© Marie-Pier Veilleux, 2019

Effets de fractions d'écorce de cannelle sur Candida albicans et les cellules épithéliales buccales

Mémoire

Marie-Pier Veilleux

Maîtrise en microbiologie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Effets de fractions d'écorce de cannelle sur

Candida albicans et les cellules épithéliales buccales

Mémoire

Marie-Pier Veilleux

Sous la direction de :

Dr Daniel Grenier

ii

Résumé

Candida albicans est un mycète pathogène opportuniste associé à des infections

superficielles et systémiques, en particulier chez les individus immunologiquement

ou médicalement compromis. C. albicans est notamment responsable de

candidoses buccales et de stomatites prothétiques. De plus, les lésions buccales

ulcéreuses (mucosites buccales) résultant de traitements de chimiothérapie et de

radiothérapie sont sensibles aux infections secondaires à C. albicans. Ce mycète

possède une multitude de facteurs de virulence lui permettant de coloniser l’hôte,

de déjouer les défenses du système immunitaire et d’induire un phénomène

inflammatoire. Actuellement traitées avec des antifongiques tels que le nystatin et

le fluconazole, les infections à C. albicans sont de plus en plus difficiles à guérir,

en raison de l’augmentation de la résistance du pathogène à ces molécules. Le but

du projet de recherche consiste à évaluer dans un premier temps les effets de

l’huile essentielle et des proanthocyanidines de cannelle sur la croissance et les

principaux facteurs de virulence de C. albicans. En second lieu, les effets des

mêmes composés sur les cellules épithéliales buccales ont été étudiés.

iii

Abstract

Candida albicans is an opportunistic pathogenic fungus associated with superficial

and systemic infections, particularly in immunologically or medically compromised

individuals. C. albicans is particularly responsible for oral candidiasis and denture

stomatitis. In addition, ulcerative oral lesions (oral mucositis) resulting from

chemotherapy and radiotherapy treatments are susceptible to secondary infections

by C. albicans. This fungus has a multitude of virulence factors allowing it to

colonize the host, to counteract the defenses of the immune system and to induce

an inflammatory response. Currently treated with antifungals such as nystatin and

fluconazole, candidiasis infections are increasingly difficult to cure, due to the

increased resistance of the pathogen to these molecules. The purpose of the

research project was to evaluate the effects of cinnamon essential oil and

proanthocyanidins on the growth and major virulence factors of C. albicans.

Moreover, the effect of the same compounds on oral epithelial cells was

investigated.

iv

Table des matières

Résumé .................................................................................................................... ii

Abstract ................................................................................................................... iii

Table des matières .................................................................................................. iv

Liste des figures ...................................................................................................... vi

Liste des tableaux .................................................................................................. vii

Liste des abréviations, sigles, acronymes ............................................................. viii

Remerciements ....................................................................................................... ix

Avant-propos ........................................................................................................... x

Introduction .............................................................................................................. 1

1) Pathologies buccales à Candida albicans .................................................................. 2

1.1) Candidoses buccales ........................................................................................... 2

1.2) Stomatites prothétiques ....................................................................................... 3

1.3) Mucites buccales ................................................................................................. 3

1.3.1) Pathogenèse de la mucite buccale .................................................................. 5

1.4) Traitements.......................................................................................................... 7

2) Muqueuse buccale et jonctions serrées...................................................................... 8

3) Candida albicans ........................................................................................................ 9

3.1) Généralités .......................................................................................................... 9

3.2) Facteurs de virulence .......................................................................................... 9

3.2.1) Dimorphisme. ................................................................................................ 10

3.2.2) Formation de biofilms. ................................................................................... 10

3.2.3) Activité hydrolytique ...................................................................................... 11

3.2.4) Interactions de C. albicans avec les cellules épithéliales ............................... 11

4) Cannelle et ses composantes .................................................................................. 13

4.1) Généralités ........................................................................................................ 13

4.2) Genre Cinnamomum ......................................................................................... 14

4.3) Huiles essentielles ............................................................................................. 14

4.4) Polyphénols ....................................................................................................... 15

5) Propriétés bénéfiques des polyphénols et huiles essentielles dans le contexte de la santé buccodentaire ..................................................................................................... 15

5.1) Candidose buccale ............................................................................................ 16

5.2) Carie dentaire .................................................................................................... 16

5.3) Maladies parodontales ....................................................................................... 17

v

5.4) Halitose ............................................................................................................. 18

6) Hypothèse et objectifs .............................................................................................. 20

6.1) Hypothèse ......................................................................................................... 20

6.2) Objectifs ............................................................................................................ 20

Chapitre 1 Effects of cinnamon bark fractions on Candida albicans and oral epithelial cells ........................................................................................................ 21

Résumé ........................................................................................................................ 21

Abstract ........................................................................................................................ 22

1) Introduction .............................................................................................................. 24

2) Materials and methods ............................................................................................. 26

2.1) Cinnamon fractions ............................................................................................ 26

2.2) C. albicans and culture conditions ..................................................................... 26

2.3) Determination of the minimum inhibitory and minimum fungicidal concentrations ................................................................................................................................. 26

2.4) Membrane permeability ..................................................................................... 27

2.5) Biofilm formation and killing ............................................................................... 27

2.6) Epithelial cell culture conditions and viability assays .......................................... 28

2.7) Adherence to epithelial cells .............................................................................. 28

2.8) Oral epithelial barrier integrity ............................................................................ 29

2.9) Secretion of cytokines by oral epithelial cells ..................................................... 30

2.10) Statistical analysis ........................................................................................... 30

3) Results ..................................................................................................................... 31

4) Discussion ................................................................................................................ 42

References ................................................................................................................... 46

Discussion et conclusion ....................................................................................... 50

Bibliographie .......................................................................................................... 55

vi

Liste des figures

Introduction

Figure 1. Pathogenèse de la mucite buccale ........................................................... 6

Figure 2. Candida albicans ...................................................................................... 9

Figure 3. Schéma représentant les différentes voies de signalisation déclenchées par les deux morphologies de C. albicans. ............................................................ 13

Chapitre 1

1 Figure 1. Effect of cinnamon bark oil on the membrane integrity of C. albicans ATCC 28266. ......................................................................................................... 32

2 Figure 2. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the growth and biofilm formation of C. albicans ATCC 28266. .................................... 33

3 Figure 3. Scanning electron micrographs of biofilms formed by C. albicans ATCC 28366 grown in the absence (panels A and B) or presence of 62.5 µg/mL of Cinnulin PF® (panels C and D) ............................................................................. 34

4 Figure 4. Effect of cinnamon bark oil on the viability and desorption of a C. albicans ATCC 28366 biofilm.. .............................................................................. 35

5 Figure 5. Effect of Cinnulin PF® on the adherence of C. albicans ATCC 28366 to GMSM-K oral epithelial cells.. ............................................................................... 36

6 Figure 6. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the viability of two oral epithelial cell lines (B11 and GMSM-K).. ................................. 38

7 Figure 7. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the integrity of the epithelial barrier (B11 cell line).. ..................................................... 39

8 Figure 8. Effect of Cinnulin PF® on TNF-α-induced IL-6 (panel A) and IL-8 (panel B) secretion by oral epithelial cells (GMSM-K cell line).. ....................................... 41

vii

Liste des tableaux

Introduction

Tableau 1. Échelle de classification des mucites buccales selon l’Organisation

mondiale de la santé………………………………………………………………….…4

Chapitre 1

Table 1. Minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum fungicidal concentrations (MFC) of cinnamon fractions against C. albicans……….………….31

viii

Liste des abréviations, sigles, acronymes

ADN Acide désoxyribonucléique

Als3 Agglutinin-like protein 3 precursor

ALS Agglutinin-like sequence

CMF Concentration minimale fongicide

CMI Concentration minimale inhibitrice

EGF Facteur de croissance épidermique

ERK1/2 Extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2

HSP Protéine de choc thermique

Hwp1 Hyphal wall protein 1

JNK c-Jun N-terminal kinase

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MR Récepteur de mannose

NF-κB Facteur nucléaire-κB

PAMP Motifs moléculaires associés aux pathogènes

PI3K Phosphoinositide 3-kinase

PRR Récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires

ROS Espèces réactives de l'oxygène

SAP Aspartyl protéase sécrétée

STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3

TEER Transepithelial electrical resistance

TLR Récepteur toll-like

TNF-α Facteur de nécrose tumorale alpha

ix

Remerciements

Je tiens à exprimer ma gratitude en premier lieu à mon directeur de recherche, le

Dr Daniel Grenier, pour m’avoir permis de me joindre à son équipe de recherche.

Sa disponibilité, sa patience et sa rigueur scientifique ont permis de me guider tout

au long de ma maîtrise. Je tiens à souligner également son soutien énorme qui a

rendu possible pour moi de saisir une opportunité en or pour ma carrière.

Mes remerciements vont également à mes collègues de laboratoire, que je peux

maintenant appeler mes amis, pour leur aide technique, leur transfert de

connaissances ainsi que leur soutien tout au long de ces deux dernières années. À

Ève, Philippe, Jabrane, Katy et Gaëlle qui ont su alimenter ma réflexion

scientifique et divertir mon esprit au besoin. Un merci tout particulier à Amel Ben

Lagha ainsi qu’à Geneviève LeBel, qui m’ont accompagnée du début jusqu’à la

toute fin, qui ont été d’excellentes mentors et exemples de persévérance et qui ont

largement contribué à mon cheminement.

Je veux exprimer ma reconnaissance à mes parents, qui m’ont épaulée et

encouragée lors de l’ensemble de mes années d’études et qui ont toujours cru en

moi. Un grand merci à mon copain qui m’a grandement appuyé dans les moments

plus difficiles et qui a su me motiver à persévérer.

Finalement, j’aimerais remercier mon comité d’encadrement, composé, en plus de

mon directeur de recherche, de la Dre Fatiha Chandad et du Dr Michel Frenette,

pour leur soutien.

x

Avant-propos

Ce présent mémoire est présenté comme exigence partielle de la maîtrise en

microbiologie de l’Université Laval. Il comprend un article intitulé « Effects of

cinnamon bark fractions on Candida albicans and oral epithelial cells » qui a été

soumis le 27 mai 2019 à la revue BCM Complementary and Alternative Medicine.

L’article est signé par deux auteurs : Dr Daniel Grenier, mon directeur de maîtrise

et moi-même, comme auteure principale. J’ai réalisé l’entièreté des

expérimentations de mon projet, sous la supervision du Dr Grenier. J’ai également

écrit le premier jet de l’article, que le Dr Grenier a corrigé et formaté pour

publication. Le Dr Grenier est professeur titulaire à la Faculté de médecine

dentaire de l’Université Laval et chercheur au sein du Groupe de recherche en

écologie buccale (GREB). Ses secteurs d’activités concernent entre autres la

microbiologie buccale, les maladies parodontales, le contrôle de l’infection, les

interactions hôtes-pathogènes lors d’infections buccales et les polyphénols de

plantes et de petits fruits.

1

Introduction

Un vieil adage mentionne que la santé de notre bouche est le miroir de notre

santé. Ce dicton ne ment pas. De nombreuses affections buccales et dentaires

peuvent avoir des incidences sur le bien-être ainsi que sur la santé globale d’un

individu. D’ailleurs, des soins orthodontiques rudimentaires et des plombages

grossiers ont été retrouvés sur la dentition de personnes ayant vécu 8 000 avant

Jésus-Christ, démontrant ainsi que l’intérêt médical envers la cavité buccale était

déjà présent [1]. Nous sommes aujourd’hui conscients de toute la complexité de la

santé bucco-dentaire. Ainsi, plusieurs spécialités médicales s’y consacrent

entièrement.

