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UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA Faculté des Sciences et Technologie et Sciences de la Matière Département de Génie des Procédés Mémoire MASTER ACADEMIQUE Domaine : Science et Technique Filière Génie des Procédés Spécialité : Génie chimique Presenté par : ABBASSI KARIMA Thème Soutenu le 25/06/2012 Devant le jury composé de : Mr. TABCHOUCHE Ahmed MA (A). Président Mr. KAHOUL Fares MA (B). Examinateur Mr. GUERRI Messaoud MA (A). Rapporteur 2011-2012 Synthèse de l’acide acétylsalicylique et l’étude de son effet synergique avec le noyau de l’acide 6- aminopénicillanique 6-APA N° d’ordre : N° de série :

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UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculté des Sciences et Technologie

et Sciences de la Matière

Département de Génie des Procédés

Mémoire

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Science et Technique

Filière Génie des Procédés

Spécialité : Génie chimique

Presenté par : ABBASSI KARIMA

Thème

Soutenu le 25/06/2012

Devant le jury composé de :

Mr. TABCHOUCHE Ahmed MA (A). Président Mr. KAHOUL Fares MA (B). Examinateur

Mr. GUERRI Messaoud MA (A). Rapporteur

2011-2012

Synthèse de l’acide acétylsalicylique et l’étude de

son effet synergique avec le noyau de l’acide 6-

aminopénicillanique 6-APA

N° d’ordre :

N° de série :

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SOMMAIRE

Introduction générale 1

Chapitre I : Généralités sur les composes aromatiques

I-1-Introduction 2

I-2- Nomenclature des composés aromatiques 2

I-3-Les propriétés chimiques des composés aromatiques 4

I- I-3-1- La réaction de substitution électrophile 4

I-4-Les déferlants types de composées aromatiques

I -4-1-Les ester aromatique

I-4-1-Les amides aromatiques

5

5

6

Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques

II-1- Historique 7

II-2-Définition

II-3-Classification

7

7

II.4. Les pénicillines

II.4.1.Définition

II.4.2.Structure générale

II.4.3.Classification II.4.4.Activité antibactérienne

8

8

8

8

10

Chapitre III : Généralités sur la microbiologie

III-1-Introduction 11

III-2- Les bactéries 11

III-3- La structure bactérienne 11

III-4- La classification des bactéries 12

III.4.1.Classification selon le Caractères phénotypiques 12

III.4.2.Classification selon le Caractères génotypiques 13

III.5.Les différents modes d’action des antibiotiques sur les

bactéries

13

III.5.1.Inhibition de la synthèse de la paroi 13

III.5.2.Action sur la membrane 14

III.5.3.Réplication de l’ADN 14

III.5.4.Transcription de l’ADN 14

III.5.5.Traduction de l’ADN 14

Chapitre IV- Matériels et Méthodes

IV.1.Synthèse de l’aspirine

IV.1.1.La réaction

IV.1.2.Conditions expérimentales

IV.1.3.Mode opératoire

15

15

15

16

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IV.2.L’acide 6-aminopénicillanique 17

IV.3.Test de l'activité biologique par la méthode des disques de

papier

18

IV.3.1. Les bactéries utilisées 18

IV.3.2. Le matériels et les réactifs utilisés 18

IV. 3.3.Préparation des solutions 18

IV.3.4.Préparation des mélanges de test 20

IV.3.5. Préparation des solutions de teste 20

IV.3.6. Préparation des disques de papier 20

IV.3.7. Préparation du milieu de culture 20

IV.3.8. Préparation de la suspension microbienne 20

IV .3.9. Préparation des inoculums 20

IV.3 .10.Test préliminaire 21

Chapitre V- Résultats et discussion

V.1.Introduction 22

V .2.Synthèse des composés 22

V.2.1.préparation de l’aspirine 22

V.2.2.préparation de l’acide 6-aminopénicillanique 24

V.3. La chromatographie 24

V.3.1. La chromatographie sur couche mince (CCM) 24

V.4. Résultats des tests bactériologiques 25

V.4.1. Test préliminaire 26

Conclusion générale 27

Bibliographique

Annexes

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Abréviations utilisées

6-APA : L’acide 6-aminopénicilanique

ADN : Acide Di-ribonucléique

CCM : Chromatographie sur couche mince

µm : Micromètre

FITR Infrarouge à Transformé de Fourier

g : Gram

GC : Caractère génotypique

mL : millilitre

NaOH Hydroxyde de sodium

RMN Résonance magnétique nucléaire

IR : Infra rouge

UV : Ultra violet

Teb : Température d’ébullition

Tf : Température de fusion

Rdt : Rendement

Rf Facteur de rétention

ppm : Partie par million

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List des figures et schémas

I -List des figures

Figure I-1: Quelques réactions de substitution électrophile sur le cycle aromatique 5

Figure I-2 : Quelques exemples des esters aromatiques 5

Figure I-3 : Exemple des amides aromatiques 6

Figure II-1 : structure générale de la Pénicilline 8

Figure II-2 : structure de base des pénicillines 9

Figure III.1 : La structure bactérienne 11

Figure III.2 : Mode d’action des antibiotiques sur les bactéries 13

Figure V.1: la plaque CCM de l’aspirine 24

II -List des schémas

Schéma II.1 : L'obtention des pénicillines semi synthétique par acylation de 6-APA. 9

Schéma IV-1 : Synthèse de l’aspirine 15

Schéma V.1 : Mécanisme de la synthèse de l’aspirine 23

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List des tableaux

Tableau I-1 : Noms triviaux de certains composés aromatiques 3

Tableau IV.1: Préparation des solutions test de l’aspirine 19

Tableau IV.2: Préparation des solutions test de l’acide 6-aminopénicillanique 19

Tableau V.1 : Bandes IR de l’aspirine 24

Tableau V.2 : Bandes IR de L’acide 6-aminopénicillanique 25

Tableau V.3: Test préliminaire avec une solution de NaOH 25

Tableau V.4: L’effet des antibiotiques sur l’Escherichia coli 25

Tableau V.5: L’effet des antibiotiques sur la Staphylocoques 25

Tableau V.6: L’effet des antibiotiques sur la Psudomonase 26

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Introduction générale

1

Introduction générale :

