DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 - Thèses · DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention...

Université Victor Segalen Bordeaux 2

Année 2009

Thèse n°1689

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales

Option : Biologie-Santé

Présentée et soutenue publiquement

Le 21 décembre 2009

Par Christophe VELOURS

Né(e) le 22 juillet 1982 à Talence

REPLICATION DE L’ADN MITOCHONDRIAL

Identification d’une seconde activité ADN polymérase dans la mitochondrie de S.cerevisiae

et Contribution à l’étude du réplisome mitochondrial

Membres du Jury

Mr le Professeur Serge ALZIARI ...........................................................Rapporteur Mr le Docteur Jean-Michel ROSSIGNOL..............................................Rapporteur Mme le Docteur Colette SAILLARD .....................................................Examinateur Mr le Professeur Michel RIGOULET.....................................................Président du jury Mr le Docteur Michel CASTROVIEJO..................................................Directeur de Thèse

1

Table d’abréviations

8-hydroxyguanine : 7,8-Dihydro-8-oxoguanine

AD : Domaine d’Activation

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ADNmt : Acide DésoxyriboNucléique mitochondrial

ADP : Adénosine diphosphate

ANCP : Adenine Nucleotide Carrier protein

APAF1 : Apoptotic Protease Activating Factor 1

APS : Ammonium PerSulfate

ARN : Acide RiboNucléique

ARS : Séquences de Réplication Autonome

ATP : Adénosine TriPhosphate

AZT-TTP : Azidothymidine

BER : Base Excision Repair

BN-PAGE : Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis

BRCT : Brca1 C-terminal

BSA : Bovine Serum Albumin

CHAPS : 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate

CN-PAGE : Clear Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis

CPD : Cyclobutane Pyrimidine Dimers

CSBs : Conserved Sequence Blocks

dATP : DésoxyAdénine 5'-TriPhosphate

DBD : DNA Binding Domain

dCTP : désoxyCytidine 5'-TriPhosphate

DDSA : Dodecenyl Succinic Anhydride

dGTP : Désoxyguanosine triphosphate

DMP30 : Tris-2,3,6-(dimethylaminomethyl)phenol

dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate

DO : Densité Optique

DOA : Atrophies Optiques Dominantes

dRP : désoxyribose phosphate

DSP : Dithiobis(Succinimidyl Propionate)

dTTP : désoxyThymidine Triphosphate

DSO : Origine Double Brin

DTT : Dithiothréitol

ESI : ElectroSpray Ionization

EDTA : Ethylène diamine tétraacétique

EGTA : Ethylene Glycol Tetraacetic Acid

FapyG : 2,6-Diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine

FEN1 : Flap endonucléase 1

FPLC : Fast protein liquid chromatography

G6PDH : Glucose-6-phosphate déshydrogénase

GFP : Green Fluorescent Protein

GST : Glutathione-S-Transferase

HA : Hemagglutinin

HCA : Hydrophobic Cluster Analysis

HMG : High Mobility Group

HSP : Heavy Strand Promotor

IgG : Immunoglobuline G

LC-MS/MS : Liquid Chromatography MS/MS

LHON : Leber Hereditary Optic Neuropathy

LSP : Light Strand Promotor

LP-BER : Long Patch Excision Repair

MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

MCM : MiniChromosomal Maintenance

MNA : Methylnorbornène-2,3-dicarboxylic anhydre

MRP : Mitochondrial RNA Processing

MS/MS : Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry

MTS : Mitochondrial Targeting Sequence

NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide

NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate

NARP : Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire

NEM : N-éthylmaléimide

NER : Nucleotide Excision Repair

NHEJ : Non homologuous End Joining

NI : Non Identifiée

ORC : Origin Replication Complex

ORF : Open Reading Frame soit cadre ouvert de lecture

PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen

PCR : Polymerase Chain Reaction

PEG : Polyéthylène Glycol

PEO : Ophthalmoplégies Externes Progressives

Pi : Phosphate inorganique

PIP : PCNA-interacting-protein

PMSF : PhenylMethylSulphonyl Fluoride

Pol : ADN polymérase

PTH : PhénylThioHydantoïne

PVDF : Polyvinylidene Fluoride

ROS : Reactive Oxygen Species

RPA : Replication Protein A

RT-PCR : Real-time PCR

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

SP : Sulfopropyl

SP-BER : Short Patch Excision Repair

SPDP : N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate

SSB : ADN simple brin

SV40 : Simian Virus 40

SYNM : asparaginyl-ARNt synthétase

TAPTAG : Tandem-Affinity Purification tag

TCA : Trichloroacetic acid

TEMED : N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine

TEV : Tobacco Etch Virus

Thymine glycol : 5,6-dihydro-5,6-dihydroxythymine

TIM : Transport Inner Membrane

TLS : TransLesion Synthesis

TOF : Time-Of-Flight

TOM : Transport Outer membrane

Topo : ADN topoisomérase

UBM : Ubiquitin-Binding Motif

UBZ : Ubiquitin-Binding Zinc Finger

UV : Ultra-Violets

VDAC : Voltage-Dependent Anion Channel

X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside

INTRODUCTION GENERALE

I- LA MITOCHONDRIE. ....................................................................................................... 6 I.1- L’origine de la mitochondrie : l’endosymbiose._______________________________________________ 6 I.2- présentation de la mitochondrie.___________________________________________________________ 8 I.3- L’ADN mitochondrial. _________________________________________________________________ 11

I.3.1- Taille et structure. ____________________________________________________________ 11 I.3.2- Les gènes. __________________________________________________________________ 13

II- LES MALADIES MITOCHONDRIALES. ................................................................... 14 II.1- Mutations de gènes nucléaires. __________________________________________________________ 14

II.1.1- mutation du gène FXN: Défaut d’assemblage de la machinerie Fe/S.____________________ 14 II.1.2- Mutation du gène OPA1: Problème de la dynamique mitochondriale. ___________________ 15 II.1.3- Mutation du gène ATP12 : Défaut d’assemblage des complexes

des oxydations phosphorylantes. ________________________________________________ 16 II.1.4- Mutation du gène TAZ1: changements de composition

de la membrane interne mitochondriale. __________________________________________ 16 II.1.5- Mutations au niveau du gène SPG7: Problème de système de contrôle de qualité dans la

mitochondrie. _______________________________________________________________ 17 II.2- Mutations de l’ADN mitochondrial. ______________________________________________________ 18

II.2.1- Syndrome de NARP. _________________________________________________________ 18 II.2.2- Maladie de LHON. __________________________________________________________ 19 II.2.3- Syndrome de Kearns-Sayre.____________________________________________________ 19

II.3 - Mutations du gène POLG : Problème de réplication de l’ADN mitochondrial._____________________ 20

III- LA REPLICATION. ....................................................................................................... 22 III.1- La réplication nucléaire. ______________________________________________________________ 22 III.2- Réplication de l’ADN mitochondrial. ____________________________________________________ 24

III.2.1- Modèle de réplication mitochondrial humain. _____________________________________ 24 III.2.2- Modèle de réplication mitochondrial de la levure S.cerevisiae. ________________________ 26

IV- LA REPARATION DE l’ADN. ...................................................................................... 28 IV.1- Le BER dans le noyau. _______________________________________________________________ 29 IV.2- Le BER dans la mitochondrie.__________________________________________________________ 30

V- LES ADN POLYMERASES. ........................................................................................... 31 V.1- Historique. _________________________________________________________________________ 31 V.2- Polymérases bactériennes. _____________________________________________________________ 31 V.3- Les ADN polymérases animales. ________________________________________________________ 32

V.3.1- L’ADN polymérase alpha (!).__________________________________________________ 32 V.3.2- L’ADN polymérase beta (").___________________________________________________ 33 V.3.3- L’ADN polymérase gamma (#). ________________________________________________ 34 V.3.4- L’ADN polymérase delta ($). __________________________________________________ 34 V.3.5- L’ADN polymérase epsilon (%&' ________________________________________________ 35 V.3.6- L’ADN polymérase zeta ((). ___________________________________________________ 36 V.3.7- L’ADN polymérase Rev1._____________________________________________________ 37 V.3.8- L’ADN polymérase lambda ()). ________________________________________________ 37 V.3.9- L’ADN polymérase eta (*).____________________________________________________ 38 V.3.10- L’ADN polymérase iota (+). __________________________________________________ 38 V.3.11- L’ADN polymérase kappa (,). ________________________________________________ 39 V.3.12- L’ADN polymérase mu (-). __________________________________________________ 40 V.3.13- L’ADN polymérase theta.(/). _________________________________________________ 40 V.3.14- Terminal deoxynucléotide transférase. __________________________________________ 40

V.4- Les ADN polymérases de S.cerevisiae. ___________________________________________________ 41 V.4.1- L’ADN polymérase alpha._____________________________________________________ 41 V.4.2- L’ADN polymérase "-like. ____________________________________________________ 41 V.4.3- L’ADN polymérase gamma. ___________________________________________________ 42

2

V.4.4- L’ADN polymérase delta. _____________________________________________________ 42 V.4.5- L’ADN polymérase epsilon. ___________________________________________________ 42 V.4.6- L’ADN polymérase zeta.______________________________________________________ 42 V.4.7- L’ADN polymérase Rev1._____________________________________________________ 43 V.4.8- L’ADN polymérase eta._______________________________________________________ 43 V.4.9- L’ADN polymérase phi (!). ___________________________________________________ 44 V.4.10- L’ADN polymérase sigma (0). ________________________________________________ 44

V.5- Les Familles de polymérases. ___________________________________________________________ 44 V.6- Les ADN polymérases mitochondriales.___________________________________________________ 45

VI- L’ADRESSAGE MITOCHONDRIAL.......................................................................... 47

VII- L’INTERET DU MODELE LEVURE. ....................................................................... 50

OBJECTIFS DE LA THESE. ............................................................................................... 52

CHAPITRE I : Identification de la seconde activité ADN polymérase mitochondriale

I- INTRODUCTION. ............................................................................................................. 54 I.1- Tentatives de purification des mitochondries. _______________________________________________ 55 I.2- Technique permettant l’identification d’une protéine. _________________________________________ 56

I.2.1- Caractéristiques physicochimiques. ______________________________________________ 56 I.2.2- Propriétés enzymatiques._______________________________________________________ 57 I.2.3- Séquençage N-terminal d’Edman.________________________________________________ 57 I.2.4- Interruption génique.__________________________________________________________ 58 I.2.5- Protéine de fusion.____________________________________________________________ 60 I.2.6- Spectrométrie de masse. _______________________________________________________ 61

OBJECTIF DU PREMIER CHAPITRE :........................................................................... 65

II- MATERIELS ET METHODES. ..................................................................................... 66 II.1- Matériels. __________________________________________________________________________ 66

II.1.1- Souches de levures et bactéries._________________________________________________ 66 II.1.2- Culture des levures.__________________________________________________________ 66 II.1.3- Préparation des mitochondries. _________________________________________________ 67 II.1.4- Préparation des mitoplastes.____________________________________________________ 68 II.1.5- Traitement à la protéinase K.___________________________________________________ 69 II.1.6- Gradient d’Histodenz™ (Sigma-Aldrich)._________________________________________ 69 II.1.7- Microscopie électronique. _____________________________________________________ 70

II.2 - Méthodes Relatives à l’étude des protéines. _______________________________________________ 71 II.2.1- Détermination de la concentration des protéines. ___________________________________ 71 II.2.2- Test d’activité ADN polymérase ADN dépendante. _________________________________ 71 II.2.3- Purification des ADN polymérases mitochondriales. ________________________________ 73 II.2.4- Détermination de la localisation des protéines. _____________________________________ 76

III- RESULTATS……………………………………………………………………………80 III.1- Purification des mitochondries. _________________________________________________________ 80

III.1.1- Traitement protéinase K. _____________________________________________________ 80 III.1.2- Mitoplastes. _______________________________________________________________ 81 III.1.3- Purification des mitochondries sur gradient d’Histodenz™ (Sigma-Aldrich)._____________ 82 III.2- Identification de l’ADN polymérase éluée avec 250 mM NaCl (ADN polymérase NI). ______ 83

III.3- Microscopie à fluorescence. ___________________________________________________________ 85

IV- DISCUSSION…………………………………………………………………………...88

3

CHAPITRE II : Etude du complexe de réplication mitochondrial de la levure S.cerevisiae

I- INTRODUCTION. ............................................................................................................. 98 I.1- Les complexes protéiques_______________________________________________________________ 98

I.1.1- Les interactions protéine-protéine. _______________________________________________ 99 I.1.2- Technique d’étude des complexes protéiques. _____________________________________ 100 I.1.3- Facteurs déstabilisants les complexes protéiques.___________________________________ 111

I.2- Complexe de réplication nucléaire. ______________________________________________________ 113 I.3- Complexe de réplication mitochondrial.___________________________________________________ 113 I.4- Candidats potentiels au réplisome mitochondrial. ___________________________________________ 115

OBJECTIFS DU CHAPITRE II......................................................................................... 117

II- MATERIELS ET METHODES. ................................................................................... 118 II.1- Matériels. _________________________________________________________________________ 118

II.1.1- Souches de levures et de bactéries. _____________________________________________ 118 II.1.2- Culture des bactéries.________________________________________________________ 118 II.1.3- Préparation des mitochondries. ________________________________________________ 119

II.2- Méthodes Relatives à l’étude des protéines. _______________________________________________ 119 II.2.1- Techniques de concentration des protéines._______________________________________ 119 II.2.2- Mesures d’activités enzymatiques. _____________________________________________ 120 II.2.3- Séparation des protéines sur gel d’électrophorèse. _________________________________ 124 II.2.4- Purification du complexe de réplication. _________________________________________ 131

II.3- Méthodes relatives à l’étude des acides nucléiques. _________________________________________ 137 II.3.1- Techniques générales. _______________________________________________________ 137 II.3.2-Séparation et purification des fragments d’ADN.___________________________________ 137 II.3.3- PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne). ____________________________________ 138 II.3.4- Réalisation des constructions ORI5, COX3. ______________________________________ 139 II.3.5- Marquage des oligonucléotides aux extrémités 5’. _________________________________ 140

III- RESULTATS. ................................................................................................................ 142 III.1- Purification du complexe de réplication natif. _____________________________________________ 142

III.1.1- Nouvelle stratégie de purification du complexe de réplication. _______________________ 143 III.1.2- Recherche des activité ADN polymérase et ADN topoisomérase dans la phase 2_________ 144 III.1.3- Approfondissement de la purification. __________________________________________ 147 III.1.4- Détermination de la taille du complexe. _________________________________________ 149 III.1.3- Recherche des différentes activités dans la phase 2.________________________________ 152 III.1.4- Identification de protéines présentes dans la phase 2 pouvant faire partie du réplisome.____ 156 III.1.5- Expérience de pontage.______________________________________________________ 161 III.1.6- Etude de la dissociation du complexe de réplication._______________________________ 162

III.2- Etude des interactions possibles entre des candidats potentiels du réplisome. ____________________ 165 III.2.1- Colonne ADN polymérase #. _________________________________________________ 166 III.2.2- Colonne ADN topoisomérase 1._______________________________________________ 169 III.2.3- Colonne ADN ligase 1.______________________________________________________ 171 III.2.4- Colonne RIM1.____________________________________________________________ 174 III.2.5- Colonne ADN Polymérase !._________________________________________________ 175 III.2.6- Colonne ADN Polymérase !1. _______________________________________________ 177 III.2.7- Colonne Nucléase 1.________________________________________________________ 179

IV- DISCUSSION…………………………………………………………………………..182

CONCLUSION GENERALE

4


5


I- LA MITOCHONDRIE.

La mitochondrie est un organite dont la taille est de l’ordre du micromètre (1 à 10 µm

de long et 0,5 à 1 µm de large) présent chez la quasi-totalité des eucaryotes. La mitochondrie

est le lieu d’une multitude de processus essentiels à la cellule, parmi lesquels la production

d’énergie via la synthèse d’ATP grâce aux oxydations phosphorylantes, la dégradation des

acides gras par la "-oxydation ou encore l’utilisation du pyruvate produit de la glycolyse par

le cycle de Krebs. Toutes ces fonctions essentielles nécessitent une molécule, l’oxygène. Cet

élément peut être délétère pour la cellule du fait de son fort potentiel d’oxydo-réduction, en

effet, il est capable d’endommager les protéines, acides gras et autres éléments composant la

cellule. Comment un élément néfaste comme le dioxygène peut permettre une amélioration

significative des rendements énergétiques ? Prenons le cas de la levure, en condition

anaérobie, le processus énergétique utilisé est la fermentation, cette voie métabolique se

déroule dans le cytoplasme et permet la production de 2 moles d’ATP par mole de glucose

consommé. Grâce à la mitochondrie, en condition aérobie, de 36 à 38 moles d’ATP sont

produites par mole de glucose consommé via le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire. Nous

pouvons nous poser une seconde question : quelle est l’origine des mitochondries dans les

cellules ? La réponse est : l’endosymbiose ; ce phénomène va être abordé dans le paragraphe

suivant.

I.1- L’origine de la mitochondrie : l’endosymbiose.

La définition de la symbiose est la coopération mutuellement bénéfique entre deux

organismes vivants, donc appelée endosymbiose lorsque l'un est contenu par l'autre.

L'organisme interne est appelé un endosymbiote. Cette terminologie est surtout employée au

niveau cellulaire pour imager une coopération entre des micro-organismes simples, et les

cellules d'organismes plus évolués qui les contiennent et dont ils favorisent le fonctionnement.

Parmi des cas d’endosymbiose, nous pouvons trouver un ver vestimentifère tubicole Riftia

pachyptila vivant le long de la dorsale océanique du pacifique Est. Il s’agit d’un ver géant

vivant en colonie à des températures proches de 20°C à des profondeurs supérieures à 2500m.

Cet organisme est dépourvu de système digestif mais il entretient une symbiose étroite avec

6

4 3 2 1 0

Age (milliard d'années)

O2 a

tmosp

hér

ique

(pourc

enta

ge

par

rap

port

a

u n

ivea

u a

tmosp

hér

ique

actu

el)

Figure 1 : Evolution de la porportion de dioxygène dans l'atmosphère au cours du temps.

Le trait large montre l'évolution proposée du niveau atmosphérique d'oxygène depuis l'apparition

de la Terre (4,6 milliard d'années) jusqu'à aujourd'hui. Des cyanobactéries sont apparues avant 2,8 Ga

et commencèrent à réaliser la photosynthèse. Entre 2,45 et 2 Ga, la valeur du taux d'oxygène est peu

précise mais devait être plus élevée que 10% du taux actuel, mais significativement plus faible que la

concentration d'oxygène de nos jours. Ce taux semble se stabiliser de 1,85 Ga à 0,85 Ga puis une

augmentation du niveau d'oxygène atmosphérique fut déterminée de 0,85 Ga à 0,54 Ga ce qui devrait

correspondre à la colonisation de la terre par les végétaux supérieurs.

1000

100

10

1

0,1

0,01

0,001

0,0001

une bactérie chemio-autotrophe contenue dans un compartiment appelé trophosome. Ce tissu

contient une grande population de gamma-protéobactéries (plus de 1011 bactéries par gramme)

capable d’assimiler de l’H2S, du CO2 et des dérivés nitrés tels que l’ammoniac et le nitrate qui

proviennent de l’environnement extérieur, ces molécules vont permettre la production d’ATP

(Minic et Hervé, 2004). Parmi les organismes pluricellulaires, les endosymbiotes sont très

communs chez les insectes, spécialement chez les suceurs de sèves de plantes, ainsi que ceux

qui se nourrissent de bois et ou ceux qui se nourrissent de kératine. Les endosymbiotes

peuvent produire de 10 à 15% des nutriments essentiels aux insectes (Wernegreen, 2004) et

certains favorisent le développement et la croissance de colonies. Ainsi, chez des espèces de

Camponotus (genre de fourmi de la famille des formicidés) une association bénéfique avec

une #-protéobactérie : Blochmannia a été mise en évidence. En effet une étude a mis en

évidence l’importance de Blochmannia dans le développement de colonie de Camponotus par

rapport à ces mêmes fourmis traitées avec un antibiotique (de Souza et al, 2009).

Blochmannia améliorerait le système immunitaire des fourmis Camponotus, la capacité de

protection de l’hôte par un endosymbiote a déjà été observée avec Wolbachia qui confère une

forte protection antivirale à la drosophile (Hedges et al, 2008), toutefois les mécanismes de

ces protections restent inconnus.

Mereschkovsky en 1909 a émis l’hypothèse de l'origine bactérienne de la

mitochondrie. Cette hypothèse sera revue dans les années 1970 (Margulis, 1970 et 1971) et

sera confirmée par la comparaison des ARNs ribosomaux et d’autres molécules. Ainsi, des

études de séquences des gènes mitochondriaux ont déterminé que l’ancêtre de la mitochondrie

était une !-protéobactérie (Yang et al, 1985). Actuellement, parmi les !-protéobactéries, les

membres de la subdivision rickettsial (Rickettsia, Anaplasma et Ehlichia) sont considérés

comme les eubactéries les plus proches de l’ancêtre de la mitochondrie (Gray et al, 1999).

L’origine de l’endosymbiose se situerait entre 1,5 et 2 milliards d’années, à cette

époque, l’atmosphère de la Terre n’était pas un environnement oxydatif agressif, et contenait

de l’H2, du CO2 de l’H2S (provenant des volcans), tandis que les océans contenaient du Fe2+

(provenant de l’interaction entre l’eau des océans et le basalte). Le niveau en oxygène à

l’époque était inférieur à 10-5, le niveau atmosphérique actuel (Holland, 2006). Du fait de

l’activité photosynthétique des cyanobactéries contenues dans les océans la concentration en

oxygène dans l’atmosphère augmenta jusqu’à une concentration d’oxygène comprise entre 1

et 10% du niveau atmosphérique actuel (figure 1) (Kump, 2008). Cette augmentation est

responsable d’une crise majeure de la vie sur Terre entraînant la disparition de formes de vie

anaérobie incapables de se protéger de la toxicité de l’oxygène ou incapables de trouver un

micro-environnement dépourvu d’oxygène. Ainsi, l’une des formes de protection est la

7

réduction de la concentration locale d’oxygène par le métabolisme. Par exemple, l’utilisation

de l’oxygène comme accepteur final d’une chaîne de transport des électrons bactérienne

entraîne une diminution de la concentration de l’oxygène à proximité de la bactérie et permet

la production d’énergie sous forme d’ATP. Ainsi, l’endocytose d’une !-protéobactérie par un

eucaryote unicellulaire a permis pour l’hôte d’une part de se protéger de l’oxygène mais aussi

d’obtenir de l’ATP. En ce qui concerne l’organisme endocyté, l’échange de l’ATP contre des

sucres est aussi bénéfique. L’endosymbiose apparaît comme une étape déterminante dans le

succès évolutif des cellules eucaryotes.

Suite à l’évènement d’endocytose et au cours de l’évolution, la majorité du contenu

génétique de l’!-protéobactérie a été transféré dans le noyau de la cellule hôte. Le génome

mitochondrial n’est plus qu’un vestige du génome bactérien, en effet les génomes

mitochondriaux ne contiennent que quelques dizaines de gènes alors que celui des rickettsies

en contient plus de 800 codant pour des protéines (Andersson et al, 1998). Ainsi, la

mitochondrie est un organite semi-autonome nécessitant des protéines codées par le génome

nucléaire pour fonctionner.

I.2- présentation de la mitochondrie.

La mitochondrie a été observée comme une organelle sous microscope en 1840. Son

isolement n’a été possible qu’à partir de 1948 grâce au développement des techniques de

centrifugation zonale. C’est seulement dans les années soixante qu’il a été constaté qu’elle

possède son propre ADN. L’ADN mitochondrial a été montré localisé à proximité de la

membrane interne mitochondriale, du coté matriciel (Albring et al, 1977). La mitochondrie

possède une dynamique structurale et est composée de deux membranes, une externe et une

interne, qui délimitent le milieu extra-mitochondrial, l’espace inter-membranaire et la matrice

mitochondriale. Les deux membranes sont liées au niveau de zones de contact, ces zones sont

des structures dynamiques qui se caractérisent par une vitesse de sédimentation comprise

entre celle des deux membranes (Ohlendieck et al, 1986).

La mitochondrie est composée de plus de 1500 protéines majoritairement codées par le

génome nucléaire à l’exception de 13 protéines chez l’homme et 9 protéines chez la levure

(hors protéines introniques et ORF hypothétiques). Une multitude de protéines est donc

traduite dans le cytoplasme, il faut donc un système de transport efficace pour importer ces

protéines du cytoplasme à la mitochondrie. L’une des protéines majoritaires des membranes

est la porine (VDAC : Voltage-Dependent Anion Channel), ancrée dans la membrane externe.

Cette protéine forme des canaux aqueux au travers de la membrane permettant le passage de

8

molécules non protéiques de taille comprise entre 5 à 10 kDa. Cette membrane est donc

considérée comme perméable. Les protéines ne pouvant traverser la membrane externe via les

porines, un système de transport existe, le complexe TOM (Transport Outer Membrane). Ce

complexe ancré dans la membrane externe, permet le passage des protéines dans l’espace

inter-membranaire de façon spécifique via la reconnaissance de séquence d’adressage

mitochondrial par des récepteurs. La membrane interne quant à elle est considérée comme

moins perméable, cette imperméabilité permet le maintien de gradient de proton de part et

d’autre de la membrane. En ce qui concerne le transport des protéines à travers cette

membrane, ce transport nécessite le complexe TIM (Transport Inner Membrane). En réalité il

existe plusieurs complexes TIM pour permettre soit le transport de protéines matricielles soit

le transport de protéines membranaires (Neupert, 1997).

Chez la majorité des cellules eucaryotes, les mitochondries constituent des réseaux

dont la forme et la taille varient selon les conditions environnementales (Jendrach et al, 2008).

Ainsi, la forme du réseau dépend de l’équilibre entre les phénomènes de fusion et de fission.

Un déséquilibre du coté de la fission conduit à la fragmentation du réseau, tandis que du coté

de la fusion cela conduit à l’élongation et à une forme allongée et interconnectée (Chan,

2006). Ces deux évènements jouent des rôles importants dans le maintien de l’intégrité de la

mitochondrie (Okamoto et Shaw, 2005), dans les transferts électriques et biochimiques au

sein des axones (Hollenbeck et Saxton, 2005), dans le renouvellement des mitochondries

(Westermann, 2002), et dans la ségrégation et la protection de l’ADN mitochondrial (Frank et

al, 2001). De plus les machineries de fusion et de fission ont été montrées comme étant

impliquées dans l’apoptose, la mort cellulaire programmée (Green et Kroemer, 2004).

La mitochondrie est impliquée dans de nombreuses fonctions métaboliques par

exemple la réoxydation du NADH, la production d’ATP, le cycle des acides tricarboxyliques

(cycle de Krebs), la biosynthèse des hèmes, l’oxydation des acides gras, le métabolisme des

acides aminés ainsi qu’une fonction de stockage du calcium (revue Lemasters et al, 2009). De

plus, la mitochondrie est impliquée dans une étape précoce de la mort cellulaire via la

libération du cytochrome c (revue Suen et al, 2008). Le cytochrome c va se fixer sur la

protéine APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1) dans le cytosol, et va activer

l’assemblage de l’apoptosome qui active la caspase 9 impliquée dans l’apoptose.

La fonction principale de la mitochondrie est la production d’énergie, réalisée via les

oxydations phosphorylantes. Il s’agit d’une série de complexes multi-protéiques ancrés au

niveau de la membrane interne mitochondriale. Chez les cellules animales, les complexes I à

IV composent la chaîne respiratoire qui permet grâce à l’ubiquinone et au cytochrome c le

transfert d’électron d’un substrat réduit à l’oxygène moléculaire. Chez la levure, le complexe I

9

n’est pas présent dans la mitochondrie, il est remplacé par deux complexes NADH

déshydrogénases, l’un du coté de l’espace inter-membranaire et l’autre du coté matriciel. Le

transfert des électrons à travers les divers complexes est couplé au transfert de protons à

travers la membrane interne vers l’espace inter-membranaire. Enfin, le gradient de protons

créé par le fonctionnement de la chaîne respiratoire va permettre la synthèse d’une molécule

d’ATP à partir d’une molécule d’ADP et de phosphate inorganique (Pi) grâce à l’ATP

synthase ainsi qu’à la ré-entrée d’un proton dans la matrice mitochondriale. L’ATP peut

ensuite être exporté de la mitochondrie via l’Ancp (Adenine nucleotide carrier) pour être

utilisé sous forme d’énergie chimique. Du fait du transfert du génome de l’!-protéobactérie

au noyau de l’eucaryote primitif, les sous-unités de la chaîne respiratoire (proche de la

centaine) sont codées pour le plus grand nombre par les gènes nucléaires. Les sous-unités

codées par le noyau sont synthétisées dans le cytoplasme et sont importées dans la

mitochondrie via TIM23 pour le complexe bc1 et la cytochrome c oxydase (Stuart, 2008). En

ce qui concerne les sous unités codées par l’ADNmt, elles sont synthétisées dans la matrice

mitochondriale grâce à la machinerie de traduction mitochondriale. Une controverse existe en

ce qui concerne la raison de la conservation de ces gènes dans la mitochondrie. Parmi les

hypothèses, il y a la différence entre le code génétique mitochondrial et le code génétique

nucléaire, spécialement au niveau des codons STOP (Jacobs, 1991). Une autre hypothèse

serait le caractère très hydrophobe des protéines codées par ces gènes, non transférés au

noyau. En effet la translocation par TIM23 nécessite la déstructuration des protéines et

l’entrée du polypeptide sans entraîner de fuite de proton (de Grey, 2005) ce qui est très

difficile avec des protéines très hydrophobes.

Bien que les machineries mitochondriales permettent l’oxydation de l’oxygène

(élément délétère à la cellule), des espèces oxydatives peuvent aussi être produites lors du

fonctionnement de la chaîne respiratoire. Ainsi la mitochondrie est le lieu de production

principal des espèces activées de l’oxygène (ROS : Reactive Oxygen Species) dans la cellule.

Ces radicaux libres sont produits au niveau du complexe I et III des oxydations

phosphorylantes (Boveris et al, 1972). Les radicaux libres sont connus pour engendrer des

dommages oxydatifs à l’ADN (Emerit et al, 1982) mais aussi aux lipides et protéines

(Stadtman, 1992). Ce stress oxydatif est considéré être le facteur majeur du déclin général des

tissus (Ames et al, 1993, Kalous et Drahota, 1996) associés avec l’âge (Lee et Wei, 2001,

Sastre et al, 2002), les maladies dégénératives (Manfredi et Beal, 2000), la mort cellulaire

programmée et le cancer (Bianchi et al, 2001, Copeland et al, 2002).

10

I.3- L’ADN mitochondrial.

L’ADN mitochondrial est localisé sur la surface de la membrane interne de la mitochondrie,

du côté de la matrice, où les espèces oxygènes réactives peuvent être générées par la chaîne

respiratoire. L’exposition prolongée a pour conséquence un niveau élevé de mutations,

supérieur à celui des génomes nucléaires (Wallace et al, 1987). De plus, l'absence de protéines

protégeant l'ADN mitochondrial, telles que les histones qui sont présentes au niveau de

l’ADN nucléaire contribue à ce taux de mutation élevé (Richter et al, 1988). L’une des

principales conséquences des ROS sur l’ADN mitochondrial est l’effet sur la base guanine

pour donner la 7,8-Dihydro-8-oxoguanine (8-hydroxyguanine). Il existe de nombreuses autres

modifications (Evans et al, 2004) qui conduisent à la 2,6-Diamino-4-hydroxy-5-

formamidopyrimidine (FapyG) ou encore la 5,6-dihydro-5,6-dihydroxythymine (thymine

glycol). Ainsi, lors de dommages de l’ADN, la prolifération cellulaire est stoppée au niveau

de point de contrôle du cycle cellulaire pour permettre à la machinerie de réparation de

réparer correctement les dommages (voir paragraphe IV).

I.3.1- Taille et structure.

L'ADN mitochondrial n’est pas réparti de façon homogène dans la mitochondrie, mais

il se concentre au niveau de structures appelées nucléoïdes (Williamson et Fennell, 1979,

Malka et al, 2006). Ces structures apparaissent avant la phase S de la méiose et possèdent des

points d’ancrage au niveau de la membrane interne mitochondriale. L’ADN mitochondrial

existe en plusieurs exemplaires dans chaque cellule et ce nombre de copies peut varier d’un

organisme à un autre. En effet, l’homme possèderait entre 200 et 1700 copies d’ADN

mitochondrial par cellule (Robin et Wong, 1988) tandis que la levure S.cerevisiae quant à elle

en possèderait entre 50 et 100 copies (Malka et al, 2006). Toutefois d’autres articles font état

de 1000 à 10000 copies chez l’homme (Moraes et al, 1991, Veltri et al, 1990) et de 20 à 50

copies chez la levure (Nagley et Linnane, 1972). En ce qui concerne le nombre d’ADN

mitochondrial par mitochondrie, il serait de deux à trois copies chez l’homme (Robin et

Wong, 1988), toutefois, ce nombre de copies peut varier en cas de maladies telles que des

maladies du foie ou des cancers du sein (Morten et al, 2007, Yu et al, 2007). Pour la levure,

les conditions environnementales peuvent modifier le nombre de copies par mitochondrie,

comme c’est le cas en présence ou en absence de ROS. En effet, un traitement avec de faibles

concentrations de péroxyde d’hydrogène entraîne une augmentation du nombre de molécules

d’ADN mitochondrial de manière dépendante de deux protéines impliquées dans la

réplication et la ségrégation de l’ADN mitochondrial : Mhr1 et Ntg1 (Hori et al, 2009). Chez

11

les mammifères, une variation du nombre d’ADN mitochondrial peut être observée si les

mitochondries étudiées proviennent de différents organes (Veltri et al, 1990). L’existence de

cette polyploïdie mitochondriale a entraîné l’apparition de deux concepts, l’homoplasmie et

l’hétéroplasmie. L’homoplasmie veut dire que toutes les copies du génome mitochondrial sont

identiques dans une cellule, contrairement à l'hétéroplasmie qui désigne un mélange de deux

types de génomes mitochondriaux ou plus. Le taux d’ADN normal par rapport à l’ADN

mutant peut varier selon les tissus, si ce taux dépasse la valeur seuil spécifique du tissu, des

caractéristiques cliniques vont se manifester, c’est l’effet seuil (Letellier et al, 1994).

En ce qui concerne la taille du génome mitochondrial, elle varie selon les espèces,

16,6 kb chez l’homme (Attardi et Schatz, 1988), 85,8 kb chez la levure S.cerevisiae (Foury et

al, 1998), 370 kb chez Arabidopsis thaliana (Unseld et al, 1997). La levure Saccharomyces

cerevisiae a été le premier organisme dont le génome mitochondrial a complètement été

séquencé (Foury et al, 1998).

La morphologie de l’ADN mitochondrial de la levure S.cerevisiae fait encore débat,

certains résultats amènent à proposer un ADN circulaire, d’autres un ADN linéaire.

Tout a commencé à partir de l’observation de formes circulaires d’ADN de 15 kb par

microscopie électronique par deux laboratoires chez le poulet, la vache et la souris (Van

Bruggen et al, 1966, Sinclair et Stevens, 1966). L’hypothèse que le génome mitochondrial est

circulaire était séduisante en effet, d’après la théorie endosymbiotique, le génome

mitochondrial dérive du génome bactérien, connu comme étant circulaire (Cairns, 1966). Il a

donc été admis que la très grande majorité des génomes mitochondriaux devaient être

circulaires bien que les protistes Tetrahymena pyriformis et Paramecium aurelia possèdent un

génome mitochondrial linéaire (Suyama et Miura, 1968). Le premier cas d’ADN

mitochondrial linéaire de levure a été trouvé en 1981 chez Williopsis mrakii (Wesolowski et

Fukuhara, 1981), puis chez Candida parapsilosis (Kovác et al, 1984). En 1991, Maleszka et

collaborateurs ont réalisé des gels d’électrophorèse en champ pulsé ce qui a permis de

montrer que pratiquement tout l’ADNmt de S.cerevisiae était sous forme de molécules

linéaires poly-disperses, dont la taille est comprise entre 75 et 150 kb (Maleszka et al, 1991),

soit approximativement une à deux unités génomiques mitochondriales. Une faible quantité

de formes circulaires ayant approximativement la même taille que le génome accompagne ces

molécules linéaires. D’autres organismes possèdent des molécules d’ADNmt linéaires, c’est

le cas de plantes de la famille Brassica (Turpen et al, 1987), de champignons comme

Ascobolus immersus (Kempken, 1989), et les algues Polytomella capuana (Smith et Lee,

2008).

12

d

f a b

ef

ac

cd

e

bc d

e

f

d e f a b c d e f a b

a

b

cd

e

f

La molécule d'ADN mitochondrial de

Saccharomyces cerevisiae a été analysée

par séquençage aléatoire par Foury

en 1998 (Foury et al., 2008).

Assemblages théoriques possibles

OU

En absence d'observation directe des molécules d'ADN

mitochondriales circulaires, les 2 hypothèses sont possibles

Figure 2 : Hypothèses de la circularité ou linéarité de l'ADN mitochondrial de S.cerevisiae.

Adapté de Williamson D. (2002) Nat Rev Genet. 3 : 475-81.

Gènes présents dans le génome mitochondrial Gènes

De l’homme De la levure S.cerevisiae

ND1 X

ND2 X

ND3 X

ND4L X

ND4 X

ND5 X

ND6 X

COX1 X X

COX2 X X

COX3 X X

ATP6 X X

ATP8 X X

CYTB X X

ATP9 X

AI1 X

AI2 X

AI3 X

AI4 X

AI5α X

AI5β X

BI2 X

BI3 X

BI4 X

VAR1 X

SCE1 X

Tableau 1 : Gènes présents dans le génome mitochondrial de l'homme et de la levure S.cerevisiae.

inspiré de Foury et al. (1998) FEBS letters. 440 : 325-331 et

Andrews et al. (1999) Nat.Genet. 23 : 147

Chez la levure, une analyse génétique par séquençage aléatoire de l’ADN

mitochondrial (Foury et al, 1998) a démontré la circularité du génome de levure (figure 2) et

ceci en contradiction avec les observations faites par microscopie électronique. Des

amplifications par PCR de fragments de 0,5 à 0,7 kb ont été réalisées et ont permis de

déterminer l’enchaînement des gènes composant le génome mitochondrial, en accord avec

une forme circulaire du génome. Pourtant l’enchaînement des gènes ainsi cartographiés par

séquençage peut également être déduit en partant d’un génome linéaire, suite à des répétitions

de gènes (tableau 1), cette seconde hypothèse est par ailleurs cohérente avec la présence de

forme d’ADN linéaire de 150 kb.

Chez l’homme, ce type d’analyse par électrophorèse en champ pulsé ont permis de

clairement identifier des molécules d’ADN mitochondrial sous forme circulaire (Bendich,

1993).

I.3.2- Les gènes.

La majorité des génomes mitochondriaux contiennent entre 12 et 20 gènes codant pour

des protéines et un certain nombre de gènes codant pour des ARNs de transfert et des ARNs

ribosomiques. Parmi les extrêmes nous pouvons trouver le génome mitochondrial du

Plasmodium falciparum qui contient seulement trois gènes codant pour des protéines et à

l’autre extrême, Reclinomonas americana avec un génome composé de 67 gènes codant pour

des protéines (Lang et al, 1997).

Chez l’homme, l’ADN mitochondrial contient 37 gènes codant pour 13 protéines, 22

ARN de transfert et deux ARN ribosomaux (RNR1 : RNA ribosomal 1 et RNR2). L’ADN

mitochondrial de la levure S.cerevisiae contient 45 gènes qui codent pour 18 protéines, 25

ARN de transfert et deux ARN ribosomaux. Sur la figure 3 on peut remarquer que l’ADN

mitochondrial code pour les mêmes protéines essentielles aux oxydations phosphorylantes, 6

protéines sont retrouvées dans le génome mitochondrial de ces deux organismes (COX1,

COX2, COX3, Cytochrome b, ATP6 et ATP 8).

Ainsi les fonctions génétiques de l’ADN mitochondrial sont bien conservées,

impliquées au maximum dans cinq processus essentiels : la respiration, et/ou les oxydations

oxydatives, la transcription, la maturation et la traduction des ARNs et l’import des protéines

(figure 4).

Des disfonctionnements de cet organite ont des répercussions importantes pour la

cellule et peuvent entraîner des maladies graves chez l’homme.

13

ori1

ori8

ori7

ori2

ori6

ori3

ori4

ori5

ARN 15S

ORF8

Scai1

Scai2

Scai3

Scai4

Scai5α

Scai5β

COX1

ATP8

ATP6

Scbi3Scbi4

ORF6

ORF7

ATP9

VAR1

ORF9

ORF10

ORF5

ARN 21S

Sce1

COX3

ORF11

ORF1

COX2

Scbi2

Apocytochrome b

ARNt pro

ARNt trp1

ARNt val1ARNt thr1

ARNt Phe

ARNt thr2

ARNt cys

ARNt his

ARNt Glu

ARNt ser

ARNt leu

ARNt glnARNt lys

ARNt arg1

ARNt glys

ARNt met

ARNt asn

ARNt tyr

ARNt ile

ARNt ala

ARNt arg2

ARNt ser2

ARNt asp

ARNt f met

Figure 3 : Représentation circulaire de l'ADN mitochondrial de la levure S.cerevisiae

Les gènes codant pour des protéines non introniques sont représentés en blocs gris clair,

les gènes codant pour des protéines introniques sont représentés en blocs gris foncé, les

gènes codant pour des protéines inconnues sont représentés par des blocs noirs. Les gènes

codant pour des ARN de transfert sont représentés par des blocs fins.

inspiré de Foury et al. (1998) FEBS letters. 440 : 325-331.

ADN Mitochondrial de levure

Saccharomyces cerevisiae

85,8 kb

II- LES MALADIES MITOCHONDRIALES.

De nombreuses maladies ont pour origine un disfonctionnement mitochondrial,

pouvant être du à des mutations au niveau de gènes nucléaires codant pour des protéines

mitochondriales. Ces mutations peuvent entrainer des répercussions sur les oxydations

phosphorylantes qui sont donc à l’origine de nombreuses maladies neuromusculaires. Des

disfonctionnements mitochondriaux peuvent être également dues à des mutations au niveau

des gènes de l’ADN mitochondrial.

II.1- Mutations de gènes nucléaires.

Les quelques exemples de maladies qui seront présentées dans les paragraphes

suivants sont principalement dus à des mutations d’un gène donné au niveau des deux allèles

(transmission autosomale récessive en général).

II.1.1- mutation du gène FXN (codant pour la frataxine) : Défaut d’assemblage

de la machinerie Fe/S.

L’ataxie de Friedreich est une maladie autosomale récessive entraînant une

dégénérescence du système nerveux central et périphérique, souvent accompagnée de

cardiomyopathie. Elle se manifeste par la dégénérescence des neurones à longs axones des

ganglions de la racine postérieure des nerfs rachidiens. Cette maladie atteint 1 personne sur

50 000, elle est due à l’insertion de répétitions GAA (de 200 à 1300 répétitions) dans un

intron du gène de la frataxine (Kœning et Mandel, 1997) : FXN, alors qu’au niveau des allèles

normaux on observe de 7 à 38 répétitions seulement. Cette insertion peut être due à un

déplacement de brin lors de la réplication de l’ADN, le brin déplacé formant une structure

secondaire. Il en découle que des régions ADN simples brins contenant des répétitions GAA

sont capables de former différents types de structures secondaires, qui peuvent être

impliquées dans l’instabilité du génome (Mirkin, 2006). Ces structures secondaires

entraîneraient le glissement des ADN polymérases réplicatives ainsi que l’insertion de

nouveaux triplets GAA. Il a été proposé que les nombreuses répétitions GAA interfèrent avec

le processus de transcription en formant une structure aberrante de l’ADN ou en induisant la

formation d’hétérochromatine répressive. Il s’agit d’une structure chromatinienne qui

14

Respiration et oxydation phosphorylante

ARNs ribosomaux

ARNs de transfert

Protéines ribosomales et EF-Tu

Import des protéines et maturation

maturation de l'ARN

Transcription

Plasm

odiu

m

Sacch

arom

yces

Hom

o

Rec

linom

onas

Rho

dom

onas

Mar

chan

tia

Ara

bido

psis

nom

bre

s de

gèn

es

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Figure 4 : Répartition des gènes mitochondriaux chez différents organismes selon des mécanismes

où ils sont impliqués, en ne tenant pas compte des protéines introniques.

D'après Burger et al, 2003

empêcherait la transcription. Ainsi ces insertions entraîneraient un « silencing » du gène FXN.

Il en résulte la déficience de cette petite protéine hautement conservée chez les animaux, les

invertébrés, la levure et les plantes (Campuzano et al, 1996). La frataxine serait un composant

de la machinerie d’assemblage des hèmes Fe/S et permettrait la maturation des protéines Fe/S

mitochondriales et cytosoliques. L’absence de la frataxine entraînerait une augmentation de

fer libre dans la matrice mitochondriale, avec pour conséquence la production de ROS suite à

la réaction entre l’oxygène et le fer (réaction de Fenton) et conduire à l’obtention d’ion

supéroxyde (Halliwell et Gutteridge, 1990) capable d’engendrer des dégâts au niveau de

l’ADN mitochondrial, des protéines, et des lipides. Au niveau des patients, l’accumulation de

fer dans les cellules du cœur a été observée et la modification des activités enzymatiques

mitochondriales montrent bien l’implication de la mitochondrie dans cette pathologie. Il

n’existe aucun mode de guérison de cette maladie, uniquement des médicaments pour traiter

les symptômes.

II.1.2- Mutation du gène OPA1 (Optic Atrophy 1) : Problème de la dynamique

mitochondriale.

La maladie de Kjer constitue la plus fréquente des neuropathies optiques autosomiques

dominantes. L’atrophie optique dominante conduit progressivement à la cécité, elle s’associe

à une acuité visuelle basse dès l’enfance et à une perturbation de la vision des couleurs. Elle

est liée à la dégénérescence des neurones qui transmettent l’information visuelle. La

fréquence de cette maladie est de 1 pour 50 000 dans la population. Le gène OPA1 est le

principal gène dont la mutation conduit à des atrophies optiques dominantes (DOA), une

centaine de mutations différentes de ce gène ont été identifiées. Le gène OPA1 code pour une

protéine ubiquitaire liée à la famille des dynamines GTPase (Olichon et al, 2002), cette

protéine serait ancrée dans la membrane interne mitochondriale et serait impliquée dans la

plasticité mitochondriale (Olichon et al, 2003). En effet, la diminution de synthèse d’OPA1

dans une cellule HeLa par utilisation d’ARNi (ARN interférant) a pour conséquence

d’entraîner une fragmentation du réseau mitochondrial, une dissipation du potentiel

membranaire suivie d’une libération de cytochrome c et du déclenchement d’évènements

apoptotiques nucléaires dépendants des caspases. Des protéines orthologues de celles codées

par le gène OPA1 ont été trouvées chez la levure, il s’agit de mgm1 et Msp1 qui sont

impliqués dans la dynamique du réseau mitochondrial. Cela suggère un lien entre la

dynamique mitochondriale et les DOA. Ainsi le produit du gène OPA1 serait impliqué dans

15

divers processus tels que les oxydations phosphorylantes (Chevrollier et al, 2008), en effet

l’activité de l’ATP synthase semble pouvoir être modifiée par des mutations du gène OPA1.

La fusion du réseau mitochondrial chez la drosophile semble aussi être sous la dépendance du

produit du gène OPA1 (Deng et al, 2008). Enfin, cette protéine contrôlerait même l’apoptose

non pas en interférant avec l’activation de BAX et BAK (deux régulateurs de l’apoptose dans

la mitochondrie et le réticulum endoplasmique) mais en contrôlant la forme des mitochondries

(Frezza et al, 2006). Aucun traitement de cette maladie n’existe, néanmoins son dépistage est

maintenant possible grâce à l’identification du gène.

II.1.3- Mutation du gène ATP12 (gène codant pour une chaperonne nécessaire

à l’assemblage du domaine F1 de l’ATP synthase) : Défaut d’assemblage des

complexes des oxydations phosphorylantes.

Différentes pathologies ont été mises en évidence telles que des acidoses lactiques,

cardiomyopathies, hépatomégalie et encéphalopathie dégénérative s’accompagnant d’une

diminution du contenu mitochondrial en ATP synthase (Houstek et al, 2006) et peuvent aussi

s’accompagner de disfonctionnements des oxydations phosphorylantes. Ces symptômes

peuvent être causés par la mutation du gène ATP12 codant pour une chaperonne du domaine

F1 de l’ATP synthase. En effet, il a été montré chez la levure S.cerevisiae qu’Atp12 et Atp11

interagissent respectivement avec les sous unités ! et ".de l'ATPsynthase et permettent

l’assemblage de la partie matricielle de l’ATPsynthase 2Ackerman, 2002). Une mutation

TGG3AGG change le tryptophane en position 94 en arginine, ce qui a pour conséquence

d’entraîner une perte d’activité ATP synthase du fait d’une accumulation de sous unité " dans

la mitochondrie (De Meirleir et al, 2004).

II.1.4- Mutation du gène TAZ1 (code pour la protéine tafazzine) : changements

de composition de la membrane interne mitochondriale.

Le syndrome de Barth est une pathologie synonyme d’une neutropénie, myopathie

squelettique, d’un retard de croissance et d’une acidurie glucanique. Le taux de personnes

atteintes est de 1 sur 300 000 dans la population. Ce syndrome est du à une mutation du gène

TAZ1 qui code pour la protéine tafazzine, plus de 70 mutations différentes de ce gène ont été

observées chez des patients. La protéine tafazzine est une phospholipide acyltranférase

16

putative qui serait impliquée dans le remodelage des cardiolipides, un lipide uniquement

présent dans la membrane interne mitochondriale. Il a été montré qu’une inactivation de taz1

affecterait l’assemblage et la stabilité des chaînes respiratoires (McKenzie et al, 2006). Cela

pourrait être du à la participation de la protéine tafazzine à la biosynthèse des phospholipides.

Des études ont montré que les cardiolipides sont essentiels à la machinerie de la chaîne

respiratoire, en effet, ils permettraient la stabilisation des supercomplexes qui ont été montrés

comme étant importants au transfert des électrons du fait de principe de canalisation des

substrats (Brandner et al, 2005).

II.1.5- Mutations au niveau du gène SPG7 (code pour la paraplégine) :

Problème de système de contrôle de qualité dans la mitochondrie : les m-AAA

métallo-protéases.

La paraplégie spastique type 7 est une maladie génétique du groupe des paraplégies

spastiques familiales. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire très progressive

atteignant les membres inférieurs agonistes s’accompagnant d’une hypertonie musculaire

entraînant une raideur des membres inférieurs antagonistes. La fréquence de cette maladie est

de 1 pour 10 000 dans la population. Cette maladie est due au gène codant pour la

paraplégine : SPG7 qui est muté dans tous les cas de paraplégie spastique type 7 (Wilkinson

et al, 2004). La paraplégine fait partie de la famille des AAA métallo-protéases qui sont

impliquées dans la dégradation de protéines, dans le transport vésiculaire ainsi que dans la

biogénèse de la mitochondrie (Elleuch et al, 2006). Les AAA protéases sont impliquées dans

la dégradation des protéines de la membrane interne mitochondriale qui ne sont pas

assemblées ou mal repliées. Les i-AAA protéases exposent leur site actif du coté inter-

membranaire tandis que celui des m-AAA protéases est actif dans la matrice. La paraplégine

Spg7 est une m-AAA ATPase, et des recherches ont mis en évidence l’homologie de la

paraplégine humaine avec Afg3p et Rca1p qui sont des protéases mitochondriales de levures

(Arlt et al, 1998). Des mutations au niveau de ces m-AAA ATPases chez la levure entraînent

divers disfonctionnements au niveau de la chaîne respiratoire, en effet l’activité de ces 2

protéines est nécessaire à l’assemblage de sous unités de la cytochrome oxydase, du complexe

b-c1 et de l’ATP synthase (Arlt et al, 1998). Des études sur des souris déficientes en

paraplégine montrent l’accumulation de mitochondries aberrantes (Ferreirinha et al, 2004). La

paraplégine humaine a été localisée dans la mitochondrie et des mutations de cette protéine

17

entraînent chez les patients une déficience des propriétés respiratoires des mitochondries

isolées après biopsie musculaire (Casari et al, 1998).

De nombreuses autres maladies mitochondriales ont pour origine des mutations de

gènes nucléaires codant pour des protéines mitochondriales mais ces quelques exemples

décrits ci-dessus ont pour but de montrer la diversité des gènes impliqués et les conséquences

de mutations de ces derniers.

II.2- Mutations de l’ADN mitochondrial.

La génétique mitochondriale est différente de la génétique Mendelienne observée dans

le noyau, en effet, seul l’ADN mitochondrial maternel est transmis à la descendance ; chez les

mammifères, les mitochondries des spermatozoïdes restent à l’extérieur de l’ovule, seul le

noyau du spermatozoïde pénètre dans l’ovule. Au cours de l’étude de mutation pouvant

entraîner des maladies, du fait de la polyploïdie, il est important de considérer le degré

d’hétéroplasmie de mutants donnés par rapport à l’ADN sauvage (voir page 10). Ainsi, les

mutations de l’ADN mitochondrial sont récessives et peuvent entraîner des maladies lorsque

le taux d’ADN muté est supérieur à 90% pour une mutation ponctuelle ou bien supérieur à

60% pour une délétion de l’ADN mitochondrial : il s’agit de l’effet de seuil (Letellier et al,

1994).

La plupart des disfonctionnements mitochondriaux impliquant l’ADNmt, sont associés

à des mutations ponctuelles ou à de larges délétions dans l’ADN mitochondrial. Voici

quelques exemples de maladies qui sont causées par des mutations de l’ADN mitochondrial.

II.2.1- Syndrome de NARP (neuropathie ataxie rétinite pigmentaire).

Le syndrome de NARP est une maladie qui se caractérise par une rétinite pigmentaire

avec neuropathie sensorielle et ataxie cérébelleuse. Ce syndrome se caractérise par un retard

du développement, une faiblesse musculaire, la démence, des convulsions et des fonctions

sensorielles amoindries. Cette maladie touche 1 personne sur 12 000, elle est associée à des

mutations ponctuelles au niveau de la sous-unité 6 de l’ATP synthase (Majander et al, 1997).

Cette mutation entraîne le remplacement d’une leucine 156 hautement conservée (donc

probablement essentielle) en une proline, ce qui bloquerait la translocation des protons à

travers l’ATP synthase. En effet la sous unité 6 se trouve au niveau de la partie F0 de l’ATP

synthase qui constitue le pore (Kucharczyk et al, 2009). Une étude au niveau de la levure

18

S.cerevisiae a permis de constater qu’une mutation identique entraînerait une forte diminution

de l’activité de synthèse d’ATP (Rak et al, 2007), la quantité en complexe IV serait aussi

diminuée chez ces mutants de levure.

II.2.2- Maladie de LHON (Leber Hereditary Optic Neuropathy).

La maladie de LHON est une pathologie affectant l’œil. Cette maladie commence

généralement par des troubles de la vision suivis d’une perte totale ou quasi-complète de la

vue. Cette maladie liée à la dégénérescence du nerf optique et des neurones de la rétine,

touche 1 personne sur 25 000 (Man et al, 2002), et peut être causée par 18 mutations faux sens

dans 9 gènes différents tous mitochondriaux (ND1, ND2, COX1, ATP6, COX3, ND4, ND5,

ND6, CYTB. La mutation la plus fréquente associée à la maladie de LHON est celle touchant

le gène codant pour la sous unité 4 (ND4) de la NADH-CO2 réductase (Singh et al, 1989)

c'est-à-dire le complexe 1 de la chaîne respiratoire de la mitochondrie. La mutation ND4

G11778A fait partie des trois mutations les plus fréquentes chez des patients atteints de la

maladie de LHON, avec la mutation ND1 G3460 et la mutation ND6 T14484C, elles

représentent de 80 à 95 % des mutations présentes dans différentes populations (Yen et al,

2006). La mutation ND4 G11778A est présente dans 50 à 70 % des cas de LHON, pourtant

elle ne diminue l’activité du complexe I que de 20 %. D’autre part, elle diminue la sensibilité

à la roténone (inhibiteur du complexe I) et augmente la sensibilité au myxothiazol (inhibiteur

du complexe III). Au final, la mutation ND4 G11778A semblerait entraîner une augmentation

de la production de ROS ce qui a de graves conséquences au niveau de la cellule, entraînant la

mort cellulaire via la voie calcium dépendante (Yen et al, 2006).

II.2.3- Syndrome de Kearns-Sayre.

Le syndrome de Kearns-Sayre est une maladie qui se caractérise par une

ophtalmoplégie externe progressive et d’une dégénérescence de la couche pigmentaire de la

rétine. Des anomalies cardiaques ainsi qu’une ataxie peuvent aussi se manifester. La

fréquence de cette maladie est de 1 à 3 sur 100 000 personnes. Ce syndrome se caractérise par

une délétion de 1,3 à 8 kb du génome mitochondrial, un tiers de personnes atteintes de cette

maladie possède une délétion de 4,977 kb ce qui a pour conséquence l’absence de composants

des oxydations phosphorylantes codées par le génome mitochondrial (pour cette délétion :

ND3, ND4, ND5, COX3, ATP6, ATP8). Il s’ensuit l’obtention de chaînes respiratoires non

fonctionnelles (Kim et Chi, 1997). Le processus conduisant à la délétion de l’ADN n’a pas

19

Rég

ion l

inker

D

om

aine

exonucl

éase

Dom

aine

poly

mér

ase

R3P

R227WT

251I

G268AL

304R

L424G

fsX

28 (

CT

) del

etio

n-4

52X

Q308H

R309L

W312R

G380D

M430L

G431V

S433C

T452X

L463F

A467T

N468D

S511N

G517V

R562Q

R574W

R579W

P587L

R597W

M603L

R627W

R627Q

P648R

R709XG

737R

G746S

G748S

G763R

2354G

ins

en G

785R807P

Y831C

G848S

R853W

A862T

N864S

W918R

T914P

A889T

G923D

H932Y

R943H

R953C

Y955C

A957S

F961S

L965X

R1047Q

R1047W

G1051R

S1104C

R1096C

S1095R

I1079L

G1076V

A1105T

V1106I

R1138C

F1164I

S1176L

D1184N

Q49E

S64L

R193Q

P241L

P18S

P324S

L392V

R546C

E622K

R722H

Y831C

Q1236H

S1230F

R1142WE1143G

R1146C

Séq

uen

ce d

'adre

ssag

e

m

itoch

ondri

ale

G1

1D

G1

1D

Q4

3R

G

lu à

l'aa

43

-55 Q

68

X

L8

3P H

11

0Y A

14

3V

+ _

C2

24

Y

R2

27

P

R2

27

W

R3

23

G

R3

23

H

R3

23

H

W2

35

X

L2

44

P

T2

51

I

H2

77

C

T3

26

fsX

38

7

W3

47

_L

35

6d

el

R3

09

H

S3

05

R

L3

04

R

L3

04

R

R3

74

X

R4

17

T

C4

18

R

L4

28

P

S4

33

C

A4

67

T

A4

67

T

Q4

97

H

Q4

97

H

G5

17

V

L4

24

Gfs

X2

8 (

CT

)

dé

léti

on

-45

2XK5

61

M

H5

69

Q

R5

74

W

P5

87

L

P5

89

L

L6

05

R

R6

17

C

P6

48

R

Q7

15

X

c.2

15

7+

5_

+6

G7

37

R

G7

37

R

R6

27

Q

R6

27

Q

R6

27

W

R6

27

W

W7

48

S

W7

48

S

F7

49

S

G7

63

R

A7

67

D

R8

07

C

c.2

48

0+

1

G8

48

S

T8

49

H

T8

51

A

R8

52

C

R8

52

C

R8

53

Q

V8

55

A

A8

62

T

E8

73

X

IV

S1

5-9

-c.

24

8d

el1

2b

p

L9

66

R

R9

64

C

R9

64

C

A9

57

P

R9

43

C

H9

32

Y

T9

14

P

G8

88

S

L8

86

P

T8

85

S

Q8

79

H

R1

09

6H

R1

09

6C

W1

02

0XR

11

28

H

E1

14

3G

E1

14

3G

34

82

+2

T o

u C

M1

16

3R

G1

05

1R

R1

04

7W

Q1

23

6H

Y1

21

0fs

12

16

X

G1

20

5A

D1

19

6N

K1

19

1N

K1

19

1R

R1

18

7W

D1

18

4N

L1

17

3fs

X

Mu

tati

on

s e

ntr

ain

an

t d

es

Op

hta

lop

lég

ie e

xte

rne

pro

gre

ssiv

e (

PE

O)

Mu

tati

on

s e

ntr

ain

an

t d

es

ma

lad

ies

d'A

lpe

rs, M

yocé

réb

roh

ép

ato

pa

thie

et

au

tre

s sy

nd

rom

es

hé

pa

tocé

réb

rau

x in

fan

tile

s av

ec

dé

plé

tio

n d

e l'

AD

Nm

t

Mu

tati

on

s e

ntr

ain

an

t d

es

syn

dro

me

s a

taxi

qu

se e

t n

eu

rop

ath

ie, M

IRA

S, S

AN

DO

, SC

AE

s

Mu

tati

on

s e

ntr

ain

an

t d

'au

tre

s sy

nd

rom

es

(in

fert

ilité

ma

le, c

an

cer

test

icu

lair

e, p

ark

inso

ns

idio

pa

thiq

ue

, ma

lad

ie d

e C

ha

rco

t-M

ari

e T

oo

th),

ma

lad

ies

no

n c

lair

em

en

t d

éte

rmin

ée

s

Po

lym

orp

his

me

d'u

n s

eu

l nu

clé

oti

de

Fig

ure

5 :

Loca

lisa

tion

des

mu

tati

on

s en

train

an

t d

es m

ala

die

s et

poly

morp

his

me

de

la p

roté

ine

AD

N p

oly

mér

ase

γ

A

dap

té d

e C

han

et

Copel

and (

2009)

Bio

chim

Bio

phys

Act

a. 1

787 :

312-9

Muta

tion d

ans

l'A

DN

poly

mér

ase

γ

encore été élucidé, néanmoins s’il a été montré qu’avec moins de 50 à 55 % d’ADN muté

dans les mitochondries, il n’y a pas d’effet sur les activités enzymatiques mitochondriales,

une fois ce seuil dépassé, des conséquences au niveau de l’activité bioénergétique de la

mitochondrie apparaissent (Porteous et al, 1998).

Les quelques exemples de maladies dues à des modifications de l’information

génétique des mitochondries montre l’importance de cet ADN et la nécessité que la

réplication soit le plus efficace et fidèle possible. Cette réplication est assurée par une ADN

polymérase, dont les mutations de son propre gène entrainent des désordres importants du

génome mitochondrial à l’origine là aussi de maladies graves chez l’homme.

II.3 - Mutations du gène POLG (gène codant pour l’ADN polymérase gamma) :

Problème de réplication de l’ADN mitochondrial.

L’ADN polymérase gamma est codée par le gène POLG, une mutation du gène POLG

peut entraîner de graves désordres neuromusculaires, des ophthalmoplégies externes

progressives (PEO), des syndromes d’Alpers, la stérilité masculine, des ataxies et

neuropathies (Chan et Copeland, 2009). L’ADN polymérase gamma est la seule ADN

polymérase mitochondriale connue chez l’homme. Cette enzyme permet de répliquer l’ADN

mitochondrial, ce qui est essentiel lors de la multiplication cellulaire afin de maintenir

l’intégrité de cet ADN. Les maladies et syndromes cités précédemment sont caractérisés par

des délétions ou déplétions de l’ADN mitochondrial (Van Goethem et al, 2001). Plus de 160

mutations dans le gène humain POLG ont été identifiées et associées à de graves désordres

mitochondriaux. Ces mutations sont réparties sur toute la séquence du gène POLG (figure 5).

Je ne présenterai que 3 mutations de ce gène parmi les plus répandues responsables de

maladies mitochondriales chez l’homme, les mutations Y955C, A467T et W478S. Ainsi par

exemple la mutation du gène POLG entraînant le remplacement de la tyrosine 955 en une

cystéine a pour conséquence d’entraîner une ophtalmoplégie externe progressive. Cette

tyrosine est un acide aminé très conservé chez de multiples espèces et est connue pour

interagir avec l’ADN. Cette mutation entraînerait des évènements de délétion de l’ADN

mitochondrial, toutefois, le mécanisme n’est pas connu.

Parmi ces mutations, il est intéressant de noter qu’une mutation particulière A467T a

été trouvée dans la plupart des maladies liées à POLG. La fréquence de cette mutation est

comprise entre 0,2 et 1 % dans des populations saines de Belgique, de Grande-Bretagne, de

Norvège et de Finlande, alors que ce taux passe à 36 % dans des populations de patients

atteints d’une maladie causée par le gène POLG. Cette mutation touche un acide aminé se

20

trouvant dans la région linker de l’ADN polymérase gamma donc ne possédant pas d’activité

enzymatique ; toutefois, l’activité ADN polymérase se trouve fortement diminuée de 96%

(Chan et Copeland, 2009). La mutation A467T touche aussi l’activité exonucléase de l’ADN

polymérase. Donc, Il semble clair que cette mutation est critique pour la cellule et que la

mutation dans cette région linker diminue drastiquement les activités enzymatiques de l’ADN

polymérase gamma. L’une des raisons expliquant l’effet de cette mutation peut être une

diminution de la capacité de fixation de la ADN polymérase # sur l’ADN, ce phénomène

serait du à une mauvaise interaction avec la sous unité accessoire ADN polymérase #B. Il

s’agit d’une protéine qui se fixe sur l’origine de réplication de l’ADN mitochondrial et qui va

permettre le recrutement de la sous unité catalytique ADN Polymérase #.

Une autre mutation ponctuelle a été bien étudiée biochimiquement, il s’agit de la

mutation W748S, la mutation est localisée à l’extrémité de la région linker. Cette mutation est

la mutation la plus commune dans le cas de désordre de type ataxie ou neuropathie et est aussi

associée au syndrome d’Alpers (Hakonen et al, 2005). W478S ne modifie pas l’interaction de

l’ADN polymérase # avec la sous unité accessoire toutefois, elle entraîne une forte diminution

de l’activité ADN polymérase, une faible processivité, en effet cette mutation diminue

fortement la capacité d’interaction de l’ADN polymérase # sur l’ADN mitochondrial (Chan et

Copeland, 2009).

Ainsi des mutations dans une région même dépourvue d’activité enzymatique peuvent

avoir des conséquences sur l’activité de l’enzyme. Des mutations de POLG ont été montrées

comme étant impliquées dans 1 cas d’ataxie sur 125 (Hakonen et al, 2005).

Ainsi l’ADN polymérase gamma est très importante pour l’intégrité de l’ADN

mitochondrial car des mutations de POLG causent des délétions de l’ADNmt. Ces mutations

peuvent toucher à la fois des activités enzymatiques nécessaires à la réplication et réparation

de l’ADNmt mais peuvent aussi toucher des sites d’interactions de l’ADN polymérase gamma

avec d’autres protéines telles que la sous unité accessoire ADN Polymérase #B (Chan et

Copeland, 2009).

Au final, on peut estimer qu’une personne sur 4000 est atteinte d’une maladie

mitochondriale (sources : http://www.orpha.net, « le portail des maladies rares et des

médicaments orphelins »). Cette forte proportion met en évidence l’importance de la

mitochondrie dans la cellule et par conséquent la nécessité pour la cellule de maintenir l’ADN

nucléaire et mitochondrial intact. Pour cela deux processus essentiels existent ; il s’agit de la

réplication et de la réparation de l’ADN.

21

ADN polymérase

possédant des

sous unité primase

Hélicase

ADN polymérase

processive

Amorce ARNRPA : Protéine

de réplication A

FEN1

ADN Ligase 1

3'5'

3'

5'

Brin à synthèse continue

Brin à synthèse discontinue

Sens de déplacement

de la fourche

RNase H1

PCNA ADN

polymérase

processive

Figure 6 : Représentation de la fourche de réplication nucléaire et Réplication des brins sens

(synthèse continue) et antisens (synthèse discontinue). L'initiation est réalisée par une activité primase,

les amorces ARN seront ensuites utilisées par une ADN polymérase peu processive qui va synthétiser des

fragments d'Okazaki, l'élongation des fragments d'Okazaki est effectuée par une ADN polymérase plus

processive. Les amorces ARNs sont ensuites éliminés par l'action de la RNase H1 puis les trous sont

comblés par une ADN polymérase et enfin les fragmentsd'ADN sont ligués ensemble grâce à l'ADN

ligase 1.

Fragment d'Okazaki

III- LA REPLICATION.

Lors de la multiplication cellulaire, l’ADN, source d’information génétique doit être

transmis à chacune des deux cellules filles issues d’une cellule mère. Dans le but de maintenir

l’intégrité de l’ADN et de conserver une quantité d’ADN semblable entre la cellule mère et

les cellules filles, le génome doit être doublé. C’est le rôle de la réplication, il s’agit d’un

processus mettant en jeu de multiples protéines. Dans une cellule d’eucaryote supérieur,

l’ADN est contenu dans deux compartiments (trois pour les plantes) le noyau où est contenu

99% de l’information génétique, et la mitochondrie (et le chloroplaste pour les plantes).

III.1- La réplication nucléaire.

La réplication est un processus nécessitant l’action concertée d’une multitude de

protéines. Dans le but d’améliorer les connaissances sur la réplication, un modèle de

réplication fut mis au point; le SV40 (Simian virus) (Li et Kelly, 1984). L’ADN double brin

de 5 kb (Fiers et al, 1978) de ce virus ne code que pour 2 protéines impliquées dans la

réplication l’antigène T (large antigen T) qui joue le rôle de proteine initiateur de la

réplication en se fixant à l’origine de réplication virale, et présente une activité hélicase sous

forme de double hexamère permettant l’ouverture des brins d’ADN (Simmons, 2000), et le

petit antigene t (Small ag t) qui joue le rôle de trans activateur des promoteurs précoces et

tardifs dans le cycle viral (Carbone et al, 1992). Cet antigene a été montré impliqué

récemment dans la régulation de l’activation du grand AgT. Les autres protéines nécessaires

pour la réplication proviennent de la cellule hôte.

L’initiation de la réplication du SV40 nécessite la fixation de l’antigène T sur l’origine

de réplication et l’initiation de la séparation des brins (Li et Kelly, 1984). Une fois l’ADN

déroulé, une activité primase cellulaire se fixe sur l’ADN simple brin et synthétise de courts

fragments d’ARN primer de 8 à 12 nucléotides qui seront utilisés comme amorces par une

ADN polymérase dans l’étape d’élongation où il y a synthèse de fragments d’ADN d’une

vingtaine de nucléotides, les fragments d’Okazaki (Burgers, 2009). L’ADN polymérase

impliquée est une enzyme peu processive et peu fidèle, il est donc nécessaire qu’une ADN

polymérase capable de synthétiser des fragments d’ADN plus longs remplace la précédente

pour continuer la synthèse des brins d’ADN (figure 6). Ce changement est catalysé par le

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Dans le but de limiter les mutations dues à la

faible fidélité de l’ADN polymérase synthétisant les fragments d’Okazaki, la seconde ADN

22

Figure 7 : Modèle du recrutement du complexe minichomosomal de maintenance (MCM)

au niveau de l'origine de réplication. Le complexe ORC va reconnaitre l'ARS (Autonome Replication

Sequence) et va s'y fixer. Le complexe MCM (MiniChromosomal Maintenance) va être recruté grâce à

l'intervention de Cdc6 et Cdt1. Grâce à l'hydrolyse de l'ATP, le MCM pourra ouvrir les deux brins d'ADN.

MCM 2-7Cdt1

Complexe ORC

Cdc6

Origine de réplication

1 2 34

56

1 2 34

56

polymérase qui permettra l’élongation est capable de corriger les erreurs grâce à une activité

3’35’ exonucléase (Burgers, 2009).

L’ADN est une molécule orientée, et les ADN polymérases réalisent leur activité de

polymérisation uniquement dans le sens 5’3 3’. Ainsi, la réplication pourra être réalisée dans

le sens du déplacement de la fourche de réplication (brin à synthèse continue) tandis que

l’autre brin sera synthétisé dans le sens contraire (brin à synthèse discontinue). Ainsi, le brin à

synthèse discontinue, du fait de l’orientation antiparallèle par rapport à la progression de la

fourche de réplication nécessite la synthèse de multiples fragments d’Okazaki (de 20 à 50

millions à chaque cycle cellulaire). La seconde ADN polymérase catalyse la synthèse

discontinue jusqu’au prochain ARN. Ces amorces ARNs sont ensuite dégradées par la RNase

H1 jusqu’au dernier ribonucléotide faisant la jonction entre l’ARN et l’ADN. La flap

endonucléase FEN1 élimine le dernier ribonucléotide (Waga et Stillman, 1998); l’élimination

de l’ARN peut aussi être réalisée par la nucléase Dna2 (Budd et al, 2000). Une fois l’amorce

ARN dégradée, le trou laissé par FEN1 et la Rnase H1 est comblé par une ADN polymérase.

Les fragments d’ADN sont ligués bout à bout par l’ADN ligase 1.

D’autres facteurs interviennent dans le processus de réplication ; certaines protéines

grâce à une forte affinité avec l’ADN simple brin stabilisent l’ADN ouvert par l’hélicase en

se fixant sur l’ADN simple brin, c’est le cas de RPA (Replication Protein A) dont la

phosphorylation pourrait aussi réguler le cycle de réplication (Wold, 1997). D’autres enzymes

telles que les ADN topoisomérases interviennent en arrière de la fourche de réplication pour

relâcher les super-tours de l’ADN crés par le processus de réplication et par l’action des

hélicases (figure 7). En effet, l’ouverture de l’ADN conduit à des tensions par torsions ; ces

dernières peuvent être relâchées par des topoisomérases. Selon des études, une forte

concentration des enzymes topo I et topo II eucaryotiques est nécessaire pour relâcher les

torsions qui accompagnent l’initiation et la propagation de la fourche de réplication (Halmer

et Gruss, 1997). Topo I a été montré comme interagissant in vivo en amont de la fourche de

réplication alors que Topo II peut aussi se trouver en amont mais est essentiel pour la

décaténation (séparation de deux ADN par coupure et ligature) de l’ADN répliqué (Baxter et

Diffley, 2008). En effet, la délétion du gène TOP2 a pour conséquence de bloquer les cellules

humaines et les levures en phase G2 et d’induire la mort cellulaire.

L’initiation chez l’homme ou la levure commence par la reconnaissance de séquences

de réplication autonome (ARS) ; ce sont des régions non codantes de l’ADN

d’approximativement 100 à 200 pb (Bell et Dutta, 2002). La reconnaissance des ARS est

réalisée grâce à un complexe protéique : ORC (Origin Replication Complex) qui va se fixer

sur l’ADN au niveau des ARS. La fixation d’ORC va permettre le recrutement d’un complexe

23

Figure 8 : Structure potentielle des origines de réplication du brin lourd (OH) et du brin léger (OL)

chez l'homme.

Les origines de réplication sont les sites à partir desquels la réplication de l'ADN mitochondrial est initée.

Cette structure particulière de type ARNt serait reconnue par la sous-unité accessoire de l'ADN polymérase

γ qui présente des homologies de séquences avec les aminoacyl ARNt synthétase.

Carrodeguas et Bogenhagen (2000) Nucleic Acids Res. 28 : 1237-44.

hexamérique MCM (MiniChromosomal Maintenance) possédant une activité hélicase

(Bowers et al, 2004). Grâce à la présence de deux protéines Cdc6 et Cdt1 ainsi qu’à

l’hydrolyse d’ATP, le complexe MCM va ouvrir les deux brins d’ADN (figure 7) (Robinson

et Bell, 2005).

Le processus suivant, décrit précédemment grâce au SV40, est très proche chez tous

les organismes.

Ainsi la réplication nucléaire est un processus complexe qui nécessite une multitude de

protéines (figure 7); ces dernières possèdent chacune un rôle précis pour permettre d’obtenir

une machinerie rapide et efficace.

III.2- Réplication de l’ADN mitochondrial.

La réplication de l’ADN mitochondrial est un processus qui a été bien étudié chez

l’homme, le mécanisme est moins connu chez la levure S.cerevisiae. Deux systèmes de

réplication différents ont été imaginés, ces mécanismes permettraient d’expliquer la présence

de forme circulaire ou linéaire et d’expliquer leur réplication. En effet, l’observation de forme

d’ADN en lasso par microscopie suggère un mécanisme en cercle roulant contrairement à la

réplication unidirectionnelle qui ne laisserait observer que des formes circulaires. La

réplication mitochondriale chez l’homme (réplication unidirectionnelle) sera abordée dans un

premier temps puis le système de réplication proposé pour la levure S.cerevisiae (réplication

de type cercle roulant) sera présenté.

III.2.1- Modèle de réplication mitochondrial humain.

Les nombreux travaux concernant le mécanisme de la réplication de l’ADN

mitochondrial des animaux ont été réalisés chez les mammifères, particulièrement sur

l’homme et la souris. Le génome mitochondrial des animaux possède deux origines de

réplication : l’origine de réplication du brin lourd (OH) qui est localisée dans la boucle-D, et

l’origine de réplication du brin léger (OL) qui est localisée à proximité d’un groupe de 5 gènes

d’ARNt au deux tiers du génome à partir de l’origine de réplication du brin lourd. Ces

séquences particulières permettent le recrutement des protéines qui dénaturent l’ADN à ce

niveau. Bien qu’aucune séquence consensus n’ait été trouvée, ces séquences permettent

néanmoins de former des structures tertiaires très complexes en feuille de trèfle (figure 8)

(Nass, 1995). En plus de l’origine OH, la boucle-D contient les origines de transcription des

deux brins d’ADN (HSP : Heavy Strand Promotor, LSP : Light Strand Promotor). On note

24

D'après Shadel et Clayton (1997). Annu Rev Biochem. 66 : 409-435

1) Initiation de la transcription au niveau du LSP

2) Formation de boucle-R (hybride ARN/ADN)

3) Processing de primer ARN au niveau de la boucle R

4) Initiation de la synthèse au niveau du brin lourd

mtTFA mtTFB

CSBs

MRP

CSBI OH

Figure 9 : Modèle général pour l'initiation de la réplication du brin lourd mitochondrial chez les

vertébrés.

HSP

LSP

HSP

LSP

OL

OH

OHOH

OL

Boucle D

brin

lourd

brin

léger

ADN mitochondrial

vertébré

Brin lourd d'ADN néosynthétisé

3'

5'

3'5'

Figure 10 : Modèle de réplication unidirectionnel utilisé par les vertébrés.

Représentation schématique du génome mitochondrial des vertébrés. La synthèse débute au niveau de

l'origine de réplication du brin lourd (OH), l'ADN polymérase γ synthéthise jusqu'à l'origine de réplication

du brin léger (OL) au deux tiers du génome. Une fois les brins ouverts au niveau de l'OL, la réplication du

second brin démarre dans le sens inverse jusqu'à rencontrer la fourche de réplication du premier brin puis

nous obtenons 2 molécules d'ADN mitochondrial double circulaire.

D'après Shadel et Clayton (1997). Annu Rev Biochem. 66 : 409-435

aussi la présence d’une région CSBs (Conserved Sequence Blocks) constituée de trois blocks

de séquence conservée chez tous les mammifères (CSBI, CSBII et CSBIII).

Si l’initiation pour l’ADN nucléaire est réalisée par une activité primase, dans la

mitochondrie la présence d’activité primase est contestée puisque seuls des travaux de Wong

et Clayton en 1985 décrivent une telle activité (Wong et Clayton, 1985). Pourtant une

extrémité 3’OH libre est nécessaire pour initier la polymérisation par une ADN polymérase.

