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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2000, 139, 21-44

EAU THERMALE D'AVÈNE ET DYNAMIQUE

DU CALCIUM INTRACELLULAIRE (*)

P. BORDAT (1) , H. COUSSE (1) , E. NEUZIL (2) , B. DUFY (3)

Des cellules hypophysaires de la lignée GH3 (cellulesexcitables) et des cellules d'ovaire de hamster de la lignéeCHOK 1 (cellules inexcitables) ont été incubées dans un milieustandard préparé avec de l'eau thermale d'Avène,comparativement à des milieux standard préparés avec de l'eaudistillée, contenant (ou non) des ions bicarbonate. Dans cesdifférents milieux, la concentration en calcium est la même.

Dans les cellules des deux types, mises en présence d'eaud'Avène, on observe une augmentation du calcium cytosolique[Ca2+] i et une diminution de la libération du calcium à partir descompartiments calciques intracellulaires. Pour les cellulesexcitables, ces variations de [Ca2+] i apparaissent liées auxbicarbonates ; pour les cellules inexcitables, des éléments autresque les ions bicarbonate sont impliqués.

(*) Manuscrit reçu le 7 Décembre 2000(1) Laboratoires Pierre Fabre, Direction générale, Le Carla, 81106 Castres Cedex,

(auxquels la correspondance relative à cet article doit être adressée).(2) Professeur honoraire (Biochimie médicale), Université Victor Segalen-Bordeaux

2, 146 rue Léo-Saignat, 33076 Bordeaux Cedex.(3) Directeur de recherche, CNRS UMR 5543, Université Victor Segalen-Bordeaux 2,

146 rue Léo-Saignat, 33076 Bordeaux Cedex.

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Avène-les-Bains, dont l'établissement thermal a été complètementreconstruit et rénové en 1990, a retrouvé une place de choix parmi les stationsofficiellement agréées pour leur orientation thérapeutique en dermatologie.

Les propriétés anti-inflammatoires de l'eau thermale d'Avène (ETA)sont mises à profit dans le traitement de la dermatite atopique, de différentstypes d'eczémas et du psoriasis [11] ; son action cicatrisante est utilisée avecsuccès dans les suites opératoires de chirurgie plastique. L'historique de cettestation, sa situation géographique, l'origine géologique et la compositionchimique de l'eau de la source Sainte-Odile ainsi que ses propriétéspharmacologiques, ont fait l'objet de deux mémoires parus dans ce Bulletin[19, 20].

La recherche de données scientifiques permettant de mieux comprendrel'action bénéfique des eaux thermales représente un objectif important pour lesmédecins et les biologistes désireux de dépasser l'empirisme clinique etd'orienter la crénothérapie vers un thermalisme scientifique.

Au cours de ces dernières années et depuis notre dernière publicationprésentée en 1995 à Bordeaux (∗ ), de nouveaux travaux expérimentaux ontconfirmé les observations médicales qui avaient mis en valeur les actions anti-inflammatoire et anti-allergique de l'ETA [1, 2, 5, 8, 14, 15]. Lesmécanismes impliqués au niveau cellulaire n'ont pas été totalement élucidés ;aussi avons nous voulu savoir si l'ETA était susceptible de modifier ladynamique du calcium intracellulaire, puisque cet élément intervient dansplusieurs processus susceptibles d'expliquer l'action apaisante de cette eau.

Nous apportons ici, avec nos résultats préliminaires, une réponsepositive ; l'exposé de nos travaux expérimentaux est précédé de quelquesrappels sur la teneur en calcium des eaux thermales et sur la dynamique ducalcium intracellulaire.

Calcium et eaux thermales

∗ Cf. Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1995, 134, 163-185.