La synthèse de molécules organiques à partir de précurseurs simples, est importante

dans l'industrie pharmaceutique. De nouvelles molécules sont souvent conçues et synthétisées

afin de pouvoir évaluer leur activité thérapeutique [1], tel que la synthèse de l'aspirine qui est

un médicament analgésique, antipyrétique, anti-inflammatoire et antiagrégant plaquettaire en

fonction de la dose utilisé. Mais certaines bactéries sont résistantes à l'aspirine, c’est pourquoi

il faut utiliser de nombreux type d'antibiotique comme la pénicilline qui détruise les bactéries

en phase de croissance. Pour étudier les antibiotiques, il faut expliquer quelques définitions

sur les micro-organismes.

Les maladies infectieuses sont responsables de 45% des décès dans les pays à faibles

revenus et de presque une mortalité prématurée sur deux dans le monde entier. Les infections

bactériennes représentent 70% des cas de mortalité causées par les microorganismes [2].

Selon l’Institut Nationale de Santé, les maladies infectieuses représentent la seconde cause des

décès et la première cause de perte d’années de vie productives à travers le monde [3].

La recherche d’une synergie n’est habituellement justifiée que dans les situations où la

bactéricide est difficile à obtenir avec un seul antibiotique. Cependant, la synergie résulte

d’une interaction positive entre deux antibiotiques dont l’action antibactérienne conjointe est

supérieure à la somme des actions de chacun des deux antibiotiques pris isolément. Une

synergie ou un antagonisme observé in vitro ne sont pas toujours extrapolables en clinique.

En effet, les conditions d’action in vivo de deux antibiotiques peuvent être influencées par des

paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques mal pris en compte in vitro [4].

L’utilisation de l’aspirine comme un anti-inflammatoire a un rôle très important dans

le domaine de la chimiothérapie. Cependant, l’association de ce produit avec l’acide 6-

aminopinicillanique peut donner une suite synergique et apporter un degré élevé d’activité

antibactérienne. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à étudier l’effet synergique de

ce composé avec l’acide 6-aminopinicillanique.

Ce travail est réparti en cinq chapitres ; le premier chapitre est consacré pour des

généralités sur les composés aromatiques, tandis que le deuxième chapitre représente des

généralités sur les antibiotiques, le troisième chapitre décrit des généralités sur la

microbiologie, le quatrième chapitre présente les méthodes et le matériels utilisés, et enfin,

résultats et discussions.

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Chapitre I chimie de Composés aromatiques

2

I-1-Introduction :

Le terme aromatique a été utilisé à l’origine pour décrire des molécules odorantes comme

le benzaldéhyde (qu’on retrouve dans les cerises, les pêches et les amandes), le toluène

(provenant du baume de tolu) et le benzène (issu de la distillation du charbon). Il a été montré

par la suite que les composés aromatiques ont un comportement chimique différent de celui des

autres composés.

Le terme aromatique sert à présent à décrire la classe de composés qui comportent des

cycles de type benzénique (cycles à six atomes comportant trois doubles liaisons). Plusieurs

composés importants sont aromatiques en partie, comme l’hormone stéroïdique œstrone, ou

l’analgésique ibuprofène. Le benzène lui- même est responsable de la baisse du nombre de

globules blancs par exposition prolongée et n’est plus utilisé comme solvant au laboratoire [1].

I-2-Nomenclature des composés aromatiques

Les substances aromatiques, plus que toutes autres classes de composés organiques,

ont hérité de nombreux noms triviaux, même si l’emploi de tels noms est à éviter. L’IUPAC

permet l’utilisation de ceux présentés dans le tableau I.1. Ainsi, le méthyl-benzène est

habituellement connu comme étant le toluène, hydroxy-benzène comme le phénol et l’amino-

benzène comme l’aniline etc [1].

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Chapitre I chimie de Composés aromatiques

3

Tableau I-1 : Noms triviaux de certains composés aromatiques [1].

Les benzènes monosubstitués sont nommés de la même façon que les autres

hydrocarbures en ajoutant le suffixe benzène. Ainsi, C6H5Br est le bromo-benzène et

C6CH5CH2CH3 l’éthyl-benzène. Le préfix phényl est employé lorsque le groupement C6H5

est considéré comme substituant et le nom benzyl est utilisé pour le groupement C6H5CH2.

Les composés benzéniques di-substitués sont nommés à l’aide des préfixes

ortho- (o), méta- (m), ou para-(p). Dans un composé ortho-di-substitué, les deux substituant se

trouvent en position 1,2 sur le cycle ; un méta-di-substitué a ses deux substituant en position

1,3, tandis qu'un para-di-substitué a ses deux substituant en position 1,4 :

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Chapitre I chimie de Composés aromatiques

4

Les composés benzéniques ayant plus de deux substituant sont nommés en numérotant

les positions des différents substituant du cycle de telle façon que les nombres les plus faibles

soient utilisés. Les substituant sont nommés dans l’ordre alphabétique.

Dans le troisième exemple, on a utilisé le suffixe -toluène au lieu-de -benzène. On peut

prendre n’importe quel des composés aromatiques monosubstitués du tableau 1 comme

suffixe; dans ce cas, le substituant principal (par exemple le -CH3 dans le toluène) est porté

par définition par le carbone n° 1. Ceci est illustré par les deux exemples suivants :

I-3. Les propriétés chimiques des composés aromatiques :

I-3.1. La réaction de substitution électrophile :

La réaction la plus importante des composés aromatiques est la substitution électrophile. Il s’agit

de la réaction d’un réactif déficient en électrons (électrophile E+) avec un noyau aromatique, qui conduit

à la substitution d’un des atomes d’hydrogène du cycle.