Un duplex stable ARN:ADN a été observé lors de test de transcription in-vitro au niveau de

l’origine OH (Xu et Clayton, 1996). In vivo, des extrémités 3’ d’ARN ont été montrées

comme coïncidant avec l’extrémité 5’ de molécules d’ADNs naissants (Chang et Clayton,

1985) et l’existence d’une liaison covalente entre ARN et ADN a été suggérée par l’apparition

de nouvelles extrémités 5’ après traitement de l’ADN au niveau de l’origine OH par une

RNase H, comparé à l’ADN non traité (Kang et al, 1997). Ainsi l’initiation de la réplication

dans la mitochondrie de cellule humaine serait pour le brin lourd initiée à partir d’un

transcript produit directement par l’ARN polymérase à partir du promoteur LSP. Cette

initiation spécifique est permise par le facteur de transcription mtTF1 (Dairaghi et al, 1995)

associé à l’ARN polymérase mitochondriale (RPO41). L’ARN synthétisé peut être utilisé

pour la transcription ou la réplication. Cependant, pour qu’il serve d’amorce à une ADN

polymérase, l’ARN doit être processé au niveau d’un site spécifique du CSBs par une RNase

MRP (Mitochondrial RNA Processing). L’extrémité 3’OH libre résultant de la coupure est

utilisée par l’ADN polymérase, et la synthèse du brin lourd H peut commencer (figure 9).

Cette synthèse est unidirectionnelle. Au deux tiers du génome mitochondrial, l’origine de

réplication du brin léger L est alors exposée, ce qui permet le début de la synthèse de ce brin

L dans la direction opposée à celle de la réplication du brin H. En ce qui concerne l’initiation

de l’origine de réplication OL, rien n’est connu, toutefois, il semblerait que l’origine OL forme

des boucles qui seraient reconnues par une sous unité de l’ADN polymérase possédant des

homologies avec le site actif des aminoacyl ARNt synthétase de classe II (Seligmann, 2009).

L’origine de réplication OL n’est pas précédée par un promoteur de transcription, cela suggère

que les amorces permettant d’initier la polymérisation du brin léger ne sont pas synthétisées

par une ARN polymérase. La synthèse du brin léger étant initiée plus tardivement que celle du

brin lourd, cette réplication est donc asymétrique. La synthèse s’arrête momentanément

lorsque les deux fourches de réplication se rencontrent. Les deux molécules filles se séparent

et la synthèse est achevée afin d’obtenir la formation de deux molécules filles contenant

chacune l’un des deux brins d’ADN parental (figure 10).

25

Figure 11 : Structure des Origines de réplication, ici ORI5.

Les origines de réplication sont des séquences d'environ 300 pb possédant des clusters GC, dénommés

cluster A, B et C séparés par des extensions AT. Le cluster C est précédé d'une séquence r qui correspond

au site début de synthèse de l'amorce ARN qui sera utilisé comme primer par l'ADN polymérase γ.

ori

Dans la cellule mère dans le

bourgeon

Réplication du cercle roulant

Cce1

Intermédiaire Holliday

Cassure double brin

au niveau de l'ori

Ntg1

Recombinaison homologue par crossing-over

conca

tém

ères

5'-Exonucléase

double

brin

Figure 12 : Modèle de la réplication en cercle roulant et de la recombinaison homologue permettant

l'obtention de concatéres.

Ntg1 introduit tout d'abord une coupure double brin au niveau de l'origine de réplication de l'ADN mitochondrial.

Une 5'-exonucléase double brin putative va processer 2 extrémités 3'. Si Mhr1 associe 1 seule extrémité 3' avec

une molécule d'ADN mt intact (A), un hétéroduplexe joint va être formé et la réplication en cercle roulant est

initiée et produit des concatémères. Par contre si Mhr1 associe 2 extrémités 3' à une molécule d'ADN mt

intacte (B), un processus de réparation double brin est initié pour former des produits de crossing-over

(intermédiaire d'Holliday). Ces intermédiaires sont ensuite coupés par Cce1 qui va former des molécules d'ADN

circulaire multimérique qui pourront être coupé par coupure double brin et donner des concatémères.

D'après Ling et al., (2007). Mol Cell Biol. 27 : 1133-1145

III.2.2- Modèle de réplication mitochondrial de la levure S.cerevisiae.

En ce qui concerne la levure S.cerevisiae, le nombre d’origines de réplication varie de

sept à huit selon les souches de levures (Baldacci et al, 1984). Elles ont été mises en évidence

sur la base de plusieurs critères :

- De leur présence obligée dans de petites molécules d’ADN circulaires qui

contiennent moins d’une unité génomique, et maintenue constamment chez

certaines levures mutantes dites 4petites4 ou 5- (de Zamaroczy et al, 1979),

- De part leur utilisation aussi bien en tant qu’origines de transcription que de

réplication (Christianson et Rabinowitz, 1983, Osinga et al, 1984),

- D’après leurs similarités avec les origines de réplication des autres

organismes (de Zamaroczy et al, 1984, Faugeron-Fonty et al, 1984).

Ces origines de réplication font environ 300 pb et sont formées de 3 clusters GC (A, B

et C) séparés par des extensions AT (figure 11). Un site d’initiation de la transcription appelé

r est généralement trouvé en amont du cluster C dans les origines de réplication actives

(Foury et al, 1998). Parmi ces nombreuses origines de réplication, seules quatre (Ori 1, 2, 3 et

5) sont également des sites d’initiation de la transcription, donc éventuellement fonctionnelles

in vivo (Baldacci et al, 1982). De plus, seules les délétions des origines de réplication 3 et 5

entraînent des perturbations sérieuses du génome mitochondrial. Ces données suggèrent que

seules ces deux origines de réplication pourraient être fonctionnelles (Piskur, 1988 et 1989).

La localisation de ces deux origines de réplication, et l’orientation inverse qu’elles

montrent, suggèrent que l’origine de réplication 5 serait impliquée dans l’initiation de la

réplication du brin lourd, alors que l’origine de réplication 3 permettrait d’initier la réplication

du brin léger. Ces deux origines de réplication sont espacées d’une distance équivalente au

deux tiers du génome mitochondrial.

La présence d’une majorité de molécules sous forme linéaire chez les végétaux et les

champignons (et S.cerevisiae), ainsi que l’existence de molécules d’ADN de 60 kb à plusieurs

centaines de kilobases et dans certains cas plus de 1 Mb (Bendich, 1996) suggère un

mécanisme de réplication de leur ADN mitochondrial différent de celui de l’homme, qui

passerait par des molécules linéaires. La présence des concatémères (multimère d’ADN

linéaire tête à queue) peut être expliquée par 2 processus (figure 12), la recombinaison

homologue de 2 molécules d’ADN circulaire et le mécanisme du cercle roulant. Ce qui est

clair c’est que deux protéines sont essentielles chez la levure Mhr1 et Cce1, en effet la

26

délétion des 2 gènes MHR1 et CCE1 entraîne la perte de l’ADN mitochondrial (Ling et

Shibata, 2002).

III.2.2.1- Recombinaison homologue.

Une protéine (Ntg1) va introduire une cassure double brin au niveau d’une origine de

réplication de l’ADNmt : Ori5 (Hori et al, 2009). Il a été montré que la protéine Ntg1 est

capable d’introduire des coupures d’ADN simple brin dans un ADN double brin lors de

processus de réparation BER (Base Excision Repair) en excisant la base endommagée grâce à

une activité ADN N-glycosylase puis ensuite grâce à son activité ADN lyase (Eide et al,

1996). La cassure double brin va donner deux extrémités 3’ simple brin suite à l’action d’une

exonucléase 5’ double brin. Si la protéine Mhr1 associe une seule extrémité 3’ simple brin

avec une séquence homologue d’une molécule d’ADNmt circulaire intact, un hétéroduplex

joint sera formé et la réplication en cercle roulant va s’initier et produire des concatémères.

Mais si la protéine Mhr1 associe deux extrémités 3’ simple brin avec une molécule d’ADN

circulaire mitochondrial intact (grâce à des homologies de séquences), cela formera encore un

hétéroduplex joint. Ensuite un processus de réparation de cassure double brin (Szostak et al,

1983) va réaliser un crossing over. Le produit obtenu après crossing-over (appelé aussi

intermédiaire d’Holliday) nécessite une protéine Cce1 (Cruciform Cutting Endonuclease) qui

va couper les intermédiaires d’Holliday (Kleff et al, 1992). Le clivage double brin des formes

circulaires multimériques d’ADN peut produire comme le cercle roulant des concatamères

(figure 12). Les concatamères vont être ensuite modifiés en forme monomérique circulaire

(Ling et Shibata, 2004, Ling et Shibata, 2002).

III.2.2.2- Cercle roulant.

En ce qui concerne le cercle roulant, il s’agit d’un mécanisme de réplication qui

permettrait d’obtenir des molécules linéaires à partir de molécules circulaires (Maleszka et al,

1991) (figure 12). Un tel mécanisme a déjà été mis en évidence chez le bactériophage 6X174

(Kornberg et Backer, 1992) ainsi que des plasmides bactériens (Gros et al, 1987) et des

plasmides présents dans les mitochondries de champignons ou de plantes (Maleszka et Clark-

Walker, 1992, Backert et al, 1998). Des molécules d’ADN linéaires de grandes tailles ont

aussi été observées dans les mitochondries de Marchantia polymorpha (Oldenburg et

Bendich, 1998) et seraient obtenues par le mécanisme de réplication du cercle roulant.

La première étape de la réplication selon le processus du cercle roulant est

l’interaction de l’origine double brin (DSO) avec les protéines initiatrices. La protéine Rep

27

interagit avec une séquence spécifique contenue dans le DSO, il en résulte l’apparition d’une

boucle d’ADN et/ou la génération d’une structure en épingle à cheveux simple brin dans

laquelle le site de coupure de Rep est localisé. La protéine Rep va ainsi couper et va se

retrouver liée covalement à l’extrémité 5’ Phosphate par la tyrosine présente dans son site

actif. La protéine Rep va ensuite recruter une ADN hélicase (PcrA dans le cas de bactéries à

Gram +) grâce à une interaction spécifique (Chang et al, 2002). L’hélicase va ainsi dérouler

l’ADN et des protéines de fixation à l’ADN simple brin (SSB) vont recouvrir cet ADN simple

brin. La réplication du brin direct va être réalisée par une ADN polymérase par extension de

l’extrémité 3’ OH au niveau du site de coupure et jusqu’à ce que le brin direct soit totalement

déplacé. Une fois que la fourche de réplication arrive au niveau du site de terminaison (DSO

régénéré), la synthèse d’ADN se poursuit d’environ dix nucléotides au-delà du site de

coupure. Un second monomère Rep va couper l’ADN simple brin déplacé. Il s’en suit des

évènements de coupure/ré-association, et le brin direct circulaire va être libéré en présence

d’un ADN relâché circulaire. L’ADN double brin va être ensuite super-enroulé par une

gyrase.

Bien que l’ADN mitochondrial soit beaucoup plus petit que l’ADN nucléaire, nous

pouvons remarquer que malgré la différence de taille, la réplication de l’ADN mitochondrial

nécessite également une multitude de protéines. Dans ces deux systèmes de réplication, les

ADN polymérases jouent un rôle central et doivent répliquer l’ADN rapidement et le plus

fidèlement possible. Même si des systèmes de contrôle de l’efficacité de la réplication

existent, des erreurs dues à la réplication ou à l’environnement peuvent néanmoins apparaître.

Pour corriger ces erreurs et maintenir l’information génétique intacte, les cellules possèdent

différents systèmes de réparation de l’ADN.

IV- LA REPARATION DE l’ADN.

Les systèmes de réparation de l’ADN sont essentiels pour la maintenance de

l’information génétique. Des altérations dans la structure de l’ADN, si elles ne sont pas

réparées, peuvent entraîner des mutations et des modifications de l’information génétique.

Des instabilités génomiques peuvent être induites par des facteurs exogènes tels que

l’alimentation, le style de vie, des stress environnementaux, ainsi que des radiations solaires et

des produits chimiques. Mais les instabilités génomiques peuvent aussi être dues aux

processus métaboliques produisant par exemple les espèces activées de l’oxygène qui peuvent

28

Base endommagée

Glycosylase (e.g. UNG)

APE1 dRP

POL β

voie du

Short-Patch BER voie du

Long-Patch BER

PCNA, RFC

POL βet/ou POLδ/ε

POLβ

LIG3α/

XRCC1

FEN1

LIG1

D'après Wilson et Bohr (2007) DNA repair. 544-559.

figure 13 : Système de réparation BER nucléaire.

Le Short-patch (SP) et le Long-patch (LP) BER sont représentés. La base endommagée va être coupée par une

glycosylase mono ou bifonctionnel. Dans le cas d'une glycosylase mono-fonctionnelle, une endonucléase sera

nécessaire pour retirer le site abasique. Ainsi, la base et le sucre sont retirés et un coupure simple brin est obtenue.

Un résidu dRP sera coupé par une ADN polymérase qui va ensuite remplacer la base et enfin la ligase 3 va liguer

les 2 fragments d'ADN (SP-BER). Après action de l'endonucléase, au lieu de retirer le résidu dRP, une ADN

polymérase peut réaliser un déplacement de brin ce qui entraine l'apparition de fragment d'ADN prohéminent qui

devra être coupés par FEN1. La ligase 1 ligue bout a bout les fragments d'ADN (Long-patch BER).

endommager l’ADN mitochondrial. Les systèmes de réparation les plus importants des

cellules de mammifères (figure 13) sont le système de réparation par excision de base (BER),

le système de réparation par excision de nucléotide (NER), la réparation des coupures double

brin, le système de réparation des mauvais appariements (MMR). Le BER permet de

remplacer des bases altérées, de réparer des sites abasiques et des coupures simple brin

(Wilson et Bohr, 2007). Le NER quant à lui permet de corriger les lésions étendues ou qui

déforment de manière importante l’ADN, par exemple des pontages avec des molécules

exogènes (Costa et al, 2003). Le MMS permet de réparer les mauvais appariements, c'est-à-

dire de réparer la présence en vis-à-vis de deux bases non complémentaires dans la double

hélice de l’ADN (Jun et al, 2006).

De tous les systèmes de réparation, il semble que seul le BER soit retrouvé dans la

mitochondrie, il permet de réparer des mutations de l’ADN nucléaire mais aussi de l’ADN

mitochondrial (Maynard et al, 2009).

IV.1- Le BER dans le noyau.

Le BER est un processus essentiel pour la maintenance génomique, qui lorsqu’il fait

défaut entraîne les cancers, vieillissement prématuré et défauts métaboliques chez les animaux

(Mostoslavsky et al, 2006). Il existe deux voies du BER possible, cela dépend des dommages

et des enzymes impliquées (figure 13). De multiples agents exogènes ou endogènes peuvent

causer des dommages de l’ADN, les ultraviolets, des radiations ionisantes, des agents

alkylants, les radicaux libres, les erreurs de la réplication (Tuteja et Tuteja, 2001). Durant le

short-patch BER, seul un nouveau nucléotide est incorporé à la place d’une base

endommagée ; tandis que dans le long-patch BER, de deux à six nouveaux nucléotides sont

incorporés.

L’étape initiale du BER nécessite des ADN glycosylases (figure 13) ; ces enzymes

coupent la liaison N-glycosyl entre le sucre et la base et relarguent la base endommagée pour

former un site abasique aussi appelé site apurinique/apyrimidique (AP). Il existe différentes

glycosylases, elles peuvent être spécifiques de certaines lésions ; par exemple, OGG1 possède

une forte spécificité pour les lésions de type 8-oxyG et FapyG (Morland et al, 2002) alors que

NEIL1 enlève efficacement les lésions FapyG et 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine

(Parsons et al, 2005). Certaines de ces glycosylases sont monofonctionnelles (et ne possèdent

que l’activité glycosylase) et nécessitent une autre enzyme (APE1) pour exciser le sucre au

niveau du site abasique. D’autres sont bifonctionnelles (comme OGG1 et NEIL1) et sont

capables de retirer la base et de couper l’ADN en 3’ du site AP. Il en résulte une cassure

29

simple brin qui présente un aldéhyde 3’-!7"-insaturé ou un 3’-phosphate qui doit être éliminé

préalablement à une polymérisation ou une ligation par l’endonucléase 1 (APE1). Cette

enzyme possède la capacité de couper immédiatement en 5’ du site AP, ainsi que de retirer

l’extrémité 3’ génante. Une ADN polymérase va remplacer le nucléotide excisé et enlever le

résidu dRP produit par la coupure de l’APE1, grâce à une activité dRP lyase (short-patch

repair). Toutefois, la polymérisation peut entraîner un déplacement de brin (long-patch BER)

et nécessite alors une flap endonucléase comme FEN1 pour couper le fragment d’ADN

déplacé, protubérant. Les deux fragments d’ADN sont ensuite ligués grâce à des ADN ligases,

l’ADN ligase 1 pour le LP-BER (Long-Patch BER) et l’ADN ligase III pour le SP-BER

(Short-Patch BER).

IV.2- Le BER dans la mitochondrie.

La proximité de l’ADN mitochondrial et des chaînes des oxydations phosphorylantes

qui sont le lieu principal de production des ROS oblige la mitochondrie à posséder des

systèmes pour se protéger des dommages oxydatifs. Mis à part des systèmes de protection tels

que les catalases ou le glutathion, il est nécessaire qu’un système de réparation de l’ADN

existe au niveau de la mitochondrie.

Le seul système de réparation mis en évidence pour le moment au niveau de la

mitochondrie est le système BER, en particuliers le LP-BER (Akbari et al, 2008). Le

processus est identique au Long-Patch BER décrit au niveau du noyau. Il a été montré que la

majorité des gènes codant pour des protéines impliquées dans le BER subissent un épissage

alternatif. Grâce à cet épissage alternatif, les protéines impliquées dans le LP-BER dans le

noyau pourraient avoir une localisation mitochondriale et participer au LP-BER dans la

mitochondrie.

C’est le cas des gènes codant pour les glycosylases OGG1 (Hashiguchi et al, 2004),

MYH (Ohtsubo et al, 2000) et UNG (Nilsen et al, 1997), et APE1 (Tell et al, 2005). Toutes

ces protéines possédant une localisation nucléaire et qui sont mises en évidence dans les

mitochondries laissent penser que la réparation dans la mitochondrie pourrait être réalisé par

plusieurs systèmes de réparation comme c’est le cas dans le noyau, mais la difficulté d’étude

du matériel mitochondrial n’a pas encore permis de les mettre en évidence.

Nous pouvons remarquer que les ADN polymérases sont centrales et essentielles aux

deux processus, la réplication et la réparation. Dans le paragraphe suivant nous allons décrire

les différents types d’ADN polymérases trouvés dans les cellules.

30

V- LES ADN POLYMERASES.

Les ADN polymérases sont des enzymes qui furent identifiées, caractérisées et

différenciées dans un premier temps à l’aide d’inhibiteurs et en fonction de leurs propriétés

biochimiques (taille, spécificité à différents substrats…). Ultérieurement, des analyses

génétiques ont permis d’assigner les gènes correspondants aux ADN polymérases connues et

d’identifier de nouvelles ADN polymérases par homologies de séquence.

V.1- Historique.

Les ADN polymérases ont été découvertes en 1955, deux ans après la découverte de la

structure en double hélice de l’ADN par Watson et Crick (Watson et Crick, 1953). Les

premiers protocoles pour purifier partiellement des activités polymérases à partir

d’Escherichia coli furent publiés en 1958 par le laboratoire de Kornberg (Lehman et al,

1958a). La synthèse enzymatique, la caractérisation des quatre désoxynucléotide

triphosphates, et de l’ADN produit furent réalisées par Lehman et Kornberg (Lehman et al,

1958b). Ces enzymes ont la capacité de réaliser la synthèse de l’ADN mais ne sont pas

capables de commencer une chaîne de novo, en effet elles nécessitent une matrice ADN ou

ARN possédant une extrémité 3’OH libre à la suite de laquelle des désoxynucléotides sont

ajoutés. Elles nécessitent aussi une matrice ADN utilisée pour guider l’ADN polymérase dans

le choix du dNTP correct à insérer lors de la polymérisation. L’implication de ces enzymes

dans la réparation de l’ADN a été démontrée par des expériences de délétion qui entraînent

une augmentation du taux de mutation sous l’effet d’UV (Richardson et al, 1964).

V.2- Polymérases bactériennes.

La première ADN polymérase découverte en 1955 chez Escherichia coli par Kornberg

fut par la suite désignée comme étant l’ADN polymérase I, puis en 1969, John Cairns et Paula

DeLucia isolèrent un mutant d’E.coli qui paraissait dépourvu de cette activité ADN

polymérase mais qui était viable et possédait une croissance normale. Les souches

présentaient toutefois une forte sensibilité aux UV ce qui indiquait que les cellules étaient

déficientes en système de réparation de l’ADN. Au même moment, les gènes nommés dnaA,

dnaB, dnaC furent découverts et paraissaient essentiels pour une réplication normale, ainsi

l’ADN polymérase I ne pouvait être seule responsable de la réplication de l’ADN. En peu de

31

temps deux ADN polymérases furent découvertes l’ADN polymérase II (Kornberg et Gefter,

1971, Knippers, 1970) et l’ADN polymérase III (Kornberg et Gefter, 1972) qui sont

clairement différentes de l’ADN polymérase découverte en 1955. Récemment deux autres

ADN polymérases furent découvertes chez E.coli, les ADN polymérases IV (Wagner et al,

1999) et V (Tang et al, 1999, Reuven et al, 1999), comme les ADN polymérases I et II, ces

nouvelles ADN polymérases sont impliquées dans la réparation de l’ADN.

Bien que les recherches d’ADN polymérase et les études de réplication et de

réparation aient été réalisées sur E.coli, étant donné les facilités de cultures, les ADN

polymérases ont été trouvées dans tout le règne bactérien (Leulliot et al, 2009), mais

également chez la levure et les cellules animales, étant donné l’importance de cette famille

d’enzymes au regard des divisions cellulaires.

V.3- Les ADN polymérases animales.

V.3.1- L’ADN polymérase alpha (!).

La première ADN polymérase découverte chez les cellules animales fut l’ADN

polymérase !, elle fut mise en évidence par Fred Bollum et Van Potter (Bollum et Potter,

1957). Chez tous les organismes eucaryotes, l’ADN polymérase ! est une enzyme hétéro-

tétramérique, chez l’homme, les sous unités sont codées par les gènes POLA1 (code pour une

sous unité d’une masse de 166 kDa), POLA2 (code pour une sous unité d’une masse de 68

kDa), PRIM1 (code pour une sous unité d’une masse de 48 kDa) et PRIM2A (code pour une

sous unité d’une masse de 58 kDa). La sous-unité catalytique p166 est composée de 3

domaines séparés qui sont (a) un domaine N-terminal (acides aminés 1 à 329) qui apparaît

superflu pour l’activité catalytique ainsi que pour l’assemblage ; (b) une partie centrale

(acides aminés 330-1279) qui contient toutes les régions conservées responsables de la

fixation à l’ADN, des dNTP et du transfert du groupement phosphoryle ; et (c) un domaine C-

terminal (acides aminés 1235-1465) qui est non essentiel à l’activité catalytique mais

nécessaire pour l’interaction avec les autres sous unités, en effet ce domaine contient un motif

en doigt de zinc. La sous unité A2 quant à elle ne possède pas d’activité enzymatique

mesurable mais apparaît jouer un rôle dans le maintien d’un complexe hétérotétramérique

fonctionnel, de plus elle semble jouer un rôle dans la régulation de l’activité ADN polymérase

en fonction de son état de phosphorylation au cours du cycle cellulaire (Mizuno et al, 1999).

Récemment, l’interaction entre la sous unité A2 et la sous unité catalytique de l’ADN

polymérase ! a été étudiée par cristallographie aux rayons X (Klinge et al, 2009). Ainsi,

32

l’extrémité C-terminale de la sous unité catalytique (acides aminés 1263-1468) et les acides

aminés 246-705 de la sous unité B sont capables d’interagir entre eux.

En ce qui concerne l’import de ces sous unités au noyau, il a été montré la nécessité

que p166 interagisse avec p68 pour que ces deux protéines aillent au noyau, tandis que les

sous unités primases sont importées indépendamment des deux autres sous unités grâce à une

séquence d’adressage nucléaire présente sur Pri2.

Cette ADN polymérase est impliquée dans la réplication nucléaire, tout d’abord au

niveau de la synthèse des amorces ARN grâce à sa sous unité primase Pri1 et ensuite grâce à

la sous unité ADN polymérase catalytique qui va permettre la synthèse des fragments

d’Okazaki.

V.3.2- L’ADN polymérase beta (").

La seconde ADN polymérase eucaryotique identifiée en 1971 est l’ADN polymérase "

(Weissbach et al, 1971), cette protéine est codée par le gène humain POLB. L’ADN

polymérase " est trouvée chez toutes les espèces de vertébrés sous la forme d’une protéine de

39 kDa. Elle ne posséde pas d’activité 3’ ou 5’ exonucléase mais contient des activités 5’dRP

lyase et AP lyase (Wilson et al, 1999). Cette protéine est composée d’un domaine amino-

terminal lyase de 8 kDa connecté par un petit domaine sensible à la protéolyse à un domaine

carboxyl-terminal ADN polymérase de 31 kDa. Le domaine N-terminal possède une forte

affinité pour les acides nucléiques simple brin et une faible affinité pour les acides nucléiques

double brin. Contrairement au précédent domaine le domaine C-terminal possède une forte

affinité pour l’ADN double brin mais une faible affinité pour l’ADN simple brin (Pelletier et

al, 1996).

L’une des ADN polymérases les plus facilement étudiées a été l’ADN polymérase beta

de part sa taille, sa facilité à être sur-exprimée et à être purifiée. L’ADN polymérase " est une

enzyme clé du système de réparation BER, elle comble les espaces dans le SP-BER et dans

quelques cas de LP-BER via son activité de synthèse d’ADN par déplacement de brin. Son

activité dRP lyase est nécessaire pour la voie indépendante d’APE1. La délétion du gène

POLB chez la souris a pour conséquence d’entraîner la mort de l’embryon ce qui indique un

rôle essentiel de l’ADN polymérase " durant le développement du fœtus (Gu et al, 1994).

Cette délétion a pour conséquence de rendre des fibroblastes de souris hypersensibles à des

agents alkylants de l’ADN ce qui prouve l’importance de l’ADN polymérase " dans le BER

(Sobol et al, 1996).

33

V.3.3- L’ADN polymérase gamma (#).

Une enzyme spécifique des mitochondries fut découverte en 1975 (Weissbach et al,

1975) et sa localisation mitochondriale fut rapidement vérifiée en 1977 (Bolden et al, 1977).

Cette ADN polymérase est hétérodimérique chez l’homme, elle est composée d’une sous

unité catalytique ADN polymérase # codée par le gène POLG et d’une sous unité accessoire

ADN Polymérase #B codée par le gène POLG2. Ces protéines sont respectivement de 140 et

55 kDa. La sous unité catalytique de l’ADN polymérase gamma possède un domaine

polymérase, un domaine 3’35’ exonucléase qui peut expliquer la meilleure fidélité de cette

ADN polymérase et enfin un domaine 5’-désoxyribose phosphate (dRP) lyase. Cette activité a

été mise en évidence au niveau de la forme humaine de l’ADN polymérase (Longley et al,

1998). En ce qui concerne la sous unité accessoire ADN Polymérase #B, des similarités de

séquence avec des aminoacyl ARNt synthétases de classe II ont été constatées chez le xénope

(Carrodeguas et al, 1999) et l’humain (Carrodeguas and Bogenhagen, 2000). Cette homologie

entre le domaine C-terminal de la sous unité B et un domaine de fixation à l’ARN ont conduit

à la proposition du rôle potentiel de l’ADN Polymérase #B dans la réplication (Fan et al,

1999). Elle pourrait être impliquée dans la reconnaissance de la structure tridimensionnelle en

feuille de trèfle de l’ARN fixé sur l’origine de réplication mitochondriale. De plus, des

expériences de pontage aux UV chez la drosophile ont mis en évidence que la sous unité

accessoire fixe un ARN dans un complexe comportant l’ADN polymérase # et une matrice

synthétique (Fan et Kaguni, 2001). La sous unité accessoire est importante aussi pour la

processivité de la synthèse de l’ADN polymérase # (Lim et al, 1999).

L’ADN polymérase # est considérée comme la seule ADN polymérase réplicative de

la mitochondrie (Kaguni, 2004). Son rôle dans la réplication de l’ADN mitochondrial fut

déterminé grâce à l’inactivation du gène codant pour l’ADN polymérase # (POLG). L’ADN

polymérase serait l’ADN polymérase impliquée dans la réparation de l’ADN par le système

LP-BER au niveau de la mitochondrie. De plus l’activité dRP lyase pourrait retirer le sucre

dRP en 5’ terminal qui résulte de l’action des glycosylases et AP endonucléase lors du

phénomène de réparation.

V.3.4- L’ADN polymérase delta ($).

34

En 1976, une quatrième ADN polymérase fut identifiée dans les cellules de

mammifères, il s’agit de l’ADN polymérase $ (Byrnes et al, 1976). L’ADN polymérase $ était

initialement identifiée comme une ADN polymérase de proofreading dans les cellules de

mammifères (Lee et al, 1980). Suivant les règnes, une grande hétérogénéité a été observée en

ce qui concerne sa composition en sous unités. Chez l’homme, elle est composée de quatre

sous unités de 124, 51, 66 et 12 kDa codées respectivement par les gènes POLD1, POLD2,

POLD3 et POLD4 (Burgers, 2009).

L’ADN polymérase $ est capable d’interagir avec le PCNA, ce qui a pour

conséquence d’améliorer de 100 à 150 fois la processivité de l’ADN polymerase $ en

présence d’ADN de Thymus de veau (Weiser et al, 1991). De plus le PCNA catalyse

l’échange de l’ADN polymérase alpha avec l’ADN polymérase delta au niveau des fragments

d’Okazaki du brin à synthèse discontinue (Burgers, 2009). L’ADN polymérase $ serait aussi

impliquée dans la réparation de ces fragments. Toutefois des doutes existent concernant

l’identité de l’ADN polymérase réalisant l’élongation au niveau du brin sens. Cette ADN

polymérase pourrait aussi être responsable de la polymérisation lors du système de réparation

par LP-BER (Stucki et al, 1998).

V.3.5- L’ADN polymérase epsilon (%&'

L’ADN polymérase % fut mise en évidence dans des cellules de mammifères en 1989

(Focher et al, 1989) comme une ADN polymérase $ dont l’activité est indépendante de la

présence de PCNA. Elle se compose de quatre sous unités chez l’homme (Burgers, 2009)

codées par les gènes POLE1, POLE2, POLE3, POLE4 de masse respective de 261, 59, 17 et

12 kDa. Le domaine N-terminal (140 kDa) de la protéine Pole1 est très conservé chez les

eucaryotes (63% d’homologies entre l’homme et la levure). Ce domaine comprend des

résidus essentiels à l’activité 3’ exonucléase de l’ADN polymérase % (Pursell et Kunkel,

2008). En ce qui concerne l’extrémité C-terminale (120 kDa) de cette sous unité, elle ne

présente pas d’activité catalytique connue, toutefois elle présente des homologies de séquence

de 25% entre l’homme et la levure. Les 100 derniers résidus en C-terminal contiennent deux

domaines en doigt de zinc et cette extrémité de la protéine semble être nécessaire et suffisante

pour l’interaction avec les petites sous unités de l’holoenzyme (Dua et al, 1998). La sous unité

de 59 kDa possède une très forte interaction avec la sous unité catalytique, toutefois elle ne

possède pas d’activité catalytique connue, et son absence diminuerait la stabilité de l’ADN

polymérase % lors de la purification de l’holoenzyme (Li et al, 1997). En ce qui concerne les

35

deux autres sous unités (codées par POLE3 et POLE4) aucune activité catalytique n’est

trouvée chez ces dernières et elles ne sont pas essentielles pour l’activité de la sous unité

catalytique. Ces sous unités semblent moduler la fidélité de l’ADN polymérase % lors de la

synthèse d’ADN.

L’ADN polymérase % serait impliquée dans la synthèse du brin sens dans la réplication

nucléaire (Pursell et Kunkel, 2008). La délétion de cette enzyme est létale pour la cellule ce

qui impliquerait un rôle essentiel à la réplication. Néanmoins, il est considéré l’hyptothèse

selon laquelle l’ADN polymérase $ serait responsable de la majorité de la synthèse d’ADN au

niveau des 2 brins, ce qui est corrélé par la nécessité des ADN polymérases ! et $ dans la

réplication du SV40 mais pas de l’ADN polymérase % (Zlotkin et al, 1996).

Au final, il apparaît aussi que l’ADN polymérase % serait impliquée dans la réparation

de l’ADN via les systèmes BER dépendant du PCNA (Stucki et al, 1998) et le NER (Shivji et

al, 1995).

V.3.6- L’ADN polymérase zeta (().

L’ADN polymérase ( a été découverte en 1993 (Bialek et Grosse, 1993), il s’agit

d’une enzyme qui est composée de deux sous unités Rev3L et Rev7, elles sont codées

respectivement par les gènes REV3L et REV7. Deux transcrits ont été identifiés pour le gène

REV3, un des produits d’expression de ce gène ferait 353 kDa (Gibbs et al, 1998, Lin et al,

1999) et le second ferait 344 kDa en fonction d’un épissage alternatif (Morelli et al, 1998).

Rev3 contiendrait l’activité catalytique de l’ADN polymérase zeta. Le gène REV7 code pour

une protéine de 24 kDa qui est capable d’interagir avec Cdc20 et Mad2 (deux protéines de

contrôle du cycle cellulaire) et avec Rev3L. D’après des expériences de co-

immunoprécipitation, Rev3L interagirait avec Rev7 via un domaine contenu dans les a.a 1776

à 2044 (Murakumo et al, 2001).

En réponse aux dommages de l’ADN et au stress cellulaire, Rev7 favoriserait la

phosphorylation d’un facteur de transcription Elk-1 par la protéine jnk (c-Jun N-terminal

protein Kinase). En effet, Elk-1 est une cible nucléaire pour la voie de signalisation ras-raf-

MAPK. Ainsi Rev7 permettrait la régulation de l’activité d’un facteur de transcription et

contribuerait à la régulation des gènes cibles dont la transcription est activée par Elk-1 comme

Egr1 (Zhang et al, 2006). En ce qui concerne le rôle de l’ADN polymérase (, cette enzyme

semble être une protéine essentielle pour la synthèse d’ADN à travers une lésion de façon

« error-prone » ou « error-free » (laisse des erreurs ou n’en laisse pas) (Ziv et al, 2009). Il

semble aussi qu’elle coopérerait avec d’autres ADN polymérases dans des mécanismes

36

nécessitant deux ADN polymérases, par exemple avec l’ADN polymérase , lors d’une lésion

de type BP-G (benzo [a] pyrene-guanine) ou , et * lors d’une lésion de type cisPt-

GG (pontage covalent entre deux guanines). L’ADN polymérase zeta possède un rôle crucial

dans la synthèse à travers une lésion (Shachar et al, 2009).

V.3.7- L’ADN polymérase Rev1.

Le gène REV1 code pour une protéine de 138 kDa (Lin et al, 1999). Cette protéine

possède un domaine BRCT (Brca1 C-terminal), il s’agit d’un domaine trouvé dans des

protéines impliquées dans la réparation d’ADN. Le domaine BRCT de Rev1 (acides aminés

de 1 à 151) a été montré comme étant important pour la localisation nucléaire. Toutefois un

fragment situé au niveau de la partie C-terminale de la protéine (a.a. 826-1036) permettrait la

translocation de la protéine dans le noyau et inclurait des régions UBM (Ubiquitin-Binding

Motif, UBM1 : a.a. 933-962, UBM2 : a.a. 1011-1040) (Gan et al, 2008).

Cette protéine possède une activité dCMP transférase qui est très spécifique, ainsi la

protéine Rev1 incorporerait préférentiellement un C normalement en face d’un G (Haracska et

al, 2002). La protéine peut aussi insérer un C en face d’un site abasique ou d’une uracil (Lin

et al, 1999). Enfin, le domaine BRCT de Rev1 est capable d’interagir avec le PCNA et le

PCNA ubiquitinylé. Les UBM et BRCT sont essentiels à la protéine, et le pontage entre ces

deux domaines supprime la capacité de Rev1 d’être recrutée au niveau de la fourche de

réplication nucléaire (Guo et al, 2006). Ainsi les régions UBM et le domaine BRCT sont

nécessaires à Rev1 pour interagir avec le PCNA qui va localiser Rev1 au niveau des

extrémités 3’OH libres. Lorsque l’ADN est endommagé, le PCNA ubiquitinylé va favoriser la

fixation de Rev1 au niveau de la fourche de réplication lors d’une lésion.

V.3.8- L’ADN polymérase lambda ()).

Le gène POLL a été identifié en 2000 chez l’homme (Garcia-Diaz et al, 2000), ce gène

code pour une protéine de 68 kDa. L’ADN polymérase ) est une protéine monomérique qui

possède un domaine BRCT ainsi qu’un domaine dRP lyase (Garcia-Diaz et al, 2001). Cette

protéine possède aussi une activité terminale tranférase indépendante de matrice (Garcia-Diaz

et al, 2000). L’ADN polymérase ) est formée d’un core similaire à celui de l’ADN

polymérase ", il contient deux domaines, un domaine de polymérisation de 31 kDa et un

domaine dRP lyase de 8 kDa (Garcia-Diaz et al, 2004).

En plus de similarité de séquence (33% d’identité en acide aminé), les propriétés de

l’ADN polymérase ) sont en partie similaires à celle de l’ADN polymérase ", et suggèrent un

37

rôle dans la réparation de l’ADN (Garcia-Diaz et al, 2002). Contrairement à l’ADN

polymérase ", l’ADN polymérase ) possède le domaine BRCT qui est nécessaire pour

l’interaction stable des facteurs impliqués dans la NHEJ (Non Homologuous End Joining).

L’ADN polymérase ) est processive sur de petits trous possédant des extrémités 5’ phosphate

et distributive sur de grands trous. L’ADN polymérase ) catalyse la synthèse d’ADN

généralement de manière dépendante d’une matrice et elle ne possède pas d’activité

proofreading associée (Garcia-Diaz et al, 2002).

V.3.9- L’ADN polymérase eta (*).

L’ADN polymérase eta est codée par le gène POLH ou XPV, ce qui correspond à une

protéine de 78 kDa. Ce gène a été identifié d’après des homologies de séquence avec le gène

POL4 de levure. Cette protéine possède un domaine catalytique au niveau de l’extrémité N-

terminale (Kannouche et al, 2001). Un motif de fixation à l’ubiquitine en doigt de zinc (UBZ)

est localisé prêt de l’extrémité C-terminale et permet l’interaction avec le PCNA mono-

ubiquitinylé (Bienko et al, 2005). Deux domaines d’interaction avec la protéine Rev1 ont été

identifiés au niveau des a.a. 509 à 557 et 369 à 491 (Tissier et al, 2004, Ohashi et al, 2004).

De plus, une séquence consensus d’interaction avec le PCNA appelée PIP box (PCNA-

interacting protein) est localisée à l’extrémité C-terminale de l’ADN polymérase * (Haracska

et al, 2001). Un second domaine PIP a été récemment identifié en amont des domaines UBZ

(Acharya et al, 2006) et est nécessaire pour la fonction de l’ADN polymérase * lors du

processus TLS (TransLesion Synthesis).

Le transcript du gène POLH est trouvé dans tous les tissus toutefois il est faiblement

ou pas détectable dans des lymphocytes, dans la rate fœtale et dans les muscles adultes

(Thakur et al, 2001). Aucune induction de transcript de POLH n’est observée chez les

mammifères en réponse à l’exposition aux UV toutefois le promoteur de POLH est régulé par

p53 (Liu et Chen, 2006), un régulateur du cycle cellulaire.

Il a été montré que l’ADN polymérase * est capable de réaliser une synthèse à travers

une lésion CPD (Cyclobutane Pyrimidine Dimers) très rapidement et très efficacement

(Prakash et al, 2005).

V.3.10- L’ADN polymérase iota (+).

Le gène POLI (aussi nommé RAD30) code pour l’ADN polymérase +, paralogue de

l’ADN polymérase *, la protéine codée possède une masse de 80 kDa (McDonald et al,

38

1999). Cette ADN polymérase possède un site actif possédant une activité enzymatique

unique ainsi qu’un motif PIP box qui se trouve en aval de ce domaine catalytique (Vidal et al,

2004). Deux domaines UBM sont retrouvés proches de l’extrémité C-terminale et sont

nécessaires pour l’interaction de l’ADN polymérase + avec le PCNA mono-ubiquinilé (Bienko

et al, 2005).

La caractérisation de la fonction de l’ADN polymérase + a d’abord été réalisée in vitro

et a permis de déterminer l’implication de cette protéine dans le TLS, en effet il a été montré

qu’elle catalysait fortement le TLS « error-prone » (laisse des erreurs) au niveau de matrice

endommagée ou non en incorporant des dGMP en face de thymine 3 à 10 fois plus

fréquemment que du dAMP (Tissier et al, 2000). Il a été montré que le PCNA augmentait la

processivité de l’ADN polymérase + (Vidal et al, 2004). D’autre part l’ADN polymérase + co-

localise avec la machinerie de réplication de l’ADN en réponse à une irradiation aux UV in

vivo (Kannouche et al, 2002). Ainsi cette enzyme est impliquée dans la synthèse bypass mais

est surtout spécifique lors de lésion de type 8-oxoG (Zhang et al, 2001).

V.3.11- L’ADN polymérase kappa (,).

Le gène POLK code pour l’ADN polymérase ,, une protéine de 99 kDa. La région N-

terminale de la protéine est indispensable pour l’activité de l’ADN polymérase , (Uljon et al,

2004). L’extrémité C-terminale contient une séquence signal d’adressage au noyau (Gerlach

et al, 1999) ainsi qu’une séquence conservée PIP box qui permet la fixation du PCNA

(Haracska et al, 2002). La région entre les a.a. 560 et 615 correspond à une séquence

d’interaction avec Rev1 (Ohashi et al, 2004) et deux domaines UBZs sont constatés au niveau

de la partie C-terminale de la protéine (Guo et al, 2009).

La délétion du gène POLK dans des cellules de souris entraîne une sensibilité au

BPDE : 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase (Ogi et al, 2002) ; il s’agit d’un agent

réagissant généralement avec l’amine en position 2 de la guanine. Cela suggère la nécessité

spécifique de l’ADN polymérase , pour synthétiser au-delà de cette lésion planaire

polycyclique sur l’ADN. La sur-expression de l’ADN Polymérase , peut aussi conduire à des

effets délétères (Bavoux et al, 2005), ainsi les cellules de souris sur-exprimant l’ADN

polymérase , augmentent 10 fois le taux de mutagénèse (Ogi et al, 1999). De façon similaire

aux UBZ de l’ADN polymérase * et des UBMs de l’ADN polymérase +, les domaines UBZs

dans l’ADN polymérase , sont critiques pour l’accumulation de la protéine ADN

polymérase , au niveau du foci réplicatif quand les cellules souffrent de dommage d’ADN.

39

V.3.12- L’ADN polymérase mu (-).

Le gène POLM code pour une protéine de 55 kDa (Aoufouchi et al, 2000), cette ADN

polymérase est une enzyme monomérique possédant un domaine BRCT. L’ADN polymérase

- possède plusieurs boucles flexibles. L’une d’elles se trouve dans le domaine C-terminal et

est composée des résidus 465 à 471. Cette boucle est plus petite que celle présente dans

l’ADN polymérase )7 et responsable de la stabilisation du nucléotide hors de l’hélice, qui

apparaît lors des décalages de cadre de lecture de cette enzyme. Elle possède par ailleurs des

activités terminal transférase dépendante et indépendante d’une matrice (Dominguez et al,

2000).

Cette protéine serait impliquée dans la réparation de l’ADN via le NHEJ et serait

capable de réaligner des brins d’ADN (Ruiz et al, 2004).

V.3.13- L’ADN polymérase theta.(/).

Après la découverte d’un huitième gène mus308 codant pour une ADN polymérase

chez Drosophila melanogaster (Harris et al, 1996), l’homologue humain fut recherché et le

gène fut nommé POLQ (Sharief et al, 1999). Ce gène code pour l’ADN polymérase /, il s’agit

d’une protéine d’environ 300 kDa (Prasad et al, 2009). L’ADN polymérase / possède une

organisation caractéristique en trois domaines ; un domaine hélicase-like au niveau N-

terminal de la protéine, un domaine central moins conservé et enfin un domaine C-terminal

caractéristique des ADN polymérases (Seki et al, 2003).

Chez la drosophile, elle joue un rôle dans une voie de réparation de l’ADN ou de

tolérance des lésions. En effet des mutants de mus308 sont sensibles aux agents de pontage de

l’ADN (Harris et al, 1996). Il a été montré que cette protéine possède un domaine 5’-dRP

lyase. Elle a été caractérisée de part ses propriétés biochimiques et sa sensibilité à des

inhibiteurs (Seki et al, 2003). Il a aussi été montré que l’ADN polymérase / est capable de

réaliser la synthèse de l’ADN et de passer outre un site abasique mais elle possède une faible

fidélité (Seki et al, 2004).

V.3.14- Terminal deoxynucléotide transférase.

Cette ADN polymérase est codée par le gène NDTT, découverte chez l’homme en

1974 (Bollum et al, 1974), le produit d’expression de ce gène a une taille de 58 kDa. Comme

les ADN polymérases ) et -, l’ADN polymérase TdT possède un domaine N-terminal BRCT.

40

Cette ADN polymérase est unique car il s’agit d’une ADN polymérase indépendante

d’une matrice (Gilfillan et al, 1993), elle est capable de générer des allongements aléatoires au

niveau du gène de l’immunoglobuline. La TdT est capable d’interagir avec le PCNA et TdIF1

(Yamashita et al, 2001) ainsi que TdIF2 (Fujita et al, 2003). TdIF1 régule l’activité de la TdT

positivement, contrairement au PCNA. L’interaction de TdIF2 et TdT va entrainer la

libération des histones au niveau de l’ADN.

V.4- Les ADN polymérases de S.cerevisiae.

V.4.1- L’ADN polymérase alpha.

Comme chez l’homme, l’ADN polymérase ! de levure est hétéro-tétramérique

(Burgers, 1998), elle est composée de quatre sous unités codées par les gènes POL1 (qui code

pour une protéine de 167 kDa), POL12 (qui code pour une protéine de 79 kDa), PRI1 (qui

code pour une protéine de 48 kDa) et PRI2 (qui code pour une protéine de 62 kDa). L’ADN

polymérase alpha est responsable de la synthèse d’environ 100 000 fragments d’Okazaki en

une seule phase S (Burgers, 2009). Les propriétés de l’ADN polymérase ! de levure sont très

proches de celle des animaux mise en évidence par Bollum et Potter.

V.4.2- L’ADN polymérase "-like.

La recherche chez la levure d’un gène codant pour une protéine se rapprochant de

l’ADN polymérase " humaine a conduit à l’identification du gène POL4 (Prasad et al, 1993).

Cette protéine possède de très fortes homologies de séquence avec l’ADN polymérase )

humaine et comme la protéine humaine, elle possède un domaine BRCT. Grâce à ce domaine

l’ADN polymérase 4 interagit avec l’ADN ligase 4 (Tseng et Tomkinson, 2002). Cette

interaction stimule la synthèse d’ADN par l’ADN polymérase 4 qui peut combler les petits

espaces formés par l’alignement d’un duplex linéaire de molécules d’ADN avec des

extrémités complémentaires partielles (Wilson et Lieber, 1999). Une étude des propriétés

biochimiques de cette enzyme a mis en évidence des propriétés particulières par exemple une

faible processivité comparée aux ADN polymérases !, $ et %.(Bebenek et al, 2005). Les

propriétés biochimiques ressemblent à celle de l’ADN polymérase ) humaine, néanmoins

d’autres paramètres tels que le taux d’erreur ne correspondent pas à cette ADN polymérase )

humaine. L’absence de l’ADN polymérase 4 ne rend pas la levure hypersensible aux agents

alkylants monofonctionnels comme le méthylmethane sulfonate (McInnis et al, 2002) et ces

levures sont capables de réparer des cassures double brin de l’ADN (Wilson et Lieber, 1999).

41

Cette protéine est donc une ADN polymérase qui est non essentielle mais qui serait impliquée

dans des processus de type NHEJ.

V.4.3- L’ADN polymérase gamma.

L’ADN polymérase # est codée par le gène MIP1 (Foury et Vanderstraeten, 1992),

alors que chez l’homme l’ADN polymérase # est dimérique, chez la levure S.cerevisiae,

l’ADN polymérase est composée d’une seule sous unité, la sous unité catalytique de 147 kDa.

Aucun gène codant pour l’homologue de la sous unité B de l’ADN polymérase # humaine n’a

été trouvé chez la levure (Lucas et al, 2004). De plus, une caractérisation biochimique de

l’ADN polymérase # a mis en évidence l’absence de sous unité B associée à la sous unité

catalytique.

V.4.4- L’ADN polymérase delta.

Alors que l’ADN polymérase delta est tétramérique chez l’homme, la levure

S.cerevisiae ne possède que 3 sous unités codées par les gènes POL3, POL31 et POL32

codant pour des protéines d’une masse respectivement de 125, 55 et 40 kDa (Gerik et al,

1998).

V.4.5- L’ADN polymérase epsilon.

Des expériences ont montré que le domaine catalytique de l’ADN polymérase % n’est

pas indispensable à la croissance de la levure S.cerevisiae (Kesti et al, 1999). Les gènes

POL2, DPB2, DPB3 et DPB4 codent respectivement pour des sous unités de 256, 78, 23 et 22

kDa.

V.4.6- L’ADN polymérase zeta.

Les gènes REV3 et REV7 codent pour deux sous unités qui composent l’ADN

polymérase (, chez la levure, ces sous unités sont respectivement de 173 kDa et 29 kDa. Ainsi

la protéine Rev3 de levure est deux fois plus petite que celle humaine. Des homologies de

séquence entre Rev3 de levure et humaine sont observées du coté C-terminal de la polymérase

humaine. La fonction de la partie N-terminale de la protéine humaine n’est pas connue.

42

La majorité des informations biochimiques de la littérature sur l’ADN polymérase (

provient d’études utilisant comme organisme modèle la levure S.cerevisiae (Lawrence et

Maher, 2001). La découverte des gènes REV3 et REV7 provient d’études par mutagénèse aux

UV et de recherche de phénotype non révertant (Lawrence et al, 1984, Lawrence et al, 1985).

Il a été montré chez cet organisme que Rev3 ne possède pas d’activité 3’35’ exonucléase et

qu’elle réalise une réplication de faible fidélité (McCulloch et Kunkel, 2008). L’ADN

polymérase zeta n’est pas essentielle pour la viabilité ou pour la réplication de l’ADN dans la

levure S.cerevisiae, bien que REV3 soit bénéfique pour la survie quand les cellules sont

exposées à des dommages de l’ADN. En effet, la délétion de REV3 entraîne une légère

augmentation de la sensibilité aux UV et aux agents pouvant endommager l’ADN (Morrison

et al, 1989, Pavlov et al, 2001).

V.4.7- L’ADN polymérase Rev1.

La protéine codée par le gène REV1 est une protéine de 112 kDa. Elle possèderait

aussi une activité dCMP transférase qui peut fonctionner lors de la synthèse à travers une

lésion (Gibbs et al, 2005, Nelson et al, 1996), toutefois cette activité n’est pas essentielle pour

l’activité de tolérance de dommage de l’ADN (Otsuka et al, 2005). Rev1 jouerait un rôle

important comme protéine de structure qui s’associerait avec plusieurs ADN polymérases

capable de synthétiser à travers une lésion. En effet il a été montré par co-

immunoprécipitation que Rev1 est capable d’interagir avec l’ADN polymérase (.(Hirano et

Sugimoto, 2006, Acharya et al, 2006) et que cette association améliorerait l’efficacité de

l’extension d’une matrice présentant des mauvais appariements ainsi qu’au niveau de site

abasique (Acharya et al, 2006).

V.4.8- L’ADN polymérase eta.

Le gène RAD30 fut découvert en 1997, il code pour l’ADN polymérase * chez la

levure S.cerevisiae (McDonald et al, 1997), cette protéine est monomérique d’une masse de

72 kDa. Des analyses de séquences mettent en évidence le remplacement d’une cystéine très

conservée chez les mammifères par une tyrosine chez S.cerevisiae au niveau des domaines

UBZ, de plus aucune fixation n’a été observée entre des fragments contenant les domaines

UBZ putatifs et des motifs PIP, ou bien la protéine entière Polymérase * et l’ubiquitine ou des

chaines d’ubiquitines (Parker et al, 2007). L’absence d’association avec l’ubiquitine et le

43

AD

N p

oly

méra

se

gène h

um

ain

Taill

e (

kD

a)

gène d

e levure

Taill

e (

kD

a)

fam

illes

localis

ation

rôle

PO

LA

166

PO

L1

167

PO

LA

268

PO

L12

79

PR

IM1

48

PR

I148

PR

IM2

58

PR

I262

Beta

PO

LB

39

PO

L4

68

Xnoyau

répara

tion

PO

LG

1140

MIP

1144

PO

LG

255

--

PO

LD

1124

PO

L3

125

PO

LD

251

PO

L31

55

PO

LD

366

PO

L32

40

PO

LD

412

--

PO

LE

1261

PO

L2

256

PO

LE

259

DP

B2

78

PO

LE

317

DP

B3

23

PO

L34

12

DP

B4

22

RE

V3

353

RE

V3

173

RE

V7

24

RE

V7

29

rev1

RE

V1

138

RE

V1

112

Ynoyau e

t

mitochondrie

réplic

ation tra

nslé

sio

nnelle

lam

bda

PO

LL

68

--

Xré

para

tion d

e l'A

DN

eta

PO

LH

78

RA

D30

72

Ynoyau

réplic

ation tra

nslé

sio

nnelle

iota

PO

LI

80

--

Ynoyau

réplic

ation tra

nslé

sio

nnelle

AD

N p

oly

méra

se "

err

or-

pro

ne"

kappa

PO

LK

99

--

Ynoyau

réplic

ation tra

nslé

sio

nnelle

mu

PO

LM

55

--

Xnoyau

répara

tion d

e l'A

DN

theta

PO

LQ

300

--

Anoyau

pro

bable

ment la

répara

tion

phi

--

PO

L5

116

Bnoyau

synth

èse d

es A

RN

r

TdT

DN

TT

58

--

Xnoyau

ajo

ute

un d

NT

P à

l'e

xtr

ém

ité

d'u

n A

DN

initia

teur

Alp

ha

Bnoyau

initia

tion d

e la r

éplic

ation :

Synth

èse d

es a

morc

es A

RN

s

et fr

agm

ents

d'O

kazaki

gam

ma

réplic

ation e

t ré

para

tion d

e

l'AD

N m

itochondrial

mitochondrie

A

delta

Bnoyau

réplic

ation d

e l'A

DN

epsilo

nB

noyau

réplic

ation d

e l'A

DN

zeta

Bré

plic

ation tra

nslé

sio

nnelle

noyau e

t

mitochondrie

Tab

leau

2 :

T

ab

leau

réc

ap

itu

lati

f d

es A

DN

poly

mér

ase

s p

rése

nte

s ch

ez l

'hom

me

et l

a l

evu

re S.cerevisiae, le

gèn

e q

ui

les

cod

e,

la t

ail

le d

es s

ou

s u

nit

és, le

ur

fam

ille

d'A

DN

poly

mér

ase

, le

ur

loca

lisa

tion

, et

leu

r rô

le d

an

s la

cel

lule

.

PCNA n’est pas essentielle pour le recrutement de l’ADN polymérase * pour passer outre un

dommage in vivo.

Cette ADN polymérase semble jouer le même rôle que l’ADN polymérase * humaine.

V.4.9- L’ADN polymérase phi (!).

Cette ADN polymérase est codée par le gène POL5, et possède une masse de 116 kDa.

Ce gène fut identifié grâce à des mutants létaux conditionnels. L’inactivation de cette ADN

polymérase ne modifierait pas la réplication des chromosomes de levure S.cerevisiae mutante

(Shimizu et al, 2002). Des études de co-localisation ont mis en évidence la co-localisation de

Pol5 avec Nop1p (nucleolar protein 1) au niveau du nucléole, lieu de synthèse des

ribonucléoprotéines et lieu de maturation des pre-tRNA (Pederson, 1998). Nop1 est un

composant du petit complexe nucléolaire de ribonucléoprotéine C+D (Schimmang et al,

1989). Il a été supposé que Pol5 serait impliquée dans la régulation de la synthèse des ARN

ribosomiques dans le nucléole (Shimizu et al, 2002).

V.4.10- L’ADN polymérase sigma (0).

Il est accepté depuis peu que les gènes TRF4 et TRF5 codent pour une poly (A)

polymérase dans la levure comme l’avait prédit leur séquence primaire (Aravind et Koonin,

1999, Saitoh et al, 2002, Haracska et al, 2005) pourtant elle fut initialement identifiée

biochimiquement comme une ADN polymérase (Wang et al, 2002). Ces poly (A)

polymérases permettent la polyadénylation d’ARN de tranfert (Kadaba et al, 2004) mais aussi

d’ARN ribosomique (Haracska et al, 2005, Houseley et Tollervey, 2006)

Nous pouvons constater que peu de différences sont observées entre les ADN

polymérases animales et de levures (tableau 2). Des similitudes structurales et de rôles sont

observées entre ces ADN polymérases.

V.5- Les Familles de polymérases.

Les ADN polymérases sont des enzymes qui possèdent des similarités au niveau de

leurs séquences protéiques ainsi qu’au niveau de leurs structures. Les ADN polymérases

adoptent une conformation tridimensionnelle qui ressemble à une main droite humaine. Elles

sont composées de trois domaines distincts : la paume, le pouce et les doigts (figure 14). Six

44

Figure 14 : Représentation en rubans de l'ADN polymérase du bactériophage RB69, le domaine

N-terminal (résidus 1-108 et 340-382) est représenté en jaune, le domaine exonucléase

(résidus 109-339) en rouge, la paume (383-468 et 573-729) est en magenta, les doigts (résidues 469-572)

sont en bleu, et le pouce (730-903) est en vert.

Franklin et al. (2001) Cell. 105 : 657-667.

Paume

Pouce

Extrémité C-terminal

Domaine

Exonucléase

Site active du

domaine Exonucléase

Site actif de

l'ADN polyméraseDoigts

Domaine

C-terminal

Molécule d'ADN

régions hautement conservées, nommée I-VI, ont été identifiées au sein des ADN

polymérases. La région I, localisée dans la paume, contient deux acides aspartiques très

conservés nécessaires à l’activité catalytique. La région II, au niveau de la paume, et la région

III, au niveau des doigts, sont importantes pour la fixation d’un dNTP. La région IV est située

au niveau N-terminal et s’étend jusqu’au domaine correspondant au site actif 3’"5’

exonucléase. Les deux autres régions, V et VI, sont localisées respectivement au niveau du

pouce et des doigts.

Les ADN polymérases peuvent être classées en six groupes principaux basés sur des

critères phylogénétiques avec l’ADN polymérase I d’E.coli (famille A), de l’ADN

polymérase II d’E.coli (famille B), de l’ADN Polymérase III d’E.coli (famille C), de l’ADN

polymérase II des euryarchaeota (famille D), l’ADN polymérase " humaine (famille X) et

UmuC/DinB et RAD30 eucaryotique (famille Y). Il n’existe pas d’homologue eucaryotique

des familles C et D malgré des études approfondies par recherche d’homologie avec PSI-

BLAST (Burgers et al, 2001). Ainsi les ADN polymérases citées précédemment peuvent être

classées dans des familles de polymérases selon le tableau 2.

Toutes les protéines de la famille Y sont caractérisées par cinq séquences conservées

dans les 350 résidus au niveau de l’extrémité N-terminale mais la longueur de la protéine

ainsi que la séquence C-terminale diffèrent beaucoup.

Ainsi une multitude d’ADN polymérases sont nécessaires à la réplication et la

réparation de l’ADN nucléaire, et permettent de continuer la synthèse en cas de différentes

lésions ou encore de réparer l’ADN endommagé.

Au regard de la multitude d’ADN polymérases dans le noyau, il semble que la

situation soit différente dans la mitochondrie.

V.6- Les ADN polymérases mitochondriales.

Découverte durant le milieu des années 70, l’ADN polymérase # (Weissbach, 1979)

est considérée depuis longtemps comme la seule ADN polymérase présente dans la

mitochondrie chez les vertébrés. L’ADN polymérase # a été isolée à partir d’une multitude

d’organismes et présente quelques différences selon les espèces. L’enzyme a été purifiée sous

forme d’un homo-tétramère chez l’embryon de poussin (Yamaguchi et al, 1980), d’un hétéro-

dimère de 52 et 47 kDa chez Tetrahymena thermophila (Ostergaard et al, 1987), d’un hétéro-

dimère de 125 et 35 kDa chez Drosophila melanogaster (Wernette et Kaguni, 1986) ou d’un

monomère chez la levure S.cerevisiae (Lucas et al, 2004). L’ADN polymérase # peut donc

45

varier selon les espèces mais est-elle vraiment la seule ADN polymérase dans la mitochondrie

dans tous les règnes ? Les trypanosomatides sont des eucaryotes unicellulaires, ils possèdent

une mitochondrie unique le kinétoplaste qui possède son propre ADN comme toute autre

mitochondrie. L’ADN kinétoplastique est composé de deux types d’anneaux d’ADN, de 5000

à 10000 mini-cercles d’une taille inférieure à 2,5 kb, et de 20 à 50 maxicercles d’une taille de

20 à 40 kb selon les espèces (Simpson, 1987). En 1992, Torri et Englund ont mis en évidence

une activité ADN polymérase qui ne faisait pas partie de la famille A des ADN polymérases

chez Crithidia fasciculata (Torri et Englund, 1992). Cette protéine fut ensuite identifiée

comme étant une ADN polymérase " (Torri et Englund, 1995), alors que ces chercheurs

s’attendaient à trouver une ADN polymérase réplicative de type #. Une recherche active

d’ADN polymérase réplicative chez Trypanosoma brucei a conduit à la découverte en 2002

de quatre gènes codant pour des ADN polymérases de la famille A, les protéines codées par

ces gènes se localisent dans la mitochondrie du parasite (Klingbeil et al, 2002). Un peu plus

tard ces mêmes chercheurs ont déterminé l’existence de deux gènes différents codant pour 2

ADN polymérases " différentes qui se localisent dans le kinétoplaste (Saxowsky et al, 2003).

Ainsi dans les trypanosomatides, plusieurs ADN polymérases de classes différentes ont été

identifiées dans la mitochondrie (quatre ADN polymérases de type semblable à l’ADN

polymérase I d’E.coli donc très proches de l’ADN polymérase # eucaryote et deux ADN

polymérases "). Les ADN polymérases beta seraient impliquées dans la maintenance de

l’ADN kinétoplastique et dans le remplissage des trous entre les fragments d’Okazaki

synthétisés par les ADN polymérase I-like (Saxowsky et al, 2003). Une question peut se

poser : est-ce une exception ? Existe-t-il d’autres eucaryotes possédant plusieurs ADN

polymérases dans la mitochondrie ?

En ce qui concerne la levure S.cerevisiae, en 1997, le laboratoire où je réalise ma thèse

a réussi à mettre en évidence une seconde activité ADN polymérase mitochondriale à partir de

mitochondries purifiées (Lucas et al, 1997). Cette activité posséde des propriétés

biochimiques différentes de celle de l’ADN polymérase gamma. Cette activité est observable

lors de tests d’activité enzymatique en présence d’une concentration de magnésium de 10 mM

et non observable en présence de 50 mM (concentration des tests d’activités pour observer

l’ADN polymérase gamma). Toutefois après de multiples colonnes chromatographiques, le

laboratoire n’a pas été capable d’identifier cette activité ADN polymérase. Il reste ainsi à

déterminer l’identité de cette seconde ADN polymérase qui possède une localisation

mitochondriale, ce sera l’objet de la première partie de ma thèse.

L’un des problèmes pouvant être rencontrés lors de l’étude des ADN polymérases est

la faible représentation de ces protéines au sein du protéome de la cellule. De plus, il est

46

important de savoir que les ADN polymérases mitochondriales ne représentent qu’une

fraction infime des ADN polymérases totales d’une cellule. En effet, l’ADN polymérase

gamma ne représente que 1 à 5 % des ADN polymérases cellulaires, ainsi celle ci n’a pu être

identifiée par spectrométrie de masse à partir d’extrait de mitochondrie de cellule du cœur

chez l’homme (Taylor et al, 2003). Ces paramètres rendent les études des ADN polymérases

mitochondriales compliquées.

En 2006, des études génétiques, complétées par de la microscopie à fluorescence ont

permis de constater que l’ADN polymérase ( et Rev1 sont localisées au niveau de la

mitochondrie de levure S.cerevisiae (Zhang et al, 2006). Ces enzymes sont nécessaires à la

réplication à travers les lésions de l’ADN (voir paragraphe V.3.6 et V.3.7). Si l’on observe

attentivement les clichés réalisés en épifluorescence, nous pouvons constater que les

fragments des 100 premiers acides aminés de Rev1, Rev3 et Rev7 fusionnés à une GFP sont

tous co-localisés uniquement au niveau de la mitochondrie. La protéine Rev1 et l’ADN

polymérase zeta sont pourtant impliquées dans la synthèse au-delà des sites abasiques dans le

noyau (Northam et al, 2010). De plus, la localisation mitochondriale n’est obtenue qu’avec les

100 premiers acides aminés, rien ne dit que la protéine entière peut aller dans la mitochondrie.

Ainsi, jusqu’à présent l’ADN polymérase gamma est la seule ADN polymérase

mitochondriale chez l’homme et il en existerait deux ou trois chez la levure S.cerevisiae.

Cette différence pourrait s’expliquer par un système de réplication différent.

Le dernier point que j’aimerai aborder est de savoir comment les protéines codées par

le génome nucléaire sont importées dans la mitochondrie en effet elles sont traduites dans le

cytoplasme des cellules. Quels sont les systèmes d’import mitochondriaux.

VI- L’ADRESSAGE MITOCHONDRIAL.

Le protéome mitochondrial a été estimé à approximativement 1500 protéines

différentes, certaines existant sous plusieurs isoformes dues aux modifications post-

traductionnelles. La majorité des protéines mitochondriales (environ 98%) sont codées par le

génome nucléaire (seules 13 protéines sont codées par le génome mitochondrial chez

l’homme) et par conséquent, elles sont produites au niveau du cytoplasme et ensuite

acheminées vers la mitochondrie. Il existe différentes voies pour permettre à une protéine de

47

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Met

GlyTrp

Trp

Ile

Gly

Arg

Ser

Arg

Lys CysHis

Arg

Met

Trp

Lys

Ala

Met

Acide Aminé :

Non polaire

Polaire, non chargé

Acide

Basique

Face polaire, et hydrophile

Face non-polaire

Figure 15 : Représentation en hélice alpha des 18 premiers acides aminés de la protéine

Pyruvate déshydrogénase Kinase

http://cti.itc.virginia.edu/~cmg/Demo/wheel/wheelApp.html

Figure 16 : Voies de translocation des protéines dans la mitochondrie via les complexes TIM-TOM

D'après Mokranjac D, Neupert W. (2005) Biochem Soc Trans. 33 : 1019-23.

+ ++

SHSH

SH SH

Complexe

TOM

Complexe

TIM23

Complexe

TIM22

Complexe

OXA

Voie Mia

système de relai

disulfide

complexe

TOB/SAM70

20

5 6407

22Tob

38

Mas

37

Tob 55

88 8

10

10

1010

10

999

999

13 1313

12

22 18

5450

21

1723

44141617

mtHSP70

Mge1

M.E.

espace

intermembranaire

M.I.

matrice

∆Ψ Oxa 1

Mia40

Erv1

traverser la membrane externe et interne mitochondriale, en fonction de leur localisation

finale (membrane interne, espace intermembranaire, matrice mitochondriale).

Les protéines sont adressées à la mitochondrie grâce à des séquences spécifiques MTS

(Mitochondrial Targeting Sequence). Il s’agit de séquence au niveau de l’extrémité

N-terminale de la protéine pouvant être clivées après translocation dans la mitochondrie par

une peptidase comme c’est le cas pour une adénylate kinase (Aky2p) et d’autres protéines

chez la levure (Bandlow et al, 1998). Cette séquence est composée de résidus positifs et

hydroxylés et au mieux sans acides aminés chargés négativement, cette séquence s’assemble

en hélice ! amphipatique (voir figure 15) (Schatz et Dobberstein, 1996).

Ce transport dans la mitochondrie est dépendant de nombreux paramètres. Il a été

montré que le transport est dépendant de la température, et du potentiel membranaire

(Neupert, 1997). L’ATP comme source d’énergie est également essentiel pour ce transport

(Eilers et al, 1987). Toutefois, comme dans tout système, il existe des exceptions, en effet la

sous unité Va de l’apocytochrome c est importée dans l’espace inter-membranaire

indépendamment de la présence de récepteur de surface (Stuart et al, 1990). Bcl2 est capable

d’être importée dans la mitochondrie en absence de potentiel membranaire ainsi qu’en

absence de composant membranaire sensible à des protéases (Nguyen et al, 1993), le transport

du translocateur des nucléotides adényliques AAC ne nécessite pas l’hydrolyse de l’ATP

(Adrian et al, 1986) et enfin le transport de la protéine MTF1 est quant à elle indépendant de

tous les paramètres cités précédemment (Biswas et Getz, 2004).

Pour 60% des protéines mitochondriales, l’import à travers la membrane externe est

réalisé par un complexe protéique appelé TOM, tandis que l’import à travers la membrane

interne est réalisé par un complexe appelé TIM.

Le système TOM est composé de neuf sous unités exposées du coté cytosolique,

présentant des domaines hydrophiles (figure 16). Tom 20, Tom 70 et Tom 71 sont ancrées au

niveau N-terminal et possède un domaine C-terminal hydrophile de 17 kDa et 65 kDa

respectivement. En effet Tom 70 et Tom 71 sont très proches d’un point de vue structural. La

protéine Tom 22 se trouve dans ce complexe, cette protéine possède environ 85 acides aminés

en N-terminal dans le cytosol, mais elle possède aussi un segment transmembranaire et enfin

un petit domaine C-terminal faisant face au coté inter-membranaire. Des composants du

système Tom apparaissent intégrés dans la membrane externe, c’est le cas de Tom40 bien

qu’il ne possède que peu de domaine hydrophobe proche. Sa forte résistance aux protéases

laisse penser que cette protéine est structurée en tonneau " comme les porines

mitochondriales et bactériennes. De petites protéines comme Tom6 (ainsi que Tom7 et Tom5)

48

sont elles aussi intégrées dans la membrane et sembleraient interagir avec Tom40 pour le

réguler (Poynor et al, 2008).

Le système TIM est composé de 15 sous unités, les protéines transmembranaires ou

translocases diffèrent selon les substrats à transporter. Les protéines importées via une

préséquence passent par un complexe nommé TIM23, le « core » du complexe est composé

des protéines Tim23, Tim17 et Tim50 (figure 16). Toutes ces protéines sont intégrées dans la

membrane et possède la fonction de former et de réguler le canal d’import des précurseurs

protéiques. Lors du transport via une translocase de protéine portant des préséquences, Tim21

constitue la quatrième protéine intégrée dans la membrane. Elle serait capable d’interagir avec

Tom22 dans l’espace intermembranaire via des interactions ioniques. Cette protéine joue un

rôle important dans le passage des préséquences de Tom22 au complexe TIM (Wagner et al,

2009). Si le substrat est un transporteur de la membrane interne, l’import passera par le

complexe TIM22, le complexe est divisé en 2 parties, la première est intégrée dans la

membrane et est composé des protéines Tim54, Tim22 et Tim18 et la seconde est composée

de protéines en périphérie de la membrane exposée à l’espace inter-membranaire et est

composée de Tim12, Tim10 et Tim9. Les protéines Tim8 et Tim13 sont des protéines

impliquées dans l’import de la protéine Tim23.

Le processus d’import à travers TIM-TOM est le suivant ; Bien que l’import de

certaines pré-protéines à travers la membrane externe ne nécessite pas la présence de

composants dégradables par des protéases (Apocytochrome c), de nombreuses autres pré-

protéines nécessitent la présence de récepteurs à la surface de la mitochondrie. Dans la

majorité des cas, en particulier pour les protéines possédant des séquences d’adressage à la

matrice ainsi que pour des protéines de la membrane externe la reconnaissance est réalisée par

le complexe Tom20-Tom22, de plus ce complexe joue un rôle dans la reconnaissance des pré-

protéines par un second complexe Tom70-Tom71-Tom37. Une fois que les récepteurs ont

fixé la pré-séquence, le précurseur va être guidé jusqu’au canal Tom40. A la sortie du canal

du coté de l’espace inter-membranaire, la partie C-terminale de Tom22 va fixer la pré-

séquence qui émerge de Tom40. La protéine Tim21 va alors connecter le système TOM au

complexe TIM23 grâce à ces interactions avec Tom22. L’interaction de la pré-séquence avec

Tim23 va entraîner l’ouverture du canal, et une fois la pré-séquence entrée dans la matrice

mitochondriale, le complexe TIM23 peut s’associer avec le complexe PAM, ce qui va

entraîner la translocation du précurseur dans la matrice. Le composant central de PAM est la

protéine essentielle Hsp70, une chaperonne dépendante de l’ATP qui se fixe sur les chaînes

polypeptidiques non repliées. Le cycle ATPase est fortement régulé au sein du complexe par

Pam18, Mge1, Pam16 et Tim44 et Pam17.

49

En ce qui concerne l’import de transporteur de la membrane interne mitochondriale,

ces derniers interagissent avec le récepteur Tom70 et grâce à l’hydrolyse de l’ATP, le

précurseur est transporté à travers la membrane externe grâce à Tom70 et Tom40. A la sortie

du système TOM, le transporteur est pris en charge par Tim9 et Tim10 dans l’espace inter-

membranaire, le transport à travers la membrane interne est dépendant du 89' L’insertion du

transporteur dans la membrane interne va ensuite être réalisée par le complexe TIM22 et

grâce à une séquence signal d’internalisation.

D’autres complexes protéiques sont impliqués dans la translocation de protéines dans

la mitochondrie tels que le complexe Oxa1, le complexe TOB/SAM pour l’insertion des

protéines membranaires et le complexe disulfide (figure 16) pour l’import des protéines

possédant des ponts disulfures toutefois je n’aborderai pas cet aspect de l’import des protéines

mitochondriales.

VII- L’INTERET DU MODELE LEVURE.

La levure S.cerevisiae est un organisme modèle car c’est d’une part une cellule

caractérisée par un temps de génération très rapide (proche de 2 h), facilement cultivable dans

différentes conditions avec un coût peu élevé. D’un point de vu génétique, le génome de la

levure est un des premiers génomes eucaryotes entièrement séquencé, et ses propriétés ont

permis la sélection, le screening et l’identification de nombreux mutants obtenus par

recombinaison homologue. De plus, la capacité de S.cerevisiae de croitre sous forme haploïde

facilite l’obtention de son mutant de délétion. En dépit de sa simplicité, la levure est similaire

aux cellules eucaryotes complexes, et s’avère être un excellent modèle pour comprendre la

biologie d’organismes eucaryotiques plus complexes.

La levure est un modèle d’étude très approprié pour l’étude des maladies

mitochondriales en effet, en 1996 lorsque 70% du génome de S.cerevisiae fut publié, on

pouvait noter que 30 à 40% des gènes associés à des maladies humaines présentent de fortes

identités de séquence avec des gènes de la levure (Basset et al, 1996). Ainsi, de nombreux

gènes humains ont été montrés comme étant capables de complémenter des séquences du

génome de levure. L’un des avantages indéniable de la levure est la possibilité de réaliser des

études moléculaires, en effet le développement des banques de délétion, des banques de

protéines étiquetées avec une GFP ou une autre étiquette ont permis de réaliser des études

globales. En ce qui concerne les tests pharmacologiques, la levure a été beaucoup utilisée

pour tester la toxicité de certains médicaments (Yang et Pon, 2003), pour détecter des

50

carcinogènes, pour l’identification de nouveaux médicaments ou la détermination des gènes

modifiés par la présence d’un médicament ou d’un composé chimique. La levure est un

modèle d’étude de choix ; en effet ces maladies mitochondriales sont souvent dues à une

production d’ATP déficiente, la principale fonction de la mitochondrie étant les oxydations

phosphorylantes. Toutefois d’autres pathologies contribuant à la production de ROS sont

responsables de dommages cellulaires. Le fonctionnement mitochondrial est lié à des

centaines de protéines codées à la fois par le génome nucléaire et mitochondrial, qui peuvent

être corrélées avec le nombre élevé (>100) de maladies mitochondriales connues. L’avantage

essentiel de la levure est de posséder un système fermentaire très efficace permettant la survie

de la levure en cas de disfonctionnement mitochondrial. Cette capacité permet d’appréhender

et d’analyser les processus entraînant les différentes maladies. L’identification de

l’homologue de levure de la frataxin (Yfh1p) a permis par exemple de déterminer la fonction

de cette protéine dans des phénomènes d’accumulation du fer, et de déficiences respiratoires.

Comme autre exemple, l’homologie de séquence d’OPA1 a permis de déterminer la structure

du gène OPA1 et d’identifier différentes mutations liées à des pathologies mitochondriales.

51

OBJECTIFS DE LA THESE.

Ma thèse va se dérouler selon deux parties, la première correspond à la continuité du

travail réalisé précédemment dans le laboratoire. Ainsi, en prenant la levure S.cerevisiae

comme modèle d’étude, des techniques chromatographiques et des analyses par spectrométrie

de masse ont été réalisées pour identifier la seconde activité ADN polymérase mitochondriale.

Dans un même temps, des évaluations d’éventuelles contaminations cytoplasmiques et

nucléaires ont été entreprises, tandis que la vérification de la localisation mitochondriale de

cette enzyme, réalisée grâce à de la microscopie à fluorescence, a été renforcée par des

résultats de MS/MS.

La découverte de cette seconde activité ADN polymérase pose des interrogations sur

le rôle de chacune des ADN polymérases dans la mitochondrie et des possibles interactions

mettant en jeu ces protéines. Ainsi la seconde partie de ma thèse correspond à une étude d’un

complexe putatif de réplication chez la levure S.cerevisiae. Pour cela deux axes d’étude ont

été envisagés, le premier correspond à la purification native du complexe de réplication pour

obtenir des informations sur la composition et les propriétés de ce complexe in vivo. La

seconde approche est l’étude des interactions entre différentes protéines susceptibles de faire

partie du complexe de réplication. Pour ces deux axes d’études, différentes approches

biochimiques ont été abordées pour obtenir des informations sur le complexe de réplication

mitochondrial de la levure S.cerevisiae.

52

CHAPITRE I :

Identification de la seconde activité

ADN polymérase mitochondriale

53

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

20 25 30 35 40 45

Fractions

acti

vit

é A

DN

poly

mer

ase

(cpm

x 1

0-3)

Figure 17 : activité ADN polymérase des fractions obtenues après gradient de sel de 0 à 0,5 M NaCl

sur la colonne SP 5 ml (GE Healthcare). Les tests sont réalisés en présence de 10 mM MgAc ( ) et

50 mM MgAc ( ). 9 séries de mesures d'activité sur des préparations différentes sont rassemblées pour

former les courbes suivantes.

CHAPITRE I :

Identification de la seconde activité

ADN polymérase mitochondriale

I- INTRODUCTION.