23

Les eaux minérales naturelles proviennent d'eaux météoriques qui ontacquis une minéralisation dont la nature et l'importance est en rapport avec lesstructures géologiques traversées [3]. Il n'est donc pas étonnant qu'ellesrenferment toutes du calcium, puisque ce métal, avec une concentration de4,6 %, occupe la cinquième place dans la liste des éléments de la croûteterrestre rangés selon leur abondance [18]. La teneur en calcium des eauxminérales naturelles couvre un très large éventail de concentrations ; dansl'inventaire récemment publié par la direction générale de la santé du Ministèrede l'emploi et de la solidarité et par le service des matières premières et dusous-sol du Secrétariat d'Etat à l'industrie [4], on note des résultatsanalytiques allant de très faibles valeurs pour certaines eaux oligominérales(1,5 mg/L pour la source Rossignol Supérieur, d'Ax-les-Thermes ; 1,6 mg/Lpour la Grande Source, de Bagnoles-de-l'Orne), à des valeurs extrêmes pourdes eaux fortement minéralisées (1.580 mg/L pour la source Chavenay, deLons-le-Saunier ; 1.610 mg/L pour la source Saint-Éloi, d'Amneville).

La classification des eaux thermales n'est pas directement reliée à leurteneur en calcium [6] ; elle prend surtout en considération l'anion principal quilui est associé, permettant de distinguer :

• Des eaux bicarbonatées calciques, le plus souvent froides ou detempérature inférieure à 25°C et peu minéralisées ; elles se distinguentainsi des eaux bicarbonatées mixtes (calco-sodiques) et surtout deseaux bicarbonatées sodiques, de thermalité élevée et dont la minéralitése situe autour de 5 g/L.

• Des eaux sulfatées calciques, diurétiques, différant ainsi des eauxsulfatées sodiques et magnésiennes, qui possèdent des propriétéslaxatives ou purgatives.

• Des eaux sulfurées calciques qui proviennent des modifications subiespar des eaux sulfatées calciques au cours de leur remontée en surface,sous l'influence d'agents réducteurs.

Parmi les douze stations thermales dont l'orientation thérapeutique endermatologie est reconnue par l'administration sanitaire, six offrent auxcuristes des eaux fortement minéralisées : les valeurs des résidus secsrespectifs sont rassemblées dans le tableau I.

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Tableau I : Eaux thermales fortement minéralisées

Résidu sec, mg/L

Allègre - Les Fumades (Source Romaine) 1.780

Meyras-Neyrac (Source Les Bains) 1.560

Rochefort (Source Empereur) 5.854

Saint-Gervais (Source Gontard) 4.597

Tercis-les-Bains (Source Bagnère) 2.324

Uriage 11.160

Les six autres stations, dont Avène-les-Bains, possèdent des eauxoligominérales bicarbonatées calciques, dont quelques caractéristiqueschimiques sont rappelées dans le tableau II.

On remarquera une légère différence dans les résultats analytiquesrelatifs aux deux eaux d'Avène, celle de la source Sainte Odile [9] et celle ducaptage Valdorb [17]. Elles proviennent toutes deux de la même ressourcehydrominérale qui se développe dans les couches anciennes dolomito-karstiques du versant nord de la Montagne Noire. Si les deux eaux minéralesont un âge voisin de 40 ans, celle du captage Valdorb semble cependant unpeu plus ancienne, comme l'indique la datation par le tritium : son séjour pluslong dans la profondeur du réservoir dolomitique augmente sa minéralité,tandis que des temps différents de remontée en surface expliquent lesdifférences de température entre l'eau qui émerge du captage Valdorb (21,3°C)et celle du griffon de la source Sainte Odile (25,8°C).

L'origine commune de deux eaux se confirme quand on considère queles rapports calcium / résidu sec et magnésium / résidu sec, dont les valeursrespectives de 0,20 et de 0,10 sont identiques pour les deux eaux.