Plusieurs substituant peuvent être introduits sur le cycle aromatique par des réactions de

substitution électrophile, comme il est illustré dans la figure suivante (figure1) [1]:

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Chapitre I chimie de Composés aromatiques

5

Figure I-1: Quelques réactions de substitution électrophile sur le cycle aromatique.

I.4.Les différentes familles des composes aromatiques :

I .4.1.Les ester aromatique :

Les esters sont des composés qui répondent à la formule générale R-COO-R '. Tandis

que, les esters aromatiques sont probablement les dérivés les plus importants des acides

aromatiques, parce qu’ils sont très répandus dans la nature et servent à des usages très divers.

La figure I.2, représente quelques exemples des esters aromatiques.

Figure I-2 : quelques exemples des esters aromatiques.

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Chapitre I chimie de Composés aromatiques

6

I.4.2.Les amides aromatiques :

Parmi les dérivés des acides carboxyliques aromatiques, on peut citer, les amides

aromatiques, qui répondent à la formule générale R-CON-R2, et qui sont les moins sensibles

à l’attaque nucléophile. Un exemple des amides aromatique est représenté dans la figure

suivante [5]:

Figure I-3 : Exemple des amides aromatiques.

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Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques

7

II.1.Historique :

En 1928, Alexander Fleming constate que les staphylocoques dorés qu’il avait

ensemencés sur une gélose nutritive ne sont pas développés à proximité d’une moisissure de

type pénicillium qui avait souillé une culture, il émet l’hypothèse que le pénicillium sécrète

une substance qui tue ou inhibe le développement des staphylocoques, c’est par hasard qu’il a

ainsi découvert la pénicilline, ce premier antibiotique ne sera utilisé qu’à partir de 1942 [6].

II.2.Définition :

Les antibiotiques sont des substances chimiques produites par différent espèces de micro-

organismes, et dont le rôle est de supprimer la croissance d’autres micro-organismes

pathogènes, et éventuellement la destruction de ces derniers [7].

II.3.Classification :

Les antibiotiques sont regroupés en familles dans lesquelles les différents produits ont

une communauté de structure chimique et un mécanisme d’action identiques (ces deux

propriétés étant souvent liées). Les antibiotiques actuellement utilisés en médecine sont

regroupés en 10 familles : les B-lactamines, les aminosides, les phénicolés, les cyclines, les

macrolides, les lincosamines, les synergistines, les polypeptides, les glycopeptides, et les

quinolanes. Un certain nombre de produits orphelins comme les rifamycines, la fosfomycine

doivent être ajoutés à cette liste.

Les sulfamides, inhibiteurs compétitifs de l’acide para-amino-benzoïque dans la synthèse

de l’acide folique ne sont pas à proprement parler des antibiotiques.

A l’intérieur d’une famille, les produits peuvent être regroupés selon leur spectre

d’activité (ensemble des groupes bactériens sensibles à l’antibiotique considéré). Ils peuvent

aussi être regroupés en fonction des modifications successives qui ont été apportées à leur

structure chimique, pour améliorer leur spectre d’activité ou leur pharmacologie ; On parle

alors de (générations d’antibiotiques) [8].

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Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques

8

II.4. Les pénicillines :

II.4.1.Définition :

Les pénicillines sont des bactéricides apparents à la famille des bâtalactamines [9]. La

pénicilline peut être extraite à partir de nombreuses espèces de Pénicillium et

d’Aspergillus. Historiquement, c'est la souche de Penicillium notatum qui était utilisée

[10].

Les Pénicillines sont indiquées dans le traitement des infections à germes sensibles

telles que l’angine streptocoque, l’érysipèle, l’endocardite bactérienne (infection d’une des

tuniques du cœur, l’endocarde), la syphilis et l’angine de Vincent, et en prévention des

crises de rhumatisme articulaire aigu.

Le spectre des Pénicilline est en médicaments sont peu nombreuses : bacille de la

diphtérie, gonocoque, méningocoque, etc. par ailleurs, les bactéries deviennent de plus en

plus résistantes aux pénicillines, certaines sécrètent une enzyme, la pénicillines, capable

de détruire plusieurs variétés de pénicillines [9].

II.4.2.Structure générale :

Elles sont constituées d’un noyon théazolidine (A) attaché à un noyon béta-lactam(B),

portant un groupement amine secondaire (R-NH-R’). Le radical acide R peut être attaché

ou bien séparé du groupement amine par les bactéries et autres amidases (Figure 2) [7].

Figure II.1 : Structure générale de la Pénicilline.

L’acide 6-aminopénicillanique (cycle thiazolidine lié au cycle beta-lactame) est le

noyau de base des pénicillines.

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Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques

9

Figure II.2 : Structure de base des pénicillines (6-APA).

Il peut être substitué par l’acylation de la fonction amine, à l'aide de chlorures d'acyles

dans l'acétone et en présence de la triéthylamine pour neutraliser HCl formé et donner des

dérivés qui se caractérisent par leur stabilité.

Schéma II.1 : L'obtention des pénicillines semi synthétique par acylation de 6-APA.

Par ailleurs, la fonction carboxylique peut être transformée en carboxylate (plus

soluble) où permettre l’obtention d’esters (prodrogues). Cette fonction acide est toutefois

essentielle à l’activité antibactérienne (elle fait partie du pharmacophorie)[11].

II.4.3.Classification :

Les diverses Pénicillines peuvent être classées de la façon suivante en fonction de

certaines de leurs propriétés :

II.4.3.1.Groupe G :

Les pénicillines G sont d’origines naturelles, elles sont très soluble dans l’eau, mais

instable en solution, inactivée par l’acidité gastrique, elles doivent être administrées par vois

parentérale. On l’utilise aussi bien sous forme de sel de sodium ou de potassium.