La seconde activité ADN polymérase décrite dans la mitochondrie de la levure

S.cerevisiae par Lucas et al, en 1997 fut mise en évidence après séparation des protéines sur

colonne chromatographique Sulfopropyl (SP). Ce deuxième pic d’activité ADN polymérase

est détecté lors de tests d’activité ADN polymérase réalisés en présence de 10 mM en

magnésium. L’ADN polymérase # a un optimum d’activité en présence de 50 mM MgAc et

dans ces conditions, un seul pic d’activité d’activité correspondant à cette enzyme est

décelable (figure 17). Des mesures de l’activité d’enzymes marqueurs tels que l’isocitrate

déshydrogénase ainsi que la Glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH : enzyme

cytoplasmique) furent réalisées à partir de mitochondries purifiées et de sphéroplastes

(levures dépourvues de membrane externe). Ces activités mettent en évidence la quasi-

absence de protéines cytoplasmiques dans les fractions de mitochondries purifiées. De plus,

l’observation des mitochondries par microscopie électronique et des tests d’activité

respiratoire mettent en évidence le bon état fonctionnel des mitochondries purifiées. Toutefois

pour affirmer qu’une seconde ADN polymérase était présente au niveau de la mitochondrie de

S.cerevisiae, de nombreux contrôles étaient nécessaires. En effet, suite à la découverte du

couple d’ADN polymérase #/" au niveau de la mitochondrie de Trypanosoma brucei, des

chercheurs ont tenté de retrouver le même couple d’ADN polymérases au niveau de la

mitochondrie de cœur de bœuf avec succés (Nielsen-Preiss et Low, 2000). Le rôle de l’ADN

polymérase " pouvait être de remplacer l’ADN polymérase # dans le système BER

mitochondrial en effet, l’efficacité de l’activité dRP lyase de l’ADN polymérase # est faible

(Longley et al, 1998). La découverte de l’ADN polymérase " dans les mitochondries de cœur

de bœuf (Nielsen-Preiss et Low, 2000) fut cependant contredite par un article mettant en

évidence la contamination des mitochondries utilisées par des microsomes (Hansen et al,

2006). De nombreuses expériences s’imposent donc pour vérifier la pureté des mitochondries,

évaluer et diminuer les contaminations cytoplasmiques si elles existent.

54

I.1- Tentatives de purification des mitochondries.

Dans le but de vérifier que les mitochondries préparées au laboratoire ne sont pas

contaminées par un autre compartiment (cytoplasme, microsomes…), trois techniques de

préparation ont été comparées pour répondre définitivement à la question.

Plusieurs méthodes existent pour se défaire des protéines contaminantes. La première

que nous avons testée nécessite l’utilisation de la protéinase K ; il s’agit d’une protéase à

sérine (l’acide aminé clé du site actif est une sérine), qui coupe la liaison peptidique des

protéines après des acides aminés aliphatiques, aromatiques ou hydrophobes. Cette enzyme a

été abondamment utilisée pour éliminer les protéines solubles cytoplasmiques ou nucléaires

co-purifiées avec les mitochondries. Cette technique est en particulier utilisée pour étudier

l’import des protéines mitochondriales (Akbari et al, 2008).

Ensuite, dans le but de supprimer les protéines collées sur la membrane externe

mitochondriale, nous avons utilisé une technique permettant d’obtenir des mitoplastes, c'est-à-

dire des mitochondries dépourvues de membrane externe. Contrairement aux expériences

réalisées précédemment par P. Lucas (mitoplastes obtenus par l’action de la digitonine), les

mitoplastes ont été isolés à l’aide d’une technique basée sur des différences d’osmolarité et

sur la différence de perméabilité des deux membranes de la mitochondrie. La membrane

interne est plus imperméable aux solutés (et au sucre) que la membrane externe qui contient

des porines. L’ajout d’une solution concentrée en sucre dans le milieu contenant les

mitochondries va entraîner le passage de molécules d’eau de la matrice mitochondriale à

l’espace inter-membranaire pour maintenir un équilibre au niveau de l’osmolarité. Cela aura

pour conséquence de contracter la membrane interne de la mitochondrie tandis que la

membrane externe reste identique. Les deux membranes possédant des points de jonctions, la

membrane externe va se rompre. De plus la matrice et la membrane interne étant contractées,

le passage des organelles ainsi traitées dans un cell disrupteur aura pour effet de retirer la

membrane externe associée sans endommager les mitoplastes. Enfin, la membrane externe et

les mitoplastes pourront être séparés par centrifugation (Camougrand et al, 1988). L’avantage

de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de mise au point comme c’est le cas pour la

solubilisation de la membrane externe par la digitonine, par ailleurs elle possède un meilleur

rendement protéique.

Enfin, la troisième technique correspond à celle qui fut utilisée en 2006 par Hansen et

al pour purifier les mitochondries de foie de rat. Cette technique est basée sur la séparation

des mitochondries sur un gradient continu de 15 à 35 % de Nycodenz. Les fractions

55

correspondant aux mitochondries intactes sont récupérées puis utilisées pour nos tests

d’identification. Toutes ces techniques permettant d’éviter les contaminations de protéines

cytoplasmiques doivent être néanmoins couplées à des mesures d’activités enzymatiques, des

tests ADN polymérasique dans notre cas mais aussi des tests d’enzymes marqueurs des

compartiments cellulaires.

Les activités enzymatiques permettent d’évaluer des contaminations de différents

compartiments dans un extrait cellulaire. Chaque compartiment cellulaire possède des

enzymes qui lui sont spécifiques et facilement mesurables, le cytoplasme contient l’activité

Glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49), et la mitochondrie par le biais de

l’activité cytochrome c oxydase (EC 1.9.3.1). Une analyse de la localisation subcellulaire de

protéine plus précise à l’intérieur d’un compartiment peut même être réalisée grâce à des

enzymes spécifiques de la membrane externe de la mitochondrie par exemple, l’activité

kynurénine hydroxylase (EC 1.99.1.5) chez la levure S.cerevisiae. Ces techniques de mesures

peuvent aussi être couplées à des western-blots de protéines marqueurs. De façon similaire

aux enzymes marqueurs, des protéines faisant partie de différents compartiments sont choisies

et analysées par des anticorps spécifiques en western-blot. Ainsi les contaminations peuvent

être évaluées par ces différentes techniques.

I.2- Technique permettant l’identification d’une protéine.

Différentes approches ont été développées qui permettent d’identifier une protéine

d’intérêt. Les résultats obtenus successivement par P. Lucas et J.P. Lasserre dans leurs essais

d’identification de la seconde activité ADN polymérase mitochondriale sont résumés dans les

paragraphes suivants.

I.2.1- Caractéristiques physicochimiques.

Dans le but d’identifier une protéine, un certain nombre de données peuvent être

obtenues grâce à l’étude des paramètres physico-chimiques d’une protéine. Un de ces

paramètres est la masse moléculaire (par extrapolation du rayon de Stokes). La masse

moléculaire d’une protéine peut être évaluée à l’aide de différentes méthodes telles que

l’électrophorèse sur gel d’acrylamide, la chromatographie par tamisage moléculaire ou encore

par centrifugation sur gradient de sucre.

Dans le but de déterminer la masse moléculaire de la seconde ADN polymérase

mitochondriale, différentes expériences ont été réalisées : filtration sur gel (Superose 12),

gradient de glycérol (15-35%), expérience de trapping avec un ADN. Ces trois techniques ont

56

été réalisées en présence de l’ADN polymérase mitochondriale éluée avec 0,25 M de NaCl sur

colonne SP 5 ml (GE Healthcare) et des formes discrètes allant de 350 kDa à 70 kDa ont été

observées. Ces expériences ne permettent pas de déterminer l’identité de la seconde ADN

polymérase mitochondriale en effet toutes les ADN polymérases de levures ont une taille

comprise entre 68 kDa (ADN polymérase "-like) et environ 350 kDa (ADN polymérase %

hétérotétramétique) voir tableau 2.

Dans le but de continuer la caractérisation de l’ADN polymérase, des études de

l’activité de cette enzyme furent entreprises.

I.2.2- Propriétés enzymatiques.

Les ADN polymérases ont été caractérisées par Kornberg comme étant des protéines

capables de réaliser la réaction de polymérisation de l’ADN à l’aide d’une matrice et de

désoxynucléosides triphosphates. Différentes ADN polymérases d’E.coli puis d’eucaryotes

furent différenciées grâce à leurs caractéristiques enzymatiques (spécificité du substrat,

vitesse de réaction, activité exonucléase…).

Des tests d’activités enzymatiques ont été réalisés en présence de la seconde activité

ADN polymérase mais n’ont toutefois pas permis de montrer une spécificité à un substrat, ou

une sensibilité à un inhibiteur (aphidicoline, NEM). Ces tests d’activité enzymatiques ne

permettent pas d’exclure une quelconque ADN polymérase de l’équation parmi les ADN

polymérases connues de S.cerevisiae.

A ce stade de l’étude, les propriétés physico-chimiques et enzymatiques obtenues lors

des différentes expériences ne permettaient pas de déterminer l’identité de la seconde activité

ADN polymérase mitochondriale. Une technique d’identification de la séquence des acides

aminés se trouvant au niveau de l’extrémité N-terminale de la protéine fut donc entreprise.

I.2.3- Séquençage N-terminal d’Edman.

Depuis sa présentation en 1967, la dégradation d’Edman automatisée (le séquençage

N-terminal d’Edman) a été l’une des méthodes les plus utilisées pour la détermination directe

de la structure primaire des protéines (Edman et Begg, 1967). Cette technique est maintenant

surpassée par des techniques plus simples d’utilisation, moins coûteuses pour l’identification

en routine de protéines. Toutefois des chercheurs continuent toujours par leur travail à

améliorer cette technique (Thoma et al, 2009).

57

N SC + NH2

R1

H O

NH

CH

R2

O

NH

C C C

NH

R1

H O

NH

CH

R2

O

NH

S

N

H

C C

CH

R2

O

NH

NH3

+

N

H

N CH

OS

R1

CC+ N

CH

NH

S

OR1

C

C

Isothiocyanate de phényle

réactif d'EdmanRésidu N-Terminal

du polypeptide

dérivé phénylthiocarbamyle (PTC)

pH =9

F3CCOOH

chaîne polypeptidique de

(n-1) résidus d'acides aminés

nouveau traitement en condition alcaline

avec le réactif d'Edman pour le second

cycle de dégradation

dérivé anilinothiazolinone

solution acide

dérivé phénylthiohydantoïne

d'acide aminé :

PTH-AA

solvant d'extraction

séparation et identification

de l'acide aminé par chromatographie

sur phase reverse à 254 nm

Figure 18 : Réaction de dégradation d'Edman

enzyme Gène viabilité Rôle

POL1 -

POL12 -

PRI1 - ADN polymérase α

PRI2 -

Impliquée dans l’initiation de la réplication

par la synthèse d’ARN et des amorces

d’Okazaki.

ADN polymérase β-like POL4 + Impliqué dans le NHEJ

ADN polymérase γ MIP1 + (petite) Réplication et réparation de l’ADN mt

POL3 -

POL31 - ADN polymérase δ

POL32 +

Synthèse du brin antisens

POL2 -

DPB2 -

DPB3 + ADN polymérase ε

DPB4 +

Synthèse du brin sens

REV3 + ADN polymérase ζ

REV7 +

Réparation de l’ADN et synthèse

translésionnelle

Rev1 REV1 + Réparation des sites abasiques

ADN polymérase η RAD30 + Réplication bypass une lésion CPD

ADN polymerase ϕ POL5 - Nécessaire pour la synthèse des ARNr

Tableau 3 : Tableau récapitulatif des gènes codant pour des ADN polymérases chez la levure

S.cerevisiae et de la létalité de leur interruption génique.

(-) : délétion létale, (+) : délétion non létale

Le principe du séquençage d’Edman est basé sur la réaction du phénylisothiocyanate

qui va réagir avec l’extrémité NH2 terminale des protéines et conduire au final à la coupure

de l’acide aminé en N-terminal couplé à un groupement phénylthiohydantoïne : PTH-acide

aminé (figure 18). En principe cette technique pourrait permettre la dégradation de n’importe

quelle séquence quelque soit la longueur, mais en pratique des dégradations restreintes sont

seulement réalisables. Le PTH-acide aminé est ensuite analysé dans un séquenceur pour

déterminer l’identité de l’acide aminé et la réaction de dégradation d’Edman redémarre pour

analyser l’acide aminé suivant au niveau de l’extrémité N-terminale.

Une analyse par séquençage d’Edman à partir d’une fraction purifiée de la seconde

ADN polymérase a été réalisée par J.P. Lasserre sans toutefois permettre d’identifier la

seconde ADN polymérase mitochondriale. L’un des inconvénients de cette technique est en

effet de nécessiter une quantité importante de protéine pour obtenir un résultat or les ADN

polymérases sont des protéines très peu exprimées dans la cellule (de 377 à environ 2000

molécules par cellule chez la levure selon http//www.expasy.org) contrairement à des

protéines telles que la pyruvate déshydrogénase (environ 100 000 molécules par cellule).

Ainsi, malgré un état de pureté élevé, la quantité de la seconde ADN polymérase n’est pas

suffisante pour cette analyse. Il est donc nécessaire de réaliser d’autres expériences pour

identifier la protéine d’intérêt.

I.2.4- Interruption génique.

Dans les années 90, grâce à l’analyse du génome, de nouvelles ADN polymérases ont

été identifiées par homologies de séquence chez l’homme et la levure. L’interruption génique

est une technique très puissante qui a permis d’attribuer des activités spécifiques à des

protéines. La levure S.cerevisiae est un organisme dont la génétique est très bien connue dont

la recombinaison homologue permet d’obtenir des collections de mutants de délétions,

disponibles dans le commerce. Ainsi, tous les gènes de la levure dont la délétion n’est pas

létale ont été délétés. L’intérêt de l’interruption génique d’un gène donné supposé coder pour

une protéine d’intérêt, consiste à observer la disparition ou non d’une activité enzymatique

lorsqu’elle est mesurable ou d’une protéine clonée analysée sur un gel d’acrylamide.

Dans le but d’identifier la seconde activité ADN polymérase mitochondriale,

l’ensemble des gènes codant pour des ADN polymérases (dont la délétion n’est pas létale) ont

été délétés chez la levure S.cerevisiae (tableau 3). Les souches délétées respectivement des

gènes MIP1, POL4, REV1, REV3, POL5, RAD30 et TRF5 ont été cultivées, afin d’isoler les

mitochondries selon le protocole établi au laboratoire permettant l’obtention d’organelles

58

fonctionnelles et non contaminées par des protéines cytoplasmiques ou nucléaires. Après

extraction les protéines solubles sont séparées par chromatographie afin de mesurer la

présence d’une deuxième activité ADN polymérase sur colonne SP 5 ml (GE Healthcare).

- Délétion du gène MIP1.

L’analyse de la souche délétée du gène MIP1 montre la disparition du pic

correspondant à l’ADN polymérase # mais la conservation de l’activité ADN polymérase

décrochée en présence de 0,25 M NaCl. Ainsi, la seconde activité ADN polymérase ne

correspond pas à un produit de traduction du gène MIP1, et ne correspond pas à un produit de

protéolyse de l’ADN polymérase #'

- Délétion du gène POL4.

L’analyse de la souche délétée du gène POL4 ne montre pas de variation au niveau de

l’activité ADN polymérase éluée de la colonne SP en présence de 0,25 M NaCl. En 1995,

plusieurs ADN polymérases ont été découvertes dans le kinétoplaste de Trypanosoma brucei,

parmi ces dernières deux ADN polymérases semblables à une beta ont été caractérisée (Torri

et Englund, 1995). A la suite de ce travail, une ADN polymérase " fut identifiée dans la

mitochondrie de cœur de bœuf (Nielsen-Preiss et Low, 2000), il était tentant de penser que la

seconde activité dans la mitochondrie de S.cerevisiae pouvait être une beta ou beta like.

Néanmoins, l’interruption génique chez la levure de l’ADN polymérase homologue de l’ADN

polymérase " animale ne montre pas de modification du profil d’activité ADN polymérase.

Donc la seconde activité ADN polymérase n’est pas codée par le gène POL4. Ainsi,

contrairement aux trypanosomatides, le couple d’ADN polymérases présent dans la

mitochondrie de la levure S.cerevisiae n’est pas gamma / beta. D’autres interruptions

géniques ont été testées pour les gènes codant pour des ADN polymérases dont la délétion

n’est pas létale.

- Délétion des gènes REV1, REV3, POL5, RAD30 et TRF5.

En ce qui concerne les autres interruptions géniques analysées, aucune modification du

profil d’élution des activités ADN polymérases mitochondriales n’a été observée. Ainsi, bien

que Rev1 et Rev3 aient été montrées récemment dans la mitochondrie par microscopie à

fluorescence (voir introduction partie V.5), ces protéines ne correspondent pas à la seconde

activité ADN polymérase mitochondriale.

59

Ainsi aucune interruption génique des gènes testés codant pour des ADN polymérases

n’entraine une disparition de l’activité ADN polymérase éluée de la colonne SP en présence

de 0,25 M NaCl. Cette technique a néanmoins permis de supprimer de nombreux candidats

potentiels et de limiter les possibilités aux trois ADN polymérases de la famille B impliquées

dans la réplication nucléaire les polymérases !, la $ et l’%.

I.2.5- Protéine de fusion.

Les trois gènes POL1, POL2 et POL3 codant respectivement pour les ADN

polymérases !, % et $, ne peuvent être délétés de par les fonctions essentielles de ces protéines

dans la cellule. Dans le but d’identifier laquelle de ces protéines correspond à la seconde

activité ADN polymérase dans la mitochondrie, une seconde approche a consisté à utiliser des

gènes étiquetés. Grâce à la facilité de manipulation génétique de la levure S.cerevisiae, des

collections de gènes étiquetés individuellement introduits dans un plasmide sont

commercialement disponibles. Ainsi, des protéines de fusion peuvent être produites par le

biais de la combinaison de différentes protéines ou fragments de protéines. Le gène d’une

protéine marqueur (tel que HA, TAPTAG ou encore la GFP) est ajouté à la suite d’un gène

donné codant pour une protéine d’intérêt dans un cadre d’étude déterminé. A l’aide

d’anticorps anti-HA ou anti-TAPTAG ou encore grâce à la fluorescence, les protéines

d’intérêt peuvent être détectées dans différentes fractions. L’utilisation de la fluorescence

présente l’avantage de permettre la détection de l’élution de notre protéine d’intérêt en temps

réel à l’aide d’un lecteur UV. L’intérêt est de suivre le produit de traduction d’un gène donné

au cours d’une purification, en effet si l’ajout de l’étiquette ne modifie pas le comportement

de la protéine codé par ce gène, la fluorescence peut permettre de suivre la protéine et

permettre d’obtenir des informations sur le produit du gène donné.

L’utilisation du gène codant pour la GFP introduit à la suite du gène d’une des trois

ADN polymérases dans un plasmide, sous la dépendance du promoteur naturel de l’ADN

polymérase étudiée, n’ont malheureusement pas donné de résultats permettant d’identifier la

seconde activité ADN polymérase mitochondriale en fonction de la localisation des pics

d’activité et émission de fluorescence. Ceci peut découler de changements de conformation

des protéines suite à l’ajout de l’étiquette GFP qui pourraient modifier l’import de la protéine

à la mitochondrie, ou le comportement chromatographique de la seconde activité ADN

polymérase mitochondriale. Néanmoins les analyses par microscopie à épifluorescence

semblaient montrer que l’ADN polymérase % pourraient posséder une double localisation

mitochondriale et nucléaire.

60

Au final, les études des propriétés physico-chimiques, des propriétés enzymatiques, de

séquençage d’Edman n’ont pas permis d’identifier la seconde activité ADN polymérase

mitochondriale. Toutefois les analyses par interruption génique ont permis de diminuer le

nombre de candidats à trois protéines : les ADN polymérases !, $ et %. N’ayant pas la

possibilité d’identifier la seconde activité ADN polymérase mitochondriale à l’aide d’outils

génétiques, une technique d’analyse physique est envisagée ; la spectrométrie de masse.

I.2.6- Spectrométrie de masse.

Cette technique a énormément évolué ces dernières années, elle est en constante

amélioration et ces évolutions ont permis d’augmenter la sensibilité des analyses et du

traitement des données ce qui permet de détecter des protéines présentes en très faible

quantité (20 à 50 fmoles). Il s’agit d’une technique physique d’analyse qui permet de détecter

et d’identifier des molécules par mesure de leur masse. Cette technique est devenue un atout

majeur à la biochimie et la biologie en général. Un spectromètre de masse est composé de

plusieurs systèmes qui jouent des rôles essentiels dans l’analyse.

I.2.6.1- Les systèmes d’ionisation.

La spectrométrie de masse était limitée depuis longtemps à des composés de petite

taille et thermodynamiquement stables du fait d’un manque d’efficacité pour ioniser en

douceur et transférer les molécules ionisées d’une phase condensée à une phase gazeuse sans

une fragmentation excessive. Deux techniques de formation d’ions moléculaires à partir de

biomolécules intactes ont été développées ; il s’agit de l’ESI (electrospray ionization) et le

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization). Ces techniques d’ionisation ont

permis de créer des polypeptides accessibles aux analyses de spectrométrie de masse.

:. L’ESI se déroule de cette manière : la solution

d’échantillon entre dans la chambre d’électrospray avec un flux de 1 à 20 µl/min à partir

d’une aiguille hypodermique en acier inoxydable. L’aiguille est maintenue à quelques

kilovolts par rapport aux parois de la chambre et aux environs de l’électrode cylindrique ce

qui aide à former la distribution du potentiel et dirige le flux du gaz. Le champ résultant au

niveau de la pointe de l’aiguille charge la surface du liquide émergeant, et disperse les charges

par les forces de Coulomb à l’intérieur d’un spray de gouttelettes chargées. Les gouttelettes

migrent dans un capillaire de verre jusqu’à la fin de la paroi de la chambre. Un contrecourant

de gaz va accélérer l’évaporation du solvant au niveau de chaque gouttelette et ainsi en

61

diminuer le diamètre. La densité de charge va augmenter à la surface des gouttelettes jusqu’à

la limite de Rayleigh qui correspond au point où les répulsions coulombiennes entre les

charges égalent la tension de surface. L’instabilité va entraîner une fission coulombienne et la

production de gouttelettes filles qui vont aussi s’évaporer. Ce processus va se répéter jusqu’à

ce que le rayon de courbure des gouttelettes filles devienne suffisamment petit pour que le

champ du à la densité de charge à la surface soit assez fort pour créer un phénomène de

désorption des ions de la gouttelette dans le gaz ambiant. Les ions désorbés sont attachés soit

au solvant soit aux espèces solubles qui ne sont pas elles-mêmes des ions, mais appelées des

ions « quasi-moléculaire » et sont utilisables pour les analyses par spectrométrie de masse.

:. En ce qui concerne le MALDI, il s’agit d’une technique

d’ionisation nécessitant un rayon laser (généralement un laser à l’azote). Une matrice est

utilisée pour protéger les protéines qui pourraient être détruites par l’action directe du faisceau

laser et pour faciliter la vaporisation et l’ionisation. La matrice est constituée de molécules

cristallisées, les 3 principalement utilisées sont l’acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique,

d’!-cyano-4-hydroxycinnamique et de l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque. Une solution avec

une de ces molécules est préparée, souvent dans un mélange avec de l’eau ultrapure et un

solvant organique (acétonitrile ou éthanol) ; de l’acide trifluoroacétique (TFA) peut aussi être

ajouté.

Les matrices sont choisies pour leur faible poids moléculaire (pour permettre une

vaporisation facile) mais suffisamment grande (avec une faible pression de vaporisation) pour

ne pas s’évaporer durant la préparation de l’échantillon. Les composés sont acides, et vont

agir comme une source de protons pour stimuler l’ionisation de l’analyte. Ils possèdent aussi

une forte capacité d’absorption des UV, donc ils absorbent rapidement et efficacement les

radiations du laser. Ils possèdent des groupes polaires, ce qui permet leur utilisation en milieu

aqueux. La matrice est ensuite mélangée avec l’analyte, les solvants organiques et l’eau vont

permettre aux molécules respectivement hydrophobes et hydrophiles de se solubiliser. La

solution est ensuite déposée sur une plaque (généralement une plaque de métal). Les solvants

se vaporisent ne laissant seulement que la matrice recristallisée, toutefois les molécules sont

étalées sur les cristaux. La matrice et l’analyte sont co-cristallisés dans un spot de MALDI.

Un laser va ensuite frapper les cristaux au niveau du spot de MALDI. La matrice va absorber

l’énergie du laser ce qui va l’ioniser, elle va ensuite transférer une partie de ces charges à

l’analyte. Les protéines vont donc être ionisées sans subir les effets destructeurs du laser. Des

ions vont être produits et correspondent à une molécule neutre [M] et d’un ion enlevé ou

ajouté. Ensemble, ils forment un ion quasimoléculaire, par exemple [M+H]+ dans le cas d’un

62

ajout de proton, [M+Na]+ dans le cas d’ajout d’ion sodium ou encore [M-H]- dans le cas d’un

proton enlevé.

I.2.6.2- Les analyseurs.

Grâce à des analyseurs TOF (Time-of-flight), le rapport masse sur charge d’un ion est

déduit du temps de vol de cet analyte à travers un tube dans le vide. Le principe est le

suivant : des ions sont accélérés par un champ électrique de valeur connue. Les ions de même

charge électrique vont acquérir la même énergie cinétique. La vitesse de l’ion dépend du

rapport masse/charge. Ce qui est mesuré est le temps mis par une particule chargée pour

atteindre un détecteur situé à une distance connue. Ce temps dépendra du rapport

masse/charge de la particule considérée. Ce sont les particules les plus lourdes qui seront

accélérées aux vitesses les plus basses. La détermination du rapport masse/charge découle de

ce temps de vol et de la connaissance des autres paramètres expérimentaux comme la position

du détecteur et la tension d'accélération.

D’autres analyseurs existent par exemple la trappe ionique, il existe 2 catégories

prédominantes, la trappe ionique quadrupole (QIT-MS) et le spectromètre de masse par

transformée de fourier (FT-MS). La QIT est une technique peu chère, simple dont le principe

est le suivant : Les ions produits par la source électrospray sont focalisés et transmis à la

trappe ionique par l'interface de transmission qui est constituée d'un jeu de lentilles et de

multipôles. La trappe est constituée d'un ensemble de 3 électrodes; une électrode annulaire

centrale (ring electrode), une électrode d'entrée et une électrode de sortie correspondant aux

"end cap electrodes". L’électrode annulaire est utilisée pour générer un champ électrique

quadripolaire qui permet de piéger les ions et de les retenir. La tension de l'électrode annulaire

est augmentée progressivement. Les ions sont alors éjectés suivant l'axe z, dans l'ordre de leur

rapport m/z croissant. Cet axe z correspond à la droite qui passe par les orifices des électrodes

d'entrée et sortie. Une moitié des ions est donc éjectée vers l'électrode d'entrée et est perdue,

l'autre moitié est éjectée vers l'électrode de sortie et captée par la dynode de conversion qui les

convertit en particules secondaires détectées par le multiplicateur d'électrons. Chaque tension

de l'électrode annulaire correspond à l'éjection d'un m/z particulier, ce signal peut être

enregistré au moyen d'un convertisseur TDC (Time to digital converter c'est-à-dire

convertisseur temps - numérique).

I.2.6.3- La spectrométrie de masse appliquée à la biologie.

63

La spectrométrie de masse est la technique la plus appropriée pour l’identification de

protéines lors de projets protéomiques du fait de sa rapidité et de sa sensibilité comparée au

séquençage d’Edman. Les extraits protéiques peuvent se présenter sous forme de bandes de

gels ou en milieux liquide. Ils peuvent subir deux différents traitements, le premier appelé

peptide masses fingerprinting (PMF) compare les peptides obtenus après digestion trypsique à

une banque de donnée de peptides provenant de tout le protéome de l’organisme étudié,

digéré virtuellement par la trypsine. La seconde technique est la spectrométrie de masse en

tandem MS/MS ; les peptides obtenus par l’action de la trypsine donc de tailles connues vont

être sujets à des collisions avec des gaz inertes qui vont couper statistiquement tous les acides

aminés un par un. Ainsi, la séquence de ces peptides pourra être lue acide aminé par acide

aminé et permettre l’identification des protéines. La première approche généralement couplée

à une analyse MALDI TOF MS est utilisée pour identifier les protéines séparées en gel 1D ou

2D. La seconde est combinée à de la nanoélectrospray et une chromatographie liquide pour

séparer les peptides, enfin, la MS/MS est utilisée pour l’analyse de mélanges protéiques sous

forme liquide.

Les analyses par spectrométrie de masse réalisées lors de la thèse de J.P. Lasserre ont

été réalisées à l’aide d’un MALDI-TOF. Toutefois, aucune ADN polymérase ne fut trouvée

parmi les protéines identifiées par spectrométrie de masse. Cela peut s’expliquer par la faible

représentation de la seconde ADN polymérase mitochondriale. Pour résoudre ce problème il

s’averait nécessaire soit d’augmenter la quantité de matériel donné à analyser, soit de modifier

le système d’analyse, ou encore espérer des améliorations de sensibilité du matériel utilisé. En

conclusion avant mon arrivée en thèse dans le laboratoire, trois ADN polymérases pouvaient

encore correspondre à la seconde ADN polymérase mitochondriale : les ADN polymérases !,

$ ou %, néanmoins, l’ADN polymérase % semblait posséder une double localisation par

microscopie à épifluorescence.

64

OBJECTIF DU PREMIER CHAPITRE :

L’objectif de la première partie de ma thèse est de poursuivre l’identification de la

seconde activité ADN polymérase mitochondriale. Pour identifier cette enzyme présente en

faible quantité, la stratégie de purification par chromatographie a été améliorée, et de

nouveaux systèmes d’analyses par spectrométrie de masse utilisés. Dans un premier temps, la

pureté des mitochondries a de nouveau été étudiée pour vérifier que cette seconde activité

ADN polymérase ne correspond pas à une contamination, comme cela avait pu être montré

pour l’ADN polymérase " de cœur de bœuf (Hansen et al, 2006).

65

II- MATERIELS ET METHODES.

II.1- Matériels.

II.1.1- Souches de levures et bactéries.

Les différentes souches utilisées au cours de ce chapitre sont :

:. La souche ST40, fournie par l’équipe du Dr J. Lazowska (CGM, Gif-sur-

Yvette) a été modifiée au niveau du génome mitochondrial, (Mat !,

ura380, lys280, leu280, his380)

:. Les souches BY4741 achetée à la société Invitrogen contenant le gène de

l’ADN polymérase alpha étiqueté avec le gène de la GFP d’Aequorea

Victoria (MAT a, his381, leu280, met1580, ura380).

:. La souche BY4742 achetée à la société Euroscarf est délètée pour le gène

MIP1 (Mat !, ura380, lys280, leu280, his380) appelée 8MIP1.

II.1.2- Culture des levures.

II.1.2.1- Cultures en milieu liquide.

- les levures ST40 et la souche 8MIP1 :

Après plusieurs pré-cultures dans des volumes croissants (20 ml puis 200 ml), les

levures sont cultivées dans un fermenteur de 20 litres contenant 10 g/l d’extraits de levures,

10 g/l de bactopeptone, 1 g/l de D-glucose et 20 g/l de D-galactose. La culture est placée sous

agitation constante et maintenue en aérobiose par barbotage d’un flux d’air stérile, à une

température de 28°C. La culture est arrêtée lorsqu’elle atteint une absorbance de 4, mesurée à

550 nm (milieu de la phase exponentielle de croissance). Les levures sont récupérées par

centrifugation en continue (Cepa-Schnell-Zentrifuge) à 40 000 rpm. Le culot est repris dans

de l’eau osmosée et les cellules sont de nouveau précipitées par centrifugation à 5 000 rpm

pendant 5 minutes.

- les levures BY4741 :

Ces levures sont cultivées dans un volume de 200 ml contenant 10 g/l d’extraits de

levures, 20 g/l de bactopeptone, 20 g/l de D-glucose.

66

II.1.2.2- Conservation des souches.

Les levures sont conservées en milieu solide de composition identique au milieu

liquide avec 1,7% d’agar en supplément à 4°C.

II.1.3- Préparation des mitochondries.

- Le culot de levures est repris dans le tampon SH (Tris/HCl 100 mM pH 9,3, "-

mercaptoéthanol 500 mM) à raison de 10 ml par gramme de poids sec et incubé 10

minutes au bain marie à 30°C.

- Les cellules sont culottées par centrifugation pendant 5 minutes à 5 000 rpm à 4°C

(rotor Sorvall GSA). Le culot est repris dans 5 volumes de tampon KCl contenant 10

mM Tris/HCl pH 7, KCl 500 mM, et centrifugé comme précédemment. Cette

opération est répétée 2 fois.

- Le culot est repris dans le tampon de digestion (0,2 M phosphate disodique pH 5,8,

246 g/l sorbitol, 1 mM EGTA, 100 mM acide citrique supplémenté par de la

zymolyase ajoutée à raison de 0,2 mg/ml [Zymolyase-20T, 20000 Unités/gramme,

ICN Biochemicals]) à raison de 10 ml par gramme de poids sec.

- La digestion des parois s’opère à 37°C sous agitation, et son évolution est suivie en

mesurant la DO à 550 nm. La réaction est arrêtée quand la DO atteint 10% de sa

valeur de départ, ou au bout d’une heure de digestion si la valeur n’est pas atteinte. Le

produit de digestion est centrifugé à 8 000 rpm pendant 5 minutes à 4°C (rotor Sorvall

SS34).

- Le culot est repris dans 5 volumes de tampon de lavage (Tris-maléate 10 mM pH 6,8,

sorbitol 750 mM, mannitol 400 mM) et homogénéisé dans un potter de Thomas, puis

complété à 30 ml dans les tubes de rotor SS34 et centrifugé comme précédemment,

cette opération est réalisée 2 fois.

- Le culot est ensuite remis en suspension dans 5 volumes de tampon de récupération

(Tris-maléate 10 mM pH 6,8, mannitol 600 mM, EGTA 2 mM, EDTA 3 mM). Les

protoplastes (levures sans parois) sont laissés reposer 30 min à 4°C.

- L’homogénat est ensuite broyé 2 fois pendant 5 secondes au Mixeur (Blendor,

Waring) à basse vitesse puis complété à 30 ml dans les tubes de rotor SS34. Les

extraits sont ensuite centrifugés pendant 5 minutes à 2 500 rpm à 4°C (rotor Sorvall

SS34), pour culotter tous les débris et cellules non digérées.

- Le surnageant est récupéré et le culot est homogénéisé au potter de Thomas avec 5

volumes de tampon de récupération et complété ensuite à 30 ml comme

67

précédemment. Le culot re-suspendu est centrifugé à 2 500 rpm à 4°C (rotor Sorvall

SS34) pour récupérer un deuxième surnageant. Ces surnageants sont centrifugés

séparément pendant 10 minutes à 12 500 rpm (rotor Sorvall SS34).

- Les culots sont ensuite rassemblés et homogénéisés dans un volume minimum de

tampon de récupération et le mélange est déposé sur un gradient discontinu de

saccharose (8 ml de solution à 55%, 8 ml de solution à 40% et 8 ml à 30%) à raison de

6 ml par tube au maximum. L’ultracentrifugation est réalisée dans un rotor à godets

oscillants (Sorvall AH-629) à 24 000 rpm pendant 30 minutes et à 4°C.

- A la fin de la centrifugation, l’anneau mitochondrial est récupéré à l’interface des

solutions 40% et 55%. Cet anneau re-suspendu avec 5 volumes de tampon de

récupération est homogénéisé au potter de Thomas. Le mélange est ensuite centrifugé

10 minutes à 12 500 rpm (rotor Sorvall SS34) à 4°C et enfin le culot mitochondrial

obtenu est repris dans un volume minimum de tampon de récupération à une

concentration d’environ 50 mg de protéine par ml.

- Les mitochondries sont immédiatement congelées dans de l’azote liquide sous forme

de billes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille stériles. Les cryotubes sont ensuite

conservés à -80°C.

II.1.4- Préparation des mitoplastes.

Les mitoplastes sont des mitochondries dépourvues de membrane externe. Les

mitoplastes sont préparés selon le protocole décrit par Camougrand (Camougrand et al, 1988)

à l’exception du fait que nous démarrons avec des mitochondries fraiches pour éviter l’étape

congélation/décongélation qui pourrait entraîner l’éclatement des mitochondries lors de la

décongélation.

- Environ 400 mg de mitochondries purifiées sont re-suspendues à une concentration de

20 mg/ml dans un tampon hyperosmotique 2X (10 mM Hepes pH 7.4, 340 mM

Saccharose et 460 mM Mannitol).

- Les mitochondries sont ensuite passées dans un cell disrupter (LTD) à une pression de

2000 psi (14 MPa) et l’extrait est dilué avec 2 volumes de tampon 1X (5 mM Hepes

pH 7,4, 170 mM Saccharose et 230 mM Mannitol).

- Le mélange est ensuite centrifugé 20 min à 13 000 rpm (rotor SS34 de Sorvall) à 4°C

et le culot est formé des mitoplastes tandis que le surnageant contient les membranes

externes mitochondriales. Le surnageant est retiré soigneusement à l’aide de pipettes

Pasteur.

68

- Le culot est remis en suspension dans un minimum de volume de tampon

d’homogénéisation. La concentration protéique est ensuite mesurée par dosage au

réactif de Bradford (Bio-rad protein assay, Bio-rad).

II.1.5- Traitement à la protéinase K.

Les mitochondries purifiées fraiches sont préparées comme précédemment. Le

nettoyage des mitochondries est réalisé selon le protocole décrit par Mansouri et Akbari

(Akbari et al, 2008). La protéinase K (EC 3.4.21.64) est une enzyme protéase végétale très

active qui a la capacité d’hydrolyser les protéines. Elle a une préférence pour les liaisons

peptidiques situées après des acides aminés aliphatiques, aromatiques et hydrophobes.

- De la protéinase K solubilisée dans du tampon de récupération (Tris-maléate 10 mM

pH 6,8, mannitol 600 mM, EGTA 2 mM, EDTA 3 mM) est ajoutée à 1 mg/ml et les

mitochondries sont incubées pendant 30 min à 37°C puis centrifugées à 12 500 rpm

(rotor Sorvall SS34) pendant 5 min à 4°C.

- Le culot est ensuite homogénéisé avec 5 volumes de tampon de récupération

supplémenté d’inhibiteurs de protéase de 10 ml (1 cachet pour 10 ml de complete mini

EDTA free, Roche) et du PMSF à 5 mM à l’aide d’un potter de Thomas. L’homogénat

est ensuite complété à 30 ml dans les tubes de rotor SS34 puis les mitochondries sont

culottées par centrifugation à 12 500 rpm (rotor Sorvall SS34) pendant 5 min à 4°C.

Ce lavage est réalisé 2 fois.

- Les mitochondries purifiées traitées sont ensuite remises en suspension dans un

minimum de volume de tampon de récupération contenant des inhibiteurs de

protéases et sont congelées avec de l’azote liquide et stockées à –80°C.

II.1.6- Gradient d’Histodenz™ (Sigma-Aldrich).

Les mitochondries purifiées fraiches sont préparées comme précédemment (II.1.4) et

la technique du gradient d’Histodenz™ est réalisée selon le protocole décrit par Hansen

(Hansen et al, 2006). Pour avoir suffisamment de matériel la totalité des mitochondries

purifiées à partir d’un fermenteur de 20 l de levures S.cerevisiae est utilisée pour la

manipulation.

- Les mitochondries purifiées sont culottées à 12 500 rpm pendant 5 min à 4°C.

- Les mitochondries sont re-suspendues avec 3 ml de saccharose 0,25 M solubilisé dans

de l’eau ultrapure.

69

- 2 solutions de 15 et 35% d’Histodenz™ sont réalisées dans de l’eau ultrapure.

- un gradient de 15-35% d’Histodenz™ est formé dans des tubes Ultra-Clear™ 14x89

mm (Beckmann), cette manipulation à nécessité l’utilisation d’un formeur de gradient

auto-densiflow® IIC (Buchler Instruments, Fort Lee, N.J.) et d’un mélangeur de

gradient.

- Pour chaque gradient 5,4 ml de solution de 15 % et 35 % d’Histodenz sont utilisés.

- 500 µl de mitochondries sont ensuite déposés sur chaque gradient continu

d’Histodenz™ et les tubes sont centrifugés pendant 2 h à 35 000 rpm (SW41Ti,

Beckmann) et à 4°C.

- Les phases correspondant aux mitochondries et aux microsomes sont récupérées

séparément à travers les tubes grâce à l’utilisation de seringues et pipettes stériles.

Les mitochondries sont ensuite stockées à -80°C ou utilisées fraiches pour obtenir des images

en microscopie électronique.

II.1.7- Microscopie électronique.

La manipulation se déroule pendant trois jours :

1er jour :

:. Fixation

- L’échantillon est dilué de moitié dans une solution de fixateur (Glutaraldéhyde 1,6%

final, Tampon de Sorensen 0,1 M final, Saccharose 0,25 M) puis homogénéisé au

vortex.

- La fixation dure 2h à 4°C.

:. Lavages

- Après les 2 h de fixation, centrifugation 3 min à 6000 rpm.

- Elimination du fixateur (pas en totalité) puis introduction de tampon de Sorensen

0,1M + saccharose 0,25M.

- Homogénéisation au vortex.

- Conservation des tubes à 4°C toute la nuit.

2ème jour :

:. Lavages

- Un bain de 5 à 10 min (tampon de Sorensen à 0,1M+saccharose 0,25M final).

- Un bain de 5 min (tampon de Sorensen à 0,1M+saccharose 0,25M final).

- Un bain de 15 min d’Ethanol 95°.

- Deux bains de 20 min d’Ethanol à 100°.

70

- Deux bains de 30 min (bouchons fermés) d’oxyde de propylène.

:. Imprégnation

- Mélange moitié/moitié avec un mélange oxyde de propylène/résine pure (Embed 812 :

22g, MNA : 15,8g, DDSA : 8,6g, DMP30 : 0,69g).

- Imprégnation 2 à 4h à température ambiante dans ce mélange.

- Introduction de résine pure.

- Bain de résine pure toute la nuit à température ambiante.

3ème jour :

:. Imprégnation/Inclusion.

- Changement de bain.

- Bain de résine pure 2 à 4h à température ambiante.

- Dépôt des échantillons dans des moules d’inclusion.

- Polymérisation à l’étuve à 60°C pendant 48h.

:. Travaux de coupes

- Utilisation d’un Ultramicrotome (Ultracute, Leica).

- Les coupes fines sont réalisées avec un couteau diamant.

- Couteau à diamant utilisé : MC12890, 2mm de couteau, 35° d’angle (position du

diamant), 6° d’angle de coupe.

- Types de grilles utilisées : grilles 200 meshes en cuivre.

- Les coupes : 3-4 coupes ultra-fines /grille (vitesse de coupe utilisée : 0,8mm/s,

épaisseur des coupes : 65 nm.

II.2 - Méthodes Relatives à l’étude des protéines.

II.2.1- Détermination de la concentration des protéines.

Ces dosages ont été réalisés selon la méthode colorimétrique de Bradford (Bradford et

al, 1964). La concentration en protéines des échantillons est estimée à l'aide d'une courbe

d'étalonnage réalisée avec des quantités connues de sérum albumine bovine (BSA).

II.2.2- Test d’activité ADN polymérase ADN dépendante.

L’activité ADN polymérase est mesurée avec une matrice d’ADN activé : ADN de

thymus de veau double brin partiellement digéré par la DNase I pancréatique selon la

71

méthode de Aposhian et Kornberg (Aposhian et Kornberg, 1962), afin d'obtenir des régions

d'ADN simple brin et des extrémités 3'OH libres.

- Lors de la mesure de l’activité ADN polymérase de l’ADN polymérase #, 5 µl

d’échantillon sont incubés avec 45 µl de milieu réactionnel (concentration finale

Tris/HCl 50 mM pH 7,5, DTT 10 mM, dATP 0,1 mM, dCTP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM,

20 µg/ml d’ADN activé, [3H]dTTP (45 Ci/mmol) 0,01 mM, BSA 200 µg/ml, MgAc

50 mM) pendant 30 minutes à 37°C.

- Lors de la mesure d’activité de l’ADN polymérase non identifiée7.5 µl d’échantillon

sont incubés avec 45 µl de milieu réactionnel (concentration final Tris/HCl 50 mM pH

7,5, DTT 10 mM, dATP 0,1 mM, dCTP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM, 20 µg/ml d’ADN

activé, [3H]dTTP (45 Ci/mmol) 0,01 mM, BSA 200 µg/ml, MgAc 10 mM) pendant 30

minutes à 37°C.

- Lors de la mesure de test d’inhibition à l’aphidicoline, des solutions intermédiaires

d’aphidicoline sont réalisées en solubilisant cet inhibiteur dans du DMSO 4 %. 5 µl

d’échantillon sont incubés avec 40 µl de milieu réactionnel (concentration finale

Tris/HCl 50 mM pH 7,5, DTT 10 mM, dATP 0,1 mM, dCTP 10 µM, dGTP 0,1 mM,

20 µg/ml d’ADN activé, [3H]dTTP (45 Ci/mmol) 0,01 mM, BSA 200 µg/ml, MgAc

10 mM) et 5 µl d’aphicoline à concentration variable pendant 30 minutes à 37°C.

- Lors de la mesure de test d’inhibition au NEM, des solutions intermédiaires de NEM

sont réalisées dans de l’eau à une concentration 2 fois celle désirée lors du test. 5 µl

d’échantillon sont pré-incubés avec 5 µl NEM pendant 15 min dans la glace. 40 µl de

milieu réactionnel (concentration finale Tris/HCl 50 mM pH 7,5, DTT 10 mM, dATP

0,1 mM, dCTP 0.1 mM, dGTP 0,1 mM, 20 µg/ml d’ADN activé, [3H]dTTP (45

Ci/mmol) 0,01 mM, BSA 200 µg/ml, MgAc 10 mM) sont ensuite rajoutés et le

mélange est incubé pendant 30 minutes à 37°C.

- Les réactions sont stoppées par addition de 2 ml d’acide trichloracétique (TCA) à 10%

(v/v) contenant 100 mM de pyrophosphate de sodium pour précipiter les acides

nucléiques. Ces précipités sont filtrés à travers une membrane de nitrocellulose

(Sartorius stedim biotech 0,45 µm) préalablement lavée avec du TCA 2%.

- Les filtres sont séchés à l’aide d’une lampe et sont placés dans des tubes à scintillation

de 7 ml (Dutscher) après addition de 2 ml d’un mélange scintillant (Ultima GoldTM,

Perkin Elmer), la radioactivité retenue sur les filtres est mesurée au compteur à

scintillation liquide de type LKB 1211 RACK BETA.

72

II.2.3- Purification des ADN polymérases mitochondriales.

II.2.3.1- Extraction et fractionnement des protéines mitochondriales.

Toutes les opérations sont réalisées à 4°C.

- 300 mg de protéines sont décongelées dans un volume final de 20 ml de tampon

d’extraction (10 mM Tris/HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5 M NaCl, 0,3%

triton X-100 réduit). Des inhibiteurs de protéase (pepstatine 1 µg/ml, leupeptine 1

µg/ml, PMSF 1 mM) sont ajoutés extemporanément.

- Cette solution est placée durant 30 minutes dans un bain à sonication maintenu à 4°C

par l’ajout de glace, puis elle est centrifugée à 30 000 rpm (rotor Sorvall A-641)

pendant 45 minutes à 4°C.

- Le surnageant (S100) est utilisé pour les étapes suivantes de purification.

II.2.3.2- Séparation des protéines par chromatographie liquide à basse pression.

Les deux activités ADN polymérase seront purifiées sur la chaîne de chromatographie

liquide basse pression FPLC®-System (Amersham Pharmacia Biotech) ou la chaîne AKTA

purifier (GE Healthcare). Toutes les colonnes utilisées sont produites par Amersham (GE

Healthcare). La première colonne (Hi Trap SP 5 ml, GE Healthcare) est réalisée sur le

FPLC®-System contrairement aux autres étapes qui sont réalisées sur l’AKTA purifier, la

colonne Hi Trap Mini Q 250µl 3/23 est quant à elle réalisée sur un Ettan LC (GE Healthcare).

Deux tampons de chromatographie sont utilisés (Tris/HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 1

mM, "-mercaptoéthanol 1 mM, glycérol 20%, triton X-100 réduit 0,001%, inhibiteur de

trypsine 0,1 mg/ml), et ne diffèrent que par leur concentration en sel. Les tampons A et B ont,

respectivement, une concentration de 0 et 2 M NaCl. La concentration en sel est suivie par la

conductivité (mesurée en mS). L’élution des protéines est suivie par l’absorbance à 280 nm.

3 Colonne Hi Trap SP 5 ml (GE Healthcare).

Cet échangeur cationique fort est composé d'une phase stationnaire constituée de billes

d'agarose sur lesquelles sont fixés les groupements ioniques SO3-. Les protéines se fixent par

des interactions ioniques entre les acides aminés positifs accessibles des protéines et les

groupements d’anhydride sulfuriques présents sur la matrice. Les protéines sont ensuite éluées

en appliquant un gradient de concentration de sels pour rompre l’interaction ionique. Les

73

Programme HiTrap Q 1 ml

0.00 Base Volume, 0,96 {ml}, HiTrap_Q_FF_1_ml

0.00 Flow 1.00 {ml/min}

0.00 Gradient 0.00 {%B}, 0.00 {base}

0.00 InjectionValve Load

0.00 InjectionMark

0.00 Wavelength 280 {nm}, 254 {nm}, 215 {nm}

5.00 Gradient 100 {%B}, 0.00 {base}

10.00 Gradient 0 {%B}, 0.00 {base}

15.00 AutoZeroUV

15.00 New_chromatogram injection

15.00 InjectionValve Inject

15.00 Fractionation 18mm, 1 {ml}, FirstTube, Volume

16.00 Fractionation 18mm, 5 {ml}, NextTube, Volume

(20.00) #vol_echant_plus_15 InjectionValve Load

25.00 Gradient 5 {%B], 0.00 {base}

25.00 Fractionation 18mm, 0.50 {ml}, NextTube, Volume

30.00 Gradient 15 {%B}, 0.00 {base}

35.00 Gradient 40 {%B}, 0.00 {base}

40.00 Gradient 100 {%B}, 0.00 {base}

45.00 FractionationStop

50.00 End_Method

Figure 20 : Programme HiTrap Q pour ADN polymérase alpha

Figure 19 : Programme HiTrap SP sur FPLC-System

débits de 2,5 ml/min et 1 ml/min, respectivement pour le chargement et l'élution nous

permettent de rester à une pression inférieure à 0,3 MPa.

Le surnageant S100 est dilué au 1/5ème pour abaisser la concentration en sel à 0,1 M.

Après avoir lavé la colonne Hi Trap SP 5 ml avec 25 ml de tampon A, l’échantillon est chargé

à un débit de 2,5 ml/min. L’élution des protéines retenues est réalisée avec un gradient

linéaire de 0 à 550 mM NaCl au débit de 1 ml/min (figure 19). Les extraits sont collectés sous

forme de fractions de 500 µl. Les activités ADN polymérases sont testées en utilisant 5 µl de

chaque fraction recueillie en présence de 10 et 50 mM de Magnésium. Deux activités ADN

polymérase différentes sont détectées, un pic d’activité ADN polymérase est élué en présence

de 250 mM NaCl, le second quant à lui est éluée en présence de 450 mM NaCl.

Ces 2 pics sont recueillis séparément pour réaliser les colonnes suivantes.

II.2.3.3- Purification de l’ADN polymérase éluée à 250 mM (ADN polymérase Non identifiée : NI).

3 Colonne Hi Trap Q 1 ml (GE Healthcare).

Cet échangeur anionique permet de séparer les protéines en fonction de leurs charges

qui établissent des interactions avec la phase stationnaire composée de billes d'agarose sur

lesquelles les groupements N+(CH3)3 sont fixés. Ainsi, les protéines présentant à leur surface

des acides aminés chargés négativement seront retenues. Le chargement de cette colonne,

ainsi que l'élution sont réalisés à débit constant de 1 ml/min, ce qui permet de rester à une

pression inférieure à 1 MPa.

La colonne Hi Trap Q 1 ml est équilibrée avec 5 ml de tampon A. Après dilution au

tiers dans du tampon A, la solution contenant l’activité ADN polymérase éluée à 250 mM est

chargée sur la colonne Hi Trap Q. Après des steps à 0,1 M, 0,3 M, 1 M et 2 M NaCl, les

protéines éluées sont collectées sous forme de fractions de 0,5 ml (figure 20). Les fractions

sont testées en présence d’acétate de magnésium 10 mM et un pic d’activité ADN polymérase

est élué au niveau du step de 0,3 M NaCl. Ce pic est recueilli pour réaliser les colonnes

suivantes.

3 Colonne d'affinité Hi Trap héparine 1 ml (GE Healthcare).

L'héparine est un polymère naturel extrait du protéoglycane de la muqueuse intestinale

de porc. Cette molécule est constituée d'un nombre variable d'unités d'acide uronique et de D-

glucosamine dont la plupart possède un à deux groupements sulfate (poids moléculaire de 5 à

74

Programme HiTrap Héparine 1 ml

0.00 Base Volume, 0,96 {ml}, HiTrap_Heparin_HP_1_ml

0.00 Flow 0,5 {ml/min}

0.00 Gradient 0.00 {%B}, 0.00 {base}

0.00 InjectionValve Load

0.00 InjectionMark

0.00 Wavelength 280 {nm}, 254 {nm}, 215 {nm}

5.00 Gradient 100 {%B}, 0.00 {base}

10.00 Gradient 0 {%B}, 0.00 {base}

15.00 AutoZeroUV

15.00 New_chromatogram injection

15.00 InjectionValve Inject

15.00 Fractionation 18mm, 1 {ml}, FirstTube, Volume


(20.00) #vol_echant_plus_15 InjectionValve Load


25.00 Gradient 15 {%B}, 0.00 {base}

40.00 Gradient 35 {%B}, 15.00 {base}

40.00 Fractionation 18mm, 0,35 {ml}, NextTube, Volume

60.00 Gradient 100 {%B}, 0.00 {base}

60.00 Fractionation 18mm, 1.00 {ml}, NextTube, Volume

65.00 FractionationStop

70.00 End_Method

Figure 21 : Programme Héparine ADN polymérase alpha

Figure 22 : Programme HiTrap Mini Q 3/23

30 kDa). Fixé sur des billes d'agarose, ce composé est utilisé pour purifier des protéines de

coagulation ou des facteurs de croissance mais, sa structure mimant celle du squelette sucre-

phosphate des acides nucléiques, il permet également de fixer les protéines se liant à l'ADN.

Nous avons utilisé les colonnes Hi Trap héparine 1 ml avec un débit constant de 0,5 ml/min,

aussi bien lors du chargement que de l’élution.

Après lavage de la colonne Hi Trap héparine 1 ml avec 5 volumes de tampon A,

l’ensemble des fractions issues de la colonne précédente contenant de l’ADN polymérase.est

dilué au deux tiers avec du tampon A avant d’être chargé sur une colonne Hi Trap héparine 1

ml et les protéines retenues sont éluées avec un gradient linéaire de 300 à 700 mM NaCl après

un step à 300 mM. Les protéines éluées dans le gradient linéaire sont collectées dans des

fractions de 350 µl (figure 21). Les fractions contenant l’activité ADN polymérase sont

recueillies pour les colonnes suivantes. L’activité ADN polymérase est éluée à 500 mM NaCl

et les fractions correspondantes sont conservées à –20°C.

3 Colonne Hi Trap desalting 5 ml (GE Healthcare).

Cette colonne permet de séparer des substances de haut poids moléculaire et bas poids

moléculaire telles que les protéines et les sels. Ainsi, cette colonne permet de diminuer la

concentration en sels présents dans les extraits protéiques.

Après avoir rassemblé les fractions contenant l’activité ADN polymérase décrochée de

la colonne Hi Trap héparine, la colonne Hi Trap desalting est lavée par 5 volumes de colonne

de tampon A, l’échantillon est chargé au débit constant de 1 ml/min qui permet de rester à une

pression inférieure à 3 bars. L’élution est réalisée seulement avec le tampon A.

3 Colonne Hi Trap Mini Q 250µl 3/23 (GE Healthcare).

Cette colonne cationique échangeur anionique est composée de billes d'un diamètre de

3 -m (MiniBeadsTM), sur lesquelles sont fixés des groupements ioniques -CH2-N+(CH3). Le

débit utilisé pour cette colonne est de 200 -l/min afin de rester en dessous de 100 bars.

Les fractions actives à la sortie de la colonne de dessalage sont rassemblées et

chargées sur la colonne après avoir lavé la colonne par 5 volumes de tampon A. Les protéines

retenues sont éluées par un gradient de 0 mM à 500 mM NaCl (figure 22). Les fractions

contenant l’activité ADN polymérase sont éluées à 250 mM NaCl et conservées à –20°C.

L’activité est stable

75

Figure 24 : HiTrap Blue cibacron 1 ml pour l'ADN polymérase gamma (GE Healthcare)

Figure 25 : Hi Trap octyl 1 ml pour l'ADN polymérase gamma (GE Healthcare)

Figure 26 : HiTrap Héparine 1 ml pour l'ADN polymérase gamma (GE Healthcare)

Figure 23 : HiTrap Héparine 1 ml pour l'ADN polymérase gamma (GE Healthcare)

II.2.3.4- Purification de l’ADN polymérase éluée à 450 mM (ADN polymérase #).

3 Colonne Hi Trap héparine 1 ml (GE Healthcare).

Les fractions issues de la colonne Hi Trap SP 5 ml et contenant l’ADN polymérase

éluée en présence de 450 mM sont chargées sans être dilué sur une colonne Hi Trap héparine

1 ml. La colonne est lavée par 5 volumes de tampon A et les protéines sont déposés sur la

colonne à un débit de 0,5 ml/min. Les protéines retenues sont éluées avec 3 steps de 0,5 M,

0,9 M et 2 M NaCl (figure 23). Après mesure des activités ADN polymérases de chaque pic

protéique obtenu, les fractions contenant de l’activité ADN polymérase sont rassemblées

(l’ADN polymérase gamma est éluée au niveau du step 0,9 M NaCl).

3 Colonne Hi Trap blue-cibacron 1 ml (GE Healthcare).

Le pool obtenu est chargé sans dilution sur une colonne Hi Trap blue-cibacron 1 ml.

Les protéines retenues sont éluées avec 3 steps de 0,9, 1,8 et 2M NaCl (figure 24). Les

fractions contenant l’activité ADN polymérase éluées à 1,8 M NaCl sont rassemblées.

3 Colonne Hi Trap octyl 1 ml (GE Healthcare).

Les fractions sont déposées sur la colonne Hi Trap octyl 1 ml. L’élution est réalisée

avec un gradient linéaire décroissant de 2 à 0 M NaCl (figure 25). Les fractions contenant

l’activité ADN polymérase éluées à 1 M NaCl sont rassemblées.

3 Colonne Hi Trap héparine 1 ml (GE Healthcare).

Pour concentrer l’enzyme obtenue après la colonne Hi Trap Octyl 1 ml, les fractions

enzymatiques sont rassemblées, diluées pour diminuer la concentration en NaCl à 0,5 M et

elles sont chargées sur une colonne Hi Trap Héparine 1 ml. L’ADN polymérase # est éluée

par un step à 1 M NaCl (figure 26). La fraction enzymatique obtenue est conservée à -20°C et

l’activité peut être conservée pendant plus de 6 mois.

II.2.4- Détermination de la localisation des protéines.

76

II.2.4.1- Mesures d'activités d'enzymes marqueurs.

Activité Glucose-6-phosphate déshydrogénase

La glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49) est localisée dans le

cytoplasme où elle catalyse la transformation du glucose-6-phosphate en 6-phosphogluconate.

Au cours de cette réaction, le cofacteur NADP+ est réduit en NADPH + H+. Son activité est

mesurée par la technique décrite par Langdon (Langdon, 1966) à 28°C.

- 0,9 ml de tampon G6PDH (Triéthanolamine 0,2 M pH 7,4, MgCl2 30 mM, EGTA 1,5

mM) sont ajoutés dans une cuve en quartz

- De l’antimycine A (inhibiteur du complexe III) est ajouté à 0,5 µg/ml.

- Du Glucose-6-phosphate est ajouté à une concentration de 5 mM final.

- 100 µg d’extrait protéique sont ajoutés dans la cuve.

- La réaction est déclenchée par l’ajout de NADP+ à 2 mM final, le mélange est agité.

L’apparition du NADPH est suivie par la mesure de la densité optique à 340 nm sur un

spectrophotomètre à double faisceau (Cary 4000). L’activité est exprimée en mole de

NADPH produite par seconde par µg de protéines.

Activité kynurénine hydroxylase

La kynurénine hydroxylase (E.C.1.14.13.9) est une enzyme mitochondriale ancrée au

niveau de la membrane externe de la mitochondrie, cette protéine est capable de transformer

la L-kynurénine en 3-hydroxy-L-kynurénine. Cette réaction nécessite le cofacteur NADPH

qui est oxydé en NADP+. Son activité est mesurée par la technique décrite par Velours

(Velours et al, 1977) à 23°C.

- 2 ml de tampon kynurénine hydroxylase (Tris Maléate 0,105 M pH 8,0, MgCl2 7,5

mM) sont déposés dans une cuve en quartz.

- 50 µl de KCN à 0,5 M (inhibiteur du complexe IV) est ajouté dans la cuve.

- 20 µl de NADPH à 10 mM est ajouté à la cuve.

- 100 ou 200 µg de protéines sont ajoutés dans la cuve de quartz et la vitesse

d’oxydation résiduelle du NADPH est mesurée en absence de L-kynurénine par

observation de l’absorbance à 340 nm.

- 50 µl de L-kynurénine à 10 mM sont ajoutés au mélange réactionnel.

77

La vitesse de disparition du NADPH est observée à DO340 dans un spectromètre à double

faisceau (Cary 4000). La vitesse d’oxydation résiduelle du NADPH est ensuite retranchée de

celle mesurée en présence de L-kynurénine.

II.2.4.2- Expérience d’épifluorescence.

La souche utilisée est une S288C-YNL102W et les marqueurs proviennent

d’Invitrogen (Yeast mitochondrial stain sampler kit, Molecular Probes).

- La souche S288C-YNL102W est cultivée dans un volume de 20 ml dans un milieu

YPD riche en glucose (bien que cela entraîne la répression catabolique) jusqu’à une

D.O. de 2.

- 1 ml de levures sont récupérées et les levures sont culotées à 16 000g, le surnageant

est ensuite retiré et les levures sont remises en suspension dans de l’eau osmosée et

peuvent être observées au microscope à épifluorescence.

- Pour réaliser le marquage de levures au mitotracker (Rhodamine B), une solution

contenant 106 cellules/ml dans du tampon HEPES pH 7,4 10 mM contenant 5% de

glucose est réalisée.

- De la Rhodamine B est ajoutée à une concentration finale de 0,1 µM.

- Après incubation pendant 15 min, les levures sont centrifugées à 4 000g et remises en

suspension dans 100 µl d’eau osmosée à température ambiante.

- 3 µl de levures sont déposés entre plaque et lamelle et les levures sont observées au

microscope à épifluorescence (Axioplan 2, Zeiss). La fluorescence de la GFP est

observée dans le vert (510 nm) et excitée dans le bleu (490 nm).

- Pour observer la fluorescence de la Rhodamine B, la longueur d’onde d’excitation de

la Rhodamine B est de 540 nm et celle d’émission est de 625 nm.

L’utilisation de programme gratuit tel qu’imageJ permet de superposer les photos de

fluorescence de la GFP et de la Rhodamine pour rechercher des co-localisations.

II.2.4.3- Méthodes informatiques.

Un certain nombre de programmes bio-informatiques disponibles sur le web

ont été développés pour prédire la présence de peptide signal à partir de la structure primaire

d’une protéine. Il existe iPSORT (http://hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/), MitoProt II 1.101

(http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html), PSORT II (http://psort.ims.u-

tokyo.ac.jp/form2.html), TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) ou SignalP

78

(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Pour réaliser ce genre d’étude il est nécessaire de

connaître la structure primaire de la protéine, cette dernière est disponible sur différents sites

internet tels que http://www.expasy.org, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,

http://www.yeastgenome.org.

79

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

15 20 25 30 35 40 45 50

Fractions

acti

vit

é A

DN

po

lym

éras

e (%

)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Co

nce

ntr

atio

n N

aCl

(M)

Figure 27 : Effet du traitement protéinase K et mitoplaste sur l'activité ADN polymérase.

Des extraits mitochondriaux (18 mg de protéines totales) préparés à partir de mitoplastes (carrés vides),

à partir de mitochondries purifiées après pré-traitement protéinase K (carrés pleins) ou à partir de

mitochondries purifiées non traitées (cercles pleins) ont été déposés sur chromatographie HiTrap SP 5 ml

(GE Healthcare). Un aliquot des fractions éluées (5µl) est testé pour l'activité ADN polymérase en

présence de 10 mM Mg pendant 30 minutes à 37°C comme décrit dans le matériel et méthodes

(paragraphe II.2.2). L'activité est indiquée en pourcentage comparé à 100% de l'activité maximale de la

fractions d'ADN polymérase γ la plus active.

III- RESULTATS.

Deux activités ADN polymérases ont été trouvées et caractérisées par J.P. Lasserre et

P. Lucas successivement au niveau de la mitochondrie de la levure S.cerevisiae correspondant

à l’ADN polymérase # pour un des pics, et à une ADN polymérase non identifiée. Des tests

d’activités enzymatiques ainsi que la microscopie à épifluorescence réalisés dans ces travaux

semblaient montrer que cette seconde ADN polymérase pouvait être de type %. Toutefois

certains résultats n’étaient pas cohérents avec cette hypothèse, et l’identification formelle de

cette ADN polymérase restait à faire. Bien que les contrôles de pureté et d’éventuelles

contaminations réalisés précédemment nous aient convaincus de l’existence d’une seconde

ADN polymérase dans la mitochondrie de S.cerevisiae, nous avons poursuivi des contrôles

supplémentaires afin de s’assurer de la qualité de nos mitochondries. Nous avons alors

poursuivi l’identification de la seconde activité ADN polymérase mitochondriale.

III.1- Purification des mitochondries.

Nous avons décidé de nous affranchir des protéines collées à la membrane externe

mitochondriale ; pour cela, différentes techniques ont été employées :

III.1.1- Traitement protéinase K.

Grâce à un traitement à la protéinase K, nous avons digéré les protéines se trouvant à

l’extérieur de la mitochondrie ou ancrées à la surface de la mitochondrie. Cette technique est

utilisée lors de tests d’import des protéines mitochondriales. Une mise au point des conditions

de digestion a été nécessaire, ainsi la protéinase K a été incubée à différentes concentrations

(0,1, 0,2 et 1 mg/ml) durant 30 minutes en présence des mitochondries purifiées. Après

digestion et extraction des mitochondries, les protéines solubles séparées par chromatographie

Hi Trap SP 5 ml laissent toujours observer les deux activités ADN polymérases. Toutefois, le

traitement protéinase K semble diminuer davantage l’activité ADN polymérase correspondant

à l’ADN polymérase non identifiée comparée à l’activité ADN polymérase due à l’ADN

polymérase # (figure 27). Cette constatation peut s’expliquer par une sensibilité plus grande

de l’ADN polymérase non identifiée aux conditions de manipulation. Cette enzyme semble

être moins stable que l’ADN polymérase #, l’ADN polymérase non identifiée pourrait être

dénaturée au cours des étapes supplémentaires de traitement des mitochondries. En effet,

parallèlement au traitement protéinase K, des mitochondries témoins sans ajout de protéinase

80

K mais subissant les mêmes conditions (temps de manipulation, dilution des mitochondries,

ajout de Péfabloc…) sont analysées selon le même protocole de séparation

chromatographique sur une colonne SP 5 ml. Après dépôt des protéines mitochondriales et

élution des protéines décrochées de la colonne, on constate que l’activité ADN polymérase est

décelée dans des proportions identiques à celle obtenue après traitement des mitochondries à

la protéinase K. Ce qui tend à montrer que la baisse d’activité observée dans les deux cas

n’est pas liée au traitement enzymatique mais plutôt à une fragilité de l’enzyme en fonction

du temps. Ainsi, le traitement à la protéinase K qui maintient la détection des deux ADN

polymérases suggère qu’elles ne sont pas accessibles à la protéinase K, donc que les deux

ADN polymérases sont à l’intérieur de la mitochondrie.

III.1.2- Mitoplastes.

Les mitoplastes peuvent être obtenus par l’action de la digitonine ou par un traitement

osmotique. Le traitement par choc osmotique permet de séparer les mitoplastes des

membranes externes mitochondriales (paragraphe II.1.5). Ainsi, les protéines présentes sur la

membrane externe, dans l’espace inter-membranaire, et d’autant plus les protéines

cytoplasmiques contaminantes sont éliminées des mitoplastes. Cette technique est basée sur

une incubation des mitochondries en présence de solution hypertonique, la membrane interne

étant semi-perméable à l’eau mais pas aux sucres, l’eau présente dans la matrice va traverser

la membrane interne et le mitoplaste va donc se contracter contrairement à la membrane

externe mitochondriale. Les deux membranes étant liées au niveau de point de jonction, des

cassures vont apparaître sur la membrane externe. Un cell disrupteur est utilisé pour séparer

les membranes externes mitochondriales des mitoplastes, culottés par centrifugation. Cette

technique purement mécanique ne nécessite pas de longues mises au point comme c’est le cas

pour le traitement à la digitonine, qui s’il est prolongé peut solubiliser la membrane interne,

ou au contraire ne pas solubiliser suffisamment la membrane externe s’il est trop court.

Toutefois, le traitement osmotique peut laisser des fragments de membranes externes collés

sur la membrane interne, principalement au niveau des zones de contact, ainsi il est nécessaire

d’évaluer ces contaminations de membranes externes ainsi que d’éventuelles contaminations

par des protéines cytoplasmiques.

L’efficacité du traitement osmotique a été évaluée grâce à la réalisation de tests

enzymatiques de protéines marqueurs. Ainsi, une protéine contenue dans la membrane

externe mitochondriale (kynurénine hydroxylase) ainsi qu’une enzyme cytoplasmique

(Glucose-6-phosphate déshydrogénase) ont été choisis. Ces études enzymatiques ont permis

de constater l’absence de contaminations cytoplasmiques dans l’extrait de mitoplastes. En

81

Figure 29 : Images de microscopie électronique des mitochondries et doubles membranes

purifiées sur gradient d'Histodenz. La phase la plus dense correspond aux mitochondries entières

et aux photographies de microscopie électronique de gauche. Les doubles membranes correspondent

à la phase la moins dense et au photographie de droite.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

mitochondries purifiées membrane externe mitoplastes

Acti

vit

é k

ynuré

nin

e h

ydro

xyla

se

(

fmol/

min

/µg d

e p

roté

ine)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Mitochondries purifiées membrane externe Mitoplaste

A

ctiv

ité

G6P

DH

(nm

ole

de

NA

DP

H/s

/µg d

e pro

téin

e)

Figure 28 : Mesure de l'activité Kynurénine hydroxylase et Glucose-6-phosphate déshydrogénase

sur des extraits de mitochondries purifiées, de membranes externes et de mitoplastes. Les tests sont

réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.4.1).

effet, une faible vitesse d’apparition de NADPH est observée lors du test G6PDH au niveau

des mitochondries purifiées, les contaminations cytoplasmiques diminuent ensuite très

fortement après le traitement hypertonique des mitochondries (figure 28). L’étude de l’activité

de la kynurénine hydroxylase met en évidence l’efficacité du traitement par choc osmotique,

en effet la vitesse d’oxydation du NADPH n’est pas mesurable à la suite du traitement. En

conséquence, les mitoplastes sont dépourvus de contaminations cytoplasmiques et de

membrane externe mitochondriale.

Dans ces conditions, les protéines provenant des mitoplastes ont été extraites et

déposées sur colonne Hi Trap SP 5 ml ; 2 pics d’activité ADN polymérases sont encore

séparés sur colonne SP. Nous pouvons constater que contrairement aux marqueurs

cytoplasmiques et marqueurs de la membrane externe qui disparaissent du fait du traitement

osmotique, les activités ADN polymérases sont toujours présentes (figure 27). Ainsi, le

traitement osmotique permet de diminuer fortement les contaminations protéiques provenant

du cytoplasme et de la membrane externe mitochondriale mais s’avère incapable de supprimer

l’une des deux activités ADN polymérase. En conclusion, cette technique nous permet de

constater que les deux ADN polymérases purifiées sont bien mitochondriales.

III.1.3- Purification des mitochondries sur gradient d’Histodenz™ (Sigma-

Aldrich).

Le gradient d’Histodenz™ (équivalent Sigma du Nycodenz®) est la technique réalisée

par Hansen (Hansen et al, 2006) qui leur a permis de montrer que l’ADN polymérase beta

trouvée au niveau de mitochondrie de cœur de bœuf possède une localisation microsomale et

non mitochondriale. Ainsi, nous avons purifié des mitochondries au travers d’un gradient 15-

35 % d’Histodenz™. Après centrifugation nous obtenons deux phases (figure 29), la

première se trouve à 6 centimètres du haut du gradient et d’après la littérature devrait

correspondre aux microsomes. La seconde phase se trouve au 2/3 du tube et d’après la

littérature correspondrait aux mitochondries purifiées entières. L’observation par microscopie

électronique a permis de visualiser dans la seconde phase des magnifiques mitochondries

intactes, et dans la première phase des doubles membranes de mitochondries éclatées (figure

29). Afin de vérifier des contaminations nucléaires et cytoplasmiques possibles, des anticorps

spécifiques d’une protéine nucléaire (Anticorps mab414 dirigés contre la nucléoporine

Nup153) et cytoplasmique (ADE2) ont été utilisés dans des expériences de western-blot.

Toutefois, aucune trace de protéine cytoplasmique ou nucléaire ne fut observée dans l’extrait

correspondant aux mitochondries purifiées sur gradient d’Histodenz!, contrairement aux

extraits cellulaires employés comme contrôles positifs qui mettent en exergue la bonne qualité

82

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

15 20 25 30 35 40 45 50

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AD

N p

oly

mér

ase

acti

vit

é (c

pm

x10 )

Conce

ntr

atio

n d

e N

aCl

(M)

Fractions

55

40

35

25

15

Nucléoporine Ade13 Atp4 VDAC

MW SN MT MW MT MW MT MW MTkDa SN SNSN

Figure 30 : Western blot de mitochondries purifiées sur gradient d'Histodenz (MT) et de

surnageant nucléaire (SN).

Figure 31 : Effet du traitement par gradient Histendenz sur l'activité ADN polymérase.

Un extrait mitochondrial est déposé sur colonne HiTrap 5 ml (GE Healthcare) et les protéines

sont décrochées par un gradient linéaire de sel. L'activité ADN polymérase est mesurée à 10 mM

MgAc (cercle plein) et 50 mM MgAc (cercle vide).

3

des anticorps (figure 30). Des anticorps spécifiques de protéines mitochondriales ont ensuite

été utilisés permettant d’observer des bandes correspondant aux tailles attendues d’ATP4 et

de porine à partir de mitochondries purifiées. Cette observation illustre bien que les phases

obtenues par gradient d’Histodenz ne contiennent pas de protéine cytoplasmique ou nucléaire.

Enfin, les mitochondries récupérées après gradient d’Histodenz ont été lysées et les protéines

mitochondriales sont déposées sur colonne SP 5 ml. Après élutions des protéines fixées, des

tests d’activité ADN polymérase ont permis de constater la présence de nouveau des deux

pics d’activité ADN polymérase (figure 31). Ainsi, nous constatons que cette méthodologie

qui a permis de démontrer la localisation microsomale de l’ADN polymérase " de cœur de

bœuf disparaissant des mitochondries purifiées par ce protocole ne conduit pas à une telle

situation dans les levures puisque les deux pics persistent après purification des mitochondries

de S.cerevisiae sur gradient d’Histodenz™.

Nous pouvons conclure qu’aucun des trois traitements effectués, que ce soit le

traitement à la protéinase K, le traitement osmotique des mitochondries purifiées et le gradient

d’Histodenz™ n’entraînent la disparition des deux pics d’activités ADN polymérase. La

proportion des deux enzymes n’évoluant pas par ailleurs quelque soit le traitement, nous

pouvons raisonnablement penser que les mitochondries purifiées sont très pures et surtout que

la présence de deux activités ADN polymérase n’est pas due à une contamination

cytoplasmique.

III.2- Identification de l’ADN polymérase éluée avec 250 mM NaCl (ADN polymérase NI).

Les analyses précédentes par spectrométrie de masse n’ont pas permis d’identifier

d’ADN polymérase, cela peut être du à une quantité insuffisante de notre protéine d’intérêt

pour l’analyse par MALDI-TOF. Ainsi pour parvenir à identifier notre protéine nous avons

décidé d’améliorer la purification de notre enzyme, d’augmenter les quantités de matériels

utilisées au départ, et changer de techniques d’analyses de spectrométrie de masse.

Nous avons tout d’abord décidé de diminuer le temps entre chaque colonne ; en effet

nous nous sommes aperçus que l’activité ADN polymérase du pic élué à 250 mM est très

sensible à ce paramètre, ce peut être lié à la protéolyse. Ensuite nous avons décidé

d’augmenter la quantité protéique de départ, nous sommes donc partis d’une concentration

protéique huit fois supérieure à celle utilisée précédemment. Le rendement de purification a

été estimé à 1667 fois l’activité ADN polymérase par rapport à la fraction de protéines

83

SwissProt

access

number

SwissProt

Name Name/Function

# distinct

peptides

Coverage

(%)

MW

(kDa)

1 P32266 MGM1_YEAST Dynamin-like GTPase MGM1, mitochondrial 34 40.6 99.2

2 P25374 NFS1_YEAST Cysteine desulfurase, mitochondrial 12 33.0 54.5

3 P13382 DPOA_YEAST DNA polymerase alpha catalytic subunit A 18 16.3 166.8

4 Q6Q560 ISD11_YEAST Protein ISD11, mitochondrial 2 24.5 11.3

5 P39965 SYPM_YEAST Probable prolyl-tRNA synthetase, mitochondrial 3 7.3 65.9

6 P32340 NDI1_YEAST Rotenone-insensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase,

mitochondrial

2 8.0 57.2

7 P38121 DPOA2_YEAST DNA polymerase subunit alpha B 5 9.2 78.8

DPOA 11 MSSKSEKLEK LRKLQAARNG TSIDDYEGDE SDGDRIYDEI DEKEYRARKR

51 QELLHDDFVV DDDGVGYVDR GVEEDWREVD NSSSDEDTGN LASKDSKRKK

101 NIKREKDHQI TDMLRTQHSK STLLAHAKKS QKKSIPIDNF DDILGEFESG

151 EVEKPNILLP SKLRENLNSS PTSEFKSSIK RVNGNDESSH DAGISKKVKI

201 DPDSSTDKYL EIESSPLKLQ SRKLRYANDV QDLLDDVENS PVVATKRQNV

251 LQDTLLANPP SAQSLADEED DEDSDEDIIL KRRTMRSVTT TRRVNIDSRS

301 NPSTSPFVTA PGTPIGIKGL TPSKSLQSNT DVATLAVNVK KEDVVDPETD

351 TFQMFWLDYC EVNNTLILFG KVKLKDDNCV SAMVQINGLC RELFFLPREG

401 KTPTDIHEEI IPLLMDKYGL DNIRAKPQKM KYSFELPDIP SESDYLKVLL

451 PYQTPKSSRD TIPSDLSSDT FYHVFGGNSN IFESFVIQNR IMGPCWLDIK

501 GADFNSIRNA SHCAVEVSVD KPQNITPTTT KTMPNLRCLS LSIQTLMNPK

551 ENKQEIVSIT LSAYRNISLD SPIPENIKPD DLCTLVRPPQ STSFPLGLAA

601 LAKQKLPGRV RLFNNEKAML SCFCAMLKVE DPDVIIGHRL QNVYLDVLAH

651 RMHDLNIPTF SSIGRRLRRT WPEKFGRGNS NMNHFFISDI CSGRLICDIA

701 NEMGQSLTPK CQSWDLSEMY QVTCEKEHKP LDIDYQNPQY QNDVNSMTMA

751 LQENITNCMI SAEVSYRIQL LTLTKQLTNL AGNAWAQTLG GTRAGRNEYI

801 LLHEFSRNGF IVPDKEGNRS RAQKQRQNEE NADAPVNSKK AKYQGGLVFE

851 PEKGLHKNYV LVMDFNSLYP SIIQEFNICF TTVDRNKEDI DELPSVPPSE

901 VDQGVLPRLL ANLVDRRREV KKVMKTETDP HKRVQCDIRQ QALKLTANSM

951 YGCLGYVNSR FYAKPLAMLV TNKGREILMN TRQLAESMNL LVVYGDTDSV

1001 MIDTGCDNYA DAIKIGLGFK RLVNERYRLL EIDIDNVFKK LLLHAKKKYA

1051 ALTVNLDKNG NGTTVLEVKG LDMKRREFCP LSRDVSIHVL NTILSDKDPE

1101 EALQEVYDYL EDIRIKVETN NIRIDKYKIN MKLSKDPKAY PGGKNMPAVQ

1151 VALRMRKAGR VVKAGSVITF VITKQDEIDN AADTPALSVA ERAHALNEVM

1201 IKSNNLIPDP QYYLEKQIFA PVERLLERID SFNVVRLSEA LGLDSKKYFR

1251 REGGNNNGED INNLQPLETT ITDVERFKDT VTLELSCPSC DKRFPFGGIV

1301 SSNYYRVSYN GLQCKHCEQL FTPLQLTSQI EHSIRAHISL YYAGWLQCDD

1351 STCGIVTRQV SVFGKRCLND GCTGVMRYKY SDKQLYNQLL YFDSLFDCEK

1401 NKKQELKPIY LPDDLDYPKE QLTESSIKAL TEQNRELMET GRSVVQKYLN

1451 DCGRRYVDMT SIFDFMLN

Figure 32 : Répartition des peptides de l'ADN polymérase alpha sur la séquence de la protéine.