La cavité buccale est un environnement propice au développement d’une flore

microbienne complexe et diversifiée [2]. Les muqueuses buccales et linguales

abritent principalement des bactéries dites aérobies, alors que les sulcus dentaires

sont plutôt colonisés par des bactéries anaérobies [2]. Plusieurs de ces

microorganismes commensaux peuvent toutefois exprimer un pouvoir pathogène

et devenir nuisibles pour l’homéostasie de la bouche, notamment lorsque l’individu

devient immunosupprimé. Les causes les plus fréquentes d’immunodépression

sont les maladies immunosuppressives et les traitements anticancéreux.

Les cancers font partie des maladies qui marqueront le 21e siècle. Bien que les

traitements aient progressé au fil des ans, ils sont incontestablement reconnus

pour leurs nombreux effets secondaires; perte de cheveux, nausée,

vomissements, fatigue [3]. Un effet secondaire légèrement moins connu, mais

aucunement banal et tout aussi fréquent est la mucite. Ces dommages causés par

les traitements anticancéreux peuvent affecter plusieurs types de muqueuses,

comme les muqueuses intestinales ou encore celles de la cavité buccale [3,4]. Ce

sont les infections liées aux muqueuses de la cavité buccale qui nous intéressent

particulièrement dans le cadre de ce mémoire [4,5], en particulier celles causées par

la levure Candida albicans.

2

1) Pathologies buccales à Candida albicans

1.1) Candidoses buccales

La candidose est une infection provoquée par les levures du genre Candida.

C. albicans est l’espèce la plus souvent associée aux candidoses buccales.

Normalement avirulent chez le sujet en santé et immunocompétent, C. albicans est

un commensal qui fait partie entre autres de la flore normale de la cavité buccale,

du tractus vaginal et intestinal [6,7]. C’est un mycète opportuniste qui peut devenir

pathogène lors d’un changement chez l’hôte, tel qu’un déséquilibre du potentiel

hydrogène (pH), un changement nutritionnel ou encore la prise d’un

antibiotique [8,9]. Les nourrissons en sont souvent atteints en raison de leur système

immunitaire qui n’est pas arrivé complètement à maturité [10]. Ces infections

fongiques sont souvent superficielles et plutôt localisées, mais peuvent également

causer des septicémies sévères et des chocs septiques lorsqu’il y a une invasion

des tissus. Ce stade plus sévère est responsable d’un haut taux de mortalité

pouvant atteindre 30-70% [11–13]. On retrouve fréquemment une colonisation par C.

albicans dans le cas de patients immunodéprimés, comme ceux recevant des

traitements de chimiothérapie ou chez les personnes atteintes du virus de

l’immunodéficience humaine [11,14]. L’usage de corticostéroïdes, qui ont un effet

immunosuppresseur localisé, peut également mener à une candidose buccale [15].

La candidose buccale est reconnaissable par l’apparition de plaques blanchâtres

sur les surfaces buccales comme la langue, les joues intérieures, les gencives et le

palais. La présence de lésions douloureuses et de fendillement aux commissures

des lèvres sont également des symptômes distinctifs [16,17]. De plus, cette infection

peut amener des difficultés à manger ou encore une perte de goût. Lorsque

l’infection devient invasive, elle peut causer de la fièvre, une baisse de la pression

sanguine et de la production d’urine ainsi qu’un souffle cardiaque. La candidose

systémique peut mener jusqu’à l’arrêt du fonctionnement des organes, ce qui

entraîne le décès [18].

3

1.2) Stomatites prothétiques

La stomatite prothétique est une inflammation ainsi qu’un érythème des tissus

chez les porteurs de prothèses dentaires partielles ou complètes amovibles. Il

s’agit de l’affection buccale la plus commune chez les sujets édentés avec une

fréquence qui varie entre 10 et 75 % [19]. La grande variation dans l’estimation de

sa fréquence est probablement due au fait qu’elle soit sous-diagnostiquée

puisqu’elle est souvent asymptomatique. En effet, seulement une minorité ressent

des symptômes comme de la douleur, des démangeaisons, une sensation de

brûlure ou encore un enflement des muqueuses. Plusieurs facteurs étiologiques

sont associés à la stomatite prothétique, quoiqu’elle demeure encore mal

comprise. Un traumatisme des muqueuses causé par à une prothèse dentaire mal

ajustée, une xérostomie, ainsi qu’une hygiène buccale et prothétique déficiente

sont souvent identifiés. Également, lorsque la prothèse est portée de nuit, la

formation de biofilm ainsi que la diminution du flux salivaire empêchent

l’oxygénation optimale des muqueuses, ce qui diminue la résistance de l’hôte à

l’invasion par les microorganismes buccaux. À cet égard, il est souvent rapporté

dans la littérature que C. albicans est un facteur étiologique important de cette

affection, puisqu’il s’agit du microorganisme le plus souvent isolé des personnes

atteintes. De plus, les biofilms de C. albicans sont capables d’adhérer autant à des

substances organiques et inorganiques, comme les muqueuses buccales et les

prothèses dentaires [20–23].

1.3) Mucites buccales

Les mucites, également appelées mucosites, sont des stomatites qui entraînent

une inflammation des muqueuses oropharyngées souvent accompagnée d’une

douleur et parfois d’ulcérations (figure 1) [24]. Elles sont, pour la plupart,

considérées comme un effet secondaire chez les patients recevant des traitements

de chimiothérapie [25,26]. Les personnes souffrant d’un cancer dans la région de la

tête et du cou en sont pratiquement toutes atteintes; environ 89 % des patients

traités par chimiothérapie combinée avec de la radiothérapie, et 40 % des patients

traités par chimiothérapie uniquement [27]. Les caractéristiques de la mucite

4

peuvent différer dans le cas où le patient ne recevrait qu’un seul des deux

traitements [28]. La chimiothérapie est administrée de façon systémique alors que la

radiothérapie agit localement sur une zone précise, ce qui peut impliquer des voies

biologiques légèrement différentes. Aussi, l’incidence des mucites peut augmenter

de façon significative au cours des différents cycles de traitements puisque ses

effets sont cumulatifs [26].

La mucite peut résulter de deux types d’agressions différentes. La première est

l’agression directe sur les cellules des muqueuses par des agents cytotoxiques,

comme les anticancéreux, incluant l’irinotécan [29,30], le fluorouracil [31] ou le

panitumumab, un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique

(EGF) [24,32]. Le deuxième type d’agression, cette fois-ci indirect, est dérivé de la

neutropénie et de la surinfection locale par des agents viraux, fongiques ou

bactériens [24]. Ces patients, immunodéprimés et affaiblis par ces traitements

toxiques, sont plus susceptibles de voir la stomatite primaire infectée par un agent

pathogène opportuniste, dont C. albicans. Les symptômes de la mucite sont très

variables. Certains patients pourraient ne présenter aucun signe clinique alors que

d’autres peuvent ressentir des sensations de brûlure, de picotement ou encore une

altération du goût [33]. L’Organisation mondiale de la santé a mis au point une

échelle de classification des mucites buccales qu’elle a répartie en 5 catégories [34].

Tableau 1. Échelle de classification des mucites buccales selon l’Organisation mondiale de

la santé [34]

Grade Critères

0 Aucune mucite

1 Érythème et douleur

2 Ulcère; capacité à manger solide

3 Ulcère; nécessite un régime liquide

4 Ulcère; alimentation non possible

Cette classification est la plus largement utilisée et se base sur la présence de

lésions, le seuil de douleur ainsi que la capacité du patient à s’alimenter. Plus le

grade est élevé, plus le patient souffrira de la présence des ulcères et plus il aura

5

de la difficulté à s’alimenter. Cette échelle permet entre autres de diriger les

cliniciens vers les traitements pour une prise en charge optimale.

1.3.1) Pathogenèse de la mucite buccale

À l’état d’homéostasie, la muqueuse se renouvelle constamment. Les cellules

basales produisent de nouvelles cellules qui migrent vers le haut pour aller

remplacer celles se trouvant au niveau de la couche superficielle. La durée de ce

remplacement varie entre 5 et 14 jours.

Lorsque le patient entreprend les traitements de chimiothérapie ou de

radiothérapie, la première phase de la pathogenèse s’enclenche. Les agents

anticancéreux ciblent principalement les cellules à division rapide, c’est-à-dire

autant les cellules cancéreuses que les cellules épithéliales. Ces dommages

directs à l’acide désoxyribonucléique (ADN) provoquent la mort cellulaire, soit

mitotique ou apoptotique, ce qui empêche l’épithélium de se renouveler [35]. Ainsi,

la muqueuse buccale s’amincit lentement, ce qui mènera, à terme, à l’ulcération

des tissus [36,37].

La phase d’initiation est également caractérisée par un stress oxydatif causé par la

production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) [38]. La chimiothérapie, la

radiothérapie ainsi que le stress oxydatif amorcent alors une série de cascades de

signalisations que l’on appelle la phase de réponse primaire (phase II). Les ROS

induisent la transcription de plusieurs facteurs cruciaux dans la réponse

inflammatoire, comme le facteur nucléaire-κB (NF-κB) ainsi que le Signal

transducer and activator of transcription 3 (STAT3), tous deux associés à

l’activation de gènes codant pour des cytokines inflammatoires menant à des

dommages tissulaires [35,38]. Physiologiquement, les deux premières phases de la

pathogenèse de la mucite ont des effets quasi immédiats, alors que les signes

cliniques peuvent prendre de quatre à cinq jours avant de faire leur apparition [35].

La phase III, l’amplification, est directement liée à la précédente. De nombreuses

molécules impliquées dans la réponse primaire ont une capacité de rétroaction

6

positive et négative et peuvent ainsi influencer la réponse tissulaire. Les cellules du

système immunitaire libèrent des médiateurs inflammatoires tels que le facteur de

nécrose tumorale alpha (TNF-α), qui peut amplifier l’activation de NF-κB et initier

d’autre voie, de signalisation ce qui déclenche une cascade inflammatoire et un

effet boule de neige [36,39].

L’accumulation de tous ces facteurs entraîne finalement la phase la plus critique

autant pour le patient que son clinicien. La phase d’ulcération résulte en un bris de

la barrière épithéliale. C’est la phase la plus symptomatique. Les ulcères peuvent

traverser l’épaisseur complète de l’épithélium. De plus, la salive, qui joue des rôles

essentiels dans la protection des tissus oraux par ses propriétés antibactériennes

et antifongiques, voit son débit diminué par les traitements du cancer [36,40,41]. La

variété de la flore microbienne additionnée à l’immunodéficience des patients

provoque fréquemment l’infection des plaies par des microorganismes

pathogènes, comme la levure opportuniste C. albicans.

Figure 1. Pathogenèse de la mucite buccale. Image adaptée de Sonis (2004) [42]

7

1.4) Traitements

Les traitements des candidoses buccales sont basés sur l’utilisation

d’antifongiques topiques ou systémiques et doivent être prescrits par le clinicien.

Les patients asthmatiques qui utilisent des inhalateurs de cortisone peuvent se

rincer la bouche après l’inhalation ou encore protéger les muqueuses pendant le

traitement pour éviter que les muqueuses soient exposées trop longtemps aux

corticoïdes. Pour les stomatites prothétiques infectées par C. albicans, des

mesures strictes d’hygiène doivent être instaurées (nettoyage mécanique et

chimique de la prothèse et de la bouche). De plus, éviter le port de la prothèse la

nuit et l’utilisation de solutions de trempage nettoyantes et désinfectantes est

recommandée. Un ajustement adéquat de la prothèse ou encore le remplacement

d’une vieille prothèse par une nouvelle peut également être suggéré si l’atteinte

aux muqueuses était due à celles-ci [21].