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Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques

10

II.4.3.2.Groupe M :

Les pénicillines du groupe M sont particulièrement indiquées pour le traitement des

infections à staphylocoques producteurs de cet enzyme. Elles sont sensiblement moins actives

que les précédentes, mais résistantes à la pénicillinase.

II.4.3.3.Groupe A (ampicilline) :

Ces pénicillines semi-synthétiques ont le spectre d’activité de la pénicilline G avec une

action élargie sur les entérocoques et les bacilles Gram négatifs [6]. Elles sont encore très

largement utilisées notamment à cause de leur excellente diffusion [8].

II.4.3.4.Pénicillines anti-pyocyaniques :

Membres plus récents du groupe des pénicillines.

On distingue actuellement deux principaux groupes :

Les carboxypénicillines ;

Les uréidopénicillines.

II.4.4.Activité antibactérienne :

Les étapes du mécanisme antibactérien sont :

a. Liaison de la molécule de pénicilline aux protéines spécifiques dites

PBPC(PénicillinBindingProtéins) qui jouent le rôle de récepteur bactériende la

pénicilline,

b. Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne par blocage de la transpeptidation des

peptidoglycans,

c. Activation des enzymes autolytiques de la paroi bactérienne conduisant à la lyse

bactérienne [6].

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Chapitre III généralités sur la microbiologie

11

III.1.Introduction :

La microbiologie a souvent été définie comme l’étude d’organismes trop petits pour

être vus à l’œil nu, on peut même dire c’est l’étude des micro-organismes. Elle est

principalement concernée par les organismes d’un diamètre inferieur à un millimètre, qui sont

invisibles et doivent être examinés au microscope, tels que les virus, les bactéries [11].

III.2.Les bactéries :

Les bactéries sont les plus petits organismes connus, doués de métabolisme et capables

de croitre et de se diviser aux dépens de substances nutritives. Leur diamètre est

habituellement d’environ 1µm [10].

III.3.La structure bactérienne :

C’est la microscopie électronique avec ses différents modes d’exploitation qui a mis

en lumière l’architecture de la bactérie telle quelle est représentée dans la (figure III.1).

Figure III.1 : La structure bactérienne.

Les coupes ultrafines ont permis en particulier de découvrir la ((structure fine)) des

bactéries. La cellule apparait entourée d’une enveloppe rigide, la paroi qui lui donne sa forme,

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Chapitre III généralités sur la microbiologie

12

sa résistance et qui entoure une seconde enveloppe beaucoup plus mince et plus délicate, la

membrane cytoplasmique. Le cytoplasme sous-jacent, en général très homogène, contient

essentiellement des granulations d’acide ribonucléique, les ribosomes, parfois aussi des

substances de réserve qui rendement sa structure plus grossière. Il ne referme aucun des

organismes décrit dans la cellule eucaryote (réticulum endoplasmique, mitochondries…).

Dans le cytoplasme, l’appareil nucléaire se distingue par son aspect fibrillaire,

finement réticulé. Il n’est pas entouré d’une membrane. La paroi, la membrane, le cytoplasme

et l’appareil nucléaire représente les structures essentielles de la cellule. Elles sont toujours

présentes. D’autres peuvent éventuellement s’y adjoindre : la capsule, enveloppe externe qui

pet prendre un développement considérable lorsqu’on favorise la synthèse de ses

constituants ; les flagelles de nature protéique, qui confèrent à la bactérie sa mobilité ; enfin

les pili au fimbriae plus fins que les flagelles rigides et cassants ; certains, appelés pili sexuels

joueraient un rôle au cours de la conjugaison bactérienne [10].

III.4.La classification des bactéries :

Une classification des bactéries est nécessaire à la communication scientifique. Les

bactéries sont classées selon une nomenclature internationale, elles sont désignées par deux

mots latins écrits en italique : le premier, commençant par une majuscule, désigne le genre, et

le second en commençant par une minuscule, caractérise l'espèce (par exemple

Staphylocoques aureus). En pratique, on utilise aussi des termes communs tels que

staphylocoque, colibacille, etc.

La classification des bactéries (taxonomie) a d'abord été fondée sur l'étude de leurs

caractères phénotypiques, puis de leurs caractères génotypiques.

III.4.1.Classification selon le Caractères phénotypiques :

• La morphologie : forme de la bactérie, mobilité éventuelle traduisant la présence de

flagelles, présence éventuelle de spores : coloration de Gram, aspect des colonies, etc. [12].

• Les propriétés biochimiques : relation avec l'oxygène, utilisation de différentes sources

de carbone, besoin en facteurs de croissance.

• La nature des antigènes de surface.

• La sensibilité aux antibiotiques.

• La sensibilité à des bactériophages.

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Chapitre III généralités sur la microbiologie

13

• L'analyse des constituants de la paroi.

III.4.2.Classification selon le Caractères génotypiques :

Ils reposent sur l'étude du génome.

• La composition en base de l'ADN (GC%) peut varier selon les espèces.

• La mesure du pourcentage d'homologie de l'ADN avec une souche de référence (déterminé

par hybridation) est une méthode qui a été très utilisée en taxonomie. On considère que des

souches ayant plus de 70% d'homologie appartiennent à la même espèce. Ce critère a conduit

à modifier des classifications qui avaient été établies en fonction de caractères phénotypiques.

Le séquençage du gène de l'ADN ribosomal 16S, gène qui comporte des régions

conservées et des régions variables, est également très employé pour la classification des

bactéries [13].

III.5.Les différents modes d’action des antibiotiques sur les bactéries :

Ils agissent au niveau du métabolisme cellulaire sur des cibles très variées que tente de

schématiser la figure III.2 [10].