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Tableau II :

Résidu sec, calcium, magnésium et bicarbonate (en mg / L)des eaux oligominérales de six stations thermales françaises

à orientation dermatologique

Station thermale Résidu sec Ca 2+ Mg 2+ CO3H- Mg/Ca

Avène-les-Bains

Source Sainte-Odile

Captage Valdorb

207

266

42,7

54,0

21,2

27,1

227

258

0,49

0,50

La Bourboule

Source Fenestre II 402 6,4 4,4 182 0,68

Molitg-les-Bains

Source Llupia 260 2,6 0,06 99,3 0,02

La Roche-Posay

Source Connétable 596 193,0 8,6 399 0,04

Sail-les-Bains

Source du Hamel 313 21,0 2,1 216 0,10

Saint-Christau

Source les Arceaux 198 56,3 8,8 200 0,15

Le calcium intracellulaire

L'élément 2040Ca, l'isotope le plus répandu du calcium (les cinq autres

isotopes stables ne représentant en tout que 3% du calcium naturel), possèdedans son noyau atomique 20 protons (nombre de charge Z = 20) et

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20 neutrons (nombre de masse M = 40). Pour le calcium, la valeur du rapportM / Z = 2, qui traduit la stabilité du noyau, est la même que celle relative àquatre éléments particulièrement représentatifs des biomolécules, C, N, O etS.

Dans la composition élémentaire du corps humain, le calcium se situe encinquième position, après l'oxygène, le carbone, l'hydrogène et l'azote ; les1.050 g de calcium d'un adulte (1,5 % de son poids total) se répartissent trèsinégalement :

� le squelette et les dents en renferment 1 kg, immobilisé sous une formeinsoluble qui joue un double rôle, de charpente et de réserve ;

� les organes mous et les humeurs n'en contiennent que 50 g, mais cecalcium, ionisé ou lié à des biomolécules organiques, estmétaboliquement très actif.

Cette inégalité de répartition se retrouve lorsque l'on compare le milieuextracellulaire et la cellule.

� La concentration du calcium dans le milieu extracellulaire est de l'ordrede 1 à 2 mM ; chez l'Homme, par exemple, la calcémie varie dans deslimites étroites, entre 95 et 105 mg/L.

� La situation est plus complexe dans la cellule (Figure 1).

Fig. 1 : Concentrations extra- et intracellulaires en ion calcium

27

• Dans le cytosol, la concentration en calcium libre [Ca2+]i, en l'absencede toute stimulation, se maintient à un taux basal d'environ 0,1 µM ; elle estdonc 10.000 à 20.000 fois plus faible que celle du milieu extracellulaire.

• Il existe également dans la cellule des compartiments de stockage ducalcium (calcium-sequestring compartments ou CSC) : ils sont représentésdans le muscle squelettique et dans le myocarde par le sarcoplasme réticulaireet dans les autres types cellulaires par le réticulum endoplasmique lisse. Dansces compartiments, le calcium, qui s'y lie à différentes protéines, se trouve àune concentration considérablement plus élevée que dans le cytosol.

• La mitochondrie est également un réservoir calcique important([Ca2+] = 0,06 mM), qui n'intervient que lors de conditions extrêmes,lorsque [Ca2+]i dépasse la valeur de 1 µM.

• La régulation du calcium nucléaire, dont la concentration est élevée([Ca2+] = 1 mM), reste encore très peu connue [12, 22].

Régulation du calcium cytosolique

Il est important que la concentration cytosolique en calcium reste à untaux très bas, au voisinage de 0,1 µM, en dehors de toute activation cellulaire.C'est l'augmentation de cette concentration qui va déclencher lefonctionnement de systèmes enzymatiques dans lesquels l'ion calciumintervient comme messager, comme c'est le cas pour la glycogénolyse, lacontraction musculaire et pour de nombreux processus de sécrétion(neurotransmetteurs, histamine, insuline...). Cette faible concentration doitêtre maintenue malgré le fort gradient qui tend à pousser l'ion calcium dumilieu extracellulaire ou du CSC vers le cytosol. La membrane plasmique etles membranes du CSC, très imperméables au calcium, représentent unrempart efficace : aussi les échanges de calcium entre les différentscompartiments ne peuvent-ils s'effectuer que par l'intermédiaire des pompeset des canaux membranaires.