Les traitements actuels contre les mucites portent beaucoup sur la prévention et le

soulagement des symptômes. Une hygiène buccale stricte avec une brosse douce,

l’évitement du tabac, des boissons alcoolisées ou acides et des mets épicés ainsi

que l’implantation de rinçages avec des solutions douce (eau pure, solution

physiologique, solutions de bicarbonate de soude) sont fortement suggérés.

Pendant les traitements, la prise de bains de bouche glacée ou l’usage de la

cryothérapie peut induire la vasoconstriction et ainsi diminuer le risque d’exposition

de la muqueuse aux agents toxiques. Concernant la prise en charge de la douleur,

les cliniciens peuvent avoir recours entre autres à des antalgiques topiques

(lidocaïne, morphine) et au laser à basse énergie. D’autres agents peuvent être

également administrés pour protéger au niveau cellulaire, ainsi que pour stimuler

la régénération des muqueuses [24,36,43,44]. C’est lorsque la mucite devient infectée

notamment par C. albicans que le traitement devient plus complexe.

Les molécules thérapeutiques les plus utilisées sont font partie de la classe des

polyènes, comme le nystatin et l’amphotéricine B, et de la classe des azoles,

comme le fluconazole. Les polyènes se lient de façon irréversible à l’ergostérol de

la membrane cellulaire de la levure, ce qui provoque la création de pores dans

8

celle-ci. L’intégrité de la membrane est ainsi perturbée et entraîne la mort du

microorganisme. Les molécules de la classe des azoles agissent quant à elles sur

une enzyme du cytochrome P-450, ce qui empêche la synthèse de l’ergostérol,

une composante essentielle de la membrane cellulaire [45–48]. Cependant,

l’utilisation de ces agents antifongiques s’avère de moins en moins efficace, en

raison de l’émergence d’un grand nombre de mécanismes de résistance face à

ces molécules [49,50].

2) Muqueuse buccale et jonctions serrées

La muqueuse buccale protège les tissus sous-jacents des dommages physiques,

chimiques et microbiens et contribue ainsi activement au maintien d’une santé

bucco-dentaire. Outre son rôle protecteur des tissus, on lui attribue également des

fonctions gustatives et sensorielles. Elle est composée d’un épithélium malpighien

(pavimenteux stratifié) plus ou moins kératinisé selon sa localisation, avec un tissu

conjonctif nommé lamina propria ou encore chorion. La lamina propria est

constituée de cellules, de vaisseaux sanguins et de nerfs [51]. Sur la surface

externe des lèvres, le dos de la langue, la gencive et le palais dur, on retrouve un

épithélium kératinisé [52]. La plus large partie de la muqueuse buccale est la

muqueuse bordante, qui revêt entre autres les joues, le palais mou et la face

ventrale de la langue et qui n’est pas kératinisée [53,54]. L’épithélium buccal se

renouvelle constamment. Les cellules basales se divisent puis se différencient et

migrent vers le haut du tissu, comme une rotation ou communément appelé en

anglais « turnover ». Le temps que nécessite cette rotation est différent selon la

région et diffère si l’épithélium est kératinisé ou non; l’épithélium kératinisé prenant

plus de temps [55]. Certains éléments comme la chimiothérapie ou la radiothérapie

peuvent interférer dans ce renouvellement cellulaire. Ce type de traitement

anticancéreux diminue grandement ce processus, ce qui provoque et fragilise la

muqueuse. Les jonctions serrées scellent les cellules épithéliales entre elles et

assurent une étanchéité. Celles-ci délimitent la frontière entre le domaine

membranaire apicale et basolatérale. On y retrouve entre autres les protéines

nommées claudines et occludines. Ces deux dernières molécules permettent le

9

rapprochement des deux membranes. Elles constituent une barrière semi-

perméable au transport paracellulaire d’ions, de soluté et d’eau [56,57]. Elles sont

dynamiques et changent de formes constamment selon ses interactions avec

différents stimuli internes et externes comme les cytokines ou les

microorganismes [58]. Certains agents pathogènes comme C. albicans peuvent

altérer l’intégrité de ces jonctions, ce qui contribue au phénomène d’invasion

tissulaire [59].

3) Candida albicans

3.1) Généralités

C. albicans est une levure présente dans la flore normale humaine. On la retrouve

chez 45-65% des enfants sains et 30-55% des adultes sains [60]. Tel que mentionné

plus tôt, ce mycète commensal peut exprimer une virulence lors d’un changement

chez l’hôte, comme une prise d’antibiotique, un changement nutritionnel, ou encore

chez les patients immunocompromis. C. albicans est le mycète le plus souvent

impliqué dans les infections fongiques chez l’humain. Sa pathogénicité peut

s’expliquer par ses nombreux facteurs de virulence et sa polyvalence.

Figure 2. Candida albicans. Image de Colm (n.d.) [61]

3.2) Facteurs de virulence

Comme tout agent pathogène, C. albicans possède un vaste éventail de

mécanismes lui permettant de coloniser et d’infecter son hôte. Son

polymorphisme, sa capacité d’adhésion à différentes surfaces, la sécrétion de

10

protéases et d’hydrolases et la formation d’un biofilm font partie des facteurs de

virulence les plus importants de cette levure [62].

3.2.1) Dimorphisme

C. albicans est une levure polymorphe, c’est-à-dire qu’elle croît sous plusieurs

formes : la forme de levure bourgeonnante ovoïde, l’ellipsoïde allongé (pseudo-

hyphe) ainsi que la forme d’hyphe parallèle. [63]. Le rôle précis de chacune des

formes dans la virulence est encore en exploration. Malgré le fait qu’il y ait

présence des deux formes du mycète lors des infections, il est reconnu que C.

albicans est plus virulent sous sa forme hyphe [64]. La capacité d’adhésion,

d’invasion, ainsi que les dommages causés aux cellules épithéliales ont tous été

observés comme étant plus importants lorsque C. albicans était sous sa

morphologie d’hyphes [63,65,66].

3.2.2) Formation de biofilms

Les biofilms consistent en un agrégat de microorganismes enveloppés d’une

matrice polymérique composée d’exopolysaccharides, d’acides nucléiques ainsi

que de protéines [67]. Plusieurs agents pathogènes, tel C. albicans, ont la capacité

de former des biofilms sur plusieurs types de surfaces : abiotiques comme sur des

prothèses dentaires, des cathéters, ou des valves cardiaques, et biotiques telles

que les cellules épithéliales [68]. La National Institutes of Health estime qu’environ

80 % de toutes les infections microbiennes seraient causées directement ou

indirectement par la présence de biofilm [9].

De façon simplifiée, la formation de biofilm peut se résumer en trois étapes. La

première étant l’adhérence des premières cellules planctoniques à une surface.

Ensuite, les cellules prolifèrent et s’agrègent entre elles pour former une couche de

base où s’ancreront les petites colonies (agrégats de cellules planctoniques).

Finalement, il y aura production de la matrice extracellulaire qui viendra encapsuler

et assurer la protection des cellules de C. albicans [69]. Les infections associées

aux biofilms sont plus fastidieuses à traiter que lorsque les microorganismes sont

sous leur forme planctonique, puisqu’ils ont une architecture complexe, une

11

expression accrue des pompes à efflux résultant en une résistance aux

antibiotiques et aux antifongiques, ainsi qu’une souplesse métabolique [68,70]. De

plus, puisque les biofilms agissent comme une communauté complexe,

l’expression des gènes varie également. Ainsi, plusieurs gènes associés à ceux-ci

se retrouvent exprimés, comme les gènes impliqués dans l’adhésion, la résistance

aux antimicrobiens, ainsi que la dispersion des cellules [71]. La dispersion des

cellules de levures provenant d’un biofilm mature a d’ailleurs été démontrée

comme étant directement liée à la virulence. La protéine de choc thermique (HSP)

Hsp90 a été récemment identifiée comme étant un élément clé dans la régulation

de la dispersion des cellules du biofilm de C. albicans. De plus, cette protéine est

également requise dans la résistance aux antifongiques des biofilms [72].

3.2.3) Activité hydrolytique

C. albicans utilise deux différents mécanismes pour envahir les tissus hôtes :

l’endocytose induite ainsi que la pénétration active [73]. L’endocytose est perpétuée

par des protéines spécialisées nommées invasines exprimées à la surface des

levures et servant de médiateurs afin de les lier aux cellules hôtes. C’est ce qui

déclenche l’engloutissement du pathogène à l’intérieur de l’hôte. Deux invasines

ont été identifiées comme jouant un rôle important, soit l’agglutinin-like protein 3

precursor (ALS3), qui jouait également le rôle d’adhésine, ainsi que Ssa1, qui fait

partie de la famille des heat shock protein 70 (Hsp70) [73,74]. De plus, C. albicans a

la capacité de sécréter des hydrolases, qui sont reconnues pour faciliter la

pénétration active dans les cellules qu’il envahit. Trois classes d’hydrolases sont

connues à ce jour : les protéases, les phospholipases et les lipases [75]. Les plus

importantes sont les aspartyls protéases sécrétées (SAPs), qui regroupent 10

membres, soit SAP1 à SAP10. Leurs rôles inclus entre autres l’invasion des tissus

et l’évasion de la réponse immunitaire. Dans un contexte d’invasion, ce sont les

SAPS 1-6 qui jouent un rôle prédominant [7,75,76].

3.2.4) Interactions de C. albicans avec les cellules épithéliales

C. albicans possède à sa surface un ensemble de protéines nommées adhésines,

qui confèrent un pouvoir d’adhérence aux autres microorganismes, à des surfaces

12

abiotiques ainsi qu’aux cellules de l’hôte [70,72]. Les plus étudiées sont les

agglutinin-like sequence (ALS), une famille de 8 protéines, soit les ALS1-7 et la

ASL-9. Particulièrement importante, la protéine ALS-3 joue un rôle déterminant

dans l’adhésion; elle est d’ailleurs surexprimée lors d’infections buccales [77]. Une

autre adhésine importante est appelée Hyphal wall protein 1 (Hwp1). Elle sert de

substrat pour les transglutaminases des mammifères et cette réaction peut lier de

manière covalente les hyphes de C. albicans aux cellules hôtes. D’ailleurs,

quelques études ont conclu qu’une mutation de cette protéine réduisait l’adhérence

aux cellules épithéliales buccales en plus d’atténuer la virulence dans un modèle

de souris [78–80]. De plus, Hpl1 ainsi que ALS-3 ont aussi été identifiées comme des

contributeurs à la formation du biofilm de C. albicans [81].