Tableau 4 : Résultats de l'analyse par spectrométrie de masse MS/MS.

Identification de la sous unité catalytique de l'ADN polymérase alpha (DPOA) et de sa

protéine associée l'ADN polymérase alpha B (DPOA2)

mitochondriales solubles, au cours des étapes chromatographiques et des extraits ont été

donnés à analyser en spectrométrie de masse LC-MS/MS (Liquid Chromatography MS/MS).

Cet appareillage possède un seuil de sensibilité supérieur à celui du MALDI-TOF utilisé pour

les précédentes identifications. Les modes d’ionisation et de mesure de la masse étant

différents, pouvaient donner accès à l’identité de notre protéine d’intérêt.

Après digestion d’une fraction purifiée de l’ADN polymérase inconnue par traitement

trypsique, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, 18 peptides différents (figure 32)

ont été obtenus et répartis sur la séquence linéaire d’une même protéine : la sous unité

catalytique de l’ADN polymérase alpha. Ces peptides sont localisés entre les acides aminés

285 et 1316, incluant le domaine exonucléase (aa 550-750), ainsi que le domaine spécifique

de la famille B des ADN polymérase (aa 800-1250). Un des peptides (aa 1307-1315) recouvre

une partie du motif en doigt de zinc spécifique de la famille B des ADN polymérases (aa

1267-1463) voir la figure 32. Ainsi la seconde activité ADN polymérase identifiée chez la

levure Saccharomyces cerevisiae est une ADN polymérase !.

Lors de cette analyse par spectrométrie de masse, moins d’une dizaine d’autres

protéines ont été trouvées (tableau 4). Ces protéines ont donc été co-purifiées avec l’ADN

polymérase alpha lors des cinq colonnes chromatographiques. Nous pouvons constater que

parmi ces dernières nous trouvons la sous unité accessoire de l’ADN polymérase alpha codée

par le gène POLA2, ainsi que d’autres protéines toutes mitochondriales (Mgm1, Nfs1, Isd11,

Sypm et Ndi1). Cela renforce la pureté des mitochondries en effet aucune protéine non

mitochondriale, à l’exception de l’ADN polymérase alpha et sa sous unité accessoire, n’a été

trouvée dans l’analyse par spectrométrie de masse et ce malgré la forte sensibilité de la LC-

MS/MS.

Nous avons enfin réussi à identifier la seconde activité ADN polymérase

mitochondriale grâce à l’amélioration des conditions de chromatographie, grâce à l’utilisation

d’outils spectrométriques plus sensibles et enfin grâce à une augmentation du matériel

mitochondrial utilisé. Après l’ensemble de toutes ces analyses, des propriétés physico-

chimiques, ou enzymatiques, aux interruptions géniques et le séquençage d’Edman, nous

avons pu déterminer que la seconde activité ADN polymérase mitochondriale correspond à

l’ADN polymérase !. Les contrôles de pureté ont permis de vérifier qu’il ne s’agit pas d’une

contamination cytoplasmique ou nucléaire. Le couple d’ADN polymérases présentes dans la

mitochondrie de levure S.cerevisiae est donc alpha / gamma contrairement au couple présent

chez les trypanosomatides ("/#) toutefois le caractère spécial du kinétoplaste peut expliquer

cette différence.

84

Image 1 Image 2

Figure 33 : Image de microscopie à épifluorescence

DIC ou

Nomarski DAPI MitoTraker GFP Fusion

POL1-GFP

WT

x 2.3

A

B

C

Figure 34 : Image de microscopie confocale

III.3- Microscopie à fluorescence.

Suite à l’identification de la seconde activité ADN polymérase nous avons tenté de

visualiser la double localisation mitochondriale et nucléaire de l’ADN polymérase alpha. Pour

cette nouvelle étude de microscopie à épifluorescence, nous avons utilisé une souche

possédant le gène ADN polymérase alpha étiqueté avec le gène codant pour la GFP intégré au

plasmide (Green Fluorescent Protein). Le gène codant pour la GFP est inséré en aval du gène

POL1 et dans le même cadre de lecture. Pour observer la fluorescence de la GFP nous avons

utilisé un microscope à épifluorescence. La protéine fluorescente visualisée correspond soit à

une protéine entière ou éventuellement dégradée du coté N-terminal.

L’une des premières constatations est que la majorité de la fluorescence est contenue

dans le noyau des levures observées (figure 33) ce qui est logique du fait que l’ADN

polymérase alpha est une des ADN polymérases majoritaires dans le noyau. Toutefois, nous

pouvons remarquer un faible signal de fluorescence localisé dans la mitochondrie (figure 33

image 2). Cette fluorescence est difficile à observer en raison d’un phénomène de photo-

blanchiment qui se produit très rapidement après le début d’excitation des chromophores par

le rayon laser. Certaines photos avec une mise au point rapide du microscope ont tout de

même permis d’observer cette faible fluorescence dans les mitochondries. Bien que la

fluorescence soit faible, elle est significative.

Un autre problème est intervenu lors de l’utilisation du marqueur des mitochondries

(ou mitotracker). Notre GFP est excité avec un laser bleu à 490 nm et émet de la fluorescence

à 510 nm, notre mitotracker (Rhodamine B) a été choisi pour éviter le chevauchement des

spectres d’excitation des deux molécules. La rhodamine B une fois excitée à 540 nm à la

capacité d’émettre à 625 nm (dans le rouge). Toutefois, si l’on observe le mitotracker à 625

nm après avoir excité les fluorochromes à 540 nm, et que l’on repasse à une longueur d’onde

d’excitation de 475 nm, le mitotracker émet encore de la fluorescence. Ce phénomène est

certainement du à la mauvaise sélectivité des longueurs d’ondes d’excitation. Pour remédier à

ces différents problèmes, une modification de la concentration de mitotracker utilisée ainsi

qu’un changement du microscope peuvent être envisagés pour faire les observations.

Dans le but d’observer la double localisation de l’ADN polymérase !-GFP, des

observations à l’aide d’un microscope confocale Laser Leica SP5 ont été réalisées en présence

de Rhodamine B. Néanmoins, la fluorescence parasite du mitotracker à la longueur d’onde de

l’émission de la GFP n’a pas permis de constater des résultats pertinents. Enfin, l’utilisation

de MitoTracker®Orange CMTMRos avec des cellules sauvages permet de constater l’absence

85

de fluorescence parasite à la longueur d’onde d’emission de la GFP (figure 34A). Des

expériences réalisées en présence de ce MitoTracker et de levure POL1-GFP permettent

d’observer une colocalisation de la fluorescence due au MitoTracker (excité à 554 nm) qui

émet à 574 nm et de la fluorescence due à la GFP en périphérie de la cellule (figure 34C). La

souche POL1-GFP présente donc une fluorescence nucléaire mais aussi au niveau des

mitochondries.

86

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

12 17 22 27 32 37 42 47

Fractions

Act

ivit

é A

DN

poly

mér

ase

(cpm

)

Figure 35 : Recherche de deux activités ADN polymérases dans les mitochondries de

Schizosaccharomyces pombe. 5 µl de chaque fraction obtenue sur cette colonne HiTrap SP 5 ml sont

testés en activité ADN polymérase à 10 mM MgAc. Les mitochondries ont été au préalable préparées

selon un protocole identique à celui de S.cerevisiae.

IV- DISCUSSION/CONCLUSION.

Après de multiples méthodes pour améliorer la pureté des mitochondries, et après

évaluation des contaminations cytoplasmiques par Western-blot et activité enzymatiques,

nous pouvons dire que les mitochondries utilisées pour purifier les deux ADN polymérases

mitochondriales ne contiennent pas de contaminants cytoplasmiques ou nucléaires. Après

avoir augmenté la quantité de matériel mitochondrial, amélioré les conditions des nombreuses

colonnes chromatographiques utilisées, et enfin changé d’appareil d’analyses de spectrométrie

de masse, nous avons pu identifier la seconde activité ADN polymérase présente dans la

mitochondrie de S.cerevisiae.

L’identification d’une seconde activité ADN polymérase présente dans la

mitochondrie s’oppose à un dogme établi depuis longtemps qui est que la mitochondrie ne

contient qu’une seule ADN polymérase : l’ADN polymérase #, et que cette enzyme est

multifonctionnelle et capable de répliquer et réparer l’ADN mitochondrial.

Parmi les eucaryotes, il a été montré chez les trypanosomatides la présence de

plusieurs ADN polymérases dans le kinétoplaste. Deux ADN polymérases de type " et quatre

polymérases de la famille A (famille de l’ADN polymérase gamma) sont trouvées chez

Trypanosoma brucei (Saxowsky et al, 2003). Ainsi, dans cet ordre de parasite deux types de

polymérases différents ("/#) sont trouvés dans cette organelle. La découverte de deux

polymérases dans la mitochondrie de la S.cerevisiae n’est pas une exception, on peut se poser

la question de savoir si d’autres levures présentent deux ADN polymérases ? Une analyse

rapide par chromatographie, mais sans identification par spectrométrie de masse, a mis en

évidence la présence de deux ADN polymérases dans des mitochondries de

Schizosaccharomyces pombe (figure 35). En effet de façon similaire à S.cerevisiae, deux pics

d’activité ADN polymérases sont séparés par colonne SP 5 ml (GE Healthcare), avec les

mêmes propriétés chromatographiques que chez la levure S.cerevisiae. Ainsi, chez deux

levures, deux ADN polymérases ont été trouvées dans la mitochondrie.

Est-ce que la présence de multiples ADN polymérases dans la mitochondrie est

générale chez les eucaryotes et quand est-il des mitochondries animales ? Suite à la

découverte d’ADN polymérase " dans le kinétoplaste de trypanosomatides (Torri et Englund,

1995), un article traitant de la découverte d’une seconde activité ADN polymérase de type

beta dans la mitochondrie de cœur de bœuf a été publié (Nielsen-Preiss et Low, 2000). Ainsi

cet article mettait en évidence la présence du même couple d’ADN polymérases dans la

mitochondrie que chez les trypanosomatides ("/#). Cependant, un second article contredisant

87

la localisation mitochondriale de cette ADN polymérase " a imposé d’état de fait la nécessité

de contrôler la pureté du matériel mitochondrial utilisé (Hansen et al, 2006). La mitochondrie

est un réseau au travers de la cellule qui est enchevêtré avec le réticulum endoplasmique

(R.E). Il arrive que lors de la purification des mitochondries des fragments de R.E. restent

associés aux mitochondries. Dans l’article de Hansen, c’est grâce à l’étape de purification sur

gradient de Percoll ou du Nycodenz (Histodenz™, Sigma-Aldrich) que la localisation

microsomale de l’ADN polymérase " fut constatée. Le traitement des mitochondries à la

protéinase K est une technique permettant de digérer les protéines accrochées sur la face

externe de la mitochondrie, cette technique est couramment utilisée pour étudier l’import des

protéines (Akbari et al, 2008). Le traitement par choc osmotique quant à lui permet de

supprimer la membrane externe mitochondriale par conséquent il peut permettre d’éliminer

les contaminants cytoplasmiques qui auraient pu ne pas être digérés par la protéinase K.

Malgré l’élaboration de ces deux traitements qui ont permis de montrer la pureté des

mitochondries, nous avons voulu réaliser la purification de mitochondries sur gradients

d’Histodenz™. L’ensemble des résultats observés nous permettent de conclure que la seconde

ADN polymérase identifiée dans la mitochondrie ne correspond pas à une contamination

microsomale, nucléaire ou cytoplasmique.

Contrairement aux trypanosomatides et aux levures S.cerevisiae et S.pombe, chez les

animaux, à l’heure actuelle, une seule ADN polymérase est caractérisée dans les

mitochondries, l’ADN polymérase gamma. Néanmoins, les difficultés inhérentes aux cultures

de cellules animales conduisant à de faibles quantités de mitochondries sans doute corrélées à

la représentation minoritaire des ADN polymérases de l’ensemble de la cellule n’ont

probablement pas rendu possible l’éventuelle découverte d’une autre ADN polymérase dans

les mitochondries animales. Ainsi il est possible que plusieurs ADN polymérases soient

également présentes dans la mitochondrie humaine.

Le but de ce travail était surtout d’identifier la seconde activité ADN polymérase dans

la mitochondrie de la levure Saccharomyces cerevisiae. Les résultats obtenus par J.P.Lasserre

ne permettaient pas d’identifier la seconde activité ADN polymérase mitochondriale.

Toutefois, les propriétés semblait indiquait une ADN polymérase de type %. Les expériences

d’interruption génique ont permis de déterminer que l’ADN polymérase éluée en présence de

250 mM NaCl ne correspondait pas à un produit du gène MIP1, et correspondait à l’une des

trois ADN polymérase réplicatives de la famille B dont la délétion du gène est létale (!, $ et

%). L’analyse par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF n’avait pas permis d’identifier

la seconde ADN polymérase mitochondriale. Ainsi, dans le but de résoudre cette

88

identification, la quantité de protéines mitochondriales utilisées pour la purification a été

augmentée d’un facteur huit. Les conditions de chromatographie ont été améliorées en

particulier en raccourcissant les temps entre chaque colonne pour diminuer les éventuelles

dégradations par protéolyse. Enfin l’utilisation d’un appareillage plus sensible et différent

(LC-MS/MS) a permis la lecture de 18 peptides correspondant à l’ADN polymérase alpha.

Ainsi contrairement au couple d’ADN polymérases présent dans le kinétoplaste de T.brucei

("/#), chez la levure S.cerevisiae, le couple d’ADN polymérase présent dans la mitochondrie

est de type !/#. Deux ADN polymérases ont été purifiées par chromatographie dans la

mitochondrie de S.pompe qui raisonnablement correspondent à l’ADN polymérase # active à

50 mM MgAc et à l’ADN polymérase ! active à 10 mM MgAc. On peut considérer qu'il

s'agit d'une généralité chez les levures. Enfin, nous pouvons nous interroger sur la possibilité

d’un couple d’ADN polymérases !/# dans les mitochondries humaines.

Dans le but de visualiser la localisation mitochondriale de l’ADN polymérase !, des

expériences de microscopie à épifluorescence ont été réalisées sur des levures S.cerevisiae

exprimant l’ADN polymérase ! étiquetée avec la GFP. L’observation de la fluorescence met

en évidence une localisation de la protéine dans le noyau ainsi que des spots situés en

périphérie de la cellule dans des zones qui pourrait correspondre aux mitochondries.

Toutefois, le mitotraker (Rhodamine B) utilisé entraîne une réaction parasite à la longueur

d’onde d’excitation de la GFP, et empêche une détermination précise de la localisation de

protéine de fusion ADN polymérase-GFP dans la cellule.

Dans le but de visualiser la localisation de l’ADN polymérase alpha dans la

mitochondrie, plusieurs approches pouvaient être réalisées. Pour s’affranchir du problème

causé par la Rhodamine, il est possible soit d’utiliser un microscope capable d’exciter des

fluorophores à une longueur d’onde précise tel que le microscope (Confocal multiphoton

FLIM/FCS, Leica DMIRE2 TCS SP2 AOBS) du service de microscopie confoncale de la

plateforme de l’INSERM de l’institue Magendie. Il est possible aussi d’utiliser un filtre

barrière de 515 à 560 nm (Velours et al, 2002), ou encore de changer de Mitotracker (en

espérant qu’il ne soit pas excité à la longueur d’onde de la GFP) par exemple Mito-ID™

(Enzo) ou le Mitotracker® Red CMXRos (Invitrogen). Nous pouvions aussi utiliser des

protéines dont la localisation est exclusivement mitochondriale comme marqueur de la

mitochondrie par exemple la citrate synthase, étiquetée avec la GFP. Ensuite, dans ces

cellules exprimant cette protéine mitochondriale fluorescente marqueur, il serait possible de

cloner le gène POL1 dans un vecteur centromérique (en faible nombre de copie) ou intégratif.

Par recombinaison homologue et à l’aide de plasmide intégratif, le gène POL1 suivit d’un

89

fluorophore pourrait être inséré dans le génome. Cette dernière option permettrait d’obtenir

des résultats optimaux, en effet l’observation de la mitochondrie à l’aide d’une protéine

mitochondriale étiquetée GFP permettrait de s’affranchir de la Rhodamine B et de ne plus

dépendre du potentiel de membrane (comme c’est le cas pour la Rhodamine B). Enfin, les

cellules pourraient être fixées et des produits anti-photoblanchiement pourraient être utilisés.

Nous avons décidé de réaliser des observations par utilisation d’un microscope

confocal dans un premier temps, puis d’utiliser ce matériel en changeant de marqueur

mitochondrial. L’utilisation de MitoTracker®Orange CMTMRos a permis de marquer les

mitochondries des levures et une colocalisation du Mitotracker et de l’ADN polymérase !-

GFP est constatée (figure 34). Une forte fluorescence à 510 nm est observée au niveau du

noyau des cellules par comparaison avec le marquage au DAPI, néanmoins de la fluorescence

due à la GFP est trouvée en foci à la périphérie des cellules dans le cytoplasme. En

conclusion, les expériences de microscopie confocale ont permis de mettre en évidence la

double localisation de l’ADN polymérase alpha, nucléaire et mitochondriale.

La découverte d’une ADN polymérase ! dans la mitochondrie entraîne une double

localisation de la protéine dans le noyau et la mitochondrie. Les cellules eucaryotiques ont

mis aux points différents mécanismes pour adresser des protéines avec des fonctions

identiques ou similaires à différentes localisations intracellulaires. Avant tout, il est nécessaire

de dire que des analyses bioinformatiques ont permis de constater la présence d’une séquence

d’adressage au noyau en position 97 de la protéine, un motif monopartite KRKK; il s’agit

d’une séquence d’adressage nucléaire (Feng et al, 2000). Nous pouvons aussi remarquer que

les peptides trouvés par la spectrométrie de masse recouvrent une zone comprise entre les

acides aminés 285 à 1316. Nous pouvons donc nous interroger sur les mécanismes permettant

le double adressage de l’ADN polymérase ! dans le noyau et la mitochondrie.

Le mécanisme le plus commun est l’expression d’isoformes par des gènes différents.

Ces gènes peuvent être homologues et peuvent être obtenus à la suite d’une duplication du

gène suivie d’une divergence de séquence. Inversement, des gènes non-homologues peuvent

avoir évolué indépendamment et convergé. Il a été montré que l’ADN topoisomérase I

humaine nucléaire est codée par son propre gène sur le chromosome 20 (20q12-q13.1) et que

l’ADN topoisomérase I mitochondriale est codée par le chromosome 8 (8q24.3). La protéine

mitochondriale est différente au niveau de l’extrémité N-terminale, la protéine est plus courte

que son homologue nucléaire (Zhang et al, 2007), de plus il a été montré qu’elle possède une

séquence d’adressage mitochondrial (Zhang et al, 2001). Cette séquence semble être absente

au niveau de la forme nucléaire, cette différence peut s’expliquer par une grande variabilité de

90

séquence de la partie N-terminale de la protéine avec seulement 4 % d’homologie (Zhang et

al, 2007). Enfin, une séquence d’adressage au noyau est trouvée au niveau de l’extrémité N-

terminale de la forme nucléaire, alors qu’elle est absente pour la forme mitochondriale. En ce

qui concerne le gène POL1, aucune duplication du gène n’a été observée au niveau du

génome de Saccharomyces cerevisiae, le gène POL1 est trouvé sur le chromosome 14 de la

position 430089 à la position 434495. La duplication ne permet pas d’expliquer le double

adressage de l’ADN polymérase alpha.

De plus en plus de protéines possédant de multiples localisations intracellulaires et

codées par un seul gène sont identifiées. Plusieurs mécanismes permettent d’expliquer

comment un seul gène peut conduire à l’obtention de protéines localisées dans différents

compartiments. L’une des explications permettant de l’expliquer est qu’un ou plusieurs

transcrits ARN peuvent être produits à partir d’un seul gène, pouvant conduire à plusieurs

protéines, chacune possédant des séquences d’adressage différentes. Des transcrits ARN

différents peuvent être dus à plusieurs phénomènes : soit une initiation de la transcription à

des sites différents dans le même cadre de lecture, soit des maturations d’ARNs conduisant à

des ARNs différents (épissage, caping, queue poly-A, édition). Il a été montré chez

S.cerevisiae que pour l’histidine (Natsoulis et al, 1986, Chiu et al, 1992) et la valine ARNt

synthétases (Chatton et al, 1988) et de nombreuses autres protéines (la fumarase, !-

isopropylmalate synthase, malonyl-coenzyme A décarboxylase), les isoformes codées par le

plus long transcrit sont localisées dans la mitochondrie tandis que les formes codées par le

transcrit le plus court sont localisées dans le cytoplasme. En ce qui concerne le double

adressage de protéines dans le noyau et la mitochondrie, les protéines N(2),N(2)-

dimethylguanosine ARNt méthyltransférase (Rose et al, 1992) sont codées par deux formes

d’ARN différents et la forme de l’ARN la plus courte est adressée au noyau tandis que la plus

longue est adressée à la mitochondrie.

L’épissage alternatif d’un ARN non mature permet donc d’adresser des protéines à

la mitochondrie. Les ARNs synthétisés à partir du gène PTC7 subissent un épissage alternatif

(Juneau et al, 2009) qui permet de produire deux transcrits différents capable d’adresser une

protéine dans la mitochondrie pour l’ARN épissé et dans le noyau pour l’ARN non épissé.

Une information à relever est que seulement 5% des gènes dans le génome de la levure

Saccharomyces cerevisiae possèdent un intron, donc pouvant potentiellement être épissés. Le

gène POL1 en est dépourvu.

L’adressage d’une protéine codée par un gène unique dont le transcrit n’est pas

modifié peut être complexe et concerner plusieurs compartiments en fonction d’autres

mécanismes de régulation d’adressage. Par exemple, les phénomènes d’initiation de la

91

traduction à des sites différents permettent de produire plusieurs protéines dont les différences

d’adressage se trouvent concentrées au niveau de l’extrémité N-terminale (a.a. 1 à 80). La

protéine CCA1 (ATP [CTP] : tRNA nucléotidyltransférase) et la cystéine désulfurase Nfs1

sont des exemples qui mettent en évidence la possibilité d’initier la synthèse protéique au

niveau d’un AUG différent dans le même cadre de lecture (Wolfe et al, 1994, Naamati et al,

2009). Si une seule protéine est produite à partir d’un seul gène, il est encore possible qu’elle

possède une double localisation mitochondriale et nucléaire pourtant cette protéine possède

les deux séquences d’adressage l’une pour le noyau, l’autre pour la mitochondrie. Différents

mécanismes tels que des changements de conformations, ou l’accessibilité aux séquences

d’adressage ou encore des modifications post-traductionnelles ou des compétitions de

séquences d’adressage existent et permettent des changements de localisation de protéines.

C’est le cas de l’Adénylate kinase Aky2 qui change de localisation après dénaturation

(Karniely et Pines, 2005). D’autres protéines telles que l’Apn1 nécessite la présence d’autres

protéines pour être importée dans la mitochondrie. Ainsi Apn1 est transloquée à la

mitochondrie avec Pir1p. L’absence de la protéine Pir1p entraine une augmentation de la

localisation nucléaire de la protéine, et une réduction simultanée de l’adressage mitochondrial

(Vongsamphanh et al, 2001). Il est suggéré que Pir1p en interagissant avec Apn1 entraîne le

masquage de la séquence d’adressage nucléaire. Ainsi nous pouvons constater qu’il existe de

nombreux mécanismes pour modifier la localisation d’une protéine ou pour adresser la

protéine à la fois dans le noyau et la mitochondrie.

Une recherche rapide en ce qui concerne l’ADN polymérase alpha nous permet de

constater que la zone de recouvrement des 18 peptides analysés par spectrométrie de masse se

trouve entre les acides aminés 285 à 1316. Soit la protéine ADN polymérase ! dans le

compartiment mitochondrial est composée de 1468 a.a. comme dans le noyau, et les peptides

compris entre les acides aminés 1 à 284 n’ont pas pu être détectés expérimentalement, soit la

protéine mitochondriale est plus courte que la forme nucléaire, ce qui pourrait s’expliquer par

l’un des phénomènes cités précédemment (initiation de la traduction ou de la transcription à

des sites différents, modification post traductionnel). En ce qui concerne l’étude de la

localisation mitochondriale de l’ADN polymérase alpha, l’utilisation de logiciel comme

Mitoprot II ou PSORT a permis de faire des observations intéressantes. Nous ne pouvons pas

constater de localisation mitochondriale avec les logiciels Mitoprot II (probabilité d’adressage

à la mitochondrie de 1,75%), PSORT (4,3% d’adressage à la mitochondrie) pour l’ADN

polymérase alpha entière. Toutefois, il existe des protéines mitochondriales dont l’analyse par

ces logiciels indique des résultats non favorables à une localisation mitochondriale, par

exemple la protéine Hmi1p (Mitoprot : 7% ; PSORT : 17,4%) ou Mtf1 (Mitoprot : 20% ;

92

PSORT : 8,7 %). Si l’initiation de la traduction se déroule au deuxième AUG, les scores de

localisation mitochondriale de la protéine ainsi tronquée des 112 premiers acides aminés

(nommée Iso!1) est plus élevée (Mitoprot : 46% ; PSORT : 13%). De même pour le troisième

AUG (Mitoprot : 30,6% ; PSORT : 43,5%) aboutissant à la synthèse d’une protéine

dépourvue des 254 premiers acides aminés (nommée Iso!2).

Les séquences d’adressage mitochondriales sont caractérisées par une hélice alpha

amphiphile, c'est-à-dire composée d’un groupe d’acides aminés hydrophobes formant la base

de l’hélice alpha, et d’un groupe d’acides aminés hydrophiles positifs ou hydroxylés. Elles

comptent communément de 20 à 60 acides aminés et sont en général clivées par une peptidase

après import dans la mitochondrie. Elles se trouvent généralement au niveau de l’extrémité N-

terminale des polypeptides bien qu’il existe un cas d’une séquence se trouvant à l’extrémité

C-terminale (Lee et al, 1999). Les logiciels iPSORT et MITOPROT permettent de chercher

les séquences d’adressage mitochondriale ; appliqués aux trois isoformes (protéine entière,

Iso!1 et Iso!2) de l’ADN polymérase alpha, une séquence potentielle de clivage lors

d’import à la mitochondrie est trouvée uniquement pour l’isoforme Iso!2, avec les scores

indiqués ci-dessus. L’extrémité N-terminale des isoformes de l’ADN polymérase peut être

représentée par la méthode de wheel plot indiquant une hélice alpha amphiphile si elle est

présente. Nous pouvons constater par cette représentation qu’une telle hélice est moins

marquée comparée à celle obtenue avec les 18 premiers acides aminés de la sous unité alpha

de l’ATP synthase, ou de la polymérase gamma de levure. Néanmoins les scores obtenus pour

l’ADN polymérase alpha de la levure de fission, S.pombe étant très importants tant avec

mitoprot (probabilité d’import à la mitochondrie 0,91 avec un site de clivage potentiel au

résidu 29) ou PSORTII (21,7% mitochondriale) suggèrent que la présence de deux acides

aminés acides en position 6 et 9 parmi les premiers résidus peuvent diminuer les scores

d’adressage mitochondrial obtenus pour l’ADN polymérase alpha intacte (voir figure annexe

chapitre I). Toutefois si l’observation de l’extrémité N-terminale de l’isoforme Iso!1, qui

serait traduite à partir du second résidu méthionine de l’ADN polymérase alpha indique

également des résidus chargés positivement et hydroxylés et l’absence d’acide aminé acide, la

conservation de résidus hydrophobes constitutifs de l’hélice alpha est moins évidente. Il en est

de même pour l’isoforme Iso!2 qui serait traduite à partir du troisième résidu méthionine

avec cependant un résidu acide (D298). Il faut noter néanmoins que ces résidus méthionines

sont éloignés dans la séquence (M113 et M285), et ne sont pas parmi les 80 premiers résidus

ni conservés. Une représentation nommée HCA (Hydrophobic Cluster Analysis) permet

d’observer les clusters hydrophobes d’une protéine et permet de prédire des structures

secondaires des protéines comme des feuillets " et hélices !. La représentation HCA ne

93

Figure 36 : profil HCA de l'ADN polymérase alpha.

Technique de prédiction de cluster d'hydrophobicité, elle pourrait permettre de trouver des hélices alpha

et feuillet beta d'après la séquence primaire de la protéine.

http://smi.snv.jussieu.fr/hca/hca-form.html

semble pas mettre clairement en évidence de secteur hydrophobe pouvant correspondre à une

hélice !"quelle que soit l’isoforme de l’ADN polymérase ! (figure 36), sauf éventuellement

du coté N-terminal que l’on retrouve pour un ensemble de séquences comparées de

polymérases alpha de levures et de champignons. En conclusion, ces études réalisées in-silico

ne semblent pas mettre en évidence de séquence d’adressage mitochondriale classique, malgré

un score important (40 %) pour la protéine tronquée du coté N-terminal, dont la méthode

HCA permet de visualiser qu’il correspond à un domaine très riche en acides aminés acides.

Soit l’ADN polymérase alpha possède une séquence d’adressage coté N-terminal ou interne,

non encore identifiée, ou bien son import dépend d’autres paramètres inconnus.

Pour conclure sur l’import de l’ADN polymérase alpha dans la mitochondrie, de

multiples possibilités pourraient expliquer la double localisation de l’ADN polymérase alpha

dans le noyau et la mitochondrie. Néanmoins il serait possible de déterminer quel est le

moyen qu’utilise la cellule pour permettre la double localisation de l’ADN polymérase !. Il

serait intéressant par exemple d’étudier les transcrits ARNs du gène POL1 par RT PCR, cela

permettrait de répondre à des questions sur une éventuelle initiation différentielle de la

transcription. Il serait aussi intéressant de réaliser de nouveau un séquençage N-terminal par

dégradation d’Edman de l’ADN polymérase alpha purifiée à partir de mitochondrie, cela

permettrait de déterminer les premiers acides aminés au niveau de l’extrémité N-terminale de

l’ADN polymérase alpha et pourrait répondre à une éventuelle initiation différentielle de la

traduction ou à une éventuelle modification post-traductionnelle (un clivage par exemple).

Une approche par le biais d’anticorps dirigés contre des domaines différents de la

polymérase est en cours, par expression dans la bactérie de deux domaines de cette protéine

compris entre les acides aminés 1-155 et 281-470. Ces anticorps devraient reconnaître la

forme nucléaire intacte tous les deux, tandis que seul le second devrait reconnaître la forme

mitochondriale si l’ADN polymérase alpha est tronquée dans ce compartiment.

Parmi les protéines identifiées en même temps que l’ADN polymérase ! lors de

l’analyse par spectrométrie de masse, nous pouvons trouver la sous unité B de l’ADN

polymérase !, cette protéine a été co-purifiée avec la sous-unité catalytique. L’ADN

polymérase ! dans le noyau est un complexe tétramérique composé de la sous unité

catalytique, de la sous unité accessoire et de deux sous unités primase. Nous pouvons

remarquer l’absence des deux sous unités primase dans les résultats d’analyses. Ainsi, soit ces

sous-unités ont été perdues au cours de la purification, soit l’ADN polymérase alpha dans la

mitochondrie est dimérique et dépourvue de sous unité primase. L’absence des sous unités

primase est cohérente avec l’abscence de publication traitant de la présence de primase dans

94

Figure 37 : Homologies structurales entre la glycine ARNt synthétase (en jaune) et la

sous unité B de l'ADN polymérase γ humaine (en bleu).

la mitochondrie depuis 1985 (Wong et al, 1985). En effet, l’initiation de la réplication au

niveau de l’origine de réplication mitochondriale se ferait grâce à une amorce ARN provenant

de la coupure d’un ARN synthétisé par l’ARN polymérase mitochondriale (RPO41) au niveau

du brin lourd. En ce qui concerne l’initiation de la réplication du brin léger, le mécanisme

n’est pas connu, toutefois il n’est pas exclu qu’une primase soit impliquée.

La découverte de la seconde activité ADN polymérase bouleverse le dogme de

l’unicité de l’ADN polymérase gamma, seule ADN polymérase connue présente dans la

mitochondrie. Au niveau du noyau, la réplication nécessite trois ADN polymérases pour

réaliser la synthèse du brin sens et anti-sens et une multitude d’autres ADN polymérases sont

impliquées dans les processus de réparation ou de synthèse en cas de lésions de l’ADN. L’une

des questions que l’on peut se poser est le rôle de l’ADN polymérase ! dans la mitochondrie.

D’après les propriétés de l’ADN polymérase ! isolée du noyau, cette enzyme semble moins

processive que l’ADN polymérase #. Ainsi, peut être que l’ADN polymérase ! est impliquée

dans la réparation de l’ADN ; ou bien, elle peut être impliquée dans l’initiation de la

réplication au niveau du brin retardé par exemple en coopération avec une ARN polymérase.

Enfin, la découverte d’une seconde ADN polymérase permet de nous interroger sur

l’existence d’un complexe putatif de réplication. Nous pouvons remarquer qu’une Proline

ARNt synthétase est trouvée parmi les protéines copurifiées avec l’ADN polymérase alpha et

sa sous unité accessoire. La présence de cette protéine avec notre protéine d’intérêt après cinq

colonnes chromatographiques peut s’expliquer soit par des propriétés chromatographiques

très proches, soit par une possible interaction entre les deux protéines. Il a été montré que

l’ADN polymérase gamma humaine interagit avec l’ADN mitochondrial grâce à sa sous unité

accessoire #B (voir introduction partie V.2.3). Des similarités structurales ont été mises en

évidence entre la sous unité #B et des aminoacyl ARNt synthétases (figure 37). Dans la

levure, aucun homologue de la sous unité #B humaine n’a été identifiée (Lucas et al, 2004)

toutefois la reconnaissance de l’origine de réplication pourrait être réalisée par une aminoacyl

ARNt synthétase. Ainsi, la présence de cette proline ARNt synthétase avec l’ADN

polymérase alpha pourrait s’expliquer par l’existence d’une interaction fonctionnelle entre ces

deux protéines, peut être au sein d’un complexe de réplication. Enfin, nous pouvons nous

interroger sur de possibles interactions entre les ADN polymérase # et ! au sein d’un

complexe et le rôle que ces protéines jouent dans la réplication de l’ADN mitochondrial de

S.cerevisiae.

L’étude d’un complexe possible de réplication fera l’objet du prochain chapitre où

sont décrits les essais de purification et de caractérisation d’un complexe de réplication dans

95

la mitochondrie de S.cerevisiae. Les interactions possibles entre les participants putatifs au

complexe ont été testées in vitro par des colonnes d’affinités.

96

CHAPITRE II :

Etude du complexe de réplication mitochondrial de la

levure S.cerevisiae

97

CHAPITRE II :

Etude du complexe de réplication

mitochondrial de la levure S.cerevisiae

I- INTRODUCTION.

Lors de l’étude d’une protéine d’intérêt, l’un des principaux axes de travail est l’étude

des interactions mettant en jeu cette protéine. Pour déterminer le rôle d’une protéine, il est

nécessaire de connaître les protéines avec lesquelles elle pourrait interagir. Dans le noyau, les

ADN polymérases sont des enzymes clés impliquées dans les processus de réplication et de

réparation qui permettent le maintien de l’intégrité de l’ADN en interagissant avec de

nombreuses protéines et sont organisées sous forme d’un complexe protéique de réplication

ou réplisome. Dans le chapitre I, nous avons mis en évidence une seconde activité ADN

polymérase dans la mitochondrie de levure Saccharomyces cerevisiae, cette protéine pourrait

être impliquée dans l’initiation de la réplication ou la réparation de l’ADN mitochondrial,

l’ADN polymérase # quant à elle serait impliquée dans la réplication. Ainsi, avec quelles

protéines interagit cette seconde ADN polymérase ! parmi les protéines impliquées dans le

réplisome mitochondrial? Dans quels processus, la réplication ou la réparation, ou bien les

deux ? Y a-t-il une spécialisation de chacune de ces deux enzymes ? Existe-t-il un réplisome

dans la mitochondrie tout aussi complexe que dans le noyau ? Et enfin, est ce que ces deux

enzymes font partie d’un complexe de réplication mitochondrial.

Très peu d’études concernant le réplisome mitochondrial ont été réalisées jusque là,

certainement de part la difficulté d’obtenir un matériel protéique en quantité suffisante. En

m’inspirant d’une technique mise au point par Malkas et collaborateurs (Malkas et al, 1990),

dans lequel le réplisome nucléaire a été bien étudié chez des cellules de lignées humaines

différentes, des études du réplisome mitochondrial ont été réalisées.

Dans l’introduction à ce chapitre, seront abordées les notions de complexes et

d’interactions, ainsi que les différentes techniques d’études des complexes, puis je ferai une

présentation bibliographique des protéines faisant partie du réplisome.

I.1- Les complexes protéiques

98

Espèces Articles de référence Moyenne des interactions Echelle

S.cerevisiae Uetz et al.

Ito et al.

Ho et al.

Gavin et al.

Stumpf et al.

28472

14940

33234

25391

25229

26650-30460

13500-16650

31750-34810

23280-27710

24100-26440

D.melanogaster Giot et al.

Stanyon et al.

Fromstecher et al.

Stumpf et al.

75506

2505545

211877

74336

72700-78400

2192900-2843800

180419-248640

71700-77100

C.elegans Li et al.

Stumpf et al.

242578

240544

221850-265700

220030-263270

H.sapiens Stelzl et al.

Rual et al.

Stumpf et al.

646557

631646

672918

588990-706640

564460-703830

625170-722670

Tableau 5: Les interactômes chez S.cerevisiae, D.melanogaster, C.elegans, H.sapiens.

Tableau compilant les analyses des interactômes chez ces quatre organismes, et rassemblant le nombre

moyens d'interactions comptées dans ces organimes par des scientifiques différents.

Après le séquençage d’une multitude de génomes allant des procaryotes à des

organismes eucaryotes, un des apports principaux de la biochimie est la détermination des

fonctions associées aux protéines codées par différents gènes. Une technique générique fut

mise au point par Séraphin B et collaborateur (Rigaut et al, 1999) qui a permis de caractériser

l’interactôme chez la levure (Gavin et al, 2002). La plupart des protéines réalisent leur

fonction grâce à des interactions stables ou transitoires avec d’autres protéines au sein de

complexes homo ou hétéro-oligomériques.

I.1.1- Les interactions protéine-protéine.

Ces interactions entre protéines sont cruciales pour la majorité des processus

moléculaires dans une cellule. Ainsi, l’identification des réseaux d’interaction permet une

meilleure compréhension des machineries cellulaires au niveau moléculaire. L’ensemble de

ces interactions ainsi que des réseaux dans une cellule est appelé interactôme. Ces dernières

permettent de comprendre différents processus tel que la formation de macromolécules, les

voies de signalisation cellulaire, de régulation ainsi que les voies métaboliques. Les PPIs

(Protein-Protein Interactions) permettent de prévoir les relations fonctionnelles entre des

protéines interagissant entre elles. Les interactions Protéine-protéine apparaissent comme des

cibles importantes de médicament lors de traitement thérapeutique par le biais de petites

molécules capables de se fixer au niveau des surfaces d’interaction. Ces interactions ont été

évaluées selon les organismes (tableau 5) mais se rapprocheraient de 25000 à 30000 pour

S.cerevisiae, 240000 pour C.elegans et 650000 pour H.sapiens (Stumpf et al, 2008).

Les interactions protéine-protéine sont dues principalement à quatre types de liaisons

différentes : des liaisons ioniques, hydrogènes, hydrophobes et des liaisons de Van Der

Waals. Les liaisons ioniques sont des interactions qui relient deux atomes de charges

opposées, il s’agit de la plus forte des liaisons non covalentes. Les liaisons hydrogènes sont

quant à elles des liaisons qui se forment à chaque fois qu’un atome d’hydrogène lié à un

atome électronégatif est à proximité d’un autre atome électronégatif (en général oxygène et

azote), l’énergie de cette liaison est moyenne. En ce qui concerne les liaisons hydrophobes,

nous pouvons les trouver lorsque deux molécules hydrophobes voisines sont à proximité (par

exemple deux acides aminés hydrophobes), leur énergie de liaison est faible. Enfin, les forces

de Van Der Waals sont des interactions électrostatiques entre deux atomes voisins, ces atomes

doivent être très proches car l’énergie de cette liaison est très faible. La force d’une liaison

protéine-protéine est définie par la distance entre les atomes impliqués dans l’interaction, au

maximum 6 Angströms.

99

I.1.2- Technique d’étude des complexes protéiques.

Dans le but de définir des interactômes chez de multiples organismes, une multitude

d’approches ont été mises au point pour caractériser des complexes protéiques ainsi que des

interactions protéine-protéine. Les premières cartes d’interactômes furent obtenues avec le

système double hybride, toutefois différentes techniques ont été mises au point pour améliorer

nos connaissances sur la composition protéique de complexe.

Avant, d’introduire les techniques permettant de purifier les complexes, je vais décrire

une méthode applicable à une grande partie de ces techniques, en effet, l’un des problèmes qui

peut être rencontré pendant la purification native d’un complexe protéique à partir de cellules,

est le suivant : seules les interactions protéine-protéine qui résistent aux traitements de lyse et

aux conditions de purification vont pouvoir être détectées par la spectrométrie de masse. Des

complexes transitoires, se caractérisent par une forte constante de dissociation et sont

généralement perdus du fait de conditions de lavage trop stringeantes, à de fortes

concentrations en sel ou suite à l’utilisation de détergent. Différentes stratégies ont été établies

pour stabiliser et conserver ces interactions transitoires ou labiles grâce à des agents de

pontage. Ces agents pontant possèdent deux groupes réactifs qui sont généralement séparés

par un bras de longueur variable (5-15 Å) qui détermine la distance maximale entre deux

molécules. Ce bras définit la spécificité du pontage : des molécules proches ont plus de

chance que des espèces distantes d’être pontées. Ainsi le choix de l’agent de pontage est

essentiel, en effet en ce qui concerne les réactions de pontage in vivo, la capacité de traverser

les membranes cellulaires varie, de même que la réactivité et la longueur des bras de l’agent

pontant. Les conditions réactionnelles doivent être bien déterminées pour permettre d’obtenir

les meilleurs résultats tout en minimisant le pontage non spécifique de protéines

contaminantes. Il existe une multitude d’agents réticulants qui peuvent être

homobifonctionnels c'est-à-dire possèdant deux groupes réactifs identiques, et souvent utilisés

dans une seule étape de pontage chimique (DSP). Des agents hétérobifonctionnels existent

aussi, ils possèdent au minimum deux groupements réactifs qui permettent la fixation

séquentielle avec des groupes fonctionnels des protéines (SPDP), cela permet de minimiser

les effets indésirables que sont la polymérisation et l’auto-conjugaison.

Parmi les agents de réticulation couramment utilisés pour stabiliser les complexes in

vivo, nous trouvons le formaldéhyde ainsi que le DSP. Ces composés permettent

l’identification de nouveaux partenaires à un complexe (respectivement Vasilescu et al, 2004

et Meunier et al, 2002) purifiés par les techniques étudiées précédemment. Le formaldéhyde

est un agent pontant très approprié pour la détection d’interaction protéine-protéine ; en effet,

100

les pontages par cet agent mettent en évidence une proximité entre les deux partenaires (2 Å).

De plus, le formaldéhyde est capable de traverser la membrane cellulaire et réalise les

pontages de façon non spécifique (pas de nécessité de groupement amine ou thiol). L’action

du formaldéhyde est instantanée, ce qui permet de figer un état physiologique particulier,

ensuite, le complexe peut être mis en conditions dénaturantes toutefois le pontage maintient

l’intégrité structurale du complexe. Enfin, cet agent pontant contrairement à d’autres est

réversible ce qui permet la séparation des composants du complexe après pontage et

purification de ce dernier.

Les agents de réticulation peuvent ainsi être utilisés dans le cadre d’études

structurales. En effet, plusieurs stratégies ont été développées pour mesurer les distances entre

acides aminés d’une même protéine ou entre deux protéines. Lorsque des agents

bifonctionnels sont incubés en présence d’un complexe protéique, plusieurs types de liaisons

peuvent se dérouler ; les deux groupements réactifs interagissent soit avec des composants

différents du complexe (interaction intermoléculaire) soit avec une seule protéine (interaction

intramoléculaire). Après digestion trypsique et analyse par MS, les acides aminés pontés

peuvent être identifiés et le choix des acides aminés à ponter est réalisé par mutagénèse

dirigée. Grâce à l’utilisation d’agent monofonctionnel, les faces exposées des protéines

peuvent être déterminées et ainsi l’architecture des complexes protéiques peut être déterminée

grâce aux techniques de pontage et de mutagénèse dirigée.

Les techniques de pontages peuvent aussi permettre d’améliorer d’autres techniques

d’étude des complexes. En effet, le pontage a permis d’utiliser des étiquettes Histidine-biotine

comme TAP-TAG, dont l’intérêt est d’augmenter fortement le rendement du fait de la forte

affinité biotine/streptavidine. De plus la purification des composants est réalisée en condition

dénaturante (8 M urée), car en effet une purification en condition native peut entrainer la perte

d’une modification post traductionnelle telle que l’ubiquitination (Tagwerker et al, 2006).

Enfin, le pontage est capable de maintenir un complexe qui pourrait se dissocier durant des

expériences d’immunoprécipitation, et cette technique est couramment utilisée pour lier

covalemment des anticorps à une matrice de type agarose pour éviter la présence de bande

correspondant aux anticorps dans des SDS-page après expérience d’immunoprécipitation.

- Double hybride.

La technique de double hybride est une technique de biologie moléculaire permettant

de détecter une interaction physique entre deux protéines. Le concept du système de double

hybride chez la levure a été inventé par Stanley Fields, en utilisant la modularité des facteurs

de transcription eucaryote de la levure S.cerevisiae pour étudier les PPis (Fields et Song,

101

ADY

X

BD

ADY

X

BD

X

gène rapporteur

Machinerie de

transcription

UAS

plasmide appât plasmide proieADBD

X Y

Figure 38 : le principe du système double hybride. Deux plasmides sont construits, le gène de la protéine

X appât est fusionné en C-terminal à un motif d'interaction de facteur de transcription (BD) et le gène

codant pour la protéine proie Y est fusionné à un domaine d'activation (AD). Alternativement, la proie

peut consister en protéines codées par des gènes clonés dans une banque de donnée d'expression. Chaque

plasmide est introduit dans une levure appropriée soit par co-transformation, transformation séquencielle,

ou par fusion de cellules haploïdes. Si les protéines X et Y interagissent physiquement entre elles,

l'interaction des domaines BD et AD permet de reconstituer un facteur de transcription actif qui va se fixer

sur une séquence spécifique d'activation (UAS) dans les promoteurs des gènes rapporteurs, et activer leur

expression.

1989). La technique est la suivante : une protéine appât est fusionnée à un domaine de

fixation à l’ADN (DBD) et une protéine cible est quant à elle fusionnée à un domaine

d’activation (AD) d’un activateur transcriptionnel (figure 38). L’interaction de ces deux

domaines (DBD et AD) permet de reconstituer un facteur de transcription fonctionnel. Ainsi

l’interaction physique entre la protéine appât et la protéine cible va permettre l’activation d’un

gène rapporteur qui peut être un gène de croissance en conditions sélectives ou un signal

coloré (test "-galactosidase). Au final, une étude des interactions d’une protéine appât peut

être réalisée sur un génome entier ou une banque de cDNA. Des matrices avec les 6000

séquences codantes de la levure ont été clonées dans des vecteurs d’appât et de cible ce qui a

permis de créer un réseau d’interactions protéine-protéine chez S.cerevisiae (Uetz et al, 2000).

Des études globales similaires ont été réalisées pour des bactéries : H.pylori (Rain et al,

2001), des organismes modèles métazoaires : D.melanogaster et C.elegans (Giot et al, 2003,

Formstecher et al, 2005) ainsi que pour le parasite responsable de la malaria P.falciparum

(LaCount et al, 2005). Enfin, des études de l’interactome humain (Stelzl et al, 2005, Rual et

al, 2005) ont permis de mettre en évidence plusieurs milliers de nouvelles PPis dont certaines

impliquant des protéines liées à des maladies. C’est ainsi que deux nouveaux facteurs ont été

identifiés ; ils agissent sur la voie de signalisation Wnt qui est importante dans les processus

d’embryogénèse et d’apparition de cancer. Cette technique permet donc de déterminer de

nouvelles protéines pouvant intervenir dans le cas de différentes maladies telles que des

maladies neurodégénérative (Kaltenbach et al, 2007).

Toutefois des problèmes subsistent, de fréquents faux positifs et faux négatifs sont

obtenus par cette technique. Les faux négatifs peuvent être dus à une mauvaise localisation ou

un mauvais repliement des protéines de fusion, ou encore à des modifications post-

traductionnelles qui peuvent ne pas être réalisées dans la levure hôte. En ce qui concerne les

faux positifs, la principale source d’erreurs est la sur-expression de protéines hétérologues

ainsi que l’autoactivation du gène rapporteur par la protéine appât. Les faux positifs

représentent de 25 à 45 % des résultats obtenus par la technique du double hybride (Suter et

al, 2008).

Des variantes de technique double hybride ont été imaginées pour éviter les limitations

dues à une mauvaise localisation de la protéine. En effet, une protéine membranaire du fait de

ses propriétés hydrophobiques et d’une localisation non-nucléaire peut ne pas pouvoir être

analysée par la technique classique. Dans ce cas-là, l’interaction de la protéine cible et de

l’appât va permettre le clivage et la libération du facteur de transcription qui sera importé dans

le noyau pour activer le gène rapporteur.

102

N+

CH3

NH

CH3

CH3

N

CH3

O

CH3

S O

O

ONa

O

O

S

O

Figure 39 : Coomassie G-250.

Cette molécule est utilisée lors de BN-PAGE pour permettre de charger les complexes protéiques

sans les dénaturer.

Poids moléculaire : 833 g/mol

La technique double hybride peut aussi être adaptée à la recherche de molécules

capables d’empêcher les interactions protéiques. La fixation de ces molécules ne permettrait

pas l’interaction des protéines cibles et appâts et donc la reformation du facteur de

transcription. Le gène rapporteur ne serait pas activé dans ce cas-là (Lentze et Auerbach,

2008). Après avoir déterminé les réseaux d’interactions, il pourrait être intéressant de localiser

les interfaces d’interactions entre 2 protéines interagissant entre elles. Pour cela, des

mutations non-sens doivent être introduites et une modification de l’interaction se traduit par

une modification de la sensibilité de la croissance de la levure à un marqueur de sélection

donné (Vidal et al, 1996).

- Blue native PAGE.

Le BN-PAGE (Blue native) a été développé pour la séparation des protéines

membranaires mitochondriales et les complexes dont les tailles vont de 10 kDa à 10 Mda en

condition native (Schägger et von Jagow, 1991). Il permet l’isolement en une étape de

complexes protéiques membranaires à partir de membranes biologiques (Schägger, 2001), de

cellules totales et d’homogénats tissulaires (Camacho-Carvajal et al, 2004). Elle permet la

détermination de la masse moléculaire, l’état oligomérique et la stœchiométrie des protéines

composant un complexe (Wittig et al, 2006). Cette technique possède une multitude d’autres

finalités par exemple elle peut servir d’outil de diagnostic des dysfonctionnements

mitochondriaux (Schägger, 1995)

Cette technique est basée sur la solubilisation de membranes biologiques grâce à

l’utilisation de détergent non-ionique. Le choix du détergent dépend de la stabilité du

complexe avec les détergents utilisés. Des détergents doux tels que la digitonine ou fort

comme le dodécyl maltoside peuvent être utilisés. Le triton X-100 quant à lui montre un

comportement intermédiaire, il est capable de solubiliser des complexes membranaires à des

concentrations élevées, comme le dodécyl maltoside (Schägger et Pfeiffer, 2000). Toutefois, à

de faibles concentrations en détergent, le triton X-100 préserverait les supercomplexes de la

chaîne respiratoire ainsi que les formes dimériques de l’ATP synthase (Arnold et al, 1998) par

comparaison au traitement à la digitonine.

Après solubilisation des membranes biologiques et extraction des complexes, un

colorant est ajouté au surnageant le bleu de Coomassie G-250 (figure 39). Ce colorant est

soluble dans l’eau mais il est aussi capable de se fixer sur des protéines membranaires grâce à

ses propriétés hydrophobiques. La fixation de cette molécule sur une protéine ou un complexe

protéique permet de la ou le charger négativement et donc de faire migrer des protéines vers

l’anode d’une cuve d’électrophorèse à pH 7.5 durant un BN-PAGE. Suite à la fixation du

103

bleu, les charges négatives de surface vont se repousser et permettre d’éviter une agrégation

des protéines membranaires. Le bleu rend les protéines membranaires solubles dans l’eau et

permet d’éviter l’utilisation de détergent supplémentaire durant l’électrophorèse et ainsi de

minimiser les dénaturations.

Le BN-PAGE est une technique compatible avec des tests d’activité ou la détection de

marqueur fluorescent in-gel, toutefois il se peut que le bleu interfère. Dans certains cas, une

autre technique d’électrophorèse en condition native peut être réalisée, il s’agit du CN-PAGE

(colorless native). Cette technique se déroule dans les mêmes conditions que le BN-PAGE à

l’exception de l’absence du bleu, cela permet d’éviter la dissociation possible des complexes

étudiés due au bleu. De plus, le bleu de Coomassie peut inhiber l’activité enzymatique de

certaines protéines. Toutefois, le CN-PAGE est limité ; en effet seuls les protéines ou les

complexes avec un point isoélectrique inférieur à 7 vont migrer, les autres protéines et

complexes seront perdus dans le tampon cathode. Dans ce cas là, l’un des moyens pour faire

migrer ces protéines est d’ajouter des détergents neutres et anioniques en faible concentration

ce qui va entraîner la formation de micelles (Wittig et Schägger, 2008) tout en évitant de

dissocier les complexes. L’un des moyens pour faire migrer un complexe possédant un pI

supérieur à 7 en condition native en absence de détergent serait l’incubation du complexe

avec un peptide, un ADN, une protéine qui permettrait de donner une charge globale négative

à notre complexe par son interaction spécifique et ainsi permettre la migration.

Un BN-PAGE peut être réalisé en seconde dimension en présence de détergent plus

déstabilisant, cela peut permettre la dissociation des complexes ainsi que l’identification des

partenaires présents dans ce complexe ainsi que la stœchiométrie. En condition dénaturante,

les partenaires d’un même complexe doivent être alignés sur la même ligne verticale.

Grâce aux BN-PAGE, des protéines membranaires et non membranaires peuvent être

déposées en électrophorèse (Reifschneider et al, 2006), cette technique a permis d’identifier

92 protéines solubles ou ancrées dans la membrane au niveau de cinq organes différents de

rats en couplant l’analyse BN/SDS-PAGE avec la spectrométrie de masse.

- Purification de complexe de façon non dissociante par chromatographie affinité.

La purification de complexes protéiques passe par une multitude de techniques

chromatographiques telles que la chromatographie de tamisage, l’échangeuse d’ion ou la

chromatographie d’affinité. De part la complexité des extraits protéiques, l’un des moyens de

purifier les complexes avec une forte spécificité reste la chromatographie d’affinité. Cette

technique est basée sur la reconnaissance spécifique d’une molécule immobilisée sur un

104

Figure 40 : Schéma de la technique de purification d'une complexe à l'aide d'un TAPTAG.

Une protéine appât possédant une étiquette comprenant en série (un fragment de la protéine A,

un linker qui peut être coupé par la protéase TEV et un site de fixation à la calmoduline) va être

purifiée dans un premier temps sur une matrice possédant des IgG. L'interaction spécifique entre

la partie constante des IgG et la protéine A permettra de supprimer des contaminants. La protéine

associée à des protéines affines sera ensuite décrochée par l'ajout de la protéase TEV puis sera

passée sur une colonne de billes sur lesquelles est greffée la calmoduline. La protéine ainsi que ses

partenaires sont ensuite décrochées en présence de Calcium.

support solide (une phase stationnaire) avec des molécules (en phase mobile) présentes dans

un extrait cellulaire. Il existe de nombreux réactifs pour les colonnes d’affinité, toutefois les

techniques les plus utilisées pour la purification de complexes sont l’utilisation de protéines

recombinantes, de protéines étiquetées avec un épitope. Pour certaines expériences

spécialisées, des peptides et des acides nucléiques peuvent être utilisés. La chromatographie

d’affinité est en plein essor grâce aux développements de la spectrométrie de masse MS/MS

mais aussi de méthodes utilisant des protéines portant une ou plusieurs étiquettes. La

combinaison de ces deux techniques a permis de réaliser des études systématiques des

interactions protéiques chez de multiples espèces telles que la levure (Gavin et al, 2002),

Escherichia coli (Arifuzzaman et al, 2006), ou encore des lignées de cellules humaines. Ces

interactomes permettent par exemple de reconstituer des voies de signalisation biologique

(Bouwmeester et al, 2004), ou bien la machinerie de transcription humaine (Westermarck et

al, 2002).

La chromatographie d’affinité utilisée lors d’étude de complexe se divise en deux

parties : la première consiste à tenter de maintenir le complexe natif et de ne pas le dissocier

pour tenter de conserver tous les partenaires jusqu’à l’analyse. La seconde est une stratégie

reconstructrice d’interaction, une protéine appât supposée faire partie du complexe est fixée

sur une matrice et les protéines capables de se fixer dessus sont analysées.

- La purification de complexes natifs par chromatographie d’affinité peut passer par la

reconnaissance d’un ligand qui possède une capacité intrinsèque à interagir avec notre

protéine appât que l’on suppose faire partie du complexe d’intérêt. Ce ligand peut être de

l’ADN, de l’ARN, de l’héparine ce qui permettra de fixer des protéines possédant de l’affinité

pour les désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, de la protéine A ou G ou l’hydroxyapatite

ce qui permettra de retenir des immunoglobulines (Huse et al, 2002, Gagnon et al, 2009). Des

lectines fixées sur une colonne pourraient permettre de purifier des protéines glycosylées

(Dulaney, 1978) et enfin un anticorps spécifique d’une des protéines du complexe pourrait

être greffé sur une matrice (Wingren et al, 2009). Ainsi cette approche permettrait de fixer

spécifiquement des protéines selon leur fonction dans la cellule ou leurs propriétés néanmoins

cette technique est limitée, en effet les sites d’interactions de la protéine pourraient ne pas être

accessibles du fait d’une interaction avec une autre protéine. En ce qui concerne la

purification du complexe avec un anticorps spécifique, il est nécessaire d’avoir un anticorps

pour chaque protéine que l’on suppose faire partie du complexe. Bien que les anticorps soient

souvent les réactifs les plus utilisés en chromatographie d’affinité, d’autres biomolécules

105

peuvent être employés. Les ADN ou ARN peuvent permettre de purifier des protéines et

complexes. En effet, des acides nucléiques peuvent être greffés sur une matrice solide ou bien

interagir à l’aide de l’interaction Biotine/Streptavidine. Les protéines pouvant interagir avec

ces derniers vont être retenues sur la colonne chromatographique. Cette technique a permis de

purifier des complexes tels que les spliceosomes qui sont des complexes protéiques se fixant

aux pre-mARNs et catalysent leur maturation en mRNAs (Neubauer et al, 1998). Parmi les

colonnes chromatographiques que nous sommes amenés à réaliser pour purifier les

composants de la réplication, nous trouvons les colonnes héparines (mimant la structure de

l’ADN) et matrice ADN double brin ou simple brin. Ces colonnes vont donc permettre de

fixer les protéines pouvant se lier à l’ADN.

- Dans le but de généraliser l’étude des complexes et grâce aux améliorations en

biologie moléculaire, des antigènes peuvent être ajoutés génétiquement à chaque protéine

d’intérêt. C’est ainsi que tous les gènes de la levure ont pu être étiquetés individuellement par

différents épitopes. Le plus utilisé à ce jour pour purifier les complexes est le TAPTAG.

Le système de purification TAP (tandem affinity purification) tag a été développé pour

la purification des complexes protéiques dans des conditions natives avec un fort rendement

(Puig et al, 2001). Dans cette procédure, deux étiquettes différentes généralement séparées par

une séquence de coupure spécifique sont insérées sur la même protéine et les protéines

complexées sont purifiées par deux étapes de purification d’affinité (figure 40). Une multitude

de TAP-tag a été développée chez la levure dont la plus connue est composée de deux sites de

fixation des IgG, un fragment de la protéine A de Staphylococcus aureus, et d’un peptide de

fixation à la calmoduline séparés par un site de coupure spécifique de la protéase TEV

(Tobacco Etch Virus) (Rigaut et al, 1999). Le TAP-tag est une technique flexible et des

modifications de la stratégie originale peuvent être réalisées. Ainsi, l’étiquette peut être

insérée au niveau de l’extrémité C-terminale ou N-terminale de la protéine, de plus des

étiquettes alternatives peuvent être créées pour résoudre certaines difficultés. Dans le but

d’améliorer l’efficacité de ces purifications par rapport au TAP-tag classique, une étiquette de

type GS-tag peut remplacer le TAP-TAG classique. Cette étiquette est composée de la

protéine Guanine nucleotide binding protein et d’un peptide de fixation à la steptavidine

(Bürckstümmer et al, 2006).

L’un des avantages de cette technique est la purification par deux étapes d’affinité

ainsi que l’élution spécifique de notre protéine appât et des protéines associées grâce à la

protéase TEV. Ces étapes permettent de réduire les contaminations dues à des fixations non

spécifiques et ainsi de diminuer le bruit de fond aspécifique et la présence de faux positif.

106

L’un des inconvénients de cette technique est le changement conformationnel que

peuvent engendrer les étiquettes. En effet, l’ajout d’un TAP-tag (21 kDa) que ce soit en C-

terminal ou N-terminal peut affecter le repliement d’une protéine, son activité et même sa

capacité d’interaction avec d’autres protéines. Pour éviter ce problème, un TAP-tag particulier

SF-TAP (Strep II et Flag) a été créé pour diminuer l’instabilité due à une grosse étiquette,

l’étiquette utilisée est d’une taille de 4,6 kDa (Gloeckner et al, 2007).

Cette technique originalement développée chez la levure (Rigaut et al, 1999) a été

surtout utilisée pour la caractérisation des complexes multiprotéiques chez S.cerevisiae

(Gavin et al, 2002). En ce qui concerne d’autres organismes, cette technique a été

efficacement adaptée à la cellule de mammifère (Bouwmeester et al, 2004).

Parmi les autres étiquettes qui peuvent permettre la purification d’une protéine

d’intérêt et des protéines associées, il en existe beaucoup d’autres. Ces étiquettes permettent

de réaliser des études systématiques des interactions protéine-protéine et des complexes grâce

à l’interaction de l’étiquette (Myc, HA, Flag, KT3) avec des anticorps greffés sur une

colonne. Le développement de la spectrométrie de masse a entraîné une augmentation de la

sensibilité des analyses, cela permet d’identifier des protéines faiblement exprimées dans la

cellule mais en contrepartie augmente aussi la détection de protéines éventuellement

contaminantes. Parmi les différentes possibilités de chromatographie d’affinité nous trouvons

la méthode GST pulldown. Il s’agit d’une précipitation grâce à une protéine de fusion

recombinante GST. Cette technique a été très utilisée dans le cadre d’interactions non

spécifiques dans les complexes protéiques (Becamel et al,. 2002). Dans cette approche, la

protéine d’intérêt est exprimée dans Escherichia coli sous forme de protéine de fusion

recombinante, puis immobilisée sur un support solide. Un extrait de lysat cellulaire est ensuite

déposé sur la colonne, les protéines qui vont interagir vont ensuite être décrochées puis

analysées. L’intérêt de cette technique est la capacité de détecter et de fixer des protéines en

faible abondance. Les inconvénients de cette technique sont que la protéine de fusion peut ne

pas fixer les protéines candidates susceptibles d’interagir simplement par le fait de la

formation préalable de complexe endogène les mettant en jeu, dans un extrait cellulaire avant

dépôt sur la colonne. En effet, lors du dépôt, la protéine de fusion peut entrer en compétition

avec la protéine correspondante endogène, dès lors l’efficacité de la fixation des protéines

pouvant interagir dépend donc de la stabilité du complexe et des constantes d’association et

de dissociation.

107

Enfin, bien qu’elle ne soit pas généralement considérée comme une colonne d’affinité,

les colonnes Ni-NTA permet de fixer les protéines possédant une étiquette Histidine sur un

support solide.

La deuxième stratégie consiste à reconstituer les interactions mises en jeu dans un complexe,

pour cela l’un des partenaires est fixé sur une matrice d’une colonne, puis des extraits

protéiques sont déposés sur la colonne, et les protéines fixées sont analysées après élution.

Cette méthode a été employée dans le cadre de l’étude des interactions entre l’actine et la

myosine, chacune séparemment pour déterminer les facteurs avec lesquels elles interagissent

dans un mélange protéique cellulaire (Bottomley and Trayer, 1975).

- Co-immunoprécipitation.

Les techniques de purification par affinité nécessitent l’utilisation de colonne

chromatographique, contrairement à la co-immunoprecipitation (co-IP) qui est une technique

se déroulant dans des tubes, basée sur la fixation de complexe sur des billes et sur une

séparation de molécules fixées ou libres par centrifugation. Il s’agit d’une technique clé pour

l’analyse des interactions protéine-protéine, cela comprend aussi les interactions des sous-

unités à l’intérieur d’un complexe protéique. La co-IP de protéines à partir de fractions

cellulaires est la technique la plus convaincante pour mettre en évidence l’interaction

physique de deux ou plusieurs protéines in vivo (Monti et al, 2005, Phee et al, 2006). Cette

technique est basée sur la reconnaissance spécifique d’une protéine appât étiquetée (HA, c-

myc…) ou non par des anticorps. Ces derniers sont incubés en présence d’homogénat clarifié

ou de mélange protéique pour former un complexe immun avec l’antigène (protéine ou

étiquette). Dans le mélange protéique, la protéine appât est capable d’interagir avec d’autres

protéines en formant un complexe. Après fixation des anticorps, le complexe peut ensuite être

isolé du mélange grâce à l’immobilisation des anticorps par la protéine A ou G. Le matériel

immunoprécipité contenant la protéine appât et les partenaires d’interactions peuvent être

analysés en gel SDS-PAGE et identifiés par spectrométrie de masse MS/MS ou bien être

analysés par test enzymatique.

En ce qui concerne les inconvénients de cette technique, comme toute expérience

utilisant des anticorps, il est nécessaire que la reconnaissance du bon antigène soit efficace

elle doit en effet être meilleure que pour des Western blot ou des ELISA. Des réactions

croisées avec des antigènes non spécifiques ou des fixations non spécifiques de protéines aux

anticorps, aux étiquettes peptidiques ou encore à des supports insolubles peuvent conduire à

des faux positifs. Il est donc conseillé de réaliser un pré-lavage des extraits cellulaires avec

108

des anticorps de l’animal avant immunisation contre l’antigène spécifique. Un autre problème

qui peut survenir lors de ces techniques concerne la fixation des anticorps. En effet, les

anticorps sont spécifiques de la protéine appât et la fixation des anticorps peut entrer en

compétition avec la fixation des protéines interagissant dans l’extrait cellulaire avec la

protéine appât elle même. Ce phénomène pourrait déstabiliser les interactions protéine-

protéine et entrainer une dissociation des complexes, même partielle. L’utilisation de

protéines étiquetées pourrait permettre de surmonter ce problème, bien que la présence de

l’étiquette puisse affecter la conformation de la protéine et donc altérer la formation du

complexe. L’un des moyens de s’affranchir des perturbations structurelles entraînées par

l’étiquette serait de réaliser les expériences en présence de la protéine étiquetée au niveau de

l’extrémité C-terminale ou N-terminale. Enfin, la surexpression de la protéine étiquetée est à

éviter, en effet, une forte concentration de la protéine appât peut altérer la stœchiométrie avec

les partenaires naturels, ce qui pourrait entrainer des interactions non spécifiques et/ou non

naturelles avec les protéines de l’hôte.

I.1.3.5- Far-Western.

Contrairement à d’autres techniques d’étude des interactions protéine-protéine tel que

la co-Ip, le Far-Western est une technique qui permet de déterminer si l’interaction entre deux

protéines est directe. De plus, la protéine appât se fixe directement à des protéines dénaturées,

séparées et immobilisées sur une membrane. Ainsi son avantage est de pouvoir déterminer de

multiples interactions directes si l’on possède des anticorps affins et de la protéine appât

purifiée. Les avantages de cette technique sont tout d’abord la flexibilité, les protéines

peuvent être préparées de différentes manières. Elles peuvent provenir d’extrait cellulaire, être

des protéines recombinantes ou il peut s’agir encore de peptides, et peuvent servir de sonde

comme de protéines cibles. Par exemple, des extraits non purifiés d’E.coli contenant des

protéines recombinantes ont été utilisés avec succès comme sonde (Fisher et al, 1997). De

plus, différents moyens de détection de matériel radioactif ou non peuvent être utilisés, par

exemple des sondes protéiques recombinantes radioactives (Kimball et al, 1998) ou encore

des sondes protéiques recombinantes marquées avec la biotine (Grulich-Henn et al, 1998). Au

contraire du western blot, où la protéine cible est connue à l’avance, le Far-WB peut détecter

des protéines dont nous ne supposons pas la présence.

Cette technique commence par la séparation d’extrait d’intérêt sur gel d’électrophorèse

suivie d’une immobilisation des protéines sur une membrane. Cette dernière est mise en

présence d’une protéine appât qui va interagir. Les protéines ayant interagit avec la sonde sont

révélées par l’utilisation d’Anticorps spécifiques de la sonde ou bien par radioactivité. La

109

Figure 41 : Schéma de purification du réplisome de cellules de neuroblastome humaine.

Sandoval et al. (2005) J.Pediatr. Surg. 40 : 1070-7

capacité de détecter les interactions directes est limitée par rapport au type de PPis. En effet,

les extraits cellulaires sont généralement dénaturés et réduits par le traitement avec le tampon

d’échantillon Laemmli. Malheureusement, beaucoup d’interactions protéine-protéine

dépendent des structures secondaires et tertiaires des protéines impliquées. Dans certains cas,

le Far-WB est une technique très utile, elle peut permettre la caractérisation d’interaction de

protéines à des petits peptides linéaires. Toutefois, dans d’autres cas, après transfert sur

membrane, les protéines sont généralement dénaturées en présence d’urée ou de chlorure de

guanidine. Des gradients de concentrations décroissantes d’urée ou de guanidine sont réalisés

dans le but de renaturer les protéines (Wu et al, 2007), qui retrouvent leurs structures

secondaires et tertiaires. Cette technique a permis d’identifier et de déterminer l’interaction du

facteur SigmaA avec l’ARN polymérase chez Bacillus subtilis (Johnston et al, 2009) ou

encore l’interaction du domaine BRCA1 avec l’hélicase BACH1 (Cantor et al, 2001).

Les principaux inconvénients de cette technique sont la nécessité de purifier la

protéine sonde et d’en avoir une quantité suffisante pour observer l’interaction, ainsi que

l’obtention de fixation non spécifique.

I.1.3.6- Technique de purification du réplisome nucléaire.

Un protocole de purification du réplisome nucléaire a été mise au point par Malkas et

al, ils ont réussi à isoler et à caractériser les propriétés de complexe enzymatique qui est

essentiel à la réplication de l’ADN du SV40 in vitro. La purification de réplisome nucléaire a

été réalisée avec des cellules de lignées humaines, Hela en suivant ce même protocole

(Malkas et al, 1990).

Cette technique est basée sur certaines étapes clés (figure 41) à commencer par le

fractionnement cellulaire en présence d’une concentration élevée en sel (2 M KCl) et en

présence de PEG-8000 (5%). L’ajout de 5% PEG en présence de 2 M KCl permet de

précipiter 50% des protéines ainsi que 70 à 80% des acides nucléiques (Malkas et al, 1990).

Environ 90% de l’activité ADN polymérase ! ainsi que 80 % de l’activité primase sont

conservées après ce traitement au PEG et KCl. La précipitation par le PEG permet de

précipiter des cellules bactériennes, des bactériophages, des virus de plantes et d’animaux, des

ribosomes ainsi que des protéines et de l’ADN (Lis JT, 1980). La précipitation dépend de

différents paramètres tels que la concentration de PEG, la taille des éléments à précipiter, de

la concentration en sel, de la concentration des fragments d’ADN à précipiter, du temps

d’incubation et du pH. Ainsi une forte concentration en sel permettra une meilleure

précipitation, de plus il est connu que le sel a la capacité de décrocher les protéines liées à

l’ADN. Ainsi le complexe de réplication est décroché de l’ADN et n’est pas précipité avec de

110

nombreuses autres protéines. Après centrifugation, une dialyse du surnageant est réalisée pour

diminuer la concentration saline (à 0.15 M KCl) et faire disparaître le PEG, l’échantillon est

alors déposé sur un coussin de saccharose 2 M. Après une ultra-centrifugation de 16h à

100 000g, des fractions correspondant au surnageant et à l’interface du gradient de saccharose

sont récoltées arbitrairement. Une dialyse va ensuite être réalisée pour remplacer le

saccharose par du glycérol et les échantillons vont pouvoir être conservés ensuite à -80°C

dans le tampon qui sera utilisé dans les colonnes suivantes. Ainsi, une colonne

chromatographique Q-sépharose peut être réalisée pour améliorer la pureté du complexe et

ensuite la taille du complexe peut être déterminée par gradient continu de saccharose 10-35%.

Si l’on s’intéresse à l’activité ADN polymérase, il a été observé qu’elle se concentre au

niveau de l’interface (Sandoval et al, 2005) et qu’un complexe de 21S et de 640 kDa a pu être

purifié par cette méthode.

Cette technique a permis d’obtenir des informations concernant le complexe de

réplication nucléaire de cellules de lignée humaine. Par exemple, la composition du complexe

a pu être déterminée dans une lignée de lymphocytes, la taille du complexe et son coefficient

de sédimentation sont des informations importantes pour l’étude des réplisomes.

I.1.3- Facteurs déstabilisants les complexes protéiques.

Les complexes sont un assemblage de protéines interagissant entre elles grâce à des

liaisons non covalentes telles que des interactions ioniques ou hydrophobes. Ces protéines

peuvent se dissocier dans différentes conditions, en présence de sels, de détergent ou en

changeant des conditions de pH ou de température (Jordan et Chollet, 1985, Kyriakidis et

Georgatsos, 1975). Un certain nombre de complexes solubles ont été étudiés grâce à l’ajout

d’agent dissociant, c’est le cas du complexe des aminoacyl-tRNA synthétases (Sihag et

Deutscher, 1983). L’effet de sel neutre ainsi que de détergents tels que le CHAPS ou le

déoxycholate sur les différentes enzymes du complexe ont été étudiés en fonction de la

température d’incubation.

I.1.3.1- Les sels.

Parmi les facteurs pouvant déstabiliser un complexe, les sels font partie des éléments

pouvant agir. Une classification des ions a été crée selon leur capacité à modifier la structure

de l’eau, il s’agit de la série d’Hofmeister. L’effet des cations et des ions sur la solubilité des

protéines a été étudié par Hofmeister. Les anions paraissent avoir un effet plus important que

les cations. Les cations et anions peuvent être représentés selon la figure 42 selon leur effet.

111

Figure 42 : Série d'Hofmeister.

tension de surfacetension de surface

facilite la formation de cavitéRend la formation de cavité plus difficile

solubilité des protéinessolubilité des protéines

Salting in

dénaturation des protéines

la stabilité des protéines

dénaturation des protéines

la stabilité des protéines

Salting out

HOH

CH3

H

CH3

H

OH

OHCH

3

NH

O

N+

S

H

O

OO

CHAPS

OO

Hn

Triton X-100A

B

Figure 43 : Structure de deux détergents, (A) le triton X-100, un détergent doux,

(B) le CHAPS un détergent zwitterionique.

Le Triton X-100 est couramment utilisé lors de tentative de solubilisation de membrane cellulaire et

particulièrement lors d'extraction de protéines mitochondriales. Le CHAPS est un détergent

zwitterionique utilisé lors d'extraction protéine, il est capable de solubiliser dans l'eau des protéines

hydrophobes comme le trion X-100.

poids moléculaire : 647 pour n=10

poids moléculaire : 614,9 g/mol

Les ions à gauche du chlore sont appelés cosmotropes tandis que ceux à droite sont dits

chaotropes. Ces termes se réfèrent à l’origine à la capacité des ions d’altérer le réseau de

liaisons hydrogènes de l’eau. Les cosmotropes qui sont considérés comme étant des

« créateurs de structure de l’eau », sont fortement hydratés et sont stabilisant et entraînent un

effet de salting-out sur les protéines et macromolécules. C'est-à-dire que les protéines ne vont

plus être suffisamment en interaction avec les molécules d’eau et les interactions entre

protéines vont devenir plus fortes, ce qui va précipiter les protéines du fait de la formation

d’interaction hydrophobe. Au contraire, les chaotropes sont connus pour déstabiliser les

protéines repliées et créent un effet salting-in ; en effet, ces sels vont interagir avec les acides

aminés, ce qui va, à faible concentration, solubiliser la protéine mais la dénaturer à forte

concentration.

I.1.3.2- Les détergents.