Figure III.2 : Mode d’action des antibiotiques sur les bactéries.

III.5.1.Inhibition de la synthèse de la paroi :

Les antibiotiques inhibant la synthèse de paroi sont bactéricides est agissent seulement

sur les germes en phase active de multiplication. Ainsi, lorsque des bactéries Gram positives

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Chapitre III généralités sur la microbiologie

14

comme staphylococcus aureus, en voie de croissance, sont traitées par la pénicilline, la

synthèse de leur paroi est arrêtée.

III.5.2.Action sur la membrane :

Les antibiotiques de nature polypeptidique comme la thyrothricine, la polymyxine et les

antibiotiques voisins agissent sur la membrane cytoplasmique à la manière des agents tensio-

actifs. L’intégrité de la structure de la membrane n’est plus maintenue. Les cellules, dont la

plupart des constituants s’échappent, dégénèrent puis meurent, atteintes dans leurs fonctions

vitales essentielles.

III.5.3.Réplication de l’ADN :

La mitomycine C et les porfiromycines en formant des ponts entre les deux chaines de

l’hélice d’ADN empêchent leur migration au moment de la division cellulaire. La réplication

de l’ADN par l’ADN polymérase qui nécessite une séparation totale des deux chaines devient

impossible. Ces substances inhibent donc la synthèse de l’ADN, bloquent la division et

provoquent l’accumulation dans la bactérie d’une grande quantité de désoxy-ribonuclésides

libres et de thymine.

III.5.4.Transcription de l’ADN :

L’actionomycine représente le chef de file de ce type d’agents. Elle ne bloque pas l’activité

de l’ADN polymérase qui réplique l’ADN, mais celle de l’ARN polymérase qui copie lune

des chaines de l’ADN en l’utilisant comme matrice pour la synthèse de l’ARN messager. La

présence d’actionomycine empêche la progression de l’ARN polymérase le long de cette

matrice.

III.5.5.Traduction de l’ADN :

Un certain nombre d’antibiotiques agissent directement sur la synthèse des protéines

au niveau des ribosomes en empêchent la lecture du code ou en la faussant [10].

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

15

IV.1.Synthèse de l’aspirine :

Dans notre travail, nous avons choisi un protocole de synthèse pour préparer l’aspirine

qui a été décrit par Nicolas CHEYMOL et all [14]. Ce produit a été testé avec l’acide 6-

aminopénicillianique sur quelques bactéries pour déterminer l’effet synergique.

IV.1.1.La réaction :

Schéma IV-1 : Synthèse de l’aspirine.

Il s’agit d’une réaction d’estérification de l’acide salicylique par l’anhydride acétique en

présence d’acide sulfurique, qui joue le rôle de catalyseur [14].

IV.1.2.Conditions expérimentales :

IV.1.2.1.Réactifs utilisés :

Les réactifs utilisés dans ce travail sont de la marque (Merck).

L’acide salicylique.

L’anhydride acétique.

L’acide sulfurique.

L’éthanol.

IV.1.2.2. Matériels :

L’erlenmeyer de 100 ml.

Bain marie.

Thermomètre.

Pipette pasteur.

cristallisoir de 250 ml.

Agitateur magnétique.

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

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Entonnoir de Buchner.

Fiole à vide.

Evaporateur rotatif.

IV.1.2.3.Le point de fusion :

Le point de fusion a été mesuré sur un tube capillaire par un appareil électro- thermal de

type GALLENKAMP.

IV.1.2.4.La chromatographie :

La chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée sur les plaques d’alumine, et

les spots ont été révélés par la lampe UV.

IV.1.2.5.Spectre Infrarouge :

Les spectres infrarouges ont été enregistrés sur un appareil FITR, marque SHIMADZU.

IV.1.2.6.Spectres RMN :

Les spectres RMN 1H,

13C ont été enregistrés sur un appareil spectrophotomètre de type

Brucker AC 300 WBP.

IV.1.3.Mode opératoire :

Dans un erlenmeyer de 100 mL dont on a éliminé les traces d’eau par un lavage à

l’acétone et un séchage sous l’air comprimé, (3.0 g, 21.73 mmol, 1 eq) d’acide salicylique sont

introduite suivi par l’addition de 7.0 mL d’anhydride acétique et de 30 à 40 gouttes d’acide

sulfurique à l’aide d’une pipette pasteur. Le mélange est placé dans un bain d’eau à 80 °C et

agité pendant 10 minutes, afin de dissoudre le solide et obtenir une solution limpide. Ensuite,

l’erlenmeyer est retiré du bain d’eau et 100 gouttes d’eau sont ajoutées. Le mélange est chauffé à

nouveau sur un bain d’eau pendant 5 minutes et 30 mL d’eau sont ajouté et laissé refroidir à

température ambiante. Un précipité blanc d’acide acétylsalicylique est apparaît et la précipitation

est complétée en plongeant l’erlenmeyer dans un bain d’eau glacée. Le solide est filtré sur un

entonnoir de Buchner, lavé avec 10 mL d’eau glacée, puis recristallisé avec l’éthanol.

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

17

IV.1.3.1.Résultats:

Recristallisation(EtOH). Solide blanc, Rdt= 51%.

IR [νmax (KBr, Disc) = 2800– 3300 cm-1

(O-H), 1683.7 cm-1

(C=O) et 1305.7 cm-1

(C-

O)].

Le point de fusion : 135°C (littérature 137°C).

RMN1H (300 MHz, DMSO-d6) : δ=2.24(s, 3H), 7.18 (d,

3J=7.9Hz, 1H), 7.37(t,

3J=7.5 Hz,

1H), 7.62(t, 3J=7.1 Hz, 1H), 7.93 (d,

3J=7.7Hz, 1H) ppm.