Les cellules épithéliales de la muqueuse buccale sont la première ligne de défense

contre C. albicans. Malgré le large éventail de réactions biochimiques qui reste à

élucider, plusieurs mécanismes de défense ont été observés. La détection par

l’hôte de la présence de C. albicans est médiée par les récepteurs de

reconnaissance de motifs moléculaires (PRRs) tels que le récepteur de mannose

(MR) et les récepteurs toll-like (TLR) 2 et 4, entre autres. Ce sont les motifs

moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) comme les mannans, ou les β-

glucans qui vont venir lier les PRRs. Cela permet le l’activation de plusieurs

mécanismes de signalisation cellulaire tels que le mitogen-activated protein kinase

(MAPK), le NF-κB, et phosphoinositide 3-kinase (PI3K). La voie PI3K est impliquée

dans la protection contre le dommage induit par les hyphes. Les hyphes et les

levures activent chacune les 3 voies MAPK (p38, c-Jun N-terminal kinase [JNK],

extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2 [ERK1/2]), en plus des voies

NF-κB et PI3k. Or, à l’instar des levures, les hyphes induisent la transcription d’une

protéine nommée c-Fos, en plus d’activer MAPK phosphatase 1 (MKP1) depuis la

ERK1/2. C’est la combinaison entre c-Fos et MKP1 qui mène à la libération des

cytokines inflammatoires (Figure 3) [82,83].

Comme C. albicans est généralement faiblement virulent lorsqu’il est sous la forme

de levures, cette dernière est reconnue par le système immunitaire sans toutefois

13

déclencher de fortes réactions inflammatoires, à l’instar de la forme hyphe [82]. Un

autre joueur clé dans la réponse immunitaire des cellules épithéliales à C. albicans

est la production de peptides antimicrobiens (β-défensines), qui aident à combattre

l’infection fongique, déclenchent d’autres réponses immunitaires, et participent à la

réparation de la barrière épithéliale. [82–85].

Figure 3. Schéma représentant les différentes voies de signalisation déclenchées par les

deux morphologies de C. albicans. Image adaptée de Naglik et al. (2014) [82]

4) Cannelle et ses composantes

4.1) Généralités

La cannelle est utilisée depuis des lustres dans de multiples domaines. On en

trouve plusieurs références dans la Bible et les Égyptiens l’utilisaient dans leur

processus d’embaumement. En médecine traditionnelle, la cannelle était utilisée

comme antiémétique, antidiarrhée ainsi que comme antiflatulence. Aujourd’hui, on

connaît la cannelle principalement pour son goût ainsi que son odeur distinctive

utilisée en cuisine et en aromathérapie [86]. C’est la partie intérieure de l’écorce qui

est utilisée pour aromatiser les plats, mais elle sert également, avec les feuilles et

les racines, à produire les multiples huiles essentielles de cannelle.

14

4.2) Genre Cinnamomum

Le genre Cinnamomum fait partie de la famille des Lauraceae. Il s’agit d’arbres et

d’arbustes chez lesquels les feuilles, les rameaux et l’écorce sont gorgés de

molécules aromatiques [87]. L’espèce la plus connue est Cinnamomum verum,

aussi appelée Cinnamomum zeylanicum ou cannelier de ceylan. C’est l’écorce de

cette espèce précise qui donne la cannelle « authentique ». Deux autres espèces

sont également utilisées en cuisine, soit Cinnamomum cassia, aussi appelée

cannelle de Chine, qui produit la casse et Cinnamomum burmannii, dont l’écorce

est aussi vendue sous le nom de cannelle, de moindre qualité cependant [87].

4.3) Huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des substances aromatiques que l’on retrouve

naturellement dans différentes parties des arbres, des plantes et des épices. Elles

sont concentrées et très volatiles. Elles ont différentes utilisations telles qu’en

aromathérapie, en cosmétique, en médecine traditionnelle et plusieurs autres.

Chaque huile essentielle est reconnue pour avoir ses propres propriétés [88], mais il

est connu qu’une multitude d’huiles essentielles possèdent des activités

antimicrobiennes [89]. Dans le cadre de ce projet, deux huiles essentielles seront

utilisées. L’huile essentielle de l’écorce ainsi que celle provenant des feuilles de

cannelle provenant de l’espèce Cinnamomum verum sera utilisée.

Comme ces huiles sont des composés concentrés contenant plusieurs molécules

différentes, les substances présentes en plus grande proportion dans ces huiles

seront également utilisées. Plus spécifiquement, l’écorce de cannelle contient

majoritairement une substance nommée cinnamaldéhyde, composée d’un anneau

de benzène rattaché à trois chaînes de carbones, alors que ses feuilles

contiennent principalement de l’eugénol, constitué d’un groupement hydroxyle,

d’un groupement méthoxyle rattaché à son anneau, et qui sont tous deux des

phénylpropanoïdes [90]. L’eugénol est d’ailleurs retrouvé en grande concentration

dans le clou de girofle. Des études in vivo et in vitro réalisées sur des sujets

humains et des animaux ont largement démontré des bénéfices anti-

15

inflammatoires, antimicrobiens et réducteurs de maladies cardiovasculaires de la

cannelle et de ses composés chimiques [91–93].

4.4) Polyphénols

Les polyphénols sont une classe de molécules présentes dans d’innombrables

substances végétales. Ils ont tous en commun la présence d’un ou de plusieurs

noyaux benzéniques incluant des fonctions hydroxyles. Ils sont présents en grande

quantité dans notre alimentation et sont reconnus comme d’excellents

antioxydants. Les proanthocyanidines, une classe de flavonoïdes, sont des

oligomères de flavon-3-ol ou des polymères liés par des liaisons interflavones. Les

proanthocyanidines de cannelle ont déjà démontré des bénéfices au niveau du

contrôle de l’hypertension et du taux glycémie [94]. Ils sont également reconnus

pour leurs propriétés anti-inflammatoires, en inhibant la voie de signalisation NF-

κB [92]. De plus, les proanthocyanidines de la cannelle ont démontré des activités

antimicrobiennes vis-à-vis certaines bactéries telles que Bacillus cereus et

Staphylococcus aureus [92]. Les polyphénols de la cannelle, plus précisément la

Cinnulin PFTM qui sera utilisée dans le cadre de ce projet, a également démontré

des bénéfices dans divers champs de la santé comme dans le contrôle du taux de

sucre dans le sang, dans la régulation des hormones féminines, ou encore dans la

santé gastro-intestinale [95].

5) Propriétés bénéfiques des polyphénols et huiles essentielles

dans le contexte de la santé buccodentaire

L’intérêt scientifique pour ces molécules dérivées des plantes et des fruits est

certainement grandissant dans plusieurs domaines de la santé, comme la nutrition.

De nombreuses équipes de recherche se penchent sur les bienfaits d’une

consommation régulière de ces composés. Dans le domaine buccodentaire, les

effets recensés touchent divers aspects des maladies qui affectent la cavité

buccale, notamment la protection des muqueuses dans le cas d’un cancer, la

diminution de l’halitose, la protection contre les caries, contre les biofilms et plus

encore [96–99]. D’innombrables études et revues de littérature ont clairement

16

démontré que les huiles essentielles et les polyphénols pouvaient être non

seulement utiles dans la gestion de la santé buccodentaire, mais également dans

la santé globale.

5.1) Candidose buccale

Divers extraits de plantes (polyphénols ou huiles essentielles) se sont avérés

efficaces sur plusieurs des facteurs de virulence de C. albicans. Une inhibition de

la croissance de C. albicans a été démontrée à l’aide de la technique de

microdilution en plaque utilisant entre autres les huiles essentielles d’origan

(Origanum vulgare), de sarriette (Satureja montana), de menthe (Mentha piperita)

et de lavande (Lavandula angustifolia) [100,101]. L’huile essentielle de lavande ainsi

que des fractions de la réglisse ont également démontré qu’à basse concentration,

la formation du tube germinatif dans le processus d’élongation en hyphes était

inhibée. Ce qui permet de considérer que ces composés pourraient être utiles

contre le dimorphisme de C. albicans [100,102]. Une autre étude a cette fois-ci établi

l’efficacité des proanthocyanidines de canneberges sur certains facteurs de

virulence de C. albicans, comme la croissance, la formation de biofilm et

l’adhérence de la levure aux cellules épithéliales buccales ainsi qu’à des disques

d’acrylique (pour simuler le port de prothèses dentaires). Cette étude a également

apporté des évidence que les polyphénols de canneberges pourraient s’avérer

utiles dans le contrôle de l’inflammation des muqueuses buccales causé par

C. albicans [103].

5.2) Carie dentaire

La carie dentaire est une maladie d’origine infectieuse qui détruit progressivement

les tissus durs (l’émail, puis la dentine) de la dent et qui, lorsque non traitée, mène

à l’inflammation de la pulpe dentaire et ultimement à sa nécrose. Ces lésions

peuvent causer de vives douleurs chez les personnes atteintes. Pour qu’une carie

se forme, trois facteurs sont requis : des bactéries dites cariogènes, des sucres

fermentescibles, et bien entendu une dent. Le quatrième facteur est le temps;

c’est-à-dire que les bactéries doivent rester en place suffisamment longtemps pour

17

qu’elles puissent se nourrir et produire de l’acide [104]. Certaines personnes, en

dépit d’une bonne hygiène buccale, peuvent être plus sujettes à développer des

caries, que ce soit en raison d’une dominance de bactéries cariogènes présente

dans leur flore buccale normale, ou d’un manque de salivation. Effectivement, pour

deux personnes ayant la même l’hygiène buccale ainsi que la même alimentation,

certaines sont plus à risque de développer des caries [105]. Cela amène un intérêt

des professionnels du domaine à identifier les effets préventifs que pourraient

apporter les polyphénols et les huiles essentielles sur le développement des

caries. Une étude en Thaïlande a testé quelques huiles essentielles (le basilic

doux [Ocimum basilicum], l’écorce de cannelle [C. zeylanicum], le fenouil doux

[Foeniculum vulgare], le poivre noir [Piper nigrum] et la menthe poivrée [Mentha

piperita] sur les bactéries cariogènes Streptococcus mutans et Lactobacillus casei.

Wiwattanarattanabut et al. ont démontré que l’ensemble des huiles choisies avait

un effet antimicrobien sur les deux bactéries. De plus, ils ont établi que jusqu’à

80 % de la formation du biofilm de S. mutans était atténuée, particulièrement avec

l’huile de cannelle [106]. D’autres études se sont penchées sur l’adhérence des

bactéries cariogènes, processus déterminant dans le développement des caries.

La quercétine par exemple, un flavonoïde, a réduit l’adhérence de S. mutans [107].

5.3) Maladies parodontales

Les maladies parodontales sont des maladies infectieuses caractérisées par une

inflammation des tissus de soutien de la dent [108]. Il est estimé qu’une très grande

majorité des adultes souffre d’une parodontite faible ou modérée, mais qu’une

proportion d’environ 5 % à 20 % est touchée par ce problème de façon plus

sévère [109]. Bien que ce soit des maladies causées par de multiples facteurs, les

biofilms jouent un rôle déterminant [110]. La forme mineure, la gingivite, peut-être

renversée par une amélioration de l’hygiène buccale alors que la forme la plus

sévère (parodontite) ne peut être totalement résorbée. Si non traitée, la parodontite

chronique mène à la destruction des tissus parodontaux et de l’os alvéolaire, à la

perte des dents et jusqu’à des complications systémiques comme des troubles

cardiovasculaires, des accouchements prématurés, de l’arthrite rhumatoïde et des

18

infections respiratoires [111–113]. Les destructions tissulaires sont le résultat de

l’activation de la réponse immuno-inflammatoire de l’hôte par les

lipopolysaccharides (LPS) des bactéries parodontopathogènes comme

Porphyromonas gingivalis et Fusobacterium nucleatum [109–111]. En réponse à la

stimulation par des bactéries parodontopathogènes, les cellules épithéliales et les

fibroblastes buccaux peuvent sécréter des cytokines pro-inflammatoires telles que

l'interleukine-6 (IL-6) et l'interleukine-8 (IL-8) [109]. Ces bactéries peuvent également

stimuler les macrophages et induire la sécrétion d’interleukine-1β (IL-1 β), IL-6 et

du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) par les macrophages [111]. Outre les

facteurs directs résultants des interactions hôtes–pathogènes, des causes

psychologiques ont également été mises en lumière et suspectées d’augmenter

les risques de parodontites. Des études ont effectivement montré une prévalence

plus élevée de la parodontite sévère chez les individus souffrant de stress

psychologique [108]. Une étude canadienne a évalué l’impact des polyphénols de

bleuets (Vaccinium angustifolium Ait.) sur une des bactéries jouant un rôle crucial

dans les maladies parodontales, soit F. nucleatum [114]. Les auteurs ont démontré

que ces polyphénols arrivaient à inhiber de 87 % la formation de biofilm et que ces

molécules possédaient un effet antibactérien en inhibant la croissance de la

bactérie, probablement par sa capacité à chélater le fer. Dans un modèle de

macrophages humains, les polyphénols de bleuets ont également inhibé

l’activation de la voie NF-κB, une voie de signalisation associée à l’inflammation

ainsi qu’à l’apoptose cellulaire, et à réduire la sécrétion de l’IL-1β, de TNF-α, et de

l'IL-6 induite par F. nucleatum, des médiateurs de l’inflammation [114].