Les détergents constituent une classe de composés qui se distingue par leur structure

amphiphile c'est-à-dire composé d’une tête polaire hydrophile et d’une longue chaîne

carbonée apolaire hydrophobe. Les détergents ont la capacité de former des micelles et sont

donc solubles dans l’eau. La partie hydrophobe des détergents est généralement droite ou bien

posséde des branchements de chaînes hydrocarbonées ou encore des squelettes stéroïdes. En

ce qui concerne la partie hydrophile, elle est plus diversifiée en effet il en existe avec des

parties ioniques ou non ioniques qui peuvent être simples ou très élaborées. Parmi les

détergents non ioniques, il existe le triton X-100 (voir figure 43A). Il s’agit d’un des

détergents non ioniques les plus utilisés, il permet de solubiliser les membranes en formant

des micelles avec les lipides et permet ainsi l’extraction des protéines membranaires. Parmi

les autres types de détergent, les zwitterioniques : c'est-à-dire possédant des charges positives

et négatives, ce sont des molécules très solubles dans l’eau. Le CHAPS (3-[(3-

cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate) fait partie de cette classe de

détergent (voir figure 43B), il s’agit d’un détergent doux, non dénaturant, toutefois il est

capable de dissocier des complexes enzymatiques (ex : complexe des aminoacyl-ARNt

synthétases). Enfin, parmi les détergents ioniques, il en existe une multitude dont le SDS

(Sodium dodécyl-sulfate) qui est couramment utilisé pour les gels protéiques en conditions

dénaturantes, ou encore le déoxycholate. Ces molécules de part leur charge sont capables de

dénaturer les protéines et de détruire les interactions protéine-protéine en créant des liaisons

ioniques avec les protéines.

112

Les détergents peuvent former des micelles, toutefois il est nécessaire que la

concentration de détergents soit supérieure à la CMC (Critical Micelle Concentration), cette

dernière dépend de la concentration saline du mélange, de la température.

Ces différentes techniques permettent d’obtenir des informations sur des interactions

et sur des complexes. Les ADN polymérases qui sont le sujet principal du laboratoire où j’ai

réalisé ma thèse s’organisent avec d’autres protéines au sein de complexe de réplication. Je

vais tout d’abord vous présenter les informations connues sur le réplisome nucléaire et ensuite

les données obtenues sur le réplisome mitochondrial.

I.2- Complexe de réplication nucléaire.

Des accumulations de résultats mettant en évidence l’isolement de complexe

multiprotéique possédant des capacités réplicatives, permettent de dire que des réplisomes ou

complexes protéiques de réplication existent (Maga et Hübscher, 1996, Lin et al, 1997).

A l’aide de la technique développée par Malkas et collaborateur, Sandoval et al ont

réussi à déterminer que le réplisome nucléaire de cellules de neuroblastome serait composé

d’une dizaine de protéines, incluant les ADN polymérases % et $, l’ADN ligase de type I,

l’ADN topoisomérase de type I, la flap endonucléase 1 (FEN1), le facteur de réplication C

(RFC), le PCNA et la protéine de réplication A (Sandoval et al, 2006). Ces résultats corrèlent

un travail réalisé par Maga et Hübscher qui ont mis en évidence l’isolement et la

caractérisation d’un complexe de réplication composé du complexe ADN polymérase

!/primase, de l’ADN polymérase $ et de RFC à partir de cellules de thymus de veau. Ces

derniers ont réussi à purifier ce complexe en réalisant 5 colonnes chromatographiques

(phosphocellulose, sulfonyl propyl sépharose, DEAE, Sephacryl HRS-500, phosphocellulose)

(Maga et Hübscher, 1996). Il a été montré que l’ADN ligase I est associée à un complexe

enzymatique possédant une activité réplicative grâce à une extraction à faible concentration

saline en présence de PEG puis des colonnes ont été réalisées (Q-sépharose, ADN natif et

dénaturé cellulose en série, Mono-Q, AMP-sépharose) (Li et al, 1994). Ainsi grâce à

différentes approches, les enzymes nécessaires à la réplication nucléaire apparaissent faire

partie d’un complexe de haut poids moléculaire caractérisé par un coefficient de

sédimentation de 21 S.

I.3- Complexe de réplication mitochondrial.

113

Peu de choses sont connues sur le réplisome mitochondrial, de part la méconnaissance

du mode de réplication et de part la difficulté d’étudier ce complexe, toutefois un réplisome

mitochondrial a été reconstitué in vitro avec des protéines de mammifères (Korhonen et al,

2004). Ce réplisome minimum serait constitué de trois protéines : TWINKLE, l’ADN

polymérase # et SSBP (Single-Strand Binding Protein); elles seraient capables d’utiliser des

ADN double brin comme matrice et synthétiseraient des molécules d’ADN simple brin.

Toutefois, la vitesse de synthèse est diminuée de 33% par rapport à celle observée in vivo et

une spécificité en ce qui concerne les interactions entre les trois composants a été relevée. Ces

expériences ont été réalisées en présence d’une matrice ADN de type mini-cercle. Il s’agit

d’un 70mer circularisé, hybridé à un 90mer qui offre une extrémité 3’OH libre utilisée comme

amorce, et possédant une extension en 5’ de 40 résidus T. L’oligonucléotide 90mer est

complémentaire au 70mer sur une région de 50 nt, le test est réalisé avec un substrat

radioactif, le dATP32 pour observer la réplication de ce mini Cercle modèle. Chez l’homme la

réplication de cette matrice mini-cercle nécessite une ADN polymérase (l’ADN polymérase

#), une ADN hélicase (TWINKLE) ainsi qu’une protéine de fixation à l’ADN simple brin

(SSBP). Si l’ADN polymérase # est présente dans le mélange réactionnel, elle est capable en

utilisant l’extrémité 3’OH du 90mer comme amorce, de polymeriser les nucleotides au moins

sur une région localement simple brin de 20 nucleotides, en copiant le brin matrice du 70mer,

correspondant aux résidus non appariés de cet oligomer non complémentaires au 90mer. La

polymérase qui se fixe à l’extrémité 3’ du 90mer peut donc commencer à combler cette

brêche et allonge le 90mer de 20nt. On obtient donc dans tous les cas une bande d’arrêt à

110nt. L’oligonucléotide 90mer possède une extension en 5’ de 40 Thymidine, non

complémentaire au 70mer circularisé et donc restant protubérante et simple brin. Dans

l’éventualité où les enzymes nécessaires sont présentes pour assurer l’ouverture et le

déroulement du 90mer pour laisser la polymérase continuer la synthèse au dela de ces 20

premiers nucléotides, la synthèse par cercle roulant peut se faire et la barre d’arrêt de 110 est

allongée, on obtient de plus grandes molécules. Dans le cas de l’homme, l’hélicase

TWINKLE ainsi que la SSBP sont nécessaires à l’ADN polymérase # pour obtenir une

synthèse de grandes molécules, au-delà de la bande d’arrêt de 110nt. La SSBP aurait la

capacité de stimuler l’activité du complexe formé par l’ADN hélicase TWINKLE avec la

polymerase gamma (Korhonen et al, 2004), ce qui a son importance même si cette hélicase a

la capacité de dérouler un ADN avec une région duplex de 55nt en absence de SSBP.

TWINKLE est une ADN hélicase qui agit dans le sens 5’ en 3’, mais qui est capable d’agir

sur plusieurs types de substrat. Cette enzyme a été proposée comme étant l’hélicase agissant

au niveau de la fourche de réplication (Spelbrink et al, 2001). En présence du mini-cercle

114

élaboré par Korhonen, l’ADN polymérase # humaine ne synthétise que des courtes molécules

de 110nt, correspondant au remplissage d’une brèche de 20nt à partir de l’extrémité 3’amorce

de l’oligomer de 90nt. Ce n’est qu’en présence de l’hélicase TWINKLE que le 90mer peut

être déplacé au niveau de son extension de 40 résidus T en 5’, permettant à la polymérase de

copier le 70mer matrice produisant de grandes molécules dont la taille peut atteindre 2 kb.

L’activité de réplication de ce substrat par l’ADN polymérase # associée à l’hélicase

TWINKLE est fortement stimulée par la présence de la SSBP, par un facteur 40, donnant une

synthèse plus importante mais conduisant également à l’extension de molécules jusqu’à 16

kb. SSBP apparaît comme essentielle, il s’agit d’une protéine qui se fixe sur l’ADN simple

brin, et possède un homologue chez la levure : la protéine Rim1.

En ce qui concerne le réplisome mitochondrial de la levure S.cerevisiae, une étude en

1995 a mis en évidence un complexe multi-enzymatique contenant une activité de réplication

d’ADN (Murthy et Pasupathy, 1995). Ce complexe aurait un coefficient de sédimentation de

40 S et serait composé d’ADN polymérase, ARN polymérase, ADN primase. Cet article n’est

basé sur aucune technique de concentration des complexes, pourtant des activités

enzymatiques ont pu être mesurées. Des Western-blots ont été réalisés et présentent des

bandes de faible intensité qui correspondraient à des ARN polymérase de 35 et 45 kDa. Il est

notable de savoir qu’aucune primase n’a été trouvée dans la mitochondrie des mammifères et

levures bien qu’elle fut recherchée dans les années 90. L’initiation de la réplication serait

réalisée par une ARN polymérase mitochondriale, il s’agit de Rpom, une ARN polymérase

composée de Rpo41 de 150 kDa et de Mtf1 de 40 kDa.

I.4- Candidats potentiels au réplisome mitochondrial.

Parmi les protéines candidats pouvant faire partie du réplisome, la première est l’ADN

polymérase #. Bien qu’elle ne soit plus la seule ADN polymérase mitochondriale chez la

levure S.cerevisiae, elle doit certainement faire partie du réplisome. Elle est même

probablement centrale au réplisome car portant une activité essentielle dans un complexe de

réplication. Comme dans le réplisome nucléaire, une ou plusieurs ADN topoisomérases

seraient requises pour supprimer les torsions de l’ADN engendrées par le processus de

réplication. Une ADN hélicase serait nécessaire pour ouvrir les deux brins d’ADN de façon

similaire à TWINKLE dans le réplisome humain (Korhonen et al, 2004), toutefois aucun

homologue de cette protéine n’a été trouvé chez la levure. Une autre protéine doit

certainement jouer ce rôle dans le réplisome. Ensuite, une ADN ligase impliquée dans les

processus de réplication et réparation doit intervenir, dans le noyau c’est l’ADN ligase I qui

115

fait partie du complexe de réplication. Par ailleurs, des interactions ont été observées entre

l’ADN polymérase # et l’ADN ligase III humaine (De A et Campbell, 2007) dont

l’homologue le plus proche chez la levure est l’ADN ligase I, qui s’avèrerait être la seule

présente dans la mitochondrie. Une nucléase serait nécessaire au processus d’initiation de la

réplication ainsi que pour la réparation. Parmi les protéines pouvant faire partie du réplisome

chez la levure il faut noter une protéine de stabilisation de l’ADN simple brin similaire à

SSBP humain montrée essentielle au réplisome, dont l’homologue chez la levure est la

protéine Rim1p. Enfin, les 2 sous unités de l’ADN polymérase alpha que nous venons de

trouver dans la mitochondrie pourraient faire partie du réplisome, pour l’initiation de la

réplication ou bien la réparation de l’ADN.

116

OBJECTIFS DU CHAPITRE II.

Ce chapitre porte sur l’étude du complexe de réplication, purifié à partir de

mitochondries de levures, et donc comporte deux axes d’analyse, la purification du complexe

lui-même en conditions natives d’une part, afin de déterminer par des activités enzymatiques

et une identification par spectrométrie de masse quels sont les constituants de ce complexe, et

d’autre part la tentative de reconstitution des interactions entre les partenaires présumés de ce

complexe, par le biais de l’utilisation de colonnes d’affinité réalisées au travers de protéines

appâts choisies en conséquence et de protéines cibles, dont on pourra analyser les effets sur

les interactions mises en évidence.

117

II- MATERIELS ET METHODES.

II.1- Matériels.

II.1.1- Souches de levures et de bactéries.

Les différentes souches utilisées au cours de notre travail sont les suivantes :

:. La souche ST40, fournie par l’équipe du Dr J. Lazowska (CGM, Gif-sur-

Yvette) a été modifiée au niveau du génome mitochondrial, (Mat !,

ura380, lys280, leu280, his380)

:. Les souches BY4741 achetées à la société Open Biosystem contenant un

gène particulier étiqueté avec un TAP : Tandem Affinity Purification

(MAT a, his381, leu280, met1580, ura380).

:. La souche BY4742 achetée à la société Euroscarf est délètée pour le gène

MIP1 (Mat !, ura380, lys280, leu280, his380)

:. Une souche bactérienne DH5! fournie par le Dr Thérèse Gin-Astier

(Laboratoire REGER) provient de Novagen.

II.1.2- Culture des bactéries.

II.1.2.1- Cultures en milieu liquide.

Les cultures de bactéries en milieu liquide sont réalisées à 37°C sous agitation

constante à 20 rpm dans le milieu LB (Luria Broth) contenant 10 g/l de bacto-tryptone, 5 g/l

de Bacto-extraits de levures et 10 g/l de NaCl à pH 7. Après culture, les bactéries peuvent être

utilisées immédiatement ou conservées à -80°C en présence de 20% glycérol.

II.1.2.2- Cultures sur milieu solide.

118

La composition de ces milieux de cultures est 10g/l de bacto-tryptone, 0,012% d’X-

Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-"-D-galactopyranoside) et 10 g/l de NaCl à pH 7 ainsi que

1,7% d’agar pour le milieu solide.

Les bactéries destinées à la culture en milieu solide sont déposées sur boîte, par

étalement ou par striation, à partir de culture en milieu liquide, puis cultivées en étuve à 37°C.

Les bactéries sur milieu solide sont conservées telles quelles pendant un mois à 4°C.

II.1.3- Préparation des mitochondries.

Des fermenteurs de 10 L sont mis en culture pour les souches TAPTAG selon le

protocole décrit dans le chapitre 1 dans un milieu YPD (Bacto-Peptone 200g, Yeast extract

100g, Glucose 200g pour 10 L)

II.2- Méthodes Relatives à l’étude des protéines.

II.2.1- Techniques de concentration des protéines.

Deux méthodes de concentration des protéines ont été utilisées. Ces méthodes sont

utilisées pour concentrer des échantillons avant de les déposer sur gel SDS-PAGE.

II.2.1.1- Concentration par l’Acide Trichloracétique (TCA).

Ajouter 0,1 volume de TCA 100% à 0,9 volume d’échantillon.

- Après incubation 60 min à 0°C (dans la glace), les protéines sont centrifugées 10

minutes à 15 000 g.

- Le culot est ensuite repris dans 25-100 µl de tampon d’échantillon (Tris/HCl 125 mM

pH 6,8, SDS 5% (p/v), "-mercaptoéthanol 2% (v/v), glycérol 50% (v/v), bleu de

bromophénol 0,1% (p/v)) et neutralisé par addition de quelques microlitres de NaOH

1M contrôlé par le virement du bleu de bromophénol, du jaune (condition acide) au

bleu (lorsque le pH est supérieur à 7).

II.2.1.2- Concentration par l’acétone.

119

A 1 volume de solution protéique est ajouté cinq volumes d'acétone refroidi à -20°C.

- L'échantillon homogénéisé est incubé pendant 1h30 dans la glace puis centrifugé

pendant 10 minutes à 13 000 g à 4°C.

- Le culot protéique est séché, afin d’éliminer toute trace d’acétone. Après séchage, le

culot est repris dans le tampon d’échantillon décrit ci-dessus.

II.2.2- Mesures d’activités enzymatiques.

II.2.2.1- Test d’activité ADN topoisomérase.

Le test d’activité ADN topoisomérase est basé sur la visualisation du relâchement de

plasmides super-enroulés après électrophorèse en gel natif d’agarose.

- 20µl du mélange réactionnel contenant Tris/HCl 25 mM pH 7,5, MgAc 10 mM, 0.2-

0.5 µg de plasmide super-enroulé (pUC18 : Invitrogen) sont préparés dans un tube

Eppendorf de 1,5 ml.

- 5 µl d’extrait enzymatique sont ajoutés au mélange, qui est incubé à 30°C pendant 1 h.

- La réaction est arrêtée par l’ajout de protéinase K (0.5 mg/ml), la digestion va être

réalisée à 30°C pendant 15 min.

- 5 µl du tampon de charge (Tris/HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 100 mM, SDS 2%, Ficoll

2 %, bleu de bromophénol 1%) sont ajoutés et les extraits sont analysés par

électrophorèse sur gel d’agarose 1% (p/v) / TBE (Tris Borate EDTA) 1X en

conditions natives avec le tampon TBE (Tris 89mM, Acide orthoborique 89 mM et

EDTA 2 mM) 1X.

- Les gels sont ensuite colorés avec 0,01% de bromure d’éthidium (ou SYBR® safe,

invitrogen) et les produits de réaction sont observés à l’aide d’un transilluminateur à

une longueur d’onde de 300 nm sous une lumière UV.

Lors des tests en présence d’inhibiteur, dans un volume réactionnel final de 25 µl, 5µl

d’inhibiteur sont ajoutés avant incubation de l’enzyme.

II.2.2.2- Test d’activité ADN hélicase.

Pour générer les substrats hélicases, plusieurs oligonucléotides sont utilisés:

:. H1-50mer :

5’-GACGCTGCCGAATTCTGGCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACGTTGACCCG-3’.

120

Figure 44 : Les substrats pour l'activité ADN hélicase.

5'

3' tail

31 19

50mer H1 radiomarqué

31mer H2

5' tail

31 19

50mer H1 radiomarqué

31mer H5

Forked

50mer H1 radioactif

43mer H3

31

12

19

marquage au phosphore 32

!" H2-31mer :

5’-ATGTCCTAGCAAGCCAGAATTCGGCAGCGTC-3’.

!" H3-43mer :

5’-CGAATAATCGTCATGTCCTAGCAAGCCAGAATTCGGCAGCGTC-3’.

!" H4-50mer :

5’-ATATCTCCGAATGGCAAAGATGTCCTAGCAAGCCAGAATTCGGCAGCGTC-3’.

!" H5-31mer :

5’-GACGCTGCCGAATTCTGGCTTGCTAGGACAT-3’.

Pour le substrat « 3’ tail », les oligonucléotides H1 et H2 sont utilisés, pour le substrat

« forked », ce sont les oligonucléotides H1 et H3 qui sont utilisés et enfin le substrat « 5’

tail » est formé des oligonucléotides H1 et H5 (figure 44). Les différents substrats sont

marqués au 32

P au niveau de l’extrémité 5!-terminale des oligonucléotides H1 et H4 en

présence de la T4 polynucléotide kinase (Stratagene) selon les conditions indiquées par le

fournisseur.

- Après réaction avec la polynucléotide kinase, les échantillons sont précipités avec

deux volumes d’éthanol en présence de 0,3 M Acétate de sodium pour éliminer les

nucléotides non incorporés.

- Les oligonucléotides marqués au 32

P sont purifiés sur gel après réaction avec la T4

kinase. Les bandes isolées sont découpées après autoradiographie correspondant à

chaque oligomère.

- Après élution 1 heure contre le tampon TAE, la solution est précipitée à l’éthanol en

présence de 0,3 M acétate de sodium. Les oligos sont repris dans un volume de

tampon TAE (50 à 100 µl pour 5 à 10 µg) pour une concentration finale de 1µg/µl et

vérifiés par une nouvelle électrophorèse sur gel.

- Les oligos en quantité équimoléculaire sont hybridés en présence de Tris 50 mM pH

7,5, EDTA 1 mM, NaCl 20 mM.

- Les oligos sont ensuite dénaturés pendant 10 min à 94°C puis ils sont refroidis

lentement.

- 25 µl de mélange réactionnel (Tris/HCl 50 mM pH 7,6, Chlorure de magnésium 10

mM, DTT 1 mM, BSA 100 µg/ml, ATP 3 mM, Glycérol 10%) contenant 15 fmoles

d’ADN substrat et 5µl d’extrait enzymatique sont ajoutés dans le mélange, les

réactions sont incubées à 32°C pendant 50 min

- Les réactions sont arrêtées par l’ajout de 3 µl de solution stop (Tampon TBE,

saccharose 10%, bromophénol 0,25% et Xylène cyanol 0,25%).

121

- L’extrait est déposé sur gel de polyacrylamide 16% non dénaturant préparé avec le

tampon TBE 1X et l’electrophorèse effectuée à 4°C à 200 volts pour éviter de

surchauffer le gel.

- Enfin le gel est séché au sécheur de gel (Gel Dryer Model 583, Biorad) puis

autoradiographié avec un film photo Kodak X-AR à -80°C en utilisant un écran

amplificateur.

II.2.2.3- Test d’activité ADN Ligase.

Le test d’activité ADN ligase nécessite un duplex ADN : ce substrat est préparé

comme décrit par Donahue (Donahue et al, 2001) en présence des oligodéoxynucléotides

15mer (5’-CCCAGTCACGACGTT-3’) et un 17mer (5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’),

phosphorylés en 5’ et parfaitement complémentaires d’un oligo 32mer lui-même également

phosphorylé en 5’ (5’-ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGT GACTGGG-3’), cela crée

une matrice DNA:DNA possédant une simple coupure. Les oligomers de 15 et 17 nucléotides

sont marqués au P32 pour visualiser la ligation entre les deux, donnant une bande

radiomarquée de 32 nucléotides. L’oligomer complémentaire de 32 nucléotides également

phosphorylé à son extrémité 5’ par la kinase T4 en présence d’ATP froid (1 mM) permet

ensuite la ligation de plusieurs duplex entre eux et donc l’obtention de multiples de 32.

- Un mélange réactionnel de 30 µl (Tris HCl pH 7,5 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1

mM, ATP 1 mM et des volumes variables d’extrait enzymatique) va être utilisé pour

ce test. La réaction de ligation va se dérouler pendant des temps variables (1h, 2h ou

toute une nuit) à 20°C ou 37°C.

- La réaction est arrêtée grâce à l’ajout de 15 µl de tampon de charge de gel dénaturant

(formamide 90% (v/v), xylène cyanol 0,5% (p/v), bleu de bromophénol 0,5% (p/v) et

sucrose 10% (p/v)) et les extraits sont déposés sur un gel d’électrophorèse dénaturant

polyacrylamide à 16% préparé dans du TBE.

- Après 2h de migration à 1200V, le gel est séché puis autoradiographié avec un film

photo Kodak X-AR à -80°C en utilisant un écran amplificateur.

II.2.2.4- Test de réplication du cercle roulant.

La matrice mini-cercle est préparée selon le protocole décrit par Falkenberg

(Falkenberg et al, 2000):

122

5'

3'

5'

Si ouverture des

deux brins d'ADN

Sinon

Arrêt à

110 nucléotides

****

concatémères

Figure 45 : Réaction de polymérisation en présence de matrice mini-cercle.

- Un oligonucléotide 70mer 5#-(GGAATATTGAGGATGAAGGGTTGAGGTGAGTT

GAGTGGAGTATAGGATCGGGAGGGTAGTATGTGGAGG-3#) est phosphorylé

en 5’ et hybridé à un 20mer (5#-TCAATATTCCCCTCCACCAT-3#) complémentaire

au niveau des 10 premières et 10 dernières bases du 70mer.

- Ceci entraîne la circularisation du 70mer simple brin dont les extrémités sont liguées

par l’ADN ligase T4. un mélange réactionnel de 100 µl (Tris/HCl 50 mM pH 7,6,

MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, et BSA 25 µg/ml contenant 8 mmoles de

chaque oligonucléotide, 15 unités d’ADN ligase T4) est incubé toute la nuit à 20°C.

- La réaction est arrêtée par l’addition d’EDTA 25 mM.

- Après extraction volume à volume par un mélange phénol/chloroforme, les

oligonucléotides sont précipités à l’éthanol. Environ 50% des produits de réaction sont

des cercles monomériques simple brin.

- Le 70mer circulaire est purifié par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10%

contenant de l’urée 7 M préparé dans du TBE.

- 300 pmoles du 70mer circulaire vont ensuite être hybridés avec 400 pmoles d’un

oligomer de 90 nt partiellement complémentaire 5#-T40CCTCCACCATACTACCCTC

CCGATCCTATACTCCACTCAACTCACCTCAA-3# dans 100 µl d’un mélange

réactionnel contenant : NaCl 20 mM, Tris/HCl 50 mM pH 7,6.

- La matrice mini-cercle résultante est purifiée sur gel de polyacrylamide non dénaturant

à 12%.

Le 90mer peut aussi être marqué avec du 32P au niveau de l’extrémité 5’ terminale avant

appariement (figure 45).

- La matrice mini-circle (1.4 nM en concentration finale) est ajoutée à un mélange

réactionnel Tris/HCl 25 mM pH 7,6, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100µg/ml,

ATP 4 mM, glycerol 10%, dATP 250 µM, dTTP 250 $M, dGTP 250 $M, dCTP 10

$M, [%-32P]dCTP 2 $Ci, et différentes quantités d’extrait enzymatique.

- La réaction incubée à 37°C est terminée après différents temps juqu’à 90 min. Pour la

détection des petits fragments d’ADN, un volume égal de tampon de charge

(formamide 98%, EDTA 10 mM pH 8,0, xylène cyanol 0,025%, bleu de bromophénol

0.025%) est ajouté au mélange réactionnel.

- Les extraits sont ensuite chauffés à 95°C pendant 5 min, et analysés sur gel de

polyacrylamide 10% en condition dénaturante dans du tampon TBE.

- Le gel est ensuite séché sur papier whattman avec un appareil (Biorad model 583 Gel

Dryer) et autoradiographié pendant 3 jours à -80°C avec un film Kodak X-AR.

123

II.2.2.5- Test d’activité ARN polymérase ADN dépendant.

L’activité ARN polymérase a été testée dans les complexes de réplication à partir

d’extraits purifiés en utilisant 5 µl d’échantillon. Le mélange réactionnel est le suivant :

45 µl (Tris HCl 50mM pH 7,5, MgAc 10 mM, DTT 1 mM, BSA 200 µg/ml, ATP 200

µM, CTP 200 µM et GTP 200 µM et [3H]UTP 1 µCi, polyd(AT) 50 µg/ml) sont mis en

présence de 5µl d’extrait enzymatique.

- Après incubation à 37°C pendant 1 h, les réactions sont stoppées par addition de 2 ml

d’acide trichloracétique (TCA) à 10% (v/v) contenant 100 mM de pyrophosphate de

sodium pour précipiter les acides nucléiques.

- Les précipités sont filtrés à travers une membrane de nitrocellulose (Sartorius stedim

biotech 0,45 µm) préalablement lavée avec du TCA 2%.

- Les filtres sont séchés et placés dans des tubes à scintillation de 7 ml (Dutscher) après

addition de 2 ml d’un mélange scintillant (Ultima GoldTM, Perkin Elmer), la

radioactivité retenue sur les filtres est mesurée au compteur à scintillation liquide de

type LKB 1211 RACK BETA.

Les tests ont été réalisés en présence de concentration allant jusqu’à 12.5µg/ml

d’!-amanitine. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage d’activité par rapport à la

ARN polymérase T7 (enzyme contrôle).

II.2.3- Séparation des protéines sur gel d’électrophorèse.

II.2.3.1- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes.

Dans cette méthode électrophorétique, les protéines sont séparées sur un gel de

polyacrylamide en conditions dénaturantes selon la méthode de LAEMMLI (Laemmli, 1970),

en utilisant l'appareil MiniProtean II de Bio-rad.

- Un gel de séparation (4,6 ml contenant Tris/HCl 375 mM pH 8,8, acrylamide 10%

(p/v), bis-acrylamide 0,33% (p/v), SDS 0,1% (p/v), APS 0,04%, TEMED 0,004%) est

tout d’abord coulé entre deux plaques de verre de dimensions 50 x 82 x 1 mm

(Biorad).

- Une fois le gel de séparation polymérisé, un gel de concentration (4 ml contenant

Tris/HCl 125 mM pH 6,8, acrylamide 5% (p/v), bis-acrylamide 0,14% (p/v), SDS

0,1% (p/v), APS 0,04%, TEMED 0,004%) est ensuite coulé en plaçant un peigne de 1

124

mm utilisé pour former 10 puits pouvant contenir chacun des volumes d'échantillons

allant jusqu'à 40 µl.

- Avant leur dépôt, les échantillons sont dénaturés par addition d’un volume de tampon

d’échantillon (Tris/HCl 125 mM pH 6,8, SDS 5% (p/v), Dithiothréitol 10% (p/v),

glycérol 20% (v/v), bleu de bromophénol 0,004 % (p/v)) à un volume d'échantillon,

puis chauffage 5 min à 95°C.

- 5µl de marqueurs de poids moléculaires (Pageruler Prestained Protein Ladder,

Fermentas) sont déposés dans l’un des puits.

- La migration est réalisée dans le tampon d’électrophorèse contenant 25 mM Tris/HCl

pH 8,3, glycine 0,192 M (p/v), SDS 0,1% (p/v), et en appliquant un courant constant

ne dépassant pas 20 mA par gel jusqu’à ce que le front de migration arrive au bas du

gel d’électrophorèse.

En ce qui concerne les gels de grandes tailles (avec des plaques 20x24 cm) le gel

contient les mêmes concentrations des composants toutefois la migration est réalisée durant

une nuit à un voltage de 130 V, un courant de 30 mA et une puissance de 1 W.

II.2.3.2- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition native.

3 LE BN-PAGE

La technique du BN-PAGE (Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis) est

basée sur celle décrite par Schägger (Wittig et al, 2006) qui permet de séparer les complexes

de la chaîne respiratoire.

Le gel de séparation est un gradient continu d’acrylamide de 4 à 15%.

- Le formeur de gradient et les solutions doivent être placés à 4°C avant utilisation.

- Les plaques (20cmX20cm) sont assemblées avec des entretoises de téflon de 1 mm et

grâce à l’utilisation de pinces placées sur tous les cotés excepté en haut.

- L’étanchéité entre les deux plaques est réalisée à l’aide d’1 ml d’une solution 15%

(Acrylamide 15%, Bis Acrylamide 0,4%, acide 6 aminocaproïque 0,37 M, Tris 37

mM, Glycérol 13,6% (v/v), Temed 0,03%, APS 0,33%) auquel 20 µl d’APS 10% et

10 µl de TEMED sont ajoutés et que l’on fait glisser le temps de la polymérisation à

chaque angle du montage. L’opération est renouvelée une seconde fois pour s’assurer

de l’étanchéité de l’assemblage.

- Une fois les joints polymérisés, un formeur de gradient est alors positionné au dessus

d’un agitateur magnétique légèrement penché du coté relié à la pompe péristaltique.

125

- Une pompe péristaltique (Minipuls 2) est associée au montage à l’aide d’un tuyau de

caoutchouc relié à une sortie du compartiment de droite du formeur de gradient.

- Dans le compartiment de gauche sont versés 12 ml de la solution d’acrylamide à 4%

(Acrylamide 4%, Bis Acrylamide 0,13%, acide 6 aminocaproïque 0,45 M, Tris 45

mM, Temed 0,04%, APS 0,4%), le canal de connexion entre les deux compartiments

est ouvert ce qui va permettre de vérifier la connexion entre les deux compartiments.

La vanne est ensuite refermée, la solution de 4 % dans le compartiment de droite est

transvasée à gauche.

- 12 ml de la solution à 15% d’acrylamide sont ensuite versés dans le compartiment de

droite auquel est ajouté un mini-barreau aimanté.

- La pompe est alors mise en marche à une vitesse de 648 unités pour permettre un

mélange efficace des solutions dans le compartiment de droite.

- Une fois le gel coulé, de l’eau est déposée délicatement au dessus du gel de séparation.

- Lorsque le gel est polymérisé, l’eau est retirée puis une solution à 3% d’acrylamide

(Acrylamide 3%, Bisacrylamide 0,1%, acide 6 aminocaproïque 0,62 M, Tris 62 mM,

Temed 0,08%, APS 0,8%) est déposée sur le gradient 4-15%. Des peignes en téflon de

1 mm sont ensuite utilisés pour permettre la formation des puits.

- Lorsque le gel de concentration à 3 % d’acrylamide est polymérisé, l’entretoise du bas

est retirée ainsi que le peigne.

- La plaque est disposée sur une potence de 25 cm de hauteur (Apelex) à 4°C en

chambre froide. Le réservoir de l’anode est rempli avec du tampon de migration

(Glycine 75 mM, Tris 50 mM : PlusOne pH 7.0), les bulles se trouvant sous le gel sont

retirées à l’aide d’une seringue de 50 ml et d’une aiguille courbée.

- Les puits sont lavés dans un premier temps avec 10 ml d’une solution de tampon de

migration de 350 ml dans laquelle du Serva Blue G (Serva) est solubilisé à raison de

0,75% (p/v). Le réservoir de la cathode est ensuite rempli jusqu’à ce que les puits

soient en contact avec le tampon.

- Avant d’être déposés, les échantillons sont dilués pour obtenir une concentration

saline inférieure à 0,1 M avec un tampon sans sel (Tris 50 mM, acide 6

aminocaproïque 0,75 M pH 7.0) pour éviter de perturber la migration.

- Le tampon de charge est ensuite ajouté aux échantillons pour permettre de visualiser le

front de migration (concentration finale : acide 6 aminocaproïque 75 mM, Serva Blue

G 0,75% (p/v)).

- Une fois les extraits chargés, le montage est mis sous tension à un voltage de 100 V,

un ampérage de 30 mA et une puissance de 1W pendant 48 à 72h.

126

Pour visualiser la taille des complexes, des protéines marqueurs (Thyroglobuline 670

kDa, BSA 60 kDa) vont être déposées dans les mêmes conditions que l’échantillon.

3 LE CN-PAGE

Cette électrophorèse est réalisée en condition native, les conditions de migration sont

identiques à celle du BN-PAGE à l’exception de l’absence de Serva Blue G dans le tampon

cathode, de plus aucun tampon de charge ne sera ajouté aux échantillons.

II.2.3.3- Seconde dimension dénaturante après une première dimension native.

Les extraits déposés en première dimension en condition native peuvent subir une

seconde dimension dénaturante. Pour cela, les pistes dans lesquelles les échantillons ont migré

sont découpées soigneusement et le gel à 3% d’acrylamide est retiré. Ces bandes vont subir

des étapes de préparation à la seconde dimension, c'est-à-dire dénaturation des protéines et

réduction des ponts disulfures.

- Les bandes vont être incubées dans une solution de tampon d’équilibration (Tris/HCl

125 mM pH 6,8, SDS 1%) pendant 5 min.

- Puis la bande sera incubée pendant 15 min dans du tampon d’équilibration

supplémenté de 50 mM final de DTT.

- Pour empêcher que les ponts disulfures se reforment les bandes vont être incubées 15

min dans du tampon d’équilibration contenant 5 µM d’iodoacétamide.

- Enfin, les bandes sont lavées avec du tampon d’équilibration seul pendant 5 min pour

retirer l’iodoacétamide.

- La bande est ensuite disposée à 1 cm du haut d’une plaque (24cmX20cm) portant des

« oreilles ». Les spacers sont ensuite disposés comme précédemment (BN-PAGE) et la

seconde plaque est ajoutée dessus. La disposition des « spacers » a pour but d’éviter

des fuites toutefois comme précédemment des joints sont nécessaires pour l’étanchéité

du montage et sont réalisés 2 fois à l’aide de 1 ml de gel de séparation (Acrylamide

10%, Bisacrylamide 0,26%, Tris/HCl 0.38 M pH 8,8, APS 0,05%, Temed 0,005%) et

20µl d’APS ainsi que 10µl de TEMED.

- Une fois les joints polymérisés, le gel de séparation (Acrylamide 10%, Bisacrylamide

0,26%, Tris/HCl 0.38 M pH 8,8, APS 0,05%, Temed 0,005%) est coulé par le côté de

127

la bande et 2 ml de butan-1-ol sont déposés sur le gel de séparation pour obtenir une

zone de contact horizontale entre les 2 gels.

- Après polymérisation, un gel de concentration (Acrylamide 4%, Bisacrylamide 0,1%,

Tris/HCl 127 mM pH 6,8, APS 0,08%, Temed 0,008%) est coulé autour de la bande

de première dimension traitée. Un puit est rajouté à coté de la bande pour permettre de

déposer des marqueurs de poids moléculaires (Pageruler Prestained Protein Ladder,

Fermentas).

- Après polymérisation, le spacer du bas est retiré et l’électrophorèse se déroule pendant

toute une nuit (14 h) à un voltage de 130V, un ampérage de 30 mA et une puissance

de 1W dans les conditions de tampon de migration identiques à la partie II.2.5.1. Une

potence de 25 cm (Apelex) est utilisée pour ce gel.

II.2.3.4- Western-blotting.

3 Transfert des protéines sur membrane PVDF

Après séparation sur gel d’acrylamide, le gel est démoulé et les protéines sont

transférées sur membrane de PVDF (Immobilon-P;, Millipore) comme il suit.

- La membrane d’immobilon est immergée 5 secondes dans du méthanol pur, rincée à

l’eau distillée et laissée 15 minutes dans du tampon Anode II (Tris/HCl 25 mM pH

10.4, méthanol 20% (v/v)).

- Le gel quant à lui est incubé dans le tampon cathode (Tris/HCl 25 mM pH 9.4, glycine

40mM, méthanol 20% (v/v)).

- Le transfert est réalisé grâce à un appareil de transfert semi-sec (The W.E.P.

company). 6 feuilles de papier Whatmann 3MM à la dimension du gel sont utilisées

pour cette manipulation et forment un sandwich avec la membrane et le gel.

- Les papiers sont répartis d’une façon particulière pour permettre de faire passer le

courant ; de haut en bas : 2 feuilles sont d’abord immergées avec du tampon Anode I

(Tris/HCl 0.3 M pH 10.4, méthanol 20% (v/v)) puis 1 feuille préalablement immergée

dans du tampon Anode II puis la membrane et le gel et enfin pour faire le contact avec

la cathode, 3 feuilles imbibées de tampon cathode.

- Le transfert est effectué à une intensité constante de 2.5 mA/cm2 pendant 30 mn à

température ambiante. L’efficacité du transfert est vérifiée par coloration au rouge

ponceau S lorsque la quantité de protéines le permet. Dans tous les cas, l’efficacité est

appréciable grâce à la visualisation sur la membrane des marqueurs protéiques

128

précolorés de masses moléculaires connues (PageRulerTM Prestained Protein Ladder,

Fermentas) déposés sur le gel. Le transfert peut être prolongé à 1h pour les grosses

protéines. La membrane est rincée à l’eau.

3 Immunodétection

L’immunodétection est réalisée à température ambiante avec agitation constante.

- La membrane est immergée dans une solution de saturation pendant 1 heure sous

agitation planaire à 50 rpm (New Brunswick Scientific model G-33, EDISON, N.J.,

USA) ou toute la nuit contenant du tampon PBS (Tris/HCl 10 mM pH 8, NaCl 150

mM), 0,01% de Tween20 et 5% de lait écrémé. La solution de saturation permet de

bloquer les sites d’interactions non spécifiques entre la membrane et les anticorps. Le

Tween20 est un détergent qui permet d’éliminer toutes les interactions Ac-Ag non

spécifiques.

- Elle est ensuite incubée sous agitation planaire à 50 rpm pendant 2h dans la solution

anticorps primaires dilués dans du tampon PBS contenant 1% de lait écrémé suivant

les concentrations indiquées par les fournisseurs des anticorps. La membrane est

ensuite lavée huit fois pendant 5 minutes chaque fois avec du tampon PBS contenant

0,01% de Tween20.

- La membrane est ensuite incubée sous agitation planaire à 50 rpm pendant une heure

dans du tampon PBS contenant 5% de lait écrémé et l’anticorps secondaire adéquat

couplé à la peroxydase de raifort et dilué selon les indications des fournisseurs. La

membrane va de nouveau être lavée huit fois 5 minutes avec du tampon PBS

contenant 0,01% de Tween20.

- La révélation conduisant à une immuno-empreinte est réalisée à l’aide du kit

« SuperSignal; West Pico Chemiluminescent Substrate » (Pierce) suivant les

recommandations du fournisseur.

L’anticorps secondaire qui reconnaît l’anticorps primaire est couplé à la peroxydase de raifort.

La réaction catalysée par cette enzyme permet de localiser l’antigène. Elle consiste en

l’oxydation du luminol à pH basique en présence de peroxyde d’hydrogène et de la

peroxydase de raifort. Cette réaction permet la révélation des bandes protéiques portant

l’antigène correspondant à l’anticorps primaire. Au niveau des bandes correspondantes, la

lumière émise impressionne un film photographique. Si les conditions d’exposition du film ne

129

conduisent pas à la saturation de la plaque photographique, l’intensité de l’empreinte est

proportionnelle à la quantité d’antigène présent.

II.2.3.5- Techniques de coloration et séchage des gels.

II.2.3.5.1- Coloration au bleu de coomassie.

Après électrophorèse, le gel est démoulé puis subit 3 lavages à l’eau ultra-pure de 5

min chacun. Le gel est ensuite coloré dans le tampon de coloration (Imperialtm protein stain,

Pierce) par incubation pendant 1h, puis décoloré sous agitation planaire à 50 rpm avec de

l’eau ultra-pure jusqu’à ce que le fond devienne incolore. Ce bleu de coloration permettrait de

visualiser des protéines présentes sur un gel à une concentration de 3 ng.

II.2.3.5.2- Coloration au nitrate d’argent.

Chaque étape s’effectue à température ambiante sous agitation à 50 rpm sur Rotamax

120.

- Après migration électrophorétique, le gel est décroché des plaques de verre et plongé

dans la solution de fixation (éthanol 50%, acide acétique 10%) pendant 20 minutes.

- Le gel est ensuite lavé avec une solution d’éthanol à 30% pendant 10 min, puis en

présence d’eau distillée pendant 10 min, puis incubé dans une solution de

sensibilisation (ProteoSilverTM Sensitizer, SIGMA).

- Après deux lavages de 10 minutes chacun avec de l’eau distillée, le gel est immergé

pendant 10 minutes dans la solution de nitrate d’argent (ProteoSilverTM Silver

solution, SIGMA).

- Enfin, un court lavage à l’eau distillée de 60 à 90 secondes est réalisé et la solution de

développement est ajoutée au gel pendant 3 à 7 min.

- La réaction est stoppée par ajout de solution stop (ProteoSilver stop solution) et le gel

incubé 5 minutes avant d’être lavé avec de l’eau distillée pendant 15 min. Le gel peut

être conservé à 4°C dans des sachets plastiques avec de l’eau s’il est scellé

hermétiquement.

Les bandes qui présentent un intérêt pour notre étude peuvent être découpées pour une

analyse en spectrométrie de masse MS/MS. Pour réaliser la découpe des bandes, une lame de

scalpel est utilisée pour chaque bande découpée afin d’éviter les contaminations. La lame est

trempée successivement dans trois récipients contenant de l’eau ultrapure, de l’éthanol pur et

130

Phase 1

Fraction contenant

les formes légères

Phase 2

Fraction contenant

les formes lourdes

et complexes

Phase 3

Phase 4

Phase 1

Fraction contenant

les formes légères

Phase 2

Fraction contenant

les formes lourdes

et complexes

Phase 3

Phase 4

Figure 46 : Technique de purification du réplisome mitochondriale.

Addition de 2 M KCl et 5% PEG 8000

Surnageant

Surnageant

Coussin de saccharose 2 M

Mitochondries purifiées

Dépôt sur coussin

de saccharose 2 M

Dialyse avec du tampon A + 0,25 M saccharose (4h)

Puis centrifugation 10 min à 13000 g

100 000g

pendant 16h

Lyse par choc osmotique

Récupération des fractions

Agitation pendant 1h puis

centrifugation 20 min à 13 000 g

de l’eau ultrapure. Les bandes sont déposées séparément dans des tubes stériles de 0,5 ou 1,5

ml.

II.2.3.5.3- Coloration des membranes de Western-blot au rouge ponceau S.

La coloration pendant 1 à 2 minutes au rouge ponceau permet de visualiser les

protéines qui ont été transférées sur la membrane PVDF. On immerge la membrane avec une

solution contenant du rouge Ponceau S 0,5% (p/v), acide acétique 1% (v/v). La décoloration

se fait par lavages successifs à l’eau distillée.

II.2.3.6- Séchage des gels.

Après coloration, les gels sont séchés entre deux feuilles de cellophane imbibées dans

une solution d'éthanol à 12% (v/v) et tendues à l'aide d'un cadre en plexiglas. Une fois, les

gels secs, le cadre en plexiglas est retiré et les gels sont découpés.

II.2.4- Purification du complexe de réplication.

II.2.4.1- Extraction des protéines mitochondriales.

Les mitochondries purifiées sont lysées par choc osmotique (figure 46):

- les mitochondries sont diluées de moitié en présence d’eau ultrapure avec du Triton X-

100 à 0.5 % final.

- Le mélange est ensuite ajusté à 2 M KCl et 5 % de PEG 8000. Ce mélange va être

incubé à 4°C sous agitation de 10 rpm (Labinco LD-79) pendant 1 heure.

- Le surnageant récupéré après centrifugation à 16 000 g pendant 20 mn est dialysé avec

du tampon A (Tris/HCl 50 mM pH 7.5, KCl 0.15 M, DTT 1 mM, EDTA-Na3 1 mM,

EGTA 1 mM, PMSF 1 mM) contenant 0,25 M de saccharose.

- Pour des volumes inférieurs à 3 ml, une cassette de dialyse (Slide-A-Lyzer® Dialysis

Cassette, Thermo) est utilisée. L’échantillon est injecté dans la cassette à l’aide d’une

seringue stérile et d’une aiguille spéciale fournies par le fournisseur. Une fois, l’extrait

injecté, la cassette est maintenue en immersion à l’aide de supports de mousse fournis

par le fournisseur. Deux changements de 330 ml de tampon de dialyse sont réalisés

durant les 4h pour accélérer le transfert du KCl. Une fois la dialyse terminée les

échantillons sont récupérés à l’aide de la seringue stérile.

131

type de colonne pouvoir de séparation

Superose 12 10/30 1 000 à 300 000 Da

Superdex 200 10/300 gl 10 000 à 600 000 Da

Superose 6 5000 à 5 000 000 Da

Séphacryl S 400 20 000 à 8 000 000 Da

Tableau 6 : Pouvoir de séparation de 4 colonnes de tamisage moléculaire qui seront utilisées

ultérieurement.

- Pour des volumes supérieurs à 3 ml, des boudins de dialyse (Regenerated cellulose

tubular membrane, taille 2, Cellu Sep™) sont utilisés. Le boudin est incubé pendant 5

min dans du tampon de dialyse et rincé intérieurement avec ce même tampon.

L’étanchéité du boudin est contrôlée en fermant une des extrémités et en le

remplissant avec du tampon. Le boudin est ensuite vidé et l’échantillon est déposé

avec une pipette. Le boudin est fermé avec un nœud et en le gonflant au maximum. Le

boudin est déposé dans un bécher contenant le tampon de dialyse. Deux changements

de tampon de dialyse sont réalisés durant les 4 h.

- Les échantillons sont ensuite centrifugés à 13 000 g pendant 10 mn pour récupérer le

surnageant.

II.2.4.2- Ultracentrifugation sur coussin de saccharose.

- Le surnageant précédent est déposé sur un coussin de saccharose 2 M dans du tampon

A et ultracentrifugé à 100 000 g pendant 16 h à 4°C (rotor Beckman SW41Ti).

- Un tube contrôle contenant du bleu dextran (2 000 kDa) est réalisé à chaque

expérimentation.

- La migration du bleu va ainsi nous permettre par comparaison de récupérer la phase

correspondant aux complexes de hauts poids moléculaires.

- Les différentes phases seront ensuite récupérées successivement.

II.2.4.3- Chromatographie de filtration sur gel.

Pour séparer les complexes des protéines libres, des chromatographies de tamisage

moléculaire ont été réalisées. Des colonnes Superdex 200 10/300 gl, Supérose 12 10/30,

supérose 6 et Séphacryl S 400 possédant différent pouvoir de séparation sont utilisées (tableau

6). Le tampon utilisé pour ces chromatographies correspond au tampon A supplémenté de

0,25 M Saccharose. Les colonnes sont préalablement équilibrées avec au moins un volume de

colonne avec ce même tampon avant injection de l’échantillon.

II.2.4.4- Expérience de trapping.

Cette technique basée sur celle décrite par Insdorf et Bogenhagen (Indorf et

Bogenhagen, 1989) permet de déterminer sur gel de polyacrylamide la taille des sous unités

catalytiques des ADN polymérases. Après réaction en présence d’un oligonucléotide et de

substrat radioactif [!-32

P]dATP, une base de Schiff est formée par l'intermédiaire d'un agent

pontant photoactivable aux UV, le BrdUTP. La matrice-amorce utilisée est un oligonucléotide

132

de 36 nucléotides dont la séquence entraine la formation d’une structure en épingle à cheveu :

5’-TCTCCATAATTTGACGGCCTGACTCACCAGGCCGTC-3’.

- Une fraction enzymatique de 20 µl est incubée pendant 10 minutes à 37°C dans un

milieu réactionnel de 80 µl contenant Tris/HCl 25 mM pH 8, DTT 10 mM, acétate de

magnésium 10 mM, KCl 50 mM, Triton X-100 réduit 0,02%, BSA 0,125 g/l, BrdUTP

10 µM, [!-32P]dATP (3000 Ci/mmol) 0,085 µM, oligonucléotide 36-mer 0,375 µM.

- Afin de permettre la liaison entre l'ADN polymérase et l'oligonucléotide, le mélange

est ensuite exposé aux UV à une distance de 6 cm de la lampe UV (Fisher Bioblock

Scientific, 312 nm, 1 mW/cm2), pendant 15 minutes, à 4°C.

- Les échantillons sont ensuite déposés sur gel natif BN-PAGE pour déterminer la taille

de l’ADN polymérase ou d’un complexe comportant une activité ADN polymérase.

- Le même essai est réalisé dans des conditions identiques à l’exception du

remplacement de [!-32P]dATP par du dATP non radioactif, et séparé sur un autre gel

BN-PAGE.

- Après migration, le gel est mis à autoradiographier à –80°C avec un écran

intensificateur.

Après comparaison entre les deux gels, les bandes sont découpées sur le gel non radioactif,

coloré au nitrate d’argent, et sont ensuite analysées par spectrométrie de masse MS/MS.

II.2.4.5- Expérience de pontage.

II.2.4.5.1- Pontage in organello.

Le pontage au formaldéhyde est réalisé in organello (Bogenhagen et al, 2008).

- les mitochondries sont re-suspendues dans 0,9 ml de tampon MSH (Mannitol 210

mM, Sucrose 70 mM, HEPES 20 mM pH 8, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,2

mM, pepstatine 2 µM, leupeptine 5 µg/ml) mélangé avec 0,1 ml de formaldéhyde 10

% dans du tampon MSH.

- Le mélange est incubé pendant 30 min à 4°C à 10 rpm (Labinco LD-79). La réaction

est arrêtée par ajout de glycine à une concentration finale de 125 mM pH 7,3.

- Après une incubation 5 min à 4°C, les mitochondries ainsi traitées sont extraites selon

le protocole de purification du réplisome mitochondrial.

Le pontage au formaldéhyde peut aussi être réalisé selon un second protocole

légèrement (Kaufman et al, 2000) différent du précédent.

133

- Les mitochondries purifiées sont lavées avec un tampon de re-suspension RB

(Saccharose 0,5M, HEPES 20 mM pH 7,6, EDTA 2 mM, EGTA 1 mM) par

centrifugation à 12 500 rpm (rotor SS-34, Sorvall)

- Les protéines mitochondriales sont ensuite diluées à 2 mg/ml dans le tampon de

crosslinking CB (RB + HEPES 50 mM pH 7,6, NaCl 50 mM, "-mercaptoéthanol 7

mM, PMSF 1 mM, du cocktail anti-protéase (Roche), Spermidine 1 mM).

- Le formaldéhyde est ajouté à une concentration de 1% et l’incubation est réalisée

pendant 16h à 4°C avec une faible rotation. La réaction est arrêtée par l’addition de

glycine 125 mM pH 7,0, et les mitochondries sont centrifugées à 16 000 g puis re-

suspendues dans un tampon CB supplémenté en glycine 50 mM.

II.2.4.5.2- Pontage au DSP (Dithiobis succinimidyl propionate).

Le pontage au DSP est réalisé en présence des extraits protéiques selon le protocole

décrit par Paumard (Paumard et al, 2000).

- Les protéines sont incubées dans un tampon (Mannitol 0,6 M, EGTA 2 mM,

Triéthanolamine HCl 50 mM pH 8,0) à volume égal.

- Le DSP est ensuite ajouté à une concentration finale de 200µM, le mélange est incubé

pendant 30 min à 27°C.

- La réaction est arrêtée grâce à l’ajout de Tris 1 M pH 8,0 à 20 mM final.

- Le pontage au DSP peut être rompu grâce à l’utilisation de DTT à la concentration

finale de 50 mM après incubation 30 min à 37°C.

II.2.4.6- Ultracentrifugation sur gradient de saccharose.

Une étude de complexe passe par la détermination du coefficient de sédimentation de

ce dernier, cette donnée exprimée en Svedberg peut être obtenue par ultracentrifugation sur

gradient de saccharose. Par comparaison avec le coefficient de sédimentation de protéines

marqueurs, nous pouvons ainsi déterminer le coefficient de sédimentation du complexe

d’intérêt.

- La phase d’intérêt contenant du saccharose doit être dialysée pour diminuer cette

concentration à 5%. Ainsi, une dialyse de 2 h est réalisée avec 1 litre de tampon A

plus 5 % de saccharose de façon semblable au protocole II.2.4.1.

- Le gradient de saccharose 10-40% est réalisé à l’aide d’une pompe péristaltique

(Minipuls 2) et d’un formeur de gradient. De façon similaire à la partie II.2.5.2, deux

134

solutions de 10% et de 40% de saccharose dans du tampon A sont utilisées pour

former un gradient au dessus d’un coussin de 500µl de saccharose 2M.

- 1 ml de l’extrait est ensuite déposé sur le gradient de saccharose et centrifugé pendant

24 h à 35 000 rpm avec un rotor SW 41 Ti (Beckmann).

- Le gradient est séparé en 32 fractions de 350 µl chacune, à l’aide d’un Densi-flow®

IIC couplé à une pompe péristaltique et à un collecteur de fraction Redifrac LKB

(Pharmacia).

- L’activité ADN polymérase testée en présence soit de 10 ou 50 mM MgAc, ainsi que

l’activité ADN topoisomérase sont recherchées dans une fraction sur deux.

- Des protéines marqueurs ont été utilisées dans les mêmes conditions que l’extrait

précédent : la thyroglobuline (19S), la catalase (11,3S), l’aldolase (7,3S) et

l’ovalbumine (3,5S)

II.2.4.7- Immunoprécipitation.

Les mitochondries provenant de souches exprimant des protéines TAPTAG sont

traitées selon le protocole de purification du complexe de réplication mitochondrial.

- Les extraits sont mis en présence de 200 µl d’IgG sépharose et sont incubés pendant

2h à 4°C à une rotation de 10 rpm (Labinco LD-79).

- Les billes sont ensuite montées en colonne de type Tricorn (GE Healthcare) et sont

lavées avec du tampon 0 M NaCl (utilisé lors du II.2.4).

- Après un lavage de 5ml avec le tampon 0 M NaCl, les protéines sont éluées en

augmentant la concentration en sel par paliers successifs de 5 ml de 0,1 M, 0,5 M, 1 M

et 2 M NaCl.

II.2.5- Chromatographie d’affinité.

II.2.5.1- Souches de levures utilisées.

Pour réaliser les études d’affinité, nous exploitons l’avantage que représente

l’interaction entre la Protéine A de Staphylococcus aureus et les IgG, résistante à une

concentration en sel élevée. Il existe une collection de souches de levures chez Open

Biosystem dont chacun des gènes est systématiquement fusionné au TAPTAG avec un

marqueur de sélection HIST3MX6. Ce TAPTAG est composé d’un fragment de la protéine A

possédant 2 sites de fixation des IgG, d’un linker qui peut être clivé par la protéase TEV

(Tobacco Etch Virus) et de l’hémaglutinine. Nous avons 7 souches TAPTAG qui seront

135

utilisées pour réaliser des chromatographies d’affinité, correspondant successivement à

l’ADN polymérase !, la sous unité B de l’ADN polymérase !, l’ADN polymérase #, l’ADN

topoisomérase I, l’ADN ligase I, la protéine Rim1 et la nucléase 1.

II.2.5.2- Protocole d’élaboration des chromatographies d’affinité

Dans le but d’éviter le plus possible les contaminations nucléaires, les protéines

étiquetées sont extraites à partir de mitochondries purifiées.

- Les mitochondries (environ 100 mg/ml de protéines mitochondriales) sont cassées

selon le protocole décrit dans la partie II.2.3.1.

- Le surnageant est ensuite dilué pour obtenir une concentration de 0,25 M NaCl.

- 500µl de billes d’IgG sépharose sont lavées deux fois avec du tampon A, puis

centrifugés 10 secondes à 5000g pour supprimer le tampon de conservation.

- Le surnageant est retiré et un lavage acide avec de la glycine pH 2,8 est réalisé dans le

but de décrocher les IgG mal greffées sur les billes.

- Les billes sont ensuite lavées 3 fois avec du tampon A pour les équilibrer à un pH de

7,5.

- Les 500 µl de billes équilibrées sont ensuite ajoutés au surnageant possédant une

concentration de 0,25 M NaCl et incubés pendant 2 h à 4°C à 10 rpm (Labinco LD-

79).

- Les billes sont récupérées par centrifugation à 3000g pendant 5 min en éliminant le

surnageant.

- Après une remise en suspension dans du tampon 0 M, les billes sont coulées dans une

colonne chromatographique système Tricorn (GE Healthcare). Une fois la résine

sédimentée, la colonne est montée sur une chaîne AKTA purifier puis les protéines

non étiquetées sont éluées grâce à l’injection de tampon 2M.

- Une fois la colonne ainsi montée, des extraits protéiques sont déposés sur les colonnes

à un débit de 0,5 ml/min.

- Après le chargement et lavage avec 5 ml de tampon 0 M, les protéines sont décrochées

grâce à quatre STEPs successifs de 5 ml de 0,1 M, 0,5 M, 1 M et 2 M NaCl. Les

échantillons sont recueillis sous forme de fractions de 350 µl.

II.2.5.3- Purification de l’ADN topoisomérase.

Certaines activités enzymatiques peuvent en masquer d’autres ; c’est le cas des

nucléases capables de digérer un substrat plasmidique utilisé pour le test ADN topoisomérase.

136

Dans ce cas là, il est nécessaire de réaliser une étape supplémentaire de purification pour

pouvoir observer les topoisomères en séparant les activités enzymatiques. En m’inspirant de

Tua et al, 1997 qui ont mis au point un protocole pour purifier l’ADN topoisomérase I

mitochondriale de levure S.cerevisiae, j’ai utilisé ce protocole pour séparer ces activités par

chromatographie échangeuse d’anion (Hi Trap Q 1 ml, GE Healthcare) à partir de souche de

levures ST40.

- La colonne est équilibrée avec 5 ml de tampon A, puis 5 steps de 5 ml de 0,1M, 0,25

M, 0,5 M, 1 M et 2 M sont réalisés.

- L’ADN topoisomérase est éluée avec 0,25 M NaCl tandis que les nucléases sont

décrochées de la colonne avec 1 et 2M NaCl.

II.3- Méthodes relatives à l’étude des acides nucléiques.

II.3.1- Techniques générales.

II.3.1.1- Détermination de la concentration des acides nucléiques.

La concentration des solutions d’acides nucléiques a été déterminée par mesure de leur

absorbance à 260 nm au nanodropTM sur des volumes réduits de 1 µl.

II.3.1.2- Préparation d’ADN mitochondrial de levures.

Pour purifier l’ADN mitochondrial, et s’affranchir de l’ADN nucléaire, nous utilisons

des mitochondries purifiées. Pour réaliser cette purification, nous avons utilisé un kit

QIAGEN – Dneasy Plant Mini Kit, et nous avons suivi les étapes de purification décrites dans

le protocole de QIAGEN. Nous sommes partis d’environ 50 µl de billes de mitochondries. Au

final, les ADN sont repris dans 100 µl d’eau RNA free.

II.3.2-Séparation et purification des fragments d’ADN.

II.3.2.1- Electrophorèse sur gel d’agarose.

L’électrophorèse en gel d’agarose est une méthode simple et efficace pour la

séparation de fragments d’ADN de tailles s’échelonnant entre 0,2 et 30 kpb. Elle est utilisée

pour analyser des hydrolysats de restriction et pour isoler des fragments d’ADN. Nous avons

utilisé diverses réticulations d’agarose en fonction de la taille des fragments d’ADN à séparer.

- 100 ml d’une solution du tampon TBE contenant 1 % d'agarose (p/v) est portée à

ébullition.

137

- Une fois la solution refroidie, du bromure d’éthidium ou du SYBR® Safe DNA gel

stain sont ajoutés dans la solution à une concentration de 0,005% et le mélange est

coulé dans des moules adaptés et des peignes sont ajoutés pour former des puits.

- Les extraits nucléiques sont préparés par addition d’un volume de tampon de charge

(Tris/HCl 20 mM pH 8, EDTA 100 mM, bleu de bromophénol 0,1% (p/v) et

saccharose 40% (p/v)) à 3 volumes d'échantillon.

- Après dépôt des échantillons sur le gel, l'électrophorèse est réalisée en tampon TBE à

voltage constant adapté à la taille du gel réalisé.

- Après migration, l'ADN coloré par le bromure d'éthidium (ou SYBR® Safe DNA gel

stain) à 0,01% est visualisé par exposition aux rayons ultra-violets. La taille des

fragments d'ADN est déterminée par comparaison avec des marqueurs de tailles.

Si l’objectif de l’expérience est de visualiser des topoisomères, aucun agent intercalant n’est

ajouté dans le gel avant électrophorèse sous peine d’obtenir des artefacts de migration.

II.3.2.2- Purification des fragments d’ADN à partir d’un gel d’agarose ou d’une solution.

Les bandes d’intérêt sont excisées délicatement avec une lame de scalpel stérile, les

ADN sont viualisés grâce au transilluminateur en essayant d’exposer le moins possible l’ADN

aux UV. Les bandes d’ADN sont ensuite traitées avec GE Healthcare-illustraTM GFXTM PCR

DNA and Gel Band Purification Kit suivant le protocole. Au final, les ADN sont solubilisés

dans 100 µl d’eau RNA-free.

II.3.3- PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne).

La Réaction de Polymérisation en Chaîne est basée sur le principe mis au point par

Mullis (Mullis et al, 1986). L'enzyme utilisée est l'ADN polymérase ADN dépendante

thermostable de la bactérie thermophile Thermus aquaticus (Chien et al, 1976, Kaledin et al,

1980) exprimée chez E.coli : l’Advantage 2 DNA polymerase (Clontech). Cette enzyme est

une taq polymérase dépourvue de son domaine nucléase.

Les réactions de polymérisation en chaîne ont été réalisées sur un thermocycleur de

type Biometra T gradient.

Chaque amplification est réalisée dans un volume réactionnel de 50 µl dans un tube

PCR dans lequel sont ajoutés :

:. 5 µl de tampon de réaction 10x.

:. 0,5µl de dNTP à 20 mM (soit 200 µM final).

138

:. 0,5µl d’amorces sens et 0,5µl d’amorces antisens (300 ng final).

:. 0,5µl de matrice ADN (0,5µg d’ADN final).

:. 0,5µl de Taq polymérase (2,6 unités d’enzyme).

Après une première étape de dénaturation à 95°C pendant 2 minutes, 24 cycles de

polymérisation sont réalisés (dénaturation 30 secondes à 95°C, hybridation 60 secondes au

Tm des amorces et polymérisation 60 secondes à 68°C). La réaction est terminée par une

étape de polymérisation de 10 minutes à 68°C et les échantillons sont conservés à 4°C.

5µl des produits de PCR sont ensuite analysés sur gel d’agarose et ensuite purifiés sur gel ou

directement en solution si le produit de PCR ne contient que le fragment souhaité.

II.3.4- Réalisation des constructions ORI5, COX3.

- L’ADN mitochondrial est tout d’abord extrait grâce à la technique décrite dans la

partie II.3.1.2.

- Des amorces spécifiques sont utilisées pour l’amplification par PCR. L’analyse de la

séquence ORI5 a permis de constater de grandes similarités de séquence entre toutes

les origines de réplication de la levure S.cerevisiae. Un fragment de même taille (300

pb) du gène COX3 qui sera utilisé comme contrôle, est amplifié de la même manière.

Amorces pour ORI5 : 5’-TTTTTATTCTATTGTGGGGGTCC-3’.

5’-ATATAAGTAATAGGGGGAGGGG-3’.

Amorces pour COX3 : 5’-ATCTTTGCTGGTTTATTCTG-3’

5’- GAGATAGTGAATGCAGCA-3’

- Les fragments amplifiés sont ensuite insérés dans le vecteur de clonage pGEM®-T

easy. Pour réaliser la ligation, nous préparons un mélange réactionnel de 10 µl

contenant :

:. 5 µl de tampon de ligation 2X (Promega).

:. 1 µl de pGEM®-Teasy.

:. 1 µl de ligase T4 (Promega) (soit 3 unités).

:. 3 µl d’ADN amplifié.

- La réaction se déroule à température ambiante pendant 1h.

- Des bactéries DH5! compétentes sont transformées avec ces constructions, pour cela

les 10 µl du mélange pGEM®-T easy sont additionnés à 200 µl de bactéries

compétentes.

- Le mélange est placé 30 min dans la glace puis on réalise un choc thermique durant

90s à 42°C et le tube est ensuite remis dans la glace pendant 5 min.

139

- Enfin, 800µl de SOC (Tryptone 2%, Yeast Extract 0,5%, NaCl 10 mM, MgSO4 10

mM, MgCl2 10 mM) sont ajoutés. Les bactéries sont mises 1h à 37°C puis elles sont

étalées sur milieu sélectif X-Gal ampicilline ce qui permet la sélection des clones

ayant intégré le plasmide et possédant un fragment d’ADN inséré au niveau du site

multiple de clonage de pGEM;-Teasy.

- Après culture toute la nuit, des colonies blanches vont être sélectionnées, elles auront

intégré le plasmide qui possède un fragment d’ADN inséré au niveau de son site

multiple de clonage. Il est nécessaire de déterminer si ce fragment peut correspondre à

notre fragment d’intérêt, pour cela les clones vont être analysés individuellement grâce

à des enzymes de restrictions (EcoRI) après extraction du plasmide. La comparaison

du fragment sur gel avec la taille du fragment prévue va être une première indication

sur ce fragment d’intérêt avant séquençage.

La séquence de l’ADN est déterminée par séquençage automatique (AB prism 310 Genetic

Analyzer), en utilisant le Kit BigDye ® Terminator Cycle sequencing Ready Reaction (Applied

Biosystems). A la fin de la réaction de PCR, les produits de réactions sont précipités dans de

l’éthanol absolu en présence de 300 mM acétate de sodium final pendant 15 min à

température ambiante. Le produit est centrifugé à 15 000 g pendant 20 min et le culot est lavé

avec trois volumes d’éthanol à 70 %, puis repris dans du tampon TSR (Template Suppression

Reagent). Les échantillons sont dénaturés à 90°C pendant 2 min avant d’être déposés dans le

séquenceur.

Si la séquence est correcte, le plasmide est amplifié par PCR avec des amorces

spécifiques biotinylées et des incubations en batch ou sur colonnes en présence des protéines

seront réalisées. L’incubation en batch est réalisée pendant 2 h à 4°C sous légère agitation,

tandis que l’incubation en colonne est réalisée à un flux constant de 50 µl/min. L’incubation

en présence de billes Streptavidine-agarose peut être réalisée avant incubation avec les

protéines (pour réaliser la méthode en colonne) ou après (pour réaliser la méthode en batch),

cette incubation est de 2 h à 4°C. Pour la méthode en colonne et en batch, le volume de billes

utilisé est de 200 µl. Pour la méthode en colonne, les billes après incubation avec l’ADN

appât seront déposées sur une colonne vide Tricorn (Amersham). Les extraits mitochondriaux

sont ensuite déposés sur la colonne à 0,5 ml/min puis la colonne est lavée par 5 ml de tampon

0M NaCl. Les protéines sont ensuites décrochées par quatre STEPs successif de 5 ml de 0,1

M, 0,5 M, 1 M et 2 M NaCl et les protéines sont recueillies dans des fractions de 250 µl

II.3.5- Marquage des oligonucléotides aux extrémités 5’.

140

Le marquage des oligonucléotides est réalisé à 37°C pendant 30 minutes dans un

volume final de 20 µl comprenant de l’imidazole-HCl 50 mM pH 6,4, MgCl2 12 mM, "-

mercaptoéthanol 1 mM, ADP 70 µM, 4 picomoles [#-32P]dATP, 30 unités de T4

polynucléotide kinase, et 25 picomoles d’oligonucléotides. L’échantillon est ensuite chauffé à

90°C pendant 1 minute et refroidi aussitôt dans la glace. Les oligonucléotides marqués sont

séparés sur gel acrylamide 12%-urée 7 M comme décrit ci-dessous. La bande correspondant à

la taille de l’oligonucléotide marqué est découpée du gel et plongée dans le tampon d’élution

(acétate d’ammonium 500 mM, EDTA 1 mM, SDS 0,1%) pendant 16 heures, afin d’extraire

les oligonucléotides. L’éluat est récupéré et précipité par 2,5 volumes éthanol, NaCl 150 mM

final pendant 2 à 3 heures à -20°C. Après centrifugation, 30 minutes à 15 000 rpm, le culot est

séché au speed-vac, puis repris dans 100 µl d’eau milliQ.

141

Tamisage_UV1_280nm activité ADN polymérase à 10 mM Tamisage_Fractions

0

100

200

300

400

mAU

0.0 0.5 1.0 1.5 2.

1A11A21A31A41A51A61A71A81A9 1A11 1B11B21B31B41B51B61B71B81B9 1B11 1C11C21C31C4

Figure 47 : Dépôt d'extrait mitochondrial traité comme le décrit dans le protocole II.3.1 sur une

colonne de tamisage Superdex 200. Dans le but de vérifier si le traitement II.3.1 permet de maintenir

des complexes, des extraits mitochondriaux sont déposés sur une colonne de tamisage Superdex 200 et

5 µl de chaque fraction sont testés par mesure d'activité ADN polymérase.

220 kDa440 kDa669 kDa

Activité

ADN polymérase

5000

10000

0

Activ

ité A

DN

po

lym

éra

se

(cp

m)

III- RESULTATS.

La découverte d’une seconde activité ADN polymérase dans la mitochondrie de

S.cerevisiae bouleverse les idées, voir les certitudes que l’on avait sur la réplication de l’ADN

mitochondrial et pose la question du rôle de chacune d’elle et de leurs possibles interactions.

L’étude du complexe de réplication chez la levure S.cerevisiae pourrait permettre

d’appréhender leur rôle et de comprendre les mécanismes d’interaction mis en jeu lors de la

réplication. La stratégie pour l’étude du réplisome est basée sur deux axes, le premier

correspond à la purification du complexe de réplication natif afin d’obtenir des informations

sur sa composition protéique, sa taille…. La seconde stratégie est basée sur l’étude

d’interactions avec des protéines supposées faire partie du réplisome afin de reconstituer le

complexe de réplication mitochondrial.

III.1- Purification du complexe de réplication natif.

Le principal moyen d’étude d’un complexe protéique est de purifier ce complexe sous

sa forme la plus fonctionnelle possible pour obtenir différentes informations sur sa

composition, sa taille, son coefficient de sédimentation…. Pour purifier un complexe dans son

intégralité, de nombreux facteurs entrent en jeu : sa stabilité, sa représentation dans la cellule.

Concernant le complexe de réplication mitochondrial de S.cerevisiae, peu de choses sont

connues, aussi un protocole de purification a dû être mis au point.

Dans le chapitre 1, il apparaît que d’autres protéines sont identifiées par spectrométrie

de masse avec l’ADN polymérase !7 après cinq colonnes de purification, leur présence

pouvait suggérer l’existence d’un complexe contenant cette ADN polymérase. Dans un

premier temps, nous avons voulu voir si le protocole décrit dans le paragraphe II.3.1 du

chapitre I permettait d’extraire un complexe contenant de l’activité ADN polymérase. Après

dépôt d’un extrait mitochondrial sur une colonne chromatographique Superdex 200, l’activité

ADN polymérase contenue dans les différentes fractions obtenues est testée à 10 mM MgAc.

Une activité ADN polymérase est observée dans des fractions correspondant à la masse des

ADN polymérases libres (environ 140 kDa) (figure 47). Aucune activité ADN polymérase

correspondant à des formes complexées n’est observée, ainsi, soit le complexe est dissocié

dans les conditions de l’expérience (concentration en sel, détergent, effet de dilution de la

colonne), soit la forme complexée de l’ADN polymérase est minoritaire par rapport à la forme

libre.

142

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Avant précipitation au PEG et

KCl

Après précipitation au PEG et

KCl

Fractions

Co

nce

ntr

atio

n p

roté

iqu

e (m

g/m

l)

Figure 48 : Mesure des concentrations protéiques avant et après traitement à 5% PEG et 2 M NaCl

ainsi qu'après ultracentrifugation sur coussin de saccharose 2 M.

Dans le but de concentrer et purifier le réplisome mitochondrial, un protocole

s’inspirant de la technique de purification du réplisome nucléaire de cellules humaines

(Malkas et al, 1990) a été mis au point. Il s’agit d’une technique décrite par Malkas qui a

permis d’obtenir des informations sur la composition ainsi que sur la masse du réplisome

nucléaire. Cette technique est basée sur un traitement au sel (KCl 2 M) en présence de PEG

(5% PEG 8000) suivi d’une ultracentrifugation sur coussin de saccharose qui permet de

purifier ce synthésome nucléaire.

III.1.1- Nouvelle stratégie de purification du complexe de réplication.

La purification est réalisée selon les techniques décrites dans matériel et méthodes

(paragraphe II.2.4.1 et II.2.4.2). Les mitochondries sont éclatées par choc osmotique en

présence d’eau milli Q. L’extraction des protéines est réalisée en présence de Triton X-100. Il

s’agit d’un détergent doux capable de solubiliser les membranes, couramment utilisé pour

solubiliser des protéines mitochondriales dont certaines sont associées aux membranes.

L’ADN nucléaire est réparti dans le noyau tandis que l’ADN mitochondrial possèderait des

points d’ancrage à la membrane interne mitochondriale (Albring et al, 1977). Ces points

d’ancrage seraient dus à une protéine : Mgm101, il s’agit d’une protéine transmembranaire

possédant la capacité d’interagir avec l’ADN et co-localisée avec l’ADNmt (Meeusen et

Nunnari, 2003). Elle pourrait permettre l’ancrage de l’ADNmt sur la membrane interne

mitochondriale. Cette protéine a été montrée comme faisant partie d’une structure

chevauchant les deux membranes mitochondriales et possédant une activité de réplication.

Parmi les autres protéines identifiées dans cette structure, l’ADN polymérase gamma ainsi

que la protéine Abf2 (ARS-binding factor 2) ont été retrouvées. La réplication de l’ADN

mitochondrial est arrétée dans des cellules délètées du gène MGM101. Si un complexe de

réplication est associé à la membrane interne mitochondriale, l’utilisation de triton X-100

pourrait permettre le décrochage via la solubilisation de Mgm101.

Un traitement au sel (KCl 2 M) est réalisé lors du protocole de purification et

permettrait également de décrocher les protéines liées à l’ADN. Le PEG-8000 à 5%

permettrait d’éliminer des protéines par une diminution des forces répulsives. Nous pouvons

constater qu’après ce traitement, la quantité de protéine dans l’extrait est diminué de 44% par

rapport à la concentration protéique avant traitement (figure 48 pistes 1 et 2). Ainsi, cette

étape devrait permettre de précipiter certaines protéines mitochondriales. Malkas et

collaborateurs ont montré que les protéines impliquées dans la réplication de l’ADN ne sont

pas précipitées suite à ce traitement. Les extraits sont ensuite dialysés en présence de

Saccharose 0,25 M dans du tampon A pour diminuer la concentration saline à 0,15 M.

143

49

50

Absorbance à 280 nm après dépôt 50 µl de Phase 1 FractionsAbsorbance à 280 nm après

dépôt 50 µl de Phase 2

Dans le but de concentrer les complexes protéiques mitochondriaux, notre extrait est

déposé sur un coussin de saccharose 2 M dans du tampon A. Une solution de bleu Dextran

(2 000 kDa) à environ 5 mg/ml est aussi déposée comme contrôle de centrifugation et de

positionnement des complexes de haut poids moléculaire. Après ultracentrifugation, nous

pouvons constater l’accumulation de bleu Dextran dans une zone (nommée phase 2) et cette

accumulation nous a permis de délimiter arbitrairement quatre phases (figure 49A). La phase

1 correspond au volume du dépôt et se trouve au dessus de la phase 2, elle ne présente pas de

coloration bleue. Les phases 3 et 4 correspondent respectivement à une couche en dessous de

la phase 2, présentant une faible coloration bleue et au reste du coussin de saccharose 2 M,

sans aucune coloration. Pour déterminer la taille d’éventuels complexes de protéines présents

dans les phases 1 et 2, les fractions correspondantes sont déposées sur une colonne Superdex

200 3.2/30 (GE Healthcare). Nous pouvons constater que la phase 2 contient des protéines de

haut poids moléculaire (présents dans le volume mort de la colonne) alors que la phase 1 ne

présente que des protéines retardées de petites tailles (figure 49B).

Dans le but de savoir si le réplisome est contenu dans l’une de ces phases, un test

d’activité enzymatique est réalisé avec un substrat modèle de type mini-cercle (voir partie

I.3). Ainsi, des tests d’activité en présence de ce substrat mini-cercle sont réalisés selon les

conditions décrites dans la partie II.2.2.4. Après électrophorèse en conditions dénaturantes,

nous pouvons constater la présence d’une bande de très haut poids moléculaire lors du test

réalisé en présence de la phase 2. Cette bande pourrait correspondre à des formes

concatamérisées d’ADN. Cela implique que la phase 2 contient une ADN hélicase qui a

permis l’ouverture de l’ADN. Une bande de 110 nucléotides est obtenue avec les phases 1, 2

et 3. Ce signal peut aussi être obtenu en présence des ADN polymérase # ou ! purifiées

(figure 50). Ainsi dans la phase 2, certaines enzymes comme une ADN hélicase doivent être

présentes contrairement aux phases 1 et 3 qui ne semblent contenir que l’activité ADN

polymérase. Ces résultats nous ont amenés à utiliser la phase 2 comme point de départ pour

l’étude et la caractérisation du complexe de réplication.

III.1.2- Recherche des activité ADN polymérase et ADN topoisomérase dans la phase 2

Comme le suggére le résultat précédent, l’une des enzymes essentielles à un

réplisome : l’ADN polymérase, devrait être présente dans la phase 2. Ainsi des tests d’activité

ADN polymérase ont été réalisés sur les phases obtenues par centrifugation sur coussin de

saccharose 2 M comme décrit dans le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe

II.2.2). Nous pouvons constater que l’activité ADN polymérase est 3,7 fois plus concentrée

144

Phase Activité ADN polymérase (cpm)

1 14100

2 53400

3 14550

4 530

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

[NEM] en mM

Pourc

enta

ge d

'acti

vit

é A

DN

poly

méra

se

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50

[Aphidicoline] en µg/ml

Pourc

enta

ge d

'acti

vit

é A

DN

poly

méra

se

Figure 51 : Test d'inhibition de l'activité ADN polymérase présente dans la phase 2.

Les tests d'activité sont réalisés comme décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2).

Tableau 7 : Mesure de l'activité ADN polymérase présente dans les 4 phases obtenues après

centrifugation sur coussin de saccharose. Le test d'activité est réalisé selon le protocole décrit

dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2).

0

100

200

300

400

500

600

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50

Fractions

Act

ivit

é A

DN

poly

mér

ase

(cpm

x 1

0 )

-3

0

10

20

30

40

50

60

70

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50

Fractions

Act

ivit

é A

DN

poly

mér

ase

(cpm

x 1

0 )

-3

Figure 52 : Dépôt de la phase 1 et 2 sur une colonne HiTrap SP 5 ml et mesure de l'activité

ADN polymérase à 10 mM MgAc (cercle vide) et 50 mM MgAc (cercle plein).