L'augmentation de la concentration cytosolique en ions calcium libresprovient essentiellement de deux origines :

— une entrée de calcium à partir du milieu extracellulaire via descanaux calciques membranaires ;

28

— une mobilisation du calcium contenu dans les compartimentscellulaires internes.

• E nt ré e du calci um e x t race llulai re dans le cy tosol

L'entrée de l'ion calcium dans le cytosol s'effectue de façon différentedans les cellules excitables et les cellules non excitables.

Les cellules excitables (neurones, cellules musculaires, cellulesendocrines) génèrent des potentiels d'action lorsqu'elles sont excitées par unestimulation chimique (neurotransmetteur, hormone...). La dépolarisation de lamembrane plasmique entraîne l'ouverture de canaux calciques membranaires,appelés de ce fait canaux voltage-dépendants (voltage-operated channels ouVOC) et une augmentation transitoire de la [Ca2+]i.

Les cellules non excitables (cellules gliales, fibroblastes, hépatocytes,adipocytes...) sont incapables de générer des potentiels d'action lors d'unestimulation chimique et sont généralement dépourvues de canaux ioniquesvoltage-dépendants ; elles possèdent en revanche des canaux calciques activésindirectement par des seconds messagers (second messenger-operatedchannels ou SMOC).

• M obi li sat i on du calci um de s compart ime nt s calci que si nt race llulai re s

La libération dans le cytosol de calcium séquestré dans un compartimentcalcique intracellulaire est un processus ubiquitaire, commun à toutes lescellules eucaryotes. La fixation d'un premier messager sur une protéinemembranaire récepteur stimule la formation d'inositol-1,4,5-triphosphate(IP3), qui provoque le passage de calcium dans le cytosol.

Lorsque l'on étudie la régulation du calcium libre intracytosolique, il estfondamental de distinguer ce qui résulte de l'influx de calcium extracellulaireet ce qui dépend de la mobilisation des compartiments calciquesintracellulaires.

29

• Sort i e du calci um du cy tosol

Toutes les cellules eucaryotes possèdent dans leur membraneplasmatique une Ca2+–ATPase qui utilise l'énergie d'hydrolyse de l'ATPpour sortir du cytosol l'ion calcium par pompage et ramener sa concentration àla valeur de 0,1 µM. Dans les cellules du muscle et du tissu nerveux, où lerôle du calcium est primordial, une pompe supplémentaire couple la sortie ducalcium à la rentrée de sodium ; toutefois, cet échangeur Na+–Ca2+ neprésente qu'une faible affinité pour le calcium et n'intervient que lorsque[Ca2+]i atteint une valeur environ dix fois supérieure à la normale. Une pompeà Ca2+ existe aussi dans les membranes du CSC.

MATERIEL ET METHODES

• Modèles cellulaires

— Cellules d'ovaire de hamster, lignée CHOK 1

Ces cellules, sélectionnées comme modèle de cellules inexcitables, sontcultivées sur des lamelles de verre dans du milieu HAMF12 (Seromed,France) additionné de 10% de sérum de veau fœtal, de L-glutamine(146 mg/L) et de pyruvate de sodium (110 mg/L). Les cellules sontmaintenues en étuve à 37°C, dans une atmosphère humide (air/CO2, 95:5,vol./vol.).

— Cellules hypophysaires, lignée GH3

Les modalités de culture de ces cellules excitables ne diffèrent de cellesindiquées ci-dessus que par l'utilisation d'un milieu HAMF10 renfermant15% de sérum de cheval et 2,5% de sérum de veau fœtal.

• Composition des milieux utilisés

Dans tous les milieux HBSS décrits ci-après, le pH est ajusté à 7,3-7,4et l'osmolarité à 300 mOsm.