5.4) Halitose

L’halitose est ce que l’on appelle communément la mauvaise haleine, soit le fait

d’avoir une haleine dégageant une odeur désagréable. Il existe plusieurs causes

possibles à l’halitose, comme une pauvre hygiène buccale, une inflammation des

gencives (maladies parodontales), un désordre du tractus gastro-intestinal ou

encore l’alcool et le tabac [115]. La xérostomie, une sécheresse de la bouche

causée par une diminution du flux salivaire, peut également être un facteur

19

contribuant à l’halitose. La xérostomie peut être un symptôme d’une maladie ou

encore un effet secondaire lié à la prise de certains médicaments [116,117]. Lorsque

le problème est d’origine bactérienne, Solobacterium moorei, une bactérie Gram

positif anaérobie stricte, est le plus souvent impliquée. S. moorei produit du sulfure

d’hydrogène, un gaz issu de la dégradation de protéines et responsable en partie

de l’odeur incommodante [118]. Les propriétés anti-S. moorei de

l’épigallocathéchine-3-gallate (EGCG), un composé du thé vert, ont été récemment

rapportées [119]. L’EGCG a démontré des effets sur la formation du biofilm de

S. moorei, ainsi que sur sa capacité d’adhérence aux cellules épithéliales

buccales. De plus, il a également diminué de façon dose dépendante l’activité de

la β-galactosidase, une enzyme clé dans la cascade menant à la production de

composés sulfurés à partir de glycoprotéines. Des résultats semblables ont

également été rapportés en regard de l’huile essentielle de cannelle [120].

20

6) Hypothèse et objectifs

6.1) Hypothèse

L’hypothèse de ce projet est que les composantes de la cannelle (huile essentielle,

proanthocyanidines) auraient un effet antifongique sur C. albicans, en plus

d’atténuer ses propriétés pathogéniques et d’exercer un effet protecteur sur les

cellules épithéliales de la muqueuse buccale.

6.2) Objectifs

1. Démontrer l’effet de composantes de la cannelle sur la croissance et le biofilm de

C. albicans.

2. Évaluer l’impact de composantes de la cannelle sur l’adhérence de C. albicans aux

cellules épithéliales buccales.

3. Déterminer l’activité de composantes de la cannelle sur la sécrétion de cytokines

pro-inflammatoires induite par le TNF-α chez les cellules épithéliales buccales.

4. Étudier l’effet de composantes de la cannelle sur l’intégrité de la barrière

épithéliale buccale.

21

Chapitre 1 Effects of cinnamon bark fractions on

Candida albicans and oral epithelial cells

Résumé

Candida albicans est un agent pathogène opportuniste pouvant causer des

infections superficielles ou systémiques chez les individus immunologiquement ou

médicalement compromis. Nous avons étudié les effets de deux fractions d’écorce

de cannelle, à savoir une huile essentielle et un extrait aqueux enrichi en

proanthocyanidines (Cinnulin PF®) sur la croissance, la formation de biofilms et

sur les propriétés d’adhérence de C. albicans. Nous avons également utilisé un

modèle de cellules épithéliales buccales pour étudier les effets des deux fractions

sur l'intégrité de la barrière épithéliale et la réponse inflammatoire. Bien que la

Cinnulin PF® n'ait pas réduit la croissance de C. albicans, l'huile d'écorce de

cannelle présentait une activité antifongique élevée, avec des valeurs de CMI et de

CMF comprises entre 0,039 % et 0,078 % (v/v). L'huile de cannelle était également

active contre le biofilm préformé de C. albicans. La capacité de l'huile de cannelle

à perturber la membrane cellulaire de C. albicans pourrait expliquer son activité

fongicide. Fait intéressant, la Cinnulin PF® a empêché la formation de biofilm par

C. albicans et a atténué son adhérence aux cellules épithéliales buccales. À leurs

concentrations efficaces, l'huile de cannelle et la Cinnulin PF® ne présentaient

aucune cytotoxicité significative vis-à-vis les cellules épithéliales buccales. Dans

un modèle in vitro, les deux fractions de cannelle ont renforcé l’intégrité de la

barrière épithéliale buccale, tel que démontré par une augmentation de la

résistance électrique transépithéliale. Enfin, la Cinnulin PF® a inhibé la sécrétion

d'interleukine-6 et d'interleukine-8 par les cellules épithéliales buccales stimulées

par le facteur de nécrose tumorale α. En conclusion, les deux fractions de cannelle

étudiées dans la présente étude pourraient être des agents thérapeutiques

prometteurs pour traiter les infections à C. albicans.

22

Abstract

Candida albicans is an opportunistic pathogen that can cause superficial or

systemic infections in immunologically or medically compromised individuals. We

investigated the effects of two cinnamon bark fractions, i.e., an essential oil and an

aqueous extract enriched in proanthocyanidins (Cinnulin PF®) on the growth,

biofilm formation, and adherence properties of C. albicans. We also used an oral

epithelial cell model to study the effects of the two fractions on the integrity of the

epithelial barrier and the inflammatory response. Although Cinnulin PF® did not

reduce the growth of C. albicans, the cinnamon bark oil exhibited high antifungal

activity, with MIC and MFC values in the range of 0.039% to 0.078%. The

cinnamon oil was also active against a pre-formed C. albicans biofilm. The ability of

cinnamon oil to perturb the C. albicans cell membrane may explain its fungicidal

activity. Interestingly, Cinnulin PF® prevented biofilm formation by C. albicans and

attenuated its adherence to oral epithelial cells. At their effective concentrations,

the cinnamon oil and the Cinnulin PF® displayed no significant cytotoxicity against

oral epithelial cells. In an in vitro model, both cinnamon fractions reinforced the

integrity of the oral epithelial barrier as determined by an increase in transepithelial

electrical resistance. Lastly, Cinnulin PF® inhibited the secretion of interleukin-6

and interleukin-8 by oral epithelial cells stimulated with tumor necrosis factor-α. In

conclusion, the two cinnamon fractions investigated in the present study may be

promising therapeutic agents for treating C. albicans infections.

23

Effects of cinnamon bark fractions on Candida albicans and oral

epithelial cells

.Marie-Pier Veilleux and Daniel Grenier*

Oral Ecology Research Group, Faculty of Dentistry,

Université Laval, Quebec City, QC, Canada

* Corresponding author: Oral Ecology Research Group, Faculty of Dentistry,

Université Laval, 2420 Rue de la Terrasse, Quebec City, QC, Canada, G1V 0A6

Telephone: 418-656-7341. Fax: 418-656-2861. E-mail:

Daniel.Grenier@greb.ulaval.ca

Keywords: Biofilm, Candida albicans, candidiasis, cinnamon, cytokine, epithelial

barrier, essential oil, epithelial cells, oral mucositis, polyphenols

24

1) Introduction

Candida albicans is a commensal fungus that colonizes oral mucosal surfaces and

that is normally harmless in healthy individuals as it is maintained at low levels by

specific and non-specific salivary and mucosal defense mechanisms as well as by

competitive inhibition by oral bacteria [1]. However, under certain circumstances,

this opportunistic microorganism can cause a superficial infection called

candidiasis. Oral candidiasis is characterized by the appearance of white plaques

on inflamed and red mucosa (inner cheeks, tongue, throat) and by pain when

eating or swallowing [1, 2]. If the infection becomes invasive, which can occur in

immunologically and medically compromised individuals, it can cause septicemia

leading to organ failure and eventually death [3]. C. albicans has also been

reported to infect oral mucositis lesions [4, 5], causing inflammation of the

oropharyngeal mucosa [6, 7]. Patients who suffer from cancer affecting the head

and neck and who receive chemotherapy and radiotherapy treatments are almost

all affected by oral mucositis [6, 7].

C. albicans produces several virulence factors that play critical roles in the

pathogenic process leading to superficial or systemic infections [8]. The cell

surface adhesins of C. albicans allow initial adhesion to oral epithelial cells, a key

step prior to subsequent tissue invasion and damage [8-10]. C. albicans can form

biofilms on biotic and abiotic oral surfaces, which is key to enabling the fungus to

accumulate in large amounts and to protecting it from antimicrobial agents and the

host immune system [2, 11, 12]. Additional virulence factors produced by C.

albicans include its ability to switch from the yeast form to an invasive hyphae

morphotype and to secrete proteolytic and lipolytic enzymes [8]. These pathogenic

determinants may be potential targets for new antifungal agents that may limit the

appearance of strains resistant to conventional antifungals.

Despite the availability of antifungal agents to treat C. albicans-associated oral

infections, treatment failures are increasingly common due to the emergence of

resistant strains [13-15]. Given this, investigations of the antifungal potential of new

molecules are highly relevant. In recent years, plant-derived compounds with

25

antifungal potential have attracted the interest of researchers [16]. Cinnamon, a

spice derived from the inner bark of the cinnamon tree, has been reported to

possess a number of therapeutic properties, including antimicrobial activity [17,

18]. In the present study, we investigated the effects of two cinnamon bark

fractions, an essential oil and an aqueous extract enriched in proanthocyanidins,

on the growth, biofilm formation, and adherence properties of C. albicans. In

addition, an oral epithelial cell model was used to study the effects of the two

fractions on the integrity of the epithelial barrier and the host inflammatory

response.

26

2) Materials and methods

2.1) Cinnamon fractions

A cinnamon extract commercialized as Cinnulin PF® was kindly provided by IN

Ingredients Inc. (Spring Hill, TN, USA). The aqueous extract, which was prepared

from the bark of Cinnamomum burmannii, contains 531.9 mg/g of

proanthocyanidins according to the datasheet provided by the company. Cinnamon

bark is relatively unusual as it contains proanthocyanidins with a high number of A-

type bonds [19]. A 20 mg/mL stock solution of the extract was prepared in 50%

dimethylsulfoxide and was sterilized by filtration (0.22-μm pore size). Carrier

solvent was used as a control in all assays. A cinnamon bark essential oil extracted

from Cinnamomum verum, was purchased from Hunzaroma (Longueuil, QC,

Canada). Cinnamaldehyde, the major component of cinnamon bark essential oil,

was purchased from Sigma-Aldrich Canada Co. (Oakville, ON, Canada).

2.2) C. albicans and culture conditions

C. albicans ATCC 28366 and LAM-1 were isolated from cases of oral candidiasis

and systemic candidiasis, respectively. They were cultivated in Sabouraud

dextrose medium (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA) at pH 7 and

37°C.

