

l'élimination intestinale des flavonoïdes, a été invoquée par les auteurs pour expliquer

l'augmentation de l'absorption de ce flavonoïde. Jusqu'à maintenant, peu d'études ont

investigué l'effet des interactions entre flavonoïdes sur leur absorption respective.

91

7.6.3.2.4 Les interactions avec d'autres composés alimentaires

Les glucides compétitionnent avec les flavonoïdes glycosylés pour le récepteur SGLT1

réduisant ainsi leur absorption respective. Outre les glucides, les flavonoïdes interagissent

également avec plusieurs composés alimentaires tels que les lipides, l'éthanol, les

émulsifiants et les protéines (Tableau 13). Une des raisons pour lesquelles la recherche sur

les vitamines antioxydantes a été priorisée provient de l'interaction des polyphenols et des

tannins avec les protéines par la réaction de Maillard. Cette réaction amène une baisse de la

biodisponibilité des protéines qui lui a valu la classification d'antinutriment (391). Une

étude in vivo chez le rat s'est intéressée aux effets de l'éthanol, des lipides et des

émulsifiants seuls ou en combinaison sur l'absorption du flavonol quercetine sous forme

aglycone (quercetine) et méthylé (isohamnetine) (392). Des compositions incluant de 30 à

50 % d'alcool étaient nécessaires pour permettre des augmentations dans l'absorption des

deux formes de quercétines.

Tableau 13 : Effet sur l'absorption des combinaisons d'aliments et de flavonoïdes

Effets sur T absorption des Mécanismes Références Composés Composés Flavonoïdes impliqués alimentaires alimentaires Protéines - - Rx de maillard (391) Glucides - - Compétition au

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Ethanol N/S + Solubilité (392) Lipides - + Solubilité (392-394) Emulsifiants N/S + Solubilité (392,394) N/S : non-significatif

Pris individuellement, les lipides et les émulsifiants n'ont aucun effet significatif sur

l'absorption de la quercetine et de l'isohamnétine, mais ont augmenté les concentrations

plasmatiques de leur forme conjuguée. La combinaison de lipides et d'émulsifiants

augmente l'absorption des deux formes de quercetine étudiées. Le même groupe de

recherche a utilisé les oignons comme source de quercetine et d'isohamnétine, la lécithine/

92

phosphatidylcholine comme émulsifiant et la suie de boeuf ainsi que des huiles de poisson

et de soya comme source de lipides pour reproduire leurs résultats in vivo chez l'homme

(395). Les trois sources de gras ont mené à des augmentations dans l'absorption de la

quercetine et de l'isohamnétine. Ces augmentations sont similaires entre les différentes

sources de lipides mais Témulsifiant a causé des augmentations supérieures à celles des

lipides. Des augmentations de l'absorption des flavonoïdes sont rapportées chez le porc

avec la quercetine (394) ainsi que chez l'humain avec différents flavonols (393) suite à des

repas riches en lipides. Ces résultats suggèrent que les lipides et les émulsifiants ont un

impact positif sur l'absorption des flavonoïdes alors que les protéines et les glucides ont un

impact négatif.

7.6.4 Consommation de flavonoïdes et risque cardiovasculaire

Plusieurs facteurs tels que la température d'entreposage (396), le pH (397), la maturité du

fruit (372), l'endroit sur la plante où se trouve le fruit (372), la saison (372), le processus de

séchage, (370), la fermentation (398), la préparation de l'aliment (372) et le type de cultivar

(396) complexificient la mesure des concentrations en flavonoïdes des aliments. Peu de

banques de données alimentaires contenant les informations relatives aux flavonoïdes sont

disponibles. Jusqu'à récemment, les seules banques disponibles provenaient des Pays-Bas

(399,400) et de la Finlande (401) et ne contenaient que des données pour les flavonols, les

flavonones et les catéchines. En 2003, le Département d'agriculture américain a produit une

nouvelle banque de données incluant 6 classes de flavonoïdes (flavones, flavonols, flavan-

3-ol, flavanones, anthocyanidines et isoflavones). Un nombre restreint d'études a utilisé

cette dernière banque de données dans un contexte d'investigation clinique et scientifique.

Les études utilisant les bases de données européennes seront d'abord analysées puis celle

utilisant la base de données américaine.

93

7.6.4.1 Données européennes incluant flavonols, flavonone s et catéchines

Jusqu'à maintenant, 12 études de cohortes prospectives utilisant les banques de données

européennes ont investigué la relation entre l'apport en flavonoïdes et le risque de MCV.

Sept études (402-407) ont observé une relation inverse entre la consommation des

flavonols, flavones et/ou catéchines et le risque d'événements coronariens. Les cinq autres

études n'ont observé aucun effet significatif (401). Une méta-analyse (408) a été effectuée

en combinant les 7 études bénéfiques. Une réduction du risque relatif de mort par

événements coronariens de 20% (0.80 ; 0.69-0.93) a été observée entre le tertile le plus

élevé et le tertile le plus faible de consommation en flavonols. Ces résultats sont similaires

à ceux rapportés pour la vitamine C ce qui est logique si Ton considère que les sources de

vitamines C contiennent fréquemment des flavonoïdes.

7.6.4.1.1 Impact de l'âge sur les associations entre flavonoïdes et MCV

Plusieurs facteurs pounaient expliquer les différences entre les résultats des études

bénéfiques et neutres. Premièrement, les populations avec plus d'incidents coronariens sont

celles ayant davantage bénéficié de la consommation de flavonols et de flavones. L'âge

moyen des cohortes où sont survenus ces nombreux incidents expliquerait partiellement

cette observation. Les participants de la Zutphen Elderly Study (402,406) (âge moyen :

étendue de Tâge ; 70 ans : 65-84 ans) et de la Rotterdam Study (67 ans : 55 et +) sont

beaucoup plus âgés que ceux de l'étude HPS (54 ans : 40-75 ans) qui n'a pas observé

d'effet cardioprotecteur. Dans les études portant sur les femmes, des diminutions du risque

cardiovasculaire ont été notées dans la cohorte de femmes postménopausées (404) mais pas

dans celle composée de femmes pré et postménopausée (409). Ces résultats suggèrent que

les sujets présentant certains facteurs de risque de MCV associés à une augmentation du

stress oxydatif tel que Tâge ou le statut menopausal bénéficieraient davantage d'une

alimentation riche en antioxydants.

94

7.6.4.1.2 Impact du genre sur les associations entre flavonoïdes et MCV

Une majorité d'études montrant un potentiel cardioprotecteur des flavonoïdes portait sur des

cohortes masculines. En effet, des 7 études réalisées avec des populations exclusivement

masculines, cinq ont observé des effets positifs. Une étude sur deux avec des cohortes

mixtes et une sur quatre chez les femmes ont observé des effets cardioprotecteurs des

flavonoïdes. Il est possible que les hommes bénéficient davantage de la supplementation en

flavonoïdes que les femmes. Le sexe étant un marqueur de risque cardiovasculaire

traditionnel, il est possible que les individus avec un risque accru bénéficient davantage de

la consommation de flavonoïdes.

7.6.4.1.3 Impact du lieu des études sur les sur les associations entre flavonoïdes et

MCV

La plupart des effets protecteurs des flavonols et des flavones ont été rapportées dans les

pays dans lesquels les banques alimentaires ont été élaborées ; ce qui suggère que des

différences régionnales dans les compositions en flavonoïdes des aliments pounaient

exister et causer un biais. Par ailleurs, les habitudes régionales de co-ingestion alimentaire

pounaient moduler la biodisponibilité des flavonoïdes. Par exemple, l'habitude des

Écossais d'ajouter du lait au thé, leur principale source alimentaire de flavonoïdes, réduirait

l'absorption de ces flavonols et expliquerait l'absence d'effets cardioprotecteurs dans cette

population (410,411).

95

7.6.4.2 Données américaines incluant flavones, flavonols, flavan-3-ol, flavonones,

anthocyanidines et isoflavones

Lagiou et coll. (412) ont réanalysé une étude cas-témoins avec la banque de données du

Département d'agriculture américain (USDA, United States Department of Agriculture). La

consommation en flavonoïdes de 329 sujets ayant survécu à un premier incident coronarien

et de 570 contrôles sains a été comparée. Aucune différence significative dans les apports

alimentaires en flavonoïdes totaux entre les deux groupes ne fut observée. Des analyses des

sous-classes de flavonoïdes ont cependant révélé une diminution de 24% du risque

d'événement cardiovasculaire par augmentation de 20.8 mg/jour de flavan-3-ol (0.76 ;

0.59-0.97) ainsi qu'une tendance non significative pour une diminution du risque de MCV

chez ceux consommant davantages d'anthocyanidines (0.86 ; 0.72-1.03). La même banque

a été utilisée pour réanalyser la Iowa Women's Health Study, une cohorte composé de

34 489 femmes post-ménopausées (413). Des taux plus faible de mortalité provenant de la

MCV étaient observés chez les grands consommateurs d'anthocyanidine (0.91 ; 0.83-0.99).

Plus spécifiquement, ces diminutions provenaient d'une réduction du risque de souffrir de

maladie coronarienne fatale (0.88 ; 0.78-0.99). Des diminutions du risque de maladie

coronarienne fatale étaient également observées pour les grands consommateurs de

flavanones (0.78 ; 0.65-0.94) lorsque comparés à ceux en consommant moins.

7.6.4.3 Capacité antioxydante des aliments riche en flavonoïdes

Selon les études épidémiologiques précédemment énoncées, les polyphenols présentent un

potentiel intéressant dans la réduction du risque cardiovasculaire. Il devient donc pertinent

de déterminer les vecteurs de composés phénoliques les plus efficaces. Parmi les différentes

études sélectionnées (370,414-416) et répertoriées dans le tableau 14, la canneberge s'avère

être la meilleure source d'antioxydant selon la méthode de Folin-ciocalteu, une des

méthodes les plus utilisées dans la littérature. Parmi les autres méthodes de mesure de la

capacité antioxydante répertoriées dans le tableau 14, dans celle des TBAR la cerise et la

96

figue possèdent les plus importantes capacités antioxydantes. Dans ces études, la

canneberge se classe 4e sur 6 et 6e sur 20 pour sa capacité antioxydante.

La méthode du TOSC a rapporté que la canneberge possède la meilleure capacité

antioxydante parmi les aliments mesurés. Une autre étude comparait plusieurs méthodes

entre elles, soit, la mesure des peroxynitrites et des radicaux peroxyls et hydroxyles. Bien

que le jus de canneberges n'ait pas directement été évalué, le jus d'airelle, un fruit membre

de la famille des vaccinium près de la canneberge l'a été. En ce qui a trait à la mesure des

peroxynitrites, le jus de betterave fermenté avec acide lactique se classe premier. Pour sa

part, le jus d'airelle se classe 6e parmi les 14 jus investigués dans l'étude. Cependant, pour

la mesure des radicaux peroxyls et hydroxyles, le jus d'airelle se positionne en tête. Enfin,

un autre indice combinant la capacité antioxydante mesurée par les méthodes du Cu/TBAR

et de Folin-ciocalteu, le PAOXI a classé la canneberge 6 e parmi les vingt fruits à l'étude.

La canneberge a une capacité antioxydante variant selon la méthode utilisée, mais elle se

classe très bien. Ces études supportent donc le fort potentiel antioxydant de la canneberge.

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7.7 La canneberge

Le chapitre 7.6 a montré que la canneberge est un fruit très riche en composés phénoliques

et avec une puissante capacité antioxydante. Par conséquent, il devient important de

déterminer qu'elle est la composition de ce fruit.

7.7.1 La composition de la canneberge

Selon les bases de données du Département de l'agriculture des États-Unis (417), la

canneberge est composée en majorité d'eau (78% p/p) avec les glucides complétant le poids

(12% ; tableau 15). Bien que la canneberge ne soit pas une source importante de gras, elle

contient une grande proportion d'acide gras polyinsaturé n-3 qui peut être une proportion

journalière importante pour certaines populations (418). La liste des autres micro et

macronutriments de la canneberge est présentée dans le tableau 15. Excluant la vitamine C,

la composition en antioxydants de la canneberge (Vaccinium macrocarpon) se répartit

principalement en acides phénoliques (419) et en flavonoïdes (420) dont les proportions

sont respectivement 44 et 56% (421). Les flavonoïdes de la canneberge font principalement

partie des familles des anthocyanidines, des flavonols, des flavan-3-ols et des

proanthocyanidines (Tableau 16)(420,422). Plus spécifiquement, la cyanidine, la péonidine,

la quercetine et la myricétine sont les flavonoïdes retrouvés en plus grande quantité dans la

canneberge (421).

Le cocktail de jus de canneberges (CJC) contient aussi du resvératrol en proportions

similaires aux jus de raisin (423). Parmi les quinze acides phénoliques présents (424) dans

la canneberge, l'acide benzoïque est le plus abondant (421,424). Il est aussi connu que les

acides phénoliques sont majoritairement liés, soient entre eux (esters) ou avec un sucre

(glycosides) (424). Ces liaisons sont aussi présentes dans les flavonoïdes comme la

quercetine qui se retrouve principalement sous forme glycosylée (425).

99

Tableau 15 : Composition en micro et macronutriments de la canneberge (Vaccinium macrocarpon)

Moyenne+ET Energie Kcal 46 Énergie KJ 194

Quantité (g/100g) Eau 87.13±0.28 Glucides 12.20 Fibres 4.6+0.1 Lipides Totaux 0.13±0.032

Saturates 0.011 Monoinsaturatés 0.018 Polyinsaturatés 0.055

Protéines 0.39±0.096 Cendre 0.15±0.029

Quantité (mg/lOOg) Minéraux Calcium, Ca 8

Fer, Fe 0.25 Magnésium, Mg 6 Potassium, K 85+2

Vitamines C, acide ascorbique total 13.3±1.2 A,UI 60+5 E (alpha-tocophérol) 1.2±0.1 K (phylloquinone) 5.1±0.4

United State Department of Agriculture (USDA) (417).

Tableau 16 : Contenu en flavonoïdes des canneberges.

Flavonoïdes Quantité (mg/100g)

Classes Flavonoïdes Moyenne+ET Min-Max Anthocyanid ines Cyanidines 41.8112.86 32.16-53.35

Delphinidine 7.66±1.93 0.12-10.66 Malvidine 0.3110.22 0.00-1.34 Péonidine 42.1013.64 32.56-58.18

Flavan-3-ols (-)-Epicatechine 4.3710.93 2.95-5.72 (-)-Epigallocatéchine 0.7410.28 0.00-1.79 (-)-Epigallocatéchine 3 gallate 0.9710.48 0.00-2.86 (+)-Catéchine 0.3910.16 0.00-1.06

Flavonols Kaempferol 0.0910.03 0.00-0.27 Myricétine 6.7811.67 0.40-23.00 Quercetine 15.091 7.30-25.00

Issu du United State Department of Agriculture (USDA) (417)

100

7.7.2 Biodisponibilité des composantes de la canneberge chez l 'humain

Plusieurs acides phénoliques sont retrouvés dans le plasma humain suite à la

supplementation en CJC (426). Plus spécifiquement, les acides benzoïques, féruliques et

sinapiques se retrouvent dans le plasma entre 45 et 270 minutes après la consommation de

CJC. De plus, plusieurs acides phénoliques plasmatiques n'étaient pas présents dans le jus.

Us pounaient provenir de metabolites de certains composés phénoliques. Les

anthocyanidines de la canneberge en circulation atteignent une concentration plasmatique

maximale entre 1 et 4 heures qui s'échelonne de 0.56 à 4.64 nmol/L selon les individus

(427). Dans le plasma, la quercetine tend à être glucuronidées et il a été montré que la

quercétine-3-glucuronide s'accumule préférentiellement dans le macrophage, une cellule

détenant un rôle central dans le développement de l'athérosclérose. Des augmentations des

concentrations plasmatiques de vitamine C et de la capacité antioxydante totale (ORAC)

ont aussi été observées (428-430). Cependant, le jus de canneberge n'a exercé aucun impact

sur les défenses antioxydantes endogènes (429) et ne réduit pas la formation de

Tisoprostane F2, un produit de peroxydation lipidique (431). Enfin, des évidences de la

présence de salicylate ont été rapportées dans le plasma après consommation de jus de

canneberges (432).

7.7.3 Mécanismes d'action des flavonoïdes de la canneberge

Les flavonoïdes pounaient réduire le risque cardiovasculaire par plusieurs mécanismes: par

un effet antioxydant ou via interaction protéique (433,434).

7.7.3.1 L'hypothèse antioxydante

Dans le cadre de la théorie antioxydante, une hypothèse concernant une synergie entre les

vitamines et les flavonoïdes a été suggérée (433). Suite à leur réaction avec les radicaux

libres, les flavonoïdes se régénéreraient en transférant leurs électrons aux vitamines,

principalement la vitamine E. La vitamine E est ensuite catabolisée lentement puis

régénérée par la vitamine C qui, comme les flavonoïdes, est hydrosoluble et rapidement

101

catabolisée. Ce système est donc efficace dans la gestion des déchets oxydatifs

métaboliques. Cet effet économisateur a notamment été démontré in vitro (435). En

conditions physiologiques, les flavonoïdes ont une capacité antioxydante de 20 et 50 fois

supérieure à celle des vitamines E et C respectivement (436).

7.7.3.2 L'hypothèse de l'interaction protéique

Une autre hypothèse suggère que l'interaction des flavonoïdes avec certaines

macromolécules entraînerait des modifications physicochimiques de ces dernières qui

pounaient influencer le système biologique. En effet, le groupe de Baxter (434) a montré

que les polyphenols, plus spécifiquement les procyanidines B2, forment des complexes

avec des protéines riches en résidus prolines. L'activité de plusieurs enzymes produisant

des radicaux libres comme la peroxydase du raifort (horseradish) (437), la lipoxygenase

(437) et la xanthine oxydase (438) est inhibée par certains flavonoïdes. Certains autres

motifs protéiques, dont les domaines liant TATP, interagissent avec les flavonoïdes (439).

Cette famille de domaine inclue notamment la phosphoinositol-3 kinase (PI-3K) (440),

AKT/PKB (441) et la protéine kinase C (442), trois protéines impliquées dans le

développement du diabète de type 2 fréquemment associé à la MCV. En effet, le plus

efficace des inhibiteurs de la PI-3K, le LY294002, provient d'un flavonoïde, la quercetine,

modifié (440,443). D'autres enzymes, telles qu'iNOS, impliquées dans la réponse

inflammatoire sont également inhibées par les flavonoïdes (444). En résumé, ces derniers

pounaient réduire directement (activité antioxydante) et indirectement (liaison protéique) le

stress oxydatif impliqué dans le développement de l'athérosclérose.

102

7.8 Effet de la canneberge sur différents marqueurs de la MCV

Les effets de la supplementation en CJC sur différents marqueurs de la MCV ont été

récemment rapportés par notre groupe. Par conséquent, une partie des résultats présentés

dans cette section est issue d'une revue de littérature publiée dans le journal Molecular

Nutrition and Food Research (445).

7.8.1 Effets de la canneberge sur les lipides sanguins

Jusqu'à maintenant, un nombre limité d'études ont investigué les effets de la canneberge

sur les concentrations plasmatiques de lipides sanguins (tableau 17). Une récente

publication de Duthie et coll. (429) a porté sur un groupe de 20 jeunes femmes qui ont

consommé 750 mL de CJC/jour ou un placebo pendant deux semaines. Aucune variation

dans les concentrations plasmatiques de TG et de cholestérol (VLDL, LDL, HDL et total)

n'a été observée. Dans une étude visant principalement à déterminer l'impact de la

consommation de CJC sur la glycémie et l'insulinémie de diabétiques, certains résultats sur

le bilan lipidique ont aussi été analysés. Dans cette étude, des extraits de canneberges

déshydratées équivalents à 240 mL de jus/jour ont été consommés par 27 hommes et

femmes diabétiques durant 12 semaines (446). Aucun effet sur le profil lipidique n'a été

noté. Le processus thermique de fabrication de la poudre de canneberge peut avoir

influencé les propriétés des flavonoïdes ingérés et réduit leur efficacité (372). Puisque le

devis et la population de l'étude n'avaient pas été sélectionnés pour déterminer les effets du

CJC sur les lipides, ces résultats doivent être interprétés avec une certaine réserve.

Vinson et coll. ont présenté au cours du congrès annuel de l'American Chemical Society les

résultats préliminaires (447) d'une étude dose-réponse qui testait des doses quotidiennes de

250, 500 et 750 mL de CJC/jour sur 19 sujets (11 femmes et 8 hommes)

hypercholestérolémiques non traités par médication. Bien que le cholestérol total n'ait pas

varié, des augmentations de cholestérol HDL et de la capacité antioxydante plasmatique ont

été observées après des doses de 500 et 750 mL de CJC/jour. Cette étude n'a cependant pas

été publiée dans une revue révisée par des paires. La durée des études pounait expliquer les

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104

divergences observées entre les résultats avec l'étude de Duthie et coll.. Dans le cadre de

mes activités de maîtrise, nous avons publié un article montrant que les concentrations

plasmatiques de HDL étaient augmentées de 8% suivant la consommation de CJC (448). La

degré d'augmentation est comparable à certaines interventions pharmacologiques, ce qui en

fait une alternative nutritionnelle intéressante. Dans cette étude, 48% de la variance des

augmentations de HDL-cholestérol étaient expliqués par les variations d'apo AI. D'une part,

cette augmentation peut provenir d'une augmentation de la synthèse d'apoAI comparable à

celle observée avec le vin rouge (449).

D'autre part, des évidences in vitro suggèrent que l'oxydation des apo AI provoque des

liaisons entre elles qui les empêchent de remplir leur fonction adéquatement (450). Une

réduction potentielle de la quantité d'apoAI oxydées suivant la consommation de CJC

aurait pu contribuer à augmenter les concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol. À cet

égard, la quercetine, un flavonol présent en grande quantité dans les canneberges (417)

augmente l'expression de l'enzyme paraoxonase-1 (PON-1) (451). Cette enzyme possède,

d'une part, un pouvoir antioxydant très puissant (452) et, d'autre part, favorise l'efflux de

cholestérol ABCA1-dépendant (453). Le resvératrol, un antioxydant également présent

dans le jus de canneberges, induit l'expression de LXR-oc dans le macrophage (454), ce qui

entraîne des augmentations d'ABCAl et de l'efflux de cholestérol subséquent (455). Deux

anthocyanines, la cyanidine et la péonidine, aussi présentes dans la canneberge ont été

montrées pour augmenter l'expression de PPAR-y, LXR-oc, et ABCA1 ainsi que l'efflux de

cholestérol (456). Enfin, d'autres composés riches en antioxydants comme l'huile d'olive,

l'huile d'argan et le vin rouge sont associés à une augmentation l'efflux de cholestérol

(449,457,458).

105

7.8.2 Effets de la canneberge sur l'oxydation des LDL, l 'adhésion endothéliale, MMP-9 et la fonction endothéliale.

Deux études ont montré qu'in vitro (459,460), les antioxydants de la canneberge pouvaient

prévenir l'oxydation des LDL. Cependant, aucune étude n'a encore investigué l'effet de la

consommation de jus de canneberges sur les concentrations plasmatiques de LDL oxydées.

Tel qu'illustré au cours des chapitres précédents, la LDL oxydée est reconnue pour induire

l'expression des molécules d'adhésion, ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine (199-201) ainsi

que MMP-9 (240). Ainsi, une réduction hypothétique des LDL oxydées pounait avoir des

bénéfices sur ces marqueurs. Indépendamment des niveaux de LDL oxydées, plusieurs

composantes de la canneberge telles que la quercetine (461,462), les proanthocyanidines

(463), les anthocyanidines (464), l'acide hydroxycinnamique (464) et l'acide

acétylsalicylique (465,466) peuvent prévenir les augmentations d'expression d'ICAM-1 et

de VCAM-1 induites par TNF-a en inhibant l'activation de NF-KB démontrée in vitro.

Par ailleurs, des extraits de différentes baies telles que les framboises, bleuets, raisins et les

mûres inhibent l'expression de MMP-2 et MMP-9 in vitro (467,468). À cet égard, les

proanthocyanidines (467) ainsi que le flavonol myricétine (469) détiennent le meilleur

pouvoir inhibiteur. En complément, la quercetine (470) et le resvératrol (471) inhibent

également l'expression de MMP-9.

Une association inverse a été rapportée entre les concentrations de MMP-9 dans le sérum et

TAIx (472). Ainsi, un effet potentiel du jus de canneberges sur MMP-9 pounait avoir des

répercussions sur TAIx. Plusieurs études ont été faites pour montrer les effets bénéfiques de

la supplementation en vitamine C sur la rigidité artérielle (473,474) et la vasodilatation

(475,476). Une étude de supplementation postprandiale n'a cependant pas donné des

résultats concluants (477). Parmi les études portant sur les sources de flavonoïdes, le

chocolat noir a amélioré le diamètre de l'artère brachiale et TAIx mais n'a eu aucun effet

sur Tonde puisée (478). Le même groupe a également rapporté des améliorations de TAIx

et de la mesure de Tonde puisée suite à la consommation de thé noir, mais pas vert (479).

106

Enfin, une diminution de TAIx a été observée suite à une supplementation de deux jours

avec 250mL de vin rouge sans alcool (480).

Plusieurs évidences in vitro ou indirectes nous portent à croire que les antioxydants de la

canneberge pounaient réduire les concentrations de certaines molécules d'adhésion ainsi

que de MMP-9. Néanmoins, des études cliniques doivent être faites pour valider ces

observations chez l'humain.

Enfin, la canneberge est un fruit avec une excellente capacité antioxydante qui pounait

exercer des bénéfices cardiovasculaires par une pléiades de mécanismes. Cependant, ces

mécanismes n'ont pas encore fait l'objet d'une investigation poussée in vivo chez l'homme.

107

Section II

108

Chapitre 8.

Description des objectifs de la thèse

8.1 Problématique

La présente thèse englobe trois études cliniques et une étude fondamentale qui portent sur

les effets d'un jus de canneberges faible en calorie (CJC) sur différents marqueurs de la

MCV. Cette thématique s'inscrit dans la recherche des mécanismes d'action impliqués dans

les bénéfices cardiovasculaires associés à la consommation de fruits et légumes rapportés

dans les études épidémiologiques. L'originalité de ces projets provient de l'utilisation d'une

excellente source d'antioxydants, soit le CJC, ainsi que la diversité des voies métaboliques

investigués.

8.2 Objectif général

L'objectif général de la présente thèse visait à déterminer les effets d'une supplementation

en cocktail de CJC sur le profil cardiométabolique de l'homme afin d'étudier les bénéfices

associés à la consommation de cet aliment.

8.3 Objectifs spécifiques

Le projet de recherche est réparti en 5 objectifs spécifiques qui ont fait ou feront l'objet

d'articles publiés dans des journaux scientifiques révisés par les pairs.

8.3.1 Premier objectif spécifique

Les résultats publiés dans le cadre de mes études de maîtrise ont démontré une diminution

du stress oxydatif tel que mesuré par les nitrites/nitrates (NOx) suite à la consommation de

jus de canneberges (448). De plus, les antioxydants de ce jus ralentissent l'oxydation des

LDL in vitro (459,460).

Le premier objectif spécifique était donc de déterminer les effets d'une supplementation en

CJC sur les concentrations plasmatiques de LDL oxydées et de la capacité antioxydante

109

plasmatique. Pour ce faire, 21 participants ont consommés 7 mL/kg de poids corporel/jour

de CJC pour une durée de 2 semaines.

Nous soulevons l'hypothèse que suite à la consommation de CJC, nous observerons une

diminution des concentrations plasmatiques de LDL oxydées et une augmentation de la

capacité antioxydante ainsi qu'une conélation inverse de ces deux paramètres.

Les travaux reliés à cet objectif spécifique sont présentés au chapitre 9 et on fait l'objet

d'un article publié dans la revue Metabolism, Clinical and Experimental en 2005.

8.3.2 Second objectif spécifique

Plusieurs études ont montré que de nombreux composés du jus de canneberges inhibent

l'expression de certaines molécules d'adhésions in vitro (461-466). Compte tenu de

l'induction des molécules d'adhésion entraînée par les LDL oxydées, il devient pertinent de

vérifier si une relation entre les deux paramètres existe.

Le deuxième objectif spécifique était de déterminer les effets d'une supplementation en

CJC sur les concentrations plasmatiques de LDL oxydées et de différentes molécules

d'adhésion endothéliale chez l'homme. Pour ce faire, 30 hommes ont participé à une étude

dose-réponse incluant la consommation de doses croissantes de CJC (125, 250 puis 500

mL/jour) durant trois phases successives de 4 semaines. Des mesures des concentrations

plasmatiques de LDL oxydées, d'ICAM-1, de VCAM-1 et d'E-sélectine ont été effectuées

au début de l'étude et après chaque phase.

Nous soulevons l'hypothèse que les concentrations plasmatiques de LDL oxydées, ICAM-

1, VCAM-1 et E-sélectine seraient diminuées et que les variations des molécules

d'adhésions corréleraient avec celles de LDL oxydées.

Les travaux reliés à cet objectif spécifique sont présentés au chapitre 10 et ont fait l'objet

d'un article publié dans la revue British Journal of Nutrition en 2008.

110

8.3.3 Troisième objectif spécifique

Plusieurs études ont montré que de nombreux composés du CJC inhibent l'expression de

MMP-9 in vitro (467,469-471). De plus, il existe une relation entre MMP-9 et NOx, un

marqueur de stress oxydatif diminué par la supplementation en CJC.

Le troisième objectif spécifique était de déterminer les effets d'une supplementation en CJC

sur les niveaux de MMP-9 chez l'homme. Pour ce faire, nous avons utilisé la cohorte du

second objectif et avons mesuré les concentrations plasmatiques de MMP-9.

Notre hypothèse était que la supplementation en CJC entraînerait des diminutions des

concentrations plasmatiques de MMP-9.

Les travaux reliés à cet objectif sont présentés au chapitre 11 et font l'objet d'un article

accepté pour publication dans le Journal of the American College of Nutrition en 2010.

8.3.4 Quatrième objectif spécifique

NOx est un marqueur de stress oxydatif, mais aussi de la biodisponibilité du NO, une

molécule qui exerce un rôle central dans la fonction vasodilatoire. Les diminutions des

concentrations plasmatiques de NOx par la consommation de CJC pounaient également

améliorer la fonction vasodilatatrice et la rigidité aortique.

Le troisième objectif spécifique visait la détermination des effets d'une supplementation en

CJC sur la rigidité artérielle ainsi que la vasodilatation chez l'homme. Pour ce faire, nous

avons mis sur pied une étude contrôlée avec un placebo, en chassé-croisé et à double-insu

où les 35 participants devaient se soumettre à la consommation de 500 mL/jour de CJC et

de son placebo pour 4 semaines. Les mesures de la fonction endothéliale ont été mesurées

par tonométrie de l'artère radiale avant et après chaque phase.

I l l

Notre hypothèse était que la supplementation en CJC serait associée à une diminution de la

rigidité aortique et à une augmentation de la fonction vascodilatatrice.

Les travaux reliés à cet objectif spécifique sont présentés au chapitre 12 et sont soumis pour

publication à T European Journal of Clinical Nutrition.

8.3.5 Cinquième objectif spécifique

Suite à la supplementation en CJC, nous avons rapporté par le passé des augmentations de

HDL-cholestérol et d'apoAI. La quercetine et la myricétine sont présentes en quantité

importante dans le CJC (417). Le degré de glycosylation des flavonoïdes modifiés leur

biodisponibilité (378,379). Les protéines ABCA1, ABCG1 et SRBI sont les principales

molécules impliquées dans l'efflux de cholestérol du macrophage (42-45,50).

Le cinquième objectif spécifique était de déterminer les effets de la myricétine, la

quercetine et la quercétine-3f3-D-glucoside sur les niveaux d'ARNm et l'abondance

protéique d'ABCAl, d'ABCGl et de SRBI ainsi que sur l'efflux de cholestérol chez le

monocyte THP-1 différencié. Les niveaux d'expression d'ARNm déterminés par PCR en

temps réel pour trouver les doses de stimulation optimale des flavonoïdes. Ensuite, nous

avons utilisé ces concentrations pour mesurer l'impact de ces flavonoïdes sur l'abondance

protéique et l'efflux de cholestérol chez ces mêmes cellules.

Notre hypothèse était que les traitements avec les flavonoïdes entraîneraient une

augmentation de l'expression des ARNm et des abondances protéiques d'ABCAl ainsi que

d'ABCGl ou de SRBI. Les hausses les plus importantes seraient observées avec la forme

glycosylée de la quercetine. Ces modifications entraîneraient une augmentation de l'efflux

de cholestérol apoAI dépendant.

Les travaux reliés à cet objectif spécifique sont présentés au chapitre 13 et seront soumis

pour publication.

Chapitre 9.

Effet de la supplementation en jus de canneberges sur les concentrations plasmatiques de LDL oxydées et la

capacité antioxydante chez l'homme.

Guillaume Ruel, Sonia Pomerleau, Patrick Couture, Benoît Lamarche, Charles Couillard

Article publié dans la revue

Metabolism. 2005 Jul;54(7):856-61.

113

Résumé

Introduction/Objectif: L'oxydation des lipoprotéines de faible densité (LDL) est

intimement liée au développement de la maladie cardiovasculaire (MCV) et, du coup,

réduire la susceptibilité à l'oxydation des LDL avec des antioxydants peut être un facteur

important en prévention cardiovasculaire. Les flavonoïdes, des composés polyphénoliques

retrouvés dans une large variété de fruits et légumes, possèdent un puissant potentiel

antioxydant et des apports élevés en aliments riche en flavonoïdes ont été associés à une

diminution de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaire.

Le but de la présente étude était de déterminer les effets de la consommation d'un cocktail

de jus de canneberges faible en calorie (CJC) sur les concentrations plasmatiques des

lipoprotéines et de LDL oxydées (LDLox).

Matériels et méthodes: Vingt et un hommes (âge moyen ± écart-type; 38 ± 8 ans) ont

consommé 7 mL/kg de masse corporelle/jour de CJC pendant 14 jours. Avant et après

l'étude, nous avons mesuré les variables anthropométriques, le bilan lipidique ainsi que les

concentrations plasmatiques d'LDLox et la capacité antioxydante.

Résultats: Au niveau basai, nous avons observé que les concentrations plasmatiques de

LDLox étaient significativement associées à la circonférence de la taille (r=0.47, p=0.0296)

ainsi qu'au niveau plasmatique de triglycéride (r=0.68, p=0.0007) et d'apolipoprotéine B

(r=0.91, p<0.0001). L'intervention a entraîné des diminutions des concentrations

plasmatiques d'OxLDL (-9.9 ± 17.8%, p=0.0131) et des augmentations de la capacité

antioxydante (+6.5 ± 10.3%, p=0.0140). Cependant, ces variations n'étaient pas reliés entre

elles (r=-0.01,ns).

Conclusions: En résumé, nos résultats montrent que la consommation journalière de CJC

est associée à une augmentation de la capacité antioxydante plasmatique et à une

diminution dans les concentrations plasmatiques de LDLox. Bien que l'impact

physiologique de nos observations requiert d'être approfondie, les résultats de la présente

étude supportent le rôle des aliments riche en flavonoïdes pour maintenir la santé et

prévenir la MCV.

114

Changes in plasma antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men following short-term cranberry juice consumption


From the Institute of Nutraceuticals and Functional Foods, Laval University (G.R., S.P., P.C., S.L., B.L., CC), the Department of Food Science and Nutrition (S.L., B.L., CC.) and the Lipid Research Center Laval University Medical Research Center (P.C.), CHUL Pavilion, Québec, Canada

Conespondence to : Charles Couillard, Ph.D. Associate Professor

Institute of Nutraceuticals and Functional Foods Department of Food Science and Nutrition Laval University 2440 boulevard Hochelaga, Room 2742 Québec (Québec) Canada G1K7P4

Phone: (418) 656-2131 ext. 12855 Fax: (418) 656-3423 E-mail : charles.couillard @ inaf . ulaval .ca

Short title: Ruel et al - Cranbenies and oxidized LDL

115

ABSTRACT

Low-density lipoprotein (LDL) oxidation is closely implicated in the development of

atherosclerotic cardiovascular disease (CVD) and thus, reducing LDL susceptibility to

oxidation with antoxidants could be of importance in CVD prevention. Flavonoids,

polyphenols compounds found in a large selection of fruits and vegetables, have been

characterized as having a strong antioxidant potential and intake of flavonoid-rich foods has

been related to decreased morbidity and mortality from heart disease. The present study

was therefore undertaken in order to investigate the effect of flavonoid-rich cranbeny juice

supplementation on plasma lipoprotein levels and LDL oxidation. For that purpose, 21 men

(age ± SD: 38 ± 8 years) were enrolled in a 14-day intervention and instructed to drink 7

mL/kg body weight/day of cranbeny juice. Physical and metabolic measures including

plasma lipid and oxidized LDL (OxLDL) concentrations as well as antioxidant capacity

were performed before and after the intervention. At baseline, we found that plasma

OxLDL levels were significantly associated with waist circumference (r=0.47, p=0.0296)

as well as plasma triglyceride (r=0.68, p=0.0007) and apolipoprotein B (r=0.91, p<0.0001)

concentrations. The intervention led to a reduction in plasma OxLDL levels (-9.9 ± 17.8%,

p=0.0131) and increase in antioxidant capacity (+6.5 ± 10.3%, p=0.0140). However, no

relationship was found between both of these changes (r=-0.01, ns). The intervention did

not result in any improvement of plasma lipoprotein-lipid or inflammatory marker

concentrations. Our results show that short-term cranbeny juice supplementation is

associated with significant increase in plasma antioxidant capacity and reduction in

circulating OxLDL concentrations. Although the physiological relevance of our

116

observations needs to be further examined, our study supports the potential role of

antioxidant-rich foods in maintaining health and preventing cardiovascular disease.

INTRODUCTION

Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of death in North America (1). Although

an elevated plasma low-density lipoprotein (LDL) cholesterol concentration is an important

CVD risk factor (2), a large proportion of CVD events remain unexplained by traditional

risk factors like hypercholesterolemia (3). This observation led to the suggestion that

oxidative modifications of LDL particles should be considered in the assessment of CVD

risk (4). Indeed, through a series of events, oxidized LDL (OxLDL) particles can induce

foam cell formation within the artery wall and lead to the development of atherosclerotic

lesions (2,5-10).

Reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS), the so-called free radicals, are highly

reactive molecules that are constantly produced through numerous cellular reactions (e.g.

mitochondrial respiratory chain and inflammation) which can modify other molecules such

as DNA, proteins and lipids (11-13). Nature has provided humans with antioxidant

defenses including enzymes (14) and vitamins (15,16) which have the capacity to neutralize

free radicals. Depleted antioxidant defenses can lead to oxidative stress i.e. imbalance

between the rates of production and elimination of free radicals, increasing the likelihood of

damage to other molecules. Intervention studies aimed at replenishing antioxidant reserves

and their impacts on health have mostly focused on the consumption of vitamins A, C and

E but these studies have yielded conflicting results (17) raising the questions as to whether

vitamins are the most potent antioxidants available and even suggesting a pro-oxidative

potential of vitamins under certain circumstances (18). On the other hand, polyphenols

117

compounds like flavonoids possess an important antioxidant capacity (19,20) and a diet

rich in flavonoids has been associated with the reduction of CVD risk (15). Flavonoids are

present in a large selection of fruits and vegetables (21-23) and thus must be considered an

essential component of a healthy diet. Cranberries (Vaccinium macrocarpon) are one of the

most important sources of flavonoids, including quercetin and myricetin, which are known

to be potent antioxidants (24). Whereas consuming cranbeny-related products has been

shown to prevent urinary tract infections (25), not much is known of the cardioprotective

potential of cranbenies. The present study was therefore undertaken in order to explore the

potential beneficial impact of short-term cranbeny juice consumption on plasma

antioxidant capacity and OxLDL concentrations.

118

SUBJECTS AND METHODS

Subjects

Twenty-one healthy men (mean age ± SD: 38 ± 8 years) were recruited and selected to

cover a wide range of body fatness values. To be part of the study, subjects had to be

weight stable for at least six months prior to the study and free of CVD, diabetes as well as

renal, hepatic or endocrine disorders. Exclusion criteria also included alcohol consumption

(> 2 drinks / day), smoking, unusual dietary habits and use of medication known to affect

insulin or lipoprotein-lipid metabolism. Subjects using vitamin, mineral, antioxidant or

flavonoid supplements were also excluded from the study. Individuals gave their written

consent to participate in the study which was approved by the Medical Ethics Committee of

the Laval University Medical Research Center.

Intervention

Subjects enrolled in the study were instructed to consume cranbeny juice (Ocean Spray's©

Light Cranbeny Juice Cocktail, Ocean Spray Cranbenies Inc., Lakeville-Middleboro, MA)

at a daily dose of 7 ml/kg of body weight for a period of 14 consecutive days. A personally-

calibrated glass and cranbeny juice supply for the entire intervention were provided to the

participants on their first visit to the investigation unit. We used the light version of the

juice, artificially sweetened with sucralose (Splenda®, McNeil Nutritionals LLC, Fort

Washington, PA), in order to avoid the potential detrimental metabolic impact of the added

sugar consumption during the course of the intervention. Subjects visited the laboratory at

the beginning and at the end of the study at which time anthropometric measures were

made and blood sampling performed.

119

Anthropometric measurements

Body weight, height as well as waist and hip circumferences were measured following

standardized procedures (26). Body mass index (BMI) and the waist-to-hip ratio (WHR)

were calculated.

Plasma lipid and lipoprotein concentrations

Blood samples were obtained from an antecubital vein in the morning after a 12-hr

overnight fast. Cholesterol and TG levels were determined in plasma by enzymatic methods

using a RA-1000 analyzer (Bayer Corporation Inc, Tanytown, NY), as previously

described (27). HDL were obtained after precipitation of apolipoprotein (apo) B containing

lipoproteins in plasma with heparin and MnCl2 (28). The cholesterol and TG contents of the

HDL fraction were measured as previously presented. LDL-cholesterol levels were

calculated using the Friedewald equation (29). ApoB concentrations were measured in

plasma by nephelometry (Dade Behring, Mississauga, Ontario, Canada). The lyophilized

serum standards for apoB measurements were prepared in our laboratory and calibrated

with reference standards obtained from the Centers for Disease Control (Atlanta, GA).

Distinct subpopulations of LDL particle were separated in whole plasma using non-

denaturing 2-16% gradient gel electrophoresis as described previously (30). LDL peak

particle diameter (LDL-PPD) was identified as the most prevalent subclass of LDL in each

individual and was calculated from calibration curves using plasma standards of known

diameter. Coefficient of variation of the technique is <2%.

120

Plasma antioxidant capacity, oxidized LDL and inflammatory marker levels

Plasma antioxidant capacity was measured with the metmyoglobin assay developped by

Miller et al. (31). Briefly, the assay is based on the inhibition by antioxidants of the

absorbance of the radical cation of 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonate)

(ABTS). Plasma samples were mixed with ABTS, metmyoglobin and hydrogen peroxide.

Antioxidant capacity or percentage inhibition of the reaction is calculated as the change in

coloration of the solution that is recorded by spectrophotometry (660 nm) at 0 and 3

minutes following mixing of the compounds. Plasma OxLDL levels were measured by

ELISA using a commercial kit (ALPCO Diagnostics, Windham, NH). The technique used

for the measurement of oxidized LDL that was used in the study was developed by Holvoet

et al. (32). The assay is a capture ELISA in which the wells of the microtiter plates are

coated with the monoclonal antibody 4E6 (mAb-4E6) that is directed against a

conformational epitope in the apolipoprotein (apo) B-l00 moiety of LDL that is generated

as a consequence of substitution of lysine residues of apoB-100 with aldehydes. All

measurment were done on the same day and the variation coefficients of both techniques

are < 3%.

Nutritional habits assessment

A 91-item validated food frequency questionnaire (FFQ) (33) was administered by a

nutritionist during the first visit of the subjects to the hospital. The FFQ was structured to

reflect food habits of the Québec population. Food items were listed in food groups: 1)

vegetables, 2) fruits, 3) legumes, nuts and seeds, 4) cereals and grain products, 5) milk and

dairy products, 6) meat/processed meat, 7) poultry, 8) fish, 9) eggs, 10) sweets, 11) oils and

121

fats as well as 12) fast foods and drinks. During the interview, the nutritionist used food

models for a better estimation of the real portion consumed by the subjects. Data were

analyzed with the Nutrition Data System for Research (NDS-R) software (version 4.03),

developed by the Nutrition Coordination Center Food and Nutrient Database 31 (University

of Minnesota, Minneapolis, MN). This database includes more than 16 000 food items for

which the complete nutritional value of 112 nutrients is included.

Statistical analyses

Unless mentionned otherwise, data are presented as mean ± SD. Paired student t-tests were

used to determine the significance of metabolic changes induced by the intervention. In all

analyses, a p value <0.05 was considered significant. When required, variables were log 10

transformed for statistical comparisons, but for practical reasons raw data are presented in

tables and figures. All analyses were conducted using the SAS statistical package (version

8.2, SAS Institute, Cary, NC).

122

RESULTS

Table 1 shows baseline physical and metabolic characteristics of the subjects. We found

that waist circumference (r=0.47, p<0.05) was significantly associated with plasma OxLDL

levels (table 2). A dyslipidémie profile including high plasma total and LDL-cholesterol,

triglyceride and apo B concentrations and the presence of small dense particles, was also

associated to increased plasma OxLDL levels (Table 2). Association between plasma

OxLDL and lipoprotein-lipid profile variables (total cholesterol, LDL-cholesterol ,

triacylglicerides and LDL particle size) were all maintained after adjustement for waist

circumference (data not shown). No association was found between circulating OxLDL

concentration and plasma HDL-cholesterol.

Although, no association was found between the intake of saturated (r= -0.33, ns),

monounsaturated (r= -0.15, ns) or polyunsaturated (r= -0.23, ns) fats and plasma oxidized

LDL concentrations, we found significant negative associations between circulating

OxLDL levels at baseline and dietary glucose (r=-0.51, p=0.0267), fructose (r=-0.50,

p=0.0306) and galactose (r=-0.49, p=0.0324) intake.

The 14-day intervention led to a small but significant (p=0.0114) decrease in BMI as well

as a 2 % reduction in systolic blood pressure in response to the intervention although the

latter failed to reach statistical significance (p=0.0730). No change was noted in the

lipoprotein-lipid profile of the subjects including LDL peak particle sizing following 14-

day cranbeny juice supplementation. However, as shown in Figure 1, we noted a

significant increase in plasma total antioxidant capacity (+0.11 ±0.19 pmol/L, p<0.05) and

123

reduction in plasma OxLDL concentration (-6.0 ± 10.0 U/L, p<0.05) following the

intervention but noted that these changes were not related to each other (r= -0.01, ns;

Figure 2).

124

DISCUSSION

Results of the present study show that short-term daily cranbeny juice consumption

reduces plasma OxLDL levels and increases plasma antioxidant capacity in men.

Considering that cranberries are an important source of polyphenols molecules with a

potent antioxidant activity (22), our results are supportive of the health benefits that can be

achieved through the consumption of antioxidant rich foods (15). To the best of our

knowledge, this is the first study on the relationship between cranbeny flavonoid

supplementation and plasma oxidized LDL concentrations. In humans, free radicals are

produced continuously through a number of cellular events including energy production,

detoxification of the body or exhaustive exercise (34) and these free radicals have the

capacity to alter the integrity of numerous molecules such as lipids, proteins and DNA (16).

In this regard, adopting healthier dietary habits to improve body antioxidant defenses must

be considered important in the global maintenance of health. Our intervention yielded a 6%

increase in total plasma antioxidant capacity, a measure that has been suggested to reflect

the capacity of an individual to neutralize free radicals (35,36).

This increase in plasma antioxidant capacity is concordant with a recent study

showing an increase in plasma flavonoid as well as phenolic and benzoic acid

concentrations after cranbeny juice consumption (37). Surprisingly, the increase in plasma

antioxidant capacity noted in the present study was not associated with the decrease in

circulating OxLDL concentrations. It is known (37) that after cranbeny juice consumption

there is a rapid degradation of dietary and possibly active flavonoids in plasma. As

antioxidant capacity is a fasting measurement, it may not represent the active antioxidant

125

molecule, and thus, could explain the lack of association between change in plasma

antioxidant capacity and OxLDL levels.

Obesity and especially a preferential accumulation of fat in the abdominal region has been

suggested to be associated with a state of oxidative stress, depletion of antioxidant reserves

and oxidative modifications of plasma lipoproteins and lipids (38). We found a positive

association between waist circumference and plasma OxLDL concentrations. A reduction

of abdominal fat accumulation can not, however, be considered as an explanation for the

lower OxLDL levels at the end of the intervention, as no change in waist circumference nor

WHR was noted. Although subjects were instructed to maintain their usual dietary habits

during the course of the intervention, spontaneous changes in the diet of the subjects could

also explain our observations. Unfortunately, this issue could not be addressed in our study

as nutritional information was only collected at baseline. Thus, our understanding of the

present observations is that antioxidants present in cranbeny juice are most likely

responsible for the reduction in plasma OxLDL levels in men of our study. However, the

exact physiological mechanisms by which such an effect takes place remains to be

determined.

Although previous reports had suggested that cranberries could have LDL-cholesterol

lowering and HDL-cholesterol raising effects (39), our intervention is not supportive of

such an effect as no change in either plasma LDL-cholesterol or HDL-cholesterol

concentrations was noted. The discrepancies between results from these previous studies

and the present one could be explain by the short duration of the intervention. Indeed, the

favorable impact of cranbeny juice on LDL-cholesterol and HDL-cholesterol

126

concentrations were noted after 4 and 12-wk interventions. The lack of effect noted in our

study is, however, concordant with a previous 2-wk study investigating the effect of

flavonoid-rich purple grape juice on plasma lipids (40).

The cross-sectional analysis of the baseline data also allowed us to investigate the

metabolic alterations that could be associated with the presence of high plasma OxLDL

levels. We found that abdominally obese-dyslipidemic individuals are most likely to show

high circulating concentrations of OxLDL. As OxLDL play an important role in

atherogenesis (5,41-43) and have been associated with CVD risk (44), our observations

could provide further insights into the increased CVD risk noted in the abdominally obese

population (45). Furthermore, monounsaturated fatty acids (MUFA) have been shown to

reduce LDL oxidation compared to saturated (SFA) and polyunsaturated fatty acids

(PUFA) (46). In the present study, we found no associaton between either the absolute or

relative consumption of SFA, MUFA or PUFA and plasma OxLDL concentrations at

baseline. However, we found that a greater consumption of glucose, fructose and galactose

were associated with low plasma OxLDL levels. As these carbohydrates mostly come from

fruits and dairy products, our observation are concordant with the health benefits than can

be retrieved from consuming these foods (47).

In summary, the present study shows that regular cranbeny juice consumption is associated

with a reduction in plasma OxLDL concentrations and increase in plasma antioxidant

reserves. Further studies are needed to confirm the physiological relevance of these

observations. It must be pointed out that the absence of a placebo group is an important

limitation of our study. However, the information obtained through our intervention

127

wanants the conducts of further studies on the importance of consuming antioxidant-rich

foods in maintaining health and preventing chronic diseases.

128

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was made possible with the financial support of the Canada Research Chair in

Nutrition, Functional Foods and Cardiovascular Health, held by Benoît Lamarche. Charles

Couillard and Patrick Couture are research scholars from the Fonds de la recherche en santé

du Québec (FRSQ). Charles Couillard is also supported by the Chair in Nutrition,

Lipidology and Cardiovascular Disease of Laval University funded by Pfizer Canada and

Provigo. We would like to thank the staff of the Lipid Research Center for their excellent

and dedicated contribution to the study. Our gratitude is also expressed to the subjects that

participated in the project.

129

REFERENCES

1. AHA. Heart disease and Stroke Statistic- 2005 Update. Dallas, Texas, American

Heart Association: 1,2005

2. Ross R: Atherosclerosis—an inflammatory disease. N Engl J Med 340:115-126,

1999

3. Genest JJ, McNamara JR, Salem DN, Schaefer EJ: Prevalence of risk factors in men

with premature coronary artery disease. Am J Cardiol 67:1185-1189, 1991

4. Sniderman AD, Bergeron J, Frohlich J: Apolipoprotein B versus lipoprotein lipids:

vital lessons from the AFCAPS/TexCAPS trial. Cmaj 164:44-47, 2001

5. Tsimikas S, Witztum JL: Measuring circulating oxidized low-density lipoprotein to

evaluate coronary risk. Circulation 103:1930-1932, 2001

6. Tsimikas S, Palinski W, Witztum JL: Circulating autoantibodies to oxidized LDL

conelate with arterial accumulation and depletion of oxidized LDL in LDL

receptor-deficient mice. Arterioscler Thromb Vase Biol 21:95-100, 2001

7. Tsimikas S: Noninvasive imaging of oxidized low-density lipoprotein in

atherosclerotic plaques with tagged oxidation-specific antibodies. Am J Cardiol

90:22L-27L, 2002

8. Tsimikas S, Shaw PX: Non-invasive imaging of vulnerable plaques by molecular

targeting of oxidized LDL with tagged oxidation-specific antibodies. J Cell

Biochem Suppl 39:138-146, 2002

9. Gaziano JM, Manson JE, Buring JE, Hennekens CH: Dietary antioxidants and

cardiovascular disease. Ann N Y Acad Sci 669:249-258; discussion 258-249, 1992

130

10. Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Khoo JC, Witztum JL: Beyond

cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity.

N Engl J Med 320:915-924, 1989

11. Urso ML, Clarkson PM: Oxidative stress, exercise, and antioxidant

supplementation. Toxicology 189:41-54, 2003

12. Parthasarathy S, Santanam N, Ramachandran S, Meilhac O: Oxidants and

antioxidants in atherogenesis. An appraisal. J Lipid Res 40:2143-2157, 1999

13. Aviram M: Review of human studies on oxidative damage and antioxidant

protection related to cardiovascular diseases. Free Radie Res 33 Suppl:S85-97, 2000

14. Libby P: Inflammation in atherosclerosis. Nature 420:868-874, 2002

15. Duthie GG, Bellizzi MC: Effects of antioxidants on vascular health. Br Med Bull

55:568-577, 1999

16. Catapano AL, Maggi FM, Tragni E: Low density lipoprotein oxidation,

antioxidants, and atherosclerosis. Cun Opin Cardiol 15:355-363, 2000

17. Bassuk SS, Albert CM, Cook NR, Zaharris E, MacFadyen JG, Danielson E, Van

Denburgh M, Buring JE, Manson JE: The Women's Antioxidant Cardiovascular

Study: design and baseline characteristics of participants. J Womens Health

(Larchmt) 13:99-117,2004

18. Eder K, Flader D, Hirche F, Brandsch C: Excess dietary vitamin E lowers the

activities of antioxidative enzymes in erythrocytes of rats fed salmon oil. J Nutr

132:3400-3404, 2002

19. Pietta PG: Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod 63:1035-1042, 2000

131

20. Aviram M, Fuhrman B: Polyphenols flavonoids inhibit macrophage-mediated

oxidation of LDL and attenuate atherogenesis. Atherosclerosis 137 Suppl :S45-50,

1998

21. Hakkinen SH, Karenlampi SO, Heinonen IM, Mykkanen HM, Tononen AR:

Content of the flavonols quercetin, myricetin, and kaempferol in 25 edible bénies. J

Agric Food Chem 47:2274-2279, 1999

22. Sun J, Chu YF, Wu X, Liu RH: Antioxidant and antiproliferative activities of

common fruits. J Agric Food Chem 50:7449-7454, 2002

23. Zheng W, Wang SY: Oxygen radical absorbing capacity of phenolics in blueberries,

cranberries, chokebenies, and lingonbenies. J Agric Food Chem 51:502-509, 2003

24. Fuhrman B, Aviram M: Flavonoids protect LDL from oxidation and attenuate

atherosclerosis. Cun Opin Lipidol 12:41-48, 2001

25. Kontiokari T, Sundqvist K, Nuutinen M, Pokka T, Koskela M, Uhari M:

Randomised trial of cranbeny-lingonbeny juice and Lactobacillus GG drink for the

prevention of urinary tract infections in women. Bmj 322:1571, 2001

26. van der Kooy K, Seidell JC: Techniques for the measurement of visceral fat: a

practical guide. Int J Obes Relat Metab Disord 17:187-196, 1993

27. Moorjani S, Dupont A, Labrie F, Lupien PJ, Brun D, Gagne C, Giguere M,

Bélanger A: Increase in plasma high-density lipoprotein concentration following

complete androgen blockage in men with prostatic carcinoma. Metabolism 36:244-

250, 1987

28. Burstein M: Determination of cholesterol in the alpha- and beta-lipoproteins of the

serum by a method based on selective precipitation of beta-lipoproteins. Pathol Biol

(Paris) 8:1247-1249, 1960

132

29. Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS: Estimation of the concentration of low-

density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative

ultracentrifuge. Clin Chem 18:499-502, 1972

30. St-Piene AC, Ruel IL, Cantin B, Dagenais GR, Bernard PM, Despres JP, Lamarche

B: Comparison of various electrophoretic characteristics of LDL particles and their

relationship to the risk of ischemic heart disease. Circulation 104:2295-2299, 2001

31. Miller NJ, Rice-Evans C, Davies MJ, Gopinathan V, Milner A: A novel method for

measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant

status in premature neonates. Clin Sci (Lond) 84:407-412, 1993

32. Holvoet P, Vanhaecke J, Janssens S, Van de Werf F, Collen D: Oxidized LDL and

malondialdehyde-modified LDL in patients with acute coronary syndromes and

stable coronary artery disease. Circulation 98:1487-1494, 1998

33. Goulet J, Nadeau G, Lapointe A, Lamarche B, Lemieux S: Validity and

reproducibility of an interviewer-administered food frequency questionnaire for

healthy French-Canadian men and women. Nutr J 3:13, 2004

34. Moller P, Wallin H, Knudsen LE: Oxidative stress associated with exercise,

psychological stress and life-style factors. Chem Biol Interact 102:17-36, 1996

35. Miller NJ, Rice-Evans C, Davies MJ: A new method for measuring antioxidant

activity. Biochem Soc Trans 2L95S, 1993

36. Pedersen CB, Kyle J, Jenkinson AM, Gardner PT, McPhail DB, Duthie GG: Effects

of bluebeny and cranberry juice consumption on the plasma antioxidant capacity of

healthy female volunteers. Eur J Clin Nutr 54:405-408, 2000

133

37. Zhang K, Zuo Y: GC-MS determination of flavonoids and phenolic and benzoic

acids in human plasma after consumption of cranbeny juice. J Agric Food Chem

52:222-227, 2004

38. Vasankari T, Fogelholm M, Kukkonen-Harjula K, Nenonen A, Kujala U, Oja P,

Vuori I, Pasanen P, Neuvonen K, Ahotupa M: Reduced oxidized low-density

lipoprotein after weight reduction in obese premenopausal women. Int J Obes Relat

Metab Disord 25:205-211, 2001

39. Reed J: Cranbeny flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular health. Crit Rev

Food Sci Nutr 42:301-316, 2002

40. Freedman JE, Parker C, 3rd, Li L, Perlman JA, Frei B, Ivanov V, Deak LR, Iafrati

MD, Folts JD: Select flavonoids and whole juice from purple grapes inhibit platelet

function and enhance nitric oxide release. Circulation 103:2792-2798, 2001

4L Kita T, Kume N, Minami M, Hayashida K, Murayama T, Sano H, Moriwaki H,

Kataoka H, Nishi E, Horiuchi H, Arai H, Yokode M: Role of oxidized LDL in

atherosclerosis. Ann N Y Acad Sci 947:199-205; discussion 205-196, 2001

42. Holvoet P, Hanis TB, Tracy RP, Verhamme P, Newman AB, Rubin SM, Simonsick

EM, Colbert LH, Kritchevsky SB: Association of high coronary heart disease risk

status with circulating oxidized LDL in the well-functioning elderly: findings from

the Health, Aging, and Body Composition study. Arterioscler Thromb Vase Biol

23:1444-1448,2003

43. Ehara S, Ueda M, Naruko T, Haze K, Itoh A, Otsuka M, Komatsu R, Matsuo T,

Itabe H, Takano T, Tsukamoto Y, Yoshiyama M, Takeuchi K, Yoshikawa J, Becker

AE: Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship

with the severity of acute coronary syndromes. Circulation 103:1955-1960, 2001

134

44. Holvoet P, Kritchevsky SB, Tracy RP, Mertens A, Rubin SM, Butler J, Goodpaster

B, Harris TB: The metabolic syndrome, circulating oxidized LDL, and risk of

myocardial infarction in well-functioning elderly people in the health, aging, and

body composition cohort. Diabetes 53:1068-1073, 2004

45. Despres JP: Health consequences of visceral obesity. Ann Med 33:534-541, 2001

46. Kratz M, Cullen P, Kannenberg F, Kassner A, Fobker M, Abuja PM, Assmann G,

Wahrburg U: Effects of dietary fatty acids on the composition and oxidizability of

low-density lipoprotein. Eur J Clin Nutr 56:72-81, 2002

47. Ness AR, Powles JW: Fruit and vegetables, and cardiovascular disease: a review.

Int J Epidemiol 26:1-13, 1997

135

Table 1 : Baseline physical and metabolic characteristics of the subjects

Variables Mean ± SD Range

Number of subjects 21 Body mass index, kg/m2 26.9 ±3.8 22.3 -35.9 Body weight, kg 84.9+11.9 66.7- 109.1 Waist circumference, cm 92.7 ± 12.4 73.5- 117.5 Hip circumference, cm 98 ± 8 84- 115 WHR 0.95 ± 0.08 0.84 -1.15 Systolic pressure, mmHg 110± 10 9 1 - 127 Diastolic pressure, mmHg 72 ± 7 58 -82 Total cholesterol, mmol/L 5.11 ±0.86 3.57 -7.04 Triglycerides, mmol/L 1.24 ±0.42 0.61 -2.12 HDL-cholesterol, mmol/L 1.24 ±0.28 0.70 -1.83 LDL-cholesterol, mmol/L 3.29 ± 0.75 2.14 -4.98 Apolipoprotein B, g/L 0.97 ± 0.20 0.59 -1.32 Total/HDL-cholesterol 4.27 ±1.01 2.49 -6.49 LDL particle size, Â 254.7 ±1.4 251.6 - 257.3

136

Table 2 : Associations between baseline physical and metabolic characteristics and plasma oxidized LDL concentrations

OxLDL

Variables r p value

Weight 0.21 0.3722 Body mass index 0.33 0.1493 Waist circumference 0.47 0.0296 Hip circumference 0.28 0.2163 WHR 0.52 0.0152 Total cholesterol 0.85 0.0001 Triglycerides 0.68 0.0007 LDL-cholesterol 0.86 0.0001 HDL-cholesterol -0.01 0.9599 Total/HDL-cholesterol 0.71 0.0003 Apolipoprotein B 0.91 0.0001 LDL particle size -0.61 0.0031 Antioxidant Capacity -0.05 0.8447

137

Table 3 : Changes in physical and metabolic characteristics following the intervention

Variables Change ± SD p value

Body mass index, kg/m2 -0.14 ±0.34 0.0114 Body weight, kg -0.46 ±1.02 0.0516 Waist circumference, cm -0.12 ±0.93 0.7925 Hip circumference, cm -0.07 ±1.23 0.5657 Waist/hip ratio 0.00 ±0.02 0.7886 Systolic pressure, mmHg - 1.86 ±4.50 0.0730 Diastolic pressure, mmHg - 1.23 ±4.00 0.1713 Total cholesterol, mmol/L 0.09 ± 0.37 0.2712 Triglycerides, mmol/L 0.02 ± 0.26 0.7728 HDL-cholesterol, mmol/L 0.01 ±0.12 0.5696 LDL-cholesterol, mmol/L 0.07 ± 0.29 0.2939 Apolipoprotein B, g/L 0.03 ± 0.09 0.2255 Total/HDL-cholesterol 0.05 ± 0.39 0.5914 LDL particle size, Â 0.01 ± 1.65 0.9682

138

FIGURE HEADINGS

Figure 1: Plasma A) antioxidant capacity and B) oxidized LDL levels before (white bars) and after (black bars) 14-day cranbeny juice supplementation in men.

Data are presented as mean ± SEM. Change in plasma antioxidant capacity: +0.11 ± 0.04 pmol/L or +6.5 ± 2.2%. Change in plasma OxLDL: -6.0 ± 2.19 U/L or -9.9 ± 3.9%.

Figure 2 :Lack of association between changes in plasma antioxidant capacity and oxidized LDL concentrations following 14-day cranbeny juice supplementation in men.

139

Figure 1. 2.10

2.00-

o eo Q. (0 O

CC

■ o

o H

1 8 0

•o CD N

X O

65-

60-

55-

50

. B P<0.05

_

--

Before After

140

20

10 -

0 -CD ~°

l .§ CO T 3

o 1 -10

tn W -20 Q.

-30

Figure 2.

r=-0.01 P=0.98

T 1 1 « T

0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

Change in plasma antioxidant capacity (/jmol/L)

141

Chapitre 10.

La supplementation en cocktail de jus de canneberges réduit les concentrations plasmatiques de LDL oxydées et

de molécules d'adhésion chez l'homme.

Guillaume Ruel, Sonia Pomerleau, Patrick Couture,

Simone Lemieux, Benoît Lamarche, Charles Couillard

Article publié dans la revue

British Journal of Nutrition 2008 Feb;99(2):352-9.

142

Résumé

Introduction/Objectif: Des concentrations plasmatiques élevées de LDL oxydées

(LDLox) et des molécules d'adhésion sont considérées comme des marqueurs du stress

oxydatif et de l'activation endothéliale qui sont impliqués dans le développement des

maladies cardiovasculaires (MCV). Par ailleurs, il a été suggéré que la consommation

d'aliments riche en flavonoïdes pounait être cardioprotectrice par leur effet bénéfique sur

l'oxydation des LDL et l'activation endothéliale. Le but de la présente étude était de

détenniner les effets de la consommations de plusieurs doses d'un cocktail de jus de

canneberges faible en calorie (CJC) sur les concentrations plasmatiques de LDLox, ICAM-

1, VCAM-1 et e-Sélectine chez l'homme avec obésité abdominale.

Matériels et méthodes: Trente hommes (âge moyen ± écart-type; 51 ± 10 ans) ont

consommé des doses croissantes de CJC au cours de 3 périodes successives de 4 semaines

(125 mL/jour; 250 mL/jour et 500 mL/jour). Avant et après chacune des phases de l'étude,

nous avons mesuré les concentrations plasmatiques de LDLox et de molécules d'adhésion

par ELISA.

Résultats: Des diminutions des concentrations plasmatiques de LDLox (p<0.0001),

d'ICAM-1 (p<0.0001) et de VCAM-1 (p<0.05) ont été observées suite à la consommation

de CJC.

Conclusions: En résumé, nos résultats montrent que la consommation journalière de CJC

est associée à des diminutions dans les concentrations plasmatiques de LDLox, ICAM-1 et

VCAM-1 chez l'homme avec obésité abdominale.

143

Low-Calorie Cranberry Juice Supplementation Reduces Plasma Oxidized LDL and Cell Adhesion

Molecules Concentrations in Men Guillaume Ruel, Sonia Pomerleau, Patrick Couture,

Simone Lemieux, Benoît Lamarche, Charles Couillard

From the Institute of NutraceutSals and Functional Foods, Laval University (G.R., S.P., P.C., S.L., B.L., CC), the Department of Food Science and Nutrition (S.L., B.L., CC.) and the Lipid Research Center Laval University Medical Research Center (P.C.), CHUL Pavilion, Québec, Canada

Conespondence to Charles Couillard, Ph.D. Associate Professor


Phone: (418) 656-2131 ext. 12855 Fax:(418)656-3423 E-mail: [email protected]

Short title: Ruel et al - Cranbenies oxidized LDL and endothelial activation

Word Count - Abstract: 197 Text: 4948

Figures and tables: 8

mailto:[email protected]

144

Abstract

Background: Elevated circulating concentrations of oxidized LDL (OxLDL) and cell

adhesion molecules are considered to be relevant markers of oxidative stress and

endothelial activation which are implicated in the development of cardiovascular diseases

(CVD). On the other hand, it has been suggested that dietary flavonoid consumption may

be cardioprotective through possible favorable impacts on LDL particle oxidation and

endothelial activation. Objective: The present study was undertaken to determine the effect

of the daily consumption of low-calorie cranbeny juice cocktail (CJC) on plasma OxLDL,

ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin concentrations in men. Design: Thirty men (age ± SD:

51 ± 10 years) were recruited and asked to consume increasing daily doses of CJC over

three successive periods of 4 wk (125 mL/day, 250 mL/day and 500 mL/day). Plasma

OxLDL and adhesion molecules concentrations were measured by ELISA before and after

each phases. Results: We noted a significant decrease in plasma OxLDL concentrations

following the intervention (p<0.0001). We also found that plasma ICAM-1 (p<0.0001) and

VCAM-1 (p<0.05) concentrations decreased significantly during the course of the study.

Conclusions: In summary, our results show that daily CJC consumption is associated with

decreases in plasma OxLDL, ICAM-1 and VCAM-1 concentrations in men.

Key Words: cranbeny • flavonoids • oxidized LDL • cardiovascular disease • ICAM-1 • VCAM-1

145

INTRODUCTION

Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of death in North America (1) and it is

well recognized that LDL-cholesterol is a major risk factor associated to CVD (2).

However, not all CVD patients show high LDL-cholesterol concentrations and it has been

shown that variations in the physical properties and composition of LDL particles such as

LDL oxidation could explain, at least in part, the atherogenicity of LDL (3, 4) even in

absence of high LDL-cholesterol concentrations. As oxidized LDL (OxLDL) are not

recognized by the LDL receptor but rather by scavenger receptors at the surface of sub-

endothelial resident macrophages, LDL oxidation favors the unrestricted uptake of

cholesterol, thereby leading to the formation of foam cells, which is the first step in the

formation of the earliest atherosclerotic lesions known as fatty streaks (2).

Migration of monocytes from the bloodstream into the subendothelial space requires that

cell adhesion molecules such as the intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1),

vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and E-selectin be expressed by endothelial

cells. This process is refened to as endothelial activation (2). Interestingly, soluble forms of

these different cell adhesion molecules can be measured in plasma probably as a result of

the vascular endothelium breakdown, and these concentrations have been shown to

conelate with cardiovascular mortality (5).

Numerous studies (6-8) have shown that antioxidants and more specifically polyphenolics

compounds can inhibit LDL oxidation, which in turn has been suggested to reduce OxLDL-

induced expression of cell adhesion molecules by endothelial cells (9, 10). Cranbeny is a

potent source of different antioxidant compounds such as flavonols, anthocyanidins,

proanthocyanidins (11, 12), as well as resveratrol (13) and phenolic acids (11).

146

Furthermore, cranberries also contain acetylsalicylic acid (14) that possesses

antiinflammatory activity and that has been shown to decrease VCAM-1 expression in vitro

(15). The present study was therefore undertaken in order to examine the effect of

consuming increasing doses of low-calorie cranbeny juice cocktail (CJC) for a period of 12

weeks on plasma concentrations of OxLDL and cell adhesion molecules in men.

147

MATERIAL AND METHODS

Subjects

Thirty-one healthy and sedentary men were recruited through the media to participate in a

12-wk intervention. Inclusion and exclusion criteria are described in details in Table 1.

Briefly, subjects had to have a waist circumference > 90 cm, a fasting plasma low-density

lipoprotein (LDL)-cholesterol concentration between 3.0 and 5.0 mmol/L and absence of

diabetes, CVD and renal, hepatic and endocrine disorders. A written consent was provided

by each volunteer to participate in the study which was approved by the Medical Ethics

Committee of Laval University (Project # 2003-131). During the course of the study, one

subject dropped out of the project due to personal reasons not related to the intervention.

Therefore, data presented in this article refer to the 30 men who completed the study.

Intervention

Upon their entry into the study, subjects met with a dietician and were instructed to

maintain their usual nutritional habits throughout the entire intervention. Participants were

subjected to a 4-wk Run-in period which consisted of consuming 500 mL/day of a

cranbeny flavored low-calorie placebo juice (PJ). During the Run-in period, participants

were instructed to reduce their alcohol consumption to a maximum of 1 drink/day (or < 15

g of alcohol/day) and to refrain from consuming any vitamin, antioxidant or mineral

supplements. This Run-in period was followed by three 4-wk periods during which subjects

successively consumed 125 mL (Phase 1), 250 mL (Phase 2) and 500 mL (Phase 3) of CJC

daily. These volumes were adjusted to 500 mL of liquid/day by adding 375, 250 or 0

148

mL/day of PJ for phases 1, 2 and 3 respectively. This was achieved in order to minimize the

impact of incorporating increasing quantities of liquid in the daily diet of subjects and blind

subjects from the level of treatment they were assigned to.

PJ and CJC were provided to the subjects in 125 mL ready-to-drink TetraBrik boxes from

Tetra-Pak© (Richmond Hill, Ontario, Canada) that were packaged at Laval University.

Both the PJ and CJC were kindly provided to us by Ocean Spray Cranberries Inc. who also

monitored the packaging sessions to ensure adequate reconstitution and quality of both the

PJ and CJC. A detailed description of the PJ and CJC that were used in the present study

has been previously published (16). In an effort to keep the subjects' sugar consumption to

a minimum and limit possible detrimental changes in plasma triacylglycerol concentrations,

we provided subjects with the no added sugar version of Ocean Spray's Low-Calorie CJC.

Both the PJ and CJC were artificially sweetened with sucralose (Splenda®, McNeil

Nutritionals LLC, Fort Washington, PA). One box of 125 mL of CJC or PJ contained 5.46

g of carbohydrates, and provided 91.3 kJ of energy. A detailed description of both CJC and

PJ is presented in Table 2.

Blood pressure and lipid measures

At each visit to the investigation unit, blood pressure was measured by a nurse with a

manual sphygmomanometer with the subject in a supine position after a 5 minute rest.

Blood samples were obtained from the subjects' antecubital vein, in the morning after a 12-

hr fast. Upon collection, cholesterol and triacylglycerol (TAG) concentrations were

determined in plasma by enzymatic methods using a Technicon RA-1000 analyzer (Bayer

Corporation Inc, Tanytown, NY) as previously described (17). Plasma very low-density

149

lipoproteins (VLDL) (d< 1.006 g/mL) were isolated by ultracentrifugation and the HDL

fraction was obtained after precipitation of LDL from the infranatant (d> 1.006 g/mL) with

heparin and MnCh (18). The cholesterol and TAG contents of the infranatant fraction were

measured before and after the precipitation step. LDL-cholesterol was obtained by

substracting the HDL-cholesterol concentration from the cholesterol content of the

d>1.006g/mL fraction. Apolipoprotein (apo) B concentrations was measured by

nephelometry (Dade Behring, Mississauga, Ontario, Canada) in total plasma as well as in

the d< 1.006 g/mL fraction (LDL-apo B). The lyophilized serum standards for apo B

measurements were prepared at the Lipid Research Center of Laval University Medical

Center and calibrated with reference standards obtained from the Centers for Disease

Control (Atlanta, GA). Commercial ELISA kits were used to determine plasma soluble

forms of E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) as well as

OxLDL (ALPCO Diagnostics, Windham, NH) concentrations.


Data are presented as mean ± SD unless stated otherwise. Treatment effect and changes

between CJC doses on the different variables were determined using the MIXED model

procedure for repeated measures. When needed, covariance matrix structure were treated

for compound symmetry, order 1 autoregressive or Huynh-Feldt. Associations between

changes in variables were quantified with Spearman conélation coefficients. Changes in

men with (n=9) or without (n=21) the metabolic syndrome were tested for significance

using Student paired t-tests. All analyses were performed with the SAS statistical package

(ver 8.2, SAS Institute, Cary, NC) and a p value < 0.05 was considered significant.

150

RESULTS

Subjects' physical and metabolic characteristics upon their entry into the study are

presented in Table 3. As shown in Figure 1, the intervention yielded a decrease in plasma

OxLDL (p<0.001), which reached significance from baseline after the 250mL/day (-5.5 ±

27.1%, p<0.05) and 500 mL/day (-20.7 ± 21.1%, p<0.001) phases. As reported and

discussed in a previous publication by our group (16), the intervention yielded a significant

increase in plasma HDL-cholesterol (p=0.0010) concentration but failed to significatnly

affect circulating TAG (p=0.0553) as well as total (p= 0.85) and LDL cholesterol (p= 0.52)

levels (Table 4).

The effects of consuming increasing daily doses of CJC on plasma cell adhesion molecules

concentrations are illustrated in Figure 2. We found that both sVCAM-1 (p<0.05) and

sICAM-1 (p<0.0001) were decreased following the intervention, reductions reaching

significance compared to baseline values after consumption of the 500mL/day CJC dose for

both sVCAM-1 (-6.4± 11.5 %,p<0.01) and sICAM-1 (-7.5± 15.4 %, p= 0.001). There was

no effect of the intervention on plasma E-selectin concentrations (p= 0.66).

In an effort to characterize the relationships between the responses in plasma sVCAM-1,

sICAM-1, sE-selectin and OxLDL concentration (0-500mL CJC/day), we computed

Spearman conélation coefficients between these variables. As shown in Figure 3, we

found a positive conélation between change in sVCAM-1 and OxLDL concentrations (r=

0.62, p<0.005) but an inverse association between sICAM-1 and OxLDL concentrations (r=

-0.40, p<0.05).