La chromatographie est réalisée selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

(paragraphe II.2.3.2 du premier chapitre) et l'activité ADN polymérase est testée selon le protocole

décrit dans le matériel et méthode (paragraphe II.2.2)

Phase 1 Phase 2

dans la phase 2 que dans les phases 1 et 3 (tableau 7). Cette phase 2 correspond à la phase où

le bleu Dextran s’accumule et correspond à des formes de haut poids moléculaire donc peut

contenir le complexe de réplication. Dans le but d’identifier la ou les ADN polymérases

responsables de cette activité, des tests en présence d’inhibiteurs tels que l’aphidicoline

(inhibiteur de l’ADN polymérase !) et le NEM (inhibiteur de l’ADN polymérase ") ont été

réalisés sur les proteines de la phase 2 selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

(paragraphe II.2.2 du chapitre I). Nous constatons une inhibition de l’activité ADN

polymérase d’environ 90% en présence de 50 µg/ml d’aphidicoline et 95% en présence de 10

mM de NEM (figure 51). Hors, l’ADN polymérase " est résistante à l’aphidicoline et sensible

au NEM donc ces tests d’inhibition indiquent la présence des deux ADN

polymérases mitochondriales (! et "# dans la phase 2. Dans le but de séparer ces activités

ADN polymérases, nous réalisons une colonne SP (SulfoPropyl) selon le protocole décrit

dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.3.2 du chapitre I), en effet nous avons vu

précédemment que cette colonne permet de séparer les deux ADN polymérases

mitochondriales. Deux pics d’activité ADN polymérase sont détectés au niveau des fractions

24 et 36 éluées de la colonne SP 5 ml (GE Healthcare) présentant respectivement un optimum

d’activité à 10 mM et 50 mM MgAc. L’ADN polymérase ! possède une activité optimale à

10 mM mais est totalement inhibée à 50 mM MgAc tandis que l’ADN polymérase " possède

une activité optimale à 50 mM. La phase 2 contient donc les deux activités ADN polymérases

mitochondriales ! et "$qui peuvent être séparées sur cette colonne avec le même profil

d’élution comparé au protocole II.2.3 du premier chapitre (figure 52). L’intérêt de cette

colonne consiste également à visualiser la proportion d’ADN polymérase alpha par rapport à

l’ADN polymérase gamma dans les phases 1 et 2. L’observation des résultats d’activité ADN

polymérase pour ces deux phases suggère que la représentation des ADN polymérases est

différente dans les deux phases, paramètre qui est difficilement évaluable dans un mélange.

La centrifugation sur gradient de saccharose entraîne une augmentation de la répresentation

de l’ADN polymérase " par rapport à l’ADN polymérase ! dans la phase 2. Hors la phase 2

contient des formes de haut poids moléculaire, il n’est donc pas exclu que l’ADN polymérase

" existerait majoritairement sous forme complexée, contrairement à l’ADN polymérase !.

L’une des activités enzymatiques pouvant faire partie du réplisome est l’ADN

topoisomérase. En effet, les ADN topoisomérases I et II sont des composants du complexe de

réplication nucléaire. Ces enzymes ont la capacité de créer temporairement des cassures

simple ou double brin, permettant de diminuer les torsions de l’ADN entraînées par la

progression de la fourche de réplication, suite à l’action des hélicases qui ouvrent l’ADN. Le

145

10 30 10 30 10 30 10 30Eco

RI

-E

Phase 1 Phase 2 Phase 3 Phase 4

Forme I

Forme II

A B

C D

[ATP] en mM 0,5 1 2 4 5 [Bérénil] en µg/ml 25 50 75 100

[ZnSO4] en mM 0 1 5 10 20

Figure 53 : Test de l'activité ADN topoisomérase présente dans les phase 1, 2, 3 et 4 durant 10 ou

30 min à 30°C. Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matérielet méthodes

(paragraphe II.2.2.1)

Figure 54 : Tests d'activité ADN topoisomérase en présence d'inhibiteur ou de stimulateur de l'activité,

des tests en présence d'ATP sont réalisé (A), de bérénil (B), de novobiocine (C) et enfin de

sulfate de zinc (D). Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

(paragraphe II.2.2.1)

100 200 300 µg / mlNovobiocine

test est basé sur le relâchement de super-enroulement d’ADN plasmidique et sur l’observation

de topoisomères entre la forme super-enroulée et la forme totalement relachée.

Durant la réplication du SV40, l’ADN topoisomérase de type I est essentielle pour

permettre l’initiation de la réplication (Trowbridge et al, 1999) ainsi que pour le processus

d’élongation complète de l’ADN. Cette enzyme co-purifiée avec le réplisome de cellule

leucémique est considérée comme étant un composant du complexe d’initiation (Lin et al,

1997). L’ADN topoisomérase de type II est impliquée dans la décaténation c'est-à-dire la

séparation des ADN fils après réplication, elle a été trouvée dans le réplisome de cellule Hela

et de cellules leucémiques (Applegren et al, 1995, Lin et al, 1997). Chez la levure, ces deux

protéines jouent le même rôle (Champoux, 2001), toutefois peu d’études portant sur le

réplisome ont été réalisées, néanmoins il a été montré que comme chez les eucaryotes

supérieurs, l’ADN topoisomérase II fait partie d’un complexe réplicatif nucléaire (Jazwinski

et Edelman, 1984).

Ainsi, des tests d’activités enzymatiques ont été réalisés selon le protocole décrit dans

le matériel et méthode (paragraphe II.2.2.1). Les tests d’activité réalisés avec les quatre phases

obtenues après ultracentrifugation sur coussin de saccharose 2 M, mettent en évidence la

formation de topoisomères au niveau de la phase 2 (figure 53). L’intensité de la forme I est

moins importante après incubation avec les protéines de la phase 2, par rapport aux autres

phases, ce qui peut résulter soit d’une activité ADN topoisomérase plus importante dans cette

fraction, soit d’une coupure endonucléase simple brin catalysée par une nucléase. En effet en

absence de protéine aucune modification de la forme superenroulée n’est observée. Ainsi, il

apparaît une accumulation d’activité ADN topoisomérase dans la phase 2, phase

correspondant au complexe et capable de produire une synthèse à partir d’une matrice de type

mini-cercle. Dans le but de caractériser cette activité, des tests en présence d’inhibiteurs et

d’activateurs des ADN topoisomérases ont été réalisés pour la phase 2. Ainsi, le bérénil

entraîne une faible inhibition de l’activité ADN topoisomérase à 75 µg/ml (figure 54B). Des

expériences ont été réalisées en présence de concentrations croissantes en ATP (de 0 à 5mM),

toutefois, aucune modification de l’activité ADN topoisomérase n’est constatée en présence

de 5 mM d’ATP (figure 54A). Et enfin, des tests en présence de novobiocine, un inhibiteur

spécifique de l’ADN topoisomérase de type II, (de 0 à 300 µg/ml) ne permettent pas de

constater une inhibition, quelque soit la concentration de l’inhibiteur (figure 54C). L’activité

ADN topoisomérase II est activée par de l’ATP, inhibée spécifiquement par la novobiocine et

enfin est inhibée à 50% à une concentration de bérénil de 25 µg/ml et inhibée à 100% en

présence de 75 µg/ml de cette drogue. D’après le comportement décrit des deux ADN

topoisomérases dans la littérature (Goto et al, 1984), ces trois tests permettent de déterminer

146

que l’activité ADN topoisomérase présente dans la phase 2 est une ADN topoisomérase de

type I. Cette enzyme existe sous deux formes dans la cellule, une isoforme nucléaire et une

mitochondriale, dans le but de déterminer à quelle isoforme correspond l’activité présente

dans la phase 2, des tests d’activité en présence de ZnSO4 ont été réalisés et une inhibition

totale de l’activité est observée dès 1 mM. D’après la bibliographie (Tua et al, 1997),

l’isoforme mitochondriale est totalement inhibée en présence de zinc de 1 à 50 mM (figure

54D). Ce résultat permet de dire que l’enzyme présente dans la phase 2 correspond à

l’isoforme mitochondriale de l’ADN topoisomérase I.

Dans le but de déterminer si la présence de l’ADN polymérase # est essentielle à la

présence de l’ADN topoisomérase I dans la phase 2, le même protocole a été effectué pour

des extraits mitochondriaux de souches 8MIP1, décrit dans le paragraphe II.2.4. Après

centrifugation sur coussin de saccharose 2 M, quatre phases sont séparées et des tests

d’activité sont réalisés sur chacune d’elles. Nous constatons toujours la formation de

topoisomères à partir des protéines de la phase 2. Ainsi, l’absence de l’ADN polymérase

gamma dans l’extrait ne semble pas modifier le comportement de l’ADN topoisomérase de

type I mitochondriale présente dans la phase 2.

III.1.3- Approfondissement de la purification.

Les mesures des activités ADN polymérase et ADN topoisomérase sont très sensibles,

contrairement à celle d’autres activités enzymatiques, ainsi le complexe de réplication étant

probablement peu représenté dans l’extrait, il est nécessaire de concentrer et purifier le

réplisome pouvant être contenu dans la phase 2 avant de poursuivre son étude. Des colonnes

chromatographiques ont donc été réalisées, en s’inspirant du travail décrit dans le cadre de la

purification du réplisome nucléaire (Malkas et al, 1990). Après l’ultracentrifugation sur

coussin de saccharose 2 M, ces auteurs ont utilisé une colonne échangeuse d’anion (Q-

sépharose) pour le concentrer. L’échantillon de la phase 2 contenant les complexes sont

chargées sur la colonne, les protéines ayant interagi sont décrochées par des paliers successifs

de 0.1 M, 0.35 M, 0.5 M et 1 M de sels. Deux enzymes clés du complexe sont testées,

l’activité ADN polymérase et l’activité ADN topoisomérase et permettent de constater la

concentration de ces deux activités enzymatiques dans le pic protéique élué en présence de

0,35 M KCl. L’observation de la densité optique a permis de déterminer que 24% des

protéines sont décrochées au niveau de ce STEP, plus de 75% des protéines sont donc

éliminées par cette étape. Dans le but de vérifier si ces protéines sont présentes dans un

complexe, une colonne de tamisage Superdex 200 a été réalisée dans la foulée selon le

protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.4.3). Des tests d’activité ADN

147

polymérase sont réalisés sur les fractions éluées de la colonne et permettent de constater la

présence d’activité enzymatique uniquement au niveau de fraction correspondant à des masses

proches de 140 kDa. Ainsi le protocole intrinsèque à la colonne de tamisage a pu dissocier le

complexe, à moins que la dissociation n’ai eu lieu sous l’effet du sel lors de l’élution de la

colonne Q-sépharose. Donc cette technique n’a pas marché pour nous et d’autres approches

ont été expérimentées.

Parmi les autres techniques chromatographiques réalisées pour concentrer le réplisome

présent dans la phase 2, la chromatographie d’affinité nous a semblé être une méthode qui

pourrait se révéler la plus spécifique. Un réplisome est un complexe protéique qui se forme au

niveau de l’ADN, c’est pourquoi nous avons utilisé une séquence d’ADN particulière du

génome mitochondrial : ORI5, qui est une des origines de réplication actives de l’ADN

mitochondrial de la levure S.cerevisiae (Baldacci et Bernardi, 1982). Cette séquence est

reconnue par l’ARN polymérase mitochondriale (RPO41) associée à un facteur de

transcription (MTF1). Un ARN serait transcrit au niveau de cette origine et utilisé comme

matrice par l’ADN polymérase gamma pour réaliser la réplication. L’intérêt de choisir une

origine de réplication et de vouloir capturer spécifiquement le réplisome et non pas toutes les

protéines qui se lient aspécifiquement à l’ADN. La construction de la colonne est réalisée

selon la partie II.3.4. La phase 2 est déposée sur la colonne ORI5 et quatre STEPs de NaCl

sont réalisés pour décrocher les protéines fixées, analysés par des mesures de l’activité ADN

polymérase. Nous pouvons constater qu’aucune activité ADN polymérase n’est observée suite

au dépôt de la phase 2 sur la colonne ORI5. Dans le but de déterminer si la colonne ORI5 est

capable de fixer des ADN polymérases, des extraits purifiés d’ADN polymérase.# et ! ont été

déposés successivement sur la colonne. L’activité ADN polymérase est alors testée et une

activité ADN polymérase est mise en évidence dans le cas de l’ADN polymérase #7

contrairement au cas de l’ADN polymérase !. Ainsi, la colonne ORI5 est capable de fixer

l’ADN polymérase #.purifiée. On peut donc penser que si l’ADN polymérase # est présente

dans la phase 2, elle ne semble pas capable de se fixer sur la colonne. Ce constat peut

s’expliquer par la présence de protéines empêchant par le jeu d’interactions la fixation de

l’ADN polymérase # sur la colonne elle même. Ces protéines peuvent aussi occuper les sites

de fixation sur l’ADN, ou encore modifier l’état conformationnel de l’ADN polymérase #.

Ainsi, la colonne ORI5 ne semble pas être utile pour purifier le réplisome mitochondrial.

Dans le but de déterminer si la structure de l’ORI5 peut gêner en elle-même la fixation

du réplisome et déterminer si un autre ADN pouvait être utilisé dans cette approche, nous

avons réalisé la même expérience en choisissant une séquence quelconque dans le génome

mitochondrial. Ainsi, une colonne a été préparée avec un fragment de la même taille qu’ORI5

148

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

[AZT] en µM

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10

[aphidicoline] en µg/ml

Pourc

enta

ge

d'a

ctiv

ité

AD

N p

oly

mér

ase

Pourc

enta

ge

d'a

ctiv

ité

AD

N p

oly

mér

ase

Figure 55 : Tests d'inhibition de l'activité ADN polymérase fixée sur l'ADN COX3 en présence d'AZT

et d'aphidicoline.

(300 pb) correspondant à la partie centrale du gène COX3 présentant peu de structure

tridimentionnelle d’après une évaluation in-silico. Nous pouvons constater suite au dépôt de

la phase 2, la présence d’activité ADN polymérase parmi les protéines décrochées de la

colonne. Dans le but d’identifier cette activité, des tests d’activités en présence d’inhibiteurs

des ADN polymérases ont été réalisés. Nous pouvons constater une inhibition supérieure à

70% de l’activité ADN polymérase en présence de 10 µM AZT-TTP (inhibiteur de l’ADN

polymérase #). Les tests d’activités en présence d’aphidicoline (inhibiteur de l’ADN

polymérase !) montrent une inhibition de 10% en présence de 10 µg/ml d’aphidicoline

(figure 55). Ainsi, il est fort probable que l’activité fixée sur la colonne soit due à l’ADN

polymérase #. Des fractions purifiées d’ADN polymérase # et ! ont été déposées

successivement sur la colonne, suivis de tests d’activité. L’ADN polymérase # seule est

capable de se fixer sur la colonne COX3, contrairement à l’ADN polymérase ! purifiée.

Ainsi, contrairement à la colonne ORI5, la colonne COX3 est capable de fixer l’activité ADN

polymérase présente dans la phase 2. Dans le but de déterminer si l’ADN polymérase # est

fixée sous forme complexée ou libre, une colonne de tamisage est réalisée. Aucune activité

ADN polymérase ne fut détectée. Ce résultat peut être lié à une concentration trop faible

d’enzyme. Ces colonnes d’affinités n’ont pas permis de concentrer le complexe de réplication.

Des tentatives de concentration des complexes ont aussi été réalisées par

centrifugation, grâce à l’utilisation de vivaspin 500 (Sartorius) possédant une limite de

séparation de 300 kDa. Après une étape de centrifugation (de 6h) et de concentration de la

phase 2, l’extrait est déposé sur un gradient de saccharose 10-30%, et ultracentrifugé 16 h à

30 000 rpm (rotor SW41Ti, Beckman). L’activité ADN polymérase libre est augmentée d’un

facteur 1,4 toutefois aucune augmentation des formes de haut poids moléculaire n’est

constatée.

Toutes ces tentatives n’ont toutefois pas permis de concentrer le réplisome

mitochondrial. Ainsi, toutes les études suivantes seront réalisées sur les phases obtenues après

ultracentrifugation sur coussin saccharose 2 M.

III.1.4- Détermination de la taille du complexe.

Dans le but de déterminer la masse du ou des complexes de réplication présents dans

la phase 2, nous avons réalisé des chromatographies de tamisage moléculaire. Du fait de la

faible intensité de l’activité ADN polymérase lors des précédentes chromatographies de

tamisage, nous avons décidé de réaliser une colonne supérose 12 qui pourrait nous permettre

149

1,45 ml

0,95 ml

Activité A

DN

polymérase (cpm

)2000

1000

00

B

A

Figure 56 : Mesure d'activité (A) ADN polymérase et (B) ADN topoisomérase de fraction protéique

obtenues après dépôt de phase 2 sur une Superose 12.

Absorbance à UV1_280nm Activité ADN polymérase Fraction

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

mAU

10.0 15.0 20.0

1A1 1A3 1A5 1A7 1A9 1A11 1B1 1B3 1B5 1B7 1B9 1B11 1C1 1C3 1C5 1C7 1C9 1C11 1D1 1D3 1D5 1D7 1D9 1D11 1E1 1E3 1E5 1E7 1E9 1

2000

1000

Activ

ité A

DN

po

lym

éra

se

(cp

m)

0

Figure 57 : Mesure de l'activité ADN polymérase à 50 mM MgAc suite au dépôt de la

phase 2 sur une colonne Superose 6.

Figure 58 : Mesure de l'activité ADN polymérase à 50 mM MgAc (histogramme orange),

ou 10 mM MgAc (histogramme vert) suite au dépôt de la phase 2 sur superdex 200 10/300 gl.

81 kDa

160 kDa

440 kDa

670 kDa

ADN polymérase gamma

ADN polymérase alpha

Absorbance à 280nm Activité ADN polymérase à 50 mM Mg2+ Fractions Activité ADN polymérase à 10 mM Mg2+

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

mAU

6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0

1A2 1A4 1A6 1A8 1A10 1A12 1B2 1B4 1B6 1B8 1B10 1B12 1C2 1C4 1C6 1C8 1C10 1C12 1D2 1D4 1D6 1D8 1D10 1D12 1E2 1E4 1E6 1E8 1E10

2000

4000

6000

8000

activité AD

N polym

érase (cpm)

de séparer les formes libres et complexées des activités ADN polymérase selon le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.4.3). Cette colonne exclue les protéines ou complexes de masse

supérieure à 300 kDa ce qui permettrait d’éviter de diluer le (ou les) complexe(s) de

réplication permettant la détection des activités enzymatiques. Nous pouvons constater la

présence d’activité ADN polymérase éluée à 1,45 ml correspondant à la masse des formes

libres des ADN polymérases mais également dans le volume mort de la colonne à 0,95 ml

(figure 56A). L’étude de l’activité ADN topoisomérase est réalisée selon le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.2.1). Le test ADN topoisomérase révèle une activité à 1,55 ml

correspondant à une masse de 60 kDa et également au niveau du volume mort de la colonne

(figure 56B). Ainsi, les deux activités qui devraient être impliquées dans le réplisome

mitochondrial sont présentes dans la phase 2 à la fois sous forme libre et complexée. Ces

complexes sont d’une masse supérieure à 300 kDa.

Après avoir montré qu’un ou plusieurs complexes possédant les activités ADN

polymérase et ADN topoisomérase ont une masse supérieure à 300 kDa, nous avons réalisé

une Superose 6 (capable de séparer les protéines comprises entre 20 kDa et 5 000 kDa) dans

le but de déterminer une masse approximative du réplisome selon le matériel et méthodes

(II.2.4.3). Après dépôt de la phase 2 sur la colonne, des tests d’activité ADN polymérase ont

été réalisés à 50 et 10 mM de MgAc. Nous avons montré précédemment que les deux ADN

polymérases mitochondriales sont présentes dans la phase 2. Ainsi, à 50 mM nous constatons

la présence d’activité ADN polymérase au niveau de fractions proches du volume d’exclusion

de la colonne, toutefois l’activité est répartie sur de nombreuses fractions donc légèrement

retardée (figure 57). Dans le but de restreindre le pic d’élution de cette activité, une superdex

200 fut aussi réalisée. Cette colonne met de nouveau en évidence à 50 mM l’ADN polymérase

# au niveau du volume d’exclusion au sein d’un pic fin tandis qu’à 10 mM, l’activité ADN

polymérase est observée dans des fractions correspondant à des masses de 120 à 140 kDa et

au niveau du volume d’exclusion (figure 58). Cela montre que l’ADN polymérase # serait

principalement sous forme complexée, tandis que l’ADN polymérase ! serait sous forme

libre. Des tests d’activité ADN topoisomérase réalisés sur ces fractions permettent de

constater aussi la formation de topoisomères à partir du plasmide superenroulé au niveau des

fractions possédant de l’activité ADN polymérase. Ainsi, nous pouvons dire qu’il existe dans

la phase 2 un complexe de masse proche de 1 000 kDa contenant l’ADN polymérase # et que

l’ADN topoisomérase de type I mitochondriale est co-éluée avec ce dernier.

Dans le but de déterminer la taille du complexe, une colonne de Séphacryl S 400 a été

réalisée, cette colonne d’un volume de 320 ml permet de séparer des protéines entre 20 kDa et

8 000 kDa. Après avoir déposé sur la colonne un échantillon dont le volume ne dépasse pas

150

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

acti

vité

AD

N p

oly

mér

ase

(cp

m)

Fractions

-E Eco

RI

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32phas

e 2 1

5'

phas

e 2 3

0'

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Fractions

acti

vité

AD

N p

oly

mér

ase

(cp

m)

C

B

A

Figure 60 : Mesure d'activité enzymatique des fractions obtenues après centrifugation sur gradient de

saccharose 10-40%, l'activité ADN polymérase est étudiée (A) à 50 mM MgAc, (B) à 10 mM MgAc

tandis que l'ADN topoisomérase est aussi recherchée (C).

Figure 59 : Mesure de l'activité ADN topoisomérase après supérose 6 de phase 2 préparée à partir

des souches ∆MIP1. Le test est réalisé selon les conditions décrite dans le matériel et méthode

(paragraphe II.2.2.1).

-E A10phas

e 2

A4 A6 A8 A12 B3 B6 B8 B10 B12 C2 C4 C6 C9 C12 D3 D6Eco

RI

19S11,3S7,3S3,5S

1% du volume de la colonne (soit environ 3 ml de phase 2), et réalisé l’élution de cette

colonne de tamisage, des tests d’activité enzymatique ont été réalisés. Aucune activité ADN

polymérase n’a pu être décelée dans les différentes fractions. Ceci peut être du à la dilution de

l’échantillon par rapport au volume de la colonne. Au final, nous nous sommes retrouvés dans

l’incapacité de déterminer la taille exacte du réplisome mitochondrial.

Maintenant que nous avons réussi à mettre en évidence un complexe de haut poids

moléculaire contenant l’ADN polymérase # et pouvant contenir de l’ADN topoisomérase de

type I mitochondriale, il serait intéressant de déterminer si l’absence de l’ADN polymérase #

pourrait empêcher la formation du réplisome. Ainsi, l’activité ADN topoisomérase a été

recherchée au niveau de fractions éluées de colonnes de tamisages Superdex 200, après dépôt

de la phase 2 provenant de souches 8MIP1. Nous pouvons remarquer la formation de

topoisomères après incubation du plasmide avec une fraction (fraction A10) correspondant au

volume mort de la colonne et donc à des complexes de haut poids moléculaire (figure 59).

Ainsi, si l’ADN polymérase gamma et l’ADN topoisomérase I mitochondriale s’associent

dans un même complexe, l’absence de la première ne dissocie pas le complexe.

La taille du complexe ne pouvant être mesurée précisément par chromatographie de

tamisage moléculaire, des expériences ont été réalisées pour déterminer un paramètre

important pour un complexe protéique : le coefficient de sédimentation. Des expériences

d’ultracentrifugation sur gradient de saccharose 10-40% ont été réalisées selon le protocole

décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.4.6). La phase 2 est tout d’abord dialysée

contre du tampon A supplémenté de saccharose 5%, pour diminuer la concentration en

saccharose présente dans l’échantillon. Le gradient de saccharose 10-40% est réalisé dans du

tampon A. La phase 2 dialysée est ensuite déposée sur le gradient et ultracentrifugée à 35 000

rpm pendant 24h (rotor SW41Ti, Beckman). Grâce, à l’utilisation de protéines marqueurs

(Ovalbumine 3,5S, Aldolase 7,3S, Catalase 11,3S et Thyroglobuline 19S), le coefficient de

sédimentation du complexe possédant l’activité ADN polymérase #.pourra être déterminé. Les

gradients sont ensuite fractionnés et des tests d’activité ADN polymérase et ADN

topoisomérases sont réalisés sur les fractions obtenues. Les tests d’activités en présence de 50

mM magnésium permettent de visualiser deux pics d’activité : le premier (fraction n°14)

correspond à un coefficient de sédimentation de 11,3S. Le second (fraction 20) correspond à

des protéines possédant un coefficient de sédimentation supérieur à 19S (figure 60A). Le test

d’activité ADN polymérase à 10 mM met en évidence une activité ADN polymérase au

niveau d’une fraction (fraction 13) correspondant à la migration de la catalase ce qui pourrait

signifier que l’ADN polymérase alpha puisse être associée à sa sous unité accessoire !B

151

(166+78=244 kDa) (figure 60B). Ces résultats permettent de penser que l’activité ADN

polymérase gamma se trouve au niveau d’une fraction de coefficient de sédimentation élevé,

proche de 21S. L’ADN polymérase alpha semble par contre être présente en majorité au

niveau d’une fraction correspondant à un coefficient de 11S. Une étude de l’activité ADN

topoisomérase permet de constater sa présence au niveau des fractions 12 et 20 (figure 60C).

Ainsi, les activités ADN topoisomérase et ADN polymérase se trouvent concentrées au

niveau des mêmes fractions correspondant à un ou différents complexes de haut poids

moléculaire. Ce ou ces complexe(s) protéiques présentent un coefficient de sédimentation

proche de celui du réplisome nucléaire purifié par Malkas et al, qui est de 21 Svedberg

(Malkas et al, 1990).

III.1.3- Recherche des différentes activités dans la phase 2.

Chez l’homme, la réplication de la matrice mini-cercle nécessite trois protéines

(l’ADN polymérase #, TWINKLE et SSBP) lors de test in vitro pour réaliser la

polymérisation après ouverture des brins d’ADN (Korhonen et al, 2004). Nous allons

rechercher quelles activités enzymatiques pourraient être présentes dans les phases obtenues

après ultracentrifugation sur coussin de saccharose 2 M. Nous avons montré précédemment

que les ADN polymérases ! et # et l’ADN topoisomérase de type I mitochondriale sont

présentes dans la phase 2, quand est-il des autres enzymes ?

- L’activité ADN hélicase.

Aucun homologue de TWINKLE n’existe chez la levure S.cerevisiae. Bien que le

système de réplication puisse être différent (cercle roulant / réplication unidirectionnelle), une

hélicase doit certainement intervenir dans le réplisome mitochondrial de la levure. Les tests de

réplication en présence de la matrice mini-cercle ont permis de constater l’apparition de

formes concatamérique d’ADN de grande taille avec la fraction correspondant à la phase 2,

ces formes ont été synthétisées grâce à la présence d’une enzyme qui a permis l’ouverture des

brins d’ADN. Ainsi, une ADN hélicase devrait être présente dans la phase 2.

Des tests hélicases ont été réalisés en présence des phases 1, 2 et 3 obtenues après

ultracentrifugation sur coussin de saccharose 2 M selon le matériel et méthodes (paragraphe

II.2.2.2). Ce test est basé sur l’ouverture de deux oligonucléotides de tailles différentes dont

l’un est radiomarqué au 32P. Après réaction, le substrat est déposé sur gel d’acrylamide natif

pour une électrophorèse en condition non dénaturante, l’oligonucléotide radiomarqué est

visualisé par autoradiographie. Cette réaction est particulièrement sensible aux nucléases

152

Phas

e 1

Phas

e 2

Phas

e 3

Phas

e 1

Phas

e 2

Phas

e 3

Mar

queu

r

San

s en

zym

e

47 nt

15 nt

90 nt

Souche ST40 Souche ∆MIP1

Fraction 61 : Etude de l'activité ADN hélicase en présence d'aliquot des phases 1, 2 et 3 à partir de souches ST40

et ∆MIP1.

32

155' 3'

3' 5'

marquage au phosphore 32

Matrice du test ADN hélicase

simple brin, en effet lorsque le marquage est réalisé au niveau d’une extrémité simple brin, un

signal correspondant à un mono-nucléotide apparaît sur l’autoradiographie. Après marquage

en 5’ et hybridation avec les oligonucléotides complémentaires adéquats, nous pouvons

disposer de substrat double brin dont l’extrémité 5’ hybridée est radiomarquée, et plus

résistante à la digestion par les nucléases (cas du 32mer froid hybridé à un 15mer

complémentaire marqué au niveau de son extrémité 5’).

En absence d’enzyme, nous observons majoritairement le marquage au niveau d’un

duplex de 47 nt, néanmoins un faible signal au niveau de l’oligonucléotide de taille 15mer

indique que cet oligo n’est pas totalement hybridé au 32mer complémentaire. Après

incubation en présence d’aliquot des phases 1, 2 et 3, nous constatons la disparition presque

complète du signal au niveau du duplex de 47 nt au profit de l’oligonucléotide simple brin de

15 nt. L’activité hélicase se trouve majoritairement dans la phase 1 correspondant à des

formes de faible masse, donc aux enzymes libres. Une faible activité de déroulement du

substrat duplex est observée au niveau des phases 2 et 3 correspondant aux formes lourdes

comme indiqué par l’accumulation de bleu Dextran dans cette phase après une centrifugation

similaire réalisée en parallèle. On constate en effet une légère diminution du signal au niveau

de la bande de 47 nt correspondant au duplex, et une légère augmentation de l’intensité de la

bande radioactive de 15 nt. La même expérience réalisée à partir de souche !MIP1 montre

également une activité hélicase dans les différentes phases, légèrement plus faible dans les

fractions des complexes, alors que la même activité de déroulement s’observe pour la phase 1

correspondant aux enzymes libres. Donc la présence de l’ADN polymérase " ne semble pas

indispensable au fait de retrouver une activité ADN hélicase dans la phase 2 correspondant

aux complexes, puisqu’on la retrouve dans cette phase pour des levures délétées du gène

MIP1, par contre on peut dire que la présence de l’ADN polymérase " favorise le maintien de

cette enzyme hélicase dans les formes lourdes, l’activité hélicase étant légèrement plus

prononcée dans la phase 3 préparée à partir de souche sauvage.

Des tests ont été réalisés en présence de protéines de la phase 2 et de différentes

matrices pour rechercher une spécificité de substrat. Des matrices dites « fourchées » ont été

utilisées (figure 61), ces matrices sont composées de deux oligonucléotides de 50mer

radiomarqué et 43mer froid, complémentaires sur une région de 31 nt seulement laissant

apparaître des protubérances 3’ et 5’ qui peuvent gêner l’activité ADN hélicase (Weinert et

Rio, 2007). En absence d’enzyme, le substrat double brin migre au niveau d’une bande de 93

nt (H1 et H3 : 50+43). Après dénaturation cinq minutes à 94°C et quenching, réalisé comme

témoin en absence d’enzyme, on observe la migration de l’oligonucléotide simple brin

marqué au niveau d’une bande de 50 nt (H1). En présence des protéines contenues dans la

153

-

-

-

-

-

-

-

-

Phase 2

-E +T4 2,5 5 10

64

32

17

15

-

-

-

-

-

-

-

-

-E +T4 WT

∆MIP1

1h 2h o/n

1h 2h o/n

2h o/n

64

32

17

15

Figure 63 : recherche de l'activité ligase dans la phase 2 :

Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.3)

Figure 64 : recherche de l'activité ligase dans la phase 2 :


1 nt

50 nt

81 nt

Sim

ple

bri

n

Phas

e 2

tém

oin

San

s en

zym

e

Figure 62 : Test de l'activité ADN hélicase avec une matrice 3' tail.


temps de réactionµl

phase 2, on remarque une activité nucléase qui dégrade le substrat, donnant un résidu mono-

nucléosidique, sans doute issu d’une activité exonucléase de type 5’"3’. Cette activité est

nettement plus marquée lorsque le marquage est à une extrémité 5’ libre, comme c’est le cas

avec les oligonucléotides H4 (50mer marqué en 5’) et H5 (31mer) parfaitement

complémentaires sur les 31 nt de l’oligomer H5, et donnant donc une queue simple brin de 19

nt du coté 5’ de l’oligo H4 radiomarqué à son extrémité 5’. Néanmoins dans chaque cas,

malgré la dégradation du duplex utilisé, on peut constater un faible signal au niveau des

molécules simple brin de 50 nt, correspondant à une activité hélicase, difficile à mettre en

évidence sur ces échantillons, qui déroule le duplex de 93 nt (substrat fourché avec H1 et H3)

ou de 21 nt (5’tail avec H4 et H3) ou surtout avec une queue 3’ tail (avec H1 et H2) (figure

62).

- L’activité ADN ligase.

Parmi les protéines faisant partie du réplisome nucléaire, une ADN ligase I a été

décrite (Lin et al, 1997), elle serait associée à un complexe protéique dont le coefficient de

sédimentation de 21S qui permet la réplication de l’ADN nucléaire dans les cellules HeLa (Li

et al, 1994). Elle interviendrait dans la ligation des fragments d’Okazaki synthétisés par

l’ADN polymérase alpha au niveau du noyau. Des études réalisées sur les extraits

mitochondriaux de cellules humaines ont mis en évidence l’interaction de l’ADN polymérase

# avec l’ADN ligase III. Cette interaction serait mise en jeu lors du BER, un système de

réparation de l’ADN. Chez la levure S.cerevisiae, il n’existerait que deux ADN ligases dans la

cellule : l’ADN ligase 1 et l’ADN ligase IV. L’ADN ligase 1 serait la seule ADN ligase

présente dans la mitochondrie de levure.

Des tests ADN ligase ont été réalisés suivant le protocole décrit dans le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.2.3). Le test est basé sur la ligation de deux oligomères de 15 et 17

nt marqués radioactivement, ces deux oligonucléotides sont hybridés spécifiquement à un

32mer dont l’extrémité 5’ est également phosphorylée par la T4 kinase en présence d’ATP

froid. Le test est réalisé en présence d’ATP pour fournir l’énergie nécessaire à l’ADN ligase

pour liguer les deux oligonucléotides. Après réaction, les échantillons sont déposés sur gel

d’électrophorèse en condition dénaturante. Ainsi, si une ligation s’est produite, un signal

radioactif apparaitra au niveau d’une bande dont la taille est de 32mer. Nous constatons qu’en

présence des protéines de la phase 2, un oligonucléotide radiomarqué de 32mer apparaît dont

l’intensité augmente avec la quantité de protéine utilisée dans le test (figure 63). Dans le but

de déterminer si cette activité ADN ligase présente dans la phase 2 est dépendante de la

présence de l’ADN polymérase gamma, l’activité ADN ligase a été testée pour la même

154

fraction préparée à partir d’extrait mitochondrial total provenant de souches 8MIP1. Une

bande correspondant à un oligo de 32mer apparaît (figure 64). Ainsi, la présence de l’ADN

ligase dans la phase 2 n’est pas dépendante de la présence de l’ADN polymérase gamma.

Nous pouvons aussi constater que le test ADN ligase est également très sensible aux

nucléases, en effet si la réaction de ligation est réalisée pendant toute une nuit, la bande de

32nt radioactive semble diminuer non pas tant en intensité mais de longueur, le signal étant

observé légèrement en dessous de 32 nt donc probablement suite à une dégradation par une

nucléase dans le sens 3’"5’. L’incubation avec la T4 polynucléotide kinase, dépourvue

d’activité nucléase contaminante donne au contraire une intensité du produit de ligation qui

augmente avec le temps, et qui permet en plus de la ligation des deux oligonucléotides de 15

et 17mer, la ligation de duplex de 32 deux à deux donnant des produits multiples de 32mer

c'est-à-dire de 64 et même 128 nt. Aucune dégradation des oligonucléotides de 15 et 17mer

n’est observée, alors qu’un « smear » est visible dès que les protéines présentes dans la phase

2 des coussins de saccharose sont incubées avec le substrat. Nous avons testé l’effet du NaCl

pour tenter d’inhiber cette activité nucléase, sans succés d’autant que parallèlement nous

constatons un effet inhibiteur sur l’activité de ligation de la T4 ligase (1 à 10 mM NaCl).

Nous remarquons surtout qu’en absence de l’ADN polymérase #, l’activité de ligation est plus

importante. Soit l’activité nucléase correspond à l’activité 3’"5’ exonucléase de proof

reading de l’ADN polymérase # elle-même, soit l’ADN polymérase # entraine la rétension de

nucléase qui gène pour observer la ligation.

- L’activité ARN polymérase.

Chez l’homme, dans le noyau, les ARN polymérases sont impliquées dans la

transcription de l’ADN en ARN. Dans la mitochondrie, il semblerait qu’une ARN polymérase

soit responsable de l’initiation de la réplication (Lecrenier et Foury, 2000). L’initiation de la

réplication de l’ADN mitochondrial reposerait sur la synthèse d’un fragment d’ARN par la

protéine RPO41 au niveau de l’origine de réplication. Chez la levure, au niveau du noyau, les

ARN polymérases jouent le même rôle que chez l’homme. En ce qui concerne la

mitochondrie, des duplexes stables ARN:ADN sont synthétisés in-vitro lors de tests de

transcription au niveau des séquences ORI en présence d’ARN polymérase mitochondriale

purifiée (Xu et Clayton, 1996). Toutefois dans un processus de réplication de type cercle

roulant une ARN polymérase ne serait pas obligatoirement nécessaire. Le processus de

réplication de l’ADN mitochondrial de la levure n’étant pas clairement défini, nous nous

sommes intéressés à l’activité ARN polymérase. Des tests pour détecter une ARN polymérase

155

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 10 20 30 40 50 60 70

temps de réaction en min

Acti

vit

é d

'in

co

rpo

rati

on

de r

ibo

nu

clé

oti

de

(cp

m)

Phase 1

Phase 2

Phase 3

Phase 4

Figure 65 : Mesure de l'activité ARN polymérase en fonction (A) des phases des complexes

étudiées, (B) de la matrice utilisées. Les tests d'activité sont réalisés selon le protocole décrit dans le

matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.5).

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Poly

ADNsb

ADN S1

ADN S

(dA:dT)

1 digéré 30 min

1 digéré 60 min

0' 10' 20' 30' 45'

temps d'incubation du test

Activité

d'in

co

rpo

ratio

n d

e r

ibo

nu

clé

otid

e

(cp

m)

A

B

ADN dépendante ont été réalisés selon le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.5) en

présence des phases 1, 2 et 3 obtenues sur coussin de saccharose. Des tests d’activité ont été

réalisés en présence d’une matrice poly (dA:dT), et d’une ARN polymérase utilisée comme

contrôle pendant 30 et 60 minutes. Nous pouvons constater une activité d’incorporation de

[3H]UTP qui augmente en fonction du temps dans les différentes phases des complexes

(figure 65A). L’intensité de l’activité étant faible (inférieur à 5000 cpm après 1h d’incubation

lors du test), nous avons cherché à optimiser la détection de cette activité en utilisant d’autres

matrices telles que de l’ADN simple brin, ou ADN double brin intact préalablement digéré

par la nucléase S1. Nous pouvons constater que l’optimum d’activité de l’ARN polymérase

contenue dans la phase 2 est obtenu avec la matrice poly (dA:dT) (figure 65B). Ainsi, malgré

de nombreuses tentatives, nous ne sommes pas parvenus à améliorer l’intensité du signal pour

cette activité dans les conditions testées et nous n’avons pas pu identifier biochimiquement

l’identité de cette activité ARN polymérase.

III.1.4- Identification de protéines présentes dans la phase 2 pouvant faire partie du réplisome.

- Identification directe par MS/MS.

Les précédentes protéines citées ont été identifiées d’après leur activité enzymatique.

Cette méthode sensible n’est pas applicable à toutes les protéines pouvant être présentes dans

la phase 2. En effet, certaines protéines peuvent être impliquées dans la structuration d’un

complexe sans avoir une fonction enzymatique. Ainsi, la spectrométrie de masse s’avère un

outil de choix dans le but d’identifier ces protéines.

Parmi les protéines identifiées par MS/MS, nous trouvons l’ADN topoisomérase de

type I (tableau de masse n°1), ce résultat de spectrométrie de masse permet de confirmer les

résultats obtenus par mesure d’activité enzymatique (paragraphe III.1.2).

Parmi les 28 autres protéines identifiées, nous trouvons une protéine de fixation à

l’ADN simple brin : Rim1, il s’agit de l’homologue chez la levure de la protéine humaine

SSBP. Cette protéine est essentielle au réplisome mitochondrial chez l’homme et représente

avec l’ADN polymérase # et l’hélicase TWINKLE, un des trois facteurs clé permettant in-

vitro la synthèse d’ADN par le mécanisme cercle roulant (Korhonen et al, 2004). Cette

analyse est corrélée avec des expériences de Southern-blot qui permettent de mettre en

évidence la présence d’une protéine ayant une activité de fixation à de l’ADN simple brin (pas

de fixation à de l’ADN double brin) et dont la taille coincide avec le produit d’expression du

156

gène RIM1 chez la levure. Cette protéine colorée au nitrate d’argent et analysée par MS/MS

correspond bien à la protéine Rim1.

D’autres protéines ont été observées dans l’analyse MS/MS de la fraction 2 dont les

plus intéressantes semblent être RPA49 et ABF2. La première est une sous unité de l’ARN

polymérase I qui pourrait être liée à une RNAse H (Ibora et al, 1979) et correspondre à

l’activité enzymatique étudiée précédemment. La seconde est une protéine de fixation à

l’ADN mitochondrial, elle reconnaît spécifiquement les séquences ARS et pourrait être

impliquée dans le compactage de l’ADN mitochondrial (Brewer et al, 2003), elle est trouvée

associée comme Rim1 aux nucléoïdes, sites actifs de réplication du génome mitochondrial

(voir paragraphe III.1.1).

En ce qui concerne les autres protéines, la majeure partie sont des protéines qui

semblent capables de se fixer à l’ADN (tableau de masse n°1), étant des facteurs impliqués

dans la condensation de l’ADN. Les seules protéines incapables de se fixer sur l’ADN sont

LSP1 (Sphingolipide long chain-responsive protin LSP1), PIL1 (Sphingolipid long chain

base-responsive protein PIL1), HSP60 (Heat shock protein 60) et VPS1 (Vacuolar protein

sorting-associated protein 1). La présence de ces protéines peut s’expliquer par une grande

représentation dans la cellule (http://www.uniprot.org/uniprot/Q12230) ou par une forte

sensibilité de la spectrométrie de masse.

- Recherche des participants au réplisome par Far-western.

Dans le but d’identifier les protéines pouvant interagir avec l’ADN polymérase

gamma, nous avons tenté une technique appelée far-western. La technique de far-western est

basée sur la reconnaissance d’une protéine par un anticorps spécifique, qui reconnaît sa cible

sur une membrane immobilon où cette protéine est présente, à la suite d’une étape

d’incubation de la membrane avec la protéine « appât » native, basée sur les interactions avec

des protéines transférées sur la membrane.

Des extraits totaux de mitochondries sont déposés préalablement sur une colonne SP

1 ml (GE Healthcare) pour séparer les protéines. La colonne est équilibrée en présence du

tampon 0 M NaCl utilisé lors de la purification des ADN polymérase, puis cinq STEPs sont

réalisés à 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M et 1 M NaCl grâce au tampon B de 2 M NaCl. Des

échantillons de chaque fraction sont déposés sur deux gels d’électrophorèse de façon

identique. Enfin, les protéines séparées sur l’un des gels sont transférées sur une membrane de

nitrocellulose. La membrane est ensuite incubée, comme décrit dans le matériel et méthodes,

en présence ou non d’ADN polymérase gamma purifiée, et grâce à l’utilisation d’anticorps

anti-ADN polymérase gamma, puis d’anticorps secondaire, les protéines interagissant avec

157

l’ADN polymérase # sont localisées sur la membrane. Après comparaison, un gel identique

coloré au nitrate d’argent, les bandes de ce second gel correspondant aux bandes réagissant

avec les anticorps anti-ADN polymérase # sont découpées et données à analyser en

spectrométrie de masse.

Des expériences ont ainsi été réalisées, toutefois les anticorps secondaires devant

réagir avec des anticorps dirigés contre l’ADN polymérase gamma étaient capables de se fixer

sur la membrane, sans spécificité propre y compris en absence d’incubation préalable avec les

anticorps primaires. Par ailleurs, une faible spécificité des anticorps primaires a été constatée,

un antiserum ayant été produit auprés de la société Eurogentec par un protocole « double X »

théoriquement efficace, les anticorps produits étant dirigés contre deux peptides différents de

l’ADN polymérase #, injectés simultanément à un même lapin. Un protocole de production de

protéines recombinantes a été initié. Ce protocole permettrait d’obtenir des anticorps plus

spécifiques que les précédents pour réaliser ces expériences de far-western.

- Analyse par immuno-précipitation de l’ADN polymérase # présente dans la phase 2.

Dans le but d’identifier les protéines pouvant faire partie du réplisome mais ne

possédant pas d’activité enzymatique mesurable, une stratégie différente a été mise au point.

L’ADN polymérase # est présente dans la phase 2 ainsi que dans un complexe de très haut

poids moléculaire, il est probable que cette protéine fasse partie du réplisome. Ainsi, des

expériences d’immuno-précipitation des protéines capables de se fixer sur l’ADN polymérase

# ont été entreprises. Pour cela, n’ayant pas à disposition un anticorps Anti-ADN polymérase

# suffisamment affin pour permettre la reconnaissance de son antigène, une souche de levure

exprimant l’ADN polymérase # étiquetée avec un TAPTAG a été utilisée. Après culture des

levures selon le matériel et méthodes (paragraphe II.1.3), et purification des mitochondries

(paragraphe II.1.3 du premier chapitre), les mitochondries sont utilisées selon le protocole

II.1.4. Une fois la phase 2 obtenue, les protéines sont mises en présence de 200 µl de billes

d’IgG sépharose pendant 2h à 4°C sous agitation de 10 rpm (Labinco LD-79). La colonne est

ensuite montée sur un support Tricorn et les protéines fixées sur l’ADN polymérase # sont

décrochées par trois STEPs successifs de NaCl de 0,5 M, 1 M et 2 M. Un seul pic de protéines

est observé à 280 nm, élué à 0,5 M NaCl. Les protéines contenues dans ce pic sont analysées

par spectrométrie de masse MS/MS. Parmi les protéines identifiées, nous trouvons de

nouveau la protéine Rim1 (tableau de masse n°2 voir dans les annexes de la partie II). Ce

158

ST

EP

0,5

M

ST

EP

1 M

ST

EP

2 M

Phas

e 2

Phas

e 1

Phas

e 3

Figure 66 : Test ADN topoisomérase des fractions obtenues suite à l'élution des protéines

immunoprécipitées à partir de la souche ADN polymérase gamma-TAPTAG. Les tests sont

réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1).

180130

100

73

54

48

35

24

16

kDa

Figure 67 : Gel BN-PAGE/SDS-PAGE de la phase 2 coloration à l'imperial Blue (Pierce)

1ère dimension native : BN-PAGE

2nde

dim

ensi

on d

énat

ura

nte

: S

DS

-PA

GE

résultat met en évidence les relations très étroites entre l’ADN polymérase gamma et la

protéine Rim1.

Dans le but de déterminer si l’ADN polymérase gamma TAPTAG interagit in vivo

avec une activité ADN topoisomérase, des tests d’activités ADN topoisomérase ont été

réalisés sur les protéines décrochées au niveau des trois STEPs de sels. Après électrophorèse

sur gel du plasmide utilisé comme substrat, nous constatons un faible signal correspondant à

la formation de topoisomères après incubation en présence des protéines éluées à 0,5 M de

sels. Ainsi, nous constatons que l’ADN polymérase #-TAPTAG est capable d’immuno-

précipiter une activité ADN topoisomérase présente dans la phase 2 (figure 66).

- Recherche du réplisome et de ses composants.

Dans le but d’identifier les protéines participant au réplisome, des gels BN-

PAGE/SDS-PAGE ont été réalisés pour séparer les complexes présents dans la phase 2. La

séparation est réalisée selon leur rayon de stokes en condition native et ensuite les composants

des complexes sont dissociés en condition dénaturante. Après coloration au nitrate d’argent,

nous constatons un nombre important de spots sur le gel (figure 67). Des analyses par

spectrométrie de masse MS/MS ont permis d’identifier différents complexes (le protéasome,

la partie soluble du complexe de la NADH deshydrogénase), toutefois cette technique ne nous

a pas permis de retrouver le synthésome mitochondrial. Ce résultat négatif peut être du à la

faible représentation du complexe de réplication, ou résulter des conditions d’électrophorèse.

En effet, la migration d’un complexe par BN-PAGE est permise grâce à l’utilisation d’un bleu

de Coomassie qui permet de charger les complexes sans les dissocier, toutefois, il arrive que

des complexes soient dissociés par ce bleu. Dans le but de vérifier cette hypothèse, des

expériences par CN-PAGE sont réalisées. Il s’agit d’une migration en condition native sans

ajout de bleu de Coomassie ; dans ces conditions, si le complexe possède une charge globale

négative, il pourra migrer dans le gel. Après coloration au nitrate d’argent, nous pouvons

constater l’absence de modification de la représentation des complexes dans le cas d’un BN-

PAGE comparé à un CN-PAGE.

L’explication probable de l’échec de cette technique peut être la faible représentation

du réplisome dans l’extrait déposé. Ainsi, dans le but de visualiser le complexe, des gels

BN/SDS-PAGE ont été transférés sur membrane immobilon pour effectuer des western-blot

afin de localiser un ou des complexes contenant l’ADN polymérase gamma (utilisation des

anticorps anti-ADN Polymérase #), ou l’ADN polymérase #-TAPTAG (utilisation d’anti

TAPTAG en anticorps primaire). Ces techniques ne m’ont toutefois pas permis de localiser le

réplisome.

159

Une méthode très sensible basée sur l’utilisation de substrat radioactif, marqué au

phosphore 32 a été tentée. La méthode du « trapping » permet le marquage des sous unités

catalytiques des ADN polymérases (Insdorf et Bogenhagen, 1989) et consiste à faire

incorporer un nucléoside radioactif par les ADN polymérases en présence d’un court substrat

ADN dont la structure est en épingle à cheveux, possédant de ce fait un groupe 3’OH

accessible comme amorce pour permettre la polymérisation. La séquence de ce substrat ADN

tige-boucle (TIG1) est telle que par complémentarité peuvent être incorporés quelques résidus

Adénine radiomarqués (en présence de [!-32P] dATP) mais également de BrdUTP en face de

résidus A, à la place de la Thymidine. La synthése est alors bloquée, limitant la taille du

produit synthétisé, ensuite l’échantillon est placé sous un appareil trans illuminateur

produisant des UV pendant 10 min à 1 mW/cm2. Un pontage covalent est alors formé entre

l’ADN ainsi radiomarqué et l’ADN polymérase présente dans l’échantillon. Après pontage

aux UV et électrophorèse 48h sur gel BN-PAGE 4-15% natif, les bandes radiomarquées sont

visualisées par autoradiographie trois jours à -80°C avec un écran intensificateur. Après

révélation, nous pouvons observer une bande de très haut poids moléculaire en haut du gel.

Ainsi, il semblerait qu’un complexe de haut poids moléculaire soit ponté avec l’ADN

radiomarqué. En parallèle, la même réaction a été réalisée en présence de nucléotide non

radioactif suivie d’un gel BN-PAGE coloré au nitrate d’argent. La bande protéique

correspondant à la radioactivité visualisée dans la première expérience a été découpée et

analysée en spectrométrie de masse MS/MS. 34 protéines ont été identifiées, ce nombre élevé

peut s’expliquer à la fois par la mauvaise séparation du complexe dans le gel conduisant à la

présence de contaminants et par la forte sensibilité des analyses par spectrométrie de masse.

Parmi la multitude de protéines identifiées par spectrométrie de masse, nous pouvons relever

la présence de l’ADN topoisomérase de type I (tableau de masse n°3 voir annexes chapitre II).

Dans le but d’améliorer la migration du complexe et de diminuer le nombre de contaminants,

le temps de migration a été augmenté (trois jours) et la composition du gradient modifiée

(3-13%). Ces changements n’ont pas permis d’améliorer la séparation des complexes de haut

poids moléculaire dans le gradient d’acrylamide.

Ces tentatives, n’ont pas permis de déterminer clairement la composition du réplisome

mitochondrial, néanmoins ces analyses ont montré que la protéine Rim1 est présente dans la

phase 2, souvent associée à l’ADN polymérase #. Enfin, nous avons pu mettre en évidence

l’interaction entre l’ADN topoisomérase I et l’ADN polymérase # in vivo. Précédemment, ces

deux protéines étaient éluées dans les mêmes fractions lors de colonnes de tamisage, ces

coélutions peuvent maintenant s’expliquer par l’interaction de ces deux protéines.

160

III.1.5- Expérience de pontage.

L’un des problèmes rencontrés lors de l’étude d’un complexe est la conservation de

tous les composants du complexe. L’un des moyens de figer le complexe avant purification

est le pontage. Il s’agit d’une technique permettant de stabiliser des complexes labiles, elle

peut être réalisée in-organelo ou en présence d’extraits protéiques purifiés. Nous avons décidé

d’utiliser le formaldéhyde ainsi que le DSP pour réaliser les pontages. L’intérêt de ces deux

agents étant qu’ils sont réversibles, en effet, nous pourrions avoir la nécessité d’inverser les

pontages pour rechercher une activité enzymatique.

- Pontage in organello.

Ainsi, des pontages in organello sont réalisés dans le but de figer le complexe avant

d’extraire les protéines mitochondriales, afin de permettre l’identification des protéines qui

aurait pu se décrocher au cours des étapes de purification. Cette technique nécessite

l’utilisation de formaldéhyde, ce composé est capable de former une liaison de deux

Angström entre deux protéines ou entre l’ADN et une protéine associée. A l’origine,

Kaufman et collaborateurs (Kaufman et al, 2000) ont utilisé le formaldéhyde pour purifier le

nucléoïde mitochondrial associé à l’ADN mitochondrial.

Les mitochondries sont traitées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

(paragraphe II.2.4.5.1), pour l’obtention des extraits mitochondriaux fractionnés après

ultracentrifugation sur coussin de saccharose 2M donnant les phases 1 à 4 qui sont récupérées.

Après mesure de l’activité ADN polymérase, nous pouvons constater l’absence d’activité

significative dans les quatre phases ainsi obtenues. Ceci est probablement du au pontage qui a

figé les ADN polymérases, puisqu’en effet ces enzymes pour répliquer un ADN changent

constamment de conformation Pour le vérifier, des fractions purifiées d’ADN polymérase

gamma sont incubées en présence de formaldéhyde, et la réaction ensuite stoppée avec de la

Glycine. Après avoir controlé que la glycine n’inhibait pas l’activité ADN polymérase dans

les conditions de l’expérience, sur l’enzyme pol # purifiée, des tests d’activités ADN

polymérase sont réalisés sur les échantillons de la phase 2 traités au formaldéhyde et ensuite

en présence de glycine 1 M. Nous constatons que l’ADN polymérase une fois pontée n’est

plus active, aucune incorporation de dNTP n’étant décelable. Nous avons tenté de réverser le

pontage toutefois, aucune activité ne fut retrouvée.

Dans le but de visualiser les complexes, des BN-PAGEs ont été réalisés, de légères

différences ont été constatées, en effet certains complexes ont disparu suite au pontage,

161

néanmoins aucun complexe de très haut poids moléculaires n’est apparu. Les complexes

séparés en BN-PAGE sont ensuite dénaturés par un traitement au "-mercaptoéthanol 0,5 M et

les échantillons fractionnés par électrophorèse en gel dénaturant SDS-PAGE. De nouveau,

peu de différence à noter au niveau des spots.

- Pontage au DSP.

Nous avons pu voir précédemment que l’un des inconvénients du pontage chimique

est la fixation des structures protéiques, en effet, la majorité des réactions enzymatiques

nécessitent des changements conformationnels et le fait de ponter peut entraîner une perte

d’activité comme c’est le cas pour l’ADN polymérase #.

Ainsi, dans le but de ponter des protéines constitutives du réplisome, les protéines de

la phase 2 sont traitées avec le DSP, un agent pontant réversible, selon de protocole décrit

chapitre II.2.4.5.2. Cet agent pontant permet de lier des protéines se trouvant à 12 Angström

l’une de l’autre. Cette molécule est un agent pontant bifonctionnel réagissant avec les

groupements amines présents sur les protéines. L’activité ADN polymérase testée après

pontage par le DSP indique une inhibition totale de l’activité après traitement par le DSP. Des

expériences de réversion du pontage ont été tentées grâce au DTT. Nous constatons qu’après

l’étape de pontage, le DTT ne permet toujours pas de retrouver l’activité ADN polymérase.

Ainsi, il n’est pas possible de réaliser le pontage au DSP en espérant maintenir le complexe

actif, et suivre ce dernier à l’aide de l’activité ADN polymérase, même après réversion du

pontage. Néanmoins, l’une des alternatives pour suivre le complexe est l’utilisation d’un

marqueur non enzymatique, par exemple une étiquette. Nous avons donc utilisé des souches

ADN polymérase gamma-TAPTAG. Des western-blot anti-TAPTAG, réalisés après

chromatographie sur une colonne superose 6, n’ont pas permis d’observer un signal probant.

Ce résultat peut encore s’expliquer par la faible quantité du complexe. De plus les protéines

étiquetées TAPTAG sont en concentration équivalente aux protéines non modifiées, codées

par le génome de la levure, ces souches TAPTAG ne sur-exprimant pas la protéine étiquetée

par rapport à la protéine endogène.

III.1.6- Etude de la dissociation du complexe de réplication.

Dans le but d’étudier le complexe de haut poids moléculaire, possédant l’activité ADN

polymérase gamma, des études de dissociation de ce dernier ont été réalisées. Ces études

pourraient permettre de déterminer les paramètres critiques pour conserver le complexe intact.

Parmi ces paramètres, deux éléments ont été étudiés : les détergents et les sels. Des études de

162

Figure 68 : Effet du Triton X-100 sur le complexe de haut poids moléculaire possédant une activité

ADN polymérase. Mesure de l'activité ADN polymérase correspondant à la fraction A10 en fonction de la

concentration de Triton X-100 incubée avec la phase 2 avant dépôt sur Superdex 200.

Figure 69 : Effet du CHAPS sur le complexe de haut poids moléculaire possédant une activité

ADN polymérase. Mesure de l'activité ADN polymérase correspondant à la fraction A10 en fonction de la

concentration de CHAPS incubée avec la phase 2 avant dépôt sur Superdex 200.

Pourcentage de triton X-100 lors de l'incubation

en présence de la phase 2.

Pourc

enta

ge

d'a

ctiv

ité

AD

N p

oly

mér

ase

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20

Concentration de CHAPS lors de l'incubation

en présence de la phase 2.

Pourc

enta

ge

d'a

ctiv

ité

AD

N p

oly

mér

ase

ce type ont par ailleurs été réalisées avec le complexe aminoacyl-tRNA synthétase (Sihag et

Deutscher, 1983).

Pour réaliser cette étude, des incubations des protéines de la phase 2 ont été réalisées

en présence de concentration variable en triton X-100 (0 à 4% final), de CHAPS (de 0 à 20

mM final), de KCl (de 0 à 1 M final), de NaCl (de 0 à 1 M final). Dans le but de déterminer

l’implication des liaisons hydrophobes dans la stabilisation du réplisome mitochondrial, nous

avons tenté de dissocier le complexe présent dans la phase 2 à l’aide de deux détergents, le

Triton X-100 et le CHAPS. Le triton X-100 est un détergent doux permettant l’extraction des

protéines hydrophobes présentes dans la membrane interne mitochondriale. Dans le but de

déterminer l’effet de ce détergent sur le complexe, un aliquot de 200 µl de la phase 2 est

incubé en présence de 50µl de détergent à 37°C pendant 10 min. Le mélange est ensuite

déposé sur une colonne de tamisage superdex 200 10/300 gl (GE Healthcare). Des tests ADN

polymérase sont réalisés à 50 mM MgAc en présence des fractions obtenues, et l’activité

ADN polymérase mesurée correspondant à des formes de haut poids moléculaire sont

observées selon la concentration de détergent utilisé. Nous pouvons constater qu’en présence

de 2% de triton X-100, 62% du complexe est encore structuré, il est nécessaire d’incuber le

complexe à une concentration finale de 4% de triton X-100 pour dissocier totalement le

complexe (figure 68). Le profil d’élution des complexes (par observation de la D.O. à 280

nm) à des concentrations variables en Triton X-100 permet d’observer des modifications de

ce profil notamment au niveau du volume mort de la colonne. Ainsi, il faut une très grande

quantité de détergent pour dissocier le complexe possédant l’activité ADN polymérase,

contrairement à la glutamine ARNt synthétase et la leucine ARNt synthétase qui restent

associées au complexe des aminoacyl ARNt synthétases quelque soit la quantité de NP-40

(Sihag et Deutscher, 1983).

Une étude en présence d’un détergent switterionique a été réalisée grâce à l’utilisation

de concentration croissante de CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-2-

hydroxy-1-propanesulfonate). La CMC (Concentration micellaire critique) du CHAPS dans

ces conditions salines (0,15 M KCl) est proche de 6 mM, ainsi nous avons réalisé des

incubations en présence de 5 mM et 20 mM de CHAPS. Après réalisation des colonnes de

tamisage et tests d’activité ADN polymérase, nous constatons une diminution de 26% de

l’activité ADN polymérase après incubation en présence de 20 mM CHAPS des protéines de

la phase 2 à 37°C pendant 10 min (figure 69). Comme précédemment, nous constatons la

modification du profil d’élution des complexes protéiques au niveau du volume mort. Ainsi,

les autres complexes présents dans le volume d’exclusion de la Superdex 200 se dissocient

très facilement en présence de concentration croissante en CHAPS. Nous notons que le

163

Figure 70 : Effet du sels neutre sur le complexe de haut poids moléculaire possédant une activité

ADN polymérase. L'expérience est réalisée en présence de concentration croissante en (A) KCl, ou

de (B) NaCl. L'activité ADN polymérase est mesurée et l'intensité de cette activité au niveau de la fraction

A10 est comparée par rapport à la chomratographie de tamisage réalisée après incubation avec 0M NaCl.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Concentration de NaCl utilisé lors de l'incubation (M)

A B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Concentration de KCl utilisé lors de l'incubation (M)

Pourc

enta

ge

d'a

ctiv

ité

AD

N p

oly

mér

ase

Pourc

enta

ge

d'a

ctiv

ité

AD

N p

oly

mér

ase

CHAPS ne dissocie qu’une faible proportion du complexe d’intérêt comparé à l’effet produit

au niveau du complexe des aminoacyl ARNt synthétases pour lequel à 20 mM de CHAPS les

arginine, glutamine ou leucine ARNt synthétases sont dissociées à 70%. Ainsi, ces résultats

permettent de dire que le complexe possédant l’activité ADN polymérase # ne semble pas

structuré essentiellement par des interactions hydrophobes comme cela semble être le cas

pour le complexe des aminacyl ARNt synthétases.

Parmi les liaisons mises en jeu dans les interactions protéine-protéine, les liaisons

ioniques sont les plus fortes. Les liaisons hydrogènes sont elles aussi mises en jeu dans ces

interactions ; ainsi, dans le but de déterminer l’importance de ces types de liaison dans la

stabilité du réplisome mitochondrial, l’effet des sels a été analysé.

Tout d’abord j’ai décidé d’évaluer l’impact que des sels neutres tels que le NaCl ou le

KCl peuvent entraîner sur le complexe possédant l’activité ADN polymérase #. Ainsi un

aliquot de 180µl des protéines de la phase 2 est mis en présence de 60µl de solution

concentrée de sel pour atteindre des concentrations finales comprise entre 0 et 1 M. Après une

incubation de 10 min à 37°C, une colonne Superdex 200 10/300 gl est réalisée, suivie de tests

d’activité ADN polymérase à 50 mM MgAc sur les fractions éluées. Nous constatons que la

quantité de complexe contenant l’ADN polymérase # est diminuée de 72% et de 67% en

présence de 0,2 M NaCl et 0,2 M KCl respectivement (figure 70). Ainsi, de faibles

concentrations en sel, sont capables de dissocier le complexe contenant l’ADN polymérase #.

Nous pouvons noter que contrairement au complexe des aminoacyl ARNt synthétases pour

lequel les sels neutres n’ont aucun effet sur la dissociation du complexe (Sihag et Deutscher,

1983), le complexe isolé des mitochondries de levures dans la phase 2 est rapidement dissocié

par les mêmes sels à faible concentration. Les sels neutres dissociant efficacement le

complexe contenant l’ADN polymérase #, il n’est pas nécessaire de réaliser des expériences

similaires avec des sels chaotropiques, qui en plus d’avoir le même effet de sel, ont la capacité

de réaliser du salting-in qui dissocie davantage les complexes. Si l’on observe l’évolution de

la D.O. à 280 nm au niveau des complexes de haut poids moléculaire nous pouvons noter qu’à

0,2 M NaCl ou KCl aucune variation n’est observée. Cette absence de variation conjuguée à

la forte dissociation du complexe comportant l’ADN polymérase # met en évidence la faible

quantité du complexe contenant l’ADN polymérase # dans la phase 2. Cette observation

explique bien les problèmes de quantité de matériel rencontrés précédemment.

Ces résultats nous permettent de comprendre d’une part que le réplisome est très

sensible aux sels, que les interactions qui sont mises en jeu sont essentiellement des

164

interactions ioniques au contraire des interactions hydrophobes apparemment minoritaires

dans le complexe composé de l’ADN polymérase # tel que nous pouvons l’étudier dans le

volume mort d’une colonne de tamisage superdex. Enfin, nous pouvons constater que notre

complexe d’intérêt ne représente qu’une infime minorité des complexes présents dans la

phase 2, en effet aucune variation de la D.O. sur les chromatogrammes n’a été observée, bien

que ce complexe soit dissocié.

Dans cette approche nous avons voulu étudier le réplisome mitochondrial en le

purifiant et en étudiant ses propriétés et sa composition, toutefois comme toute technique de

purification, il est possible que des associations protéine-protéine aient été rompues et n’aient

pu être détectées. Ainsi dans une seconde approche, un réseau d’interactions entre différents

candidats potentiels du réplisome sera reconstitué grâce à une stratégie utilisant des colonnes

d’affinités.

III.2- Etude des interactions possibles entre des candidats potentiels du réplisome.

Cette approche est totalement différente de la purification native du réplisome ; au

contraire de la précédente où l’on cherchait à conserver le complexe, ici ce sont les

interactions protéine-protéine qui sont étudiées. En effet, l’une des voies d’études des

complexes est de tenter de reconstituer les interactions protéiques mises en jeu. Pour cela, sept

protéines appâts ont été choisies de part leur possible implication dans la réplication du

génome mitochondrial. Pour identifier les protéines fixées sur une protéine appât, deux

méthodes d’identification ont été réalisées : la spectrométrie de masse (LC-MS/MS), et les

tests d’activités enzymatiques.

Le principe de la chromatographie d’affinité est de fixer une protéine appât sur une

colonne et ensuite de passer des extraits protéiques sur la colonne en espérant la fixation de

certaines protéines. Après lavage des protéines contaminantes, les protéines fixées sur la

protéine appât sont décrochées puis analysées. Pour fixer les protéines, nous avons décidé

d’utiliser des souches exprimant nos protéines appât étiquetées par le TAPTAG. Ces souches

provenant de chez Open Biosystems™ vont permettre la fixation spécifique de la protéine

appât sur la matrice (IgG sépharose). Des extraits mitochondriaux de souche ST40 (souches

considérées comme sauvages), de souche 8MIP1 ainsi que des extraits purifiés d’ADN

polymérase # ou d’ADN polymérase ! seront déposés sur les colonnes. Nous avons pu

constater lors de l’analyse par spectrométrie de masse MS/MS du chapitre I que la fraction

purifiée d’ADN polymérase ! contient quelques autres protéines mais ne devrait contenir que

165

des traces d’ADN polymérase # celle-ci n’étant pas révélée par MS/MS. Et inversement les

fractions purifiées d’ADN polymérase # contiennent eux aussi quelques protéines mais ne

devraient pas contenir d’ADN polymérase !.

III.2.1- Colonne ADN polymérase #.

L’ADN polymérase gamma est une des deux ADN polymérases présentes dans la

mitochondrie de la levure S.cerevisiae. Elle est impliquée dans la réplication de l’ADN

mitochondrial et serait aussi impliquée dans la réparation de cet ADN. Cette protéine doit être

centrale dans le réplisome, de plus nous avons montré précédemment que cette ADN

polymérase fait partie d’un complexe de haut poids moléculaire qui pourrait être le complexe

de réplication mitochondrial. Ainsi, nous nous sommes intéressés aux protéines pouvant

interagir avec l’ADN polymérase gamma grâce à une souche exprimant une ADN polymérase

#-TAPTAG (#YSC1178-7502971).

Après culture dans un fermenteur de 10 L, selon le protocole décrit dans la partie

II.1.3, les mitochondries sont extraites selon le protocole décrit dans le chapitre I (II.1.3). Les

protéines mitochondriales solubles traitées comme décrit dans le premier chapitre (protocole

II.2.3.1) sont incubées avec des billes d’IgG Sépharose. La fixation de la protéine appât sur

les IgG est basée sur la forte interaction entre la protéine A et la partie constante des IgG (qui

résiste à 2 M NaCl). Après incubation pendant 2h, les billes sont culottées, lavées avec du

tampon 0 M et enfin les billes sont coulées dans une colonne Tricorn (GE Healthcare). La

colonne est ensuite montée sur un appareil AKTA purifier, et lavée en présence de tampon 2

M NaCl pour dissocier les protéines ayant interagit in-vivo avec notre protéine appât. La

colonne est ensuite équilibrée avec du tampon 0 M. Des protéines solubles de mitochondries

isolées de souches ST40, traitées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

(chapitre 1 partie II.2.3.1) ou bien une fraction purifiée d’ADN polymérase # ou !.sont

déposées sur la colonne d’affinité ADN polymérase gamma-TAPTAG. Les protéines n’ayant

pas interagit sont lavées par cinq volumes de colonnes de tampon 0 M NaCl. Les protéines

fixées sur la colonne sont décrochées par des STEPs successifs de 0,1 M, 0,5 M, 1 M et 2 M

NaCl. Avant de réaliser les colonnes d’affinité, la spécificité de l’interaction Protéine A/IgG

fut évaluée lors d’un dépôt d’extrait mitochondrial de souches ST40 sur la matrice, après

lavages, aucune protéine n’a été détectée selon la D.O. à 280 nm dans chacune des quatre

fracctions éluées par paliers successifs de sel. La caractérisation des fractions repose sur des

tests d’activités ADN polymérase, ADN topoisomérase, et une identification par

166

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

[AZT] en µM

Po

urc

en

tag

e d

'ac

tiv

ité

AD

N p

oly

mé

ras

e

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[aphidicoline] en µg/ml

Po

urc

en

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se

Figure 72 : Test d'inhibition de l'activité ADN polymérase présente au niveau du

STEP 0,5 M en présence de concentration croissante (A) d'AZT ou (B) d'Aphidicoline.

Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier chapitre

(paragraphe II.2.2).

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Dépôt fraction non

retenue

STEP 0,1 M STEP 0,5M STEP 1M STEP 2M

acti

vit

é A

DN

po

lym

érase (

cp

m)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Dépôt Fraction non

retenue

STEP 0,1M STEP 0,5M STEP 1M STEP 2M

Acti

vit

é A

DN

po

lym

érase (

cp

m)

Figure 73 : Mesure de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne ADN polymérase

gamma-TAPTAG après dépôt d'ADN polymérase gamma purifiée. Les tests sont réalisés

selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).


gamma-TAPTAG après dépôt d'extrait mitochondrial total de souche ST40. Les tests sont

réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier chapitre


A B

spectrométrie de masse MS/MS. La majorité des protéines est éluée en présence de 0,5 M

NaCl d’après l’intensité de la densité optique à 280 nm.

- Activité ADN polymérase.

Des tests d’activité ADN polymérase réalisés selon le protocole décrit dans le matériel

et méthodes (paragraphe II.2.2) ont permis de mettre en évidence une forte activité de

polymérisation en présence de matrice ADN activé de thymus de veau dans la fraction éluée à

0,5 M NaCl (figure 71). Dans le but d’identifier le type d’ADN polymérase qui est éluée de la

colonne, des inhibiteurs spécifiques ont été testés. En présence de concentration croissante en

AZT-TTP (figure 72A), nous constatons une inhibition de l’activité, de 75% à 5 µM d’AZT-

TTP. Aucune inhibition de l’activité ADN polymérase n’est observée en présence de

concentration croissante en aphidicoline y compris à 50 µg/ml (figure 72B), ces propriétés

correspondent à l’ADN polymérase #. Enfin, un extrait protéique total de mitochondries de

souches 8MIP1 est chargé sur la colonne d’affinité ADN polymérase # et les protéines sont

décrochées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2).

Aucune activité ADN polymérase n’est retrouvée, ainsi les analyses par l’utilisation

d’inhibiteur et ou suivant l’utilisation de souches 8MIP1 montrent que l’activité ADN

polymérase fixée sur la colonne ADN polymérase # taggée est l’ADN polymérase #. Pour

vérifier que cette activité ne corresponde pas à un simple décrochage de l’ADN polymérase

gamma étiquetée fixée sur la colonne, du fait de l’ajout de sel, une chromatographie d’affinité

est effectuée sans dépôt protéique sur la colonne selon le protocole décrit dans le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.5.2). Aucune activité ADN polymérase n’est alors éluée de la

colonne. Donc, l’activité ADN polymérase # éluée de la colonne n’est pas un artefact de

manipulation, et semble bien capable de se fixer sur la colonne d’affinité ADN polymérase #-

TAPTAG. Dans le but de déterminer si la présence de l’ADN polymérase ! est nécessaire à

l’interaction de l’ADN polymérase # sur la colonne, des extraits purifiés d’ADN polymérase #

(préparés selon le protocole II.2.3.4) sont déposés et les protéines décrochées selon le matériel

et méthodes (paragraphe II.2.5.2). De l’activité ADN polymérase est trouvée à nouveau au

niveau des fractions éluées à 0,5 M de NaCl (figure 73). Ainsi, la fixation de l’ADN

polymérase # n’est pas dépendante de la présence d’ADN polymérase !. Des extraits purifiés

d’ADN polymérase ! ont aussi été déposés sur la colonne ADN polymérase gamma, toutefois

aucune activité n’a été observée dans les différentes fractions.

- Activité ADN topoisomérase.

167

Figure 74 : Dépôt d'extrait provenant de souche ST40 sur la colonne ADN polymérase

gamma-TAPTAG, les protéines sont décrochées avec 0,1 M, 0,5 M , 1 M et 2 M NaCl.

Le test est réalisé selon le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1).

A B

C D

0 0,25 0,5 1 2 5[ATP] en mM [Bérénil] en µg/ml 0 25 50 100 200

0 50 100 150 200[KCl] en mM [ZnSO4] en mM 0 0,5 1 5 10 50

Figure 75 : L'activité ADN topoisomérase décrochée de la colonne ADN polymérase gamma-TAPTAG

avec 0,5 M NaCl est testée en présence (A) d'ATP, (B) de bérénil, (C) de KCl et (D) de sulfate de zinc.


Dé

pô

t

Frac

tio

n n

on

re

ten

ue

ST

EP 0

,1 M

ST

EP 0

,5 M

ST

EP 1

M

ST

EP 2

M

pla

smid

e n

on

dig

éré

Eco

RI

Une analyse de l’activité ADN topoisomérase a aussi été entreprise sur les protéines

décrochées de la colonne d’affinité ADN polymérase gamma. Après migration dans un gel

d’agarose 1% TBE, nous pouvons constater la présence d’échelle de topoisomères

apparaissant après incubation en présence des protéines éluées à 0,5 M NaCl (figure 74).

Ainsi, une activité ADN topoisomérase est décrochée de la colonne ADN polymérase gamma

lors du STEP 0,5M. Dans le but d’identifier quel type d’ADN topoisomérase est capable de se

fixer sur cette colonne d’affinité et provenant d’extrait mitochondriaux de souche ST40, des

tests d’inhibition ont été réalisés comme décrit précédemment (paragraphe III.1.2). Après

électrophorèse, nous constatons une faible inhibition de l’activité ADN topoisomérase en

présence de 50 µg/ml de bérénil et une forte inhibition, quasi-totale, à 200 µg/ml (figure 75B).

En présence de KCl, on observe une inhibition de l’activité ADN topoisomérase à 200 mM

étant donné l’intensité plus grande au niveau des formes super-enroulées (figure 75C).

L’incubation en présence d’ATP permet de constater une inhibition de l’activité à partir de 2

mM d’ATP (figure 75A). Enfin, l’activité ADN topoisomérase est totalement inhibée dès

l’ajout de 0,5 mM de ZnSO4 (figure 75D). L’absence de stimulation par l’ATP, et la faible

inhibition observée à 50 µg/ml de bérénil permettent de dire que l’ADN topoisomérase

présente dans la fraction éluée à 0,5 M NaCl correspond à une ADN topoisomérase de type I.

De plus, l’inhibition totale de l’activité à de faibles concentrations de Zinc et l’inhibition

pratiquement à 100% de cette même activité en présence de 200 µg/ml de KCl permettent de

déterminer en se référant à la biobliographie, que l’activité ADN topoisomérase présente

correspond à la forme mitochondriale de l’ADN topoisomérase I (Tua et al, 1997). Ainsi,

l’ADN topoisomérase I mitochondriale est capable de se fixer sur la colonne d’affinité ADN

polymérase gamma.

Pour prouver cette interaction, la purification de l’ADN topoisomérase I

mitochondriale a été tentée, néanmoins les difficultés de purification de cette protéine n’ont

pas permis de vérifier cette hypothèse.

- Analyse MS/MS.

En parallèle, à ces études enzymatiques, une analyse par spectrométrie de masse

MS/MS est réalisée et a permis d’identifier 38 protéines (tableau de masse n°4 voir annexes

de la partie II). Parmi ces protéines, certaines m’ont parues intéressantes de par leur

implication possible dans un complexe de réplication. Ainsi, l’ADN polymérase gamma a été

identifiée parmi les protéines décrochées de la colonne en présence de 0,5 M NaCl, ce résultat

permet de confirmer celui obtenu par mesure d’activité ADN polymérase en présence

d’inhibiteur. Ainsi peut être existe-t-il un dimère d’ADN polymérase #.dans la mitochondrie.

168

L’ADN topoisomérase de type I est elle aussi retrouvée, ce qui permet de nouveau de

confirmer les tests d’inhibition de l’activité ADN topoisomérase. Enfin parmi les autres

protéines identifiées par spectrométrie de masse MS/MS, nous avons pu constater la présence

d’une asparaginyl-ARNt synthétase (SYNM). La présence de cette protéine peut s’expliquer

par des homologies structurales entre les aminoacyl ARNt synthétase de classe II avec la sous

unité B de l’ADN polymérase # humaine (Fan et al, 1999). Etant donné que l’ADN

polymérase # ne possède pas d’homologue strict de la sous unité B chez S.cerevisiae (Lucas et

al, 2004), il est possible qu’une aminoacyl ARNt synthétase joue le rôle de la sous unité B,

c'est-à-dire permettrait la reconnaissance de l’origine de réplication chez la levure. De plus, la

protéine SYNM fait partie des aminoacyl ARNt synthétase de classe II. Cette protéine

interagirait donc avec l’ADN polymérase # de par une homologie structurale et un rôle

possible dans la reconnaissance de l’origine de réplication mitochondriale. Cette protéine a

aussi été trouvée lors d’analyses par spectrométrie de masse des protéines capables de se fixer

sur l’ORI5 à partir de la phase 2. Parmi les autres protéines identifiées, la protéine ABF2 est

trouvée. Cette protéine avait été identifiée dans la phase 2 et son interaction avec l’ADN

polymérase # discutée dans la partie III.1.1. Elle pourrait être due à la présence de ces deux

protéines dans un complexe réplicatif ancré dans la membrane.