2.3) Determination of the minimum inhibitory and minimum fungicidal

concentrations

The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration

(MFC) were determined using a microplate dilution assay. To determine the MIC

value, a 24-h culture of C. albicans was diluted in fresh culture medium to an

optical density at 660 nm (OD660) of 0.2. Aliquots (100 μL) of C. albicans were

added to an equal volume of serial dilutions in culture medium of the cinnamon

fractions in 96-well microplates. Wells without C. albicans or without the cinnamon

fractions were used as controls. When testing the cinnamon oil, the microplate was

covered with an adhesive film to avoid evaporation of the volatile compounds. After

27

an incubation at 37°C for 24 h, growth was monitored by recording the OD660 using

a microplate reader (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada). Lack of

growth was also assessed visually. The MIC value corresponded to the lowest

concentration of the cinnamon fractions that completely inhibited growth. To

determine the MFC, 5 μL from wells showing no visible growth was spotted on

Sabouraud dextrose agar plates, which were incubated at 37°C for 3 days. The

MFC value corresponded to the lowest concentration of the cinnamon fractions

where no colony formation was observed. The antifungal agent nystatin was used

as a reference antifungal. The MFC/MIC ratio was calculated, and a compound or

fraction was considered fungicidal when the ratio was ≤ 4 and fungistatic when the

ratio was > 4. All assays were performed in triplicate to ensure reproducibility.

2.4) Membrane permeability

The ability of the cinnamon oil at MFC to permeabilize the membrane of C.

albicans ATCC 28366 was evaluated using SYTOX Green dye (Life Technologies

Inc., Burlington, ON, Canada), which binds to DNA once the membrane has been

compromised. The assay was performed as previously described [20]. The

fluorescence resulting from the binding of the dye to DNA was recorded using a

Synergy 2 microplate reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) every 15

min for 2 h with the excitation wavelength set at 485 nm and the emission

wavelength set at 528 nm. A reaction mixture without essential oil was used as a

negative control.

2.5) Biofilm formation and killing

The effect of the cinnamon fractions on biofilm formation by C. albicans ATCC

28366 was determined using a microplate dilution assay as described above.

Following growth, the medium and free-floating microorganisms were removed by

aspiration using a 26 g needle, and the wells were washed three times with distilled

water. Biofilms were stained with 100 μL of 0.01% crystal violet for 15 min. The

wells were then washed three times with distilled water and were dried at 37°C

overnight, after which 100 μL of 75% ethanol (v/v) was added to each well to

28

release the dye from the biofilm. Absorbance at 550 nm (A550) was then measured

using a microplate reader. The effect of the cinnamon fractions on biofilm formation

was also examined by scanning electron microscopy using the protocol previously

described by Lagha et al. [21]. Samples were examined using a JEOL JSM6360LV

scanning electron microscope operating at 30 kV. The ability of the cinnamon oil to

kill a pre-formed C. albicans biofilm was also investigated. Biofilms (24 h) in 96-well

plates were treated for 1 h with the cinnamon oil at the MFC value. Biofilm viability

was then measured with an XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-sulfophenyl)-2H-

tetrazolium-5-carboxanilide sodium salt] assay, as described previously [22].

2.6) Epithelial cell culture conditions and viability assays

The human oral epithelial cell line B11, which was kindly provided by S. Groeger

(Justus Liebig University Giessen, Germany) and has already been characterized

[23], was cultured in keratinocyte serum-free medium (K-SFM; Life Technologies

Inc.) supplemented with growth factors (50 µg/mL of bovine pituitary extract and 5

ng/mL of human epidermal growth factor) and 100 µg/mL of penicillin G-

streptomycin. The human oral epithelial cell line GMSM-K [24] was kindly provided

by V. Murrah (University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) and was

cultivated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10%

heat-inactivated inactivated fetal bovine serum (FBS) and 100 µg/mL of penicillin

G-streptomycin. The cell cultures were incubated at 37 °C in a 5 % CO2

atmosphere. Epithelial cells (1 x 105 cells) were seeded into the wells of a 96-well

tissue culture plate and were cultivated until they reached confluence. The cells

were then treated with either Cinnulin PF® or cinnamon oil in the appropriate

culture medium for 24 h. Their viability was then determined using an MTT (3-[4,5-

diethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay (Roche

Diagnostics, Laval, QC, Canada).

2.7) Adherence to epithelial cells

The effect of the cinnamon fractions on the adherence of C. albicans ATCC 28366

to oral epithelial cells was assessed using the human GMSM-K cell line. Epithelial

29

cells were seeded (5 x 104 cells/well) in a 96-well clear bottom black microplate

(Greiner Bio One, Frickenhausen, Germany) and were incubated at 37°C in a 5%

CO2 atmosphere until they reached confluence. The wells were then washed with

DMEM-1% heat-inactivated FBS and were blocked with 1% bovine serum albumin

(BSA) to prevent non-specific fungal adherence, and the cinnamon fractions diluted

in DMEM-1% heat-inactivated FBS medium were added. Wells without the

cinnamon fractions were used as controls. In parallel, cells from an overnight

culture of C. albicans were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC; Sigma-

Aldrich Canada Co.) according to a protocol routinely used in our laboratory [25].

FITC-labeled C. albicans was added at a multiplicity of infection (MOI) of 100 to

wells containing an epithelial cell monolayer (in the absence or presence of the

cinnamon fractions). Following an incubation for 4 h at 37°C, unbound C. albicans

were aspirated, and the wells were washed three times with 50 mM phosphate-

buffered saline (pH 7; PBS). Adhered C. albicans were determined by monitoring

fluorescence using a Synergy 2 microplate reader with the excitation and emission

wavelengths set at 488 and 522 nm, respectively. Adhered FITC-labeled C.

albicans were also observed using an Olympus FSX100 fluorescence microscope

(Olympus Canada Inc., Richmond Hill, ON, Canada).

2.8) Oral epithelial barrier integrity

The effect of the cinnamon fractions on the integrity of the epithelial barrier was

assessed using the human B11 cell line described above. Epithelial cells (3.5 x 105

cells/insert) were seeded in Costar Transwell™ plates with clear polyester

membrane inserts (6.5-mm diameter, 0.4-μm pore size; Corning Co., Cambridge,

MA, USA). The basolateral and apical compartments were filled with 0.6 mL and

0.1 mL of culture medium, respectively. Following a 3-day incubation to allow the

cells to form tight junctions, the conditioned medium was replaced with antibiotic-

free K-SFM, and the cells were incubated for a further 16 h. The cinnamon

fractions were then added, and the integrity of the epithelial tight junctions was

determined by monitoring the transepithelial electrical resistance (TER) using an

ohmmeter (EVOM2, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) after 2 and 4

30

h of incubation at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Resistance values were

calculated in Ohms (Ω)/cm2 by multiplying the resistance values by the surface

area of the membrane filter. Results are expressed as a percentage of the basal

control value measured at time 0 (100% value).

2.9) Secretion of cytokines by oral epithelial cells

The effect of the cinnamon fractions on the secretion of the pro-inflammatory

cytokines interleukin 6 (IL-6) and interleukin 8 (IL-8) was investigated using the

GMSM-K epithelial cell line. Cells were seeded in a 6-well plate (106 cells/well in 2

mL) and were cultured overnight at 37°C in a 5% CO2 atmosphere to allow cell

adhesion. The epithelial cells were pre-treated with the cinnamon fractions for 30

min prior to stimulating them with 1 ng/mL of recombinant human TNF-α

(AnaSpec, Fremont, CA, USA). After a 24-h incubation, cell-free supernatants were

collected and were stored at –20°C until used. Commercial enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) were

used to quantify IL-6 and IL-8 concentrations according to the manufacturer's

protocols.

2.10) Statistical analysis

Unless indicated otherwise, all assays were performed in triplicate in two

independent experiments, and the means ± standard deviations were calculated.

Statistical analyses were performed using a one-way analysis of variance with a

post hoc Bonferroni multiple comparison (GraphPad Software Inc.; La Jolla, CA,

USA). All results were considered statistically significant at p < 0.01.

31

3) Results

The antifungal activity of the cinnamon fractions is reported in Table 1. While

Cinnulin PF® at concentrations up to 1,000 µg/mL did not reduce the growth of

either strain of C. albicans, the cinnamon bark oil displayed high antifungal activity,

with MIC and MFC values in the range of 0.039% to 0.078% (v/v).

Cinnamaldehyde, the major component of cinnamon bark oil, had a MIC and MFC

value of 0.078%. Nystatin, which was used as a reference antifungal agent, had a

MIC of 50 µg/mL and an MFC of 200 µg/mL. Cinnamon oil and cinnamaldehyde

are fungicidal rather than fungistatic, with an MFC/MIC ratio in the range of 1 to 2.

Table 1. Minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum fungicidal

concentrations (MFC) of cinnamon fractions against C. albicans.

* MFC/MIC Ratio: > 4 means fungistatic activity; ≤ 4 means fungicidal activity.

SYTOX Green dye is a fluorescent molecule that penetrates impaired cytoplasmic

membranes, binds to DNA, and emits fluorescence. When the C. albicans cells

were treated with cinnamon oil, a time-dependent increase in fluorescence

occurred, suggesting that their membranes had been permeabilized due to the

fungicidal activity of the cinnamon oil (Fig. 1). No significant increase in

fluorescence occurred in the negative control over the 2-h incubation period.

Candida albicans

ATCC 28366 LAM-1

Compounds MIC MFC MFC/MIC*

Ratio MIC MFC

MFC/MIC

Ratio

Cinnulin PF® (µg/ml) >1 000 >1 000 - >1 000 >1 000 -

Cinnamon bark oil (% [v/v]) 0,039 0,078 2,0 0,078 0,078 1,0

Cinnamaldehyde (% [v/v]) 0,078 0,078 1,0 0,078 0,078 1,0

Nystatin (µg/ml) 50 200 4,0 50 200 4,0

32

1 Figure 1. Effect of cinnamon bark oil on the membrane integrity of C. albicans

ATCC 28266 as determined using SYTOX® Green dye, which penetrates damaged

cytoplasmic membranes. C. albicans cells were incubated with cinnamon oil at its

MFC and fluorescence was recorded for 2 h.

The effect of Cinnulin PF® and cinnamon bark oil on biofilm formation by C.

albicans was then investigated. Although Cinnulin PF® did not reduce the growth of

C. albicans, it significantly attenuated biofilm formation as determined by crystal

violet staining (Fig. 2A). More specifically, at a Cinnulin PF® concentration of 62.5

μg/mL, biofilm formation was reduced by 91%. The effect of Cinnulin PF® on

biofilm formation by C. albicans was also visualized by scanning electron

microscopy. The control biofilm of C. albicans appeared dense, and hyphae were

an important structural component (Fig. 3A and 3B). Electron micrographs clearly

showed the marked reduction in mature biofilm when C. albicans was grown in the

presence of 62.5 μg/mL of Cinnulin PF® (Fig. 3C and 3D). In addition, no hyphae

were observed. The cinnamon bark oil also attenuated biofilm formation by C.

albicans at concentrations that did not inhibit growth. The formation of biofilm was

reduced by 86% when C. albicans was grown in the presence of 0.0049%

cinnamon oil (Fig. 2B).

33

2 Figure 2. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the

growth and biofilm formation of C. albicans ATCC 28266 A value of 100% was

assigned to the growth and biofilm obtained in the absence of the cinnamon

fractions. Results are expressed as the means ± SD of triplicate assays from two

independent experiments. *: significantly different from the control (p < 0.01).