30

— Milieu standard HBSS (en mM)

NaCl KCl CaCl2

MgCl2

MgSO4

NaHCO3

NaH2PO

4KH

2PO

4HEPES glucose

136,9 5,4 2,0 2,0 0,9 4,2 0,169 0,22 10,0 5,6

L'eau distillée utilisée pour la confection de ce milieu est de qualité milliQ.

— Milieu HBSS-A

Mili eu HBSS standard réalisé avec l'eau thermale d'Avène, quiremplace l'eau distillée ; toutefois, la concentration en calcium et enmagnésium du milieu de base HBSS a été modifiée de façon à ce que laconcentration finale de ces deux ions reste la même que celle indiquée pour lemilieu HBSS, malgré la présence d'eau d'Avène.

— Milieux HBSS bicarbonatés

Mili eu HBSS standard additionné de bicarbonate de sodium àdifférentes concentrations : 258, 516 ou 1032 mg/L, soit 1, 2 ou 4 fois lateneur de l'eau thermale d'Avène en ions bicarbonate (milieux HBSS-BC1, -BC2, -BC4). Nous avons également utilisé un milieu HBSS dépourvu debicarbonate (HBSS-BC0).

— Eau thermale d'Avène (en mg/L)

HCO3- SO42- Cl- Ca2+ Mg2+ K+ Na+ résidu sec

258 25,4 3,2 54 27,1 1,1 4,1 266

• Agents pharmacologiques

— Thapsigargine (1 mM)

Cette lactone sesquiterpénique (Figure 2) inhibe les pompes calciquesATP-ases du réticulum endoplasmique et libère le calcium de ces réservoirsintracellulaires [23].

31

— Carbonyl-cyanide-m-chlorophénylhydrazone ou CCCP (1 mM)

La m-chlorophénylhydrazone du dinitrile mésoxalique (Figure 3) est undécouplant de la phosphorylation oxydative au niveau mitochondrial qui induitla mobilisation du calcium de ces réservoirs [13].

O

O

O

O

O

O

OHOH

O

OO

OH

Fig. 2 : Structure de la thapsigargine

ClHN

N CN

CN

Fig. 3 : Structure du CCCP

• Détermination de la concentration cytosolique en ions calcium

La spectrofluorimétrie permet de mesurer, sur une population decellules, la [Ca2+]i grâce à une sonde fluorescente sensible au calcium, dérivéede l'Indo-1, l'acide 1-[2-amino-5-(6-carboxyindol-2-yl)phénoxy]-2- (2'-amino-5'-méthylphénoxy)éthane-N,N,N',N'-tétracétique ; la sonde utili-séeest son ester acétoxyméthylique (Indo-1/AM), qui pénètre facilement dans lacellule où il subit une hydrolyse ; la forme acide ainsi libérée se lie aux ionscalcium. La sonde Indo-1, excitée à 350 nm, présente deux émissions à 405 età 480 nm, qui correspondent respectivement à la forme liée et à la forme libre[16]. L'augmentation de l'émission à 405 nm, associée à la diminution del'émission à 480 nm, indique donc une augmentation de la concentrationintracellulaire en calcium libre (Figure 4).

32

Fig. 4 : Spectre de fluorescence de la sonde Indo-1en présence d'ions calcium

Protocole expérimental

Les cellules, incubées pendant 60 min dans un des milieux HBSS en

présence de 5 mM d'Indo-1/AM (Calbiochem, La Jolla, CA), sont rincées

puis introduites dans la cuve du spectrofluorimètre. Après stabilisation de lafluorescence, le niveau de base de la [Ca2+]

i est alors mesuré puis les cellules

sont stimulées par les deux agents pharmacologiques.