RMN 13

C (75MHz, DMS-d6) : δ=21.1, 123.9, 124.6, 126.2, 131.6, 133.8, 150.4, 166.0,

169.4 ppm

C9H8O4 (180 g/mol). Rf (cyclohexane/Acétate d’éthyl ; 20 / 80) = 0.54.

Le point de fusion : 135°C, Lit [14] = 137°C.

IV.2.L’acide 6-aminopénicillanique:

L’acide 6-aminopénicillanique a été préparé dans un laboratoire a SAIDAL et sa structure

a été confirmé par les analyses IR et RMN 1H.

IR [νmax (KBr, Disc) = 3500 cm-1

(N-H), 1772.5 cm-1

(C=O) et 1338.5 cm-1

(C-O)].

RMN 1H(300 MHz, DMSO-d6) : δ=1.47(s, 3H), 1.56(s, 3H), 4.14(s, 1H),

4.55(d, 3J=4.2 Hz, 1H), 5.39(d,

3J=4.2 Hz, 1H) ppm.

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

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IV.3.Test de l'activité biologique par la méthode des disques de papier:

Après la préparation des composés aromatiques, on a testé leur efficacité biologique sur

quelques types de bactérie par la méthode de diffusion dans laboratoire de l’établissement

publique de sante de proximité Ouargla (SEMEP/O).

IV.3.1. Les bactéries utilisées :

Escherichia Coli : Gram Négatif.

Staphylocoques : Gram positif.

Pseudomonase.

IV.3.2. Le matériels et les réactifs utilisés :

Des boite de pétri.

Pipette pasteur.

Disques papier filtre.

Des tubes à essai.

L’eau distillée.

L’eau physiologique.

Autoclave.

IV. 3.3.Préparation des solutions :

IV. 3.3.1.Préparation de la solution mère de l’aspirine :

Dans un bécher de 250 mL (0.5 g) de l’aspirine est introduit, suivit par l’addition de 160

mL de l’eau distillée. Une solution de l’aspirine de concentration 3.125 g/l est obtenue. Ensuite, 1

mL de la solution préparée est transféré dans un erlenmeyer et 30.25 mL de l’eau distillée sont

ajoutés, pour obtenir une solution mère de concentration 100 µg/mL.

IV. 3.3.2.Préparation des solutions test de l’aspirine :

Après avoir préparé la solution mère, des solutions test sont préparés, comme il est

indiqué dans le tableau IV.1.

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

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Tableau IV.1: Préparation des solutions te stde l’aspirine :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentration

μg/mL

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Volume de

l’eau mL

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Volume de

l’aspirine mL

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5

IV. 3.3.3.Préparation de la solution mère de l’acide 6-aminopénicillanique:

Dans un bécher de 250 mL (1 g) de 6-APA est introduit, suivit par l’addition de (0.18 g)

de NaOH et 20 mL de l’eau distillée. Le mélange est agité à température ambiante et une solution

de 6-APA de concentration 55.05 g/l est obtenue. Ensuite, 0.1 mL de la solution préparée est

transféré dans un erlenmeyer et 54.95 mL de l’eau distillée sont ajoutés, pour obtenir une solution

mère de concentration 100 µg/mL.

IV. 3.3.4.Préparation des solutions test de l’acide 6-aminopénicillanique:

Après avoir préparé la solution mère, des solutions test sont préparés, comme il est

indiqué dans le tableau IV.2.

Tableau IV.2: Préparation des solutions test de l’acide 6-aminopénicillanique:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentration

μg/ml

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Volume de

l’eau ml

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Volume de la

pénicilline ml

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

20

IV.3.4.Préparation des mélanges de test : Pour préparer les mélanges de test ; on prélève 50 %

de chaque solution qui ont la même concentration.

IV.3.5. Préparation des solutions de teste : On prend 10 ml de solution d’hydroxyde de sodium

à des concentrations différentes.

IV.3.6. Préparation des disques de papier :

On coupe le papier en petits disques de 5 mm de diamètre, on les met dans l’étuve et les

laisser stérilisés à 130 °C pendant 45 minutes.

IV.3.7. Préparation du milieu de culture :

Après la dissolution du milieu de Muller Hinton, on le verse dans les boite de pétri, on

laisse le milieu jusqu’à la solidification et on le sèche dans un étuve pendant 15 minutes pour le

déshumidifier.

IV.3.8. Préparation de la suspension microbienne :

On dépose à chaque fois une goutte du milieu de culture délivrée à la pipette pasteur pour

les trois espèces de bactéries dans des tubes à essai contenant un Bouillon nutritif (10 ml), en

agitant bien, et on prend une suspension de densité 0.5 McFarland pour chaque bactérie. On

disperse la suspension sur le milieu de Muller Hinton contenu dans la boite de pétri, et on passe 3

fois sur la même zone afin de s’assurer qu’il est entièrement couvert, puis on l’incubait pendant

18-24h à 37 0C.

IV .3.9. Préparation des inoculums :

La méthode utilisé pour la préparation des inoculum, est la méthode de VINCENT

(JACOBETAL, 1979) [13]. On prépare deux tube à essai qui contiennent respectivement :

l’aspirine dans l’eau distillée et l’acide 6-aminopénicillanique dans hydroxyde de Sodium, des

disques de papier filtre de 3 mm de diamètre sont immergé dans les tube et sont imprégnés d’une

faible quantité de nos produits, puis à l’aide de distributeur, on les dépose à la surface de boite

pétri préalablement ensemencée à la surface par les bactéries à étudiés. Après l’incubation ; on

fait la lecture des résultats par la mesure de diamètre d’inhibition en mm.

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Chapitre IV : Matériels et Méthodes

21

IV.3 .10.Test préliminaire :

Dans le but de tester la toxicité du solvant vis-à-vis les souches bactériennes, on ajoute 2

ml de NaOH à une boite de pétri contenant le milieu de culture, puis on mélange pour

homogénéiser le milieu, et ensemencer les bactéries à étudiés, puis on laisse le milieu jusqu’à la

solidification. Après l’incubation ; on fait la lecture des résultats.