0 1 5 .6 3 3 1 .2 5 6 2 .5 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

C in n u lin P F (µ g /m l)

Re

lativ

e g

ro

wth

(%

)

Bio

film

fo

rm

ati

on

(%

)

*

*

0 0 .0 0 1 2 0 .0 0 2 4 0 .0 0 4 9 0 .0 0 9 8 0 .0 1 9 5 0 .0 3 9 1

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

C in n a m o n b a rk o il (% [v /v ])

Re

lativ

e g

ro

wth

(%

)

Bio

film

fo

rm

ati

on

(%

)

*

*

*

**

**

34

3 Figure 3. Scanning electron micrographs of biofilms formed by C. albicans ATCC

28366 grown in the absence (panels A and B) or presence of 62.5 µg/mL of

Cinnulin PF® (panels C and D). Magnification: 100 X (panels A and C) and 1,000 X

(panels B and D).

Given the fungicidal activity of the cinnamon bark oil, we determined whether it

could kill C. albicans biofilms. A 24-h pre-formed C. albicans biofilm was treated for

60 min with cinnamon oil at its MFC. Residual viability was determined using an

XTT assay that measures metabolic activity. This treatment reduced biofilm

viability by 48%, but did not cause any desorption of the biofilm biomass (Fig. 4).

A

B

C

D

35

4 Figure 4. Effect of cinnamon bark oil on the viability and desorption of a

C. albicans ATCC 28366 biofilm. A pre-formed (24 h) C. albicans biofilm was

treated for 60 min with cinnamon oil at its MFC, and the residual biomass and

viability were measured by crystal violet staining and an XTT assay, respectively. A

value of 100% was assigned to the pre-formed biofilm exposed to the cinnamon oil

carrier solvent. The assays were performed in triplicate, and the mean ± SD of two

independent experiments was calculated. *: significantly different from the control

(p < 0.01).

The effect of the cinnamon fractions on the adherence of C. albicans to oral

epithelial cells (GMSM-K cell line) was then tested. Cinnulin PF® dose-dependently

reduced the adherence of FITC-labeled C. albicans to epithelial cells (Fig. 5A).

More specifically, in the presence of 1,000 μg/mL of Cinnulin PF®, adherence was

inhibited by 59%. The ability of Cinnulin PF® to reduce the adherence of C.

albicans to oral epithelial cells was confirmed by fluorescence microscopy (Fig.

5B). Cinnamon bark oil had no inhibitory effect on the adherence of C. albicans to

oral epithelial cells (data not shown).

0

20

40

60

80

100

120

Control Cinnamon bark oil

Relative

biofilm

viability (%)

*

36

5 Figure 5. Effect of Cinnulin PF® on the adherence of C. albicans ATCC 28366 to

GMSM-K oral epithelial cells. Panel A: FITC-labeled C. albicans cells adhered to

epithelial cells were quantified by measuring fluorescence using a microplate

reader. A value of 100% was assigned to C. albicans adhered to epithelial cells in

the absence of Cinnulin PF®. Results are expressed as the means ± SD of triplicate

assays from two independent experiments. *: significantly different from the control

(p < 0.01). Panel B: Fluorescence micrograph of FITC-labeled C. albicans cells

adhered to epithelial cells.

0 1 2 5 2 5 0 5 0 0 1 0 0 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

C innu lin P F (µ g /m l)

Re

lati

ve

ad

he

ren

ce

(%

)

*

**

Control + Cinnulin PF® (125 μg/ml)

A)

B)

37

In order to investigate the biocompatibility of the cinnamon fractions, we tested

their effects on the viability of two oral epithelial cell lines. Up to 1,000 µg/mL of

Cinnulin PF® had no cytotoxic effect on B11 epithelial cells (Fig. 6A). However, 500

µg/mL of Cinnulin PF® reduced the viability of GMSM-K epithelial cells by 42.8%.

Treating the B11 and GMSM-K epithelial cell lines with 0.0625% cinnamon bark oil

reduced cell viability by 14% (not significant at p < 0.01) and 73.8%, respectively

(Fig. 6B).

38

6 Figure 6. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the

viability of two oral epithelial cell lines (B11 and GMSM-K). The epithelial cells were

treated for 16 h with the cinnamon fractions prior to determining cell viability ussing

a colorimetric MTT assay. Results are expressed as the means ± SD of triplicate

assays in two independent experiments. *: significantly different from the control

(p < 0.01).

B 1 1 G M S M - K

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

Re

lati

ve

via

bil

ity

(%

)

0

1 2 5

2 5 0

5 0 0

1 0 0 0

µ g /m l

*

*

B 1 1 G M S M - K

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

Re

lati

ve

via

bil

ity

(%

)

0

0 ,0 0 7 8

0 ,0 1 5 6

0 ,0 3 1 3

0 ,0 6 2 5

0 ,1 2 5

% (v /v )

*

**

*

*

A)

B)

39

We then investigated the effect of Cinnulin PF® and cinnamon bark oil on the

integrity of the epithelial barrier by monitoring the TER values of the B11 cell line.

After a 4-h incubation, 62.5 μg/mL and 125 μg/mL of Cinnulin PF® time-

dependently increased the TER values of the B11 cell line by 42.9 % and 39.5 %,

respectively (Fig. 7), while 0.0156 % cinnamon oil increased the TER value by

43.9 %.

7 Figure 7. Effect of Cinnulin PF® (panel A) and cinnamon bark oil (panel B) on the

integrity of the epithelial barrier (B11 cell line). The TER values were determined

after a 6-h incubation. A value of 100% was assigned to the TER values at time 0.

Results are expressed as the means ± SD of triplicate assays. *: significantly

different from the control (p < 0.01).

0 6 2 .5 1 2 5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

C innu lin P F (µ g /m l)

Re

lati

ve

TE

R (

%)

0

2

4

*

T im e (h )**

*

0 0 .0 0 7 8 0 .0 1 5 6

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

C inn am on b ark o il (% [v /v ])

Re

lati

ve

TE

R (

%)

0

2

4

T im e (h )*

**

A)

B)

40

We assessed the anti-inflammatory properties of Cinnulin PF® using an oral

epithelial cell model (GMSM-K cell line) stimulated with TNF-. Stimulating the

epithelial cells with 1 ng/mL of TNF- induced the secretion of IL-6 (670 pg/mL)

and IL-8 (15,008 pg/mL). A 30-min pre-treatment with 62.5 μg/mL of Cinnulin PF®

prior to stimulating the epithelial cells with TNF- reduced the secretion of IL-6 and

IL-8 by 29% and 57%, respectively (Fig. 8) while 250 μg/mL of Cinnulin PF® almost

totally inhibited the secretion of the two cytokines. The cinnamon bark oil did not

reduce the secretion of IL-6 or IL-8 at non-cytotoxic concentrations (≤ 0.0078%;

data not shown).

41

8 Figure 8. Effect of Cinnulin PF® on TNF-α-induced IL-6 (panel A) and IL-8 (panel

B) secretion by oral epithelial cells (GMSM-K cell line). Results are expressed as

the means ± SD of triplicate assays in two independent experiments. *: significantly

different from the control (p < 0.01).

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

IL

-6 (

pg

/ml)

*

*

*

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

IL

-8 (

pg

/ml)

*

*

*

TNF-α - + + + +

Cinnulin PF® (µg/ml) 0 0 62.5 125 250

B)

A)

TNF-α - + + + +

Cinnulin PF® (µg/ml) 0 0 62.5 125 250

42

4) Discussion

C. albicans can be isolated from various sites in humans. It is an opportunistic

pathogen and has been associated with superficial and systemic infections,

especially in immunologically or medically compromised individuals [3, 11]. C.

albicans causes oral candidiasis and denture stomatitis, and may also be involved

in dental caries, periodontal diseases, and refractory endodontic infections [2].

Ulcerative oral lesions (oral mucositis) resulting from chemotherapy and

radiotherapy treatments are susceptible to secondary infections by oral

microorganisms, including C. albicans [4, 5]. For instance, Belazi et al. [26] isolated

Candida spp. from oral mucositis lesions in 77% of patients undergoing

radiotherapy for head and neck cancer.

C. albicans infections can generally be successfully treated with conventional

antifungal agents. However, the emergence of resistance to these therapeutic

agents is of increasing concern [13-15], which is why investigations of the

antifungal potential of new molecules are highly relevant. Plants and their

derivatives are an important source of bioactive molecules. Essential oils extracted

from different parts of certain plants (leaves, flowers, seeds, bark, etc.) possess

numerous therapeutic properties, including antimicrobial activities [27, 28].

Moreover, proanthocyanidins, a family of polyphenols consisting of flavan-3-ol

oligomers and polymers, have been proposed as promising molecules for treating

oral infections given their anti-adherence and anti-inflammatory properties [29].

The present study was designed to evaluate the effects of two cinnamon fractions,

an essential oil and an aqueous extract enriched in proanthocyanidins, on both C.

albicans (growth, biofilm formation, adherence properties) and oral epithelial cells

(barrier integrity, inflammatory response).

We first showed that the growth of C. albicans was inhibited by cinnamon bark oil

as well as cinnamaldehyde, its main constituent. Cinnulin PF®, had no effect on the

growth of C. albicans, even at the highest concentration tested (1,000 µg/mL). The

ability of cinnamon oil to inhibit the growth of several oral microbial pathogens,

43

including Porphyromonas gingivalis [30], Solobacterium moorei [20], Streptococcus

mutans [31], and C. albicans [32] has been previously reported. Moreover, in a

recent study, Essid et al. [32] showed that combining cinnamon oil with the

antifungal drug fluconazole provided a synergistic effect against fluconazole-

resistant Candida strains.

We then explored the mechanism by which the cinnamon bark oil exerts its

antifungal effect against C. albicans. The ability of cinnamon oil to disrupt the cell

membrane was assessed by SYTOX® Green staining, which showed that the

antifungal activity of cinnamon oil may be due to its ability to damage the cell

membrane. This is in agreement with Essid et al. [32], who reported that cinnamon

essential oil inhibits ergosterol biosynthesis in Candida species, an effect that may

have an impact on the integrity of the fungal membrane by permeabilizing the cell.

However, despite the ability of cinnamon oil to cause damage to the cell membrane

of C. albicans, additional mechanisms that may contribute to its fungicidal effect

cannot be ruled out.

C. albicans forms biofilms on many oral surfaces, including tooth enamel, oral

mucosa, implants, and dentures [1, 2]. C. albicans cells embedded in a biofilm are

more resistant to mechanical elimination by saliva and to antifungal agents

compared with their planktonic counterparts [33-36]. Antimicrobial agents have

difficulty penetrating a biofilm, which can reduce their effectiveness. Therapeutic

strategies aimed at inhibiting biofilm formation are thus highly relevant. The present

study showed that cinnamon bark oil at sub-inhibitory concentrations can inhibit C.

albicans biofilm formation. Moreover, the treatment of a preformed C. albicans

biofilm with cinnamon bark oil significantly reduced the viability of the biofilm. A

very low concentration of Cinnulin PF® (≥ 31.25 µg/mL) also significantly inhibited

the formation of a biofilm by C. albicans. These results suggest that Cinnulin PF®

may be a promising anti-C. albicans agent because it specifically acts on biofilm

formation but has no effect on growth. In vivo, biofilm formation by C. albicans

requires initial adherence to the oral mucosa. Interestingly, Cinnulin PF®

44

significantly attenuated the adherence of C. albicans while no such effect was

observed with cinnamon oil.