We also examined the impact of being characterized by the metabolic syndrome, according

to the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP ATP-III)

guidelines (19), on the responses of OxLDL and adhesion molecules to the intervention. As

151

shown in Figure 4, we found that consuming low-calorie CJC for a period of 12 weeks

significantly reduced plasma OxLDL and sICAM-1 concentration in both men with and

without the MS. However, circulating s VCAM-1 were signficantly lower at the end of the

intervention only in men without the metabolic syndrome. We found no effect of the

presence of the MS on the response of plasma sE-selectin concentrations to the intervention

(data not shown).

As shown in Table 4, a significant variation was noted in systolic blood pressure (p across

doses <0.05) during the intervention which was accounted for by a significant decrease

between the 125 and 500mL CJC/day (-7 ± 12 mmHg, p= 0.0036) doses. On the other

hand, we noted no significant change in diastolic blood pressure or heart beat in response to

the 12-wk intervention (Table 3).

Finally, we examined the relationships between changes in systolic blood pressure (SBP)

and plasma cell adhesion molecule concentrations following the intervention. A significant

association was noted between change in plasma VCAM-1 concentrations and SBP (r=

0.42, p< 0.05). However, no conélation was noted between changes in SBP and circulating

ICAM-1 (p= 0.51) or E-selectin (p= 0.87) concentrations.

152

DISCUSSION

In the present study, we report that consumption of increasing doses of low-calorie CJC on

a daily basis for a period of 12 weeks is associated with reductions in plasma OxLDL as

well as sICAM-1 and sVCAM-1 concentrations but has no effect on circulating E-selectin

concentrations in men. It is to our knowledge, the first time that low-calorie CJC

supplementation is associated with reductions in plasma cell adhesion molecules

concentrations in humans. In this sense, our observations tend to give further support to the

cardioprotective potential of cranbenies that has been already suggested (20).

The significant reduction in plasma OxLDL concentrations with consumption of CJC

observed in the present study is in agreement with results from previous investigations

having shown that cranbeny antioxidants decrease metal-ion induced LDL oxidation in

vitro (6, 7) and with a previous study from our group in which we observed a decrease in

OxLDL concentration following a 2-wk CJC supplementation in men (21). Consumption of

other fruit juices rich in flavonoids such as grape (22) and pomegranate (23), which share

similarities with cranbenies in regards to their polyphenols content, has also been shown

to reduce plasma OxLDL concentrations.

Although, plasma LDL cholesterol concentrations and LDL oxidation are closely related

(24), the reduction in circulating OxLDL concentrations we report herein cannot be

explained by changes in LDL cholesterol concentrations as these remained stable

throughout the entire intervention, as previously reported (16). Furthermore, it has been

shown that small dense LDL particles are more susceptible to oxidation (25). Although

LDL size was not measured in the present study, we have previously shown that a 2-wk

CJC supplementation was not associated with any significant variation in LDL size despite

153

a reduction in plasma OxLDL concentrations (21). In addition, there was no change in the

LDL-apo B/LDL cholesterol ratio, a crude marker of LDL density, during the cunent

intervention. This suggests that LDL size may not be a major contributor to the decrease in

OxLDL observed in the present study. We believe that the reduction of plasma OxLDL

concentrations in response to low-calorie CJC supplementation is likely to be attributable to

polyphenols compounds of the cranberries as they exert a potent antioxidant activity (26,

27) and have been shown to prevent in vitro LDL oxidation (6, 7). On the other hand, it

may be argued that consuming low-calorie CJC may have affected the total antioxidant

capacity of the subjects through increases and/or preservation of endogenous antioxidant

defenses. However, evidence against such changes have been recently provided with data

indicating that CJC supplementation for 2 weeks had no effect on fasting blood glutathione

peroxidase, catalase and superoxide dismutase activities nor on fasting circulating

glutathione concentrations (28). However, the possibility of improvements in these

parameters over the course of the 12-wk low-calorie CJC supplementation such as the one

we report herein cannot be excluded.

Consumption of grape juice for 14 days was associated with decreases in plasma sICAM-1,

an effect that was attributed to polyphenols grapes (29). Our results are supportive of the

effect of polyphenols on ICAM-1 production. Interestingly, similarities exist in the

polyphenol content of grapes and cranbenies. Both have been characterized as potent

sources of quercetin, myricetin and resveratrol (27, 30), which have been identified as

strong antioxidants (27). In contrast, other polyphenol-rich foods like tea have shown

equivocal results on their effects on circulating adhesion molecules concentrations (31-33).

Differences in the design of these studies but mostly in the type of flavonoids found in tea

154

compared to cranberries are likely to explain the discrepancies between these previous

observations and ours.

The most extensively characterized pathway for cell adhesion molecules production

involves the activation of the nuclear factor-KB (NF-KB). Briefly, stimulation of a

phosphorylation cascade will ultimately lead to the cleavage of the IKB/NF-KB complex

and nuclear translocation of NF-KB where it will be able to regulate the transcription of

numerous genes such as ICAM-1 and VCAM-1 (3). Many stimuli have been identified to

activate the IKB/NF-KB pathway including many inflammatory mediatior and OxLDL (3).

Our observations are somewhat supportive of the OxLDL-induced production of s VCAM-1

as the change in plasma OxLDL concentration following the intervention was positively

conelated to the change in circulating VCAM-1. Unfortunately, NF-kB activation was not

assessed in the cunent study and thus our hypothesis remains to be ascertained.

On the other hand, the contribution of OxLDL to the reduction in plasma sICAM-1

concentrations following the intervention is not so clear as we found an inverse relationship

between the decrease in circulating OxLDL and sICAM-1 concentrations. Although

statistically significant, the physiological relevance of that relationship remains to be better

understood. Results from in vitro studies suggest that molecules like quercetin (34, 35),

resveratrol (36-37), proanthocyanidin (38), anthocyanidin (39), hydroxycinnamic acid (39)

and acetylsalicylic acid (40, 41) have all been shown to prevents TNF-a induce expression

of VCAM-1 and/or ICAM-1 through their inhibition of NF-KB activation. Because

cranbenies are rich in quercetin, it is likely that the 12-wk low-calorie CJC

supplementation may have lowered plasma sICAM-1 through a direct effect of the increase

in flavonoid intake.

155

Abdominal obesity is associated with a cluster of metabolic alterations including

hypertriglyceridemia, low HDL-cholesterol and impaired glucose-insulin homeostasis that

has been defined as the metabolic syndrome (MS) (42). Furthermore, the MS per se is now

recognized as a risk factor of cardiovascular events (43). It is therefore relevant to develop

strategies aimed at improving the metabolic condition of abdominally obese individuals

that could reduce their CVD risk. In the present study, we found that consuming low-

calorie CJC for a period of 12 weeks significantly reduced plasma OxLDL and sICAM-1

concentrations in both men with or without the MS. However, our intervention yielded a

significant reduction of s VCAM-1 concentrations only in subjects without the MS.

A high blood pressure is an important risk factor for CVD (19). In the present study, we

noted a slight significant decrease in systolic blood pressure over the course of the

intervention. We found no effect of drinking low-calorie CJC on a daily basis on diastolic

blood pressure. Previous studies with fruit juice have also reported blood pressure lowering

effect. Indeed, pomegranate (44), Concord grape juice (45) and sweetie juice (mix of

grapefruit and pummelo) (46) in humans as well as grape juice with wine vinegar in rats

(47) have all been shown to lower blood pressure . Among possible mechanisms underlying

the hypotensive effect of these beverages, inhibition of the activity of the angiotensin-

converting enzyme (ACE) has been suggested as most likely. On the other hand, dark

chocolate, a food also rich in flavonoids has been reported to increase resting brachial

artery diameter (48) which is concordent with a blood pressure lowering effect. Neither

ACE activity nor brachial artery diameter were measured in the present study and the

decrease in systolic blood pressure emergent herein remains unexplained.

One important drawback of our study is that we are not able to clearly assess whether the

favorable changes in plasma OxLDL, ICAM-1 and VCAM-1 concentrations we noted were

156

the result of increasing doses of CJC or duration of the intervention. Furthermore, although

a similar study design has been previously used in numerous studies (16, 21, 49-53), the

absence of a placebo control group is also unfortunate and surely imposes a limit to our

study. These issues are presently under investigation in our laboratory.

In summary, results of the present study show that a 12-wk supplementation with low-

calorie CJC reduces plasma OxLDL concentrations in men. Furthermore, to our

knowledge, our study is the first to show that consuming low-calorie CJC leads to a

decrease in circulating sICAM-1 and SVCJAM-1 concentrations in humans. Although

further research is needed to wanant our observations, the present study reinforces the

notion that consuming fruits and vegetables, or their derived products, can have significant

benefits on CVD risk profile.

157

ACKNOWLEDGMENTS

This study was supported by an unrestricted grant from the Canadian Cranbeny Growers

Coalition. Charles Couillard, Simone Lemieux and Patrick Couture are research scholars

from the Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ). Charles Couillard is also

supported by the Chair in Nutrition, Lipidology and Cardiovascular Disease of Laval

University. Benoît Lamarche holds a Canada Research Chair in Nutrition and

Cardiovascular Health. The authors had no conflicts of interest to disclose.

GR was responsible for data collection, data analysis, and drafting of the manuscript. SP

recruited the subjects and contributed to data collection and analysis. PC was responsible of

the medical monitoring of the subjects during the intervention. SL was responsible for the

conception and design of the study. BL was responsible for the conception and design of

the study and provided assistance for statistical analyses. CC was responsible for the

conception and design of the study as well as obtaining funding for the study. All authors

were also implicated in the critical review of the manuscript for important intellectual

content. The authors would like to thank Marge Leahy Ph.D. and Robin Roderick M.Sc.

from Ocean Spray Cranbenies Inc. for kindly assessing the composition of CJC and

placebo juice as well as supervising the packaging sessions at Laval University. We also

acknowledge the contributions of Danielle Aubin (R.N) as well as Mélanie Martineau,

Jocelyne Giasson, Raoul Géra, Pascal Cliche and Bernard Béliveau (Food Transformation

Laboratory, Laval University). Finally, we would like to thank the subjects without whom,

no clinical research would be possible.

158

REFERENCES

1. AHA (2005) Heart disease and Stroke Statistic- 2005 Update., pp. 1. Dallas, Texas:

American Heart Association.

2. Ross R (1999) Atherosclerosis—an inflammatory disease. N Engl J Med 340, 115-

126.

3. Robbesyn F, Salvayre R & Negre-Salvayre A (2004) Dual role of oxidized LDL on

the NF-kappaB signaling pathway. Free Radie Res 38, 541-551.

4. Klouche M, May AE, Hemmes M, Messner M, Kanse SM, Preissner KT & Bhakdi

5 (1999) Enzymatically modified, nonoxidized LDL induces selective adhesion and

transmigration of monocytes and T-lymphocytes through human endothelial cell

monolayers. Arterioscler Thromb Vase Biol 19, 784-793.

5. Blankenberg S, Rupprecht HJ, Bickel C, Peetz D, Hafner G, Tiret L & Meyer J

(2001) Circulating cell adhesion molecules and death in patients with coronary

artery disease. Circulation 104, 1336-1342.

6. Chu YF & Liu RH (2005) Cranbenies inhibit LDL oxidation and induce LDL

receptor expression in hépatocytes. Life Sci 77, 1892-1901.

7. Wilson T, Porcari JP & Harbin D (1998) Cranbeny extract inhibits low density

lipoprotein oxidation. Life Sci 62, PL381-386.

8. Fuhrman B & Aviram M (2001) Flavonoids protect LDL from oxidation and

attenuate atherosclerosis. Cun Opin Lipidol 12, 41-48.

9. Couillard C, Ruel G, Archer WR, Pomerleau S, Bergeron J, Couture P, Lamarche B

6 Bergeron N (2005) Circulating levels of oxidative stress markers and endothelial

159

adhesion molecules in men with abdominal obesity. J Clin Endocrinol Metab 90,

6454-6459.

10. Kume N, Cybulsky MI & Gimbrone MA, Jr. (1992) Lysophosphatidylcholine, a

component of atherogenic lipoproteins, induces mononuclear leukocyte adhesion

molecules in cultured human and rabbit arterial endothelial cells. J Clin Invest 90,

1138-1144.

11. Chen H, Zuo Y & Deng Y (2001) Separation and determination of flavonoids and

other phenolic compounds in cranbeny juice by high-performance liquid

chromatography. J Chromatogr A 913, 387-395.

12. Wang P, Du, C , and Francis, F. (1978) Isolation and characterization of

polyphenols compounds in cranbenies. J. Food Science 43, 1402-1404.

13. Wang Y, Catana F, Yang Y, Roderick R & van Breemen RB (2002) An LC-MS

method for analyzing total resveratrol in grape juice, cranbeny juice, and in wine. J

Agric Food Chem 50,431-435.

14. Duthie GG, Kyle JA, Jenkinson AM, Duthie S J, Baxter GJ & Paterson JR (2005)

Increased salicylate concentrations in urine of human volunteers after consumption

of cranbeny juice. J Agric Food Chem 53, 2897-2900.

15. Eisele G, Schwedhelm E, Schieffer B, Tsikas D & Boger RH (2004) Acetylsalicylic

acid inhibits monocyte adhesion to endothelial cells by an antioxidative mechanism.

J Cardiovasc Pharmacol 43, 514-521.

16. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lemieux S, Lamarche B & Couillard C (2006)

Favourable impact of low-calorie cranbeny juice consumption on plasma HDL-

cholesterol concentrations in men. Br J Nutr 96, 357-364.

160

17. Moorjani S, Dupont A, Labrie F, Lupien PJ, Brun D, Gagne C, Giguere M &

Bélanger A (1987) Increase in plasma high-density lipoprotein concentration

following complete androgen blockage in men with prostatic carcinoma.

Metabolism 36, 244-250.

18. Burstein M, Scholnick HR & Morfin R (1970) Rapid method for the isolation of

lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J Lipid Res 11,

583-595.

19. (2001) Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol

Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment

of High Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel III). Jama 285, 2486-

2497.

20. Reed J (2002) Cranbeny flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular health. Crit

Rev Food Sci Nutr 42, 301-316.

21. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lamarche B & Couillard C (2005) Changes in

plasma antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after

short-term cranbeny juice consumption. Metabolism 54, 856-861.

22. Castilla P, Echani R, Davalos A, et al. (2006) Concentrated red grape juice exerts

antioxidant, hypolipidemic, and antiinflammatory effects in both hemodialysis

patients and healthy subjects. Am J Clin Nutr 84, 252-262.

23. Aviram M, Dornfeld L, Rosenblat M, Volkova N, Kaplan M, Coleman R, Hayek T,

Presser D & Fuhrman B (2000) Pomegranate juice consumption reduces oxidative

stress, atherogenic modifications to LDL, and platelet aggregation: studies in

humans and in atherosclerotic apolipoprotein E-deficient mice. Am J Clin Nutr 71,

1062-1076.

161

24. Holvoet P (1999) Role of oxidatively modified low density lipoproteins and anti

oxidants in atherothrombosis. Expert Opin Investig Drugs 8, 527-544.

25. Parthasarathy S, Santanam N, Ramachandran S & Meilhac O (1999) Oxidants and

antioxidants in atherogenesis. An appraisal. J Lipid Res 40, 2143-2157.

26. Sun J, Chu YF, Wu X & Liu RH (2002) Antioxidant and antiproliferative activities

of common fruits. J Agric Food Chem 50, 7449-7454.

27. Hakkinen SH, Karenlampi SO, Heinonen IM, Mykkanen HM & Tononen AR

(1999) Content of the flavonols quercetin, myricetin, and kaempferol in 25 edible

bénies. J Agric Food Chem 47, 2274-2279.

28. Duthie SJ, Jenkinson AM, Crozier A, Mullen W, Pirie L, Kyle J, Yap LS, Christen

P & Duthie GG (2006) The effects of cranbeny juice consumption on antioxidant

status and biomarkers relating to heart disease and cancer in healthy human

volunteers. Eur J Nutr 45(2), 113-122.

29. Coimbra SR, Lage SH, Brandizzi L, Yoshida V & da Luz PL (2005) The action of

red wine and purple grape juice on vascular reactivity is independent of plasma

lipids in hypercholestérolémie patients. Braz J Med Biol Res 38, 1339-1347.

30. Flamini R (2003) Mass spectrometry in grape and wine chemistry. Part I:

polyphenols. Mass Spectrom Rev 22, 218-250.

31. Hodgson JM, Puddey IB, Mori TA, Burke V, Baker RI & Beilin U (2001) Effects

of regular ingestion of black tea on haemostasis and cell adhesion molecules in

humans. Eur J Clin Nutr 55, 881-886.

32. Sung H, Min WK, Lee W, Chun S, Park H, Lee YW, Jang S & Lee DH (2005) The

effects of green tea ingestion over four weeks on atherosclerotic markers. Ann Clin

Biochem 42, 292-297.

162

33. Lee W, Min WK, Chun S, Lee YW, Park H, Lee do H, Lee YK & Son JE (2005)

Long-term effects of green tea ingestion on atherosclerotic biological markers in

smokers. Clin Biochem 38, 84-87.

34. Blanco-Colio LM, Valdenama M, Alvarez-Sala LA, et coll. (2000) Red wine intake

prevents nuclear factor-kappaB activation in peripheral blood mononuclear cells of

healthy volunteers during postprandial lipemia. Circulation 102, 1020-1026.

35. Choi JS, Choi YJ, Park SH, Kang JS & Kang YH (2004) Flavones mitigate tumor

necrosis factor-alpha-induced adhesion molecule upregulation in cultured human

endothelial cells: role of nuclear factor-kappa B. J Nutr 134, 1013-1019.

36. Leiro J, Ananz JA, Fraiz N, Sanmartin ML, Quezada E & Orallo F (2005) Effect of

cis-resveratrol on genes involved in nuclear factor kappa B signaling. Int

Immunopharmacol 5, 393-406.

37. Kaplan S, Morgan JA, Bisleri G, Cheema FH, Akman HO, Topkara VK & Oz MC

(2005) Effects of resveratrol in storage solution on adhesion molecule expression

and nitric oxide synthesis in vein grafts. Ann Thorac Surg 80, 1773-1778.

38. Bagchi D, Bagchi M, Stohs S, Ray SD, Sen CK & Preuss HG (2002) Cellular

protection with proanthocyanidins derived from grape seeds. Ann N Y Acad Sci

957, 260-270.

39. Youdim KA, McDonald J, Kalt W & Joseph JA (2002) Potential role of dietary

flavonoids in reducing microvascular endothelium vulnerability to oxidative and

inflammatory insults ( small star, filled). J Nutr Biochem 13, 282-288.

40. Kopp E & Ghosh S (1994) Inhibition of NF-kappa B by sodium salicylate and

aspirin. Science 265, 956-959.

163

4L Weber C, Erl W, Pietsch A & Weber PC (1995) Aspirin inhibits nuclear factor-

kappa B mobilization and monocyte adhesion in stimulated human endothelial cells.

Circulation 91, 1914-1917.

42. Grundy SM, Brewer HB, Jr., Cleeman JI, Smith SC, Jr. & Lenfant C (2004)

Definition of metabolic syndrome: report of the National Heart, Lung, and Blood

Institute/American Heart Association conference on scientific issues related to

definition. Arterioscler Thromb Vase Biol 24, el3-18.

43. Malik S, Wong ND, Franklin SS, Kamath TV, L'Italien GJ, Pio JR & Williams GR

(2004) Impact of the metabolic syndrome on mortality from coronary heart disease,

cardiovascular disease, and all causes in United States adults. Circulation 110, 1245-

1250.

44. Aviram M & Dornfeld L (2001) Pomegranate juice consumption inhibits serum

angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure.

Atherosclerosis 158, 195-198.

45. Park YK, Kim JS & Kang MH (2004) Concord grape juice supplementation reduces

blood pressure in Korean hypertensive men: double-blind, placebo controlled

intervention trial. Biofactors 22, 145-147.

46. Reshef N, Hayari Y, Goren C, Boaz M, Madar Z & Knobler H (2005)

Antihypertensive effect of sweetie fruit in patients with stage I hypertension. Am J

Hypertens 18, 1360-1363.

47. Honsho S, Sugiyama A, Takahara A, Satoh Y, Nakamura Y & Hashimoto K (2005)

A red wine vinegar beverage can inhibit the renin-angiotensin system: experimental

evidence in vivo. Biol Pharm Bull 28, 1208-1210.

164

48. Vlachopoulos C, Aznaouridis K, Alexopoulos N, Economou E, Andreadou I &

Stefanadis C (2005) Effect of dark chocolate on arterial function in healthy

individuals. Am J Hypertens 18, 785-791.

49. Stein JH, Keevil JG, Wiebe DA, Aeschlimann S & Folts JD (1999) Purple grape

juice improves endothelial function and reduces the susceptibility of LDL

cholesterol to oxidation in patients with coronary artery disease. Circulation 100,

1050-1055.

50. Kurowska EM, Spence JD, Jordan J, Wetmore S, Freeman DJ, Piche LA &

Senatore P (2000) HDL-cholesterol-raising effect of orange juice in subjects with

hypercholesterolemia. Am J Clin Nutr 72, 1095-1100.

51. Freedman JE, Parker C, 3rd, Li L, Perlman J A, Frei B, Ivanov V, Deak LR, Iafrati

MD & Folts JD (2001) Select flavonoids and whole juice from purple grapes inhibit

platelet function and enhance nitric oxide release. Circulation 103, 2792-2798.

52. Keevil JG, Osman HE, Reed JD & Folts JD (2000) Grape juice, but not orange juice

or grapefruit juice, inhibits human platelet aggregation. J Nutr 130, 53-56.

53. O'Byrne DJ, Devaraj S, Grundy SM & Jialal I (2002) Comparison of the antioxidant

effects of Concord grape juice flavonoids alpha-tocopherol on markers of oxidative

stress in healthy adults. Am J Clin Nutr 76, 1367-1374.

165

Table 1. Exclusion and inclusion criteria of the study.

Inclusion criteria

• Men between 18 and 70 years of age

• Body mass index > 25 and < 35 kg/m2

• Waist circumference > 90 cm

• LDL cholesterol between 3.0-5.0 mmol/L

• No use of medication known to affect lipid

metabolism or possess antiinflammatory effect.

Exclusion criteria

• Alcohol consumption > 15 g of alcohol /day

• Chronic use of supplements (vitamins, minerals

or flavonoids)

• Chronic diseases: CHD, diabetes, etc.

• Dyslipidemia secondary to renal insufficiency,

hypothyroidism or others.

• Smoking ( 1 or more cigarette/day)

166

Table 2. Detailed description of the content of a portion (125 mL) of placebo juice (PJ) and low calorie cranbeny juice cocktail (CJC).

PJ CJC mean SD mean SD

Energy (kJ) 91.3 91.3 Carbohydrates (g) 5.46 0.08 5.46 0.28 Ascorbic acid (mg) 32 32 Total organic acids (g) 0.90 0.01 0.98 0.04 Total phenolics (mg) 39 0.09 100 6.50 Total anthocyanins (mg) n.d. n.d. 5.2 0.68

Cyanidin-3-galactoside n.d. n.d. 0.91 0.33 Cyanidin-3-glucoside n.d. n.d. 0.08 0.01 Cyanidin-3-arabinoside n.d. n.d. 1.3 0.26 Peonidin-3-galactoside n.d. n.d. 1.5 0.09 Peonidin-3-glucoside n.d. n.d. 0.24 0.01 Peonidin-3-arabinoside n.d. n.d. 1.2 0.09

Proanthocyanidins (mg) n.d. n.d. 74 5.21 Other ingredients included in PJ and CJC are filtered water, cranbeny juice concentrate (CJC only), fructose, pectin, sodium citrate, ascorbic acid, sucralose, and acesulfame-K. n.d.: none determined. Results based on 5 determinations for each beverages.

167

Table 3. Baseline physical and metabolic characteristics of the 30 men.

Variable Mean±SD 25th-75th

percentiles

Age (years) 51 ±10 46-60

Weight (kg) 85.0 ±11.8 78.1-89.2

BMI (kg/m2) 27.8 ± 3.2 25.7 - 28.8

Waist circumference (cm) 97.9 ±6.4 92.5 -100

Waist/hip ratio 0.95 ±0.04 0.92-0.99

Cholesterol (mmol/L) 5.97 ± 0.85 5.45-6.51

Triacylglycerols (mmol/L) 1.64 ±0.76 1.31-1.75

LDL-cholesterol (mmol/L) 4.06 ±0.70 3.64-4.58

HDL-cholesterol (mmol/L) 1.24 ±0.26 1.06-1.32

Cholesterol/HDL cholesterol 4.97 ±1.18 3.96 - 5.86

Apolipoprotein B (g/L) 1.19 ±0.23 1.05-1.29

Oxidized LDL (U/L) 61.3 ±20.7 45.7 - 70.2

sE-selectin (ng/mL) 43.1 ± 18.5 28.7 - 59.7

sIC AM-1 (ng/mL) 191.4 ±59.3 134.8 - 227.5

s VCAM-1 (ng/mL) 425 ± 61 385 - 480

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CJ

169

Figure Legends

Figure 1 : Changes in plasma oxidized LDL (OxLDL, p<0.0001 across doses) concentrations

during the intervention.

Data are presented as means ± SEM.

1 Different from baseline (0 mL CJC/day), p<0.05

Figure 2 : Changes in plasma soluble vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1, p<0.05

across doses), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, p=0.0001) and E-

selectin (p=0.66) concentrations during the intervention.

Data are presented as means ± SEM.

1 Different from baseline (0 mL CJC/day), p<0.05

2 Different from 8-wk (250 mL CJC/day), p<0.05

Figure 3 : Associations between changes in plasma OxLDL and soluble VCAM-1, ICAM-1

as well as E-selectin concentrations over the course of the entire intervention.

Figure 4 : Changes in plasma A) oxidized LDL, B) soluble intercellular adhesion molecule-1

(ICAM-1) and C) vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) concentrations in

response the intervention in men with or without the metabolic syndrome.

* : significantly different from week 0, p<0.05

Figure 1

170

70

60

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Oxidized LDL (U/L)

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LDL-cholesterol (mmol/L)

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0 125 250 500

Cranberry Juice Cocktail (mL/day)

171

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Cranberry Juice Cocktail (mL/day)

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172

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Changes in OxLDL (U/L)

173

Figure 4

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> 360 -

340

*

WkO Wk12 WkO Wk12

WkO Wk12 WkO Wk12 Without With

Metabolic Syndrome

174

Chapitre 11.

La supplementation en cocktail de jus de canneberges réduit les concentrations plasmatiques de MMP-9 chez

l'homme.

Guillaume Ruel, Sonia Pomerleau, Patrick Couture, Simone Lemieux, Benoît Lamarche, Charles Couillard

Article accepté pour publication dans la revue

Journal of the American College of Nutrition (2010)

175

Résumé

Introduction/Objectif: La métalloprotéinase des matrices 9 (MMP-9) ou gelatinase B est impliqué dans le développement de l'hypertension et de la vulnérabilité de la rupture de la plaque athérosclérotique, une étape importante dans l'étiologie de la maladie cardiovasculaire. Certaines études ont suggérées que la consommation d'aliments riches en flavonoïdes pourrait exercer un effet cardioprotecteur et qu'un impact sur les concentrations circulantes de MMP-9 pourrait expliquer, du moins partiellement, cet effet. Le but de la présente étude était de déterminer les effets de la consommation de plusieurs doses d'un cocktail de jus de canneberges faible en calorie sur les concentrations plasmatiques de MMP-9 chez l'homme avec obésité abdominale. Matériels et méthodes: Trente hommes (âge moyen ± écart-type; 51 ± 10 ans) ont consommés des doses croissantes de CJC au cours de 3 périodes successives de 4 semaines (125 mL/jour; 250 mL/jour et 500 mL/jour). Avant et après chacune des phases de l'étude, nous avons mesuré une série de variables métaboliques incluant MMP-9. Résultats: La consommation de CJC était associée à une diminution significative des concentrations plasmatiques de MMP-9 (-36 ± 9%, p<0.0005; 500mL/jour vs. basal) et les concentrations basales corrélaient avec les diminutions observées (r=-0.71, p<0.0001). Nous avons également montré que les réductions dans les concentrations plasmatiques de MMP-9 étaient associées aux variations observées dans les concentrations plasmatiques de nitrites/nitrates (NOx) durant l'intervention (r= -0.38, p<0.05; 500 mL/jour vs. basal). Des corrélations ont également été observées entre les variations des niveaux de MMP-9 et celles des tensions systoliques (r=0.39, p<0.05) et diastoliques (r=0.60, p<0.001) mesurées au cours de l'étude (500 mL/jour vs. basal)

Conclusions: Nos résultats montrent que la consommation journalière de CJC est associée à des diminutions dans les concentrations plasmatiques de MMP-9 chez l'homme avec obésité abdominale. Nous croyons que les composés phénoliques des canneberges pourraient être responsables de ces effets, ce qui supporte l'hypothèse selon laquelle la consommation d'aliments riches en flavonoïdes exerce des bienfaits cardiovasculaires.

176

Plasma Matrix Metalloproteinase (MMP)-9 Levels Are Reduced Following Low-Calorie Cranberry Juice Supplementation in Men

Guillaume Ruel, MSc, Sonia Pomerleau, RD, MSc, Patrick Couture, MD, PhD, Simone Lemieux, PhD, Benoît Lamarche, PhD, FAHA and Charles Couillard, PhD

Institute of Nutraceuticals and Functional Foods (G.R., S.P., S.L, B.L, CC) and Department of Food Sciences and Nutrition (S.L, B.L, CC) Laval University, Québec, Canada, Lipid Research Center (P.C.) Laval University Medical Research Center, CHUL Pavilion, Québec, Canada

Address correspondence to : Charles Couillard, PhD Associate Professor Institute of Nutraceuticals and Functional Foods Department of Food Sciences and Nutrition Laval University 2440 boulevard Hochelaga, Room 2742 Québec (Québec) Canada G1V0A6

Phone: (418) 656-2131 ext. 12855 Fax:(418)656-3423 E-mail: [email protected]

Short title: Cranberry juice and plasma MMP-9 in men


177

ABSTRACT

OBJECTIVE: Matrix metalloproteinase (MMP)-9 also known as gelatinase B is implicated in

the development of hypertension and atherosclerotic plaque vulnerability to rupture, an

important step in the etiology of cardiovascular diseases. Studies have suggested that

flavonoids consumption may be cardioprotective and a favourable impact on circulating

MMP-9 concentrations could partly explain this association. The aim of the present study was

to determine the effect of consuming increasing daily doses of low-calorie cranberry juice

cocktail (CJC) on plasma MMP-9 concentrations of abdominally obese men.

METHODS: 30 men (mean age: 51 + 10 years) consumed increasing doses of CJC during

three successive periods of 4 wk (125 mL/day, 250 mL/day and 500 mL/day). Before the

study and after each phase, we measured a series of physical and metabolic variables,

including MMP-9.

RESULTS: We found that CJC supplementation significantly decreased plasma MMP-9

concentrations (-36 ± 9%, p<0.0005; 500mL/day vs. baseline) while baseline plasma MMP-9

concentrations strongly correlated with the changes noted during the intervention (r=-0.71,

p<0.0001). We also show that the reduction in plasma MMP-9 levels was associated with a

change in plasma nitrites/nitrates (NOx) concentration over the entire intervention (r= -0.38,

p<0.05; 500 mL/day vs. baseline). Significant correlations were also noted between changes

in plasma MMP-9 levels and those of systolic (r=0.39, p<0.05) and diastolic (r=0.60,

p<0.001) blood pressure during the course of the study (500 mL/day vs. baseline).

CONCLUSIONS: Our results show that daily CJC consumption is associated with a decrease

in plasma MMP-9 concentrations in abdominally obese men. We hypothesize that

polyphenols compounds from cranberries may be responsible for this effect, supporting the

notion that the consumption of flavonoid-rich foods can exert cardioprotective effects.

178

INTRODUCTION

Endothelial dysfunction is a key step in the development of cardiovascular diseases (CVD)

(1), the leading cause of mortality in North America (2). Indeed, a large body of evidence

supports the role of endothelial vascular cells in the maintenance of homeostatic processes in

humans which include cell adhesion and migration, thrombosis, and fibrinolysis (3). For

instance, endothelial cells are known to express a large selection of adhesion molecules such

as the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), and vascular cell adhesion molecule-1

(VCAM-1) which are involved in the modulation of leukocyte recruitment and platelet

adhesion during thrombosis and inflammation (4). Furthermore, inflammation has been

shown to induce the expression of matrix metalloproteinase (MMP)-9, which is an

endopeptidase involved in the homeostasis of the extracellular matrix (ECM) and known to

play a role in the development of hypertension and atherosclerotic plaque instability (5, 6).

Nitric oxide (NO), a potent vasodilator, has been shown to inhibit MMP-9 increase following

inflammatory stimuli. (7-9). Accordingly, an inverse relationship has been recently reported

between plasma markers of MMP-9 and NO (10).

Improving diet quality is considered has an important and relevant way to help prevent and

treat CVD with a lot of emphasis being put on the shift from saturated (SFA) and trans fatty

acids towards mono (MUFA) and polyunsaturated fatty acid (PUFA) consumption (11).

Furthermore, epidemiological studies have indicated that a diet high in fruits and vegetables

intake is also associated with lower risk of CVD (12), an observation presumably resulting, at

least partly, from increased consumption of polyphenols compounds (e.g. flavonoids) which

possess potent antioxidant and antiinflammatory actions (13). To that effect, numerous studies

179

(14-17) have shown that polyphenols commonly found in fruits can inhibit MMP-9

expression in vitro and that proanthocyanidins (14) as well as the flavonol myricetin (16) are

among the most effective MMP-9 expression inhibitors. Interestingly, cranberries (Vaccinium

macrocarpon) are not only a good source of flavonols like quercetin and myricetin (18,19) but

are also made up of anthocyanidins, proanthocyanidins (20-22) as well as resveratrol (23) and

phenolic acids (21). The present study was therefore undertaken in order to investigate the

effects of consuming low-calorie cranberry juice cocktail (CJC) on a daily basis on plasma

MMP-9 concentrations in a group of healthy abdominally obese men. To our knowledge, this

is the first study to investigate the impact of a polyphenol-rich foods on plasma MMP-9 levels

in human.

180

METHODS

Study Subjects

Thirty-one healthy and sedentary men (mean age ± SD: 51 + 10 years) were recruited through

the media to participate in this 12-wk intervention. To be included in the study, subjects had

to have a waist circumference > 90 cm, a slightly elevated (between 3.8 and 5.0 mmol/L)

fasting plasma low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol concentration and to be free from

diabetes and CVD as well as renal, hepatic and endocrine disorders. Furthermore, they had to

be non-smokers and not be using medications known to affect blood pressure as well as lipid

or insulin metabolism. Subjects gave their written consent to participate in the study which

was approved by the Medical Ethics Committee of Laval University. One subject dropped out

of the study for personal reasons not related to the intervention.

Study design

As previously reported (24), upon their entry into the study, subjects were instructed by a

registered dietetitian to maintain their usual nutritional habits throughout the entire

intervention. Participants were subjected to a 4-wk Run-In period which consisted of

consuming 500 mL/day of a cranberry flavoured low-calorie placebo juice (PJ). A detailed

description of the PJ and CJC has been previously published (24). During the Run-in period,

participants were instructed to reduce and maintain their alcohol consumption to a maximum

of 1 drink/day (equivalent to 15 g of alcohol/day) and to restrict themselves from consuming

any vitamin, antioxidant or mineral supplements for the entire study. This Run-in period was

followed by three 4-wk periods during which subjects successively consumed 125 mL (Phase

1 ), 250 mL (Phase 2) and 500 mL (Phase 3) of CJC daily. These volumes were adjusted to a

total of 500 mL of liquid /day i.e. with 375 mL, 250 mL or 0 mL of PJ for phases 1, 2 and 3

181

respectively. This was achieved in order to minimize the impact of incorporating increasing

quantities of liquid in the daily diet of subjects and blind subjects from the treatment they

were assigned. All subjects had to complete the entire protocol in order to be kept for

statistical analyses.

Anthropometry & Blood pressure

At each visit to the research facility, body weight and height as well as waist and hip

circumferences were measured following standardized procedures (25) and the body mass

index (BMI) and waist-to-hip ratio were calculated. Blood pressure was also measured with a

sphygmomanometer by a nurse with the subject in a supine position after a 5 minute rest.

Plasma measurements

At each visit to the investigation unit, blood samples were obtained from the subject's

antecubital vein, in the morning after a 12-hr fast. Upon collection, cholesterol and

triglyceride (TG) concentrations were determined in plasma by enzymatic methods using a

Technicon RA-1000 analyzer (Bayer Corporation Inc, Tarrytown, NY, USA), as previously

described (26). Plasma very low-density lipoproteins (VLDL) (d<1.006 g/mL) were isolated

by ultracentrifugation and the HDL fraction was obtained after precipitation of LDL from the

infranatant (d>1.006 g/mL) with heparin and MnC12 (27). The cholesterol and TG contents of

the infranatant fraction were measured before and after the precipitation step. Apolipoprotein

(apo) AI and apoB plasma concentrations were measured by nephelometry (Dade Behring,

Mississauga, Ontario, Canada). The lyophilized serum standards for apo measurements were

prepared at the Lipid Research Center of Laval University Medical Center and calibrated with

reference standards obtained from the Centers for Disease Control (Atlanta, GA). MMP-9

182

levels were measured in plasma by ELISA using commercial kits (Amersham Biosciences,

Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). Plasma nitrites/nitrates (NOx) concentrations were

determined by colorimetry (Cayman Chemical Company, Ann Harbor, MI). Briefly, after

conversion of nitrates to nitrites in the subject's plasma sample, all nitrites present in the

sample were converted into a deep purple azo compound using Griess reagent. When this

reaction was completed, the concentration of the azo product was determined by

spectrophotometry (550 nm) and was proportional to the NOx present in the sample.

Statistical analysis

Data are presented as mean ± SD unless stated otherwise. Transformation of variables was

done when appropriate. The MIXED model procedure was used to test for the main treatment

effect and to identify statistical significances between different doses. Associations between

variables were quantified with Spearman correlation coefficients. In an effort to better

understand the impact of NOx and hypertension status on changes of plasma MMP-9 in

response to the intervention (500 mL vs. 0 mL CJC/day), subjects were separated into tertiles

according to baseline plasma NOx concentrations (33rd percentile= 38.6 ng/mL and 66th

percentile=56 ng/mL) as well as in normotensive (SBP<120 mmHg and DBP<80 mmHg) or

prehypertensive (SBP>120 mmHg or DBP>80 mmHg) status as measured both 4 weeks prior

to and at the beginning of the first phase. General Linear Model (GLM) procedures followed

by Duncan comparison tests were used to determine significant differences between

subgroups, while paired t test were used for within group differences. All analyses were

performed with the SAS statistical package (ver. 8.2, SAS Institute, Cary, NC) and a p value <

0.05 was considered significant.