III.2.2- Colonne ADN topoisomérase 1.

Les résultats de la colonne d’affinité ADN polymérase # comme ceux obtenus lors de

l’étude du complexe natif (III.1.2) confirment l’idée que l’ADN topoisomérase de type I

pourrait faire partie du réplisome, ainsi pour trouver d’autres partenaires, nous avons réalisé

une colonne d’affinité ADN topoisomérase I. Ainsi, une souche exprimant l’ADN

topoisomérase de type I étiquetée a été utilisée. Dans le but de fixer uniquement l’isoforme

mitochondriale sur les billes d’IgG sépharose, nous avons au préalable purifié les

mitochondries de la souche (#YSC1178-7502625) pour préparer la colonne de la même façon

que la colonne ADN polymérase #.

Comme précédemment, des extraits protéiques totaux mitochondriaux provenant de

souche ST40, 8MIP1 et enfin des fractions purifiées d’ADN polymérase # et ! sont déposés

sur la colonne d’affinité. Les protéines fixées sont décrochées selon le protocole décrit dans le

matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2). Des tests d’activité ADN polymérase et ADN

topoisomérase sont réalisés. Enfin, les protéines décochées de la colonne ADN topoisomérase

I sont analysées par spectrométrie de masse MS/MS.


169

Figure 77 : mesure d'activité ADN polymérase sur le STEP 0,5 M en présence de

concentrations croissantes d'Aphidicoline ou d'AZT.Les tests sont réalisés selon le

protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

Figure 78 : Mesure de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne ADN

topoisomérase 1 -TAPTAG après dépôt d'ADN polymérase gamma purifiée.

Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier

chapitre (paragraphe II.2.2).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[AZT] en µM

Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50


Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000


retenue

STEP 0,1 M STEP 0,5 M STEP 1 M STEP 2 M

Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

Figure 76 : mesure d'activité ADN polymérase sur les différentes fractions obtenues après

dépôt d'extrait mitochondrial de souche ST40 sur la colonne d'affinité ADN

topoisomérase 1-TAPTAG.Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et

méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

Comme la colonne précédente, une activité ADN polymérase est décrochée de la

colonne d’affinité à 0,5 M NaCl (figure 76). Pour identifier l’activité ADN polymérase, nous

avons réalisé les mêmes tests d’inhibiteur que précédemment. De façon similaire à l’activité

ADN polymérase décrochée de la colonne d’affinité ADN polymérase #, l’activité ADN

polymérase décrochée de la colonne d’affinité ADN topoisomérase 1 présente une forte

inhibition en présence d’AZT-TTP et une absence d’inhibition en présence d’aphidicoline

(figure 77). Ainsi, l’ADN polymérase décrochée de la colonne d’affinité ADN topoisomérase

I correspond à l’ADN polymérase #. Des extraits mitochondriaux provenant de souches

8MIP1 ont été déposés sur la colonne d’affinité ADN topoisomérase I et des tests d’activité

ADN polymérase n’ont pas permis de mettre en évidence la présence d’activité ADN

polymérase. L’activité ADN polymérase qui se fixe sur la colonne ADN topoisomérase

devrait correspondre à l’ADN polymérase #. Dans le but de déterminer si l’interaction de cette

ADN polymérase est dépendante de l’ADN polymérase alpha, un extrait purifié d’ADN

polymérase gamma est déposé sur la colonne. Après élution par des STEPs de sel, on décèle

de nouveau la présence d’ADN polymérase gamma dans la fraction éluée à 0,5 M (figure 78).

Ainsi, l’ADN polymérase gamma ne nécessite pas la présence d’ADN polymérase alpha dans

l’extrait pour se fixer sur la colonne d’affinité. Des extraits purifiés d’ADN polymérase ! sont

aussi déposés sur la colonne ADN topoisomérase I mais comme pour la précédente colonne,

les tests d’activité ADN polymérase n’ont pas mis en évidence d’activité ADN polymérase

retenue sur la colonne. Ce résultat confirme celui obtenu lors du dépôt de l’extrait

mitochondrial de souche 8MIP1 et laisse penser que l’ADN polymérase alpha ne serait pas

capable de se fixer sur la colonne ADN topoisomérase I.


Des tests d’activité ADN topoisomérase ont été réalisés selon le protocole décrit dans

le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1) et permettent de constater après incubation avec

les protéines décrochées en présence de 0,5 M NaCl la dégradation de l’ADN plasmidique

utilisé comme substrat, qui n’est pas décelable, correspondant probablement à une quantité

importante d’activité nucléase dans l’échantillon (figure 79). Afin de visualiser l’activité

ADN topoisomérase, une colonne chromatographique supplémentaire a été réalisée pour

permettre de séparer l’activité nucléase présente. Les fractions correspondantes au STEP 0,5

M sont déposées sur une colonne Hi-Trap Q 1 ml (GE Healthcare) et les protéines fixées sont

décrochées grâce à l’élaboration de cinq STEPs de 0,1 M, 0,25 M, 0,5M, 1 M et 2 M NaCl.

Après cette étape chromatographique, des tests d’activité ADN topoisomérase sont à nouveau

170

Figure 80 : Mesure d'activité ADN topoisomérase suite au dépôt d'extrait mitochondrial de souche

ST40 sur colonne ADN topoisomérase 1 -TAPTAG, les protéines décrochées avec 0,5 M NaCl sont

ensuites déposées sur une colonne Q HP et les protéines sont décrochées par des STEP de 0,1 M,

0,25 M, 0,5 M, 1 M et 2 M NaCl. Le test est réalisé selon le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1).

ST

EP 0

,5 M

de

l'A

DN

lig

ase

1

Frac

tio

n n

on

re

ten

ue

ST

EP 0

,1 M

ST

EP 0

,25

M

ST

EP 0

,5 M

ST

EP 1

M

ST

EP

2 M

Figure 79 : Mesure d'activité ADN topoisomérase suite au dépôt d'extrait mitochondrial de

souche ST40 sur colonne ADN topoisomérase 1 -TAPTAG. Le test est réalisé selon le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.2.1).

Dé

pô

t

Fra

cti

on

no

n r

ete

nu

e

ST

EP

0,1

M

ST

EP

0,5

M

ST

EP

1 M

ST

EP

2 M

réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1) et la

formation des topoisomères est cette fois observée en présence des protéines décrochées de la

colonne Q-HP à 0,25 M NaCl (figure 80). Ainsi une activité ADN topoisomérase est capable

de se fixer sur la colonne d’affinité ADN topoisomérase I en présence de 0,5 M NaCl. Dans le

but de vérifier que cette activité ne corresponde pas au décrochage de l’ADN topoisomérase I

de la colonne, une chromatographie sans injection d’échantillon est réalisée selon le protocole

précédent toutefois aucune activité ADN topoisomérase ne fut constatée lors des différents

STEPs de sel. Ainsi, une activité ADN topoisomérase et une activité nucléase indeterminée

sont capables d’interagir avec l’ADN topoisomérase I.

- Analyse MS/MS.

Comme pour la colonne précédente, une analyse MS/MS des protéines décrochées en

présence de 0,5 M NaCl a été réalisée et 48 protéines ont été identifiées (tableau de masse n°5

voir annexes de la partie II). Parmi les protéines identifiées pouvant être impliquées dans le

réplisome, comme lors de la colonne ADN polymérase #, nous trouvons la protéine Synm,

dont la présence pourrait être due à la fixation de l’ADN polymérase # sur la colonne ADN

topoisomérase I. Les protéines Abf2 et Mgm101 ont aussi été identifiées, leur présence a été

discutée précédemment (dans la partie III.1.1) et pourraient donc se justifier par l’existence

d’un complexe dans lequel figurent Mgm101 et Abf2.

III.2.3- Colonne ADN ligase 1.

L’ADN ligase 1 est une enzyme essentielle dans les processus de réplication et de

réparation de l’ADN (voir le système LP-BER), de plus il s’agit de la seule ADN ligase

trouvée dans la mitochondrie de S.cerevisiae à ce jour, enfin une activité ADN ligase a été

trouvée précédemment dans la phase 2. Ainsi, bien que nous ne l’ayons jamais identifiée, il

nous a paru intéressant d’étudier les partenaires possibles de cette protéine. Ainsi une souche

de levure exprimant l’ADN ligase 1 étiquetée avec un TAPTAG (#YSC1178-7499664) a été

mise en culture et les mitochondries purifiées. En effet l’ADN ligase existant sous deux

formes, nucléaire et mitochondriale (Willer et al, 1999), l’utilisation des mitochondries

purifiées permet de s’affranchir de la forme nucléaire.

Après extraction, la protéine appât est fixée sur des billes d’IgG sépharose de façon

similaire aux colonnes précédentes. Après préparation de la colonne selon le protocole décrit

dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2). Des extraits mitochondriaux provenant de

souches ST40 et 8MIP1 et des fractions purifiées d’ADN polymérase # et ! sont déposés sur

la colonne ADN ligase 1. Dans le but d’identifier les protéines décrochées de la colonne, les

171

A B

Figure 82 : Test d'inhibition de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne d'affinité

ADN ligase 1 en présence de concentration croissante (A) d'AZT ou (B) d'aphidicoline. Ces

tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2 du

premier chapitre).

Figure 83 : Mesure de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne ADN ligase 1

-TAPTAG suite au dépôt d'une fraction purifée d'ADN polymérase gamma purifiée.

Ces tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

( paragraphe II.2.2 du premier chapitre)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[AZT] en µM

Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50


Po

urc

en

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Dépot Fraction non

retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000


retenue


acti

vit

é A

DN

po

lym

érase (

cp

m)


dépôt d'extrait mitochondriaux de ST40 sur une colonne d'affinité ADN ligase 1-TAPTAG.

Les tests sont réalisé selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe

II.2.2 du premier chapitre).

tests enzymatiques et une analyse par spectrométrie de masse MS/MS ont été à nouveau

réalisés.


Dans un premier temps, je me suis intéressé à la recherche d’activité ADN polymérase

parmi les protéines qui se sont fixées sur la colonne ADN ligase I. Ainsi de façon similaire

aux colonnes précédentes, des tests d’activités ADN polymérases ont été réalisés sur les

protéines décrochées de la colonne selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes

(paragraphe II.2.5.2). L’activité ADN polymérase est trouvée au niveau du STEP 0,5 M

(figure 81). Dans le but d’identifier cette activité ADN polymérase, des tests en présence

d’AZT-TTP et d’aphidicoline ont été réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.2 du chapitre I). Comme les deux colonnes précédentes, nous

constatons une forte inhibition de l’activité ADN polymérase en présence de l’inhibiteur

nucléosidique (figure 82A) ainsi qu’un faible effet de l’aphidicoline (figure 82B). Ces

propriétés laissent penser que l’ADN polymérase présente dans le STEP 0,5 M correspond

toujours à l’ADN polymérase #. Comme précédemment, des extraits mitochondriaux de

souches 8MIP1 sont déposés sur la colonne d’affinité ADN ligase 1 toutefois, aucune activité

ADN polymérase n’a été détectée. L’absence d’activité ADN polymérase confirme les

analyses réalisées en présence d’inhibiteur, ainsi l’ADN polymérase # est capable de se fixer

sur la colonne ADN ligase 1. Dans le but de déterminer si l’interaction entre l’ADN

polymérase # et l’ADN ligase I est dépendante de la présence d’ADN polymérase !, une

fraction purifiée d’ADN polymérase # est déposée sur la colonne. Les protéines fixées sur la

colonne sont décrochées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe

II.2.5.2), des tests d’activité ADN polymérase permettent de constater une forte activité au

niveau des fractions éluées à 0,5 M de NaCl (figure 83). Ainsi, l’ADN polymérase # est

capable d’interagir sur la colonne ADN ligase 1 en absence d’ADN polymérase !. Enfin, des

extraits d’ADN polymérase ! sont déposés sur la colonne comme précédemment, toutefois

comme lors des deux précédentes colonnes, aucune activité n’a été décelée. Ce résultat

confirme celui obtenu avec les mitochondries provenant de souche 8MIP1, ainsi l’ADN

polymérase !.ne serait pas capable de se fixer sur la colonne ADN ligase 1 en absence

d’ADN polymérase #.


172

A

C D

0 0,2 0,5 1 2 5[ATP] en mM


Figure 85 : L'activité ADN topoisomérase décrochée de la colonne d'affinité ADN ligase 1 est testée en

présence (A) d'ATP, (B) de bérénil, (C) de KCl et (D) de sulfate de zinc. Le test est réalisé selon le matériel

et méthodes (II.2.2.1)

ST

EP

0,5

M d

e l'

AD

N li

ga

se 1

Fra

ctio

n n

on

re

ten

ue

ST

EP

0,1

M

ST

EP

0,2

5 M

ST

EP

0,5

M

ST

EP

1 M

ST

EP

2 M

-E

Figure 84 : Test d'activité ADN topoisomérase suite au dépôt d'extrait mitochondrial de souche ST40

sur colonne d'affinité ADN ligase, les protéines décrochées avec 0,5 M NaCl sont déposées sur une

colonne Q HP, enfin les protéines sont éluées par des STEPs de 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M, 1 M et 2 M NaCl.

L'activité ADN topoisomérase est testées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes


0 25 50 100 200

B[Bérénil] en µg/ml

Une recherche de l’activité ADN topoisomérase est réalisée selon le protocole décrit

dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1) sur les fractions obtenues suite au dépôt

d’extrait mitochondrial de souche ST40 sur la colonne. Comme la colonne précédente, une

activité nucléase est constatée parmi les protéines décrochées en présence de 0,5 M. Afin de

pouvoir déceler la présence d’activité ADN topoisomérase, une colonne Hi-Trap Q-HP est

également réalisée selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.3).

Suite à cette étape chromatographique, des tests d’activité ADN topoisomérase ont permis

d’obtenir des topoisomères en présence des protéines décrochées de la colonne Q-HP à une

concentration de 0,25 M NaCl (figure 84). Ainsi, une activité ADN topoisomérase est

présente au niveau du STEP 0,5 M de la colonne ADN ligase 1. Une identification

biochimique de cette activité a été réalisée de façon similaire aux tests réalisés sur la colonne

d’affinité ADN polymérase #. Ainsi, nous constatons une inhibition de l’activité ADN

topoisomérase avec le bérénil (figure 85A) et une indépendance de l’activité par rapport à

l’ATP (figure 85B). Un optimum de l’activité ADN topoisomérase est observé à une

concentration de KCl comprise entre 100 et 150 mM (figure 85C), enfin, une inhibition totale

de l’activité topoisomérase est constatée à une concentration de 1 mM de ZnSO4 (figure 85D).

Ces résultats correspondent au comportement de l’ADN topoisomérase mitochondriale, de

type I, identifiée lors de la colonne ADN polymérase #. Au final, les tests enzymatiques ont

permis de déterminer que l’ADN topoisomérase de type I mitochondriale est capable

d’interagir avec l’ADN ligase 1.

- Analyse MS/MS.

En parallèle à ces analyses biochimiques, une analyse par MS/MS réalisée sur les

protéines décrochées de la colonne en présence de 0,5 M NaCl a permis de détecter 115

protéines (tableau de masse n°6 voir annexes de la partie II). La présence de l’ADN

polymérase # et de l’ADN topoisomérase de type I parmi les protéines fixées sur la colonne a

été confirmée par cette analyse. Néanmoins, une ADN topoisomérase de type II a également

été identifiée parmi ces protéines, dont certaines pourraient faire partie du réplisome. Nous

avons en particuliers retrouvé des protéines identifiées lors des précédentes colonnes, les

protéines Synm et Abf2 ainsi que Mgm101. Une protéine intéressante a été identifiée par

spectrométrie de masse parmi les protéines interagissant sur la colonne ADN ligase 1 il s’agit

de Rim1. Cette protéine est l’homologue de levure de la protéine SSBP humaine qui fait

partie du « replisome minimal » humain (Korhonen et al, 2004). Il s’agit d’une protéine de

fixation à l’ADN simple brin.

173

A B

Figure 87 : Tests d'inhibition de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne Rim1 avec

0,5 M NaCl en présence de concentration croissante (A) d'AZT ou (B) d'aphidicoline. Les tests

sont réalisés selon le protocole décrite dans le matériel et méthodes du premier chapitre


Figure 88 : Mesure de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne d'affinité Rim 1

suite au dépôt de fraction purifiée d'ADN polymérase gamma purifiée. Les tests sont réalisés

selon le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[AZT] en µM

Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50


Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

Figure 86 : mesure d'activité ADN polymérase des différentes fractions obtenues suite au

dépôt d'un extrait mitochondrial de souche ST40 sur la colonne d'affinité Rim1. Les tests sont

réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

III.2.4- Colonne RIM1.

Lors de la colonne précédente, la protéine Rim1 a été identifiée comme étant capable

d’interagir avec l’ADN ligase 1, de plus nous avons montré que cette protéine est capable

d’interagir avec l’ADN polymérase # dans la phase 2. Enfin des homologies de séquence avec

la protéine humaine SSBP, pourrait lui attribuer un rôle essentiel dans la réplication et la

synthèse de forme d’ADN de grande taille dans la mitochondrie (Korhonen et al, 2004). Ainsi

une souche exprimant la protéine Rim1 étiquetée avec un TAPTAG (#YSC1178-7499498) est

mise en culture et les mitochondries purifiées d’après le protocole II.1.3. Les protéines

mitochondriales sont ensuite extraites selon le protocole décrit dans la partie II.2.3.1. La

colonne est construite selon la même méthodologie utilisée pour les précédentes colonnes.

Des extraits mitochondriaux totaux provenant de souches ST40 et 8MIP1 et des fractions

purifiées d’ADN polymérase # et ! sont déposés sur la colonne d’affinité RIM1. Les protéines

fixées sont décrochées selon le même protocole que pour les 3 colonnes précédentes, enfin

des identifications biochimiques et par spectrométrie de masse sont réalisées.


Suite au dépôt d’extraits mitochondriaux totaux à partir de souches ST40 sur la

colonne Rim1, des tests d’activités ADN polymérase de façon similaire aux précédentes

colonnes. Ainsi, nous pouvons remarquer la présence d’activité ADN polymérase au niveau

du STEP 0,5 M NaCl (Figure 86), comme lors des précédentes colonnes, l’utilisation d’AZT-

TTP et d’aphidicoline a permis de déterminer que cette activité ADN polymérase possède le

même comportement que l’ADN polymérase # en présence de ces inhibiteurs (figure 87).

Ainsi, dans le but de vérifier cette observation, des extraits mitochondriaux provenant de la

souche 8MIP1 ont été déposés sur la colonne d’affinité Rim1 et les protéines sont décrochées

selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2). Aucune activité

ADN polymérase n’est décrochée de la colonne. Ainsi, l’ADN polymérase fixée sur la

colonne d’affinité Rim1 et décrochée en présence de 0,5 M NaCl correspond à l’ADN

polymérase #. Des fractions purifiées d’ADN polymérase # sont ensuite déposées sur la

colonne d’affinité Rim1, et une activité ADN polymérase a été fixée sur la colonne (figure

88). Ainsi, en absence d’ADN polymérase !, l’ADN polymérase # est capable d’interagir

avec la protéine Rim1. Enfin de l’ADN polymérase ! a de nouveau été déposée sur la colonne

Rim1, mais aucune fixation de cette enzyme n’est observée. Ainsi comme pour les autres

colonnes, cela confirme le résultat obtenu lors du dépôt d’extrait mitochondriaux de souche

8MIP, l’ADN polymérase !.ne semble pas capable d’interagir avec la protéine Rim1.

174

Figure 89 : Test d'activité ADN topoisomérase suite au dépôt d'extrait provenant

(A) de souche ST40 (B) de souche ∆MIP1 sur la colonne Rim 1 -TAPTAG, les protéines sont

décrochées avec 0,1 M, 0,5 M , 1 M et 2 M NaCl. Le test est réalisé selon le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.2.1).

Dépôt

Fraction non retenue

STEP 0,1 M

STEP 0,5 M

STEP 1 M

STEP 2 M

A B

C D



Figure 90 : L'activité ADN topoisomérase décrochée de la colonne Rim 1-TAPTAG avec 0,5 M est

testée en présence (A) d'ATP, (B) de bérénil, (C) de KCl et (D) de sulfate de zinc. Le test est réalisé

selon le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1).

Dépôt


STEP

0,1 M

STEP

0,5 M

STEP

1 M

STEP

2 M

A B


En parallèle, des tests d’activité ADN topoisomérase sont réalisés sur les protéines

mitochondriales provenant de la souche ST40 qui se sont fixées sur la colonne Rim1. Nous

constatons la présence de topoisomères au niveau du STEP 0,5 M principalement mais aussi

au niveau du STEP 0,1 M (figure 89A). Comme les colonnes précédentes, dans le but de

caractériser cette enzyme, des tests d’activité ADN topoisomérase ont été réalisés en présence

de bérénil, d’ATP et de ZnSO4 (figure 90). Ces tests ont permis d’observer un comportement

similaire de l’activité ADN topoisomérase par rapport aux colonnes précédentes. Cette

activité correspond de nouveau à l’ADN topoisomérase I mitochondriale. Ainsi, l’ADN

topoisomérase I mitochondriale est capable d’interagir avec la protéine Rim1. Dans le but de

déterminer si la présence de l’ADN polymérase # dans l’extrait est importante pour qu’il y ait

fixation entre les deux protéines, des extraits mitochondriaux de souches 8MIP1 ont été

déposés sur la colonne d’affinité Rim1 et les protéines fixées sont éluées de façon similaire à

l’expérience réalisée avec les souches ST40. Comme pour les précédentes colonnes, nous

pouvons constater la formation de topoisomères après incubation du plasmide avec les

protéines éluées à 0,5 M de sels (figure 89B). Ainsi, l’ADN topoisomérase I mitochondriale

ne nécessite pas la présence d’ADN polymérase # pour interagir avec la protéine Rim1.

- Analyse MS/MS.

En ce qui concerne les autres protéines décrochées de la colonne en présence de 0,5 M

NaCl et qui n’ont pu être identifiées par activité, 36 d’entre elles ont pu être identifiées par

une analyse MS/MS (tableau de masse n°7 voir annexes de la partie II). Parmi ces dernières,

nous trouvons trois protéines susceptibles de faire partie du réplisome qui ont été trouvées lors

des précédentes analyses : les protéines Synm, Abf2, et Mgm101.

III.2.5- Colonne ADN Polymérase !.

Dans le chapitre précédent est décrite la localisation d’une seconde ADN polymérase

dans la mitochondrie de S.cerevisiae, et identifiée comme l’ADN polymérase !. Ainsi, j’ai

décidé d’utiliser la sous unité catalytique de l’ADN polymérase ! comme protéine appât et

d’identifier les protéines qui sont capables d’interagir avec elle. Cela pourrait permettre de

déterminer une interaction possible avec la seconde ADN polymérase mitochondriale ou

d’autres protéines. La colonne est préparée suivant la même méthodologie que les cinq

colonnes précédentes à l’exception de la souche de levure exprimant l’ADN polymérase !-

TAPTAG (#YSC1178-7502406).

175

A B

Figure 92 : Tests d'inhibition de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne ADN

polymérase alpha avec 0,5 M NaCl en présence de concentrations croissantes (A) d'AZT ou

(B) d'aphidicoline. Les tests sont réalisés selon le protocole décrite dans le matériel et méthodes

du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

Figure 93 : Mesure de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne d'affinité ADN

polymérase alpha suite au dépôt d'une fraction purifiée d'ADN polymérase gamma purifiée.

Les tests sont réalisés selon le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

Figure 91 : mesure d'activité ADN polymérase des différentes fractions obtenues suite au

dépôt d'un extrait mitochondrial de souche ST40 sur la colonne d'affinité ADN polymérase

alpha. Les tests sont réalisés selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes du premier


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

[AZT] en mM

Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Dépot Fraction non

retenue

STEP 0,1 M STEP 0,5 M STEP 1 M STEP 2 MA

cti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

Des extraits protéiques mitochondriaux provenant de souches ST40, 8MIP1 et des

fractions purifiées d’ADN polymérase # et ! sont déposés sur la colonne. Les protéines fixées

sont éluées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2). Afin

d’identifier ces protéines, des analyses biochimiques et une identification par spectrométrie de

masse MS/MS sont réalisés.

- Une activité ADN polymérase.

Des manipulations identiques aux précédentes colonnes ont été réalisés, ainsi suite au

dépôt d’un extrait mitochondrial de levure ST40 sur la colonne d’affinité ADN polymérase !,

des tests d’activité ADN polymérase ont mis en évidence la présence d’activité parmi les

protéines décrochées de la colonne en présence de 0,5 M NaCl (figure 91). Des tests d’activité

en présence d’aphidicoline et d’AZT-TTP ont permis de constater un comportement

biochimique de l’activité ADN polymérase fixée sur la colonne semblable à celui de l’ADN

polymérase # (figure 92). Le dépôt d’extrait mitochondrial de souche 8MIP1 sur la colonne

d’affinité ADN polymérase !.a pour conséquence de ne pas entraîner de fixation d’activité

ADN polymérase sur la colonne. Ainsi, l’ADN polymérase # présente dans les mitochondries

de la souche ST40 est capable d’interagir avec l’ADN polymérase !. Une fraction purifiée

d’ADN polymérase # est déposée sur la colonne d’affinité ADN polymérase !, une fixation

d’activité ADN polymérase et ensuite constatée comme lors des précédentes colonnes (figure

93). Une fraction purifiée d’ADN polymérase ! a été déposée sur la colonne d’affinité mais

n’a pas permis de constater une fixation d’activité ADN polymérase. Ce résultat confirme le

résultat obtenu suite au dépôt d’extrait provenant de mitochondrie de souche 8MIP1, ainsi

l’ADN polymérase ! ne semble pas capable d’interagir avec elle même.

- Une activité ADN topoisomérase.

Parmi les nombreuses protéines décrochées de la colonne, l’activité ADN

topoisomérase a été recherchée. Nous pouvons constater la présence d’une activité nucléase

au niveau des protéines éluées à 0,5 M de sels. Néanmoins après une étape

chromatographique réalisée comme décrit lors de la colonne d’affinité ADN topoisomérase,

les activités ADN topoisomérase et nucléase sont séparées sur une colonne Hi Trap Q HP.

Des tests d’activités ADN topoisomérase ont été réalisés et ont permis de constater la

formation de topoisomères après incubation avec les protéines décrochées à 0,25 M de sels

(figure 94). Ainsi, une activité ADN topoisomérase est capable de se fixer sur la colonne

d’affinité ADN polymérase.!. Des tests d’activité ADN topoisomérase ont été réalisés pour

176

ST

EP

0,5

M d

e l

a c

olo

nne

AD

N p

oly

méra

se a

lpha

fracti

on

no

n r

ete

nu

e

ST

EP

0,1

M

ST

EP

0,5

M

ST

EP

0,2

5 M

ST

EP

1 M

Figure 94 : Etude de l'ADN topoisomérase capable de se fixer sur la colonne ADN polymérase

alpha et qui est décrochée de la colonne avec 0,5 M NaCl puis fixée sur une colonne Q-HP.

Les protéines sont ensuite éluées en présence de 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M, 1 M NaCl et l'activité ADN

topoisomérase est testée selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1).

Dép

ot

Fra

ctio

n n

on r

eten

ue

ST

EP

0,1

M

ST

EP

0,5

M

ST

EP

1 M

ST

EP

2 M

Figure 95 : test d'activité ADN topoisomérase suite au dépôt d'extrait mitochondrial provenant

de souches ∆MIP1 et à l'élution des protéines fixées sur la colonne. l'activité ADN topoisomérase

est testée selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1)

les mêmes fractions de protéines provenant de souche 8MIP1, et nous pouvons constater la

présence d’une activité de relâchement des super-tours de l’ADN au niveau du STEP 0,5 M

NaCl (figure 95). Ainsi, l’interaction de cette activité ADN topoisomérase sur la colonne

d’affinité ADN polymérase ! ne nécessite pas la présence de l’ADN polymérase # dans

l’extrait, de plus une nucléase semble capable d’interagir sur l’ADN polymérase !.

- Analyse MS/MS.

Une identification par spectrométrie de masse MS/MS des protéines décrochées en

présence de 0,5 M NaCl nous permet d’identifier 75 protéines (tableau de masse n°8 voir

annexes de la partie II). Parmi ces dernières, l’ADN polymérase # a été identifiée, ce résultat

confirme les analyses biochimiques. Parmi les autres protéines identifiées, l’ADN

topoisomérase de type I est retrouvée. Ainsi l’ADN topoisomérase de type I et l’ADN

polymérase # sont capables d’interagir avec l’ADN polymérase !. Parmi les autres protéines

protéines capables de se fixer sur la colonne ADN polymérase ! et qui pourraient faire partie

du réplisome, nous trouvons la nucléase Nuc1. Néanmoins, il n’est pas exclu que l’activité

nucléase observée ne puisse pas être apportée par une nucléase autre que Nuc1, présente en

faible quantité ou mal ionisée lors de son identification. La protéine Nuc1 a été décrite comme

candidat potentiel lors d’étape précoce du cycle de réplication, il s’agit de l’homologue de

levure de la protéine Endo G humaine, protéine impliquée dans l’initiation de la réplication

chez l’homme. En ce qui concerne les autres protéines qui ont interagit sur la colonne

d’affinité ADN polymérase !, la spectrométrie de masse a permis d’identifier trois aminoacyl

ARNt synthétase (Synm, Syh et Sytc) ainsi que les protéines Abf2 et Mgm101, dont la

présence dans un réplisome a été discutée lors des colonnes d’affinité précédentes.

III.2.6- Colonne ADN Polymérase !1.

Dans le chapitre précédent, il a été montré la présence de l’ADN polymérase !B parmi

les protéines co-purifiées après cinq colonnes chromatographiques avec l’ADN polymérase

alpha mitochondriale. Ainsi, j’ai décidé d’identifier les protéines capables d’interagir avec la

sous unité accessoire de l’ADN polymérase !. Une souche capable d’exprimer cette protéine

appât étiquetée avec un TAPTAG (#YSC1178-7499185) est utilisée pour réaliser une colonne

d’affinité avec la même méthodologie que lors de la prépatation des cinq colonnes

précédentes.

Des extraits mitochondriaux totaux de souches ST40 et 8MIP1 ainsi que des fractions

purifiées d’ADN polymérase # ou ! sont déposés sur la colonne et les protéines fixées sont

177

Figure 96 : Mesure d'activité ADN polymérase sur les différentes fractions obtenues suite

au dépôt d'un extrait mitochondrial total sur une colonne d'affinité ADN polymérase

alpha B. Les tests sont réalisés selon le protocole décrite dans le matériel et méthodes du

premier chapitre (paragraphe II.2.2).


alpha B-TAPTAG après dépôt d'ADN polymérase gamma purifiée. Les tests sont réalisés

selon le protocole décrite dans le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)

décrochées selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2). Dans

le but d’identifier les protéines capables d’interagir sur la colonne, des tests d’activité

enzymatiques sont réalisés ainsi qu’une analyse par spectrométrie de masse MS/MS.


Après dépôt d’un extrait total de protéines mitochondriales de souche ST40 sur la

colonne d’affinité ADN polymérase !B, des tests d’activité ADN polymérase ont mis en

évidence la présence d’activité ADN polymérase parmi les protéines éluées de la colonne en

présence de 0,5 M, 1 M et 2 M NaCl (figure 96). Des tests d’activité en présence

d’aphidicoline et d’AZT-TTP ont permis de constater un comportement de l’activité ADN

polymérase fixée sur la colonne ADN polymérase !B similaire à ceux obtenus au niveau de la

colonne ADN polymérase alpha. Dans le but de vérifier ce résultat, des extraits

mitochondriaux de souches 8MIP1 ont été déposés sur la colonne. De façon similaire aux

précédentes colonnes, aucune activité ADN polymérase ne semble s’être fixée sur la colonne

d’affinité ADN polymérase !B. Ainsi, l’ADN polymérase qui se fixe sur la colonne !B est

bien l’ADN polymérase #. Enfin, une fraction d’ADN polymérase # purifiée est déposée sur la

colonne d’affinité, après mesure de l’activité enzymatique des protéines décrochées de la

colonne, nous constatons la présence d’activité ADN polymérase dans une fraction éluée à 0,5

M (figure 97). Ainsi, l’ADN polymérase # est capable d’interagir avec la sous unité B de

l’ADN polymérase ! en absence de l’ADN polymérase !. Une fraction purifiée d’ADN

polymérase alpha est aussi déposée sur la colonne d’affinité ADN polymérase !B-TAPTAG,

toutefois aucune fixation d’activité ADN polymérase n’a été constatée lors de cette

manipulation. Ainsi, ce résultat laisse paraître que l’ADN polymérase ! ne serait pas capable

d’interagir avec sa sous unité !B dans les conditions de l’expérience.


De façon similaire aux précédentes colonnes, l’activité ADN topoisomérase a été

recherchée parmi les protéines capables d’interagir avec la colonne ADN polymérase !B.

Comme précédemment, une activité ADN topoisomérase est éluée de la colonne en présence

de 0,5 M NaCl (figure 98A). Dans le but de caractériser cette activité, des tests en présence

d’ATP, de bérénil, de KCl et de ZnSO4 ont été réalisés et ont permis de constater un

comportement semblable aux activités ADN topoisomérases détectées lors des cinq

précédentes colonnes (figure 99). Ainsi, l’activité ADN topoisomérase qui est capable

d’interagir avec l’ADN polymérase !B est l’ADN topoisomérase de type I mitochondriale.

178

Figure 98 : Test d'activité ADN topoisomérase suite au dépôt d'extrait provenant (A) de

souche ST40 (B) de souche ∆MIP1 sur la colonne ADN polymérase alphaB -TAPTAG,

les protéines sont décrochées avec 0,1 M, 0,5 M , 1 M et 2 M NaCl. Le test est réalisé selon

le matériel et méthodes (paragraphe II.2.2.1).

Dépôt


STEP 0,1 M

STEP 0,5 M

STEP 1 M

STEP 2 M

A B

C D



Figure 99 : L'activité ADN topoisomérase décrochée de la colonne ADN polymérase alphaB -TAPTAG

avec 0,5 M NaCl est testée en présence (A) d'ATP, (B) de bérénil, (C) de KCl et (D) de sulfate de zinc.

Le test est réalisé selon le matériel et méthodes

Dépôt


STEP

0,1 M

STEP

0,5 M

STEP

1 M

STEP

2 M

A B

Enfin, des tests d’activité ADN topoisomérase de protéines ainsi isolées à partir de souche

8MIP1 ont été réalisés et ont permis de constater la présence d’une activité de relâchement

des super-tours de l’ADN au niveau du STEP 0,5 M NaCl (figure 98B). Ainsi, l’interaction de

l’ADN topoisomérase I mitochondriale sur la colonne d’affinité ADN polymérase !1 ne

nécessite pas la présence de l’ADN polymérase # dans l’extrait.

- Analyse MS/MS.

Une identification par spectrométrie de masse a été réalisée sur les protéines

décrochées en présence de 0,5 M NaCl et ont permis d’identifier 20 protéines (tableau de

masse n°9 voir annexes de la partie II). Parmi ces protéines, l’ADN topoisomérase de type I a

été identifiée, ce résultat de spectrométrie de masse permet donc de confirmer les résultats

obtenus par les tests biochimiques identifiant l’ADN topoisomérase mitochondriale de type I.

L’étude approfondie des résultats de spectrométrie de masse permet de constater la présence

d’une protéine récurrente: la protéine Abf2. Cette protéine a été identifiée dans toutes les

colonnes d’affinités jusqu’à présent.

III.2.7- Colonne Nucléase 1.

Lors des précédentes colonnes, une activité nucléase a été trouvée capable d’interagir

avec les colonnes ADN topoisomérase I, ADN ligase 1 et elle a été identifiée par

spectrométrie de masse MS/MS parmi les protéines se fixant à l’ADN polymérase !. La

protéine Nuc1 a été décrite comme candidat potentiel lors d’étape précoce du cycle de

réplication, de plus elle correspond à l’homologue de levure de la protéine Endo G humaine,

protéine décrite impliquée dans l’initiation de la réplication chez l’homme. Ainsi, nous avons

utilisé une souche de levure exprimant la protéine Nuc1 étiquetée avec un TAPTAG

(#YSC1178-7501263).

Après culture des levures (fermenteur de 10 L), les mitochondries sont purifiées selon

le protocole II.1.3 puis les protéines totales sont extraites (selon le protocole du premier

chapitre II.2.3.1). Les colonnes sont construites de façon similaire aux quatre colonnes

précédentes. Des extraits mitochondriaux totaux de souches ST40 ou 8MIP1 ou des fractions

purifiées d’ADN polymérase # et ! sont déposés sur la colonne. Les protéines sont décrochées

selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2). Dans le but

d’identifier les protéines capables de se fixer sur la colonne, des analyses biochimiques et de

spectrométrie de masse ont été entreprises.


179

Figure 101 : mesure d'activité ADN polymérase sur les protéines décrochées avec 0,5 M de

NaCl en présence de concentrations croissantes d'Aphidicoline ou d'AZT.Les tests sont

réalisés selon le protocole décrite dans le matériel et méthodes du premier chapitre


Figure 102 : Mesure de l'activité ADN polymérase décrochée de la colonne Nucléase 1 -TAPTAG

après dépôt d'ADN polymérase gamma purifiée. Les tests sont réalisés selon le protocole décrite

dans le matériel et méthodes du premier chapitre (paragraphe II.2.2).

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

érase (

cp

m)

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50


Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[AZT] en µM

Po

urcen

tag

e d

'acti

vit

é A

DN

po

lym

érase

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000


retenue


Acti

vit

é A

DN

po

lym

éra

se (

cp

m)


dépôt d'extrait mitochondrial de souche ST40 sur la colonne d'affinité Nucléase 1-TAPTAG.

Les tests sont réalisés selon le protocole décrite dans le matériel et méthodes du premier


Après le dépôt d’extrait mitochondriaux totaux de ST40 et élution des protéines fixées

sur la colonne comme décrit dans le paragraphe précédent, des tests d’activité ADN

polymérase ont été réalisés et ont permis de déterminer qu’une activité ADN polymérase est

présente au niveau du STEP 0,5 M (figure 100). Dans le but de l’identifier, des tests

d’activités ADN polymérase ont permis de constater un comportement identique à l’activité

ADN polymérase fixée lors des précédentes colonnes d’affinité en présence d’aphidicoline et

d’AZT-TTP (figure 101) il est fort probable que l’activité ADN polymérase fixée sur la

colonne et qui provient des mitochondries des souches ST40, soit l’ADN polymérase #. Dans

le but de vérifier cette hypothèse, des extraits mitochondriaux de souches de levure 8MIP1

sont déposés sur la colonne Nuc1. Après décrochage des protéines selon le protocole décrit

dans le matériel et méthodes (paragraphe II.2.5.2), des tests d’activité ADN polymérase ont

permis de constater l’absence d’activité ADN polymérase. Ainsi, l’ADN polymérase qui se

fixe sur la protéine Nuc1 correspond à l’ADN polymérase #. Le dépôt d’une fraction purifiée

d’ADN polymérase # sur la colonne d’affinité Nuc1, entraîne la fixation d’activité ADN

polymérase. Ainsi l’ADN polymérase # est capable de se fixer sur la protéine Nuc1 en

absence d’ADN polymérase ! (figure 102). Après dépôt de fraction purifiée d’ADN

polymérase ! et élution des protéines aucune activité ADN polymérase n’est décrochée de la

colonne, ainsi ce résultat confirme celui obtenu lors du dépôt d’extrait mitochondriaux de

souche 8MIP1 qui est que l’ADN polymérase ! ne semble pas capable d’interagir sur Nuc1.


Comme pour les précédentes colonnes d’affinité, dans le but de déterminer si une

ADN topoisomérase présente dans la mitochondrie de la souche ST40 est capable d’interagir

avec Nuc1, l’activité ADN topoisomérase présente dans les protéines décrochées de la

colonne est évaluée. Nous pouvons constater qu’une activité de relâchement des super-tours

d’ADN est éluée de la colonne à 0,5 M NaCl (figure 102). Comme pour les précédentes

colonnes, dans le but de caractériser cette activité, des tests d’activités ADN topoisomérase

sont réalisés de façon identique à ceux réalisés pour la colonne d’affinité ADN polymérase #

(paragraphe III.2.1). L’activité ADN topoisomérase qui se fixe sur la colonne d’affinité Nuc1

se comporte de la même façon que l’ADN topoisomérase I mitochondriale identifiée lors des

colonnes d’affinité précédentes (figure 103). Ainsi, une activité ADN topoisomérase de type I

mitochondriale est capable d’interagir avec Nuc1. Après dépôt d’extrait mitochondrial de

souche 8MIP1, et élution des protéines fixées selon le protocole décrit dans le matériel et

méthodes (paragraphe II.2.5.2), des tests d’activité ADN topoisomérases ont mis en évidence

180

Figure 103 : Tests d'activité ADN topoisomérase après dépôt d'extraits mitochondriaux provenant

(A) de souche ST40 (B) de souche ∆MIP1 sur la colonne Nucléase 1 -TAPTAG, les protéines sont

décrochées avec 0,1 M, 0,5 M , 1 M et 2 M NaCl. Le test est réalisé selon le matériel et méthodes


Dépôt


STEP 0,1 M

STEP 0,5 M

STEP 1 M

STEP 2 M

A B

C D



Figure 104 : L'activité ADN topoisomérase décrochée de la colonne d'affinité Nucléase 1 avec

0,5 M NaCl est testée en présence (A) d'ATP, (B) de bérénil, (C) de KCl et (D) de sulfate de zinc.


Dépôt


STEP

0,1 M

STEP

0,5 M

STEP

1 M

STEP

2 M

A B

la fixation de l’ADN topoisomérase I mitochondriale. La fixation de l’ADN topoisomérase I

mitochondriale sur la colonne d’affinité Nuc1 est indépendante de la présence d’ADN

polymérase # (figure 104).

- Analyse MS/MS.

En parallèle à ces études biochimiques, une analyse par spectrométrie de masse a

permis d’identifier les protéines décrochées en présence de 0,5 M NaCl, 48 protéines ont été

identifiées (tableau de masse n°10 voir annexes de la partie II), dont l’ADN topoisomérase de

type I, ce qui corrobore les résultats obtenus lors des tests biochimiques. Parmi les autres

protéines identifiées par spectrométrie de masse un certain nombre de protéines pourrait

potentiellement faire partie du réplisome. Ainsi, nous retrouvons des protéines identifiées

précédemment : les protéines Abf2, Mgm101 ainsi que la protéine Synm.

181

IV- DISCUSSION / CONCLUSION.

Dans le premier chapitre, j’ai décris l’identification de l’ADN polymérase ! comme la

seconde activité ADN polymérase dans la mitochondrie de la levure S.cerevisiae, et cette

découverte pose la question du rôle joué par ces ADN polymérases ! et # dans la

mitochondrie, de leurs interactions, ainsi que celles des autres protéines impliquées dans la

réplication mitochondriale. Ce dernier point m’a amené à m’intéresser à l’étude du réplisome

dans la mitochondrie de S.cerevisiae.

Cette étude a été initiée selon deux axes principaux de travail, le premier correspond à

la purification du réplisome natif, et la seconde correspond à l’identification des différents

partenaires impliqués dans la réplication afin de proposer un modèle de réplisome.

Le réplisome mitochondrial n’est pas un complexe très étudié aussi dans un premier

temps j’ai du mettre au point un protocole permettant de purifier ce complexe de réplication

mitochondrial. Cette méthodologie est basée sur une technique ayant permis la purification du

réplisome nucléaire mais que j’ai dû adapter. Ainsi, l’extraction des protéines mitochondriales

au triton X-100, le décrochage des protéines fixées sur l’ADN en présence de 2 M KCl et 5%

PEG, les conditions de dialyse, la récupération des fractions d’intérêt ont été optimisées pour

concentrer le réplisome mitochondrial au maximum dans une seule fraction nommée la phase

2. Dans le but de déterminer si cette phase 2 pouvait contenir le réplisome mitochondrial, des

tests d’activité en présence d’une matrice mini-cercle ont été effectués et ont permis de mettre

en évidence la présence dans cette phase de toutes les enzymes nécessaires à la réplication de

cette matrice.

Après avoir montré sur des colonnes de tamisage moléculaire la présence de

complexes protéiques de haut poids moléculaire dans cette phase 2, nous avons détecté dans

ces fractions une activité ADN polymérase et une activité ADN topoisomérase. Ainsi, ces

deux activités qui sous forme libre possèdent respectivement une masse maximale de 150 kDa

pour l’activité ADN topoisomérase et 170 kDa pour l’activité ADN polymérase sont

retrouvées au niveau de fractions correspondant à des protéines ou complexes de masse

supérieure à 300 kDa (limite d’exclusion Superose 12, GE healthcare). Dans le but d’affiner

la masse du réplisome, d’autres colonnes de tamisage ont été réalisées. Quelle que soit la

colonne utilisée, ce complexe se retrouve dans la fraction exclue donc à une masse supérieure

ou égale à 1 000 kDa (limite d’exclusion de la Superose 6). L’activité ADN polymérase a un

optimum d’activité en présence de 50 mM MgAc et différents tests nous ont permis

d’identifier l’ADN polymérase #.comme étant l’enzyme responsable de cette activité.

L’utilisation de souche 8MIP1 permet de vérifier cette identification, l’absence de l’ADN

182

polymérase gamma ne fait pas disparaître l’activité ADN topoisomérase au niveau de ces

fractions de haut poids moléculaire ce qui suggère qu’elle n’est pas essentielle à la

structuration du complexe. Des expériences de centrifugation sur gradient de saccharose ont

aussi été réalisées et nous ont permis de montrer que l’activité ADN topoisomérase et

l’activité ADN polymérase migrent au niveau d’un complexe possédant un coefficient de

sédimentation de 21S. A partir des expériences de tamisage moléculaire, nous avons montré

également que l’ADN polymérase alpha est éluée dans des fractions de masse inférieure à 300

kDa ce qui peut correspondre aux deux sous unités de l’ADN polymérase !, la sous unité

catalytique ! et la sous unité accessoire !B. Ce résultat suggère que l’ADN polymérase ! ne

fait pas partie du complexe ou qu’elle est facilement labile.

Dans le but d’identifier les protéines se trouvant dans la phase 2 et pouvant

potentiellement faire partie du réplisome, d’autres tests d’activité enzymatiques ont été

réalisés, ils ont permis d’identifier une activité ADN hélicase, une activité ligase, et une

activité ARN polymérase dans cette phase. D’autres protéines identifiées par spectrométrie de

masse pourraient faire partie du réplisome, c’est le cas de la protéine Rim1. Cette protéine est

l’homologue de levure de la protéine SSBP, cofacteur qui stimule l’activité de l’ADN

polymérase # en présence de l’hélicase TWINKLE et lui permet de synthétiser de grandes

molécules d’ADN (Korhonen et al, 2004). De plus, cette protéine est co-immunoprécipitée

avec l’ADN polymérase # à partir de la phase 2 dans nos essais de co-immunoprécipitation.

Enfin, dans le but de déterminer la composition et de purifier de façon plus

approfondie le complexe de haut poids moléculaire, différentes techniques ont été réalisées

mais n’ont toutefois pas permis de visualiser les composants du complexe de réplication. Ces

échecs pourraient être dus à la très forte sensibilité du complexe au sel, la dissociation du

complexe rendant son étude plus difficile.

Dans la littérature, il a été mis en évidence l’existence d’un complexe protéique ancré

au niveau de la membrane interne mitochondriale et possédant une activité réplicative. Ce

complexe est composé de nombreuses protéines parmi lesquelles se trouve l’ADN polymérase

#, la protéine Abf2 et la protéine Mgm101 parmi d’autres protéines. Mgm101 est essentielle à

la maintenance de l’ADN mitochondrial et la délétion de son gène conduit à la perte de

l’ADN mitochondrial. Il a été proposé que Mgm101 facilite la formation d’un intermédiaire

lors de la recombinaison (Williamson, 2002). Toutefois, il a été supposé aussi que la protéine

Mgm101 servirait de point d’ancrage de l’ADN au niveau de la membrane interne

mitochondriale. La protéine Abf2 quant à elle, est une protéine possédant deux domaines

HMG (High Mobility Group) qui sont retrouvés chez de nombreux facteurs de transcription et

183

ADN pol γ ADN top I ADN ligase 1 Rim1 ADN pol α ADN pol αB Nuc1

ADN polymérase γ + + + + + + + +

ADN polymérase α + - - - - - - -

ADN topoisomérase 1 + + + + + + + +

Rim1 + - - + - - - -

Synm + + + + + + - +

ABF2 + + + + + + + +

Mgm101 - - + + + + - +

colonnesPhase 2protéines identifiées

Tableau 8 : Tableau récapitulatif des interactions sur les différentes colonnes comparées aux protéines

présentes dans la phase 2 obtenues sur coussin de saccharose 2 M

complexes de remodellage de la chromatine. Cette protéine serait impliquée dans

l’empaquetage et la recombinaison de l’ADN mitochondrial.

D’autres interactions mettant en jeu l’ADN polymérase ! ont été constatées dans la

mitochondrie. Chez l’homme, une interaction entre ADN polymérase ! et l’ADN ligase III a

été mise en évidence (De et Campbell, 2007) dont l’homologue est l’ADN ligase I chez la

levure, la seule décrite jusqu’à présent dans la mitochondrie chez S.cerevisiae (Willer et al,

1999). Enfin, des expériences d’activité de réplication in vitro ont été réalisées dans le but

d’identifier les protéines essentielles à la réplication d’un ADN très proche de l’ADN

mitochondrial chez l’homme : un ADN modèle de type mini-cercle. Trois protéines ont été

montrées comme étant des composants du réplisome minimum permettant de répliquer cette

matrice, il s’agit de l’ADN polymérase gamma, de l’hélicase TWINKLE et de la protéine

SSBP (Korhonen et al, 2004). Cette dernière est nécessaire pour améliorer la synthèse de

molécules d’ADN de grande taille. L’homologue de cette protéine est Rim1 qui doit interagir

avec l’ADN polymérase ! lors de la réplication de l’ADN mitochondrial.

La seconde partie, de ce chapitre avait pour but de reconstituer un réseau

d’interactions possibles entre les protéines pouvant faire partie du réplisome, dont certaines

ont été choisies pour une stratégie d’analyse basée sur des colonnes d’affinité. Des extraits

mitochondriaux totaux de souches de levures ST40, "MIP1, et des fractions purifiées d’ADN

polymérase ! et # ont été déposés sur les différentes colonnes utilisées. Après élution des

protéines fixées, et analyses par mesure d’activités enzymatiques et par spectrométrie de

masse, nous pouvons constater que certaines protéines sont redondantes au fil des colonnes

(tableau 8).

Les résultats obtenus grâce aux colonnes d’affinités permettent de constater que

l’ADN polymérase ! semble capable de se fixer sur toutes les colonnes, il est probable que

certaines de ces interactions puissent être directes, et d’autres indirectes par l’intermédiaire

d’autres protéines présentes dans les extraits. Cette fixation est observée en présence d’extrait

mitochondriaux totaux de souches ST40, mais aussi de fractions purifiées d’ADN polymérase

gamma.

Parmi les interactions de l’ADN polymérase gamma sur les colonnes, nous pouvons

remarquer tout d’abord qu’elle semble capable d’interagir sur elle-même, cette interaction

pourrait être le signe d’une dimérisation de l’enzyme. Ensuite, de façon similaire aux

complexes et interactions décrits dans la littérature, l’ADN polymérase gamma pourrait

intéragir avec la protéine Rim1 et l’ADN ligase 1. Ces résultats tendent à montrer que l’ADN

polymérase ! de levure S.cerevisiae serait capable d’avoir les mêmes interactions que son

homologue humain.

184

Nous pouvons constater la présence de certaines protéines de façon récurrante lors des

analyses, ces identifications pourraient être le signe d’une interaction de ces dernières avec la

majorité des protéines appâts fixées sur les colonnes. Ainsi nous pouvons constater la

présence de trois protéines Synm, Abf2, et Mgm101. La première correspond à une aminoacyl

ARNt synthétase de classe II. La présence de cette protéine sur les différentes colonnes

pourrait être expliquée par la présence de l’ADN polymérase #. En effet, des homologies

structurales entre les aminoacyl ARNt synthétase de la classe II et la sous unité B de l’ADN

polymérase # humaine ont été constatées (Fan et al, 1999). Etant donné que l’ADN

polymérase #B humaine ne possède pas d’homologue strict chez S.cerevisiae (Lucas et al,

2004), il est possible que l’Asparaginyl ARNt synthétase joue le rôle de la sous unité B dans

la mitochondrie de levure ; c'est-à-dire qu’elle permettrait la reconnaissance de l’origine de

réplication mitochondriale et le recrutement de l’ADN polymérase #.

En ce qui concerne l’identification des protéines Abf2 et Mgm101 sur les différentes

colonnes d’affinité, leur présence pourrait résulter de l’existence d’un complexe préformé de

ces protéines avec l’ADN polymérase #, comme décrit dans la littérature, et qui serait

maintenu sur les colonnes d’affinités. Abf2 est une protéine qui se fixe à l’ADN

mitochondrial et participe à la structure des nucléoïdes dans la mitochondrie, sites actifs pour

la réplication et la transcription, Mgm101 servant de point d’ancrage à la membrane interne

mitochondriale. L’ADN mitochondrial n’est pas une molécule nue dans l’organelle et se

trouve empaqueté dans une structure où se forment des complexes protéines-ADN, associés

aux membranes que l’on appelle les nucléoïdes. Parmi les protéines majeures constitutives de

ces nucléoïdes figurent également Rim1.

Ces deux approches de l’étude du complexe par reconstitution des interactions et par

purification du complexe natif ont permis de constater que de nombreuses protéines étaient

retrouvées dans les deux approches. Ainsi nous pouvons constater que mis à part les protéines

dont la présence dans le complexe de réplication a été déterminé par de précédentes études,

les protéines Synm, Nuc1, l’ADN topoisomérase de type I et l’ADN polymérase ! et sa sous

unité accessoire sont succeptibles de faire partie du réplisome.

Dans la réplication mitochondriale humaine, lors de l’initiation de la réplication, une

enzyme possédant une activité RNAse H catalyserait une coupure spécifique d’un ARN

transcrit par l’ARN polymérase mitochondriale produisant une amorce pour l’ADN

polymérase gamma. Chez l’humain, Endo G et la RNAse MRP interviennent dans cette étape,

Endo G étant principalement trouvée dans la mitochondrie. En ce qui concerne la levure,

185

Pol γ

Figure 105 : Schéma du réplisome imaginé d'après les résultats de colonnes d'affinité et l'expérience

de purification du complexe natif.

Ligase 1

Pol αB

Pol α

Nuc1

Rim1

Abf2

Top I

Mgm

101

Pol γSynm

membrane interne

mitochondriale

matrice mitochondriale

Espace intermembranaire

aucune protéine n’a été identifiée comme pouvant réaliser cette coupure, toutefois la protéine

Nuc1p serait l’homologue chez la levure d’Endo G. De plus, cette enzyme représenterait la

majorité de l’activité nucléase de la mitochondrie de levure (Dake et al, 1988). Puisque le

système de réplication chez la levure n’est pas bien établi (voir Introduction generale III.2.2),

nous avons recherché les protéines interagissant avec Nuc1 par le biais d’une colonne

d’affinité Nuc1-TAPTAG. L’ADN polymérase gamma semble être capable d’interagir sur

cette colonne. Cette interaction pourrait rendre compte d’un rôle de maturation du transcrit

lors du mécanisme de réplication unidirectionnel.

Si l’on réunit les résultats obtenus avec ces deux approches totalement différentes,

nous pouvons dire tout d’abord que l’ADN polymérase # et l’ADN topoisomérase I font partie

d’un complexe de masse supérieure à 669 kDa. L’ADN polymérase # semble être centrale, en

effet, elle est capable d’interagir avec une multitude de protéines. Néanmoins, l’absence de

cette protéine ne semble pas dissocier le complexe. Une liaison qui parait jouer un rôle

important dans le complexe serait l’interaction de l’ADN polymérase gamma avec l’ADN

topoisomérase de type I. L’ADN topoisomérase de type I devrait être un composant du

complexe car en effet elle est identifiée dans la phase 2, et elle est capable d’interagir avec les

sept protéines appât utilisées dans les colonnes d’affinité, d’une façon indépendante à la

présence d’ADN polymérase #. Dans la phase 2, une activité ADN ligase est également

détectée. L’interaction de l’ADN polymérase gamma avec l’ADN ligase 1, mise en évidence

par la technique de colonne d’affinité suggère que cette interaction observée chez l’homme,

avec son homologue l’ADN ligase III, subsiste chez la levure. L’ADN ligase 1 a été décelée

dans un complexe de 21S (Li et al, 1994) et pourrait donc correspondre à l’activité ADN

ligase trouvée dans la phase 2. Dans cette phase d’intérêt, Rim1 homologue de la protéine

SSBP humaine, est une autre protéine importante qui a été co-immunoprécipitée avec l’ADN

polymérase gamma, mettant en exergue une interaction de l’ADN polymérase gamma,

également décelée par le biais de la colonne d’affinité Rim1-TAPTAG. Enfin, par

spectrométrie de masse, les protéines Synm et Abf2 sont décelées dans les deux approches,

Mgm101 quant à elle n’est pas retrouvée dans la phase 2. Ceci peut s’expliquer par le

traitement au détergent réalisé lors de la préparation qui pourrait décrocher du complexe une

protéine d’ancrage de la membrane interne mitochondriale telle que Mgm101. Ainsi, une

représentation du complexe de réplication a été imaginée à l’aide des deux axes d’études

(figure 105).

186

Dans le but de vérifier les candidats au complexe, il serait intéressant de purifier de

façon plus poussée le complexe de réplication pour pouvoir l’analyser par BN-PAGE dans. Il

serait aussi intéressant de vérifier le schéma d’interaction, pour cela il sera nécessaire de

purifier chacun des candidats supposés du complexe afin de reconstituer un complexe

fonctionnel. Il serait alors possible in-vitro de déterminer le réplisome minimum nécessaire à

la réplication de matrice de type mini-cercle.

Le dépôt d’extrait mitochondriaux provenant de souches ST40 a permis de constater la

fixation d’activité ADN polymérase sur les différentes colonnes testées. L’utilisation

d’inhibiteurs a mis en évidence la présence d’ADN polymérase gamma parmi les protéines

fixées sur la colonne. Toutefois, rien n’indique que l’ADN polymérase alpha ne puisse être

présente parmi les protéines fixées sur les colonnes. En effet, l’ADN polymérase alpha

pourrait être minoritaire dans l’extrait, ce qui peut être rend compte des difficultés

d’identification de cette seconde activité ADN polymérase au niveau de la mitochondrie. Une

autre hypothèse serait que cette ADN polymérase est très sensible aux conditions de

manipulation, étant particulièrement instable. Cette capacité à se dénaturer facilement nous a

poussés à améliorer les conditions de chromatographie décrites dans le chapitre précédent.

Enfin, nous pourions envisager que l’ADN polymérase alpha fixée sur la colonne est inactive,

suite à un changement conformationnel, une modification post-traductionnelle ou encore une

interaction avec une molécule inhibant son activité (ADN, protéine inhibiteur). Ces

hypothèses pourraient expliquer l’absence d’inhibition ou la faible inhibition par

l’aphidicoline constatée sur toutes les colonnes effectuées. Nous avons vu précédemment que

lors d’analyses par spectrométrie de masse, des protéines sont retrouvées associées à l’ADN

polymérase alpha après cinq colonnes chromatographiques. Néanmoins, l’ADN polymérase !

purifiée ne se fixe visiblement pas sur les colonnes #-TAPTAG, !-TAPTAG, !B-TAPTAG,

ligase 1-TAPTAG, nucléase 1-TAPTAG, ADN topoisomérase I-TAPTAG et

Rim1-TAPTAG. Les mêmes hypothèses que précédemment peuvent prévaloir de cette

absence d’ADN polymérase alpha détectée sur l’ensemble de ces colonnes.

187

CONCLUSION GENERALE

188

CONCLUSION GENERALE

Dans un premier temps, le travail réalisé durant ma thèse a permi d’identifier la

seconde ADN polymérase présente dans la mitochondrie de levure Saccharomyces cerevisiae,

cette protéine correspond à l’ADN polymérase alpha. Ainsi, cette ADN polymérase impliquée

dans l’initiation de la réplication et la synthèse de fragment d’Okazaki dans le noyau possède

une double localisation.

Dans un second temps, des études d’un réplisome possible ont été réalisées selon deux

approches différentes. La première correspondant à la purification du complexe natif a permis

d’identifier une dizaine de protéines pouvant faire parties du complexe de réplication

mitochondrial. La seconde approche, basée sur une stratégie de colonnes d’affinités a permis

de confirmer les résultats obtenus avec le complexe natif et de proposer d’autres protéines

comme candidats potentiels aux réplisome.

D’après la littérature, l’ADN polymérase # et les protéines Mgm101 et Abf2 sont les

composants d’un complexe réplicatif ancré dans la membrane interne mitochondriale. La

protéine Rim1 quant à elle favoriserait la synthèse de molécule d’ADN de grande taille par

l’ADN polymérase #. De même, il a été montré que l’ADN ligase III humaine était capable

d’interagir avec l’ADN polymérase #.

Mon travail confirme que ces interactions sont présentes au sein du réplisome

mitochondrial de la levure S.cerevisiae et de plus me permet de proposer d’autres protéines

pouvant faire parti du complexe de réplication. En effet, mes expériences de chromatographie

d’affinité mettent en exerguent des interactions entre la protéine Nuc1, les ADN polymérases

!, !B et Synm avec les protéines citées précédemment. Ces interactions pourraient être

fonctionnelles et se dérouler lors du processus de réplication et/ou réparation de l’ADN

mitochondrial au sein d’un complexe probablement ancré dans la membrane interne

mitochondriale via la protéine Mgm101. Tout ce travail a permis d’élaborer un schéma

d’interaction et d’imaginer une représentation du complexe réplicatif mitochondrial de la

levure S.cerevisiae.

Ces résultats ont permis d’ouvrir des perspectives sur la réplication dans la

mitochondrie. Il serait interessant dans un premier temps de déterminer le rôle de l’ADN

polymérase ! dans la mitochondrie (réplication, réparation), d’expliquer le mécanisme

permettant son adressage mais aussi de rechercher si chez les eucaryotes supérieurs, une

seconde activité ADN polymérase est également trouvée dans la mitochondrie. L’étude du

189

réplisome natif pourrait être poursuivie via l’identification des protéines participant ou via la

recherche de nouveaux partenaires après pontage ce qui pourrait permettre d’identifier

d’autres partenaires perdus lors des manipulations. De même pour permettre d’améliorer, de

développer, d’optimiser des techniques de détection déjà utilisées (immunoprécipitation,

western-blot, far-western), actuellement au laboratoire nous préparons des anticorps dirigés

contre des fragments des ADN polymérase ! et #. Deux fragments des extrémités Nter et Cter

de l’ADN polymérase gamma (a.a. 1 à 163 et de l’a.a. 1000 à 1254) et deux fragments de

l’extrémité Nter et un domaine interne (a.a. 1 à 155 et de l’a.a. 284 à 470) de l’ADN

polymérase alpha ont été produits et injectés à des lapins. Jusqu’à présent cet outil

immunologique n’était pas assez spécifique ou n’existait pas, ce qui nous limitait

considérablement par un certain nombre de techniques et nous pensons que la possession

d’outils performant devrait nous permettre de progresser dans l’étude du réplisome et du rôle

des deux ADN polymérases dans la mitochondrie de la levure Saccharomyces cerevisiae.

190

ANNEXES

1

L

1

12

16

2

3

14 7

18 11

4

15

8

10

17

6

13

1

M

M

S

1

12

5 16

2

3

14 7

18 11

4

15

8

10

17

6

13

DNA POL ALPHA S.pombe :

Mitoprot: score 0.9109

Site de clivage: 29 MRKRNAGIKPSQRFAELRALRQAGKTRA

iPSORT: score 21.7%

DNA POL ALPHA S.cerevisiae :

Mitoprot score: 0.0175

iPSORT score: 0.043

DNA POL Gamma S.cerevisiae :

Mitoprot score: 0.9946

Site de clivage: 42 MTKLMVRSECMLRMVRRRPLRVQFCARWFSTKKNTAEAPRI

iPSORT score: 0.907

Représentation wheel plot des séquences potentielles d’adressage mitochondrial des polymérases alpha

de levure S.cerevisiae et S.pombe, comparées à l’ADN polymérase gamma de la levure S.cerevisiae.

9

14

7

R R

R

M

L

V

S

M

L

ME

T

R

V

R

C

K

M

7

59

RL

K

Q

L

M

R

SAE

S

K

E

A

K

S

LK

1

L

1

12

16

2

3

14 7

18 11

4

15

8

10

17

6

13

7

59

RS

R

A

I

M

Q

NEK

R

R

A

L

P

K

FG

ANNEXE 1 :

Tableau de masse n°1

Identification

# M

S/M

S

sca

n

# d

isti

nct

pep %

cov

era

ge

MW

1sw|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long

chain base-responsive protein LSP1 9 7 25.22% 38070.9

2

sw|P53252|PIL1_YEAST Sphingolipid long

chain base-responsive protein PIL1

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PIL1 PE=1

SV=1

13 8 32.74 % 38348.83

3

sw|P19882|HSP60_YEAST Heat shock protein

60, mitochondrial OS=Saccharomyces

cerevisiae GN=HSP60 PE=1 SV=1

17 14 31.47 % 60751.18

4

sw|P32445|RIM1_YEAST Single-stranded

DNA-binding protein RIM1, mitochondrial

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RIM1

PE=1 SV=1

2 2 22.22 % 56723.2

5

sw|P21827|RCC1_YEAST Regulator of

chromosome condensation (Protein PRP20)

(Pheromone response pathway component

SRM1).

6 5 12.66 % 53013.5

6sw|P21576|VPS1_YEAST Vacuolar protein

sorting-associated protein 1. 6 5 9.38 % 78736.0

7

sw|P46367|ALDH4_YEAST Potassium-

activated aldehyde dehydrogenase,

mitochondrial precursor (EC 1.2.1.3) (K(+)-

activated acetaldehyde dehydrogenase)(K(+)-

ACDH).

6 6 15.80 % 101919.5

8

sw|P38144|ISW1_YEAST ISWI chromatin-

remodeling complex ATPase ISW1 (EC 3.6.1.-

).

2 2 3.28 % 131100.9

9

sw|P32832|NPL6_YEAST Chromatin structure-

remodelling complex protein RSC7 (Remodel

the structure of chromatine complex subunit 7)

(SWI3 homolog).

2 2 5.28 % 49650.3

10sw|P53125|ITC1_YEAST Imitation switch two

complex protein 1 4 4 4.59 % 145641.6

11sw|P11633|NHP6B_YEAST Non-histone

chromosomal protein 6B 3 2 25.25 % 11575.0

12

sw|P43609|RSC8_YEAST Chromatin structure-

remodeling complex protein RSC8 (Remodel

the structure of chromatin complex subunit 8)

(SWI3 homolog).

3 3 4.85 % 63167.6

13

sw|P11938|RAP1_YEAST DNA-binding

protein RAP1 (SBF-E) (Repressor / activator

site-binding protein) (TUF).

2 2 3.63 % 92412.7

14

sw|P38339|RGD1_YEAST RHO GTPase-

activating protein RGD1 (RhoGAP) (Related

GAP domain protein 1

6 3 7.96 % 74618.7

15 sw|P02309|H4_YEAST Histone H4 13 4 42.72 % 11368.22

16 sw|O74261|HSP60_CANAL Heat shock protein 6 3 4.42 % 60125.3



17

sw|Q03973|HMO1_YEAST High mobility

group protein 1 (High spontaneous mutagenesis

protein 2).

3 2 11.79 27543.8

18

sw|P14164|BAF1_YEAST Transcription factor

BAF1 (ARS-binding factor) (Protein

ABF1)(Bidirectionally acting factor) (SFB-B)

(DNA replicationenhancer-binding protein

OBF1).

4 2 3.69 % 81748.9

19sw|P32835|GSP1_YEAST GTP-binding nuclear

potein GSP1/CNR13 3 15.07 % 24810.2

20 sw|P02293|H2B1_YEAST Histone H2B1 4 2 16.03 % 14244.7

21

sw|Q01080|RPA49_YEAST DNA-directed

RNA polymerase I subunit RPA49 (DNA-

directed RNA polymerase I 49 kDa

polypeptide) (A49)

2 2 6.27 % 46650.4

22

sw|Q06488|RSC2_YEAST Chromatin

structure-remodeling complex protein RSC2

(Remodel the structure of chromatin complex

subunit2).

2 2 2.59 % 102299.0

23sw|q06680|CND3_YEAST Condensin complex

subunit 3 (CAPG homolog). 2 2 2.80 % 117850.3

24

sw|Q02486|ABF2_YEAST ARS-binding factor

2, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae

GN=ABF2 PE=1 SV=1

3 3 16.94 % 21561.55

25

sp|P32445|RIM1_YEAST Single-stranded



PE=1 SV=1

3 3 16,94 % 15386.06

26sw|P25694|CDC48_YEAST Cell division

control protein 48. 2 2 4.91 % 91995.4

27

sw|P32597|STH1_YEAST Nuclear protein

STH1/NPS1 (EC 3.6.1.-) (ATP-dependent

helicase STH1) (Chromatin structure-

remodeling complex protein STH1)(SNF2

homolog)

2 2 1.62 % 156741.4

28

sw|P17106|CBF1_YEAST Centromere-binding

protein 1 (CBP-1) (Centromere-binding factor

1) (Centromere promoter factor 1)

3 2 5.98 % 39387.4

29sw|P39521|FHL1_YEAST Pre-rRNA-

processing protein FHL1 2 2 2.67% 103501.6


Identification

# M

S/M

S

sca

n

# d

isti

nct

pep %

cov

era

ge

MW

1

sp|P25294|SIS1_YEAST Protein SIS1

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SIS1 PE=1

SV=1

3 3 10.51 37589.8

2

sp|P19882|HSP60_YEAST Heat shock protein



28 17 30.24 60751.2

3

sp|P32445|RIM1_YEAST Single-stranded



PE=1 SV=1

3 2 22.22 15386.1

4

sp|Q01560|NOP3_YEAST Nucleolar protein 3

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NOP3

PE=1 SV=1

3 2 6.52 45407.1

5

sp|P53252|PIL1_YEAST Sphingolipid long

chain base-responsive protein PIL1

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PIL1 PE=1

SV=1

11 7 29.79 38348.8

6

sp|P32468|CDC12_YEAST Cell division

control protein 12 OS=Saccharomyces

cerevisiae GN=CDC12 PE=1 SV=1

2 2 6.63 46667.6

7

sp|P32419|MDHP_YEAST Malate

dehydrogenase, peroxisomal

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MDH3

PE=1 SV=3

3 3 9.91 37185.9

8

sp|P25694|CDC48_YEAST Cell division

control protein 48 OS=Saccharomyces

cerevisiae GN=CDC48 PE=1 SV=3

9 8 13.29 91995.4

9

sp|P00044|CYC1_YEAST Cytochrome c iso-1

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=CYC1

PE=1 SV=2

3 2 24.77 12181.9

10

sp|P53131|PRP43_YEAST Pre-mRNA-splicing

factor ATP-dependent RNA helicase PRP43

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PRP43

PE=1 SV=1

4 4 6.52 87561.2

11

sp|P08518|RPB2_YEAST DNA-directed RNA

polymerase II subunit RPB2

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RPB2

PE=1 SV=2

3 3 3.68 138750.5

12

sp|P25374|NFS1_YEAST Cysteine desulfurase,

mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae

GN=NFS1 PE=1 SV=2

3 3 8.45 54466.8

13

sp|P10080|SSBP1_YEAST Single-stranded

nucleic acid-binding protein

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SBP1 PE=1

SV=2

2 2 8.84 32989.3

14

sp|P0C2I0|RL20_YEAST 60S ribosomal

protein L20 OS=Saccharomyces cerevisiae

GN=RPL20A PE=1 SV=2

2 2 13.95 20436.6

15

sp|Q12464|RUVB2_YEAST RuvB-like protein

2 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RVB2

PE=1 SV=1

3 3 7.64 51611.3

16

sp|P05739|RL6B_YEAST 60S ribosomal

protein L6-B OS=Saccharomyces cerevisiae

GN=RPL6B PE=1 SV=4

2 2 13.64 19986.3

17

sp|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long

chain base-responsive protein LSP1

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=LSP1 PE=1

SV=1

9 6 19.94 38070.9

18

sp|P02309|H4_YEAST Histone H4

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HHF1

PE=1 SV=2

3 3 31.07 11368.2

19

sp|Q03940|RUVB1_YEAST RuvB-like protein

1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RVB1

PE=1 SV=1

2 2 4.32 50452.8

sp|P05737|RL7A_YEAST 60S ribosomal

protein L7-A OS=Saccharomyces cerevisiae

GN=RPL7A PE=1 SV=3

11.07 27638.0

20sp|Q12213|RL7B_YEAST 60S ribosomal

protein L7-B OS=Saccharomyces cerevisiae

GN=RPL7B PE=1 SV=3

2 2=

11.07 27696.1

21

sp|P12695|ODP2_YEAST Dihydrolipoyllysine-

residue acetyltransferase component of pyruvate

dehydrogenase complex, mitochondrial

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PDA2

PE=1 SV=1

2 2 5.39 51817.8

22

sp|P37292|GLYM_YEAST Serine

hydroxymethyltransferase, mitochondrial

OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SHM1

PE=1 SV=2

2 2 4.08 53686.0

Keratines

Remarque :


Identification

# M

S/M

S

sca

n

# d

isti

nct

pep

% c

ov

era

ge

MW

1

sw|P43609|RSC8_YEAST Chromatin structure-

remodeling complex protein RSC8 (Remodel the

structure of chromatin complex subunit 8) (SWI3

homolog).

2 2 5.03 63167.6

2 sw|P19657|PMA2_YEAST Plasma membrane A 10 8 8.87 102172.3

3

sw|P07257|QCR2_YEAST Cytochrome b-c1 complex

subunit 2, mitochondrial precursor (Ubiquinol-

cytochrome-c reductase complex core protein 2) (Core

protein II) (Complex III subunit 2).

2 2 6.79 40477.8

4sw|P39004|HXT7_YEAST High-affinity hexose

transporter HXT6. 6 5 11.40 62734.8


6sw|P21576|VPS1_YEAST Vacuolar protein sorting-

associated protein 1. 13 13 21.31 78736.0

7sw|P53252|PIL1_YEAST Sphingolipid long chain base-

responsive protein PIL1. 13 7 25.07 38348.8

8

sw|P46677|TAF1_YEAST Transcription initiation factor

TFIID subunit 1 (EC 2.3.1.48) (TBP- associated factor 1)

(TBP-associated factor 145 kDa) (TAFII-145) (TAFII-

130).

3 2 2.44 120695.0

9sw|P11938|RAP1_YEAST DNA-binding protein RAP1

(SBF-E) (Repressor/activator site-binding protein) (TUF). 4 3 4.11 92412.7

10sw|P32657|CHD1_YEAST Chromo domain-containing

protein 1 (EC 3.6.1.-) (ATP-dependent helicase CHD1). 2 1 0.89 168239.6

11

sw|P07149|FAS1_YEAST Fatty acid synthase subunit

beta (EC 2.3.1.86) [Includes: 3- hydroxypalmitoyl-[acyl-

carrier-protein] dehydratase (EC 4.2.1.61); Enoyl-[acyl-

carrier-protein] reductase [NADH] (EC 1.3.1.9); [Acyl-

carrier-protein] acetyltransferase (EC 2.3.1.38); [Acyl-

carrier- protein] malonyltransferase (EC 2.3.1.39); S-acyl

fatty acid synthase thioesterase (EC 3.1.2.14)].

3 3 1.85 228688.5

12 sw|P02309|H4_YEAST Histone H4. 7 4 42.72 11368.2

13

sw|P19097|FAS2_YEAST Fatty acid synthase subunit

alpha (EC 2.3.1.86) [Includes: Acyl carrier; 3-oxoacyl-

[acyl-carrier-protein] reductase (EC 1.1.1.100) (Beta-

ketoacyl reductase); 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein]

synthase (EC 2.3.1.41) (Beta-ketoacyl synthase)].

14 13 8.48 206944.7

14sw|P03871|REP1_YEAST Partitioning protein REP1

(R1) (Trans-acting factor B) (Protein Baker). 4 3 8.31 43230.8

15 sw|P32896|PDC2_YEAST Protein PDC2. 3 2 2.49 103905.4

16

sw|P14164|BAF1_YEAST Transcription factor BAF1

(ARS-binding factor 1) (Protein ABF1) (Bidirectionally

acting factor) (SFB-B) (DNA replication enhancer-

binding protein OBF1).

2 2 2.74 81748.9

sw|P32835|GSP1_YEAST GTP-binding nuclear protein

GSP1/CNR1.8.68 24810.2

17sw|P32836|GSP2_YEAST GTP-binding nuclear protein

GSP2/CNR2.

2 2=

8.64 24990.3

18

sw|P04786|TOP1_YEAST DNA topoisomerase 1 (EC

5.99.1.2) (DNA topoisomerase I) (Maintenance of killer

protein 1).

3 3 4.42 89994.8

19

sw|P36008|EF1G2_YEAST Elongation factor 1-gamma 2

(EF-1-gamma 2) (Translation elongation factor 1B

gamma 2) (Eukaryotic elongation factor 1Bgamma 2)

(eEF1Bgamma 2).

3 3 8.50 46519.8

20

sw|P32597|STH1_YEAST Nuclear protein STH1/NPS1

(EC 3.6.1.-) (ATP-dependent helicase STH1) (Chromatin

structure-remodeling complex protein STH1) (SNF2

homolog).

6 6 4.93 156741.4

21sw|P07251|ATPA_YEAST ATP synthase subunit alpha,

mitochondrial precursor. 2 2 4.40 58607.6

22sw|Q06680|CND3_YEAST Condensin complex subunit 3

(CAPG homolog). 2 2 2.51 117850.3

23

sw|P34111|TFC3_YEAST Transcription factor tau 138

kDa subunit (TFIIIC 138 kDa subunit) (Transcription

factor C subunit 3).

2 2 2.24 132107.0

24sw|Q02326|RL6A_YEAST 60S ribosomal protein L6-A

(L17) (YL16) (RP18). 2 2 10.23 19961.3

25

sw|P43098|FAS2_CANAL Fatty acid synthase subunit

alpha (EC 2.3.1.86) [Includes: Acyl carrier; 3-oxoacyl-

[acyl-carrier-protein] reductase (EC 1.1.1.100) (Beta-

ketoacyl reductase); 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein]

synthase (EC 2.3.1.41) (Beta-ketoacyl synthase)].

2 2 1.43 207587.0

26 sw|P39744|NOC2_YEAST Nucleolar complex protein 2. 2 2 3.52 81600.9

27sw|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long chain base-

responsive protein LSP1. 4 4 13.49 38070.9

28sw|P38811|TRA1_YEAST Transcription-associated

protein 1 (p400 kDa component of SAGA). 2 2 0.59 433177.3

29 sw|P60010|ACT_YEAST Actin. 2 2 6.93 41689.4

30

sw|Q06891|RAF_YEAST Trans-acting factor D (REP-

antagonizing factor) (Recombinase- activating factor)

(RAF).