33

RESULTATS

• Cellules non excitables de la lignée CHO K1

— [Ca2+] i basale

Nos résultats sont groupés dans la figure 5. Nous avons enregistré uneaugmentation légère, mais significative, de la [Ca2+]i basale après incubation

des cellules pendant 60 minutes dans le milieu préparé avec l'eau thermaled'Avène (HBSS-A : 598 ± 10, n = 17 ; HBSS : 536 ± 13, n = 25 ; p < 0,05).

Fig. 5 : Cellules non excitables (CHOK 1)

Modifications de la [Ca2+] i basale

dans différentes conditions expérimentales

La valeur de la [Ca2+]i basale n'est modifiée par la présence d'ions

bicarbonate que lorsque ces derniers se trouvent en forte concentration. Lemilieu qui contient la même teneur en bicarbonate que l'eau d'Avène ainsi que

34

le milieu complètement dépourvu de bicarbonate ne se différencient pas dumilieu standard HBSS (HBSS-BC1 : 537 ± 12, n = 14, p < 0,05 ; HBSS-BC0 : 533 ± 4, n = 8, p < 0,05). Au contraire, nos résultats montrent unediminution de la concentration cytosolique en calcium, légère et nonsignificative, pour HBSS-BC2 ; la baisse de concentration est plus accusée etsignificative lorsque le milieu renferme quatre fois plus de bicarbonate quel'eau d'Avène (HBSS-BC2 : 491 ± 10, n = 6, ns ; HBSS-BC4 : 469 ± 9,n = 6, p < 0,05).

— Variations de la [Ca2+] i basale induites par la thapsigargine et le

CCCP

L'adjonction au milieu standard HBSS de thapsigargine à laconcentration de 1 µM entraîne, après 150 secondes, une montée progressivede la [Ca2+]i basale qui, partant d'une valeur voisine de 530, atteint un peu

après 6 min un plateau correspondant à une concentration calcique légèrementinférieure à 900 (Figure 6 A) La variation est de 345 ± 26, n = 16, p < 0,05.Les mêmes expériences réalisées avec le milieu HBSS-A contenant l'eaud'Avène (Figure 6 B) montrent des tracés de même allure générale mais lamontée calcique, si elle est un peu plus précoce, atteint ici des valeursnettement plus faibles (variation de 261 ± 20, n = 15, p < 0,05).

Le milieu HBSS-BC1 fournit des résultats identiques à ceux donnés parle milieu HBSS-A (variation de 261 ± 26, n = 14, p < 0,05), tandis qu'avecles mili eux HBSS-0, HBSS-2 et HBSS-4, la variation calcique induite par lathapsigargine, n'est pas différente de celle notée avec le milieu standardHBSS (Figure 6 C).

Le CCCP, introduit dans le milieu standard HBSS à la concentration de1 mM, augmente également la [Ca2+]i, mais cette augmentation (254 ± 27,n = 4, p > 0,05 est plus faible que celle induite par la thapsigargine. Dans lemilieu contenant l'ETA, les variations sont légèrement moins importantes.

35

Fig. 6 : Cellules non excitables (CHOK 1)A, B, C : action de la thapsigargine

36

En résumé, les cellules non excitables incubées dans l'eau thermaled'Avène présentent une concentration intracellulaire de calcium accrue,mais le pool libérable à partir du réticulum endoplasmique ou desréserves mitochondriales est diminué. Ces effets ne sont pas imputablesaux ions bicarbonate, lorsque leur concentration correspond à celleexistant dans l'eau d'Avène.

• Cellules excitables de la lignée GH3

— [Ca2+] i basale

Par rapport au milieu HBSS, nous avons observé une augmentationsignificative de la [Ca2+]i basale lorsque les cellules GH 3 sont incubées dans

le milieu HBSS-A réalisé avec l'ETA (470 ± 11, n = 17, p < 0,05 ; milieustandard, 406 ± 9, n = 15). Nos résultats indiquent également une hausse dela [Ca2+]i basale lorsque l'incubation est réalisée dans le milieu HBSS-BC1,

qui présente la même teneur en ions bicarbonate que l'eau thermale d'Avène(492 ± 22, n = 6, p < 0,05). Cette hausse est encore plus accentuée avec lemilieu riche en bicarbonate HBSS-BC4 (530 ± 25, n = 5, p < 0,05).