183

RESULTS

Baseline subjects' physical characteristics and lipoprotein-lipid profile are shown in Table 1.

Table 2 shows that there was a significant decrease in plasma MMP-9 concentrations in

response to the intervention (p<0.0001). The decrease in MMP-9 was only significant after

the dose of 500mL/day (means + SEM: -36 ± 9%, p<0.0005). As already reported (28),

systolic blood pressure significantly varied during the course of the intervention (p<0.05) but

no significant change in diastolic blood pressure was noted. We also noted a significant

decrease in plasma NOx concentrations which was mostly accounted for by the reduction of

circulating NOx levels during the last phase of the intervention (median: -16.7% (25, 75th

percentiles: -31.5, 8.8% respectively) vs. 0 mL CJC/day, (p<0.05)).

Figure 1 illustrates the relationship between baseline plasma MMP-9 levels and changes in

circulating MMP-9 concentrations in response to the intervention (p<0.0001; 500 mL vs. 0

mL CJC/day). We also found significant associations between the changes in plasma MMP-9

levels and those in systolic (r=0.39, p<0.05) and diastolic (r=0.60, p<0.001) blood pressure.

Furthermore, we noted significant inverse correlations between changes in plasma MMP-9

concentrations and those in NOx levels (r= -0.38, p<0.05) as well as changes in apoAI levels

(r=-0.50, p<0.005) whereas no association were found with changes in HDL-cholesterol (r=-

0.26, p=0.16). We did not find any significant correlation between baseline values in plasma

LDL-cholesterol, total cholesterol, VLDL-cholesterol, triacylglycerol as well as OxLDL

levels and MMP-9 concentration (data not shown).

In an effort to further explore the relationship between plasma NOx and MMP-9, we

separated the group in tertiles according to baseline plasma NOx concentrations (Figure 2)

184

and compared absolute and relative changes in plasma NOx and MMP-9 levels following the

intervention (500 mL vs. 0 mL CJC/day) within and between groups (Table 3). Contrary to

men of the lowest tertile which showed a non-significant increase in plasma NOx (28.4 ±

51.3%, p=0.1139) those of the middle and highest tertiles of baseline NOx concentrations

displayed significant reductions in plasma NOx concentrations. Significant decreases in

plasma MMP-9 concentrations were observed in subjects of the lowest and middle tertiles of

baseline NOx levels but not in those from the highest tertile. Finally, there was no difference

in the changes in plasma MMP-9 levels between tertiles of baseline NOx.

Considering the link between hypertension and MMP-9, we looked at the changes in plasma

MMP-9 levels in response to the intervention (500 mL vs. 0 mL CJC/day) in men separated

on the basis of their baseline blood pressure. Figure 3 shows that there was no significant

difference in plasma MMP-9 concentrations measured at baseline between normo and

prehypertensive individuals. Furthermore, both groups of men showed significant and

comparable decrease in plasma MMP-9 levels during the course of the intervention (500 mL

vs. 0 mL CJC/day) but we noted a tendency (p=0.0646) for lower circulating MMP-9

concentrations in the prehypertensive group than in the normotensive group at the end of the

study.

185

DISCUSSION

Results from the present study show that consumption of low-calorie CJC on a daily basis for

a period of 12 consecutive weeks is associated with a 36% decrease in plasma MMP-9

concentrations. To our knowledge, we are the first to report such an effect in humans. Few

interventions have been reported to lower circulating MMP-9 levels. Among them, statin

therapy has been shown to induce a 24% reduction in plasma MMP-9 concentrations in

hyperlipidemic individuals (29). Furthermore, behavioral changes based on the combination

of diet and exercise has been showed to lower circulating MMP-9 levels (30), while diet alone

(AHA step 1) only tended to decrease plasma MMP-9 activity (29). Interestingly the decrease

observed in the present study was only significant after a dose of 500mL/day which suggest

that a threshold dose could be necessary to gain the benefits associated with CJC consumption

on plasma MMP-9 concentrations.

The reduction in plasma MMP-9 we noted in the present study is supported by several in vitro

studies (14-17). Extracts from various fruits (raspberries, blackberries, blueberries and

muscadine grapes) have been shown to inhibit MMP-2 and MMP-9 expression in vitro (14,

31) and proanthocyanidins (14) as well as the flavonol myricetin (16) have been identified to

have the most effective inhibitory activity. More recently, a high molecular weight fraction

from cranberry juice concentrate was shown to inhibit MMP-9 production by human

macrophages stimulated with lipopolysaccharide (LPS) (32). Previous work by the same

group reported that this high molecular weight fraction is rich (65.1%) in proanthocyanidins

(33). Furthermore, as shown in a previous paper published by our group (24),

proanthocyanidins are present in significant quantity in the low-calorie CJC used in the

present study. On the other hand, resveratrol has also been shown to reduce MMP-9

expression through inhibition of the nuclear factor kappa B (NF-KB) (34) as well as c-Jun

186

NH2-terminal protein kinase (JNK) and protein kinase C (PKC)-S (35) pathways.

Furthermore, the PKC/mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway has recently been

implicated in the MMP-9 reduction observed in vitro following treatment with lowbush

blueberries (36). Interestingly, cranberries are part of the same Vaccinium species as

blueberries and are known to share many polyphenols compounds (37).

MMP-9 is thought to play a role in the development of hypertension as well as atherosclerotic

plaque vulnerability (5, 6, 38, 39). In this regard, higher levels of circulating MMP-9 are

noted in healthy individuals with high-normal blood pressure compared to subjects with

normal blood pressure (5). In the present study, we did not find any difference in plasma

MMP-9 concentrations between normo and prehypertensive men at baseline. This apparent

contradiction could be explained, at least in part, by the fact that we tested a group of

abdominally obese men whereas lean individuals were tested in the previous study (5). We

also noted that our intervention led to significant decreases in plasma MMP-9 concentrations

in both normo and prehypertensive subjects.

Nitric oxide (NO) has been shown to be a potent regulator of MMP-9 activity and expression

(10, 40, 41). In the present study, we noted an inverse relationship between changes in

plasma NOx and MMP-9 concentrations which is somewhat supportive of the inhibitory

action of NO on MMP-9 expression (7-10, 42). Interestingly, NO has been suggested to exert

different physiological roles depending on its circulating concentration (43). Indeed, at high

concentration, mostly resulting from an increased in the activity of the inducible NO synthase

(iNOS), it will act as a prooxidant and lead to the development of oxidative stress.

However,when NO concentration is in the normal range, it can mostly be considered to be the

product of endothelial NO synthase (eNOS) activity which is implicated in vasodilation. In

187

this regard, Cranberry has been prevriously shown to induce nitric oxide dependent

vasodilation suggesting a beneficial impact of Cranberry on eNOS activity (44).

Results from subgroup analyses performed in the present study tend to support the beneficial

role of normal range NO production. Indeed, when men were divided on the basis of baseline

plasma NOx concentrations, a crude marker of NO production, we noted a significant

decrease in plasma MMP-9 levels in the 1st and 2nd tertile. On the other hand, even if men in

the highest tertile of baseline plasma NOx concentrations were those who displayed the most

important decrease in NOx during the intervention (500 mL vs. 0 mL CJC/day), their plasma

NOx levels remained significantly higher compared to the other men. Furthermore, men with

the highest plasma NOx levels at baseline did not show a significant change in circulating

MMP-9 concentrations. It could be hypothetized that an oxidative stress condition still

prevailed in men of the third tertile of baseline plasma NOx concentrations even after the

consumption of 500mL/day of CJC, as suggested by the high circulating NOx levels at

follow-up, that could contribute to maintain elevated plasma MMP-9 levels.

On the other hand, infusion of HDL has been reported to reduce MMP-9 expression in rabbits

comparable to statin therapy (45). We previously reported that the intervention presented in

this paper yielded a significant increase in plasma HDL-cholesterol concentrations after

250mL and 500 mL CJC/day (24). Although there was no significant correlation between the

decrease in plasma MMP-9 and the increase in HDL-cholesterol concentrations, we found a

significant inverse correlation with plasma ApoA-I levels. While we are not able to certify the

role of HDL/ApoA-I in the decrease of circulating MMP-9 concentrations with CJC

consumption, a possible contribution of HDL/ApoA-I to changes in plasma MMP-9 levels

cannot be overlooked.

188

One drawback of our study is that we are not able to clearly assess whether the favorable

changes reported herein were the result of increasing doses of CJC or duration of the

intervention. Furthermore, the absence of a placebo control group is also unfortunate and

surely imposes a limit to our study although a similar study design has been previously used

in numerous studies(24, 46-50).

In summary, we report a decrease in plasma MMP-9 concentrations following low-calorie

CJC consumption. Those findings reinforce the notion that cardiovascular health benefits can

be obtained from consuming flavonoid-rich foods like cranberries. It is our understanding that

phenolic compounds present in CJC are implicated, at least in part, in this favourable change

in plasma MMP-9 concentrations. Further studies need to be undertaken in order to elucidate

the exact physiological mechanisms through which such an effect occurs and to verify

whether such a change is of clinical relevance with regards to CVD prevention.

189

Acknowledgements

This study was supported by an unrestricted grant from the Canadian Cranberry Growers

Coalition. Charles Couillard, Simone Lemieux and Patrick Couture are research scholars from

the Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ). Benoît Lamarche holds a Canada

Research Chair in Nutrition and Cardiovascular Health. Charles Couillard is also supported

by the Chair in Nutrition and Cardiovascular Health of Laval University.

The authors would like to thank Marge Leahy Ph.D. and Robin Roderick M.Sc. from Ocean

Spray Cranberries Inc. for kindly assessing the composition of CJC and placebo as well as

supervising the packaging sessions at Laval University. We also acknowledge the

contributions of Danielle Aubin (R.N.) as well as Mélanie Martineau, Jocelyne Giasson,

Raoul Géra, Pascal Cliche and Bernard Béliveau (Food Transformation Laboratory, Laval

University). Finally, we would like to thank the subjects who participated in this study

without whom, no clinical research would be possible.

Abbreviations: MMP-9= matrix metalloproteinase-9, CJC=cranberry juice cocktail and

NOx=nitrates/nitrites

190

REFERENCES

1. Cooke, J. P.: The endothelium: a new target for therapy. Vascular Medicine 5:49-53,

2000.

2. American Heart Association: AHA:Heart disease and Stroke Statistic- 2005 Update,

p. 1-2005.

3. Michiels, C : Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology 196:430-443,

2003.

4. Springer, T. A.: Traffic Signals for Lymphocyte Recirculation and Leukocyte

Emigration - the Multistep Paradigm. Cell 76:301-314, 1-28-1994.

5. Papadopoulos, D. P., Makris, T. K, Krespi, P. G, Poulakou, M., Papazachou, O. G,

Hatzizacharias, A. N., Perrea, D., and Votteas, V.: Changes in métalloprotéinases in

healthy normotensive patients with high-normal blood pressure. European Cytokine

Network 16:211-214, 2005.

6. Pascarella, L., Penn, A., and Schmid-Schonbein, G W.: Venous hypertension and the

inflammatory cascade: Major manifestations and trigger mechanisms. Angiology

56:S3-S10,2005.

7. Upchurch, G. R., Ford, J. W., Weiss, S. J., Knipp, B. S., Peterson, D. A., Thompson,

R. W., Eagleton, M. J., Broady, A. J., Proctor, M. C , and Stanley, J. C : Nitric oxide

inhibition increases matrix metalloproteinase-9 expression by rat aortic smooth muscle

cells in vitro. Journal of Vascular Surgery 34:76-82, 2001.

8. Eagleton, M. J., Peterson, D. A., Sullivan, V. V., Roelofs, K. J., Ford, J. A., Stanley, J.

C , and Upchurch, G. R.: Nitric oxide inhibition increases aortic wall matrix

metalloproteinase-9 expression. Journal of Surgical Research 104:15-21, 5-1-2002.

191

9. Deleve, L. D., Wang, X. D., Kanel, G. C , Ito, Y., Bethea, N. W., McCuskey, M. K.,

Tokes, Z. A., Tsai, J., and McCuskey, R. S.: Decreased hepatic nitric oxide production

contributes to the development of rat sinusoidal obstruction syndrome. Hepatology

38:900-908, 2003.

10. Demacq, C , Metzger, I. F., Gerlach, R. F., and Tanus-Santos, J. E.: Inverse

relationship between markers of nitric oxide formation and plasma matrix

metalloproteinase-9 levels in healthy volunteers. Clinica Chimica Acta 394:72-76,

2008.

11. Hu, F. B., Stampfer, M. J., Manson, J. E., Rimm, E., Colditz, G. A., Rosner, B. A.,

Hennekens, C. H , and Willett, W. C: Dietary fat intake and the risk of coronary heart

disease in women. New England Journal of Medicine 337:1491-1499:11-20, 1997.

12. Bazzano LA, Liu S, and Serdula MK: Dietary intake of fruits and vegetables and risk

of cardiovascular disease. Current atherosclerosis reports 5:492-499, 2003.

13. Rahman, I., Biswas, S. K., and Kirkham, P. A.: Regulation of inflammation and redox

signaling by dietary polyphenols. Biochemical Pharmacology 72:1439-1452:11-30,

2006.

14. Matchett, M. D., MacKinnon, S. L., Sweeney, M. I., Gottschall-Pass, K. T., and Hurta,

R. A. R.: Blueberry flavonoids inhibit matrix metalloproteinase activity in DU 145

human prostate cancer cells. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie et Biologie

Cellulaire 83:637-643, 2005.

15. Dell'Agli, M., Canavesi, M., Galli, G , and Bellosta, S.: Dietary polyphenols and

regulation of gelatinase expression and activity. Thrombosis and Haemostasis 93:751-

760, 2005.

192

16. Sartor, L., Pezzato, E., Dell'ASa, I., Caniato, R., Biggin, S., and Garbisa, S.: Inhibition

of matrix-proteases by polyphenols: chemical insights for anti-inflammatory and anti-

invasion drug design. Biochemical Pharmacology 64:229-237:7-15,2002.

17. Ende C and Gebhardt R: Inhibition of matrix metalloproteinase-2 and -9 activities by

selected flavonoids. Planta medica 70:1006-1008, 2004.

18. Hakkinen, S. H , Karenlampi, S. O., Heinonen, I. M., Mykkanen, H. M., and Torronen,

A. R.: Content of the flavonols quercetin, myricetin, and kaempferol in 25 edible

berries. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47:2274-2279, 1999.

19. Vvedenskaya, I. O., Rosen, R. T., Guido, J. E., Russell, D. J., Mills, K. A., and Vorsa,

N.: Characterization of flavonols in cranberry (Vaccinium macrocarpon) powder.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 52:188-195:1-28, 2004.

20. Maatta-Riihinen, K. R., Kahkonen, M. P., Torronen, A. R., and Heinonen, I. M.:

Catechins and procyanidins in berries of Vaccinium species and their antioxidant

activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53:8485-8491:11-2, 2005.

21. Chen, H , Zuo, Y. G, and Deng, Y. W.: Separation and determination of flavonoids

and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid

chromatography. Journal of Chromatography A 913:387-395:4-13, 2001.

22. Wang, P. L., Du, C. T., and Francis, F. J.: Isolation and Characterization of

Polyphenols Compounds in Cranberries. Journal of Food Science 43:1402-1404,

1978.

23. Wang, Y., Catana, R, Yang, Y. N., Roderick, R., and van Breemen, R. B.: An LC-MS

method for analyzing total resveratrol in grape juice, cranberry juice, and in wine.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:431-435:1-30, 2002.

193

24. Ruel, G, Pomerleau, S., Couture, P., Lemieux, S., Lamarche, B., and Couillard, C:

Favourable impact of low-calorie cranberry juice consumption on plasma HDL-

cholesterol concentrations in men. British Journal of Nutrition 96:357-364, 2006.

25. Vanderkooy, K. and Seidell, J. C: Techniques for the Measurement of Visceral Fat -

A Practical Guide. International Journal of Obesity 17:187-196, 1993.

26. Moorjani, S., Dupont, A., Labrie, F., Lupien, P. J., Brun, D., Gagne, C, Giguere, M.,

and Bélanger, A.: Increase in Plasma High-Density-Lipoprotein Concentration

Following Complete Androgen Blockage in Men with Prostatic-Carcinoma.

Metabolism-Clinical and Experimental 36:244-250, 1987.

27. Burstein, M. and Samaille, J.: Sur Un Dosage Rapide du Cholesterol Lie Aux Alpha-

Lipoproteines et Aux Beta-Lipoproteines du Serum. Clinica Chimica Acta 5:609-609,

1960.

28. Ruel, G, Pomerleau, S., Couture, P., Lemieux, S., Lamarche, B., and Couillard, C:

Low-calorie cranberry juice supplementation reduces plasma oxidized LDL and cell

adhesion molecule concentrations in men. British Journal of Nutrition 99:352-359,

2008.

29. Koh, K. K, Son, J. W., Ahn, J. Y., Jin, D. K., Kim, H. S., Choi, Y. M., Kim, D. S.,

Jeong, E. M., Park, G. S., Choi, I. S., and Shin, E. K.: Comparative effects of diet and

statin on NO bioactivity and matrix métalloprotéinases in hypercholestérolémie

patients with coronary artery disease. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular

Biology 22:E19-E23, 2002.

30. Roberts, C. K, Won, D., Pruthi, S., Kurtovic, S., Sindhu, R. K., Vaziri, N. D., and

Barnard, R. J.: Effect of a short-term diet and exercise intervention on oxidative stress,

194

inflammation, MMP-9, and monocyte chemotactic activity in men with metabolic

syndrome factors. Journal of Applied Physiology 100:1657-1665, 2006.

31. Tate, P., God, J., Bibb, R., Lu, Q., and Larcom, L. L.: Inhibition of metalloproteinase

activity by fruit extracts. Cancer Letters 212:153-158:8-30, 2004.

32. Bodet, C , Chandad, F., and Grenier, D.: Inhibition of host extracellular matrix

destructive enzyme production and activity by a high-molecular-weight cranberry

fraction. Journal of Periodontal Research 42:159-168, 2007.

33. Bodet, C , Chandad, F., and Grenier, D.: Anti-inflammatory activity of a high-

molecular-weight cranberry fraction on macrophages stimulated by

lipopolysaccharides from periodontopathogens. Journal of Dental Research 85:235-

239, 2006.

34. Lee, B. and Moon, S. K.: Resveratrol inhibits TNF-alpha-induced proliferation and

matrix metalloproteinase expression in human vascular smooth muscle cells. Journal

of Nutrition 135:2767-2773, 2005.

35. Woo, J. H , Lim, J. H , Kim, Y. H , Suh, S. I., Min, D. S., Chang, J. S., Lee, Y. H.,

Park, J. W., and Kwon, T. K.: Resveratrol inhibits phorbol myristate acetate-induced

matrix metalloproteinase-9 expression by inhibiting JNK and PKC delta signal

transduction. Oncogene 23:1845-1853:3-11, 2004.

36. Matchett, M. D., MacKinnon, S. L., Sweeney, M. I., Gottschall-Pass, K. T., and Hurta,

R. A. R.: Inhibition of matrix metalloproteinase activity in DU145 human prostate

cancer cells by flavonoids from lowbush blueberry (Vaccinium angustifolium):

possible roles for protein kinase C and mitogen-activated protein-kinase-mediated

events. Journal of Nutritional Biochemistry 17:117-125, 2006.

195

37. Zheng, W. and Wang, S. Y.: Oxygen radical absorbing capacity of phenolics in

blueberries, cranberries, chokeberries, and lingonberries. Journal of Agricultural and

Food Chemistry 51:502-509:1-15, 2003.

38. Loftus, I. M., Naylor, A. R., Goodall, S., Crowther, M., Jones, L., Bell, P. R. F.,

Thompson, M. M., and Thompson, M.: Increased matrix metalloproteinase-9 activity

in unstable carotid plaques A potential role in acute plaque disruption. Stroke 31:40-

47, 2000.

39. Galis, Z. S., Sukhova, G. K., Lark, M. W., and Libby, P.: Increased Expression of

Matrix Métalloprotéinases and Matrix-Degrading Activity in Vulnerable Regions of

Human Atherosclerotic Plaques. Journal of Clinical Investigation 94:2493-2503, 1994.

40. Gurjar, M. V., Sharma, R. V., and Bhalla, R. C : eNOS gene transfer inhibits smooth

muscle cell migration and MMP-2 and MMP-9 activity, j^rteriosclerosis Thrombosis

and Vascular Biology 19:2871-2877, 1999.

41. Ridnour, L. A., Windhausen, A. N., Isenberg, J. S., Yeung, N., Thomas, D. D., Vitek,

M. P., Roberts, D. D., and Wink, D. A.: Nitric oxide regulates matrix

metalloproteinase-9 activity by guanylyl-cyclase-dependent and -independent

pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 104:16898-16903:10-23, 2007.

42. Knipp, B. S., Ailawadi, G, Ford, J. W., Peterson, D. A., Eagleton, M. J., Roelofs, K.

J., Hannawa, K. K, Deogracias, M. P., Ji, B., Logsdon, C, Graziano, K. D., Simeone,

D. M., Thompson, R. W., Henke, P. K., Stanley, J. C , and Upchurch, G. R.: Increased

MMP-9 expression and activity by aortic smooth muscle cells after nitric oxide

synthase inhibition is associated with increased nuclear Factor-kappa B and activator

protein-1 activity. Journal of Surgical Research 116:70-80, 2004.

196

43. Mariotto, S., Menegazzi, M., and Suzuki, H.: Biochemical aspects of nitric oxide.

Current Pharmaceutical Design 10:1627-1645, 2004.

44. Maher, M. A., Mataczynski, H, StephaniaK, H. M., and Wilson, T.: Cranberry juice

induces nitric oxide dependent vasodilation and transiently reduces blood pressure in

conscious and anaesthetized rats. Journal of Medecinal Foods 3:141-147, 2000.

45. Nicholls, S. J., Cutri, B., Worthley, S. G, Kee, P., Rye, K. A., Bao, S., and Barter, P.

J.: Impact of short-term administration of high-density lipoproteins and atorvastatin on

atherosclerosis in rabbits. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 25:2416-

2421,2005.

46. Kurowska, E. M., Spence, J. D., Jordan, J., Wetmore, S., Freeman, D. J., Piche, L. A.,

and Serratore, P.: HDL-cholesterol-raising effect of orange juice in subjects with

hypercholesterolemia. American Journal of Clinical Nutrition 72:1095-1100, 2000.

47. Freedman, J. E., Parker, C , Li, L. Q., Perlman, J. A., Frei, B., Ivanov, V., Deak, L. R.,

Iafrati, M. D., and Folts, J. D.: Select flavonoids and whole juice from purple grapes

inhibit platelet function and enhance nitric oxide release. Circulation 103:2792-2798:

6-12,2001.

48. Keevil, J. G, Osman, H. E., Reed, J. D., and Folts, J. D.: Grape juice, but not orange

juice or grapefruit juice, inhibits human platelet aggregation. Journal of Nutrition

130:53-56,2000.

49. O'Byrne, D. J., Devaraj, S., Grundy, S. M., and Jialal, I.: Comparison of the

antioxidant effects of Concord grape juice flavonoids and alpha-tocopherol on markers

of oxidative stress in healthy adults. American Journal of Clinical Nutrition 76:1367-

1374,2002.

197

50. Ruel, G, Pomerleau, S., Couture, P., Lamarche, B., and Couillard, C: Changes in

plasma antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after

short-term cranberry juice consumption. Metabolism-Clinical and Experimental

54:856-861,2005.

198

Table 1. Baseline characteristics of the 30 men.

Mean ± SEM Age (years) 51 ±1.9 Body weight (kg) 85.0 ± 2.2 BMI (kg/m2) 27.8 ± 0.6 Waist circumference (cm) 97.8 ± 1.2 Waist-to-hip ratio 0.95 ± 0.01 Cholesterol

Total (mmol/1) 5.97 ±0.16 LDL (mmol/1) 4.06 ±0.13 HDL (mmol/1) 1.24 ±0.05 Total/HDL 4.97 ±0.21

Triglycerides (mmol/1) 1.64 ±0.14

199

Table 2. Blood pressure, MMP-9 and NOx values of the 30 men during the intervention.

Daily CJC consumption

Variables OmL 125 mL 250 mL 500 mL P across

doses Systolic BP (mmHg) 110±2 114 ± 2 111+2 107 ±2Z 0.0311 Diastolic BP (mmHg) 73 ± 2 75 ±1 73 ± 2 71 ± 1 0.2881 Mean arterial BP (mm Hg) 85+2 88±2 86±2 83±12 0.0670 MMP-9 (ng/ml) 12.211.9 12.2 ±2.3 15.1 ±2.9 6.0 ± 0.81'2,3 <0001 NOx (pmol/1) 49.4 ± 4.4 41.2 ±2.6 42.2 ± 4.0 39.9 ±3.2' 0.0389

1.2, Datas are presented as means ± SEM; '' and = significantly different from 0 , 125 and 250 ml CJC/day respectively; BP= blood pressure; NOx= nitrites/nitrates.

200

Table 3. Changes between baseline and 500 mL CJC/day in blood pressure, MMP-9 and NOx in men separated on the basis of baseline plasma NOx levels.

Tertile of baseline NOx

lowest middle highest p across tertile

Systolic BP (mm Hg) -2.8 ± 3.4 -0.8 ± 4.0 -2.9 ± 3.2 0.8951 Diastolic BP (mm iHg) 0.4 ± 2.4 -3.6 ± 2.3 -1.8 ±4.4 0.6532 MMP-9 (ng/mL) -9.1 ±3.7* -6.3 ± 2.4* -3.5 ± 2.8 0.4305 MMP-9 (%) -45.3 ±11.3** -41.0 ±17.1* -22.9 ±16.3 0.5457 NOx (pmol/L) 5.6 ±4.7 -9.0 ± 2.6f -25.3 ± 7.2+ 0.0010 NOx (%) 28.4 ±16.2 -19.2±6.1* -31.3±8.5 f 0.0019

Datas are presented as means ± SEM; Significant change from baseline; *p< 0.05, p< 0.01, ** p< 0.005; BP= blood pressure; NOx= Nitrite/Nitrate.

201

Figure Headings

Figure 1. Correlation between baseline and change after the 500 mL/day doses in plasma matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) concentrations.

Figure 2. Comparison between tertiles of plasma NOx value at baseline on plasma NOx concentrations at week 0 and 12 as well as their change after the 500 mL/day doses. Datas are presented as means ± SEM. Means with the same letter within the same week of measurement are not statistically different.

Figure 3. Effect of baseline blood pressure status on plasma MMP-9 concentrations measured at baseline and after 500 mL CJC/day as well as their variation. Datas are presented as means ± SEM; Blood pressure status was define as normotensive (SBP<120 mmHg and DBP<80 mmHg) and prehypertensive status (SBP>120 mmHg or DBP>80 mmHg); * significant change from baseline, p<0.05.

202

FIGURE 1.

20 -i

-40

E 10 - • ^ ■ • ^

O) - • = S- 0 - k»L « » 09 ■

hang

M

MP

-10 -

° co -20 -

E - r = -0.71 M

-30 - p<0.0001

0 10 20 30 40

Baseline plasma MMP-9 (ng/mL)

203

O E

100 i

80 -

60 -

FIGURE 2.

Plasma NOx (WeekO) D Tertile 1 E l Tertile 2

I Tertile 3

ce E C/Ï ca

40 -

20 -

0

i

WeekO

I a,b es

Week 12

204

FIGURE 3

] Normotensive j Prehypertensive

WkO Wk12 Change

205

Chapitre 12.

Effets de la consommation de cocktail de jus de canneberges sur la rigidité artérielle chez l'homme

affichant un surpoids: Résultats d'une étude en chasse-croisé à double insu.

Guillaume Ruel, Annie Lapointe, Sonia Pomerleau, Patrick Couture, Simone Lemieux, Benoît Lamarche, Charles Couillard

Article présentement soumis pour publication à la revue

European Journal of Clinical Nutrition (2010)

206

Résumé

Introduction/Objectif: L'augmentation de la rigidité artérielle est une étape clef de

l'ahtérogénèse, la principale cause de maladie cardiovasculaire. Il a été suggéré que les

flavonoïdes pourraient exercer un effet cardioprotecteur en réduisant le stress oxydatif et la

rigidité artérielle. Le but de cette étude en chassé-croisé à double-insu est de déterminer les

effets de la consommation d'un cocktail de jus de canneberges faible en calorie (CJC) sur une

base journalière durant une période de 4 semaines sur la rigidité artérielle d'homme affichant

une obésité abdominale.

Matériels et méthodes: Trente-cinq hommes (âge moyen ± écart-type; 45 ± 10 ans) ont été

assignée aléatoirement à la consommation de 500 mL/jour de CJC ou de jus placebo (JP)

durant 4 semaines dans cette étude en chassé-croisé à double insu. Avant et après chacune des

phases de l'étude, la rigidité artérielle (Abc) a été mesurée au repos et suite à l'administration

de salbutamol puis de nitroglycérine par tonométrie d'aplanation.

Résultats: Aucune différence significative n'a été observée entre le CJC et le PJ sur la tension

sanguine, le pouls et la rigidité artérielle. En dépit de l'absence de différence significative

entre les traitements, la consommation de 500mL/jour de CJC a amené des diminutions

significatives de l'AIx au repos (-19 %, p<0.05).

Conclusions: En résumé, nous ne rapportons aucune différence significative entre les effets

du CJC et du PJ sur la rigidité artérielle chez l'homme avec obésité abdominal. Cependant, la

diminution significative des valeurs d'AIx observée après la consummation de CJC mérite

une investigation plus poussée.

207

Consumption of cranberry juice cocktail and arterial stiffness in overweight men: Results from a double-blind placebo-controlled crossover study


From the Institute of Nutraceuticals and Functional Foods, Laval University (G.R., S.P., P.C., S.L., B.L., CC), the Department of Food Science and Nutrition (S.L., B.L., CC.) and the Lipid Research Center Laval University Medical Research Center (P.C.), CHUL Pavilion, Québec, Canada.

Correspondence to : Charles Couillard, Ph.D. Associate Professor


Phone: (418)656-2131 ext. 12855 Fax:(418)656-3423 E-mail: [email protected]

Short title: Ruel et al - Cranberry juice and arterial stiffness in men


208

ABSTRACT

Background/Objectives: The stiffening of arteries is a key step in atherogenesis leading to

cardiovascular disease. It has been suggested that dietary flavonoids may be cardioprotective

through possible favorable effects on oxidative stress and arterial stiffness. The present

double-blind crossover study was therefore undertaken in order to examine the effect of

consuming low-calorie cranberry juice cocktail (CJC) on a daily basis for a period of 4 weeks

on arterial stiffness in abdominally obese men.

Subjects/Methods: Thirty-five men (mean ± SD; age: 45 ± 10 years) were randomly assigned

to drink 500 ml/day of CJC or placebo juice (PJ) for 4 weeks in a double-blind crossover

design. Before the study and after each phase, arterial stiffness (AIx) was measured by

applanation tonometry at rest as well as following salbutamol and nitroglycerin

administration.

Results: There was no statistically significant difference between the effects of CJC and PJ

on blood pressure, heart rate or arterial stiffness. Despite the lack of difference between the

CJC and PJ treatments, drinking 500 ml/day of CJC led to a significant decrease in resting

AIx value (-19 %, p<0.05).

Conclusions: In summary, we report a lack of statistical difference between the effects of

CJC and PJ on arterial stiffness in abdominally obese healthy men. However, the fact that a

significant decrease in AIx values was noted following CJC consumption deserves further

investigation.

209

Introduction

The stiffening of arteries is a key step in atherogenesis (1,2) leading to cardiovascular disease

(CVD) and in this sense reducing arterial stiffness could be of importance in CVD prevention.

On the other hand, adoption of healthy nutritional habits is now considered an important and

relevant way to help prevent and treat CVD (3) through improvements in circulating

lipoprotein-lipid (4) and inflammatory marker concentrations as well as in the vasodilatory

capacity of blood vessels (5). Whereas a lot of emphasis has been put over the years on the

reduction of dietary fat intake and shift from saturated (SFA) towards mono (MUFA) and

polyunsaturated (PUFA) fatty acid consumption (6), recent epidemiological observations

suggest that increasing fruits and vegetables consumption may be helpful in lowering CVD

risk (7, 8). The most frequently proposed explanation for the cardioprotective potential of

fruits and vegetables is their high content in polyphenols compounds like flavonoids (9).

Flavonoids are ubiquitous in plant foods and found in significant quantities in a large variety

of products like tea, grape juice, red wine and dark chocolate (10). Cranberries are also a

potent source of different flavonoids such as flavonols, anthocyanidins, proanthocyanidins

(11, 12) as well as resveratrol (13) and phenolic acids (11). Consumption of cranberries (or

their related products) could therefore be a relevant way to take advantage of the health

benefits associated with dietary polyphenols. Accordingly, consumption of flavonoid-rich

foods such as dark chocolate, red wine or tea has been shown to exert beneficial impact on

oxidative stress as well as acutely (14-16) and chronically (17) reduce arterial stiffness

although the physiological mechanisms by which flavonoids exert their cardioprotective

effects are not well described.

The present short-term double-blind crossover study was therefore undertaken in order to

examine the effect of consuming low-calorie cranberry juice cocktail (CJC) on a daily basis

for a period of 4 weeks on arterial stiffness measured by applanation tonometry in

abdominally obese men.

210

Methods Subjects

Thirty-five healthy and sedentary men were recruited through the media to participate in this

intervention. To be included in the study, subjects had to have a BMI > 25 kg/m2, waist

circumference > 90 cm, fasting plasma low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol

concentration between 3.2 and 5.0 mmol/1 and be free from diabetes and CVD as well as

renal, hepatic and endocrine disorders. Furthermore, they had to be nonsmokers and not be

using medications known to affect lipid, insulin metabolism or blood pressure. Subjects gave

their written consent to participate in the study which was approved by the Medical Ethics

Committee of Laval University.

Intervention

Upon their entry into the study, subjects were instructed by a dietician to maintain their usual

nutritional habits, limit their alcohol consumption to a maximum of 1 drink/day (equivalent to

15 g of alcohol/day) as well as restrain themselves from consuming any vitamin, antioxidant

or mineral supplements. Following a 4-wk Run-in period during which participants were

asked to drink 500 ml of water/day in order to get the subjects acquainted with the

introduction of 500 ml/day of liquid in to their usual diet, subjects were then randomly

assigned to drink 500 ml/day of low-calorie cranberry juice cocktail (CJC) or placebo juice

(PJ) for 4 weeks. This period was followed by a 4-wk washout period (500 ml of water/day)

and then CJC and PJ treatments were crossed for another 4-wk. All subjects had to complete

the entire protocol to be considered for the statistical analyses.

As previously reported (18), the PJ used in this study was developed by Ocean Spray

Cranberries Inc. (Lakeville-Middleboro, MA, USA) and had similar organoleptic properties

(taste, color and texture) as the low-calorie CJC but had no cranberries in its composition.

Detailed descriptions of the PJ and CJC juices are provided in Table 1. Furthermore, in an

effort to eliminate handling of the juice, PJ and CJC were packaged at Laval University in 125

ml ready-to-drink TetraBrik® boxes (Tetra-Pak, Richmond Hill, Ontario, Canada). The

packaging sessions were monitored by Ocean Spray to ensure adequate reconstitution and

quality of both the PJ and CJC. All CJC used in the present study was reconstituted from

211

concentrate from the same processed batch of cranberries, in order to avoid any variations in the composition of the juice throughout the intervention. Subjects had to drink four 125 ml boxes per day which were marked with a code indicating their content (PJ or CJC). This information was kept secret from the subjects and only revealed at the end of the study. Participants were instructed to drink two boxes of juice in the morning and two in the evening. Finally, in an effort to keep the subjects' sugar consumption to a minimum and limit possible detrimental health effects, we provided subjects with the no added sugar version of Ocean Spray's low calorie CJC sweetened with sucralose. The same sweetener was used in the PJ.

Anthropometry Body weight and height as well as waist and hip circumferences were measured following standardized procedures (19) upon each visit of the subjects to the investigation unit and the body mass index (BMI) and waist-to-hip ratio were calculated.

Plasma measurements Blood samples were obtained from the subjects' antecubital vein, in the morning after a 12-hr fast. Upon collection, cholesterol and triglyceride (TG) concentrations were determined in plasma by enzymatic methods using a Technicon RA-1000 analyzer (Bayer Corporation Inc, Tarrytown, NY), as previously described (20). Plasma very low-density lipoproteins (VLDL) (d<1.006 g/ml) were isolated by ultracentrifugation and the HDL fraction was obtained after precipitation of LDL from the infranatant (d> 1.006 g/ml) with heparin and MnC12 (21). The cholesterol and TG contents of the infranatant fraction were measured before and after the precipitation step. Apolipoproteins (apo) AI and B concentrations were measured by nephelometry (Dade Behring, Mississauga, Ontario). The lyophilized serum standards for apo measurements were prepared at the Lipid Research Center of Laval University Medical Center and calibrated with reference standards obtained from the Centers for Disease Control (Atlanta, GA). Plasma glucose concentration was determined with a glucose oxydase assay (Sigma, St-Louis, MO) as previously described (22) while insulin level was measured in plasma using a commercial double-antibody radio immunoassay (LINCO Research, St-Louis, MO) that shows little cross-reactivity (<0.02%) with pro-insulin. The Homeostasis Model

212

Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR) was calculated as a marker of insulin

resistance (23).

Blood pressure and arterial stiffness

Blood pressure was measured with a sphygmomanometer by a nurse with the subject in a

supine position after a 5 minute rest. Mean arterial pressure (MAP) was calculated as the sum

of diastolic blood pressure and one-third of the difference between systolic and diastolic blood

pressure as previously reported (24). Arterial stiffness (Augmentation Index, AIx) was

obtained by applanation tonometry using the SphygmoCor® System (AtCor Medical, Sydney,

Australia) as previously described (25, 26). Briefly, after a 30-minute resting period,

peripheral artery waveforms were recorded on the subjects' radial artery. The same technique

was used to assess arterial stiffness during endothelium-independent radial artery vasodilation

(EIV) by performing measurements at 3, 5, 10, 15, 20 and 30 minutes following sublingual

administration of 400 pg of nitroglycerin. Finally, waveforms were also recorded at 5, 10, 15

and 20 minutes after inhalation of 400 pg of salbutamol and considered as a measure of

arterial stiffness during endothelium-dependent vasodilation (EDV) induced by b-adrenergic

stimulation. Global endothelial function was calculated as the substraction of EIV with EDV

as previously described (27).

Nutritional habits assessment

Dietary vitamin C intake of the participant was assessed using data collected in a 91-item

validated food frequency questionnaire (FFQ) was administered by the dietitian at baseline.

The FFQ was structured to reflect food habits of the Québec population as previously reported

(28).