The oral epithelium protects the underlying tissues from microbial invasion and

thus actively contributes to the maintenance of oral health [37]. This barrier effect is

mediated by the tight junctions that seal the epithelial cells together. We thus

investigated the ability of the cinnamon fractions to strengthen the epithelial barrier.

Our results demonstrated that electrical resistance increased when the epithelial

cells were cultivated in the presence of either cinnamon bark oil or Cinnulin PF®.

These results suggest that these cinnamon fractions, by reinforcing the epithelium,

may potentially prevent the invasion of the oral mucosa by oral pathogens.

Although the host inflammatory response is key to maintaining oral health, an

acute and exacerbated inflammatory reaction as observed in oral candidiasis and

oral mucositis may be deleterious by causing tissue damage. More specifically, the

development of oral mucositis in patients receiving chemotherapy and radiotherapy

treatments involves the stimulation of infiltrating macrophages, resulting in the

activation of NF-κB [6, 7]. This process is associated with the secretion of

inflammatory cytokines, including TNF-α, that promote inflammation and tissue

destruction. In the present study, when epithelial cells were challenged with TNF-α,

they secreted a large quantity of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8. On

the other hand, Cinnulin PF® dampened the secretion of both cytokines.

In conclusion, the two cinnamon fractions (essential oil, Cinnulin PF®) investigated

in the present study may be promising agents for controlling C. albicans infections.

Conflicts of interest

The authors declare that they have no conflict of interest related to this study.

Acknowledgements

We are grateful to IN Ingredients Inc. (Spring Hill, TN, USA) for providing the

Cinnulin PF®, S. Groeger (Department of Periodontology, Justus Liebig University

45

Giessen, Germany) for providing the B11 cell lines, and V. Murrah (University of

North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) for providing the GMSM-K cell line. This

study was supported by funding from the Laboratoire de Contrôle Microbiologique

de l’Université Laval.

46

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50

Discussion et conclusion

C. albicans peut être isolé à partir de divers sites chez l'Homme et est souvent

associé à des affections du tractus intestinal, de la région oropharyngée et des

muqueuses vaginales [121,122]. C'est un agent pathogène opportuniste associé à des

infections superficielles et systémiques, en particulier chez les individus

immunologiquement ou médicalement compromis [18,123]. C. albicans provoque des

candidoses buccales et des stomatites prothétiques et peut également être

impliqué dans les caries dentaires, les maladies parodontales et les infections

endodontiques réfractaires [124]. Les lésions buccales ulcéreuses (mucites

buccales) résultant de traitements de chimiothérapie et de radiothérapie sont

sensibles aux infections secondaires par des microorganismes buccaux, y compris

C. albicans [125,126]. Par exemple, Belazi et al. ont isolé Candida spp. des lésions de

la muqueuse buccale chez 77 % des patients sous radiothérapie pour un cancer

de la tête et du cou [127].

Les infections à C. albicans peuvent généralement être traitées avec succès avec

des antifongiques classiques. Cependant, l'apparition de résistances à ces agents

thérapeutiques est une préoccupation croissante [50,128,129], ce qui explique

pourquoi les recherches sur le potentiel antifongique de nouvelles molécules sont

hautement pertinentes. Les plantes et leurs dérivés constituent une source

importante de molécules bioactives. Les huiles essentielles extraites de différentes

parties de certaines plantes (feuilles, fleurs, graines, écorce, etc.) possèdent de

nombreuses propriétés thérapeutiques, y compris des activités

antimicrobiennes [130,131]. De plus, les proanthocyanidines, une famille de

polyphénols comprenant des oligomères et des polymères de flavan-3-ol, ont été

proposées comme molécules prometteuses pour le traitement des infections

buccales en raison de leurs propriétés anti-adhérence et anti-inflammatoires [132].

La présente étude visait à évaluer les effets de deux fractions de cannelle, une

huile essentielle et un extrait aqueux enrichi en proanthocyanidines, sur

C. albicans (croissance, formation de biofilm, propriétés d'adhérence) et sur les

51

cellules épithéliales buccales (intégrité de la barrière, réponse inflammatoire).

Dans une précédente étude, nous avions démontré que l’huile essentielle d’écorce

de cannelle était efficace pour inhiber la croissance et la formation des biofilms

chez Solobacterium moorei, une bactérie associée à l’halitose [120].

Nous avons d'abord montré que la croissance de C. albicans était inhibée par

l'huile d'écorce de cannelle ainsi que par le cinnamaldéhyde, son constituant

principal. Les proanthocyanidines de la cannelle (Cinnulin PF®) n'ont eu aucun

effet sur la croissance de C. albicans, même à la concentration la plus élevée

testée (1 000 µg / mL). La capacité de l'huile de cannelle à inhiber la croissance de

plusieurs agents pathogènes microbiens buccaux, dont Porphyromonas

gingivalis [133], Solobacterium moorei [120], Streptococcus mutans [134] et

C. albicans [135] a déjà été rapportée. De plus, dans une étude récente, Essid et al.

ont montré que l'association de l'huile de cannelle et du fluconazole, un

antifongique, produisait un effet synergique contre les souches de Candida

résistantes au fluconazole [135]. Aussi, le ratio « concentration minimale

fongicide / concentration minimale inhibitrice » indique si le produit a un effet

fongicide (ratio <4) ou fongistatique (ratio ≥4) [136]. Il est intéressant de constater

que l’huile d’écorce de cannelle ainsi que le cinnamaldéhyde ont démontré un ratio

inférieur à 4 et peuvent donc être classés comme des agents fongicides.

Nous avons ensuite exploré le mécanisme par lequel l'huile d'écorce de cannelle

exerce son effet antifongique contre C. albicans. La capacité de l'huile de cannelle

à compromettre la membrane cellulaire a été évaluée par la coloration SYTOX®

Green, ce qui a démontré que l'activité antifongique de l'huile de cannelle peut être

attribuée à sa capacité à endommager la membrane cellulaire. Ceci est en accord

avec Essid et al., qui ont rapporté que l'huile essentielle de cannelle inhibe la

biosynthèse de l'ergostérol chez les espèces de Candida, un effet qui pourrait avoir

un impact sur l'intégrité de la membrane fongique en perméabilisant la cellule [135].

Cependant, malgré la capacité de l'huile de cannelle à endommager la membrane

cellulaire de C. albicans, des mécanismes supplémentaires susceptibles de

contribuer à son effet fongicide ne peuvent être exclus.

52

La capacité d’un agent pathogène à former des biofilms joue un rôle clé dans le

développement de plusieurs infections, autant dans la région buccodentaire

qu’ailleurs dans le corps humain [137,138]. C. albicans forme des biofilms sur de

nombreuses surfaces buccales, notamment l'émail des dents, la muqueuse

buccale, les implants et les prothèses dentaires [124,139]. Les cellules de C. albicans

au sein d’un biofilm sont plus résistantes à l'élimination mécanique par la salive et

aux antifongiques que leurs homologues planctoniques [140–143]. Les agents

antimicrobiens ont de la difficulté à pénétrer dans un biofilm, ce qui peut réduire

leur efficacité. Les stratégies thérapeutiques visant à inhiber la formation de biofilm

sont donc très pertinentes. La présente étude a montré que l'huile d'écorce de

cannelle à des concentrations sous-inhibitrices peut inhiber la formation de biofilm

de C. albicans. De plus, le traitement d'un biofilm préformé de C. albicans avec de

l'huile d'écorce de cannelle a considérablement réduit la viabilité du biofilm. Une

très faible concentration de Cinnulin PF® (≥ 31,25 µg / mL) a également inhibé de

manière significative la formation d'un biofilm par C. albicans. Ce constat a été

effectué à l’aide d’une méthode semi-quantitative, par coloration au cristal violet,

ainsi qu’à l’aide d’une méthode qualitative, c’est-à-dire visuellement par

microscopie électronique. En présence de 62,5 µg / mL de Cinnulin PF, il était

possible d’observer les levures sous forme planctonique et non organisée en

biofilm. Ce constat permet de supposer que la Cinnulin PF® pourrait empêcher la

formation de la matrice extracellulaire [144]. Ces résultats suggèrent que la Cinnulin

PF® pourrait être un agent anti-C. albicans prometteur, car elle agit spécifiquement

sur la formation de biofilm, mais sans affecter sur la croissance. In vivo, la

formation de biofilms par C. albicans nécessite une adhérence initiale à la

muqueuse buccale. De plus, l’attachement des cellules de C. albicans à la

muqueuse buccale est la première étape à l’invasion des tissus. Fait intéressant, la

Cinnulin PF® a considérablement atténué l’adhérence de C. albicans alors qu’un

tel effet n’a pas été observé avec l’huile de cannelle. L’effet a visuellement été

observé à l’aide de la microscopie à fluorescence. Le mécanisme exact de la

diminution de l’adhérence n’a pas été étudié. Cependant, il serait possible qu’il en

53

résulte de la liaison des polyphénols aux adhésines présentes à la surface de

C. albicans ou aux récepteurs retrouvés sur les cellules épithéliales.

L'épithélium buccal protège les tissus sous-jacents de l'invasion microbienne et

contribue ainsi activement au maintien de la santé bucco-dentaire [145,146]. Cet effet

de barrière est provoqué par les jonctions serrées qui scellent les cellules

épithéliales ensemble. Ces dernières sont dynamiques et changent de formes

constamment selon ses interactions avec différents stimuli internes et externes

comme les cytokines ou les microorganismes [145]. C’est pourquoi nous avons

étudié la capacité des fractions de cannelle à renforcer la barrière épithéliale. Nos

résultats ont montré que la résistance électrique augmentait lorsque les cellules

épithéliales étaient cultivées en présence d’huile d’écorce de cannelle ou de

Cinnulin PF®. Cette résistance transépithéliale est un index de la perméabilité

paracellulaire. Ces résultats suggèrent que ces fractions de cannelle, en renforçant

l'épithélium, pourraient empêcher l'invasion de la muqueuse buccale par des

agents pathogènes oraux et pourraient être de bons agents à des fins de

prévention.

Bien que la réponse inflammatoire de l'hôte soit essentielle au maintien de la santé

bucco-dentaire, une réaction inflammatoire aiguë et exacerbée, telle qu'elle est

observée dans les candidoses et les mucites buccales, peut être délétère en

provoquant des lésions tissulaires. Plus spécifiquement, le développement de la

mucosite buccale chez les patients traités par chimiothérapie et radiothérapie

implique la stimulation de macrophages infiltrant, entraînant l'activation de

NF-kB [26,43]. Ce processus est associé à la sécrétion de cytokines inflammatoires,

y compris le TNF-α, qui favorisent l'inflammation et la destruction des tissus. Dans

la présente étude, lorsque les cellules épithéliales ont été stimulées par le TNF-α,

elles ont sécrété une grande quantité de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et IL-8.

Les cytokines IL-6 et IL-8 jouent un rôle crucial dans le processus inflammatoire,

entre autres pour le recrutement des neutrophiles et des macrophages sur le site

d’infection [147]. En revanche, la Cinnulin PF® a atténué la sécrétion des deux

54

cytokines et pourrait ainsi représenter un agent thérapeutique efficace lors d’une

réaction inflammatoire exacerbée.

À la lumière des résultats rapportés dans cette étude, les différentes fractions de la

cannelle pourraient être considérées comme des agents prometteurs dans la

prévention et le traitement de la mucite buccale et de la candidose buccale à

C. albicans.

55

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