En revanche, nous n'avons pas trouvé de différence significative entrela [Ca2+]i basale incubées dans le milieu HBSS-BC0 dépourvu de

bicarbonates (418 ± 8, n = 5, p > 0,05). La figure 7 A illustre ces résultats.

— Variations de la [Ca2+] i basale induites par la thapsigargine et le

CCCP

L'augmentation de la [Ca2+]i basale en réponse à la thapsigargine

(Figure 7 B) lorsque les expériences sont effectuées dans le milieu standardHBSS, nous donne la valeur suivante : 132 ± 15, n = 8, p > 0,05. Lesvariations obtenues sont pratiquement les mêmes lorsque l'on utilise le milieuHBSS-BC0 dépourvu de bicarbonates (119 ± 4, n = 5, p > 0,05).

Au contraire, la réponse à la thapsigargine est significativementdiminuée dans le milieu HBSS-A préparé avec l'eau d'Avène :

HBSS-A : 73 ± 7, n = 6, p < 0,05)

ainsi qu'avec le milieu HBSS-BC1 qui contient la même quantité d'ionsbicarbonate que l'EAT :

HBSS-BC1 : 71 ± 5, n = 6, p < 0,05

ou avec un milieu contenant une quantité quatre fois supérieure :

37

HBSS- BC4 : 55 ± 10, n = 6, p < 0,05

Fig . 7 : Cellules excitables (cellules GH3)

A : Modifications de la [Ca2+] i basale dans différentes conditions expérimentales

B : Action de la thapsigargine

38

La variation de la [Ca2+]i basale induite par le CCCP (1 mM) n'est pas

significativement différente pour le milieu standard HBSS (81 ± 7, n = 4,p < 0,05) et pour le milieu réalisé avec l'ETA (80 ± 7, n = 6, p < 0,05).

En résumé, pour les cellules excitables, dans lesquelles la pénétrationdu calcium s'effectue par des canaux calciques voltage-dépendants activés parla dépolarisation de la membrane, l'eau thermale d'Avène augmente laconcentration du calcium cytosolique et diminue la sortie de cet ion à partir dupool libérable. Ces effets sont en rapport avec la présence des ionsbicarbonate.

DISCUSSION

L’eau d’Avène augmente la concentration du calcium libre cytosolique

[Ca2+]i dans les deux modèles cellulaires étudiés ; ces modifications ne sontpas reliées à la teneur en calcium de l'ETA. Nos résultats indiquent toutefoisune différence importante entre les cellules excitables et les cellules non-excitables.

Dans les cellules excitables GH3, l’eau d’Avène entraîne uneaugmentation de la concentration basale d’ions calcium libres cytosoliques

[Ca2+]i et une diminution du pool intracellulaire libérable par la thapsigargine.

On peut donc penser que l’augmentation de la [Ca2+]i résulte de la libération

du Ca2+ contenu dans les compartiments de stockage. Cet effet est égalementproduit par l’adjonction d’ions bicarbonate dans le milieu extracellulaire etdépend de leur concentration. Les effets de l’eau d’Avène sur la concentration

de [Ca2+]i et sur l’amplitude des pools calciques sont comparables à ceuxproduits par les ions bicarbonate à la même concentration que celle présentedans l’eau d’Avène. L'action conjointe des ions calcium et bicarbonate surl'exocytose mastocytaire a été récemment mise en évidence [25, 15].