Data are presented as mean ± SD unless stated otherwise. The MIXED model procedure was

used to test the difference between PJ and CJC treatments as well as the difference within

each treatment group. Paired student t tests were used to test the statistical significance of

within group changes in AIx values in response to each treatment in age subgroup.

Associations between variables were quantified with Spearman correlation coefficients. All

213

analyses were performed with the SAS statistical package (ver. 8.2, SAS Institute, Cary, NC) and a p value < 0.05 was considered significant.

214

Results Baseline physical and metabolic characteristics of the subjects are presented in Table 2. As a

group, subjects were overweight and hyperinsulinemic (29) but plasma lipoprotein lipid levels

were within recommended guidelines (3). Figure 1 illustrates arterial stiffness measured by

applanation tonometry in the 35 participants prior to the intervention. As expected, the

administration of salbutamol significantly decreased arterial stiffness compared to resting

values by 12 ± 6% (p<0.0001) and nitroglycerin further decrease AIx values compared to

salbutamol (-2 ± 6% p<0.05) respectively. Univariate associations between resting AIx and

physical, metabolic as well as haemodynamic characteristics of the participants prior to the

intervention are shown in Table 3. We found that baseline resting AIx values were positively

associated with age, WHR and plasma apoAI levels whereas, height, body weight and heart

rate were inversely correlated to AIx values measured at rest as well as following salbutamol

and nitroglycerin administration. As shown in Figure 2, baseline resting AIx values were also

positively correlated with AIx measured after salbutamol and nitroglycerin administration.

There was no effect of the intervention on blood pressure or heart rate (Table 4). However,

despite the lack of difference between the CJC and PJ treatments (p=0.5428), we found that

within subjects consuming 500ml of CJC/day there was a significant decrease in resting AIx

value (p<0.05) while the change within the PJ group failed to reach statistical significance. On

the other hand, there was no effect of either treatments on arterial stiffness measured

following salbutamol and nitroglycerin administration (Table 4).

As indicated above, age was highly correlated to arterial stiffness. We therefore examined the

change in AIx in respect to CJC or PJ supplementation measured at rest as well as after

salbutamol and nitroglycerin in men divided on the basis of age. As illustrated in Figure 3, we

found that subjects over 50 years old appeared to benefit from CJC consumption as they

showed a significant 11% decrease in resting AIx (p<0.05) but this change failed to reach

significance compared to the variation noted in resting AIx following PJ treatment.

215

Discussion Dietary fruit and vegetable intake has been reported to be negatively associated to the risk of

cardiovascular disease (7, 8). The cardioprotective potential of fruits and vegetables is

explained, at least partly, by their high contents in polyphenols compounds (30) which not

only exert potent antioxidant activity (31) but are increasingly recognized to have an impact

on numerous metabolic pathways relevant to the cardiometabolic risk (10, 32). Among those

cardiovascular benefits, polyphenol-rich food consumption has been associated with

reductions in LDL-cholesterol (33), oxidized LDL (34-36), blood pressure (37), cell-adhesion

molecules (36) levels as well as an increase in HDL-cholesterol concentrations (18).

Results from the present 4-wk placebo-controlled double-blind cross-over trial indicate that

daily CJC consumption reduces resting arterial stiffness as measured by applanation

tonometry, although this variation fails to reach statistical significance compared to PJ.

Furthermore, there was no effect of CJC on arterial stiffness assessed following adrenergic

stimulation induced by the administration of salbutamol (endothelium-dependent

vasodilation) or after inhalation of the NO-donor nitroglycerin (endothelium-independent

vasodilation).

Consumption of flavonoid-rich foods has been shown to acutely decrease arterial stiffness in

healthy subjects and coronary artery disease patients (14, 15). This benefit was suggested to

be attributable to flavonoids present in these products. Furthermore, the consumption of 400

ml/day of polyphenol-rich dealcoholized red wine during 6 weeks has been reported to

decreased AIx stiffness by 9% in postmenauposal women (17).

The benefits of flavonoids on vascular cells are explained by different physiological

mechanisms. Arterial stiffness has been shown to decrease after angiotensin-converting

enzyme (ACE) inhibitor therapy (38). Consumption of flavonoid-rich foods such as wine, tea

or chocolate has also been shown to inhibit ACE activity in rodents (39). Interestingly, a

cranberry water-soluble phytochemical extract has also been associated to ACE activity

inhibition (40). Unfortunately, ACE activity was not assessed in the current study. Nitric

oxide (NO) is a molecule well known to be implicated in vasodilation and studies have

suggested a cause/effect relationship between endothelial NO production and arterial stiffness

216

(41, 42). On the other hand, it has been shown that cyanidin-3-glucoside treatment increases eNOS expression (43) and decreases iNOS expression (44). Such changes in the balance between eNOS and iNOS expression/abundance/activity would favour the bioavailability of vasoactive plasmatic concentration of NO and lead to vasodilation. In a previous study by our group, we reported a significant decrease in plasma nitrites and nitrates concentration, a surrogate markers of NO production, following CJC consumption in abdominaly obese men (18), an observation that we suggested to be linked to a reduction in oxidative stress and decrease in iNOS activity. In the present study, the plasma concentrations of NO were not available and the effect of CJC on circulating NO levels could not be investigated.

However we report herein that there was a lack of a statistically significant difference in arterial stiffness between CJC and PJ. In this regard, acute (45) and chronic (46-48) vitamin C supplementation has been shown to exert a beneficial impact on arterial stiffness, an observation that is supported by the negative correlation between change in dietary vitamin C intake and in AIx found in the present study (r=-0.42, p<0.05). Although showing different quantities of polyphenols compounds, the PJ and CJC used in the present study provided similar daily vitamin C quantities to the participants. Thus, a potential beneficial impact of vitamin C on arterial stiffness in the PJ group cannot be excluded and may have prevented the significance of changes in resting AIx between the different treatments. Furthermore, it is well known that chronic hyperuricemia is detrimental for the cardiometabolic risk profile (49, 50). However, recent observations also suggest that food-induced moderate elevation of uric acid can protect against arterial stiffness in healthy humans (51). Indeed, in the latter, consumption of fructose was shown to prevent the increase in hypoxia-induced arterial stiffness, an effect partially explained by an increase in plasma uric acid concentrations. Although not measured in the present study, a potential increase within physiological levels of uric acid in response to fructose consumption present in both the CJC and the PJ may also have contributed to the lack of statistically significant difference between both treatments on arterial stiffness. However, the fact that we observed a significant decrease in resting AIx only in CJC treated individuals could suggest that polyphenols present in CJC may have exerted some beneficial effect on arterial stiffness beyond those that could be attributable to the intake of vitamin C or fructose.

217

Furthermore, we found that resting arterial stiffness was strongly correlated with age, which is

concordant with previous observation (52). Results from this subanalysis suggest that older

subjects could be better responders to CJC treatment than younger subjects probably due to

the higher arterial stiffness at baseline in older individuals.

In summary, results of the present study indicate that the reduction in resting arterial stiffness

following daily consumption of 500 ml of CJC/day for 4 weeks fails to statistically differ

from the one noted after consumption of PJ. However, we believe that although not

statistically significant compared to PJ, the significant decrease in arterial stiffness in CJC

supplemented subjects warrants further investigation. Change in duration of study as well as

in the daily dose and composition of the are CJC also believed to potentiate the effects of CJC

on arterial stiffness and endothelial function. Further studies will also need to be performed in

order to investigate the availability of bioactive compounds following CJC consumption.

218

Acknowledgements This study was supported by the Canadian Institue of Health Research (CHR, MOP-64438).

Guillaume Ruel is the recipient of a studentship from the Fonds de la recherche en santé du

Québec (FRSQ). Charles Couillard and Patrick Couture are research scholars from the

FRSQ. Charles Couillard is also supported by the Chair in Nutrition, Lipidology and

Cardiovascular Disease of Laval University. Benoît Lamarche holds a Canada Research Chair

in Nutrition, Functional Foods and Cardiovascular Disease.

The authors would like to thank Marge Leahy Ph.D. and Robin Roderick M.Sc. from Ocean

Spray Cranberries Inc. for kindly assessing the composition of cranberry and placebo juices as

well as supervising the packaging sessions at Laval University. We also acknowledge the

contributions of Danielle Aubin as well as Mélanie Martineau, Jocelyne Giasson, Raoul Géra,

Pascal Cliche and Bernard Béliveau. Finally, we would like to thank the subjects who

participated in this study without whom, no clinical research would be possible.

219

References 1. McEniery CM, Cockcroft JR. Does arterial stiffness predict atherosclerotic coronary

events? Adv Cardiol 2007;44:160-72.

2. Stehouwer CD, Henry RM, Ferreira I. j\rterial stiffness in diabetes and the metabolic

syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia 2008;51:527-39.

3. NCEP-ATPffl. Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol

Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment of

High Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel III). Jama 2001 ;285:2486-

97.

4. Jenkins DJ, Kendall CW, Marchie A, et al. Effects of a dietary portfolio of cholesterol-

lowering foods vs lovastatin on serum lipids and C-reactive protein. Jama

2003;290:502-10.

5. Sacks FM, Svetkey LP, Vollmer WM, et al. Effects on blood pressure of reduced

dietary sodium and the Dietary Approaches to Stop Hypertension (DASH) diet.

DASH-Sodium Collaborative Research Group. N Engl J Med 2001;344:3-10.

6. Hu FB, Stampfer MJ, Manson JE, et al. Dietary fat intake and the risk of coronary

heart disease in women. N Engl J Med 1997;337:1491-9.

7. Yusuf S, Hawken S, Ounpuu S, et al. Effect of potentially modifiable risk factors

associated with myocardial infarction in 52 countries (the INTERHEART study):

case-control study. Lancet 2004;364:937-52.

8. Bazzano LA, Serdula MK, Liu S. Dietary intake of fruits and vegetables and risk of

cardiovascular disease. Curr Atheroscler Rep 2003;5:492-9.

9. Rahman I, Biswas SK, Kirkham PA. Regulation of inflammation and redox signaling

by dietary polyphenols. Biochem Pharmacol 2006;72:1439-52.

10. D'Archivio M, Filesi C, Di Benedetto R, Gargiulo R, Giovannini C, Masella R.

Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann 1st Super Sanita 2007;43:348-

61.

11. Chen H, Zuo Y, Deng Y. Separation and determination of flavonoids and other

phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography. J

Chromatogr A 2001 ;913:387-95.

12. Wang P, Du, C , and Francis, F. Isolation and characterization of polyphenols

compounds in cranberries. J. Food Science 1978;43:1402-1404.

220

13. Wang Y, Catana F, Yang Y, Roderick R, van Breemen RB. An LC-MS method for analyzing total resveratrol in grape juice, cranberry juice, and in wine. J Agric Food Chem 2002;50:431-5.

14. Karatzi KN, Papamichael CM, Karatzis EN, et al. Red wine acutely induces favorable effects on wave reflections and central pressures in coronary artery disease patients. Am J Hypertens 2005;18:1161-7.

15. Vlachopoulos C, Aznaouridis K, Alexopoulos N, Economou E, Andreadou I, Stefanadis C. Effect of dark chocolate on arterial function in healthy individuals. Am J Hypertens 2005;18:785-91.

16. Vlachopoulos C, Alexopoulos N, Dima I, Aznaouridis K, Andreadou I, Stefanadis C. Acute effect of black and green tea on aortic stiffness and wave reflections. J Am Coll Nutr 2006;25:216-23.

17. Naissides M, Pal S, Mamo JC, James AP, Dhaliwal S. The effect of chronic consumption of red wine polyphenols on vascular function in postmenopausal women. Eur J Clin Nutr 2006;60:740-5.

18. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lemieux S, Lamarche B, Couillard C. Favourable impact of low-calorie cranberry juice consumption on plasma HDL-cholesterol concentrations in men. Br J Nutr 2006;96:357-64.

19. van der Kooy K, Seidell JC. Techniques for the measurement of visceral fat: a practical guide. Int J Obes Relat Metab Disord 1993;17:187-96.

20. Moorjani S, Dupont A, Labrie F, et al. Increase in plasma high-density lipoprotein concentration following complete androgen blockage in men with prostatic carcinoma. Metabolism 1987;36:244-50.

21. Burstein M. [Determination of cholesterol in the alpha- and beta-lipoproteins of the serum by a method based on selective precipitation of beta-lipoproteins]. Pathol Biol (Paris) 1960;8:1247-9.

22. Raabo E, Terkildsen TC. On the enzymatic determination of blood glucose. Scand J Clin Lab Invest 1960;12:402-7.

23. Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 1985;28:412-9.

221

24. Sesso HD, Stampfer MJ, Rosner B, et al. Systolic and diastolic blood pressure, pulse

pressure, and mean arterial pressure as predictors of cardiovascular disease risk in

Men. Hypertension 2000;36:801-7.

25. Vlachopoulos C, Dima I, Aznaouridis K, et al. Acute systemic inflammation increases

arterial stiffness and decreases wave reflections in healthy individuals. Circulation

2005;112:2193-200.

26. O'Rourke MF, Staessen JA, Vlachopoulos C, Duprez D, Plante GE. Clinical

applications of arterial stiffness; definitions and reference values. Am J Hypertens

2002;15:426-44.

27. McEniery CM, Wallace S, Mackenzie IS, et al. Endothelial function is associated with

pulse pressure, pulse wave velocity, and augmentation index in healthy humans.

Hypertension 2006;48:602-8.

28. Goulet J, Nadeau G, Lapointe A, Lamarche B, Lemieux S. Validity and reproducibility

of an interviewer-administered food frequency questionnaire for healthy French-

Canadian men and women. Nutr J 2004;3:13.

29. Scarsella C, Aimeras N, Mauriege P, et al. Determination of reference values for

fasting insuline levels in a representative sample of the adult Québec population In:

Atherosclerosis, ed. XII th International Symposium on Atherosclerosis. Stockholm,

Sweden, 2000:101.

30. Bravo L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional

significance. Nutr Rev 1998;56:317-33.

31. Ghiselli A, Nardini M, Baldi A, Scaccini C. Antioxidant Activity of Different Phenolic

Fractions Separated from an Italian Red Wine. J Agric Food Chem 1998;46:361-367.

32. Curin Y, Andriantsitohaina R. Polyphenols as potential therapeutical agents against

cardiovascular diseases. Pharmacol Rep 2005;57 Suppl:97-107.

33. Cartron E, Fouret G, Carbonneau MA, et al. Red-wine beneficial long-term effect on

lipids but not on antioxidant characteristics in plasma in a study comparing three types

of wine—description of two O-methylated derivatives of gallic acid in humans. Free

Radie Res 2003;37:1021-35.

34. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lamarche B, Couillard C. Changes in plasma

antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after short-

term cranberry juice consumption. Metabolism 2005;54:856-61.

222

35. Aviram M, Fuhrman B. Polyphenols flavonoids inhibit macrophage-mediated oxidation of LDL and attenuate atherogenesis. Atherosclerosis 1998; 137 Suppl:S45-50.

36. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lemieux S, Lamarche B, Couillard C. Low-calorie cranberry juice supplementation reduces plasma oxidized LDL and cell adhesion molecule concentrations in men. Br J Nutr 2008;99:352-9.

37. Aviram M, Dornfeld L. Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure. Atherosclerosis 2001;158:195-8.

38. Mallareddy M, Parikh CR, Peixoto AJ. Effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors on arterial stiffness in hypertension: systematic review and meta-analysis. J Clin Hypertens (Greenwich) 2006;8:398-403.

39. Actis-Goretta L, Ottaviani JI, Fraga CG. Inhibition of angiotensin converting enzyme activity by flavanol-rich foods. J Agric Food Chem 2006;54:229-34.

40. Apostolidis E, Kwon YI, Shetty K. Potential of cranberry-based herbal synergies for diabetes and hypertension management. Asia Pac J Clin Nutr 2006;15:433-41.

41. Stewart AD, Millasseau SC, Kearney MT, Ritter JM, Chowienczyk PJ. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension 2003;42:915-8.

42. Rashid P, Weaver C, Leonardi-Bee J, Bath F, Fletcher S, Bath P. The effects of transdermal glyceryl trinitrate, a nitric oxide donor, on blood pressure, cerebral and cardiac hemodynamics, and plasma nitric oxide levels in acute stroke. J Stroke Cerebrovasc Dis 2003;12:143-51.

43. Xu JW, Ikeda K, Yamori Y. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by cyanidin-3-glucoside, a typical anthocyanin pigment. Hypertension 2004;44:217-22.

44. Wang Q, Xia M, Liu C, et al. Cyanidin-3-O-beta-glucoside inhibits iNOS and COX-2 expression by inducing liver X receptor alpha activation in THP-1 macrophages. Life Sci 2008;83:176-84.

45. Mullan BA, Ennis CN, Fee HJ, Young IS, McCance DR. Protective effects of ascorbic acid on arterial hemodynamics during acute hyperglycemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004;287:H 1262-8.

223

46. Wilkinson B , Megson IL, MacCallum H, Sogo N, Cockcroft JR, Webb DJ. Oral vitamin C reduces arterial stiffness and platelet aggregation in humans. J Cardiovasc Pharmacol 1999;34:690-3.

47. Plantinga Y, Ghiadoni L, Magagna A, et al. Supplementation with vitamins C and E improves arterial stiffness and endothelial function in essential hypertensive patients. Am J Hypertens 2007;20:392-7.

48. Mullan BA, Young IS, Fee H, McCance DR. Ascorbic acid reduces blood pressure and arterial stiffness in type 2 diabetes. Hypertension 2002;40:804-9.

49. Feig DI, Kang DH, Johnson RJ. Uric acid and cardiovascular risk. N Engl J Med 2008;359:1811-21.

50. Gagliardi AC, Miname MH, Santos RD. Uric acid: A marker of increased cardiovascular risk. Atherosclerosis 2009;202:11-7.

51. Vukovic J, Modun D, Budimir D, et al. Acute, food-induced moderate elevation of plasma uric acid protects against hyperoxia-induced oxidative stress and increase in arterial stiffness in healthy humans. Atherosclerosis 2009.

52. McEniery CM, Wilkinson D3, Avolio AP. Age, hypertension and arterial function. Clin Exp Pharmacol Physiol 2007;34:665-71.

224

Table 1 Detailed description of the content of a portion (125 ml) of placebo juice (PJ) and low calorie cranberry juice cocktail (CJC).

PJ CJC Mean SD Mean SD

Energy (kJ) 91.3 91.3 Carbohydrates (g) 5.46 0.08 5.46 0.28 Ascorbic acid (mg) 32 32 Total organic acids (g) 0.90 0.01 0.98 0.04 Total phenolics (mg) 39 0.09 100 6.50 Total anthocyanins (mg) n.d. n.d. 5.2 0.68

Cyanidin-3-galactoside n.d. n.d. 0.91 0.33 Cyanidin-3-glucoside n.d. n.d. 0.08 0.01 Cyanidin-3-arabinoside n.d. n.d. 1.3 0.26 Peonidin-3-galactoside n.d. n.d. 1.5 0.09 Peonidin-3-glucoside n.d. n.d. 0.24 0.01 Peonidin-3-arabinoside n.d. n.d. 1.2 0.09

Proanthocyanidins (mg) n.d. n.d. 74 5.21

Other ingredients included in PJ and CJC are filtered water, cranberry juice concentrate (CJC only), fructose, pectin,

sodium citrate, ascorbic acid, sucralose, and acesulfame-K. n.d.: none determined.

Results based on 5 determinations for each beverages

225

Table 2 Baseline physical and metabolic characteristics of the 35 men

Variable Means ± SD Age (years) 45 + 10 Height (m) 1.74 ±0.06 Body weight (kg) 86.1 ± 9.7 Body mass index (kg/m2) 28.3 ± 2.4 Waist circumference (cm) 98.5 ± 6.0 Hip circumference (cm) 102.9 ± 5.4 Waist-to-hip ratio 0.96 ± 0.04 Fasting glucose (mmol/1) 5.82 ± 0.45 Fasting insulin (pmol/1) 119 ± 65 HOMA-IR 5.2 ± 3.2 Total cholesterol (mmol/1) 5.33 ± 0.74 LDL cholesterol (mmol/1) 3.51 ± 0.62 HDL cholesterol (mmol/1) 1.19 ±0.31 Total/HDL cholesterol 4.75 ±1.31 Triglycerides (mmol/1) 1.54 ± 0.70 Apolipoprotein AI (g/1) 1.24 ± 0.19 Apolipoprotein B (g/1) 1.06 ± 0.18 Heart rate (beats/min) 66 ± 10 Systolic blood pressure (mm Hg) 117 ± 13 Diastolic blood pressure (mm Hg) 75 ± 8 Mean arterial pressure (mm Hg) 89 ± 9

226

Table 3 Correlations between baseline AIx value and physical, metabolic as well as hemodynamic variables prior to the beginning of the intervention of the 35 men

Baseline AIx Resting Salbutamol Nitroglycerin

Age 0.70§§ 0.67§§ 0.76§§ Height - 0.49§ - 0.36* - 0.43* Body weight - 0.34* -0.13 - 0.34* Body mass index -0.04 0.20 -0.06 Waist circumference 0.01 0.21 0.00 Hip circumference - 0.35* -0.15 -0.31 Waist-to-hip ratio 0.34* 0.35* 0.24 Fasting glucose) -0.10 -0.12 -0.25 Fasting insulin -0.20 -0.20 -0.41* HOMA-IR -0.20 -0.19 -0.41* Total cholesterol 0.20 0.21 0.11 LDL cholesterol 0.11 0.21 0.10 HDL cholesterol 0.29 0.27 0.30 Total/HDL cholesterol -0.19 -0.14 -0.23 Triglycerides -0.12 -0.22 -0.27 Apolipoprotein AI 0.42* 0.39* 0.39* Apolipoprotein B 0.08 0.11 0.01 Heart rate - 0.55§§ - 0.47§ - 0.48§ Systolic blood pressure -0.01 -0.05 -0.19 Diastolic blood pressure 0.12 0.04 0.02 Mean arterial pressure 0.03 -0.02 -0.12

p<0.05; §, p<0.005 and §§, p<0.0001.

227

Table 4 Changes in hemodynamic variables and AIx values in the 35 men

Treatments

Placebo CJC

Before After Before After P between treatments

Heart rate (beats/min) 69±10 68±10 66±8 67±9 0.1704 Systolic BP (mm Hg) 117±13 115±12 115±13 115±10 0.3967 Diastolic BP (mm Hg) 75±7 74±8 74±7 73±6 0.7535 MAP (mm Hg) 89±8 88±9 87±9 87±7 0.5333 Resting AIx (%) 18.7±9.1 17.4±9.5 19.8±9.7 17.8±10.9 * 0.5428 Salbutamol Aix (%) 3.8±11.7 3.4±10.1 4.2+11.6 4.4±10.7 0.7102 Nitroglycerin Aix (%) 5.3±7.3 4.3±7.3 6.4±8.4 5.8±8.7 0.7851 Global endothelial function 2.6±5.8 1.9±4.5 1.1 ±2.8 0.2±6.9 0.9272

p<0.05 vs. before treatment

228

Figure Headings

Figure 1 : Arterial stiffness (AIx) in the 35 men at baseline measured at rest as well as after salbutamol (SALB) and nitroglycerin (NTG) administration.

Means ± SEM. 1 significantly different from resting values (p<0.0001) 2 significantly different from salbutamol values (p<0.05)

Figure 2 : Associations between baseline measures of resting arterial stiffness (AIx) and those of the response to salbutamol and nitroglycerin administration.

Figure 3 : Changes in arterial stiffness (AIx) measured at rest as well as following the administration and nitroglycerin in abdominal obese men below (top panel) or above (bottom panel) the age of 50 years old after CJC (black bars) and PJ (white bars) consumption.

Means ± SEM. * significant decrease, p<0.05.

229

Figure 1

Rest SALB NTG

230

Figure 2

40-, Salbutamol •

# 30- r=0.73 .

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Resting Augmentation Index (%)

Associations between baseline measures of resting arterial stiffness (AIx) and those of the response to salbutamol and nitroglycerin administration.

231

Figure 3

3

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232

Chapitre 13.

La Quercetine mais pas la myricétine augmente l'efflux de cholestérol dans le macrophage humain THP-1.

Guillaume Ruel, Christophe Garenc, Jorge Barreto-Reyes, Charles Couillard

Article en préparation

233

Résumé Introduction/Objectif: Une faible concentration plasmatique de HDL-cholestérol (HDL-C) est un facteur de risque indépendant de maladies cardiovasculaires (MCV). Nous avons précédement montré que la consommation quotidienne de jus de canneberges (CJC) était associée à une augmentation des concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol. Par contre, les mécanismes régissants cette augmentation sont méconnus. L'objectif principal était d'étudier les effets de flavonoïdes retrouvés dans le CJC sur l'efflux de cholestérol de macrophages-THPl en culture. Matériels et méthodes: Les quantités d'ARNm des cassettes de liaison à l'ATP Al (ABCA1), Gl (ABCG1) et du récepteur d'épuration Bl (SR-BI) ont été mesurées par PCR en temps réel dans les macrophages humains THP-1 et suite à un traitement avec chacun des flavonoïdes suivant : quercetine dihydrates, quercétine-3-P-D-glucoside et myricétine. Les quantités relatives des protéines ABCG1, ABC Al et SRBI ont également été déterminées par Immunobuvardage de type Western. L'efflux de cholestérol dépendant de l'apolipoprotéine AI (apo AI) et du HDL a été mesuré dans les macrophages humains THP-1 traités aux flavonoïdes. Résultats: La myricétine n'a pas induit de variations significatives de l'expression des ARNm et des protéines de chacun des traitements. Pour leurs parts, les traitements avec la quercétine-3-P-D-glucoside et la quercetine aglycone ont induit des augmentations significatives des ARNm d'ABCGl et de SRBI. En dépit des augmentations d'ARN observées suite aux traitements avec les deux formes de quercetine, seule l'augmentation dans l'abondance protéique de SRBI suite au traitement avec la quercétine-3-P-D-glucoside s'est avéré significative. Lorsque comparées aux contrôles, des augmentations significatives de 2 à 3.5 fois étaient observées dans l'efflux de cholestérol pour tous les transporteurs. La seule exception est l'efflux HDL-dépendant de 12 heures traité à la quercétine-3-P-D-glucoside. Conclusions: Nos résultats suggèrent que la quercetine, mais pas la myricétine, exerce des effets bénéfiques sur l'efflux de cholestérol dans les macrophages humains THP-1 ce qui pourrait, du moins en partie, expliquer les bénéfices cardiovasculaires associés à la consommation d'aliments riches en flavonoïdes. Des études complémentaires devront être réalisées afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les augmentations de l'efflux de cholestérol observées dans le macrophage humain THP-1 suite aux traitements avec les deux formes de quercetine.

234

QUERCETIN BUT NOT MYRICETIN INCREASES CHOLESTEROL EFFLUX IN

HUMAN THP-1 MACROPHAGES

Guillaume Ruel, Christophe Garenc, Jorge Barreto-Reyes, Charles Couillard

From the Institute of Nutraceuticals and Functional Foods, Laval University (G.R., C C ) , the Department of Food Science and Nutrition (CC.) and the Research Center of the Centre hospitalier universitaire de Québec (CRCHUQ) (C.G., J B-R.), CHUL Pavilion, Québec, Canada.

Correspondence to : Charles Couillard, Ph.D. Associate Professor

Institute of Nutraceuticals and Functional Foods Department of Food Science and Nutrition Laval University 2440 boulevard Hochelaga, Room 2742 Québec (Québec) Canada G1V0A6

Phone: (418)656-2131 ext. 12855 Fax:(418)656-3423 E-mail: [email protected]

Short title: Ruel et al - Quercetin and cholesterol efflux


235

ABSTRACT

A low HDL-cholesterol (HDL-C) concentration is an independent risk factor for

cardiovascular disease (CVD). We have previously shown that low-calorie cranberry juice

cocktail (CJC) supplementation was associated with an increase in circulating HDL-

cholesterol levels. However, not much is known about the cellular mechanism responsible for

the HDL-raising effect of CJC supplementation. Research objective: Study the effect of

flavonoids commonly found in cranberries on cholesterol efflux in Human THP-1

macrophages. Materials and methods: ATP binding cassette Al (ABCA1) and Gl

(ABCG1) as well as scavenger receptor class B type 1 (SRBI) mRNA expression levels were

determined by real-time PCR in PMA-differentiated human THP-1 macrophages, and treated

with flavonoids (quercetin dihydrate, quercetin-3-P-D-glucoside and myricetin). Protein

abundance of ABCG1, ABCA1 and SRBI in cultured macrophages treated with flavonoids

was determined by Western blot. Apolipoprotein AI (apo AI) and HDL-dependent cholesterol

efflux was also measured in cultured macrophages following flavonoids treatment. Results:

While myricetin did not increase expression levels ABCA1, ABCG1 and SRBI, aglycone

quercetin significantly increased mRNA expressions at specific concentrations. For its part,

quercetin-3-p-D-glucoside increased ABCG1 and SRBI mRNA expressions levels.

Irrespective of the increase observed in mRNA following both quercetin treatments, only an

increase in the abundance of SRBI protein after quercetin-3-P-D-glucoside was observed.

When compared to control and vehicle, quercetin and quercetin 3-P-D-glucoside treatments

resulted in a 2 to 3.5 fold increase in cholesterol efflux with every cholesterol transporters for

both the 6 and 12 hours incubation periods. The only exception was the 12 hours efflux with

quercetin 3-P-D-glucoside which did not change significantly. Conclusion: These results

suggest that quercetin, but not myricetin, exert a beneficial impact on HDL-C mediated

cholesterol efflux in human macrophages which could, at least partly, explain the benefits

associated with the consumption of flavonoid-rich beverage such as CJC. Complementary

studies should be performed in order to better understand molecular and cellular mechanism

implicated to the increase in cholesterol efflux in human macrophages following both

quercetin treatments.

236

INTRODUCTION

A reduced high-density lipoprotein (HDL) cholesterol concentration is a well established independent risk factor for cardiovascular diseases (CVD) (1), one of the main causes of death in North America (2). While strategies to increase circulating HDL-cholesterol concentration has been the focus of numerous interventions, the recent failure of the CETP inhibitor Torcetrapid to reduce cardiovascular risk (3) despite a significant increase in circulating HDL-cholesterol levels shifted the strategies to focus toward the regulation and effectiveness of the reverse cholesterol transport pathway (4). In atherosclerosis, cholesteryl esters and oxysterols-laden macrophages accumulate in the arterial wall and mature into foam cells. HDL particles are central to the reverse cholesterol transport, a process that brings cholesteryl esters and oxystérols to the liver for excretion into bile acids.

It is well established that cholesterol efflux from macrophages can be mediated by pathways involving ATP binding cassettes Al (ABCA1) and Gl (ABCG1) as well as scavenger receptor class B type 1 (SRBI) (5). Accordingly, ABCA1 and ABCG1 knockout mice are characterized by decreased cholesterol efflux (6, 7). ABCA1 is implicated in lipid-free apoA-I cholesterol efflux while ABCG1 and SRBI regulate HDL-mediated cholesterol efflux as well as less specific efflux such as those resulting form interaction with LDL and albumin (5).

On the other hand, consumption of flavonoid-rich foods has been associated to a decrease in CVD risk (8) presumably resulting from a decrease in oxidative stress (9, 10) and inflammation (11, 12). In addition, an increase in circulating HDL-cholesterol concentrations could also contribute to the cardioprotective benefits related to dietary flavonoid consumption. Indeed, the consumption of foods such as grape juice (13), wine (14, 15), cocoa (16) and orange juice (17) has been shown to increase plasma HDL-cholesterol concentrations. Furthermore, we have recently reported a significant increase in plasma HDL-cholesterol levels following daily supplementation with low-calorie cranberry juice cocktail (CJC) in overweight men (18). However, physiological mechanisms underlying the HDL-raising effects of flavonoids are not well described. The present study was therefore

237

undertaken in order to investigate the effects of flavonoids commonly found in cranberries, such as quercetin and myricetin, on cholesterol efflux in cultured human macrophages.

238

MATERIALS AND METHODS

Cell culture

Human monocyte-like cells (THP-1) were grown in RPMI-1640 (Fisher, Pittsburg, PA) with

10% fetal bovine serum (FBS), 10 mM HEPES (Fisher, Pittsburgh, PA), 1 mM sodium

pyruvate, 100 U/ml penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) and 2.5 g/1 D-

glucose (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO). A total of IO6 THP-1 monocytes/well were seeded

on 24-well plates and differentiated into macrophages following a 24 hr incubation with 60

ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma-Aldrich, St-Louis, MO). Macrophages

were then treated either with 1 mM vehicle alone (DMSO; Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) or

500 nM of the LXRs specific agonist GW3965 (Alexis biochemicals, Farmingdale, NY).

Concentrations of 2, 20, 50 and 100 uM of myricetin (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO),

quercetin dihydrate (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) or quercetin-3-P-D-glucoside (Sigma-

Aldrich, St-Louis, MO) for 48 hours were taken for mRNA measurements while flavonoids

concentration of 100 pM was used for protein abundance and cholesterol efflux.

RNA quantification

From PMA-differentiated macrophages, total RNA was extracted using Trizol (Invitrogen,

Carlsbad, CA) and purified according to the manufacturer instructions. The mRNA was

reverse transcribed into cDNA using poly-dT primers and analyzed by real-time PCR using

the Rotor-Gene RG3000A (Corbett Research, Montreal, Canada) and FastStart SyBR Green

Master mix (Roche, Mississauga, Canada). Expression levels of ABCA1, ABCG1 and SRBI

were determined using following primers (forward/reverse): ABCA1, 5'-

AGCCACAAGGCAGGTCATG-3,/5,-CATCCGGACAAGGTCCATTT-3'; ABCG1, 5'-

CGTGGAAAATGCCAAGCTGT-37 S'-CCCGGATTTTGTACCTGAGGA-S'; and SRBI, 5'-

CTACCCACCCAACGAAGGCT-37 5'-TCGGCGTTGAGGAAGTGAG-3\ Data were

expressed relative to the house keeping gene Basal transcriptor factor 3 (BTF3) and DMSO

set to one.

239

Protein extraction and Western blotting detection Cells were harvested in lysis buffer (50 mM Hepes-PH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 20 mM P-glycerophosphate, 1 % NP-40 and a protease inhibitor cocktail (Sigma) on ice for 30 minutes. Total protein concentration was measured using the BCA protein assay (Pierce, Rockford, IL). A total of 100 pg of cell lysate was loaded onto a 7.5 % polyacrylamide gel. After electrophoresis, proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore, Billerica, MA) and pre-incubated with 5 % skim-milk phosphate-buffered saline-0.1 % Tween 20 to prevent unspecific binding. Primary anti-SRBI antibody (Abeam, Cambridge, UK) was used at a concentration of 1:1000 in 5 % bovine serum albumin in TBS-T; anti-ABCAl antibody (Abeam, Cambridge, UK) was used at a concentration of 1:500 in 5 % bovine serum albumin in TBS-T; while anti-ABCGl antibody (Abeam, Cambridge, UK) was used at a concentration of 1:500 in a 1 % gelatin/ 5 % skim milk TBS-T solution. An anti-a-tubulin antibody (Abeam, Cambridge, UK) at a concentration of 1:5000 in 5 % bovine serum albumin in TBS-T was used as the protein reference. Secondary anti-mouse antibodies (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) was used at a concentration of 1:5000 for a-tubulin and 1:1000 for ABCA1. Secondary anti-rabbit antibodies (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) were used for ABCG1 and SR-BI at a concentration of 1:10 000. Signal was revealed with the use of the Immobilon western detection system (Fisher Pittsburgh, PA) and revealed using ECL Hyperfilm (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). The results are presented as a mean of three independent experiments.

Cholesterol Efflux Cellular cholesterol pools were radiolabeled with medium containing both the corresponding treatment and 0.5 uCi/mL [3H]cholesterol (Perkin Elmer Life Science, Waltham, MA) during the last 24 hours of the incubation with the different treatments. Thereafter, cholesterol efflux was measured after 6 and 12 hours. Efflux medium was minimal essential medium (MEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) with 0.5 % fatty acid free bovine albumin (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) with or without 10 ug/mL of human apolipoprotein AI (apoAI) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) or 25 ug/mL of human HDL (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA). Medium was set apart for counting by liquid scintillation. Cells were lysed and lysates were used for radioactivity counts as well as for protein concentration

240

determination using BCA protein assay (Pierce, Rockford, IL). Efflux was expressed as the ratio of radioactivity measured in the medium divided by the sum of the radioactivity in the medium and cells. The results were adjusted for protein content and divided by the mean value of the control without transporter (HDL or apoAl; n = 2 for both incubation period).

Statistical analyses Data are presented as mean ± SD unless stated otherwise. The Wilcoxon signed rank test was used for all tests. All analyses were performed with the SAS statistical package (ver. 8.2, SAS Institute, Cary, NC) and a p value < 0.05 was considered as significant.

241

RESULTS

Genes expression levels

In an effort to establish the critical range of activity of the flavonoids tested, we measured

J \ B C A 1 , SRBI and ABCG1 gene expression levels following flavonoids stimulation at

different doses (figure 1). As expected (19), the LXRs agonist GW3965 triggered an increase

in ABCA1 (5.6 fold), ABCG1 (26.3 fold) and SRBI (2.7 fold) expression levels. Regardless

of the doses, the flavonoid myricetin had no effect on mRNA expression levels of genes

taken. On the other hand, aglycone quercetin treatment caused significant increases in SRBI

(20 uM and 100 uM), ABCG1 (20 uM and 50 \iM) and ABCA1 (100 pM) gene expression

levels. Quercetin 3-p-D-glucoside treatment increased the gene expression levels of ABCG1

(100 uM) and SRBI (50 uM and 100 pM). According to these results, we chose the 100 uM

doses for the rest of the study.

Protein expression

Figure 2 shows the protein abundance in cultured macrophages following treatment with the

flavonoids myricetin, quercetin and quercetin 3-P-D-glucoside. Among the flavonoids, only

quercetin 3-p-D-glucoside exhibited a significant effect on protein abundance of SRBI (13

fold). Furthermore, treatment with the LXR agonist GW3965 increased the protein abundance

for ABCA1 and SRBI but not ABCG1 despite the 25 fold increase in gene expression level

observed.

Cholesterol efflux

Treating cultured macrophages wih the LXR-agonist GW3965 resulted in significant

increases in cholesterol efflux following an incubation with HDL for 6 hours or with BSA or

ApoAl for 12 hours. When compared to control, quercetin and quercetin 3-P-D-glucoside

treatments resulted in 2 to 3.5 fold increases in cholesterol efflux for every incubation period

and cholesterol acceptor tested (figure 3), with the exception of efflux following the quercetin

3-p-D-glucoside treatments and the 12 hours efflux with the HDL transporter.