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Chapitre V : Résultats et discussion

22

V.1.Introduction :

De nombreux travaux de recherches en synthèse organique montrent l’importance et la

synthèse de l’aspirine. Cependant, après la Première Guerre mondiale, le Traité de Versailles

stipule que la marque et le procédé de fabrication tombent dans le domaine public dans un

certain nombre de pays (France, États-Unis… mais ils perdurent dans d'autres pays comme le

Canada). Tandis que l'acide 6-aminopénicillanique est le noyau de base des pénicillines. Il est

obtenu de la fermentation de la moisissure Penicillium et est utilisé comme composé de départ

dans la préparation de nombreuses pénicillines d'hémisynthèse.

L’originalité de ce travail consiste dans l’étude de l’effet synergique de ces deux

composés.

V .2.Synthèse des composés :

V.2.1.préparation de l’aspirine:

L’acide acétylsalicylique (Aspirine) a été préparé en deux étapes. Dans un premier

temps, l’anhydride acétique réagit avec l’acide sulfurique pour former un intermédiaire

réactionnel. Ce dernier réagit ensuite avec l’acide salicylique pour former l’aspirine selon le

mécanisme indiqué dans le Schéma V.1 [14].

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Chapitre V : Résultats et discussion

23

Schéma V.1 : Mécanisme de la synthèse de l’aspirine.

La structure de ce composé a été identifiée par les méthodes spectroscopiques telles

que RMN 1H, RMN

13C et IR.

Le spectre RMN 1H présente cinq signaux distincts, à 2.24 ppm (s, 3H, CH3), 7.18

ppm (d, 1H, CH aromatique), 7.37 ppm (t, 1H, CH aromatique), 7.62 ppm (t, 1H, CH

aromatique) et 7.93 ppm (d, 1H, CH aromatique).

Le spectre RMN 13

C montre neuf signaux à 21.1 ppm (s, CH3), 123.9 ppm (s, CH

aromatique), 124.6 ppm (s, C aromatique), 126.2 ppm (s, CH aromatique), 131.6 ppm (s, CH

aromatique), 133.8 ppm (s, CH aromatique), 150.4 ppm (s, C aromatique), 166.0 ppm (s, C du

groupement acide) et 169.4 ppm (s, C du groupement ester).

Le spectre IR montre deux bandes caractéristiques larges ; entre 2800 cm-1

et 3300

cm-1

attribuée à la vibration d’élongation de la liaison O-H de l’acide aromatique, et à 1683.7

cm-1

attribuée à la vibration de valence de la liaison C=O de l’ester aromatique. D’autres

bandes sont indiquées dans le tableau V.1:

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Chapitre V : Résultats et discussion

24

Tableau V.1 : Bandes IR de l’aspirine.

Fréquence cm-1 observation

3050 cm-1

Correspond au C-H aromatique

1751.2 cm-1

Vibration d’élongation du C=O de l’acide

aromatique

1604 .7 cm-1

Vibration d’élongation de C=C aromatique

1305.7 cm-1

Vibration d’élongation de C-O de l’ester

V.2.1.1. La chromatographie sur couche mince (CCM) :

On observe l’apparition d’une seule tache, ce qui preuve qu’on a un seul produit,

comme il est représenté sur la figure suivante :

Figure V.1: la plaque CCM de l’aspirine.

V.2.2.préparation de l’acide 6-aminopénicillanique:

L’acide 6-aminopénicillanique a été préparé dans un laboratoire à SAIDAL, est sa

structure a été confirmé par les méthodes spectroscopiques telles que RMN 1H, IR.

Le spectre RMN 1H présente cinq signaux distincts, à 1.47 ppm (s, 3H, CH3), 1.56

ppm (s, 3H, CH3), 4.14 ppm (s, 1H, CH), 4.55 ppm (d, 1H, CH) et 5.39 ppm (d, 1H, CH).

Le spectre IR montre deux bandes caractéristiques ; à 3500 cm-1

attribuée à la

vibration d’élongation de la liaison N-H de l’amine primaire, et à 1772.5 cm-1

attribuée à la

vibration de valence de la liaison C=O de l’acide. D’autres bandes sont indiquées dans le

tableau V.2:

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Chapitre V : Résultats et discussion

25

Tableau V.2 : Bandes IR de L’acide 6-aminopénicillanique.

Fréquence cm-1 observation

2983.7 cm-1

Vibration d’élongation du C-H de CH3

1624.0 cm-1

Vibration d’élongation du C=O de lactame

1338.5 cm-1

Vibration d’élongation de C-O de l’acide

V.4. Résultats des tests bactériologiques :

V.4.1. Test préliminaire :

Tableau V.3: Test préliminaire avec une solution de NaOH.

Souche de test Ensemencement sans

NaOH

Ensemencement avec

NaOH

Escherichia Coli Croissance Croissance

Staphylocoques Croissance Croissance

Psudomonase Croissance Croissance

D’après les résultats du tableau, on constate la croissance des bactéries, ce qui veut

dire que la solution de NaOH n’a aucune influence sur les bactéries.

1) Test sur l’Escherichia coli :

Tableau V.4: L’effet des antibiotiques sur l’Escherichia coli.

Composé Escherichia Coli Diamètre (mm) Catégorie de la

souche

6-APA - 0 R

Aspirine - 0 R

Mélange - 0 R

(+) : sensible au compose, (-) : résistante.

D’après les résultats du tableau, on constate que notre souche (Escherichia Coli) de

test est résistante à l’aspirine et à 6-APA, ainsi qu’au mélange. Donc, les composés

synthétisés n’ont pas une activité antibactérienne.

2) Test sur la Staphylocoques :

Tableau V.5: L’effet des antibiotiques sur la Staphylocoques.