39

Dans les cellules inexcitables CHOK 1 les ions bicarbonate n’entraînent

pas d’augmentation de la [Ca2+]i ; à forte concentration, ils auraient plutôt

tendance à la diminuer. L’augmentation de la [Ca2+]i provoquée par l’eaud’Avène ne peut donc résulter de l’effet des ions bicarbonate : d’autreséléments doivent intervenir pour expliquer cet effet

Par ailleurs, nos résultats mettent en évidence une diminutionsignificative de la réponse calcique à la thapsigargine après incubation avecl’eau d’Avène dans les deux modèles cellulaires. Ceci suggère que

l’augmentation de la [Ca2+]i basale pourrait être due à la vidange partielle desréservoirs calciques intracellulaires ; ceci aurait pour conséquence de diminuerl’amplitude des variations calciques induites par la thapsigargine.

Nos résultats montrent enfin que la diminution de la réponse à lathapsigargine n’est pas la conséquence d’une vidange partielle des réservoirsmitochondriaux. Dans les cellules inexcitables, la principale voie demobilisation du calcium concerne les réservoirs du réticulum endoplasmiquesensibles à l’inositol-1,4,5-triphosphate. L’eau d’Avène aurait donc pour effetprincipal de réduire la quantité de calcium contenu dans le réticulumendoplasmique.

Les cytokines proinflammatoires de type interleukine (IL-8) entraînentune libération rapide de calcium à partir des pools intracellulaires [24]. Enréduisant le pool libérable par les cytokines proinflammatoires, l’eau d’Avèneseraient susceptible de réduire leurs effets.

La cible de l’eau thermale d’Avène ainsi que les mécanismes parlesquels l’eau d’Avène pourrait réduire le pool calcique libérable du réticulumendoplasmique restent à déterminer. Il a été montré que l’eau d’Avèneaugmente la fluidité de la membrane plasmique [7] ; par ailleurs cette eauactive la phospholipase A2 (Charveron, communication personnelle). Il doitdonc en résulter une production accrue d’acide arachidonique, dont nousavons montré la capacité à libérer le calcium séquestré dans le poolintracellulaire [21]. Des études complémentaires sont nécessaires pour vérifierces hypothèses.

40

Puisque l'eau d'Avène se montre capable d'agir sur la dynamique ducalcium intracellulaire, sur des cellules appartenant à deux types différents, etcompte-tenu de l'utilisation de cette eau thermale presque exclusivement encrénologie dermatologique, nous étendrons dans un proche avenir nosrecherches à des lignées cellulaires directement impliquées dans la pathologiecutanée, en particulier kératinocytes et cellules immunitaires de la peau.

Nous désirons également prendre en considération l'action,parallèlement à celle du calcium, d'un autre constituant cationique importantde l'eau d'Avène, le magnésium. Denda et coll. [10] viennent en effet demontrer l'influence favorable de l'association calcium-magnésium dans larestauration de l'intégrité cutanée ; rappelons que le rapport Mg/Ca estparticulièrement élevé dans l'ETA (Tableau II), par rapport à celui des autreseaux thermales à indication dermatologique (∗ ).

BIBLIOGRAPHIE

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ABSTRACT

Avène spa water modifies the dynamicof intracellular calcium

GH3 pituitary cells (excitable cells) and CHOK 1 hamster ovary cells(unexcitable cells) have been incubated in a standard medium prepared withAvène spa water and compared with the same medium prepared with distilledwater and with other media containing various concentrations of bicarbonate ;calcium concentration was the same in the different media.

Both types of cells, in presence of Avène spa water, showed anincreased concentation of their cytosolic free calcium [Ca2+]i and a decrease ofcalcium release from the calcium-sequestring compartments.

Regarding the excitable cells, the variations of [Ca2+]i appear to belinked to the bicarbonate anions of the thermal waters ; for the unexcitablecells, the influence of constituants different from bicarbonate and yetunknown may be postulated.

Keys-words : Avène-les-Bains, a South France spaPituitary cellsHamster ovary cellsCalcium ionsBicarbonate ionsDynamics of intracellular calcium