242

Discussion

The main finding of the present study is a beneficial impact of both the aglycone and the

glucoside forms of quercetin on cholesterol efflux in cultured human THP-1 PMA-

differentiated macrophages. To our knowledge, this is the first study reporting a beneficial

impact of quercetin on cholesterol efflux in human THP-1 macrophages. However, myricetin

had no significant impact on cholesterol efflux in the same condition. In line with our results,

other individual flavonoids such as cyanidin-3-O-P-glucoside and peonidin-3-O-P-glucoside

have also been previously shown to increase cholesterol efflux in cultured macrophages (20).

The methanolic extract of argania pericarp as well as an extra virgin olive oil enriched with

green tea polyphenols has been shown to increase cholesterol efflux in J774 cultured

macrophages (21, 22) and the authors suggested that polyphenols compounds could be

responsible for this effect. The increase observed with argania was independent from ABCA1

pathways and the authors suggested an SRBI implication (21).

The increase in cholesterol efflux following quercetin exposition irrespective of its

glucosylation was noted with each cholesterol acceptor which suggests that different proteins

may actually mediate the efflux. However, SRBI is known to interact with numerous

molecules and to be implicated in a bidirectionnal cholesterol exchange (5). In the present

study, important increases in SRBI mRNA expression level and protein abundance were

noted following the treatment of macrophages with quercetin 3-P-D-glucoside whereas only

mRNA levels were increased after the treatment with aglycone quercetin. The fact that SRBI

has been shown to interact whit all cholesterol acceptors tested in the present study (4, 23), is

also compatible with its contribution to increased cholesterol efflux in macrophages treated

with aglycone and glucosylated quercetin.

Furthermore, a 2 to 2.5 fold non-significant increase in ABCA1 protein abondance was noted

following treatment with both forms of quercetin which is in line with the significant 4 fold

and not significant 3 fold increase in ABCA1 mRNA expression levels observed following

treatment with algycone and glucosylated quercetin, respectively. In support of this

observation, both cyanidin-3-O-P-glucoside and peonidin-3-O-P-glucoside, two flavonoids

243

structurally similar to quercetin has been shown to activate LXR, to increase ABCA1 expression and to favor apoAI-binding in macrophages (20). Neverthless, the specificity of ABCA1-dependent cholesterol transport with delipidated ApoAI exclude a possible contribution to BSA and HDL mediated choelesterol efflux.

Cellular redistribution in ABCG1 to the plasma membrane is known to increase cholesterol efflux to HDL (24). Considering the lack of specifity of cholesterol acceptor for ABCG1 (24), it could be implicated in the increase in cholesterol efflux observed in the different culture conditions of the present study. However, although in ABCG1 mRNA expression was markedly increased in macrophages following quercetin 3-p-D-glucoside exposition, no important change was noted in ABCG1 protein abundance. Although unlikely, the contribution of ABCG1 in our observations cannot be excluded.

The quercetin 3-P-D-glucoside can be found in plasma in concentrations ranging from 10 to 21 ng/mL (25) which are smaller than the concentrations used. On the other hand, following supplementation, of quercetin has been shown to be present in concentration up to 529 nmol/L if the glucuronidated and sulfatated metoblites were included (26). Kawai et al. (27) has demonstrate that the glucuronidated form of quercetin accumulate preferentially in activated macrophages in human atheroscelortic aorta. These results along with those reported herein are suggestive of a HDL-raising potential of quercetin and potential cardioprotective action of flavonoids (18, 28).

In summary, we reported an increase in cholesterol efflux in human THP-1 PMA-differentiated macrophages treated with either aglycone or the 3-P-D-glucoside form of quercetin. Our results put into light a mechanism by which quercetin could contribute to increase plasma HDL-cholesterol concentration in vivo and thus reinforce the notion that health benefits can be retrieved from consuming flavonoids-rich foods.

244

REFERENCES

1. Brewer HB, Jr. Focus on high-density lipoproteins in reducing cardiovascular risk. Am

Heart J 2004; 148:S 14-8.

2. AHA. Heart disease and Stroke Statistic- 2005 Update. Dallas, Texas: American Heart

Association, 2005:1.

3. Barter PJ, Caulfield M, Eriksson M, et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk

for coronary events. N Engl J Med 2007;357:2109-22.

4. Garenc C, Julien P, Levy E. Oxystérols in biological systems: the gastrointestinal tract,

liver, vascular wall and central nervous system. Free Radie Res;44:47-73.

5. Rothblat GH, de la Llera-Moya M, Favari E, Yancey PG, Kellner-Weibel G. Cellular

cholesterol flux studies: methodological considerations. Atherosclerosis 2002;163:1-8.

6. Yvan-Charvet L, Ranalletta M, Wang N, et al. Combined deficiency of ABCA1 and

ABCG1 promotes foam cell accumulation and accelerates atherosclerosis in mice. J

Clin Invest 2007; 117:3900-8.

7. Out R, Jessup W, Le Goff W, et al. Coexistence of foam cells and

hypocholesterolemia in mice lacking the ABC transporters Al and Gl. Circ Res

2008;102:113-20.

8. Hertog MG, Feskens EJ, Hollman PC, Katan MB, Kromhout D. Dietary antioxidant

flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen Elderly Study. Lancet

1993;342:1007-11.

9. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lamarche B, Couillard C. Changes in plasma

antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after short-

term cranberry juice consumption. Metabolism 2005;54:856-61.

10. Whitehead TP, Robinson D, Allaway S, Syms J, Hale A. Effect of red wine ingestion

on the antioxidant capacity of serum. Clin Chem 1995;41:32-5.

11. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lemieux S, Lamarche B, Couillard C Low-calorie

cranberry juice supplementation reduces plasma oxidized LDL and cell adhesion

molecule concentrations in men. Br J Nutr 2008;99:352-9.

12. Rahman I, Biswas SK, Kirkham PA. Regulation of inflammation and redox signaling

by dietary polyphenols. Biochem Pharmacol 2006;72:1439-52.

245

13. Albers AR, Varghese S, Vitseva O, Vita JA, Freedman JE. The antiinflammatory effects of purple grape juice consumption in subjects with stable coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vase Biol 2004;24:e 179-80.

14. Senault C, Betoulle D, Luc G, Hauw P, Rigaud D, Fumeron F. Beneficial effects of a moderate consumption of red wine on cellular cholesterol efflux in young men. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2000;10:63-9.

15. Naissides M, Pal S, James AP, Mamo JC. The effect of red wine polyphenols on cardiovascular disease risk in postmenopausal women. Asia Pac J Clin Nutr 2004;13:S71.

16. Mursu J, Voutilainen S, Nurmi T, et al. Dark chocolate consumption increases HDL cholesterol concentration and chocolate fatty acids may inhibit lipid peroxidation in healthy humans. Free Radie Biol Med 2004;37:1351-9.

17. Kurowska EM, Spence JD, Jordan J, et al. HDL-cholesterol-raising effect of orange juice in subjects with hypercholesterolemia. Am J Clin Nutr 2000;72:1095-100.

18. Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lemieux S, Lamarche B, Couillard C. Favourable impact of low-calorie cranberry juice consumption on plasma HDL-cholesterol concentrations in men. Br J Nutr 2006;96:357-64.

19. Naik SU, Wang X, Da Silva JS, et al. Pharmacological activation of liver X receptors promotes reverse cholesterol transport in vivo. Circulation 2006; 113:90-7.

20. Xia M, Hou M, Zhu H, et al. Anthocyanins induce cholesterol efflux from mouse peritoneal macrophages: the role of the peroxisome proliferator-activated receptor {gamma}-liver X receptor {alpha}-ABCA 1 pathway. J Biol Chem 2005;280:36792-801.

21. Berrougui H, Cherki M, Koumbadinga GA, et al. Antiatherogenic activity of extracts of Argania spinosa L. pericarp: beneficial effects on lipid peroxidation and cholesterol homeostasis. Can J Physiol Pharmacol 2007;85:918-27.

22. Rosenblat M, Volkova N, Coleman R, Almagor Y, Aviram M. Antiatherogenicity of extra virgin olive oil and its enrichment with green tea polyphenols in the atherosclerotic apolipoprotein-E-deficient mice: enhanced macrophage cholesterol efflux. J Nutr Biochem 2008;19:514-23.

246

23. Ohgami N, Nagai R, Miyazaki A, et al. Scavenger receptor class B type I-mediated

reverse cholesterol transport is inhibited by advanced glycation end products. J Biol

Chem 2001;276:13348-55.

24. Wang N, Ranalletta M, Matsuura F, Peng F, Tall AR. LXR-induced redistribution of

ABCG1 to plasma membrane in macrophages enhances cholesterol mass efflux to

HDL. Arterioscler Thromb Vase Biol 2006;26:1310-6.

25. Oliveira EJ, Watson DG, Grant MH. Metabolism of quercetin and kaempferol by rat

hépatocytes and the identification of flavonoid glycosides in human plasma.

Xenobiotica 2002;32:279-87.

26. Egert S, Wolffram S, Bosy-Westphal A, et al. Daily quercetin supplementation dose-

dependently increases plasma quercetin concentrations in healthy humans. J Nutr

2008;138:1615-21.

27. Kawai Y, Nishikawa T, Shiba Y, et al. Macrophage as a Target of Quercetin

Glucuronides in Human Atherosclerotic Arteries: implication in the anthi-

atherosclerotic mechanism of dietary flavonoids. J Biol Chem 2008;283:9424-34.

28. Ruel G, Couillard C Evidences of the cardioprotective potential of fruits: the case of

cranberries. Mol Nutr Food Res 2007;51:692-701.

247

Figure 1: THP-1 PMA-differentiated macrophages have been incubated in absence or presence of vehicle alone (DMSO; 1/10,000), myricetin (2, 20, 50 and 100 mM), quercetin (2, 20, 50 and 100 mM) and quercetine 3-p-D-glucoside (2, 20, 50 and 100 mM) or a LXRs specific agonist (GW3965) for 24 hours. Following RNA extraction and cDNA transcription RT-PCR was done on ABCA1, ABCG1 and SRBI. BTF3 was used as housekeepin gene. The results are from three separate experiments.

Figure 2: THP-1 PMA-differentiated macrophages have been incubated in absence or presence of vehicle alone (DMSO; 1/10,000), myricetin (100 mM), quercetin (100 mM) and quercetine 3-P-D-glucoside (100 mM), a LXRs specific agonist (GW3965) or vehicle alone for 24 hours. One hundred pg of protein was loaded on a 8% polyacrylamide gel, transferred to a nitrocellulose membrane, and immunobloted for ABCA1, ABCG1 and SRBI. The a-tubuline was used as a control. The blot shown is representative of three separate experiments.

Figure 3: THP-1 PMA-differentiated macrophages have been incubated in absence or presence of vehicle alone (DMSO; 1/10,000), myricetin (100 mM), quercetin (100 mM) and quercetine 3-P-D-glucoside (100 mM) or a LXRs specific agonist as cholesterol efflux control (GW3965) for 48 hours. Then cells were labelled with 1,2-bHSholesterol for 24 hours and incubated in absence or presence of human apo-AI or HDL for 6 (upper pannel) or 12 hours ( lower pannel). Finally, radioactivity levels were measured in cells and media by liquid scintillation and cholesterol efflux calculated as relative to control. Significantly different from the Control (1), DMSO (2) inside the same cholesterol acceptor.

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Conclusions

La maladie cardiovasculaire est la seconde cause de mortalité au Canada. C'est une maladie

complexe, lente et progressive qui implique généralement le développement de plaques

athérosclérose. Un désordre lipidique est la cause principale de l'athérosclérose. Une

augmentation du stress oxydatif entraînera des modifications des LDL qui deviendront

proathérogènes. Ces LDL oxydées activeront des voies de signalisation impliquant entre

autres les molécules d'adhésion qui contribueront au recrutement des monocytes dans

l'intima. Les monocytes deviendront ensuite des cellules spumeuses et suite à une captation

importante de lipides provenant entre autre des LDL oxydées. L'accumulation de ces

cellules spumeuses provoquera la formation d'une chape fibreuse. Les MMP seront

généralement impliquées dans la fragilisation et la rupture de cette chape, ce qui entraînera,

l'obstruction des artères et un événement cardiovasculaire. Cette chape fibreuse est plus

rigide que le vaisseau normal ce qui réduit sa vasodilatation, un phénomène qui peut parfois

amener de l'hypertension, mais aussi une surcharge du ventricule gauche.

La connaissance des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de cette maladie nous offre

des opportunités préventive et thérapeutique intéressantes. À cet égard, la nutrition nous

offre plusieurs outils de prévention privilégiés. Par exemple, les antioxydants présents dans

les fruits et légumes ont plusieurs caractéristiques physico-chimiques qui en font des outils

intéressants dans la lutte au stress oxydatif qui est à la source des MCV. Plusieurs

mécanismes d'action potentiels des fruits et légumes ont été mis de l'avant par des études

in vitro. Cependant, le besoin d'élucider les mécanismes par lesquels les fruits et légumes

pourraient exercer leurs bienfaits cardiovasculaires in vivo est présent. Nous nous sommes

proposé de vérifier les effets d'un jus de fruits naturellement riches en polyphenols, le CJC,

sur différents marqueurs cardiométaboliques clés de cette pathologie.

252

Retour sur les résultats

Au chapitre 9, nous avons déterminé les effets de la consommation journalière de 7mL/kg

de poids de CJC pour une durée de deux semaines sur les concentrations plasmatiques de

LDL oxydées et la capacité antioxydante. Une diminution des concentrations plasmatiques

de LDL oxydées a été observée. Cependant, cette diminution n'était pas associée à une

réduction de la concentration totale de LDL. De plus, aucune variation dans les LDL petites

et denses, qui ont une propension élevée à l'oxydation, n'a été observée. Nous rapportons

également une augmentation de la capacité antioxydante plasmatique qui ne corrélait

cependant pas avec les variations des LDL oxydées. Nos résultats concordent donc avec les

observations in vitro rapportant une augmentation de la période de latence préoxydative des

LDL exposées à des générateurs de radicaux libres (459,460).

Au chapitre 10, nous avons analysé l'impact de la consommation journalière de doses

croissantes (125, 250 et 500 mL/jour) de CJC au cours de trois phases successives de 4

semaines sur les concentrations plasmatiques de LDL oxydée, ICAM-1, VCAM-1 et E-

sélectine. Tout d'abord, les diminutions des LDL oxydées observées dans cette étude ont

permis de valider les résultats présentés dans le chapitre 9. Ensuite, des diminutions ont été

observées dans les concentrations plasmatiques d'ICAM-1 et de VCAM-1 après la dose de

500 mL/jour. Une corrélation positive a été notée entre les diminutions des LDL oxydées et

de VCAM-1 après 12 semaines. Ces résultats sont en accord avec les résultats des études

cellulaires qui suggèrent que la LDL oxydée peut induire la production de VCAM-1 en

activant la voie NF-KB (199-201).

La stabilité de la plaque d'athéroclérose est un facteur important dans manifestation d'un

événement cardiovasculaire. MMP-9 est principalement exprimée dans le macrophage et

est impliquée dans l'instabilité de la plaque. Au chapitre 11, des concentrations

plasmatiques de MMP-9 et de NOx ont été mesurées dans le cadre de la même étude dose-

réponse déjà décrite au chapitre 10. Des diminutions importantes des concentrations

plasmatiques de MMP-9 ont été notées après la dose de 500 mL/jour. Les individus ayant le

mieux répondu au traitement sont ceux qui avaient des niveaux basaux élevés. Dans le

253

cadre des résultats générés durant ma maîtrise, des diminutions de NOx étaient aussi

observées. En accord avec la littérature [10,40,41], une corrélation inverse était notée entre

les diminutions de MMP-9 et de NOx. Compte tenu de la relation étroite entre ces deux

marqueurs de la MCV, des sous-analyses ont été effectuées. Les sous-analyses ont montré

que les gens affichant au départ des concentrations plasmatiques faibles en NOx (rôle de

vasodilatateur) ont diminué davantage leur niveau de MMP-9 que ceux qui avaient des

concentrations plasmatiques élevées de NOx. Pour leur part, ceux avec des niveaux initiaux

élevés de NOx (rôle inflammatoire délétère) ont diminué leur niveau de NOx. Ainsi, nos

résultats tendent à suggérer que le traitement au CJC diminue préférentiellement les

niveaux de NOx avant ceux de MMP-9. D convient de rappeler que de fortes corrélations

avaient été rapportées entre l'expression des ARN messagers (r= 0.524, p<0.01) et des

protéines (r= 0.964, p<0.01) d'ICAM-1 et de MMP-9 dans des cellules musculaires lisses et

les macrophages chez l'homme (232). Cependant, des corrélations similaires entre MMP-9

et ICAM-1 n'ont pas été observées dans la cohorte décrite aux chapitres 10 et 11 de la

présente thèse. La différence entre le type de modèle utilisé pourrait expliquer cette

divergence.

Tel que présenté au chapitre 3.1.3 (p. 38), un relargage de LDL oxydée se produit lorsque la

plaque d'athérosclérose est instable, ce qui suggère qu'une diminution des concentrations

de LDL oxydées pourrait provenir d'une diminution de la perméabilité de la plaque

d'athérosclérose instable : phénomène couramment associé aux proteases des matrices

(MMPs) comme MMP-9 (142). Cependant, aucune corrélation entre les variations de

concentrations plasmatiques de LDL oxydée et de MMP-9 (0.04, p=0.8172) n'ont été

observée dans les études des chapitres 10 et 11.

Il convient de se rappeler que la plupart des mesures présentées dans le cadre des chapitres

9, 10 et 11 ont été effectuées sur des échantillons sanguins récoltés à jeun et qu'une étude

cinétique de chacun de ces paramètres pourrait apporter des éléments bien différents de ce

qui est rapporté présentement.

254

Le NOx est aussi reconnu pour jouer un rôle crucial dans la vasodilatation. Le

développement récent de technologies de pointes permet aujourd'hui de mesurer la

vasodilatation et la rigidité artérielle. Les diminutions des niveaux pathologiques NOx

observés suite au traitement au CJC (448) suggèrent qu'il pourrait y avoir un bénéfice pour

la fonction vasomotrice. Dans cette étude présentée au chapitre 12, aucune variation

significative de la vasodilatation n'a été observée suite à une supplementation journalière

de 500 mL de CJC pour une période de 4 semaines. Une diminution des niveaux basaux de

rigidité artérielle a été rapportée suite au traitement au CJC. Cependant, cette différence

n'était pas significative lorsque comparée au traitement placebo. La composition du

placebo pourrait avoir entrainé des diminutions non significatives de la rigidité artérielle.

Par exemple, la vitamine C présente dans les deux boissons est reconnue pour diminuer la

rigidité artérielle. Une augmentation du nombre de participants aurait probablement permis

de mieux discriminer les effets du CJC sur la fonction endothéliale. Une autre étude portant

uniquement sur la mesure des niveaux de base pourrait permettre d'une part d'alléger le

protocole et de faciliter le recrutement afin d'obtenir une conclusion plus claire sur les

effets du CJC sur la rigidité artérielle. En résumé, les résultats ambigus de cette étude

soulèvent davantage de questions qu'ils ne fournissent de réponses.

Nous avons montré dans un article publié antérieurement que la consommation de CJC était

associée à des augmentations de 8% des concentrations plasmatique de HDL-cholestérol

(448). L'étude sur le Torcetrapid a montré que les augmentations de HDL-cholestérol

doivent êtres caractérisées par une hausse du transport inverse du cholestérol pour offrir des

bénéfices cardiovasculaires. Au cours de l'étude présentée au chapitre 13, nous avons

montré que la quercetine, qu'elle soit glucosylée ou non, augmente l'efflux de cholestérol

dans le macrophage humain THP1, contrairement à la myricétine qui n'a eu aucun impact

significatif sur l'efflux de cholestérol. Les mesures des ARNm et de l'abondance relative

des protéines n'ont pas permis de définir clairement le mécanisme impliqué. Des études

complémentaires devront être faites afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués

dans les augmentations de l'efflux de cholestérol observées dans le macrophage humain

THP-1 suite aux traitements avec les deux formes de quercetine.

255

L'objectif général de la présente thèse était d'approfondir nos connaissances sur les effets

des antioxydants de la canneberge sur différents marqueurs cardiométaboliques. Nos

travaux ont engendré des connaissances nouvelles qui ont permis de découvrir des pistes

intéressantes concernant les mécanismes d'action des antioxydants de la canneberge in vivo

chez l'homme. Toutefois, nos découvertes ne nous permettent pas d'affirmer que nous

avons trouvé les mécanismes d'action par lesquels agissent les antioxydants sur la maladie

cardiovasculaire. Nos résultats identifient des mécanismes pouvant expliquer les effets

potentiellement antiathérogènes associés à la consommation d'aliments riches en

antioxydants.

Implications pour les études ultérieures, les professionnels de la santé et la population.

L'engouement pour les aliments fonctionnels et les nutraceutiques propagé entre autres par

une augmentation de la conscientisation de l'individu face à sa santé augmente sans cesse.

Cet intérêt de la part des consommateurs a mené au développement du marché des aliments

fonctionnels et des nutraceutiques. Les estimations quant à la valeur du marché mondial des

aliments fonctionnels s'échelonne entre 10 et 30 milliards de dollars américains. Au

Canada, on estime que le secteur des aliments fonctionnels, des produits nutraceutiques et

des produits dermaceutiques valait environ 1 milliard de dollars américains en 1999 (481).

Aux Etats-Unis, ce marché a une croissance de près de 8% en 2000 et une croissance

prévue de 9,5% par année (482). Ainsi lorsque certains chefs d'entreprise affirment que la

santé est l'avenir de l'alimentation, ils ne semblent pas faire fausse route (483).

Est-ce que les profits mirobolants vont rendre les publicitaires médiatiques démagogues?

Plus simplement la recherche de la nouvelle à sensation va-t-elle enlever la nuance

nécessaire à la crédibilité de ces produits? En tant que scientifique, j 'ai participé à une

activité démagogique : suite à la publication par les médias de notre précédente étude

mettant en relation la canneberge et des augmentations de cholestérol des lipoprotéines de

haute densité, des augmentations substantielles de vente de CJC ont été enregistrées dans la

province de Québec suggérant un lien étroit entre la recherche clinique et les habitudes des

256

consommateurs. Pourtant, mon affirmation que le CJC augmente le HDL-cholestérol n'a

pas encore été répliquée par un autre groupe de recherche indépendant. De plus, la

population sur laquelle l'étude a porté était masculine et à risque de MCV : rien à voir avec

l'auditoire général qui a lu mes propos. Outre pour la prévention des récidives d'infections

urinaires où les évidences scientifiques sont évidentes, peut-on affirmer que le jus de

canneberges est un aliment nutraceutique en regard de ces bienfaits pour la MCV? Les

résultats soumis dans la présente thèse lorsque combinés à ceux de d'autres groupes de

recherche tendent à supporter cette affirmation. Cependant, il reste beaucoup plus sage et

conservateur de se fier aux évidences acceptées par l'ensemble de la communauté

scientifique comme les recommandations sur la consommation de fruits et légumes.

Ultimement, cette intervention avec les médias a permis de renforcer, à court terme, la

consommation de fruits et légumes du consommateur mais la raison qui l'a justifiée n'était

peut-être pas la bonne.

D'un point de vue scientifique, ces résultats vont renforcer les connaissances sur les

bienfaits cardiovasculaires associés aux différents aliments riches en antioxydants.

Ultimement, une accumulation d'études cliniques montrant des bénéfices cardiovasculaires

justifiera la tenue de grandes études onéreuses avec une bonne méthodologie et un vaste

échantillonnage portant sur les aliments et non les suppléments comme l'étude DASH l'a

été à une certaine époque pour les effets de la consommation de fruits, légumes et produits

laitier sur l'hypertension (484). Les résultats issus de la présente thèse ouvrent plusieurs

pistes de recherche pour la suite des choses. Premièrement, avec une approche moléculaire,

on pourrait tenter d'identifier les composés actifs présents dans le CJC. Des études

postprandiales pourraient aussi être envisagées afin de complementer les informations sur

les réponses aiguës des différents marqueurs investigués dans les chapitres 9, 10 et 11.

Enfin, une étude où l'on compare deux diètes, l'une riche en flavonoïdes et l'autre pauvre,

mais où l'alimentation est contrôlée et les macronutriments ajustés entre eux pourrait

permettre de répondre à la question des bienfaits des flavonoïdes par opposition à l'aliment.

La principale contribution de cette thèse de doctorat et des activités de recherche en

découlant est de répondre à plusieurs questions sur les mécanismes d'action sous-jacents

aux effets cardiobénéfiques des antioxydants de la canneberge.

257

Bibliographie des chapitres 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 et de la conclusion 1. Feuillet d'information de la fondation des maladies du coeur Les maladies

cardiovasculaires. (Fondation des Maladies du coeur, 2005). 2. Le fardeau croissant des maladies cardiovasculaires et des accidents vasculaires

cérébraux. (Fondation des Maladies du coeur, Ottawa, 2003). 3. Causes de décès. Vol. 2010 (Statistiques Canada, 2005). 4. Scheen, A.J. & Kulbertus, H. [Interheart: nine risk factors predict nine out often

myocardial infarctions]. Rev Med Liege 2004;59:676-679. 5. Yusuf, S., et al. Effect of potentially modifiable risk factors associated with

myocardial infarction in 52 countries (the INTERHEART study): case-control study. Lancet 2004;364:937-952.

6. Novogen. Cardiovascular Program. Vol. 2010 (Novogen). 7. Virchow, R. Phlogose und Thrombose im Gefdssystem., (Meidinger, Sohn and Co.,

Frankfurt, 1856). 8. Zarifis, J.H. Atherosclerosis, thrombosis, and inflammatory risk factors, from

history and the laboratory to real life. Eur Heart J 2005;26:317-318. 9. Thomas, W.A., Florentin, R.A., Nam, S.C, Reiner, J.M. & Lee, K.T. Alterations in

population dynamics of arterial smooth muscle cells during atherogenesis. I. Activation of interphase cells in cholesterol-fed swine prior to gross atherosclerosis demonstrated by "postpulse-salvage labeling". Exp Mol Pathol 1971;15:245-267.

10. Rhoads, G.G., Gulbrandsen, CL. & Kagan, A. Serum lipoproteins and coronary heart disease in a population study of Hawaii Japanese men. N Engl J Med 1976;294:293-298.

11. Kannel, W.B., Castelli, W.P., Gordon, T. & McNamara, P.M. Serum cholesterol, lipoproteins, and the risk of coronary heart disease. The Framingham study. Ann Intern Med 1971;74:1-12.

12. Coronary heart disease in seven countries. I. The study program and objectives. Circulation 1970;41:11-8.

13. Goldstein, J.L. & Brown, M.S. The LDL pathway in human fibroblasts: a receptor-mediated mechanism for the regulation of cholesterol metabolism. Curr Top Cell Regul 1976;11:147-181.

14. Lamarche, B. Notes de cours: Lipidologie I (MDX-64370). (Université Laval, Québec, 2003).

15. Cathcart, S. & Dominiczak, M.H. The measurement of lipoprotein subfractions in plasma using a tabletop ultracentrifuge. Ann Clin Biochem 1990;27 ( Pt 5):459-464.

16. Havel, R.J., Eder, H.A. & Bragdon, J.H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest 1955;34:1345-1353.

17. Hussain, M.M. A proposed model for the assembly of chylomicrons. Atherosclerosis 2000;148:1-15.

18. Cohn, J.S., Marcoux, C & Davignon, J. Detection, quantification, and characterization of potentially atherogenic triglyceride-rich remnant lipoproteins. Arterioscler Thromb Vase Biol 1999;19:2474-2486.

258

19. Eisenberg, S. & Sehayek, E. Remnant particles and their metabolism. Baillieres Clin Endocrinol Metab 1995;9:739-753.

20. Brown, M.S. & Goldstein, J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science 1986;232:34-47.

21. Capell, W.H., Zambon, A., Austin, M.A., Brunzell, J.D. & Hokanson, J.E. Compositional differences of LDL particles in normal subjects with LDL subclass phénotype A and LDL subclass phénotype B. Arterioscler Thromb Vase Biol 1996;16:1040-1046.

22. Esterbauer, H., Waeg, G., Puhl, H., Dieber-Rotheneder, M. & Tatzber, F. Inhibition of LDL oxidation by antioxidants. EXS 1992;62:145-157.

23. Krauss, R.M. & Burke, D.J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res 1982;23:97-104.

24. Austin, M.A. & Edwards, K.L. Small, dense low density lipoproteins, the insulin resistance syndrome and noninsulin-dependent diabetes. Curr Opin Lipidol 1996;7:167-171.

25. Sniderman, A.D. & Silberberg, J. Is it time to measure apolipoprotein B? Arteriosclerosis 1990;10:665-667.

26. Barter, P.J., et al. Apo B versus cholesterol in estimating cardiovascular risk and in guiding therapy: report of the thirty-person/ten-country panel. J Intern Med 2006;259:247-258.

27. Lamarche, B., Lemieux, I. & Despres, J.P. The small, dense LDL phénotype and the risk of coronary heart disease: epidemiology, patho-physiology and therapeutic aspects. Diabetes Metab 1999;25:199-211.

28. Yancey, P.G., et al. Importance of different pathways of cellular cholesterol efflux. Arterioscler Thromb Vase Biol 2003;23:712-719.

29. Blanche, P.J., Gong, E.L., Forte, T.M. & Nichols, A.V. Characterization of human high-density lipoproteins by gradient gel electrophoresis. Biochim Biophys Acta 1981;665:408-419.

30. Barter, P.J. & Rye, K.A. High density lipoproteins and coronary heart disease. Atherosclerosis 1996;121:1-12.

31. Van Lenten, B.J., Navab, M., Shih, D., Fogelman, A.M. & Lusis, A.J. The role of high-density lipoproteins in oxidation and inflammation. Trends Cardiovasc Med 2001;11:155-161.

32. Glomset, J.A. The plasma lecithinsxholesterol acyltransferase reaction. J Lipid Res 1968;9:155-167.

33. Yamashita, S., et al. Characterization of plasma lipoproteins in patients heterozygous for human plasma cholesteryl ester transfer protein (CETP) deficiency: plasma CETP regulates high-density lipoprotein concentration and composition. Metabolism 1991;40:756-763.

34. Lewis, G.F. & Rader, D.J. New insights into the regulation of HDL metabolism and reverse cholesterol transport. Circ Res 2005;96:1221-1232.

35. Lewis, G.F. Determinants of plasma HDL concentrations and reverse cholesterol transport. Curr Opin Cardiol 2006;21:345-352.

36. Castelli, W.P., et al. HDL cholesterol and other lipids in coronary heart disease. The cooperative lipoprotein phenotyping study. Circulation 1977;55:767-772.

259

37. Gordon, T., Castelli, W.P., Hjortland, M.C, Kannel, W.B. & Dawber, T.R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease. The Framingham Study. Am J Med 1977;62:707-714.

38. Brown, B.G., Stukovsky, K.H. & Zhao, X.Q. Simultaneous low-density lipoprotein-C lowering and high-density lipoprotein-C elevation for optimum cardiovascular disease prevention with various drug classes, and their combinations: a metaanalysis of 23 randomized lipid trials. Curr Opin Lipidol 2006;17:631-636.

39. Natarajan, P., Ray, K.K. & Cannon, CP. High-density lipoprotein and coronary heart disease: current and future therapies. J Am Coll Cardiol 55:1283-1299.

40. Barter, P.J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. N Engl J Med 2007;357:2109-2122.

41. Krimbou, L., et al. Molecular interactions between apoE and ABCA1: impact on apoE lipidation. J Lipid Res 2004;45:839-848.

42. Out, R., et al. Coexistence of foam cells and hypocholesterolemia in mice lacking the ABC transporters Al and Gl. Circ Res 2008; 102:113-120.

43. Yvan-Charvet, L., et al. Combined deficiency of ABCA1 and ABCG1 promotes foam cell accumulation and accelerates atherosclerosis in mice. J Clin Invest 2007;117:3900-3908.

44. Adorni, M.P., et al. The roles of different pathways in the release of cholesterol from macrophages. J Lipid Res 2007;48:2453-2462.

45. Wang, X., et al. Macrophage ABCA1 and ABCG1, but not SR-BI, promote macrophage reverse cholesterol transport in vivo. J Clin Invest 2007; 117:2216-2224.

46. Bodzioch, M., et al. The gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease. Nat Genet 1999;22:347-351.

47. Rust, S., et al. Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1. Nat Genet 1999;22:352-355.

48. Brooks-Wilson, A., et al. Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency. Nat Genet 1999;22:336-345.

49. Cohen, J.C, et al. Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol. Science 2004;305:869-872.

50. Yvan-Charvet, L., et al. In vivo evidence for a role of adipose tissue SR-BI in the nutritional and hormonal regulation of adiposity and cholesterol homeostasis. Arterioscler Thromb Vase Biol 2007;27:1340-1345.

51. Santamarina-Fojo, S., et al. Complete genomic sequence of the human ABCA 1 gene: analysis of the human and mouse ATP-binding cassette A promoter. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:7987-7992.

52. Kennedy, M.A., et al. Characterization of the human ABCG1 gene: liver X receptor activates an internal promoter that produces a novel transcript encoding an alternative form of the protein. J Biol Chem 2001;276:39438-39447.

53. Cao, G., et al. Structure and localization of the human gene encoding SR-BI/CLA-1. Evidence for transcriptional control by steroidogenic factor 1. J Biol Chem 1997;272:33068-33076.

54. Calvo, D. & Vega, M.A. Identification, primary structure, and distribution of CLA-1, a novel member of the CD36/LIMPII gene family. J Biol Chem 1993;268:18929-18935.

260

55. Nakamura, K., et al. Expression and regulation of multiple murine ATP-binding cassette transporter G1 mRNAs/isoforms that stimulate cellular cholesterol efflux to high density lipoprotein. J Biol Chem 2004;279:45980-45989.

56. Acton, S., et al. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor. Science 1996;271:518-520.

57. Malerod, L., Juvet, L.K., Hanssen-Bauer, A., Eskild, W. & Berg, T. Oxysterol-activated LXRalpha/RXR induces hSR-BI-promoter activity in hepatoma cells and preadipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2002;299:916-923.

58. Suzuki, S., et al. Verapamil increases the apolipoprotein-mediated release of cellular cholesterol by induction of ABCA1 expression via Liver X receptor-independent mechanism. Arterioscler Thromb Vase Biol 2004;24:519-525.

59. Cavelier, C , Lorenzi, I., Rohrer, L. & von Eckardstein, A. Lipid efflux by the ATP-binding cassette transporters ABCA1 and ABCG1. Biochim Biophys Acta 2006;1761:655-666.

60. Oram, J.F., Lawn, R.M., Garvin, M.R. 8c Wade, D.P. ABCA1 is the cAMP-inducible apolipoprotein receptor that mediates cholesterol secretion from macrophages. J Biol Chem 2000;275:34508-34511.

61. Wang, N., Silver, D.L., Costet, P. & Tall, A.R. Specific binding of ApoA-I, enhanced cholesterol efflux, and altered plasma membrane morphology in cells expressing ABC1. J Biol Chem 2000;275:33053-33058.

62. Lorenzi, I., von Eckardstein, A., Cavelier, C , Radosavljevic, S. & Rohrer, L. Apolipoprotein A-I but not high-density lipoproteins are internalised by RAW macrophages: roles of ATP-binding cassette transporter Al and scavenger receptor BI. J Mol Med 2008;86:171-183.

63. Takahashi, Y. & Smith, J.D. Cholesterol efflux to apolipoprotein AI involves endocytosis and resecretion in a calcium-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U SA 1999;96:11358-11363.

64. Smith, J.D., Waelde, C , Horwitz, A. & Zheng, P. Evaluation of the role of phosphatidylserine translocase activity in ABCA 1-mediated lipid efflux. J Biol Chem 2002;277:17797-17803.

65. Hassan, H.H., et al. Quantitative analysis of ABCA 1-dependent compartmentalization and trafficking of apolipoprotein A-I: implications for determining cellular kinetics of nascent high density lipoprotein biogenesis. J Biol Chem 2008;283:11164-11175.

66. Schaefer, E.J., Zech, L.A., Schwartz, D.E. & Brewer, H.B., Jr. Coronary heart disease prevalence and other clinical features in familial high-density lipoprotein deficiency (Tangier disease). Ann Intern Med 1980;93:261-266.

67. Remaley, A.T., et al. Human ATP-binding cassette transporter 1 (ABC1): genomic organization and identification of the genetic defect in the original Tangier disease kindred. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:12685-12690.

68. Rust, S.W., Kumar, P., Burgoon, D.A., Niemuth, N.A. & Schultz, B.D. Influence of bone-lead stores on the observed effectiveness of lead hazard intervention. Environ Res 1999;81:175-184.

69. Costet, P., Luo, Y., Wang, N. & Tall, A.R. Sterol-dependent transactivation of the ABC 1 promoter by the liver X receptor/retinoid X receptor. J Biol Chem 2000;275:28240-28245.

261

70. Ide, T., et al. Cross-talk between peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha and liver X receptor (LXR) in nutritional regulation of fatty acid metabolism. II. LXRs suppress lipid degradation gene promoters through inhibition of PPAR signaling. Mol Endocrinol 2003;17:1255-1267.

71. Yoshikawa, T., et al. Cross-talk between peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha and liver X receptor (LXR) in nutritional regulation of fatty acid metabolism. I. PPARs suppress sterol regulatory element binding protein-lc promoter through inhibition of LXR signaling. Mol Endocrinol 2003;17:1240-1254.

72. Roosbeek, S., et al. Phosphorylation by protein kinase CK2 modulates the activity of the ATP binding cassette Al transporter. J Biol Chem 2004;279:37779-37788.

73. Haidar, B., Denis, M., Marcil, M., Krimbou, L. & Genest, J., Jr. Apolipoprotein A-I activates cellular cAMP signaling through the ABCA1 transporter. J Biol Chem 2004;279:9963-9969.

74. Fu, X., et al. 27-hydroxycholesterol is an endogenous ligand for liver X receptor in cholesterol-loaded cells. J Biol Chem 2001;276:38378-38387.

75. Wang, N., Ranalletta, M., Matsuura, F., Peng, F. & Tall, A.R. LXR-induced redistribution of ABCG1 to plasma membrane in macrophages enhances cholesterol mass efflux to HDL. Arterioscler Thromb Vase Biol 2006;26:1310-1316.

76. Terasaka, N., Wang, N., Yvan-Charvet, L. & Tall, A.R. High-density lipoprotein protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by promoting efflux of 7-ketocholesterol via ABCG1. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:15093-15098.

77. Gelissen, LC, et al. ABCA1 and ABCG1 synergize to mediate cholesterol export to apoA-I. Arterioscler Thromb Vase Biol 2006;26:534-540.

78. Vaughan, A.M. & Oram, J.F. ABCA1 and ABCG1 or ABCG4 act sequentially to remove cellular cholesterol and generate cholesterol-rich HDL. J Lipid Res 2006;47:2433-2443.