Composé Staphylocoques Diamètre (mm) Catégorie de la

souche

6-APA - 0 R

Aspirine - 0 R

Mélange - 0 R

D’après les résultats du tableau, on constate que notre souche (Staphylocoques) de

test est résistante à l’aspirine et à 6-APA, ainsi qu’au mélange. Donc, les composés

synthétisés n’ont pas une activité antibactérienne.

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Chapitre V : Résultats et discussion

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3) Test sur la Psudomonase :

Tableau V.6: L’effet des antibiotiques sur la Psudomonase.

Composé Psudomonase Diamètre (mm) Catégorie de la

souche

6-APA - 0 R

Aspirine - 0 R

Mélange - 0 R

D’après les résultats du tableau, on constate que notre souche (Psudomonase) de test

est résistante à l’aspirine et à 6-APA, ainsi qu’au mélange. Donc, les composés synthétisés

n’ont pas une activité antibactérienne.

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Conclusion générale

27

Conclusion générale :

Ce travail nous a permis d’apprendre beaucoup de choses à savoir ; les différentes

méthodes de synthèses, les techniques de purifications, la maîtrise de différentes méthodes

d’analyses et les testes biologiques.

Nous avons dans un premier temps, synthétisé l’acide acétyl salicylique avec un

rendement acceptable. La purification de ce produit a été faite par la recristallisation dans

l’éthanol et sa structure a été confirmée par les méthodes spectroscopiques telles que ; IR, RMN

1H et RMN

13C. Dans un second temps, nous avons testé ce produit avec 6-APA sur trois types

de bactéries ; Escherichia Coli, Staphylocoques et Pseudomonase.

Et d’après les résultats obtenus, nous constatons que les produits testés n’ont aucune

activité antibactérienne. Cependant, la combinaison des deux produits avec différentes

concentrations n’a donné aucun effet synergique, où antagonisme.

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Références

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Dunod, Paris, 2007, p- 171.

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[6]-Jeam. Figarelle ; Guyleyral. Michéle. Terret., Microbiologie générale et appliquée, edition

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[7]-Helai. Abdelkader., Pharmacologie Fondamentale et clinique, ENAG Edition Alger, 1999, p-

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[8]-Jean. Louis. Fauchére ; Jean. Loup., Bactériologie général et médicale, Elipses Edition

Marketing S.A, 2002, p-

[ 9]-Frank. G. Staughter Petit Larousse de médecine, Paris, 2008, p-710.

[10]-H. Leclerc ; D. Izard ; M. O. Husson ; P. Wather ; E. Jakubzak., Microbiologie générale,

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[11]-Lansing. M. Prescott; Johm. P. Harhey; Donld. A. Klein., Microbiologie, 2eme

édition

française, , p-2.

[12]-Erimont. Pad, taxonomy and classification of bacteria, manual of clinical microbiology, 7th

edition, 1997, p-.

[13]-Murray. P; Barone. ASM Press, Wasington, ,p-249-261.

[14]-Nicolas. Cheymol ; Michael. Hoff., La microchimie, DeBoeack, Paris, 1999, p-194.

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Annexes

L’effet de l’aspirine sur l’Escherichia coli

L’effet de l’aspirine sur la Pseudomonase

L’effet de l’aspirine sur la Staphylocoques

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Annexes

L’effet de la 6-APA sur l’Escherichia Coli

L’effet de 6-APA sur la Staphylocoques

L’effet de 6-APA sur la pseudomonas

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Annexes

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Annexes

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Annexes

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Annexes

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Annexes

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Résumé :

L’acide acétylsalicylique a été synthétisé par la réaction de l’acide salicylique et

l’anhydride acétique en présence de l’acide sulfurique comme catalyseur avec rendement

acceptable. La structure de ce produit a été confirmée par L’infrarouge à transformer de

fourrier, RMN 1H et RMN

13C.

Le produit préparé a été testé avec l’acide 6-amino pénicillique sur les bactéries telles

que ; Escherichia Coli, Staphylocoques, Pseudomonase et l’effet synergique a été déterminé.

Mots clés : acide salicylique, anhydride acétique, acide acétylsalicylique, acide 6-amino

pénicillique, effet synergique, bactéries.

Abstract:

The acetyl salicylic acid has been synthesized by the reaction of salicylic acid and acetic

anhydride in presence of sulfuric acid as a catalyst, with an acceptable yield. The product has

been characterized by the FITR, RMN 1H and RMN

13C.

The product has been tested with 6-amino penicillic acid on bacteria Escherichia coli,

Staphylococcus and Pseudomonase, and then the synergic effect was determined.

Keywords: 6-amino penicillic acid, acetyl salicylic acid, salicylic acid, acetic anhydride,

Biological effect.

:ملخص

جم جحضٍس حمض االسحٍم سانٍسٍهٍك عن طسٌق جفاعم حمض انسانٍسٍهٍك مع انهدزٌد اسحٍك فً وجىد حمض

انكبسٌث كمحفز و ذنك بمسدود مقبىل و جم انحاكد من صٍغة هرا انمسكب بىاسطة انححانٍم انمطٍافٍة منها االشعة جحث

RMN انحمساء و انسنٍن اننىوي انمغناطٍسً 1Hو RMN

13C

انبكحٍسٌا انقىنىنٍة انمكىزات انعنقىدٌة و :امٍنى بٍنٍسٍالنٍك عهى انبكحٍسٌا انحانٍة-6هرا انمسكب ثم اخحبازه مع حمض

انبسىدومىناس و جم جحدٌد انحأثٍس انبٍىنىجً

:الكلمات الدالة

امٍنى بٍنٍسٍالنٍك حمض االسحٍم سانٍسٍهٍك حمض انسانٍسٍهٍك انهدزٌد اسحٍك جاثٍس بٍىنىجً-6حمض