79. Lorenzi, I., von Eckardstein, A., Radosavljevic, S. & Rohrer, L. Lipidation of apolipoprotein A-I by ATP-binding cassette transporter (ABC) Al generates an interaction partner for ABCG1 but not for scavenger receptor BI. Biochim Biophys Acta 2008;1781:306-313.

80. Calvo, D., Gomez-Coronado, D., Lasuncion, M.A. & Vega, M.A. CLA-1 is an 85-kD plasma membrane glycoprotein that acts as a high-affinity receptor for both native (HDL, LDL, and VLDL) and modified (OxLDL and AcLDL) lipoproteins. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997;17:2341-2349.

81. Acton, S.L., Scherer, P.E., Lodish, H.F. & Krieger, M. Expression cloning of SRBI, a CD36-related class B scavenger receptor. J Biol Chem 1994;269:21003-21009.

82. Cao, G., et al. Developmental and hormonal regulation of murine scavenger receptor, class B, type 1. Mol Endocrinol 1999;13:1460-1473.

83. Braun, A., et al. Loss of SR-BI expression leads to the early onset of occlusive atherosclerotic coronary artery disease, spontaneous myocardial infarctions, severe cardiac dysfunction, and premature death in apolipoprotein E-deficient mice. Circ Res 2002;90:270-276.

84. Van Eck, M., Bos, I.S., Hildebrand, R.B., Van Rij, B.T. & Van Berkel, T.J. Dual role for scavenger receptor class B, type I on bone marrow-derived cells in atherosclerotic lesion development. Am J Pathol 2004;165:785-794.

262

85. Zhang, W., et al. Inactivation of macrophage scavenger receptor class B type I promotes atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 2003;108:2258-2263.

86. Yvan-Charvet, L., et al. SR-BI inhibits ABCG1-stimulated net cholesterol efflux from cells to plasma HDL. J Lipid Res 2008;49:107-114.

87. Yancey, P.G., et al. In vivo modulation of HDL phospholipid has opposing effects on SR-BI- and ABCA 1-mediated cholesterol efflux. J Lipid Res 2004;45:337-346.

88. Hassan, H.H., et al. Identification of an ABCA 1-dependent phospholipid-rich plasma membrane apolipoprotein A-I binding site for nascent HDL formation: implications for current models of HDL biogenesis. J Lipid Res 2007;48:2428-2442.

89. Foumier, N., et al. Analysis of the relationship between triglyceridemia and HDL-phospholipid concentrations: consequences on the efflux capacity of serum in the Fu5AH system. Atherosclerosis 2001;157:315-323.

90. Horter, M.J., et al. Associations of HDL phospholipids and paraoxonase activity with coronary heart disease in postmenopausal women. Acta Physiol Scand 2002;176:123-130.

91. Piperi, C, et al. The significance of serum HDL phospholipid levels in angiographically defined coronary artery disease. Clin Biochem 2004;37:377-381.

92. Esterbauer, H., Striegl, G., Puhl, H. & Rotheneder, M. Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein. Free Radie Res Commun 1989;6:67-75.

93. Dieber-Rotheneder, M., Puhl, H., Waeg, G., Striegl, G. & Esterbauer, H. Effect of oral supplementation with D-alpha-tocopherol on the vitamin E content of human low density lipoproteins and resistance to oxidation. J Lipid Res 1991 ;32:1325-1332.

94. Parthasarathy, S., Printz, D.J., Boyd, D., Joy, L. & Steinberg, D. Macrophage oxidation of low density lipoprotein generates a modified form recognized by the scavenger receptor. Arteriosclerosis 1986;6:505-510.

95. Steinberg, D., Parthasarathy, S., Carew, T.E., Khoo, J.C. & Witztum, J.L. Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N Engl J Med 1989;320:915-924.

96. Parthasarathy, S., Santanam, N., Ramachandran, S. & Meilhac, O. Oxidants and antioxidants in atherogenesis. An appraisal. J Lipid Res 1999;40:2143-2157.

97. Staprans, L, Rapp, J.H., Pan, X.M. & Feingold, K.R. Oxidized lipids in the diet are incorporated by the liver into very low density lipoprotein in rats. J Lipid Res 1996;37:420-430.

98. Staprans, I., Rapp, J.H., Pan, X.M., Hardman, D.A. & Feingold, K.R. Oxidized lipids in the diet accelerate the development of fatty streaks in cholesterol-fed rabbits. Arterioscler Thromb Vase Biol 1996;16:533-538.

99. Napoli, C , Ambrosio, G., Palumbo, G., Elia, P.P. & Chiariello, M. [Human low-density lipoproteins are peroxidized by free radicals via chain reactions triggered by the superoxide radical]. Cardiologia 1991;36:527-532.

100. Ho, CY. & Clifford, A.J. Bovine milk xanthine oxidase, blood lipids and coronary plaques in rabbits. J Nutr 1977;107:758-766.

101. Graham, A., et al. Péroxynitrite modification of low-density lipoprotein leads to recognition by the macrophage scavenger receptor. FEBS Lett 1993;330:181-185.

263

102. Hogg, N., Darley-Usmar, V.M., Graham, A. & Moncada, S. Péroxynitrite and atherosclerosis. Biochem Soc Trans 1993;21:358-362.

103. Santanam, N. & Parthasarathy, S. Paradoxical actions of antioxidants in the oxidation of low density lipoprotein by peroxidases. J Clin Invest 1995;95:2594-2600.

104. Heinecke, J.W. Mechanisms of oxidative damage of low density lipoprotein in human atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 1997;8:268-274.

105. Rankin, S.M., Parthasarathy, S. & Steinberg, D. Evidence for a dominant role of lipoxygenase(s) in the oxidation of LDL by mouse peritoneal macrophages. J Lipid Res 1991;32:449-456.

106. Ursini, F., et al. Postprandial plasma lipid hydroperoxides: a possible link between diet and atherosclerosis. Free Radie Biol Med 1998;25:250-252.

107. Moller, P., Wallin, H. & Knudsen, L.E. Oxidative stress associated with exercise, psychological stress and life-style factors. Chem Biol Interact 1996;102:17-36.

108. Tsopanakis, C & Tsopanakis, A. Stress hormonal factors, fatigue, and antioxidant responses to prolonged speed driving. Pharmacol Biochem Behav 1998;60:747-751.

109. Halliwell, B. Free radicals in biology and médecine, (Oxford University Press, Oxford, 1999).

110. Ruhe, R.C. & McDonald, R.B. Use of antioxidant nutrients in the prevention and treatment of type 2 diabetes. J Am Coll Nutr 2001;20:363S-369S; discussion 381S-383S.

111. McCarthy, D.O. Rethinking nutritional support for persons with cancer cachexia. Biol Res Nurs 2003;5:3-17.

112. Burton, G.W., Joyce, A. & Ingold, K.U. First proof that vitamin E is major lipid-soluble, chain-breaking antioxidant in human blood plasma. Lancet 1982;2:327.

113. Huang, D., Ou, B. & Prior, R.L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agric Food Chem 2005;53:1841-1856.

114. Quinn, M.T., Parthasarathy, S. & Steinberg, D. Lysophosphatidylcholine: a chemotactic factor for human monocytes and its potential role in atherogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85:2805-2809.

115. Kume, N., Cybulsky, M.I. & Gimbrone, M.A., Jr. Lysophosphatidylcholine, a component of atherogenic lipoproteins, induces mononuclear leukocyte adhesion molecules in cultured human and rabbit arterial endothelial cells. J Clin Invest 1992;90:1138-1144.

116. Khan, B.V., Parthasarathy, S.S., Alexander, R.W. & Medford, R.M. Modified low density lipoprotein and its constituents augment cytokine-activated vascular cell adhesion molecule-1 gene expression in human vascular endothelial cells. J Clin Invest 1995;95:1262-1270.

117. Maier, J.A., Barenghi, L., Bradamante, S. & Pagani, F. Induction of human endothelial cell growth by mildly oxidized low density lipoprotein. Atherosclerosis 1996;123:115-121.

118. Auge, N., et al. The sphingomyelin-ceramide signaling pathway is involved in oxidized low density lipoprotein-induced cell proliferation. J Biol Chem 1996;271:19251-19255.

119. Deckert, V., et al. Inhibitors of arterial relaxation among components of human oxidized low-density lipoproteins. Cholesterol derivatives oxidized in position 7 are

264

potent inhibitors of endothelium-dependent relaxation. Circulation 1997;95:723-731.

120. Kugiyama, K., Kerns, S.A., Morrisett, J.D., Roberts, R. & Henry, P.D. Impairment of endothelium-dependent arterial relaxation by lysolecithin in modified low-density lipoproteins. Nature 1990;344:160-162.

121. Wada, H., et al. Effect of lipoproteins on tissue factor activity and PAI-II antigen in human monocytes and macrophages. Int J Cardiol 1994;47:S21-25.

122. Steinbrecher, U.P., Parthasarathy, S., Leake, D.S., Witztum, J.L. & Steinberg, D. Modification of low density lipoprotein by endothelial cells involves lipid peroxidation and degradation of low density lipoprotein phospholipids. Proc Natl Acad Sci U S A 1984;81:3883-3887.

123. Ling, W., et al. Oxidized or acetylated low density lipoproteins are rapidly cleared by the liver in mice with disruption of the scavenger receptor class A type I/II gene. J Clin Invest 1997;100:244-252.

124. Lipton, B.A., et al. Components of the protein fraction of oxidized low density lipoprotein stimulate interleukin-1 alpha production by rabbit arterial macrophage-derived foam cells. J Lipid Res 1995;36:2232-2242.

125. Palinski, W., et al. Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:1372-1376.

126. Itabe, H., et al. A monoclonal antibody against oxidized lipoprotein recognizes foam cells in atherosclerotic lesions. Complex formation of oxidized phosphatidylcholines and polypeptides. J Biol Chem 1994;269:15274-15279.

127. Ehara, S., et al. Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship with the severity of acute coronary syndromes. Circulation 2001;103:1955-1960.

128. Kayo, S., et al. Oxidized low-density lipoprotein levels circulating in plasma and deposited in the tissues: comparison between Helicobacter pylori-associated gastritis and acute myocardial infarction. Am Heart J 2004;148:818-825.

129. Toshima, S., et al. Circulating oxidized low density lipoprotein levels. A biochemical risk marker for coronary heart disease. Arterioscler Thromb Vase Biol 2000;20:2243-2247.

130. Tsimikas, S., et al. Temporal increases in plasma markers of oxidized low-density lipoprotein strongly reflect the presence of acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol 2003;41:360-370.

131. Tsimikas, S., et al. High-dose atorvastatin reduces total plasma levels of oxidized phospholipids and immune complexes present on apolipoprotein B-100 in patients with acute coronary syndromes in the MIRACL trial. Circulation 2004; 110:1406-1412.

132. Segev, A., Strauss, B.H., Witztum, J.L., Lau, H.K. & Tsimikas, S. Relationship of a comprehensive panel of plasma oxidized low-density lipoprotein markers to angiographic restenosis in patients undergoing percutaneous coronary intervention for stable angina. Am Heart J 2005;150:1007-1014.

133. Kotani, K., et al. Distribution of immunoreactive malondialdehyde-modified low-density lipoprotein in human serum. Biochim Biophys Acta 1994;1215:121-125.

134. Holvoet, P., Vanhaecke, J., Janssens, S., Van de Werf, F. & Collen, D. Oxidized LDL and malondialdehyde-modified LDL in patients with acute coronary syndromes and stable coronary artery disease. Circulation 1998;98:1487-1494.

265

135. Holvoet, P., et al. Circulating oxidized LDL is a useful marker for identifying patients with coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vase Biol 2001;21:844-848.

136. Holvoet, P., Stassen, J.M., Van Cleemput, J., Collen, D. 8c Vanhaecke, J. Oxidized low density lipoproteins in patients with transplant-associated coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vase Biol 1998; 18:100-107.

137. Chang, M.K., Binder, C.J., Torzewski, M. & Witztum, J.L. C-reactive protein binds to both oxidized LDL and apoptotic cells through recognition of a common ligand: Phosphorylcholine of oxidized phospholipids. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:13043-13048.

138. Matsuura, E., Kobayashi, K., Tabuchi, M. & Lopez, L.R. Oxidative modification of low-density lipoprotein and immune regulation of atherosclerosis. Prog Lipid Res 2006;45:466-486.

139. Itabe, H. 8c Ueda, M. Measurement of plasma oxidized low-density lipoprotein and its clinical implications. J Atheroscler Thromb 2007;14:1-11.

140. Tsimikas, S. Noninvasive imaging of oxidized low-density lipoprotein in atherosclerotic plaques with tagged oxidation-specific antibodies. Am J Cardiol 2002;90:22L-27L.

141. Yla-Herttuala, S., et al. Evidence for the presence of oxidatively modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man. J Clin Invest 1989;84:1086-1095.

142. Jong, G.P., et al. Immunoglobulin E and matrix metalloproteinase-9 in patients with different stages of coronary artery diseases. Chin J Physiol 2007;50:277-282.

143. Pryor, W.A., Stanley, J.P. & Griffith, M.G. The Hydrogen Atom and Its Reactions in Solution. Science 1970;169:181-183.

144. Burton, G.W. & Ingold, K.U. Autooxidation of biological molecules. 1. the autooxidation of vitamin E and related chain-breaking antioxydants in vitro. Journal of the american chemical society 1981;103:6472-6477.

145. Pryor, W.A., Strickland, T. & Church, D.F. Comparison of the efficiencies of several natural and synthetic antioxydants in aqueous sodium dodecyl sulfate micelle solutions, journal of the american chemical society 1988;110:2224-2229.

146. Pryor, W.A. A rapid screening test to determine the antioxidants potencies of natural and synthetic antioxidants. Journal of Organic chemistry 1993;58:3521-3532.

147. Giamalva, D.H., Church, D.F. & Pryor, W.A. Effect of bilayer structure on the rates of reaction of ozone with polyunsaturated fatty acids in phosphatidylcholine liposomes. Chem Res Toxicol 1988;1:144-145.

148. Kleinveld, H.A., Hak-Lemmers, H.L., Stalenhoef, A.F. & Demacker, P.N. Improved measurement of low-density-lipoprotein susceptibility to copper-induced oxidation: application of a short procedure for isolating low-density lipoprotein. Clin Chem 1992;38:2066-2072.

149. Frankel, E.N., German, J.B. & Davis, P.A. Headspace gas chromatography to determine human low density lipoprotein oxidation. Lipids 1992;27:1047-1051.

150. Foti, M. & Ruberto, G. Kinetic solvent effects on phenolic antioxidants determined by spectrophotométrie measurements. J Agric Food Chem 2001;49:342-348.

151. Cao, G., Alessio, H.M. & Cutler, R.G. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radie Biol Med 1993;14:303-311.

266

152. Ou, B., Hampsch-Woodill, M. & Prior, R.L. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe. J Agric Food Chem 2001;49:4619-4626.

153. Huang, D., Ou, B., Hampsch-Woodill, M., Flanagan, J.A. & Deemer, E.K. Development and validation of oxygen radical absorbance capacity assay for lipophilic antioxidants using randomly methylated beta-cyclodextrin as the solubility enhancer. J Agric Food Chem 2002;50:1815-1821.

154. Wu, X., et al. Lipophilic and hydrophilic antioxidant capacities of common foods in the United States. J Agric Food Chem 2004;52:4026-4037.

155. Prior, R.L., et al. Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity (oxygen radical absorbance capacity (ORAC(FL))) of plasma and other biological and food samples. J Agric Food Chem 2003;51:3273-3279.

156. Bors, W., Saran, M. & Michel, C. Radical intermediates involved in the bleaching of the carotenoid crocin. Hydroxyl radicals, superoxide anions and hydrated electrons. Int J Radiât Biol Relat Stud Phys Chem Med 1982;41:493-501.

157. Tubaro, F., Ghiselli, A., Rapuzzi, P., Maiorino, M. & Ursini, F. Analysis of plasma antioxidant capacity by competition kinetics. Free Radie Biol Med 1998;24:1228-1234.

158. Wayner, D.D., Burton, G.W., Ingold, K.U. & Locke, S. Quantitative measurement of the total, peroxyl radical-trapping antioxidant capability of human blood plasma by controlled peroxidation. The important contribution made by plasma proteins. FEBS Lett 1985;187:33-37.

159. Dudonne, S., Vitrac, X., Coutiere, P., Woillez, M. & Merillon, J.M. Comparative Study of Antioxidant Properties and Total Phenolic Content of 30 Plant Extracts of Industrial Interest Using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC Assays. J Agric Food Chem 2009;

160. Folin, O. & Cicocalteu, V. Tyrosine and tryptophan determination proteins. J Biol Chem 1927;73:627.

161. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.

162. Kresge, N., Simoni, R.D. & Hill, R.L. The Most Highly Cited Paper in Publishing History: Protein Determination by Oliver H. Lowry. J Biol Chem 2O05;73:e25.

163. Mangas, J., Suarez, B. & Blanco, D. Automated determination of total polyphenols in apple juice. Z Lebensm Unters Forsch 1993;197:424-426.

164. Miller, N.J., Rice-Evans, C & Davies, M.J. A new method for measuring antioxidant activity. Biochem Soc Trans 1993;21:95S.

165. Re, R., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radie Biol Med 1999;26:1231-1237.

166. Benzie, LF. & Strain, J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Anal Biochem 1996;239:70-76.

167. Oxiresearch, I. Colorimetric, quantitative assay for total antioxidant potential (aqueous sample), (2002).

168. Yamashita, N., et al. Alpha-tocopherol induces oxidative damage to DNA in the presence of copper(II) ions. Chem Res Toxicol 1998; 11:855-862.

169. Zaporozhets, O.A., Krushynska, O.A., Lipkovska, N.A. & Barvinchenko, V.N. A new test method for the evaluation of total antioxidant activity of herbal products. J Agric Food Chem 2004;52:21-25.

267

170. Nomura, T., Kikuchi, M., Kubodera, A. & Kawakami, Y. Proton-donative antioxidant activity of fucoxanthin with l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Biochem Mol Biol Int 1997;42:361-370.

171. Bondet, V., Brand-William, W. & Berset, C Kinetics and mechanisms of antioxydant activity using DPPH free radical method. Food Sci. Technol.-Leb. 1997;30:609-615.

172. Connor, A.M., Luby, J.J., Hancock, J.F., Berkheimer, S. & Hanson, E.J. Changes in fruit antioxidant activity among blueberry cultivars during cold-temperature storage. J Agric Food Chem 2002;50:893-898.

173. Nojiri, S., et al. Association of serum antioxidant capacity with coronary artery disease in middle-aged men. Jpn Heart J 2001;42:677-690.

174. Skalska, A.B. & Grodzicki, T. Carotid atherosclerosis in elderly hypertensive patients: potential role of endothelin and plasma antioxidant capacity. J Hum Hypertens 2009;

175. Veglia, F., Cavalca, V. & Tremoli, E. OXY-SCORE: a global index to improve evaluation of oxidative stress by combining pro- and antioxidant markers. Methods Mol Biol 594:197-213.

176. Veglia, F., et al. Assessment of oxidative stress in coronary artery bypass surgery: comparison between the global index OXY-SCORE and individual biomarkers. Biomarkers 2009;

177. Veglia, F., et al. Age- and gender-related oxidative status determined in healthy subjects by means of OXY-SCORE, a potential new comprehensive index. Biomarkers 2006; 11:562-573.

178. Virchow, R. Cellular pathology as based upon physiological and pathological anatomy (english translation of german) (1859).

179. Gilbert, A. 8c Lion, G. Arterites infectieuses expérimentales. Comptes rendus hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie 1889;41:

180. Nieto, FJ. Infections and atherosclerosis: new clues from an old hypothesis? Am J Epidemiol 1998;148:937-948.

181. Benditt, E.P. & Benditt, J.M. Evidence for a monoclonal origin of human atherosclerotic plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 1973;70:1753-1756.

182. Ross, R. & Glomset, J.A. Atherosclerosis and the arterial smooth muscle cell: Proliferation of smooth muscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosis. Science 1973;180:1332-1339.

183. Ross, R., Glomset, J. & Harker, L. Response to injury and atherogenesis. Am J Pathol 1977;86:675-684.

184. Ross, R. & Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science 1976; 193:1094-1100.

185. Harker, L.A., Slichter, S.J., Scott, CR. & Ross, R. Homocystinemia. Vascular injury and arterial thrombosis. N Engl J Med 1974;291:537-543.

186. Hansen, O.E. Hyperuricemia, gout, and atherosclerosis. Am Heart J 1966;72:570-572.

187. Hardin, N.J., Minick, CR. & Murphy, G.E. Experimental induction of atheroarteriosclerosis by the synergy of allergic injury to arteries and lipid-rich diet. 3. The role of earlier acquired fibromuscular intimai thickening in the pathogenesis of later developing atherosclerosis. Am J Pathol 1973;73:301-326.

268

188. Minick, CR. & Murphy, G.E. Experimental induction of atheroarteriosclerosis by the synergy of allergic injury to arteries and lipid-rich diet. II. Effect of repeatedly injected foreign protein in rabbits fed a lipid-rich, cholesterol-poor diet. Am J Pathol 1973;73:265-300.

189. Bjorkerud, S. & Bondjers, G. Arterial repair and atherosclerosis after mechanical injury. I. Permeability and light microscopic characteristics of endothelium in non-atherosclerotic and atherosclerotic lesions. Atherosclerosis 1971;13:355-363.

190. Helin, P., Lorenzen, I., Garbarsch, C. 8c Matthiessen, M.E. Arteriosclerosis in rabbit aorta induced by mechanical dilatation. Biochemical and morphological studies. Atherosclerosis 1971;13:319-331.

191. Gerrity, R.G. The role of the monocyte in atherogenesis: I. Transition of blood-borne monocytes into foam cells in fatty lesions. Am J Pathol 1981;103:181-190.

192. Huo, Y., Hafezi-Moghadam, A. & Ley, K. Role of vascular cell adhesion molecule-1 and fibronectin connecting segment-1 in monocyte rolling and adhesion on early atherosclerotic lesions. Circ Res 2000;87:153-159.

193. Ramos, CL., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ Res 1999;84:1237-1244.

194. Pigott, R., Dillon, L.P., Hemingway, I.H. & Gearing, A.J. Soluble forms of E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1 are present in the supernatants of cytokine activated cultured endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1992;187:584-589.

195. Rothlein, R., Dustin, M.L., Marlin, S.D. & Springer, T.A. A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct from LFA-1. J Immunol 1986; 137:1270-1274.

196. Wong, D., Prameya, R. & Dorovini-Zis, K. In vitro adhesion and migration of T lymphocytes across monolayers of human brain microvessel endothelial cells: regulation by ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and PECAM-1. J Neuropathol Exp Neurol 1999;58:138-152.

197. Hope, S.A. & Meredith, I.T. Cellular adhesion molecules and cardiovascular disease. Part I. Their expression and role in atherogenesis. Intern Med J 2003;33:380-386.

198. Roebuck, K.A., Rahman, A., Lakshminarayanan, V., Janakidevi, K. & Malik, A.B. H202 and tumor necrosis factor-alpha activate intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) gene transcription through distinct cis-regulatory elements within the ICAM-1 promoter. J Biol Chem 1995;270:18966-18974.

199. Haraldsen, G., Kvale, D., Lien, B., Farstad, I.N. & Brandtzaeg, P. Cytokine-regulated expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human microvascular endothelial cells. J Immunol 1996;156:2558-2565.

200. Amberger, A., et al. Co-expression of ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1 and Hsp60 in human arterial and venous endothelial cells in response to cytokines and oxidized low-density lipoproteins. Cell Stress Chaperones 1997;2:94-103.

201. Ardans, J.A., Economou, A.P., Martinson, J.M., Jr., Zhou, M. & Wahl, L.M. Oxidized low-density and high-density lipoproteins regulate the production of matrix metalloproteinase-1 and -9 by activated monocytes. J Leukoc Biol 2002;71:1012-1018.

269

202. Vestweber, D. & Blanks, J.E. Mechanisms that regulate the function of the selectins and their ligands. Physiol Rev 1999;79:181-213.

203. Pober, J.S., Slowik, M.R., De Luca, L.G. & Ritchie, A.J. Elevated cyclic AMP inhibits endothelial cell synthesis and expression of TNF-induced endothelial leukocyte adhesion molecule-1, and vascular cell adhesion molecule-1, but not intercellular adhesion molecule-1. J Immunol 1993; 150:5114-5123.

204. Dong, Z.M., Brown, A.A. & Wagner, D.D. Prominent role of P-selectin in the development of advanced atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Circulation 2000;101:2290-2295.

205. Dong, Z.M., et al. The combined role of P- and E-selectins in atherosclerosis. J Clin Invest 1998;102:145-152.

206. Iiyama, K., et al. Patterns of vascular cell adhesion molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1 expression in rabbit and mouse atherosclerotic lesions and at sites predisposed to lesion formation. Circ Res 1999;85:199-207.

207. Cybulsky, M.I., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest 2001;107:1255-1262.

208. Collins, R.G., et al. P-Selectin or intercellular adhesion molecule (ICAM)-l deficiency substantially protects against atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. J Exp Med 2000;191:189-194.

209. Osborn, L., et al. Direct expression cloning of vascular cell adhesion molecule 1, a cytokine-induced endothelial protein that binds to lymphocytes. Cell 1989;59:1203-1211.

210. Read, M.A., et al. Tumor necrosis factor alpha-induced E-selectin expression is activated by the nuclear factor-kappaB and c-JUN N-terminal kinase/p38 mitogen-activated protein kinase pathways. J Biol Chem 1997;272:2753-2761.

211. Kaplanski, G., et al. A novel role for E- and P-selectins: shape control of endothelial cell monolayers. J Cell Sci 1994; 107 ( Pt 9):2449-2457.

212. Ruchaud-Sparagano, M.H., Walker, T.R., Rossi, A.G., Haslett, C & Dransfield, I. Soluble E-selectin acts in synergy with platelet-activating factor to activate neutrophil beta 2-integrins. Role of tyrosine kinases and Ca2+ mobilization. J Biol Chem 2000;275:15758-15764.

213. Couillard, C, et al. Circulating levels of oxidative stress markers and endothelial adhesion molecules in men with abdominal obesity. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:6454-6459.

214. Hwang, S.J., et al. Circulating adhesion molecules VCAM-1, ICAM-1, and E-selectin in carotid atherosclerosis and incident coronary heart disease cases: the Atherosclerosis Risk In Communities (ARIC) study. Circulation 1997;96:4219-4225.

215. Virmani, R., Burke, A.P., Farb, A. & Kolodgie, F.D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol 2006;47:03-18.

216. Galis, Z.S., Muszynski, M., Sukhova, G.K., Simon-Morrissey, E. & Libby, P. Enhanced expression of vascular matrix métalloprotéinases induced in vitro by cytokines and in regions of human atherosclerotic lesions. Ann N Y Acad Sci 1995;748:501-507.

217. Galis, Z.S., Sukhova, G.K. & Libby, P. Microscopic localization of active proteases by in situ zymography: detection of matrix metalloproteinase activity in vascular tissue. Faseb J 1995;9:974-980.

270

218. Segers, D., et al. Gelatinolytic activity in atherosclerotic plaques is highly localized and is associated with both macrophages and smooth muscle cells in vivo. Circulation 2007; 115:609-616.

219. Hansson, G.K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 2005;352:1685-1695.

220. Dollery, CM. & Libby, P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res 2006;69:625-635.

221. Nagase, H., Visse, R. & Murphy, G. Structure and function of matrix métalloprotéinases and TIMPs. Cardiovasc Res 2006;69:562-573.

222. Newby, A.C. Matrix métalloprotéinases regulate migration, proliferation, and death of vascular smooth muscle cells by degrading matrix and non-matrix substrates. Cardiovasc Res 2006;69:614-624.

223. Zempo, N., et al. Matrix métalloprotéinases of vascular wall cells are increased in balloon-injured rat carotid artery. J Vase Surg 1994;20:209-217.

224. Bendeck, M.P., Zempo, N., Clowes, A.W., Galardy, R.E. & Reidy, M.A. Smooth muscle cell migration and matrix metalloproteinase expression after arterial injury in the rat. Circ Res 1994;75:539-545.

225. George, S.J., Zaltsman, A.B. & Newby, A.C Surgical preparative injury and neointima formation increase MMP-9 expression and MMP-2 activation in human saphenous vein. Cardiovasc Res 1997;33:447-459.

226. Southgate, KM., et al. Upregulation of basement membrane-degrading metalloproteinase secretion after balloon injury of pig carotid arteries. Circ Res 1996;79:1177-1187.

227. Chesler, N.C, Ku, D.N. & Galis, Z.S. Transmural pressure induces matrix-degrading activity in porcine arteries ex vivo. Am J Physiol 1999;277:H2002-2009.

228. Hanemaaijer, R., Koolwijk, P., le Clercq, L., de Vree, W.J. & van Hinsbergh, V.W. Regulation of matrix metalloproteinase expression in human vein and microvascular endothelial cells. Effects of tumour necrosis factor alpha, interleukin 1 and phorbol ester. Biochem J 1993,296 ( Pt 3):803-809.

229. Mach, F., Schonbeck, U., Bonnefoy, J.Y., Pober, J.S. & Libby, P. Activation of monocyte/macrophage functions related to acute atheroma complication by ligation of CD40: induction of collagénase, stromelysin, and tissue factor. Circulation 1997;96:396-399.

230. Amorino, G.P. & Hoover, R.L. Interactions of monocytic cells with human endothelial cells stimulate monocytic metalloproteinase production. Am J Pathol 1998;152:199-207.

231. Gait, S.W., et al. Differential regulation of matrix metalloproteinase-9 by monocytes adherent to collagen and platelets. Circ Res 2001;89:509-516.

232. Kong, Y.J., Sun, W.X., Zhang, YM. & Shi, Y.Z. [Relationships between the expressions of intercellular adhesion molecule-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-9 in lung tissues of patients with chronic obstructive pulmonary disease]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi 2008;31:129-133.

233. Malik, N., Greenfield, B.W., Wahl, A.F. & Kiener, P.A. Activation of human monocytes through CD40 induces matrix métalloprotéinases. J Immunol 1996;156:3952-3960.

271

234. Gu, Z., et al. S-nitrosylation of matrix métalloprotéinases: signaling pathway to neuronal cell death. Science 2002;297:1186-1190.

235. Rajagopalan, S., Meng, X.P., Ramasamy, S., Harrison, D.G. & Galis, Z.S. Reactive oxygen species produced by macrophage-derived foam cells regulate the activity of vascular matrix métalloprotéinases in vitro. Implications for atherosclerotic plaque stability. J Clin Invest 1996;98:2572-2579.

236. Saren, P., Welgus, H.G. & Kovanen, P.T. TNF-alpha and IL-1 beta selectively induce expression of 92-kDa gelatinase by human macrophages. J Immunol 1996;157:4159-4165.

237. Nold, M., Goede, A., Eberhardt, W., Pfeilschifter, J. & Muhl, H. IL-18 initiates release of matrix metalloproteinase-9 from peripheral blood mononuclear cells without affecting tissue inhibitor of matrix métalloprotéinases-1 : suppression by TNF alpha blockage and modulation by IL-10. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2003;367:68-75.

238. Schonbeck, U., et al. Ligation of CD40 activates interleukin 1 beta-converting enzyme (caspase-1) activity in vascular smooth muscle and endothelial cells and promotes elaboration of active interleukin lbeta. J Biol Chem 1997;272:19569-19574.

239. Schonbeck, U., et al. Regulation of matrix metalloproteinase expression in human vascular smooth muscle cells by T lymphocytes: a role for CD40 signaling in plaque rupture? Circ Res 1997;81:448-454.

240. Xu, X.P., et al. Oxidized low-density lipoprotein regulates matrix metalloproteinase-9 and its tissue inhibitor in human monocyte-derived macrophages. Circulation 1999;99:993-998.

241. Kojima, C , Ino, J., Ishii, H., Nitta, K. & Yoshida, M. MMP-9 inhibition by ACE inhibitor reduces oxidized LDL-mediated foam-cell formation. J Atheroscler Thromb 17:97-105.

242. Galis, Z.S., Sukhova, G.K., Kranzhofer, R., Clark, S. & Libby, P. Macrophage foam cells from experimental atheroma constitutively produce matrix-degrading proteinases. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:402-406.

243. Chase, A.J., Bond, M., Crook, M.F. & Newby, A.C. Role of nuclear factor-kappa B activation in metalloproteinase-1, -3, and -9 secretion by human macrophages in vitro and rabbit foam cells produced in vivo. Arterioscler Thromb Vase Biol 2002;22:765-771.

244. Welgus, H.G., et al. Neutral métalloprotéinases produced by human mononuclear phagocytes. Enzyme profile, regulation, and expression during cellular development. J Clin Invest 1990;86:1496-1502.

245. Watanabe, H., Nakanishi, I., Yamashita, K., Hayakawa, T. & Okada, Y. Matrix metalloproteinase-9 (92 kDa gelatinase/type IV collagénase) from U937 monoblastoid cells: correlation with cellular invasion. J Cell Sci 1993; 104 ( Pt 4):991-999.

246. Lacraz, S., Dayer, J.M., Nicod, L. & Welgus, H.G. 1,25-dihydroxyvitamin D3 dissociates production of interstitial collagénase and 92-kDa gelatinase in human mononuclear phagocytes. J Biol Chem 1994;269:6485-6490.

247. Whatling, C , Bjork, H., Gredmark, S., Hamsten, A. & Eriksson, P. Effect of macrophage differentiation and exposure to mildly oxidized LDL on the proteolytic repertoire of THP-1 monocytes. J Lipid Res 2004;45:1768-1776.

272

248. Corcoran, M.L., Stetler-Stevenson, W.G., Brown, P.D. & Wahl, L.M. Interleukin 4 inhibition of prostaglandin E2 synthesis blocks interstitial collagénase and 92-kDa type IV collagenase/gelatinase production by human monocytes. J Biol Chem 1992;267:515-519.

249. Corcoran, M.L., Kibbey, M.C, Kleinman, H.K. & Wahl, L.M. Laminin SIKVAV peptide induction of monocyte/macrophage prostaglandin E2 and matrix métalloprotéinases. J Biol Chem 1995;270:10365-10368.

250. Bar-Or, A., et al. Analyses of all matrix metalloproteinase members in leukocytes emphasize monocytes as major inflammatory mediators in multiple sclerosis. Brain 2003;126:2738-2749.

251. Lacraz, S., et al. Suppression of metalloproteinase biosynthesis in human alveolar macrophages by interleukin-4. J Clin Invest 1992;90:382-388.

252. Major, T.C, Liang, L., Lu, X., Rosebury, W. & Bocan, T.M. Extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) is induced upon monocyte differentiation and is expressed in human atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 2002;22:1200-1207.

253. Cipollone, F., et al. Association between prostaglandin E receptor subtype EP4 overexpression and unstable phénotype in atherosclerotic plaques in human. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005;25:1925-1931.

254. Newby, A.C. Metalloproteinase expression in monocytes and macrophages and its relationship to atherosclerotic plaque instability. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008;28:2108-2114.

255. Bendeck, M.P., Irvin, C & Reidy, M.A. Inhibition of matrix metalloproteinase activity inhibits smooth muscle cell migration but not neointimal thickening after arterial injury. Circ Res 1996;78:38-43.

256. Godin, D., Ivan, E., Johnson, C , Magid, R. & Galis, Z.S. Remodeling of carotid artery is associated with increased expression of matrix métalloprotéinases in mouse blood flow cessation model. Circulation 2000;102:2861-2866.

257. Lijnen, H.R., et al. Temporal and topographic matrix metalloproteinase expression after vascular injury in mice. Thromb Haemost 1999;81:799-807.

258. Kenagy, R.D., et al. The role of plasminogen, plasminogen activators, and matrix métalloprotéinases in primate arterial smooth muscle cell migration. Arterioscler Thromb Vase Biol 1996;16:1373-1382.

259. Aoyagi, M., et al. Immunolocalization of matrix métalloprotéinases in rabbit carotid arteries after balloon denudation. Histochem Cell Biol 1998;109:97-102.

260. Mason, D.P., et al. Matrix metalloproteinase-9 overexpression enhances vascular smooth muscle cell migration and alters remodeling in the injured rat carotid artery. Circ Res 1999;85:1179-1185.

261. Thomas, A.C. & Newby, A.C. Effect of Matrix Metalloproteinase-9 Knockout on Vein Graft Remodelling in Mice. J Vase Res 2009;47:299-308.

262. Kai, H., et al. Peripheral blood levels of matrix metalloproteases-2 and -9 are elevated in patients with acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol 1998;32:368-372.

263. Fukuda, D., et al. Comparison of levels of serum matrix metalloproteinase-9 in patients with acute myocardial infarction versus unstable angina pectoris versus stable angina pectoris. Am J Cardiol 2006;97:175-180.

273

264. Robertson, L., Grip, L., Mattsson Hulten, L., Hulthe, J. & Wiklund, O. Release of protein as well as activity of MMP-9 from unstable atherosclerotic plaques during percutaneous coronary intervention. J Intern Med 2007,262:659-667.

265. Blankenberg, S., et al. Plasma concentrations and genetic variation of matrix metalloproteinase 9 and prognosis of patients with cardiovascular disease. Circulation 2003;107:1579-1585.

266. Zhang, B., et al. Genetic variation at the matrix metalloproteinase-9 locus on chromosome 20ql2.2-13.1. Hum Genet 1999;105:418-423.

267. Fiotti, N., et al. Metalloproteinases-2, -9 and TIMP-1 expression in stable and unstable coronary plaques undergoing PCI. Int J Cardiol 2008;127:350-357.

268. Brown, D.L., Hibbs, M.S., Kearney, M., Loushin, C. & Isner, J.M. Identification of 92-kD gelatinase in human coronary atherosclerotic lesions. Association of active enzyme synthesis with unstable angina. Circulation 1995;91:2125-2131.

269. Galis, Z.S., Sukhova, G.K., Lark, M.W. & Libby, P. Increased expression of matrix métalloprotéinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest 1994;94:2493-2503.

270. Morgan, A.R., Zhang, B., Tapper, W., Collins, A. & Ye, S. Haplotypic analysis of the MMP-9 gene in relation to coronary artery disease. J Mol Med 2003;81:321-326.

271. Zhang, B., et al. Functional polymorphism in the regulatory region of gelatinase B gene in relation to severity of coronary atherosclerosis. Circulation 1999;99:1788-1794.

272. Johnson, J.L., George, S.J., Newby, A.C. & Jackson, CL. Divergent effects of matrix métalloprotéinases 3, 7, 9, and 12 on atherosclerotic plaque stability in mouse brachiocephalic arteries. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:15575-15580.

273. Luttun, A., et al. Loss of matrix metalloproteinase-9 or matrix metalloproteinase-12 protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth. Circulation 2004;109:1408-1414.

274. Castrillo, A., Joseph, S.B., Marathe, C , Mangelsdorf, D.J. & Tontonoz, P. Liver X receptor-dependent repression of matrix metalloproteinase-9 expression in macrophages. J Biol Chem 2003;278:10443-10449.

275. Shu, H., et al. Activation of PPARalpha or gamma reduces secretion of matrix metalloproteinase 9 but not interleukin 8 from human monocytic THP-1 cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;267:345-349.

276. Marx, N., Sukhova, G., Murphy, C , Libby, P. & Plutzky, J. Macrophages in human atheroma contain PPARgamma: differentiation-dependent peroxisomal proliferator-activated receptor gamma(PPARgamma) expression and reduction of MMP-9 activity through PPARgamma activation in mononuclear phagocytes in vitro. Am J Pathol 1998;153:17-23.

277. Marx, N., Schonbeck, U., Lazar, M.A., Libby, P. & Plutzky, J. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma activators inhibit gene expression and migration in human vascular smooth muscle cells. Circ Res 1998;83:1097-1103.

278. Marx, N., et al. Antidiabetic PPAR gamma-activator rosiglitazone reduces MMP-9 serum levels in type 2 diabetic patients with coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vase Biol 2003;23:283-288.

279. Fiotti, N., et al. Short term effects of doxycycline on matrix métalloprotéinases 2 and 9. Cardiovasc Drugs Ther 2009;23:153-159.

274

280. Liu, J., Xiong, W., Baca-Regen, L., Nagase, H. & Baxter, B.T. Mechanism of inhibition of matrix metalloproteinase-2 expression by doxycycline in human aortic smooth muscle cells. J Vase Surg 2003;38:1376-1383.

281. Rabbani, R. & Topol, E.J. Strategies to achieve coronary arterial plaque stabilization. Cardiovasc Res 1999;41:402-417.

282. Luan, Z., Chase, A.J. & Newby, A.C. Statins inhibit secretion of métalloprotéinases-1, -2, -3, and -9 from vascular smooth muscle cells and macrophages. Arterioscler Thromb Vase Biol 2003;23:769-775.

283. Bellosta, S., et al. HMG-CoA reductase inhibitors reduce MMP-9 secretion by macrophages. Arterioscler Thromb Vase Biol 1998;18:1671-1678.

284. Aikawa, M., et al. An HMG-CoA reductase inhibitor, cerivastatin, suppresses growth of macrophages expressing matrix métalloprotéinases and tissue factor in vivo and in vitro. Circulation 2001;103:276-283.

285. Bright, W. (ed.) Reports of medical cases selected with a view of illustrating symptoms and cure ofdiesases by a reference to morbid anatomy., (Longmans, London, 1827).

286. Mohamed, F.A. The physiology and clinical use of the sphygmograph. Med time gazette 1872;62.

287. Noon, J.P. The arterial pulse wave and vascular compliance. Prog Cardiovasc Nurs 2009;24:53-58.

288. Mahomed, F.A. The aetiology of bright's disease and the prealbuminuric stage., Vol. 57 (Transcripts of the medical chirurgical society, 1874).

289. Postel-Vinay, N.A. (ed.) A century of arterial hypertension 1896-1996., (John Wiley and Sons., Chichester, UK, 1996).

290. Goldberg, R.J., Larson, M. & Levy, D. Factors associated with survival to 75 years of age in middle-aged men and women. The Framingham Study. .Arch Intern Med 1996;156:505-509.

291. Levy, D., Garrison, R.J., Savage, D.D., Kannel, W.B. 8c Castelli, W.P. Left ventricular mass and incidence of coronary heart disease in an elderly cohort. The Framingham Heart Study. Ann Intern Med 1989; 110:101-107.

292. Nichols, W.W. & O'Rourke, M.F. McDonald's blood flow in arteries: theoretical, experimental and clinical practice. 54-72 (Arnold, London, 1998).

293. O'Rourke, M.F. & Mancia, G. Arterial stiffness. J Hypertens 1999; 17:1-4. 294. Wilkinson, I.B., Cockcroft, J.R. & Webb, D.J. Pulse wave analysis and arterial

stiffness. J Cardiovasc Pharmacol 1998;32 Suppl 3:S33-37. 295. Cai, H. & Harrison, D.G. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the

role of oxidant stress. Circ Res 2000;87:840-844. 296. DeLeve, L.D., et al. Decreased hepatic nitric oxide production contributes to the

development of rat sinusoidal obstruction syndrome. Hepatology 2003;38:900-908. 297. Eagleton, M.J., et al. Nitric oxide inhibition increases aortic wall matrix

metalloproteinase-9 expression. J Surg Res 2002;104:15-21. 298. Upchurch, G.R., Jr., et al. Nitric oxide inhibition increases matrix

metalloproteinase-9 expression by rat aortic smooth muscle cells in vitro. J Vase Surg 2001;34:76-83.

299. Knipp, B.S., et al. Increased MMP-9 expression and activity by aortic smooth muscle cells after nitric oxide synthase inhibition is associated with increased nuclear factor-kappaB and activator protein-1 activity. J Surg Res 2004; 116:70-80.

275

300. Tahvanainen, A., et al. Non-invasive measurement of the haemodynamic effects of inhaled salbutamol, intravenous L-arginine and sublingual nitroglycerin. Br J Clin Pharmacol 2009;68:23-33.

301. Celermajer, D.S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet 1992;340:1111-1115.

302. Joannides, R., et al. Nitric oxide is responsible for flow-dependent dilatation of human peripheral conduit arteries in vivo. Circulation 1995;91:1314-1319.

303. Lerman, A. & Zeiher, A.M. Endothelial function: cardiac events. Circulation 2005;111:363-368.

304. Donald, A.E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol 2008;51:1959-1964.

305. Wilkinson, LB., et al. Pulse-wave analysis: clinical evaluation of a noninvasive, widely applicable method for assessing endothelial function. Arterioscler Thromb Vase Biol 2002;22:147-152.

306. Hayward, C.S., Kraidly, M., Webb, CM. & Collins, P. Assessment of endothelial function using peripheral waveform analysis: a clinical application. J Am Coll Cardiol 2002;40:521-528.

307. Rambaran, C, et al. Assessment of endothelial function: comparison of the pulse wave response to beta 2-adrenoceptor stimulation with flow mediated dilatation. Br J Clin Pharmacol 2008;65:238-243.

308. Donald, A.E., et al. Non-invasive assessment of endothelial function: which technique? J Am Coll Cardiol 2006;48:1846-1850.

309. McEniery, CM., et al. Endothelial function is associated with pulse pressure, pulse wave velocity, and augmentation index in healthy humans. Hypertension 2006;48:602-608.

310. Vlachopoulos, C, et al. Prediction of cardiovascular events and all-cause mortality with central haemodynamics: a systematic review and meta-analysis. Eur Heart J

311. Weber, T., et al. Increased arterial wave reflections predict severe cardiovascular events in patients undergoing percutaneous coronary interventions. Eur Heart J 2005;26:2657-2663.

312. Mitchell, G.F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation 121:505-511.

313. Tuttolomondo, A., et al. Arterial stiffness indexes in acute ischemic stroke: Relationship with stroke subtype. Atherosclerosis

314. Mohan, V., Gokulakrishnan, K., Ganesan, A. & Kumar, S.B. Association of Indian Diabetes Risk Score with Arterial Stiffness in Asian Indian Nondiabetic Subjects: The Chennai Urban Rural Epidemiology Study (CURES-84). J Diabetes Sci Technol 4:337-343.

315. Urbina, EM., et al. Prevalence of Increased Arterial Stiffness in Children with Type 1 Diabetes Mellitus Differs by Measurement Site and Sex: The SEARCH for Diabetes in Youth Study. J Pediatr

316. Wadwa, R.P., et al. Measures of arterial stiffness in youth with type 1 and type 2 diabetes: the SEARCH for Diabetes in Youth study. Diabetes Care

317. Kim, O.Y., Baek, S.H., Lee, Y.J. & Lee, K.H. Association of Increased Hair Calcium Levels and Enhanced Augmentation Index (AIx): a Marker of Arterial Stiffness. Biol Trace Elem Res

276

318. Ayer, J.G., Harmer, J.A., Marks, G.B., Avolio, A. & Celermajer, D.S. Central arterial pulse wave augmentation is greater in girls than boys, independent of height. J Hypertens 28:306-313.

319. Janner, J.H., Godtfredsen, N.S., Ladelund, S., Vestbo, J. & Prescott, E. Aortic augmentation index: reference values in a large unselected population by means of the SphygmoCor device. Am J Hypertens 23:180-185.

320. Minami, J., Ishimitsu, T., Ohrui, M. & Matsuoka, H. Association of smoking with aortic wave reflection and central systolic pressure and metabolic syndrome in normotensive Japanese men. Am J Hypertens 2009;22:617-623.

321. Otsuka, T., Kawada, T., Ibuki, C & Kusama, Y. Obesity as an independent influential factor for reduced radial arterial wave reflection in a middle-aged Japanese male population. Hypertens Res 2009;32:387-391.

322. Wycherley, T.P., et al. Long-term effects of weight loss with a very low carbohydrate and low fat diet on vascular function in overweight and obese patients. J Intern Med 2009;

323. John, S., et al. Plasma soluble adhesion molecules and endothelium-dependent vasodilation in early human atherosclerosis. Clin Sci (Lond) 2000;98:521-529.

324. Gedikli, O., et al. Low total antioxidative capacity levels are associated with augmentation index but not pulse-wave velocity. Heart Vessels 2009;24:366-370.

325. CCTC Province du Québec LOI SUR LE TABAC Projet de loi no 444. (CCTC, 1998).

326. Oberman, A. Exercise and the primary prevention of cardiovascular disease. Am J Cardiol 1985;55:10D-20D.

327. Mann, G.V. Dietary trans fatty acids and CHD. Lancet 1994;344:473. 328. NCEP-ATPHI. Executive Summary of The Third Report of The National

Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment of High Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel HI). Jama 2001;285:2486-2497.

329. Siri-Tarino, P.W., Sun, Q., Hu, F.B. 8c Krauss, R.M. Saturated fat, carbohydrate, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 91:502-509.

330. Siri-Tarino, P.W., Sun, Q., Hu, F.B. & Krauss, R.M. Meta-analysis of prospective cohort studies evaluating the association of saturated fat with cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 91:535-546.

331. Débat: Chambre des communes. (Index du Hansard, 2005). 332. Joshipura, K.J., et al. The effect of fruit and vegetable intake on risk for coronary

heart disease. Ann Intern Med 2001;134:1106-1114. 333. Joshipura, K.J., et al. Fruit and vegetable intake in relation to risk of ischemic

stroke. Jama 1999;282:1233-1239. 334. Bazzano, L.A., et al. Fruit and vegetable intake and risk of cardiovascular disease in

US adults: the first National Health and Nutrition Examination Survey Epidemiologic Follow-up Study. Am J Clin Nutr 2002;76:93-99.

335. Liu, S., et al. Fruit and vegetable intake and risk of cardiovascular disease: the Women's Health Study. Am J Clin Nutr 2000;72:922-928.

336. Liu, S., et al. Intake of vegetables rich in carotenoids and risk of coronary heart disease in men: The Physicians' Health Study. Int J Epidemiol 2001;30:130-135.

277

337. Bazzano, L.A., Serdula, M.K. & Liu, S. Dietary intake of fruits and vegetables and risk of cardiovascular disease. Curr Atheroscler Rep 2003;5:492-499.

338. Kovacic, P. & Thurn, L.A. Cardiovascular toxicity from the perspective of oxidative stress, electron transfer, and prevention by antioxidants. Curr Vase Pharmacol 2005;3:107-117.

339. Kris-Etherton, P.M., et al. Bioactive compounds in nutrition and health-research methodologies for establishing biological function: the antioxidant and antiinflammatory effects of flavonoids on atherosclerosis. Annu Rev Nutr 2004;24:511-538.

340. Rimm, E.B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med 1993;328:1450-1456.

341. Enstrom, J.E., Kanim, L.E. & Klein, M.A. Vitamin C intake and mortality among a sample of the United States population. Epidemiology 1992;3:194-202.

342. Stampfer, M.J., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women. N Engl J Med 1993;328:1444-1449.

343. Hennekens, C.H., Gaziano, J.M., Manson, J.E. & Buring, J.E. Antioxidant vitamin-cardiovascular disease hypothesis is still promising, but still unproven: the need for randomized trials. Am J Clin Nutr 1995;62:1377S-1380S.

344. Gaziano, J.M., Manson, J.E., Buring, J.E. & Hennekens, CH. Dietary antioxidants and cardiovascular disease. Ann N Y Acad Sci 1992;669:249-258; discussion 258-249.

345. Tribble, D.L. & Frank, E. Dietary antioxidants, cancer, and atherosclerotic heart disease. West J Med 1994;161:605-612.

346. Voko, Z., Hollander, M., Hofman, A., Koudstaal, P.J. & Breteler, M.M. Dietary antioxidants and the risk of ischemic stroke: the Rotterdam Study. Neurology 2003;61:1273-1275.

347. Yochum, L.A., Folsom, A.R. & Kushi, L.H. Intake of antioxidant vitamins and risk of death from stroke in postmenopausal women. Am J Clin Nutr 2000;72:476-483.

348. Osganian, S.K., et al. Dietary carotenoids and risk of coronary artery disease in women. Am J Clin Nutr 2003;77:1390-1399.

349. Gaziano, J.M., et al. A prospective study of consumption of carotenoids in fruits and vegetables and decreased cardiovascular mortality in the elderly. Ann Epidemiol 1995;5:255-260.

350. Tavani, A., Negri, E., D'Avanzo, B. & La Vecchia, C Beta-carotene intake and risk of nonfatal acute myocardial infarction in women. Eur J Epidemiol 1997; 13:631-637.

351. Osganian, S.K., et al. Vitamin C and risk of coronary heart disease in women. J Am Coll Cardiol 2003;42:246-252.

352. Khaw, K.T., et al. Relation between plasma ascorbic acid and mortality in men and women in EPIC-Norfolk prospective study: a prospective population study. European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. Lancet 2001;357:657-663.

353. Wei, W., Kim, Y. & Boudreau, N. Association of smoking with serum and dietary levels of antioxidants in adults: NHANES III, 1988-1994. Am J Public Health 2001;91:258-264.

278

354. Hercberg, S., et al. The SU.VIMAX Study: a randomized, placebo-controlled trial of the health effects of antioxidant vitamins and minerals. Arch Intern Med 2004;164:2335-2342.

355. Rapola, J.M., et al. Effect of vitamin E and beta carotene on the incidence of angina pectoris. A randomized, double-blind, controlled trial. Jama 1996;275:693-698.

356. Rapola, J.M., et al. Randomised trial of alpha-tocopherol and beta-carotene supplements on incidence of major coronary events in men with previous myocardial infarction. Lancet 1997;349:1715-1720.

357. Omenn, G.S., et al. Effects of a combination of beta carotene and vitamin A on lung cancer and cardiovascular disease. N Engl J Med 1996;334:1150-1155.

358. Sesso, H.D., et al. Vitamins E and C in the prevention of cardiovascular disease in men: the Physicians' Health Study II randomized controlled trial. Jama 2008;300:2123-2133.

359. Blot, W.J., et al. Nutrition intervention trials in Linxian, China: supplementation with specific vitamin/mineral combinations, cancer incidence, and disease-specific mortality in the general population. J Natl Cancer Inst 1993;85:1483-1492.

360. Stephens, N.G., et al. Randomised controlled trial of vitamin E in patients with coronary disease: Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS). Lancet 1996;347:781-786.

361. Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-Prevenzione trial. Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico. Lancet 1999;354:447-455.

362. Yusuf, S., Dagenais, G., Pogue, J., Bosch, J. & Sleight, P. Vitamin E supplementation and cardiovascular events in high-risk patients. The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N Engl J Med 2000;342:154-160.

363. MRC/BHF Heart Protection Study of antioxidant vitamin supplementation in 20,536 high-risk individuals: a randomised placebo-controlled trial. Lancet 2002;360:23-33.

364. Boaz, M., et al. Secondary prevention with antioxidants of cardiovascular disease in endstage renal disease (SPACE): randomised placebo-controlled trial. Lancet 2000;356:1213-1218.

365. The effect of vitamin E and beta carotene on the incidence of lung cancer and other cancers in male smokers. The Alpha-Tocopherol, Beta Carotene Cancer Prevention Study Group. N Engl J Med 1994;330:1029-1035.

366. Leppala, J.M., et al. Vitamin E and beta carotene supplementation in high risk for stroke: a subgroup analysis of the Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study. Arch Neurol 2000;57:1503-1509.

367. Hercberg, S., et al. Incidence of cancers, ischemic cardiovascular diseases and mortality during 5-year follow-up after stopping antioxidant vitamins and minerals supplements: A postintervention follow-up in the SU.VIMAX Study. Int J Cancer

368. Pietta, P.G. Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod 2000;63:1035-1042. 369. Rusznyak S, S.-G.A. Vitamin P: flavonols as vitamins. Nature 1936; 138:27. 370. Vinson, J.A., Zubik, L., Bose, P., Samman, N. & Proch, J. Dried fruits: excellent in

vitro and in vivo antioxidants. J Am Coll Nutr 2005;24:44-50. 371. Bravo, L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional

significance. Nutr Rev 1998;56:317-333.

279

372. Aherne, S.A. & O'Brien, N.M. Dietary flavonols: chemistry, food content, and metabolism. Nutrition 2002;18:75-81.

373. Manach, C , Scalbert, A., Morand, C , Remesy, C & Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr 2004;79:727-747.

374. Murota, K., et al. Unique uptake and transport of isoflavone aglycones by human intestinal caco-2 cells: comparison of isoflavonoids and flavonoids. J Nutr 2002;132:1956-1961.

375. Cassidy, A. & Faughnan, M. Phyto-oestrogens through the life cycle. Proc Nutr Soc 2000;59:489-496.

376. Crespy, V., et al. Quercetin, but not its glycosides, is absorbed from the rat stomach. J Agric Food Chem 2002;50:618-621.

377. Walle, T. Absorption and metabolism of flavonoids. Free Radie Biol Med 2004;36:829-837.

378. Wu, X., Cao, G. & Prior, R.L. Absorption and metabolism of anthocyanins in elderly women after consumption of elderberry or blueberry. J Nutr 2002;132:1865-1871.

379. Karakaya, S. Bioavailability of phenolic compounds. Crit Rev Food Sci Nutr 2004;44:453-464.

380. Cermak, R., Landgraf, S. & Wolffram, S. Quercetin glucosides inhibit glucose uptake into brush-border-membrane vesicles of porcine jejunum. Br J Nutr 2004;91:849-855.

381. Sesink, A.L., O'Leary, K.A. & Hollman, P.C. Quercetin glucuronides but not glucosides are present in human plasma after consumption of quercetin-3-glucoside or quercetin-4'-glucoside. J Nutr 2001;131:1938-1941.

382. Hollman, P.C. & Katan, M.B. Absorption, metabolism and health effects of dietary flavonoids in man. Biomed Pharmacother 1997;51:305-310.

383. Simons, A.L., Renouf, M., Hendrich, S. & Murphy, P.A. Human gut microbial degradation of flavonoids: structure-function relationships. J Agric Food Chem 2005;53:4258-4263.

384. Tsuda, T., Horio, F. & Osawa, T. Absorption and metabolism of cyanidin 3-O-beta-D-glucoside in rats. FEBS Lett 1999;449:179-182.

385. Felgines, C, et al. Blackberry anthocyanins are slightly bioavailable in rats. J Nutr 2002;132:1249-1253.

386. Turner, N.J., Thomson, BM. & Shaw, I.C. Bioactive isoflavones in functional foods: the importance of gut microflora on bioavailability. Nutr Rev 2003;61:204-213.

387. Hollman, P.C. Bioavailability of flavonoids. Eur J Clin Nutr 1997;51 Suppl 1 :S66-69.

388. Bengmark, S. Bacteria for optimal health. Nutrition 2000; 16:611-615. 389. Silberberg, M., Morand, C , Manach, C , Scalbert, A. & Remesy, C Co

administration of quercetin and catechin in rats alters their absorption but not their metabolism. Life Sci 2005;77:3156-3167.

390. Zhang, H., Wong, C.W., Coville, P.F. & Wanwimolruk, S. Effect of the grapefruit flavonoid naringin on pharmacokinetics of quinine in rats. Drug Metabol Drug Interact 2000;17:351-363.

391. Finot, P.A. The absorption and metabolism of modified amino acids in processed foods. J AOAC Int 2005;88:894-903.

280

392. Azuma, K., Ippoushi, K., Ito, H., Higashio, H. & Terao, J. Combination of lipids and emulsifiers enhances the absorption of orally administered quercetin in rats. J Agric Food Chem 2002;50:1706-1712.

393. Clifford, M.N. Diet-derived phenols in plasma and tissues and their implications for health. Planta Med 2004;70:1103-1114.

394. Lesser, S., Cermak, R. & Wolffram, S. Bioavailability of quercetin in pigs is influenced by the dietary fat content. J Nutr 2004;134:1508-1511.

395. Azuma, K., Ippoushi, K., Ito, H., Horie, H. & Terao, J. Enhancing effect of lipids and emulsifiers on the accumulation of quercetin metabolites in blood plasma after the short-term ingestion of onion by rats. Biosci Biotechnol Biochem 2003;67:2548-2555.

396. Wang, S.Y. & Stretch, A.W. Antioxidant capacity in cranberry is influenced by cultivar and storage temperature. J Agric Food Chem 2001;49:969-974.

397. Lemanska, K., et al. The influence of pH on antioxidant properties and the mechanism of antioxidant action of hydroxyflavones. Free Radie Biol Med 2001;31:869-881.

398. Schubert, S.Y., Lansky, E.P. & Neeman, I. Antioxidant and eicosanoid enzyme inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice flavonoids. J Ethnopharmacol 1999;66:11-17.

399. Arts, LC, van De Putte, B. & Hollman, P.C. Catechin contents of foods commonly consumed in The Netherlands. 2. Tea, wine, fruit juices, and chocolate milk. J Agric Food Chem 2000;48:1752-1757.

400. Arts, LC, van de Putte, B. & Hollman, P.C. Catechin contents of foods commonly consumed in The Netherlands. 1. Fruits, vegetables, staple foods, and processed foods. J Agric Food Chem 2000;48:1746-1751.

401. Knekt, P., et al. Flavonoid intake and risk of chronic diseases. Am J Clin Nutr 2002;76:560-568.

402. Hertog, M.G., Feskens, E.J. & Kromhout, D. Antioxidant flavonols and coronary heart disease risk. Lancet 1997;349:699.

403. Knekt, P., Jarvinen, R., Reunanen, A. & Maatela, J. Flavonoid intake and coronary mortality in Finland: a cohort study. Bmj 1996;312:478-481.

404. Yochum, L., Kushi, L.H., Meyer, K. & Folsom, A.R. Dietary flavonoid intake and risk of cardiovascular disease in postmenopausal women. Am J Epidemiol 1999;149:943-949.

405. Hirvonen, T., Virtamo, J., Korhonen, P., Albanes, D. & Pietinen, P. Intake of flavonoids, carotenoids, vitamins C and E, and risk of stroke in male smokers. Stroke 2000;31:2301-2306.

406. Hertog, M.G., Feskens, E.J., Hollman, P.C, Katan, M.B. & Kromhout, D. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen Elderly Study. Lancet 1993;342:1007-1011.

407. Geleijnse, J.M., Launer, L.J., Van der Kuip, D.A., Hofman, A. & Witteman, J.C. Inverse association of tea and flavonoid intakes with incident myocardial infarction: the Rotterdam Study. Am J Clin Nutr 2002;75:880-886.

408. Huxley, R.R. & Neil, H.A. The relation between dietary flavonol intake and coronary heart disease mortality: a meta-analysis of prospective cohort studies. Eur J Clin Nutr 2003;57:904-908. *

281

409. Sesso, H.D., Gaziano, J.M., Liu, S. & Buring, J.E. Flavonoid intake and the risk of cardiovascular disease in women. Am J Clin Nutr 2003;77:1400-1408.

410. Hertog, M.G., Sweetnam, P.M., Fehily, A.M., Elwood, P.C. & Kromhout, D. Antioxidant flavonols and ischemic heart disease in a Welsh population of men: the Caerphilly Study. Am J Clin Nutr 1997;65:1489-1494.

411. Arts, M.J., Haenen, G.R., Voss, H.P. & Bast, A. Masking of antioxidant capacity by the interaction of flavonoids with protein. Food Chem Toxicol 2001;39:787-791.

412. Lagiou, P., et al. Intake of specific flavonoid classes and coronary heart disease-a case-control study in Greece. Eur J Clin Nutr 2004;58:1643-1648.

413. Mink, P.J., et al. Flavonoid intake and cardiovascular disease mortality: a prospective study in postmenopausal women. Am J Clin Nutr 2007;85:895-909.

414. Sun, J., Chu, Y.F., Wu, X. & Liu, R.H. Antioxidant and antiproliferative activities of common fruits. J Agric Food Chem 2002;50:7449-7454.

415. Vinson, J.A., Su, X., Zubik, L. & Bose, P. Phenol antioxidant quantity and quality in foods: fruits. J Agric Food Chem 2001;49:5315-5321.

416. Lichtenthaler, R. & Marx, F. Total oxidant scavenging capacities of common European fruit and vegetable juices. J Agric Food Chem 2005;53:103-110.

417. USDA. Database for the flavonoid Content of Selected Foods, Release 2. Vol. 2006 (2006).

418. Bere, E. Wild berries: a good source of omega-3. Eur J Clin Nutr 2006; 419. Marwan, A.G.a.N, CW. Separation of hydroxycinnamic acid derivatives in

cranberries. J. Food Science 1982;585-588. 420. Wang, P., Du, C , and Francis, F. Isolation and characterization of polyphenols

compounds in cranberries. J. Food Science 1978;43:1402-1404. 421. Chen, H., Zuo, Y. & Deng, Y. Separation and determination of flavonoids and other

phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A 2001;913:387-395.

422. Puski, G.a.F., R. Flavonol glycosides in cranberries. J. Food Science 1967;527-530. 423. Wang, Y., Catana, F., Yang, Y., Roderick, R. & van Breemen, R.B. An LC-MS

method for analyzing total resveratrol in grape juice, cranberry juice, and in wine. J Agric Food Chem 2002;50:431-435.

424. Zuo, Y., Wang, C & Zhan, J. Separation, characterization, and quantitation of benzoic and phenolic antioxidants in American cranberry fruit by GC-MS. J Agric Food Chem 2002;50:3789-3794.

425. Zheng, W. & Wang, S.Y. Oxygen radical absorbing capacity of phenolics in blueberries, cranberries, chokeberries, and lingonberries. J Agric Food Chem 2003;51:502-509.

426. Zhang, K. & Zuo, Y. GC-MS determination of flavonoids and phenolic and benzoic acids in human plasma after consumption of cranberry juice. J Agric Food Chem 2004;52:222-227.

427. Milbury, P.E., Vita, J.A. & Blumberg, J.B. Anthocyanins are Bioavailable in Humans following an Acute Dose of Cranberry Juice. J Nutr

428. Pedersen, C.B., et al. Effects of blueberry and cranberry juice consumption on the plasma antioxidant capacity of healthy female volunteers. Eur J Clin Nutr 2000;54:405-408.

282

429. Duthie, S. J., et al. The effects of cranberry juice consumption on antioxidant status and biomarkers relating to heart disease and cancer in healthy human volunteers. Eur J Nutr 2005;

430. Ruel, G., Pomerleau, S., Couture, P., Lamarche, B. & Couillard, C. Changes in plasma antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after short-term cranberry juice consumption. Metabolism 2005;54:856-861.

431. Willcox, J.K., Catignani, G.L. & Roberts, L.J., 2nd. Dietary flavonoids fail to suppress F2-isoprostane formation in vivo. Free Radie Biol Med 2003;34:795-799.

432. Duthie, G.G., et al. Increased salicylate concentrations in urine of human volunteers after consumption of cranberry juice. J Agric Food Chem 2005;53:2897-2900.

433. Ghiselli, A., Nardini, M., Baldi, A. & Scaccini, C Antioxidant Activity of Different Phenolic Fractions Separated from an Italian Red Wine. J Agric Food Chem 1998;46:361-367.

434. Baxter, N.J., Lilley, T.H., Haslam, E. & Williamson, M.P. Multiple interactions between polyphenols and a salivary proline-rich protein repeat result in complexation and precipitation. Biochemistry 1997;36:5566-5577.

435. Cossins, E., Lee, R. & Packer, L. ESR studies of vitamin C regeneration, order of reactivity of natural source phytochemical preparations. Biochem Mol Biol Int 1998;45:583-597.

436. Shi, J., Yu, J., Pohorly, J.E. & Kakuda, Y. Polyphenolics in grape seeds-biochemistry and functionality. J Med Food 2003;6:291-299.

437. Rimbach G, V.F.a.P.L. French Maritime Pine Bark: Pycnogenol. in Handbook of Antioxidants (ed. Packer, E.C.a.L.) 417-436 (Marcel Dekker, Los Angeles, 2002).

438. Moini, H., Guo, Q. & Packer, L. Enzyme inhibition and protein-binding action of the procyanidin-rich french maritime pine bark extract, pycnogenol: effect on xanthine oxidase. J Agric Food Chem 2000;48:5630-5639.

439. Conseil, G., et al. Flavonoids: a class of modulators with bifunctional interactions at vicinal ATP- and steroid-binding sites on mouse P-glycoprotein. Proc Natl Acad Sci US A 1998;95:9831-9836.

440. Matter, W.F., Brown, R.F. & Vlahos, CJ. The inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase by quercetin and analogs. Biochem Biophys Res Commun 1992;186:624-631.

441. Spencer, J.P., Rice-Evans, C. & Williams, R.J. Modulation of pro-survival Akt/protein kinase B and ERK 1/2 signaling cascades by quercetin and its in vivo metabolites underlie their action on neuronal viability. J Biol Chem 2003;278:34783-34793.

442. Gamet-Payrastre, L., et al. Flavonoids and the inhibition of PKC and PI 3-kinase. Gen Pharmacol 1999;32:279-286.

443. Vlahos, C.J., Matter, W.F., Hui, K.Y. & Brown, R.F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1 -benzopyran-4-one (LY294002). J Biol Chem 1994;269:5241-5248.

444. Kobuchi, H., Droy-Lefaix, M.T., Christen, Y. & Packer, L. Ginkgo biloba extract (EGb 761): inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7. Biochem Pharmacol 1997;53:897-903.

445. Ruel, G. & Couillard, C. Evidences of the cardioprotective potential of fruits: the case of cranberries. Mol Nutr Food Res 2007;51:692-701.

283

446. Chambers, B.K. 8c Camire, M.E. Can cranberry supplementation benefit adults with type 2 diabetes? Diabetes Care 2003;26:2695-2696.

447. Vinson, J.A., Al Kharrat, H. & Samman, N. Single-dose and supplementation studies with cranberry juice relevant to its role in heart disease and as an antioxidant. (American chemical society, New Orleans, 2003).

448. Ruel, G., et al. Favourable impact of low-calorie cranberry juice consumption on plasma HDL-cholesterol concentrations in men. Br J Nutr 2006;96:357-364.

449. Senault, C, et al. Beneficial effects of a moderate consumption of red wine on cellular cholesterol efflux in young men. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2000; 10:63-69.

450. Berrougui, H., Cloutier, M., Isabelle, M. & Khalil, A. Phenolic-extract from argan oil (Argania spinosa L.) inhibits human low-density lipoprotein (LDL) oxidation and enhances cholesterol efflux from human THP-1 macrophages. Atherosclerosis 2006;184:389-396.

451. Gouedard, C , Barouki, R. & Morel, Y. Dietary polyphenols increase paraoxonase 1 gene expression by an aryl hydrocarbon receptor-dependent mechanism. Mol Cell Biol 2004;24:5209-5222.

452. Rosenblat, M., Karry, R. & Aviram, M. Paraoxonase 1 (PONI) is a more potent antioxidant and stimulant of macrophage cholesterol efflux, when present in HDL than in lipoprotein-deficient serum: Relevance to diabetes. Atherosclerosis 2005;

453. Rosenblat, M., Vaya, J., Shih, D. & Aviram, M. Paraoxonase 1 (PONI) enhances HDL-mediated macrophage cholesterol efflux via the ABCA1 transporter in association with increased HDL binding to the cells: a possible role for lysophosphatidylcholine. Atherosclerosis 2005;179:69-77.

454. Sevov, M., Elfineh, L. & Cavelier, L.B. Resveratrol regulates the expression of LXR-alpha in human macrophages. Biochem Biophys Res Commun 2006;348:1047-1054.

455. Berrougui, H., Grenier, G., Loued, S., Drouin, G. & Khalil, A. A new insight into resveratrol as an atheroprotective compound: inhibition of lipid peroxidation and enhancement of cholesterol efflux. Atherosclerosis 2009;207:420-427.

456. Xia, M., et al. Anthocyanins induce cholesterol efflux from mouse peritoneal macrophages: the role of the peroxisome proliferator-activated receptor {gamma}-liver X receptor {alpha}-ABCAl pathway. J Biol Chem 2005;280:36792-36801.

457. Rosenblat, M., Volkova, N., Coleman, R., Almagor, Y. & Aviram, M. Antiatherogenicity of extra virgin olive oil and its enrichment with green tea polyphenols in the atherosclerotic apolipoprotein-E-deficient mice: enhanced macrophage cholesterol efflux. J Nutr Biochem 2008;19:514-523.

458. Berrougui, H., et al. Antiatherogenic activity of extracts of Argania spinosa L. pericarp: beneficial effects on lipid peroxidation and cholesterol homeostasis. Can J Physiol Pharmacol 2007;85:918-927.

459. Wilson, T., Porcari, J.P. & Harbin, D. Cranberry extract inhibits low density lipoprotein oxidation. Life Sci 1998;62:PL381-386.

460. Chu, Y.F. & Liu, R.H. Cranberries inhibit LDL oxidation and induce LDL receptor expression in hépatocytes. Life Sci 2005;77:1892-1901.

461. Martinez-Florez, S., Gutierrez-Fernandez, B., Sanchez-Campos, S., Gonzalez-Gallego, J. & Tunon, M.J. Quercetin attenuates nuclear factor-kappaB activation

284

and nitric oxide production in interleukin-1 beta-activated rat hépatocytes. J Nutr 2005;135:1359-1365.

462. Comalada, M., et al. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down-regulation of the NF-kappaB pathway. Eur J Immunol 2005;35:584-592.

463. Bagchi, D., et al. Cellular protection with proanthocyanidins derived from grape seeds. Ann N Y Acad Sci 2002;957:260-270.

464. Youdim, K.A., McDonald, J., Kalt, W. & Joseph, J.A. Potential role of dietary flavonoids in reducing microvascular endothelium vulnerability to oxidative and inflammatory insults ( small star, filled). J Nutr Biochem 2002;13:282-288.

465. Weber, C , Erl, W., Pietsch, A. & Weber, P.C. Aspirin inhibits nuclear factor-kappa B mobilization and monocyte adhesion in stimulated human endothelial cells. Circulation 1995;91:1914-1917.

466. Kopp, E. & Ghosh, S. Inhibition of NF-kappa B by sodium salicylate and aspirin. Science 1994;265:956-959.

467. Matchett, M.D., MacKinnon, S.L., Sweeney, M.I., Gottschall-Pass, K.T. & Hurta, R.A. Blueberry flavonoids inhibit matrix metalloproteinase activity in DU 145 human prostate cancer cells. Biochem Cell Biol 2005;83:637-643.

468. Tate, P., God, J., Bibb, R., Lu, Q. & Larcom, L.L. Inhibition of metalloproteinase activity by fruit extracts. Cancer Lett 2004;212:153-158.

469. Sartor, L., et al. Inhibition of matrix-proteases by polyphenols: chemical insights for anti-inflammatory and anti-invasion drug design. Biochem Pharmacol 2002;64:229-237.

470. Moon, S.K., et al. Quercetin exerts multiple inhibitory effects on vascular smooth muscle cells: role of ERK1/2, cell-cycle regulation, and matrix metalloproteinase-9. Biochem Biophys Res Commun 2003;301:1069-1078.

471. Lee, B. & Moon, S.K. Resveratrol inhibits TNF-alpha-induced proliferation and matrix metalloproteinase expression in human vascular smooth muscle cells. J Nutr 2005;135:2767-2773.

472. Vlachopoulos, C, et al. Negative association between serum levels of matrix metalloproteinases-2 and -9 and aortic stiffness in healthy adults. Int J Cardiol 2007;122:232-238.

473. Mullan, B.A., Young, I.S., Fee, H. & McCance, D.R. Ascorbic acid reduces blood pressure and arterial stiffness in type 2 diabetes. Hypertension 2002;40:804-809.

474. Mullan, B.A., Ennis, C.N., Fee, H.J., Young, LS. & McCance, D.R. Protective effects of ascorbic acid on arterial hemodynamics during acute hyperglycemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004;287:H 1262-1268.

475. Mangoush, O., et al. Effect of ascorbic acid on endothelium-dependent vasodilatation of human arterial conduits for coronary artery bypass grafting. Eur J Cardiothorac Surg 2003;24:541-546.

476. Eskurza, L, Monahan, K.D., Robinson, J.A. & Seals, D.R. Effect of acute and chronic ascorbic acid on flow-mediated dilatation with sedentary and physically active human ageing. J Physiol 2004;556:315-324.

477. Plotnick, G.D., Corretti, M.C. & Vogel, R.A. Effect of antioxidant vitamins on the transient impairment of endothelium-dependent brachial artery vasoactivity following a single high-fat meal. Jama 1997;278:1682-1686.

285

478. Vlachopoulos, C, et al. Effect of dark chocolate on arterial function in healthy individuals. Am J Hypertens 2005;18:785-791.

479. Vlachopoulos, C, et al. Acute effect of black and green tea on aortic stiffness and wave reflections. J Am Coll Nutr 2006;25:216-223.

480. Karatzi, K.N., et al. Red wine acutely induces favorable effects on wave reflections and central pressures in coronary artery disease patients. Am J Hypertens 2005;18:1161-1167.

481. Rea, P. Functional Foods Report. Nutrition Business Journal 2001; 135. 482. Mirablon, N. Quatrième édition des Journées Aliments & Santé, (ed. Anvar)

(http://www.anvar.fr/actulettNl larti 1 .htm. La Rochelle, 2002). 483. Ruby, F. Salon international de l'alimentation (SIAL). (ed. PasseportSante.net)

(http://wwvv.passeportsante.net/fr/Actualites/Nouvelles/Fiche.aspx?doc=200504180 0, Montréal, 2005).

484. Sacks, FM., et al. Effects on blood pressure of reduced dietary sodium and the Dietary Approaches to Stop Hypertension (DASH) diet. DASH-Sodium Collaborative Research Group. N Engl J Med 2001;344:3-10.

http://www.anvar.fr/actulettNl

http://PasseportSante.net

http://wwvv.passeportsante.net/fr/Actualites/Nouvelles/Fiche.aspx?doc=200504180

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