2 2 10.50 21289.6

31

sw|P33302|PDR5_YEAST Pleiotropic ABC efflux

transporter of multiple drugs (Pleiotropic drug resistance

protein 5) (Suppressor of toxicity of sporidesmin).

2 2 1.72 170436.5

32

sw|Q07979|RSC58_YEAST Chromatin structure-

remodeling complex protein RSC58 (Remodel the

structure of chromatin complex subunit 58).

3 3 5.78 57794.0

33 sw|Q04373|PUF6_YEAST Protein PUF6. 2 2 3.05 75105.0

34sw|P13181|GAL2_YEAST Galactose transporter

(Galactose permease). 4 4 4.53 63625.6

Remarque :


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

%covera

ge

MW

sw|Q6FWM7|H2A1_CANGA Histone H2A.1. 29.77 13872.9

sw|P04911|H2A1_YEAST Histone H2A.1. 29.55 13989.1

sw|Q6FM31|H2A2_CANGA Histone H2A.2. 29.77 13900.9


1

sw|Q6CK59|H2A_KLULA Histone H2A.

3 2=

30.00 13818.9

2sw|Q04636|POB3_YEAST FACT complex subunit POB3 (Facilitates chromatin transcription complex subunit POB3).

6 4 11.96 62993.3

3sw|P15801|DPOG_YEAST DNA polymerase gamma (EC 2.7.7.7) (Mitochondrial DNA polymerase catalytic subunit).

9 9 9.09 143501.2

4 sw|Q02959|HOS3_YEAST Histone deacetylase HOS3. 3 3 6.17 79199.6

5sw|P38144|ISW1_YEAST ISWI chromatin remodeling complex ATPase ISW1 (EC 3.6.1.-).

5 5 6.47 131100.9

6sw|P40513|MAM33_YEAST Mitochondrial acidic protein MAM33, mitochondrial precursor.

7 5 21.80 30132.2

7sw|Q02486|ABF2_YEAST ARS-binding factor 2, mitochondrial precursor.

66 13 48.63 21561.6

8

sw|P12695|ODP2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial precursor (EC 2.3.1.12) (Dihydrolipoamide acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex)

2 2 6.85 51817.8

9

sw|P14164|BAF1_YEAST Transcription factor BAF1 (ARS-binding factor 1) (Protein ABF1) (Bidirectionally acting factor) (SFB-B) (DNA replication enhancer- binding protein OBF1).

3 3 5.34 81748.9

10sw|Q03973|HMO1_YEAST High mobility group protein 1 (High spontaneous mutagenesis protein 2).

2 2 12.20 27543.8

11sw|P35191|MDJ1_YEAST DnaJ homolog 1, mitochondrial precursor.

4 3 7.24 55560.5

12

sw|P19262|ODO2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2- oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial precursor (EC 2.3.1.61) (E2) (Dihydrolipoamide succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex).

6 4 13.39 50430.4

13 sw|P40578|MGA2_YEAST Protein MGA2. 2 2 2.25 127053.4

14sw|P53163|YGG8_YEAST 60S ribosomal protein L7/L12 homolog, mitochondrial precursor.

11 3 23.20 20649.8

15sw|P40485|SLM1_YEAST Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-binding protein SLM1 (TORC2 effector protein SLM1) (Synthetic lethal with MSS4 protein 1).

2 2 6.41 77994.6

16sw|P53252|PIL1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein PIL1.

11 6 29.50 38348.8

17sw|P25345|SYNM_YEAST Asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial precursor (EC 6.1.1.22) (Asparagine--tRNA ligase) (AsnRS).

2 2 5.69 56784.5

18sw|P36521|RM11_YEAST 60S ribosomal protein L11, mitochondrial precursor (YmL11).

7 4 25.30 28514.8

19sw|P11633|NHP6B_YEAST Nonhistone chromosomal protein 6B.

10 4 39.39 11575.0

20sw|P25038|IF2M_YEAST Translation initiation factor IF-2, mitochondrial precursor (IF-2Mt) (IF2(mt)) (IF-2(Mt)).

2 2 3.85 75656.3

21sw|P25374|NFS1_YEAST Cysteine desulfurase, mitochondrial precursor (EC 2.8.1.7) (tRNA- splicing protein SPL1).

2 2 5.03 54466.8

22

sw|P32558|SPT16_YEAST FACT complex subunit SPT16 (Facilitates chromatin transcription complex subunit SPT16) (Suppressor of Ty protein 16) (Cell division control protein 68).

6 4 5.12 118629.3

23sw|P11632|NHP6A_YEAST Nonhistone chromosomal protein 6A.

18 5 58.06 10802.3

24sw|P07251|ATPA_YEAST ATP synthase subunit alpha, mitochondrial precursor (EC 3.6.3.14).

2 2 4.40 58607.6

25sw|P04786|TOP1_YEAST DNA topoisomerase 1 (EC 5.99.1.2) (DNA topoisomerase I) (Maintenance of killer protein 1).

6 5 8.84 89994.8

26sw|P33417|IXR1_YEAST Intrastrand cross-link recognition protein (Structure-specific recognition protein) (SSRP).

6 4 6.87 67855.6



29 sw|P43596|IOC3_YEAST ISWI one complex protein 3. 2 2 3.81 90896.0

30sw|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein LSP1.

7 5 18.77 38070.9

31 sw|P50085|PHB2_YEAST Prohibitin-2. 3 3 13.87 34406.3

32 sw|P31376|SWC3_YEAST SWR1-complex protein 3. 3 3 5.92 72514.0


34sw|Q03388|VPS72_YEAST Vacuolar protein sorting-associated protein 72 (SWR complex protein 2).

3 2 3.14 90579.3

35sw|Q756A7|SPT16_ASHGO FACT complex subunit SPT16 (Facilitates chromatin transcription complex subunit SPT16).

2 2 2.23 117827.1

sw|P02293|H2B1_YEAST Histone H2B.1 (Su 19.08 14244.7

sw|Q74ZL5|H2B1_ASHGO Histone H2B.1. 18.94 14284.2

sw|Q6FWM8|H2B1_CANGA Histone H2B.1. 19.38 14003.0

sw|Q6CK60|H2B1_KLULA Histone H2B.1. 18.94 14296.2

sw|Q8J1F8|H2B2_ASHGO Histone H2B.2. 19.69 13823.7

sw|Q6FM30|H2B2_CANGA Histone H2B.2. 19.08 14218.2

sw|Q6CMV8|H2B2_KLULA Histone H2B.2. 18.94 14403.4

36

sw|P02294|H2B2_YEAST Histone H2B.2.

4 2=

19.08 14237.2

37sw|Q6FWT4|SPT16_CANGA FACT complex subunit SPT16 (Facilitates chromatin transcription complex subunit SPT16).

2 2 1.07 117894.7

38sw|P07269|PHO2_YEAST Regulatory protein PHO2 (General regulatory factor 10).

2 2 4.29 63390.4

Remarque :


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

% c

overa

ge

MW

1 sw|P00044|CYC1_YEAST Cytochrome c iso-1. 21 5 40.37 12181.9

2 sw|P25294|SIS1_YEAST Protein SIS1. 7 6 17.33 37589.8


5 2 11.79 27543.8

4sw|P35817|BDF1_YEAST Bromodomain-containing factor 1.

2 2 4.96 76977.4

5

sw|P38705|SYSM_YEAST Seryl-tRNA synthetase, mitochondrial (EC 6.1.1.11) (Seryl- tRNA(Ser/Sec) synthetase) (Serine--tRNA ligase) (SerRS) (Digs into agar protein 4).

2 2 6.95 50389.7

6sw|P32657|CHD1_YEAST Chromo domain-containing protein 1 (EC 3.6.1.-) (ATP-dependent helicase CHD1).

9 8 7.97 168239.6

7sw|P32787|MG101_YEAST Mitochondrial genome maintenance protein MGM101, mitochondrial precursor.

4 3 16.73 30090.3

8sw|P17106|CBF1_YEAST Centromere-binding protein 1 (CBP-1) (Centromere-binding factor 1) (Centromere promoter factor 1).

3 2 7.98 39387.4

9


9 4 13.39 50430.4


8 3 17.67 28514.8


13 8 25.20 56784.5

12sw|P21827|RCC1_YEAST Regulator of chromosome condensation (Protein PRP20) (Pheromone response pathway component SRM1).

13 4 10.79 53013.5

13sw|P80428|ARP4_YEAST Actin-related protein 4 (Actin-like protein 4) (Actin-like protein ARP4).

2 2 6.95 54831.6


4 3 8.88 62993.3

15sw|P38144|ISW1_YEAST ISWI chromatin-remodeling complex ATPase ISW1 (EC 3.6.1.-).

5 4 4.96 131100.9


13 8 27.40 55560.5

17

sw|P12398|HSP77_YEAST Heat shock protein SSC1, mitochondrial precursor (mtHSP70) (Endonuclease SceI 75 kDa subunit) (Endo.SceI 75 kDa subunit).

3 3 5.66 70627.3

18

sw|P32340|NDI1_YEAST Rotenone-insensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase, mitochondrial precursor (EC 1.6.5.3) (Internal NADH dehydrogenase).

2 2 5.85 57249.4


2 2 4.29 75656.3

20sw|P15179|SYDM_YEAST Aspartyl-tRNA synthetase, mitochondrial (EC 6.1.1.12) (Aspartate--tRNA ligase) (AspRS).

6 6 12.16 75460.2

sw|P25374|NFS1_YEAST Cysteine desulfur 5.03 54433.8

21 sw|O60028|NFS1_ASHGO Cysteine desulfurase, mitochondrial precursor (EC 2.8.1.7) (tRNA- splicing protein SPL1).

4 2=5.10 54435.5

22sw|P15424|MS116_YEAST ATP-dependent RNA helicase MSS116, mitochondrial precursor (EC 3.6.1.-).

3 2 4.82 76268.1

23sw|P34111|TFC3_YEAST Transcription factor tau 138 kDa subunit (TFIIIC 138 kDa subunit) (Transcription factor C subunit 3).

2 2 2.50 132107.0

24 sw|Q12466|TCB1_YEAST Tricalbin-1. 2 2 3.12 133574.9

25sw|P43596|IOC3_YEAST ISWI one complex protein 3.

4 4 6.86 90896.0

26

sw|P46677|TAF1_YEAST Transcription initiation factor TFIID subunit 1 (EC 2.3.1.48) (TBP- associated factor 1) (TBP-associated factor 145 kDa) (TAFII-145) (TAFII-130).

4 4 4.22 120695.0


16 6 29.51 21561.6

28 sw|P60010|ACT_YEAST Actin. 3 3 13.33 41689.4

29sw|P21576|VPS1_YEAST Vacuolar protein sorting-associated protein 1.

3 2 3.84 78736.0


3 3 4.68 89994.8

31sw|P11938|RAP1_YEAST DNA-binding protein RAP1 (SBF-E) (Repressor/activator site-binding protein) (TUF).

4 4 6.65 92412.7

32 sw|P32558|SPT16_YEAST FACT complex sub 2 2 2.42 118557.8


34

sw|P14164|BAF1_YEAST Transcription factor BAF1 (ARS-binding factor 1) (Protein ABF1) (Bidirectionally acting factor) (SFB-B) (DNA replication enhancer- binding protein OBF1).

2 2 4.79 81748.9

35sw|Q04599|RM01_YEAST 54S ribosomal protein L1, mitochondrial precursor.

6 4 15.79 30995.7


37

sw|P09440|C1TM_YEAST C-1-tetrahydrofolate synthase, mitochondrial precursor (C1-THF synthase) [Includes: Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (EC 1.5.1.5); Methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase (EC 3.5.4.9);

2 2 2.87 106216.7

38

sw|P12695|ODP2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial precursor (EC 2.3.1.12) (Dihydrolipoamide acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex)

3 3 9.75 51817.8

39

sw|P40485|SLM1_YEAST Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-binding protein SLM1 (TORC2 effector protein SLM1) (Synthetic lethal with MSS4 protein 1).

4 3 6.71 77994.6

40sw|P53115|INO80_YEAST Putative DNA helicase INO80 (EC 3.6.1.-) (Inositol-requiring protein 80).

2 2 1.88 171453.4

41sw|Q08023|FMP25_YEAST Protein FMP25, mitochondrial precursor (Found in mitochondrial proteome protein 25).

2 2 4.63 66689.5

42sw|P23641|MPCP_YEAST Mitochondrial phosphate carrier protein (Phosphate transport protein) (PTP) (mPic 1) (Mitochondrial import receptor) (p32).

2 2 9.00 32811.8



45sw|P36056|RT22_YEAST 37S ribosomal protein S22, mitochondrial precursor (EC 2.1.1.-).

3 3 7.17 72189.8

46sw|P07251|ATPA_YEAST ATP synthase subunit alpha, mitochondrial precursor.

2 2 4.40 58607.6

47 sw|P40578|MGA2_YEAST Protein MGA2. 2 2 3.05 127053.4

48sw|P06786|TOP2_YEAST DNA topoisomerase 2 (EC 5.99.1.3) (DNA topoisomerase II).

2 2 1.82 164213.2

Remarque :


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

% c

overa

ge

MW

1sw|P47068|BBC1_YEAST Myosin tail region-interacting protein MTI1 (Protein BBC1).

16 10 11.50 128295.5

2 sw|P36006|MYO3_YEAST Myosin-3. 3 3 4.40 142779.7

3


16 12 19.71 118629.3

4

sw|P41543|OST1_YEAST Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferase subunit OST1 precursor (EC 2.4.1.119) (Oligosaccharyl transferase subunit OST1) (Oligosaccharyl transferase subunit alpha) (Oligosaccharyl transferase 64 kDa subunit).

3 3 12.18 54071.6


6sw|P13181|GAL2_YEAST Galactose transporter (Galactose permease).

13 6 16.03 63625.6




3 3 12.07 54466.8

10 sw|Q12386|ARP8_YEAST Actin-like protein ARP8. 7 6 13.05 100208.2

11

sw|P23644|TOM40_YEAST Mitochondrial import receptor subunit TOM40 (Mitochondrial import site protein ISP42) (Translocase of outer membrane 40 kDa subunit).

4 4 12.14 42038.1


20 13 33.27 55560.5


14sw|Q12404|MPD1_YEAST Protein disulfide-isomerase MPD1 precursor (EC 5.3.4.1).

4 4 14.78 36407.8

15

sw|P39952|OXA1_YEAST Inner membrane protein OXA1, mitochondrial precursor (Oxidase assembly protein 1) (Cytochrome oxidase biogenesis protein OXA1).

2 2 8.96 44815.5

16sw|P49376|ATPB_KLULA ATP synthase subunit beta, mitochondrial precursor (EC 3.6.3.14).

3 2 6.73 54068.3

17sw|Q04697|GSF2_YEAST Glucose-signaling factor 2 (Extracellular mutant protein 6).

2 2 9.43 45869.2

18


5 5 16.18 77994.6

sw|P39003|HXT6_YEAST High-affinity hexose transporter HXT6.

10.18 62704.819

sw|P39004|HXT7_YEAST High-affinity hexose transporter HXT6.

4 3=

6.14 62734.8

20sw|P47140|YJ70_YEAST Uncharacterized protein YJR100C.

3 2 10.40 37479.3

21sw|P80967|TOM5_YEAST Mitochondrial import receptor subunit TOM5 (Translocase of outer membrane 5 kDa subunit).

2 2 30.00 5984.9


23sw|P53723|YN8B_YEAST Uncharacterized protein YNR021W.

3 2 10.64 47092.8

24

sw|P07143|CY1_YEAST Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial precursor (Cytochrome c-1) (Cytochrome b-c1 complex subunit 4) (Ubiquinol-cytochrome-c reductase complex cytochrome c1 subunit) (Complex III subunit 4) (Complex III subunit Iv).

4 4 22.65 34054.3


8 8 22.10 62993.3

26sw|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein LSP1.

6 6 29.03 38070.9

27


26 8 22.68 50430.4

28

sw|P39007|STT3_YEAST Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferase subunit STT3 (EC 2.4.1.119) (Oligosaccharyl transferase subunit STT3).

2 2 4.87 81528.4

29 sw|Q04439|MYO5_YEAST Myosin-5. 4 4 4.59 136898.4

30sw|P32657|CHD1_YEAST Chromo domain-containing protein 1 (EC 3.6.1.-) (ATP-dependent helicase CHD1).

12 11 9.20 168239.6

31sw|Q12464|RUVB2_YEAST RuvB-like protein 2 (EC 3.6.1.-) (RUVBL2) (TIP49b homolog) (TIP49- homology protein 2).

4 4 14.65 51611.3

32


10 9 18.65 70627.3

33sw|P36519|RM07_YEAST 54S ribosomal protein L7, mitochondrial precursor (YmL7) (YmL5).

2 2 14.04 33098.7

34sw|Q04182|PDR15_YEAST ATP-dependent permease PDR15.

6 6 8.18 172254.1


9 8 45.61 30995.7


13 10 30.28 56784.5


38sw|P04840|VDAC1_YEAST Outer mitochondrial membrane protein porin 1 (Voltage-dependent anion- selective channel protein 1) (VDAC 1).

3 3 16.61 30428.3

39sw|Q02959|HOS3_YEAST Histone deacetylase HOS3.

6 6 14.63 79199.6

40

sw|P53040|TAF6_YEAST Transcription initiation factor TFIID subunit 6 (TBP-associated factor 6) (TBP-associated factor 60 kDa) (TAFII-60) (TAFII60).

2 2 8.91 57901.6

41sw|P39743|RV167_YEAST Reduced viability upon starvation protein 167.

2 2 6.64 52774.0

42sw|P53125|ITC1_YEAST Imitation switch two complex protein 1.

7 7 9.26 145641.6


12 6 31.15 21561.6


4 3 6.41 92412.7

45 sw|P05030|PMA1_YEAST Plasma membrane ATP 1 (EC 3 6 3 6) (P t 1)

10 8 14.71 99618.6

ATPase 1 (EC 3.6.3.6) (Proton pump 1).

sw|Q6FSF1|RUVB2_CANGA RuvB-like helica 6.09 51998.9

sw|Q6CT29|RUVB2_KLULA RuvB-like helica 6.21 51095.646

sw|Q755G5|RUVB2_ASHGO RuvB-like helicase 2 (EC 3.6.1.-).

3 2=

6.18 51526.2

47sw|P34111|TFC3_YEAST Transcription factor tau 138 kDa subunit (TFIIIC 138 kDa subunit) (Transcription factor C subunit 3).

4 4 5.00 132107.0


5 4 22.93 30132.2

49sw|P53163|MNP1_YEAST 54S ribosomal protein L12, mitochondrial precursor (Mitochondrial- nucleoid protein 1).

20 4 21.65 20649.8

50sw|P03874|CBP2_YEAST Cytochrome B pre-mRNA-processing protein 2.

6 6 15.71 73860.6

51sw|P21827|RCC1_YEAST Regulator of chromosome condensation (Protein PRP20) (Pheromone response pathway component SRM1).

6 5 18.46 53013.5


8 6 32.74 38348.8

53

sw|Q05022|RRP5_YEAST rRNA biogenesis protein RRP5 (Ribosomal RNA-processing protein 5) (U3 small nucleolar RNA-associated protein RRP5) (U3 snoRNA-associated protein RRP5).

3 3 2.72 193132.3

54sw|P11633|NHP6B_YEAST Non-histone chromosomal protein 6B.

4 2 25.25 11575.0


18 7 36.55 28514.8

56sw|Q04603|DPB4_YEAST DNA polymerase epsilon subunit D (EC 2.7.7.7) (DNA polymerase II subunit D).

3 3 25.51 21997.3

57sw|Q756P0|FBRL_ASHGO rRNA 2'-O-methyltransferase fibrillarin (EC 2.1.1.-).

2 2 10.12 34212.8


5 5 6.06 143501.2

59sw|P40098|YE12_YEAST Uncharacterized protein YER182W.

3 3 18.03 27697.7

60

sw|P15565|TRM1_YEAST N(2),N(2)-dimethylguanosine tRNA methyltransferase, mitochondrial precursor (EC 2.1.1.32) (tRNA(guanine-26,N(2)-N(2)) methyltransferase) (tRNA 2,2-dimethylguanosine-26 methyltransferase) (tRNA(m(2,2)G26)dimethyltransferase).

4 4 12.11 64051.9


9 6 12.83 90896.0

62sw|P38264|PHO88_YEAST Inorganic phosphate transport protein PHO88 (Phosphate metabolism protein PHO88).

3 3 19.68 21136.8

63

sw|P07213|TOM70_YEAST Mitochondrial import receptor subunit TOM70 (70 kDa mitochondrial outer membrane protein) (Translocase of outer membrane 70 kDa subunit).

5 5 14.59 70122.7


10 10 10.36 164213.2

64sw|Q08773|ISW2_YEAST ISWI chromatin-remodeling complex ATPase ISW2 (EC 3.6.1.-) (Imitation switch protein 2).

3 3 3.39 130326.4

65sw|P23833|SCO1_YEAST Protein SCO1, mitochondrial precursor.

2 2 15.25 33165.7

sw|P60009|ACT_CANGA Actin. 16.00 41689.4

sw|P60011|ACT_SACBA Actin. 16.00 41689.4

sw|P60010|ACT_YEAST Actin. 16.00 41689.4

sw|Q75D00|ACT_ASHGO Actin. 15.96 41732.5

66

sw|P17128|ACT_KLULA Actin.

4 4=

16.00 41658.4

67sw|P38771|RRF1_YEAST Ribosomal recycling factor, mitochondrial precursor.

4 3 17.39 26406.5

68sw|P32785|FMT_YEAST Methionyl-tRNA formyltransferase, mitochondrial precursor (EC 2.1.2.9) (MtFMT).

2 2 7.48 44616.4

69sw|P38934|BFR1_YEAST Nuclear segregation protein BFR1 (Brefeldin A resistance protein 1).

2 2 6.38 54638.9

70sw|P14906|SEC63_YEAST Protein translocation protein SEC63 (Sec62/63 complex 73 kDa subunit) (Protein NPL1).

2 2 5.13 75344.1

71sw|Q06678|RM35_YEAST 54S ribosomal protein L35, mitochondrial precursor (YmL35).

3 2 9.26 42824.8

72sw|P36101|YKC7_YEAST Uncharacterized protein YKL027W.

4 4 12.53 50265.5

sw|Q74ZL5|H2B1_ASHGO Histone H2B.1. 18.94 14284.2

sw|Q6FWM8|H2B1_CANGA Histone H2B.1. 19.38 14003.0

sw|Q6CK60|H2B1_KLULA Histone H2B.1. 18.94 14296.2

sw|Q8J1F8|H2B2_ASHGO Histone H2B.2. 19.69 13823.7

sw|Q6FM30|H2B2_CANGA Histone H2B.2. 19.08 14218.2

sw|Q6CMV8|H2B2_KLULA Histone H2B.2. 18.94 14403.4

73


12 2=

19.08 14237.2

sw|P32580|SUV3_YEAST ATP-dependent RNA 4.07 84271.9

74 sw|O74727|SUV3_SACDO ATP-dependent RNA helicase SUV3, mitochondrial precursor (EC 3.6.1.-).

2 2=4.07 84282.6

75

sw|P32473|ODPB_YEAST Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial precursor (EC 1.2.4.1) (Pyruvate dehydrogenase complex component E1 beta) (PDHE1-B).

2 2 8.74 40053.4

76sw|P19882|HSP60_YEAST Heat shock protein 60, mitochondrial precursor (Stimulator factor I 66 kDa component) (P66) (CPN60).

2 2 6.12 60751.2

77sw|P32445|RIM1_YEAST Single-stranded DNA-binding protein RIM1, mitochondrial precursor (Mitochondrial ssDNA-binding protein).

2 2 22.22 15386.1

78

sw|P38122|PANB_YEAST 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.11) (Ketopantoate hydroxymethyltransferase)(Extracellular matrix protein 31).

2 2 10.58 34464.7

79sw|P38756|YHG3_YEAST Uncharacterized protein YHR003C.

3 2 7.23 48883.0


16 16 16.92 131100.9

81sw|P23641|MPCP_YEAST Mitochondrial phosphate carrier protein (Phosphate transport protein) (PTP) (mPic 1) (Mitochondrial import receptor) (p32).

6 4 20.58 32811.8

82

sw|P39112|MSU1_YEAST Exoribonuclease II, mitochondrial precursor (EC 3.1.13.1) (Ribonuclease II) (RNase II) (Mitochondrial biogenesis protein MSU1).

2 2 4.33 110821.2

83 sw|P39945|AST2_YEAST Protein AST2. 3 3 9.77 48370.4

84sw|P38339|RGD1_YEAST RHO GTPase-activating protein RGD1 (RhoGAP) (Related GAP domain protein 1).

5 4 7.96 74618.7

sw|P54780|RL15B_YEAST 60S ribosomal pr 14.71 24408.385 sw|P05748|RL15A_YEAST 60S ribosomal protein

L15-A (L13) (YL10) (RP15R) (YP18).

2 2=14.71 24422.0

86sw|P13711|ACOX_YEAST Acyl-coenzyme A oxidase (EC 1.3.3.6) (Acyl-CoA oxidase).

3 3 7.35 84041.6

87sw|P38626|NCB5R_YEAST Putative NADH-cytochrome b5 reductase (EC 1.6.2.2) (P35).

2 2 9.94 36199.2

sw|Q6FWM7|H2A1_CANGA Histone H2A.1. 29.01 13872.9


sw|Q757L4|H2A2_ASHGO Histone H2A.2. 29.01 13846.9

sw|Q6FM31|H2A2_CANGA Histone H2A.2. 29.01 13900.9


88

sw|Q6CK59|H2A_KLULA Histone H2A.

4 2=

29.23 13818.9


90sw|P11632|NHP6A_YEAST Non-histone chromosomal protein 6A.

9 5 45.16 10802.3

91sw|P39986|ATC6_YEAST Probable cation-transporting ATPase 1 (EC 3.6.3.-).

3 3 4.03 135267.5

92

sw|P40215|NDH1_YEAST External NADH-ubiquinone oxidoreductase 1, mitochondrial precursor (EC 1.6.5.3) (External NADH dehydrogenase 1).

4 3 9.29 62773.7

93sw|P05735|RL19_YEAST 60S ribosomal protein L19 (L23) (YL14) (RP15L) (RP33).

2 2 14.29 21703.9

94sw|P38120|RT09_YEAST 37S ribosomal protein S9, mitochondrial precursor.

2 2 13.67 31924.9

95sw|Q03940|RUVB1_YEAST RuvB-like protein 1 (EC 3.6.1.-) (RUVBL1) (TIP49a homolog) (TIP49- homology protein 1).

2 2 7.78 50452.8

96 sw|P32843|RNA12_YEAST Protein RNA12. 2 2 3.41 96687.9


3 3 15.99 30090.3

98

sw|P46677|TAF1_YEAST Transcription initiation factor TFIID subunit 1 (EC 2.3.1.48) (TBP- associated factor 1) (TBP-associated factor 145 kDa) (TAFII-145) (TAFII-130).

7 7 10.41 120695.0

sw|Q59SU5|H2A1_CANAL Histone H2A.1. 6.82 14009.099

sw|A5DJJ2|H2A2_PICGU Histone H2A.2. 4 2=

6.92 13896.9

100sw|P32419|MDHP_YEAST Malate dehydrogenase, peroxisomal (EC 1.1.1.37).

3 3 13.41 37185.9

sw|P07251|ATPA_YEAST ATP synthase subu 4.59 58573.4101 sw|P49375|ATPA_KLULA ATP synthase subunit

alpha, mitochondrial precursor (EC 3.6.3.14).

2 2=4.56 59102.3

102sw|P53115|INO80_YEAST Putative DNA helicase INO80 (EC 3.6.1.-) (Inositol-requiring protein 80).

3 3 2.96 171453.4

103

sw|P35189|TAF14_YEAST Transcription initiation factor TFIID subunit 14 (TBP-associated factor 14) (TBP-associated factor 30 kDa) (Transcription initiation factor TFIIF 30 kDa subunit) (Transcription factor G 30 kDa subunit)

2 2 13.52 27440.0


4 4 8.21 67855.6

105sw|P25038|IF2M_YEAST Translation initiation factor IF-2, mitochondrial precursor (IF-2Mt) (IF2(mt)) (IF-

4 4 9.76 75656.3


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

% c

overa

ge

MW

1sp|P02994|EF1A_YEAST Elongation factor 1-alpha OS=Saccharomyces cerevisiae GN=TEF1 PE=1 SV=1

2 2 7.2 % 50032.33

2sp|P23301|IF5A2_YEAST Eukaryotic translation initiation factor 5A-2 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HYP2 PE=1 SV=3

2 2 22.92 % 17114.2

3

sp|P19262|ODO2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=KGD2 PE=1 SV=2

8 4 13.39 % 50430.4

4

sp|P15424|MS116_YEAST ATP-dependent RNA helicase MSS116, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MSS116 PE=1 SV=1

9 8 16.11 % 76268.05

5sp|Q02486|ABF2_YEAST ARS-binding factor 2, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ABF2 PE=1 SV=1

7 5 28.96 % 21561.55

6sp|P39726|GCSH_YEAST Glycine cleavage system H protein, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=GCV3 PE=1 SV=2

2 2 20.58 % 18794.87

7sp|P02992|EFTU_YEAST Elongation factor Tu, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=TUF1 PE=1 SV=1

4 4 13.04 % 47971.82

8sp|P40513|MAM33_YEAST Mitochondrial acidic protein MAM33 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MAM33 PE=1 SV=1

4 3 16.54 % 30132.2

9sp|P19882|HSP60_YEAST Heat shock protein 60, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HSP60 PE=1 SV=1

7 7 15.38 % 60751.18

10sp|P25374|NFS1_YEAST Cysteine desulfurase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NFS1 PE=1 SV=2

4 4 10.26 % 54466.75

11sp|P25345|SYNM_YEAST Asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SLM5 PE=1 SV=1

4 4 10.97 % 56784.52

12sp|Q04599|RM01_YEAST 54S ribosomal protein L1, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MRPL1 PE=1 SV=1

3 3 14.03 % 30995.73

13sp|Q02784|GLRX5_YEAST Monothiol glutaredoxin-5, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=GRX5 PE=1 SV=1

6 5 48.66 % 16931.33

14sp|P00890|CISY1_YEAST Citrate synthase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=CIT1 PE=1 SV=2

7 7 18.99 % 53359.71

15sp|P12398|HSP77_YEAST Heat shock protein SSC1, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SSC1 PE=1 SV=1

8 6 11.46 % 70627.31

16sp|P09440|C1TM_YEAST C-1-tetrahydrofolate synthase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MIS1 PE=1 SV=1

3 3 4.1 % 106216.7

17sp|P00044|CYC1_YEAST Cytochrome c iso-1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=CYC1 PE=1 SV=2

5 4 34.86 % 12181.91

18sp|P53252|PIL1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein PIL1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PIL1 PE=1 SV=1

8 8 30.38 % 38348.83

19sp|P32787|MG101_YEAST Mitochondrial genome maintenance protein MGM101 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MGM101 PE=1 SV=1

3 3 14.49 % 30090.3

20sp|Q03976|RT24_YEAST 37S ribosomal protein S24, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RSM24 PE=1 SV=1

3 3 11.91 % 37393.14

21sp|P36517|RM04_YEAST 54S ribosomal protein L4, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MRPL4 PE=1 SV=2

2 2 8.15 % 36964.67

22sp|P11632|NHP6A_YEAST Non-histone chromosomal protein 6A OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NHP6A PE=1 SV=1

3 2 27.95 % 10802.25

23sp|P02309|H4_YEAST Histone H4 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HHF1 PE=1 SV=2

5 3 31.06 % 11368.22

24sp|P21827|RCC1_YEAST Regulator of chromosome condensation OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PRP20 PE=1 SV=1

2 2 4.97 % 53013.49


2 2 10.22 % 30271.1

26sp|P47150|RT07_YEAST 37S ribosomal protein S7, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RSM7 PE=1 SV=1

2 2 8.09 % 27815.9


3 3 16.06 % 28514.77

28

sp|P46367|ALDH4_YEAST Potassium-activated aldehyde dehydrogenase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ALD4 PE=1 SV=2

3 3 6.74 % 56723.24

29sp|P00427|COX6_YEAST Cytochrome c oxidase polypeptide 6, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=COX6 PE=1 SV=1

3 3 22.29 % 17341.47

30sp|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein LSP1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=LSP1 PE=1 SV=1

2 2 8.5 % 38070.86

31sp|P53551|H1_YEAST Histone H1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HHO1 PE=1 SV=1

2 2 9.68 % 27803.38

32

sp|P32340|NDI1_YEAST Rotenone-insensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NDI1 PE=1 SV=1

2 2 7.79 % 57249.43

33sp|P38771|RRF1_YEAST Ribosome-recycling factor, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RRF1 PE=1 SV=1

2 2 8.69 % 26406.51

34sp|Q12159|YRA1_YEAST RNA annealing protein YRA1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=YRA1 PE=1 SV=2

2 2 11.94 % 24955.43

35

sp|Q01852|TIM44_YEAST Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM44 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=TIM44 PE=1 SV=1

2 2 5.33 % 48854.09

36sp|P25039|EFG1_YEAST Elongation factor G 1, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MEF1 PE=1 SV=2

2 2 3.41 % 84573.09

Keratines


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

% c

overa

ge

MW

1


4 4 9.91 77994.6


10 9 29.78 54466.8

3sw|P13181|GAL2_YEAST Galactose transporter (Galactose permease).

2 2 7.14 63625.6



11 9 20.35 55560.5



4 4 24.81 30132.2


9sw|P02992|EFTU_YEAST Elongation factor Tu, mitochondrial precursor (tufM).

2 2 7.78 47971.8


2 2 17.51 20090.6

11sw|P15424|MS116_YEAST ATP-dependent RNA helicase MSS116, mitochondrial precursor (EC 3.6.1.-).

9 7 15.66 76268.1

12


8 3 9.07 50430.4

13sw|P00830|ATPB_YEAST ATP synthase subunit beta, mitochondrial precursor (EC 3.6.3.14).

3 3 8.41 54793.4


15


9 9 10.53 118629.3

16

sw|P15646|FBRL_YEAST rRNA 2'-O-methyltransferase fibrillarin (EC 2.1.1.-) (Nucleolar protein 1) (U3 small nucleolar RNA-associated protein NOP1) (U3 snoRNA-associated protein NOP1).

4 4 11.62 34465.1


4 2 11.79 27543.8

18sw|P27476|NSR1_YEAST Nuclear localization sequence-binding protein (p67).

3 3 10.63 44534.8


4 4 4.23 143501.2


5 4 7.87 67855.6


11 10 22.49 75656.3



27 6 29.51 21561.6


sw|P04912|H2A2_YEAST Histone H2A.2. 7 2=

24.24 13989.1

25sw|P07263|SYH_YEAST Histidyl-tRNA synthetase, mitochondrial precursor (EC 6.1.1.21) (Histidine--tRNA ligase) (HisRS).

5 5 10.81 59952.2


4 4 17.47 30090.3

27sw|P38756|YHG3_YEAST Uncharacterized protein YHR003C.

2 2 6.29 48883.0

sw|P02293|H2B1_YEAST Histone H2B.1 (Suppressor of Ty protein 12).

19.08 14252.228


9 2=

19.08 14237.2

29sw|P32445|RIM1_YEAST Single-stranded DNA-binding protein RIM1, mitochondrial precursor (Mitochondrial ssDNA-binding protein).

4 2 22.22 15386.1

30sw|P07251|ATPA_YEAST ATP synthase subunit alpha, mitochondrial precursor (EC 3.6.3.14).

7 6 12.84 58607.6


9 4 21.69 28514.8

32sw|P53163|MNP1_YEAST 54S ribosomal protein L12, mitochondrial precursor (Mitochondrial- nucleoid protein 1).

8 2 16.49 20649.8

33sw|P11632|NHP6A_YEAST Nonhistone chromosomal protein 6A.

6 2 29.03 10802.3

34sw|P39004|HXT7_YEAST High-affinity hexose transporter HXT6.

2 2 5.61 62734.8


3 3 4.84 92412.7


4 4 9.06 62993.3

37 sw|P36006|MYO3_YEAST Myosin-3. 3 3 2.99 142779.7

38sw|Q12404|MPD1_YEAST Protein disulfide-isomerase MPD1 precursor (EC 5.3.4.1).

2 2 8.18 36407.8

39sw|P53723|YN8B_YEAST Uncharacterized protein YNR021W.

3 3 9.65 47092.8

40sw|P08466|NUC1_YEAST Mitochondrial nuclease (EC 3.1.30.-).

2 2 10.03 37209.2

41sw|P38264|PHO88_YEAST Inorganic phosphate transport protein PHO88 (Phosphate metabolism protein PHO88).

3 3 19.68 21136.8

42sw|P32419|MDHP_YEAST Malate dehydrogenase, peroxisomal (EC 1.1.1.37).

2 2 9.33 37185.9

sw|P39516|RS14B_YEAST 40S ribosomal pr 17.39 14641.843 sw|P06367|RS14A_YEAST 40S ribosomal

protein S14-A (RP59A).

2 2=17.52 14536.5


6 6 7.09 131100.9

45sw|P47015|YJN1_YEAST Uncharacterized protein YJL131C.

2 2 7.87 41460.8


2 2 13.57 38348.8


3 3 2.73 164213.2

48

sw|P39015|STM1_YEAST Suppressor protein STM1 (GU4 nucleic-binding protein 2) (G4p2 protein) (Triplex-binding protein 1) (3BP1) (Ribosomal subunits association factor) (AF) (POP2 multicopy suppressor protein 4) (TOM1 suppressor protein 1).

2 2 8.42 29994.7

sw|P19657|PMA2_YEAST Plasma membrane A 6.34 102108.549 sw|P05030|PMA1_YEAST Plasma membrane

ATPase 1 (EC 3.6.3.6) (Proton pump 1).

5 5=6.54 99618.6



4 3 5.07 89994.8

52 sw|P06787|CALM_YEAST Calmodulin (CaM). 5 5 52.38 16134.8


3 3 4.83 90896.0

54sw|P02994|EF1A_YEAST Elongation factor 1-alpha (EF-1-alpha) (Translation elongation factor 1A) (Eukaryotic elongation factor 1A) (eEF1A).

4 3 8.95 50032.3

55sw|P15179|SYDM_YEAST Aspartyl-tRNA synthetase, mitochondrial (EC 6.1.1.12) (Aspartate--tRNA ligase) (AspRS).

4 4 8.21 75460.2

56sw|Q03713|YMD0_YEAST Mitochondrial protein YML030W.

2 2 11.32 18477.3

57sw|P21576|VPS1_YEAST Vacuolar protein sorting-associated protein 1.

7 6 10.51 78736.0


6 6 16.06 56784.5

59sw|Q12159|YRA1_YEAST RNA annealing protein YRA1.

2 2 11.95 24955.4


2 2 11.23 30995.7

61


7 6 9.02 70627.3

62sw|P32785|FMT_YEAST Methionyl-tRNA formyltransferase, mitochondrial precursor (EC 2.1.2.9) (MtFMT).

3 3 8.73 44616.4

63sw|P38771|RRF1_YEAST Ribosomal recycling factor, mitochondrial precursor.

2 2 10.43 26406.5

64sw|P17558|RTPT_YEAST Mitochondrial 37S ribosomal protein PET123.

2 2 6.60 35998.0

65sw|P47068|BBC1_YEAST Myosin tail region-interacting protein MTI1 (Protein BBC1).

6 5 5.45 128295.5

66sw|P36101|YKC7_YEAST Uncharacterized protein YKL027W.

3 3 7.83 50265.5

71 sw|P39945|AST2_YEAST Protein AST2. 3 3 8.14 48370.4

67sw|P39103|COX14_YEAST Cytochrome c oxidase assembly protein COX14.

2 2 14.29 7959.0

68

sw|P39007|STT3_YEAST Dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferase subunit STT3 (EC 2.4.1.119) (Oligosaccharyl transferase subunit STT3).

2 2 2.37 81528.4

69sw|Q6Q560|ISD11_YEAST Protein ISD11 (Iron-sulfur protein biogenesis, desulfurase-interacting

3 3 32.98 11266.0

70sw|P38353|SSH1_YEAST Sec sixty-one protein homolog (Ssh1 complex subunit SSH1) (Ssh1 complex subunit alpha).

3 3 3.27 53311.4

71

sw|P23641|MPCP_YEAST Mitochondrial phosphate carrier protein (Phosphate transport protein) (PTP) (mPic 1) (Mitochondrial import receptor) (p32).

2 2 8.04 32811.8

72sw|P11325|SYLM_YEAST Leucyl-tRNA synthetase, mitochondrial precursor (EC 6.1.1.4) (Leucine--tRNA ligase) (LeuRS).

2 2 4.03 101919.5

73sw|P10662|RT01_YEAST 37S ribosomal protein MRP1, mitochondrial precursor.

2 2 7.48 36728.6

Remarque :


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

% c

overa

ge

MW

1P32558|SPT16_YEAST FACT complex subunit SPT16 - Saccharomyces cerevisiae

5 5 6.76 118629.3

2P14908|MTF1_YEAST Mitochondrial replication protein MTF1 - Saccharomyces cerevisiae

5 5 22.28 39726.59

3P36521|RM11_YEAST 54S ribosomal protein L11, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

7 5 25.3 28514.77

4Q03435|NHP10_YEAST Non-histone protein 10 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 17.73 23856.8

5P00044|CYC1_YEAST Cytochrome c iso-1 - Saccharomyces cerevisiae

24 6 50.45 12181.91

6Q03973|HMO1_YEAST High mobility group protein 1 - Saccharomyces cerevisiae

7 3 16.66 27543.79

7P25374|NFS1_YEAST Cysteine desulfurase, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

7 6 20.72 54466.75

8P02994|EF1A_YEAST Elongation factor 1-alpha - Saccharomyces cerevisiae

9 5 17.03 50032.33

9P25294|SIS1_YEAST Protein SIS1 - Saccharomyces cerevisiae

10 6 20.73 37589.75

10P35191|MDJ1_YEAST DnaJ homolog 1, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

2 2 7.24 55560.5

11P13181|GAL2_YEAST Galactose transporter - Saccharomyces cerevisiae

6 4 9.4 63625.62

12Q06488|RSC2_YEAST Chromatin structure-remodeling complex protein RSC2 - Saccharomyces cerevisiae

6 6 10.46 102299

13P21827|RCC1_YEAST Regulator of chromosome condensation - Saccharomyces cerevisiae

10 5 18.46 53013.49

14

P19262|ODO2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

21 5 15.33 50430.4

15P06634|DED1_YEAST ATP-dependent RNA helicase DED1 - Saccharomyces cerevisiae

5 5 14.9 65552.39

16Q12285|MDY2_YEAST Ubiquitin-like protein MDY2 - Saccharomyces cerevisiae

4 2 14.15 23732.16

17P32419|MDHP_YEAST Malate dehydrogenase, peroxisomal - Saccharomyces cerevisiae

9 6 31.48 37185.88

18P53551|H1_YEAST Histone H1 - Saccharomyces cerevisiae

6 3 18.21 27803.38

19P32597|STH1_YEAST Nuclear protein STH1/NPS1 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 3.01 156741.4

20P53163|MNP1_YEAST 54S ribosomal protein L12, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

12 3 21.64 20649.84

21P04911|H2A1_YEAST Histone H2A.1 - Saccharomyces cerevisiae

8 2 24.24 13989.05

22P04912|H2A2_YEAST Histone H2A.2 - Saccharomyces cerevisiae

8 2 24.24 13989.05

23P38144|ISW1_YEAST ISWI chromatin-remodeling complex ATPase ISW1 - Saccharomyces cerevisiae

7 6 7.88 131100.9

24P07263|SYH_YEAST Histidyl-tRNA synthetase, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

6 6 17.76 59952.2

25P47015|YJN1_YEAST Uncharacterized protein YJL131C - Saccharomyces cerevisiae

3 3 13.48 41460.8

26P11938|RAP1_YEAST DNA-binding protein RAP1 - Saccharomyces cerevisiae

5 5 8.58 92412.66

27P15646|FBRL_YEAST rRNA 2'-O-methyltransferase fibrillarin - Saccharomyces cerevisiae

13 8 31.19 34465.05

28Q12159|YRA1_YEAST RNA annealing protein YRA1 - Saccharomyces cerevisiae

4 3 15.48 24955.43

29P02293|H2B1_YEAST Histone H2B.1 - Saccharomyces cerevisiae

14 2 19.08 14252.21

30P02294|H2B2_YEAST Histone H2B.2 - Saccharomyces cerevisiae

14 2 19.08 14237.2

31P32657|CHD1_YEAST Chromo domain-containing protein 1 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 1.83 168239.6

32P39743|RV167_YEAST Reduced viability upon starvation protein 167 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 6.63 52773.98

33P04801|SYTC_YEAST Threonyl-tRNA synthetase, cytoplasmic - Saccharomyces cerevisiae

4 4 6.81 84519.92

34P25038|IF2M_YEAST Translation initiation factor IF-2, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

7 4 9.31 75656.25

35P32796|CACP_YEAST Carnitine O-acetyltransferase, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

6 5 10.74 77241.27

36Q04636|POB3_YEAST FACT complex subunit POB3 - Saccharomyces cerevisiae

4 4 10.5 62993.34

37P25345|SYNM_YEAST Asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

5 5 14.02 56784.52

38P32833|ORC2_YEAST Origin recognition complex subunit 2 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 5.16 71237.8

39P04802|SYDC_YEAST Aspartyl-tRNA synthetase, cytoplasmic - Saccharomyces cerevisiae

2 2 7 63515.09

40P04840|VDAC1_YEAST Outer mitochondrial membrane protein porin 1 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 10.24 30428.25

41Q02959|HOS3_YEAST Histone deacetylase HOS3 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 5.59 79199.59

42P15424|MS116_YEAST ATP-dependent RNA helicase MSS116, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

5 5 9.48 76268.05

43P15179|SYDM_YEAST Aspartyl-tRNA synthetase, mitochondrial - Saccharomyces cerevisiae

5 4 9.57 75460.19

44P02309|H4_YEAST Histone H4 - Saccharomyces cerevisiae

12 4 42.71 11368.22

45P53125|ITC1_YEAST Imitation switch two complex protein 1 - Saccharomyces cerevisiae

5 5 5.3 145641.6

46P00045|CYC7_YEAST Cytochrome c iso-2 - Saccharomyces cerevisiae

8 4 30.97 12532.23

47P38884|YHZ8_YEAST Uncharacterized protein YHR198C - Saccharomyces cerevisiae

2 2 7.78 36501.38

48P14164|BAF1_YEAST Transcription factor BAF1 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 4.78 81748.94

49P43596|IOC3_YEAST ISWI one complex protein 3 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 4.82 90896.04

50P60010|ACT_YEAST Actin - Saccharomyces cerevisiae

4 4 20.8 41689.39

51P39015|STM1_YEAST Suppressor protein STM1 - Saccharomyces cerevisiae

3 3 13.55 29994.71

52P38771|RRF1_YEAST Ribosomal recycling factor, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

5 4 17.39 26406.51

53P21576|VPS1_YEAST Vacuolar protein sorting-associated protein 1 - Saccharomyces cerevisiae

8 6 11.07 78735.95

54P06786|TOP2_YEAST DNA topoisomerase 2 - Saccharomyces cerevisiae

3 3 3.01 164213.2

55Q02486|ABF2_YEAST ARS-binding factor 2, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

6 4 24.59 21561.55

56Q12405|PEX84_YEAST Peroxisomal membrane protein YOR084W - Saccharomyces cerevisiae

6 6 20.41 43726.68

57Q12466|TCB1_YEAST Tricalbin-1 - Saccharomyces cerevisiae

3 2 3.45 133574.9

58P40485|SLM1_YEAST Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-binding protein SLM1 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 4.66 77994.57

59P07143|CY1_YEAST Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

3 3 17.47 34054.3

60P17255|VATA_YEAST Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A - Saccharomyces cerevisiae

4 3 4.76 118635.8

61P32787|MG101_YEAST Mitochondrial genome maintenance protein MGM101, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

3 3 17.1 30090.3

62

P12695|ODP2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

2 2 6.63 51817.75

63P22936|APN1_YEAST DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase 1 - Saccharomyces cerevisiae

3 3 14.71 41438.71

64Q06339|TFC6_YEAST Transcription factor tau 91 kDa subunit - Saccharomyces cerevisiae

2 2 4.76 74708.04

65P14906|SEC63_YEAST Protein translocation protein SEC63 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 5.12 75344.05

66P06787|CALM_YEAST Calmodulin - Saccharomyces cerevisiae

2 2 21.08 16134.77

67P38934|BFR1_YEAST Nuclear segregation protein BFR1 - Saccharomyces cerevisiae

3 3 9.78 54638.87

68P07251|ATPA_YEAST ATP synthase subunit alpha, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

3 3 6.42 58607.59

69Q02457|TBF1_YEAST Protein TBF1 - Saccharomyces cerevisiae

3 2 4.44 62823.26

70P39112|MSU1_YEAST Exoribonuclease II, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

3 2 3.5 110821.2

71Q12125|YO164_YEAST UPF0363 protein YOR164C - Saccharomyces cerevisiae

6 6 23.39 36279.99

72P27476|NSR1_YEAST Nuclear localization sequence-binding protein - Saccharomyces cerevisiae

3 3 7.97 44534.84

73P38122|PANB_YEAST 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase - Saccharomyces cerevisiae

2 2 10.57 34464.72

74Q05123|ARP9_YEAST Actin-like protein ARP9 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 4.49 53073.81

75Q12404|MPD1_YEAST Protein disulfide-isomerase MPD1 precursor - Saccharomyces cerevisiae

7 6 25.15 36407.82

76P41903|PTE1_YEAST Peroxisomal acyl-coenzyme A thioester hydrolase 1 - Saccharomyces cerevisiae

3 3 11.74 40259.38

77P19882|HSP60_YEAST Heat shock protein 60, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

2 2 5.06 60751.18

78P48527|SYYM_YEAST Tyrosyl-tRNA synthetase, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

2 2 5.28 55287.08

79P39945|AST2_YEAST Protein AST2 - Saccharomyces cerevisiae

2 2 7.2 48370.35

80P05030|PMA1_YEAST Plasma membrane ATPase 1 - Saccharomyces cerevisiae

3 2 3.48 99618.59

81P19657|PMA2_YEAST Plasma membrane ATPase 2 - Saccharomyces cerevisiae

3 2 3.37 102171.2

82P10662|RT01_YEAST 37S ribosomal protein MRP1, mitochondrial precursor - Saccharomyces cerevisiae

2 2 8.09 36728.58

Keratin -

Remarque :


Identification

# M

S/M

S

scan

# d

isti

nct

pep

% c

overa

ge

MW

1sp|P02992|EFTU_YEAST Elongation factor Tu, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=TUF1 PE=1 SV=1

4 4 13.72 % 47971.82

2

sp|P19262|ODO2_YEAST Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=KGD2 PE=1 SV=2

6 4 13.39 % 50430.4


9 4 34.86 % 12181.91

4sp|Q03973|HMO1_YEAST High mobility group protein 1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HMO1 PE=1 SV=1

4 3 12.19 % 27543.79

5

sp|P32796|CACP_YEAST Carnitine O-acetyltransferase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=CAT2 PE=1 SV=2

9 9 17.46 % 77241.27

6sp|P47068|BBC1_YEAST Myosin tail region-interacting protein MTI1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=BBC1 PE=1 SV=2

3 3 3.97 % 128295.5

7sp|P43579|IES1_YEAST Ino eighty subunit 1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=IES1 PE=1 SV=1

2 2 4.33 % 78752.16

8

sp|P15424|MS116_YEAST ATP-dependent RNA helicase MSS116, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MSS116 PE=1 SV=1

11 9 18.07 % 76268.05

9sp|P25345|SYNM_YEAST Asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SLM5 PE=1 SV=1

7 7 20.12 % 56784.52

10sp|P00890|CISY1_YEAST Citrate synthase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=CIT1 PE=1 SV=2

6 6 16.49 % 53359.71

11sp|P09440|C1TM_YEAST C-1-tetrahydrofolate synthase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MIS1 PE=1 SV=1

3 3 4.82 % 106216.7

12sp|P27929|NAM9_YEAST 37S ribosomal protein NAM9, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NAM9 PE=1 SV=2

2 2 6.37 % 56355.62

13sp|P12398|HSP77_YEAST Heat shock protein SSC1, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SSC1 PE=1 SV=1

12 8 13.6 % 70627.31

14sp|P11632|NHP6A_YEAST Non-histone chromosomal protein 6A OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NHP6A PE=1 SV=1

8 2 27.95 % 10802.25


4 2 19.46 % 12532.23

16sp|P25374|NFS1_YEAST Cysteine desulfurase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae

2 2 5.43 % 54466.75

GN=NFS1 PE=1 SV=2


4 4 22.1 % 30995.73

18sp|Q02486|ABF2_YEAST ARS-binding factor 2, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ABF2 PE=1 SV=1

8 5 29.5 % 21561.55

19sp|Q02608|RT16_YEAST 37S ribosomal protein S16, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MRPS16 PE=1 SV=1

2 2 22.31 % 13638.89

20sp|P03874|CBP2_YEAST Cytochrome B pre-mRNA-processing protein 2 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=CBP2 PE=1 SV=2

2 2 5.07 % 73860.55

21sp|P19882|HSP60_YEAST Heat shock protein 60, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HSP60 PE=1 SV=1

3 3 7.34 % 60751.18

22sp|P11633|NHP6B_YEAST Non-histone chromosomal protein 6B OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NHP6B PE=1 SV=2

3 2 25.25 % 11575.03

23sp|P53125|ITC1_YEAST Imitation switch two complex protein 1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ITC1 PE=1 SV=1

4 4 3.32 % 145641.6

24sp|P53252|PIL1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein PIL1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=PIL1 PE=1 SV=1

5 5 16.51 % 38348.83

25sp|P32787|MG101_YEAST Mitochondrial genome maintenance protein MGM101 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MGM101 PE=1 SV=1

4 4 20.44 % 30090.3

26sp|P02994|EF1A_YEAST Elongation factor 1-alpha OS=Saccharomyces cerevisiae GN=TEF1 PE=1 SV=1

3 2 7.2 % 50032.33

27sp|P11325|SYLM_YEAST Leucyl-tRNA synthetase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NAM2 PE=1 SV=1

3 3 4.69 % 101919.5

28sp|P53163|MNP1_YEAST 54S ribosomal protein L12, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MNP1 PE=1 SV=1

3 2 16.49 % 20649.84

29sp|P17255|VATA_YEAST Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A OS=Saccharomyces cerevisiae GN=VMA1 PE=1 SV=3

2 2 2.14 % 118635.8

30sp|P11938|RAP1_YEAST DNA-binding protein RAP1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RAP1 PE=1 SV=2

2 2 3.02 % 92412.66

31

sp|P32340|NDI1_YEAST Rotenone-insensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=NDI1 PE=1 SV=1

4 4 11.3 % 57249.43


6 5 25.3 % 28514.77

33

sp|P46367|ALDH4_YEAST Potassium-activated aldehyde dehydrogenase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ALD4 PE=1 SV=2

2 2 4.81 % 56723.24

34sp|P10662|RT01_YEAST 37S ribosomal protein MRP1, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MRP1 PE=1 SV=2

3 3 11.83 % 36728.58

35sp|P02309|H4_YEAST Histone H4 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=HHF1 PE=1

2 2 21.35 % 11368.22

SV=2

36sp|P38771|RRF1_YEAST Ribosome-recycling factor, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=RRF1 PE=1 SV=1

2 2 8.69 % 26406.51

37sp|P40513|MAM33_YEAST Mitochondrial acidic protein MAM33 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=MAM33 PE=1 SV=1

4 3 16.16 % 30132.2

38

sp|P06168|ILV5_YEAST Ketol-acid reductoisomerase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ILV5 PE=1 SV=1

2 2 6.07 % 44368.13

39sp|P33417|IXR1_YEAST Intrastrand cross-link recognition protein OS=Saccharomyces cerevisiae GN=IXR1 PE=1 SV=2

5 5 9.71 % 67855.61

40sp|P00427|COX6_YEAST Cytochrome c oxidase polypeptide 6, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=COX6 PE=1 SV=1

2 2 13.51 % 17341.47

41sp|Q6Q560|ISD11_YEAST Protein ISD11 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ISD11 PE=1 SV=1

2 2 22.34 % 11265.96

42sp|Q02784|GLRX5_YEAST Monothiol glutaredoxin-5, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=GRX5 PE=1 SV=1

2 2 20 % 16931.33

43sp|P38122|PANB_YEAST 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase OS=Saccharomyces cerevisiae GN=ECM31 PE=1 SV=1

2 2 7.05 % 34464.72

44sp|Q12230|LSP1_YEAST Sphingolipid long chain base-responsive protein LSP1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=LSP1 PE=1 SV=1

2 2 8.5 % 38070.86

45sp|P25038|IF2M_YEAST Translation initiation factor IF-2, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=IFM1 PE=1 SV=2

2 2 3.55 % 75656.25


2 2 10.38 % 21436.78

47sp|P04786|TOP1_YEAST DNA topoisomerase 1 OS=Saccharomyces cerevisiae GN=TOP1 PE=1 SV=2

4 4 5.72 % 89994.8

48

sp|P37292|GLYM_YEAST Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial OS=Saccharomyces cerevisiae GN=SHM1 PE=1 SV=2

2 2 5.1 % 53686.04

Keratines

BIBLIOGRAPHIE

Acharya N, Johnson RE, Prakash S, Prakash L. (2006) Complex formation with Rev1

enhances the proficiency of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase zeta for mismatch

extension and for extension opposite from DNA lesions. Mol Cell Biol. 26:9555-63.

Ackerman SH. (2002) Atp11p and Atp12p are chaperones for F(1)-ATPase biogenesis in

mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1555:101-5.

Adrian GS, McCammon MT, Montgomery DL, Douglas MG. (1986) Sequences required

for delivery and localization of the ADP/ATP translocator to the mitochondrial inner

membrane. Mol Cell Biol. 6:626-34.

Akbari M, Visnes T, Krokan HE, Otterlei M. (2008) Mitochondrial base excision repair of

uracil and AP sites takes place by single-nucleotide insertion and long-patch DNA synthesis.

DNA Repair (Amst). 7:605-16.

Albring M, Griffith J, Attardi G.(1977) Association of a protein structure of probable

membrane derivation with HeLa cell mitochondrial DNA near its origin of replication. Proc

Natl Acad Sci U S A. 74:1348-52.

Ames B. N., Shigenaga M. K., Hagen T. M. (1993). Oxidants, antioxidants, and the

degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:7915-22.

Andersson SG, Zomorodipour A, Andersson JO, Sicheritz-Pontén T, Alsmark UC, Podowski RM, Näslund AK, Eriksson AS, Winkler HH, Kurland CG. (1998) The

genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria. Nature. 396:133-

40.

Aoufouchi S, Flatter E, Dahan A, Faili A, Bertocci B, Storck S, Delbos F, Cocea L, Gupta N, Weill JC, Reynaud CA. (2000) Two novel human and mouse DNA polymerases

of the polX family. Nucleic Acids Res. 28:3684-93.

Aposhian HV, Kornberg A. (1962) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. IX. The

polymerase formed after T2 bacteriophage infection of Escherichia coli: a new enzyme. J Biol

Chem. 237:519-25.

Applegren N, Hickey RJ, Kleinschmidt AM, Zhou Q, Coll J, Wills P, Swaby R, Wei Y, Quan JY, Lee MY, et al. (1995) Further characterization of the human cell multiprotein

DNA replication complex. J Cell Biochem. 59:91-107.

Aravind L, Koonin EV. (1999) DNA polymerase beta-like nucleotidyltransferase

superfamily: identification of three new families, classification and evolutionary history.

Nucleic Acids Res. 27:1609-18.

Arifuzzaman M, Maeda M, Itoh A, Nishikata K, Takita C, Saito R, Ara T, Nakahigashi K, Huang HC, Hirai A, Tsuzuki K, Nakamura S, Altaf-Ul-Amin M, Oshima T, Baba T, Yamamoto N, Kawamura T, Ioka-Nakamichi T, Kitagawa M, Tomita M, Kanaya S, Wada C, Mori H. (2006) Large-scale identification of protein-protein interaction of

Escherichia coli K-12. Genome Res. 16:686-91.

Arlt H, Steglich G, Perryman R, Guiard B, Neupert W, Langer T. (1998) The formation

of respiratory chain complexes in mitochondria is under the proteolytic control of the m-AAA

protease. EMBO J. 17:4837-47.

Arnold I, Pfeiffer K, Neupert W, Stuart RA, Schägger H. (1998) Yeast mitochondrial

F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO

J. 17:7170-8.

Attardi G, Schatz G. (1988) Biogenesis of mitochondria. Annu Rev Cell Biol. 4:289-333.

Backert S, Kunnimalaiyaan M, Börner T, Nielsen BL. (1998) In vitro replication of

mitochondrial plasmid mp1 from the higher plant Chenopodium album (L.): a remnant of

bacterial rolling circle and conjugative plasmids? J Mol Biol. 284:1005-15.

Baldacci G, Bernardi G. (1982) Replication origins are associated with transcription

initiation sequences in the mitochondrial genome of yeast. EMBO J. 1:987-94.

Baldacci G, Chérif-Zahar B, Bernardi G. (1984) The initiation of DNA replication in the

mitochondrial genome of yeast. EMBO J. 3:2115-20.

Bandlow W, Strobel G, Schricker R. (1998) Influence of N-terminal sequence variation on

the sorting of major adenylate kinase to the mitochondrial intermembrane space in yeast.

Biochem J. 329:359-67.

Bassett DE Jr, Boguski MS, Hieter P. (1996) Yeast genes and human disease. Nature.

379:589-90.

Bavoux C, Leopoldino AM, Bergoglio V, O-Wang J, Ogi T, Bieth A, Judde JG, Pena SD, Poupon MF, Helleday T, Tagawa M, Machado C, Hoffmann JS, Cazaux C. (2005) Up-

regulation of the error-prone DNA polymerase {kappa} promotes pleiotropic genetic

alterations and tumorigenesis. Cancer Res. 65:325-30.

Baxter J, Diffley JF. (2008) Topoisomerase II inactivation prevents the completion of DNA

replication in budding yeast. Mol Cell. 30:790-802.

Bebenek K, Garcia-Diaz M, Patishall SR, Kunkel TA. (2005) Biochemical properties of

Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase IV. J Biol Chem. 280:20051-8.

Bécamel C, Alonso G, Galéotti N, Demey E, Jouin P, Ullmer C, Dumuis A, Bockaert J, Marin P. (2002) Synaptic multiprotein complexes associated with 5-HT(2C) receptors: a

proteomic approach. EMBO J. 21:2332-42.

Bell SP, Dutta A. (2002) DNA replication in eukaryotic cells. Annu Rev Biochem. 71:333-

74.

Bendich AJ. (1993) Reaching for the ring: the study of mitochondrial genome structure. Curr

Genet. 24:279-90.

Bendich AJ. (1996) Structural analysis of mitochondrial DNA molecules from fungi and

plants using moving pictures and pulsed-field gel electrophoresis. J Mol Biol. 255:564-88.

Bialek G, Grosse F. (1993) An error-correcting proofreading exonuclease-polymerase that

copurifies with DNA-polymerase-alpha-primase. J Biol Chem. 268:6024-33.

Bianchi N. O., Bianchi M. S., Richard S. M. (2001) Mitochondrial genome instability in

human cancers. Mutat Res. 488:9-23.

Bienko M, Green CM, Crosetto N, Rudolf F, Zapart G, Coull B, Kannouche P, Wider G, Peter M, Lehmann AR, Hofmann K, Dikic I. (2005) Ubiquitin-binding domains in Y-

family polymerases regulate translesion synthesis. Science. 310:1821-4.

Biswas TK, Getz GS. (2004) Requirement of different mitochondrial targeting sequences of

the yeast mitochondrial transcription factor Mtf1p when synthesized in alternative translation

systems. Biochem J. 383:383-91.

Bogenhagen DF, Rousseau D, Burke S. (2008) The layered structure of human

mitochondrial DNA nucleoids. J Biol Chem. 283:3665-75.

Bolden A, Noy GP, Weissbach A. (1977) DNA polymerase of mitochondria is a gamma-

polymerase. J Biol Chem. 252:3351-6.

Bollum FJ, Chang LM, Tsiapalis CM, Dorson JW. (1974) Nucleotide polymerizing

enzymes from calf thymus gland. Methods Enzymol. 29:70-81.

Bollum FJ, Potter VR. (1958) Incorporation of thymidine into deoxyribonucleic acid by

enzymes from rat tissues. J Biol Chem. 233:478-82.

Bottomley RC, Trayer IP. (1975) Affinity chromatography of immobilized actin and

myosin. Biochem J. 149:365-79.

Bouwmeester T, Bauch A, Ruffner H, Angrand PO, Bergamini G, Croughton K, Cruciat C, Eberhard D, Gagneur J, Ghidelli S, Hopf C, Huhse B, Mangano R, Michon AM, Schirle M, Schlegl J, Schwab M, Stein MA, Bauer A, Casari G, Drewes G, Gavin AC, Jackson DB, Joberty G, Neubauer G, Rick J, Kuster B, Superti-Furga G. (2004) A

physical and functional map of the human TNF-alpha/NF-kappa B signal transduction

pathway. Nat Cell Biol. 6:97-105.

Boveris A, Oshino N, Chance B. (1972) The cellular production of hydrogen peroxide.

Biochem J. 128:617-30.

Bowers JL, Randell JC, Chen S, Bell SP. (2004) ATP hydrolysis by ORC catalyzes

reiterative Mcm2-7 assembly at a defined origin of replication. Mol Cell. 16:967-78.

Bradford HF, Swanson PD, Gammack DB. (1964) Constituents of a microsomal fraction

from the mammalian brain: their solubilization, especially by detergents. Biochem J. 92:247-

54.

Brandner K, Mick DU, Frazier AE, Taylor RD, Meisinger C, Rehling P. (2005) Taz1, an

outer mitochondrial membrane protein, affects stability and assembly of inner membrane

protein complexes: implications for Barth Syndrome. Mol Biol Cell. 2005 Nov;16(11):5202-

14.

Brewer LR, Friddle R, Noy A, Baldwin E, Martin SS, Corzett M, Balhorn R, Baskin RJ.(2003) Packaging of single DNA molecules by the yeast mitochondrial protein Abf2p.

Biophys J. 85:2519-24.

Budd ME, Choe W, Campbell JL. (2000) The nuclease activity of the yeast DNA2 protein,

which is related to the RecB-like nucleases, is essential in vivo. J Biol Chem. 275:16518-29.

Bürckstümmer T, Bennett KL, Preradovic A, Schütze G, Hantschel O, Superti-Furga G, Bauch A. (2006) An efficient tandem affinity purification procedure for interaction

proteomics in mammalian cells. Nat Methods. 3:1013-9.

Burgers PM. (1998) Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair.

Chromosoma. 107:218-27.

Burgers PM, Koonin EV, Bruford E, Blanco L, Burtis KC, Christman MF, Copeland WC, Friedberg EC, Hanaoka F, Hinkle DC, Lawrence CW, Nakanishi M, Ohmori H, Prakash L, Prakash S, Reynaud CA, Sugino A, Todo T, Wang Z, Weill JC, Woodgate R.(2001) Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature. J Biol Chem.

276:43487-90.

Burgers PM. (2009) Polymerase dynamics at the eukaryotic DNA replication fork. J Biol

Chem. 284:4041-5.

Byrnes JJ, Downey KM, Black VL, So AG. (1976) A new mammalian DNA polymerase

with 3' to 5' exonuclease activity: DNA polymerase delta. Biochemistry. 15:2817-23.

Cairns J. (1966) The bacterial chromosome. Sci Am. 214:36-44.

Camacho-Carvajal MM, Wollscheid B, Aebersold R, Steimle V, Schamel WW. (2004)

Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole

cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3:176-82.

Camougrand NM, Cheyrou A, Henry MF, Guérin MG. (1988) The alternative respiratory

pathway of the yeast Candida parapsilosis: oxidation of exogenous NAD(P)H. J Gen

Microbiol. 134:3195-204.

Campuzano V, Montermini L, Moltò MD, Pianese L, Cossée M, Cavalcanti F, Monros E, Rodius F, Duclos F, Monticelli A, Zara F, Cañizares J, Koutnikova H, Bidichandani SI, Gellera C, Brice A, Trouillas P, De Michele G, Filla A, De Frutos R, Palau F, Patel PI, Di Donato S, Mandel JL, Cocozza S, Koenig M, Pandolfo M. (1996) Friedreich's

ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion.

Science. 271:1423-7.

Cantor SB, Bell DW, Ganesan S, Kass EM, Drapkin R, Grossman S, Wahrer DC, Sgroi DC, Lane WS, Haber DA, Livingston DM. (2001) BACH1, a novel helicase-like protein,

interacts directly with BRCA1 and contributes to its DNA repair function. Cell. 105:149-60.

Carbone M, Hauser J, Carty MP, Rundell K, Dixon K, Levine AS. (1992) Simian virus 40

(SV40) small t antigen inhibits SV40 DNA replication in vitro. J Virol. 66:1804-8.

Carrodeguas JA, Bogenhagen DF. (2000) Protein sequences conserved in prokaryotic

aminoacyl-tRNA synthetases are important for the activity of the processivity factor of human

mitochondrial DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 28:1237-44.

Carrodeguas JA, Kobayashi R, Lim SE, Copeland WC, Bogenhagen DF. (1999) The

accessory subunit of Xenopus laevis mitochondrial DNA polymerase gamma increases

processivity of the catalytic subunit of human DNA polymerase gamma and is related to class

II aminoacyl-tRNA synthetases. Mol Cell Biol. 19:4039-46.

Casari G, De Fusco M, Ciarmatori S, Zeviani M, Mora M, Fernandez P, De Michele G, Filla A, Cocozza S, Marconi R, Dürr A, Fontaine B, Ballabio A. (1998) Spastic paraplegia

and OXPHOS impairment caused by mutations in paraplegin, a nuclear-encoded

mitochondrial metalloprotease. Cell. 93:973-83.

Champoux JJ. (2001) DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annu Rev

Biochem. 70:369-413.

Chan SS, Copeland WC. (2009) DNA polymerase gamma and mitochondrial disease:

understanding the consequence of POLG mutations. Biochim Biophys Acta. 1787:312-9.

Chan DC. (2006) Michondrial fusion and fission in mammals. Annu Rev Cell Biol. 22 : 79-

99.

Chan SS, Longley MJ, Copeland WC. (2006) Modulation of the W748S mutation in DNA

polymerase gamma by the E1143G polymorphismin mitochondrial disorders. Hum Mol

Genet. 15:3473-83.

Chang DD, Clayton DA. (1985) Priming of human mitochondrial DNA replication occurs at

the light-strand promoter. EMBO J. 4:1559-67.

Chang LM, Plevani P, Bollum FJ. (1982) Evolutionary conservation of DNA polymerase

beta structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 79:758-61.

Chang TL, Naqvi A, Anand SP, Kramer MG, Munshi R, Khan SA. (2002) Biochemical

characterization of the Staphylococcus aureus PcrA helicase and its role in plasmid rolling

circle replication. J Biol Chem. 277:45880-6.

Chatton B, Walter P, Ebel JP, Lacroute F, Fasiolo F. (1988) The yeast VAS1 gene

encodes both mitochondrial and cytoplasmic valyl-tRNA synthetases. J Biol Chem. 263:52-7.

Chevrollier A, Guillet V, Loiseau D, Gueguen N, de Crescenzo MA, Verny C, Ferre M, Dollfus H, Odent S, Milea D, Goizet C, Amati-Bonneau P, Procaccio V, Bonneau D, Reynier P. (2008) Hereditary optic neuropathies share a common mitochondrial coupling

defect. Ann Neurol. 63:794-8.

Chien A, Edgar DB, Trela JM. (1976) Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme

thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol. 127:1550-7.

Chiu MI, Mason TL, Fink GR. (1992) HTS1 encodes both the cytoplasmic and

mitochondrial histidyl-tRNA synthetase of Saccharomyces cerevisiae: mutations alter the

specificity of compartmentation. Genetics. 132:987-1001.

Christianson T, Rabinowitz M. (1983) Identification of multiple transcriptional initiation

sites on the yeast mitochondrial genome by in vitro capping with guanylyltransferase. J Biol

Chem. 258:14025-33.

Claros MG, Vincens P. (1996) Computational method to predict mitochondrially imported

proteins and their targeting sequences. Eur J Biochem. 241:779-86.

Coleman MS, Hutton JJ, Bollum FJ. (1974) Terminal deoxynucleotidyl transferase and

DNA polymerase in classes of cells from rat thymus. Biochem Biophys Res Commun.

58:1104-9.

Copeland W. C., Wachsman J. T., Johnson F. M., Penta J. S. (2002) Mitochondrial DNA

alterations in cancer. Cancer Invest. 20:557-69.

Costa RM, Chiganças V, Galhardo Rda S, Carvalho H, Menck CF. (2003) The eukaryotic

nucleotide excision repair pathway. Biochimie. 85:1083-99.

Dairaghi DJ, Shadel GS, Clayton DA. (1995) Human mitochondrial transcription factor A

and promoter spacing integrity are required for transcription initiation. Biochim Biophys

Acta. 1271:127-34.

Dake E, Hofmann TJ, McIntire S, Hudson A, Zassenhaus HP. (1988) Purification and

properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. J Biol

Chem. 263:7691-702.

De A, Campbell C. (2007) A novel interaction between DNA ligase III and DNA polymerase

gamma plays an essential role in mitochondrial DNA stability. Biochem J. 402:175-86.

De Lucia P, Cairns J. (1969) Isolation of an E. coli strain with a mutation affecting DNA

polymerase. Nature. 224:1164-6.

Delettre C, Lenaers G, Griffoin JM, Gigarel N, Lorenzo C, Belenguer P, Pelloquin L, Grosgeorge J, Turc-Carel C, Perret E, Astarie-Dequeker C, Lasquellec L, Arnaud B, Ducommun B, Kaplan J, Hamel CP. (2000) Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial

dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26:207-10.

de Grey AD. (2005) Forces maintaining organellar genomes: is any as strong as genetic code

disparity or hydrophobicity? Bioessays. 27:436-46.

De Meirleir L, Seneca S, Lissens W, De Clercq I, Eyskens F, Gerlo E, Smet J, Van Coster R. (2004) Respiratory chain complex V deficiency due to a mutation in the assembly

gene ATP12. J Med Genet. 41:120-4.

Deng H, Dodson MW, Huang H, Guo M. (2008) The Parkinson's disease genes pink1 and

parkin promote mitochondrial fission and/or inhibit fusion in Drosophila. Proc Natl Acad Sci

U S A. 105:14503-8.

de Souza DJ, Bézier A, Depoix D, Drezen JM, Lenoir A. (2009) Blochmannia

endosymbionts improve colony growth and immune defence in the ant Camponotus fellah.

BMC Microbiol. 9 : 29.

de Zamaroczy M, Baldacci G, Bernardi G. (1979) Putative origins of replication in the

mitochondrial genome of yeast. FEBS Lett. 108:429-32.

de Zamaroczy M, Faugeron-Fonty G, Baldacci G, Goursot R, Bernardi G. (1984) The ori

sequences of the mitochondrial genome of a wild-type yeast strain: number, location,

orientation and structure. Gene. 32:439-57.

Diekert K, de Kroon AI, Ahting U, Niggemeyer B, Neupert W, de Kruijff B, Lill R.(2001) Apocytochrome c requires the TOM complex for translocation across the

mitochondrial outer membrane. EMBO J. 20:5626-35.

Diekert K, Kispal G, Guiard B, Lill R. (1999) An internal targeting signal directing proteins

into the mitochondrial intermembrane space. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:11752-7.

Domínguez O, Ruiz JF, Laín de Lera T, García-Díaz M, González MA, Kirchhoff T, Martínez-A C, Bernad A, Blanco L. (2000) DNA polymerase mu (Pol mu), homologous to

TdT, could act as a DNA mutator in eukaryotic cells. EMBO J. 19:1731-42.

Donahue SL, Corner BE, Bordone L, Campbell C. (2001) Mitochondrial DNA ligase

function in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 29:1582-9.

Driggers WJ, Grishko VI, LeDoux SP, Wilson GL. (1996) Defective repair of oxidative

damage in the mitochondrial DNA of a xeroderma pigmentosum group A cell line. Cancer

Res. 56:1262-6.

Dua R, Levy DL, Campbell JL. (1998) Role of the putative zinc finger domain of

Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase epsilon in DNA replication and the S/M

checkpoint pathway. J Biol Chem. 273:30046-55.

Dulaney JT. (1978) Binding interactions of glycoproteins with lectins. Mol Cell Biochem.

21:43-63.

Dunn PP, Stephens PJ, Shirley MW. (1998) Eimeria tenella: two species of

extrachromosomal DNA revealed by pulsed-field gel electrophoresis. Parasitol Res. 84:272-5.

Edman P, Begg G. (1967) A protein sequenator. Eur J Biochem. 1:80-91.

Edwards JC, Osinga KA, Christianson T, Hensgens LA, Janssens PM, Rabinowitz M, Tabak HF. (1983) Initiation of transcription of the yeast mitochondrial gene coding for

ATPase subunit 9. Nucleic Acids Res. 11:8269-82.

Eide L, Bjørås M, Pirovano M, Alseth I, Berdal KG, Seeberg E. (1996) Base excision of

oxidative purine and pyrimidine DNA damage in Saccharomyces cerevisiae by a DNA

glycosylase with sequence similarity to endonuclease III from Escherichia coli. Proc Natl

Acad Sci U S A. 93:10735-40.

Eilers M, Oppliger W, Schatz G. (1987) Both ATP and an energized inner membrane are

required to import a purified precursor protein into mitochondria. EMBO J. 6:1073-7.

Elleuch N, Depienne C, Benomar A, Hernandez AM, Ferrer X, Fontaine B, Grid D, Tallaksen CM, Zemmouri R, Stevanin G, Durr A, Brice A. (2006) Mutation analysis of

the paraplegin gene (SPG7) in patients with hereditary spastic paraplegia. Neurology. 66:654-

9.

Emerit I, Keck M, Levy A, Feingold J, Michelson AM. (1982) Activated oxygen species at

the origin of chromosome breakage and sister-chromatid exchanges. Mutat Res. 103:165-72.

Evanics F, Maurmann L, Yang WW, Bose RN. (2003) Nuclear magnetic resonance

structures of the zinc finger domain of human DNA polymerase-alpha. Biochim Biophys

Acta. 1651:163-71.

Evans MD, Dizdaroglu M, Cooke MS. (2004) Oxidative DNA damage and disease:

induction, repair and significance. Mutat Res. 567 : 1-61.

Falkenberg M, Lehman IR, Elias P. (2000) Leading and lagging strand DNA synthesis in

vitro by a reconstituted herpes simplex virus type 1 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A.

97:3896-900.

Fan L, Kaguni LS. (2001) Multiple regions of subunit interaction in Drosophila

mitochondrial DNA polymerase: three functional domains in the accessory subunit.

Biochemistry. 40:4780-91.

Fan L, Sanschagrin PC, Kaguni LS, Kuhn LA. (1999) The accessory subunit of mtDNA

polymerase shares structural homology with aminoacyl-tRNA synthetases: implications for a

dual role as a primer recognition factor and processivity clamp. Proc Natl Acad Sci U S A.

96:9527-32.

Faugeron-Fonty G, Le Van Kim C, de Zamaroczy M, Goursot R, Bernardi G. (1984) A

comparative study of the ori sequences from the mitochondrial genomes of twenty wild-type

yeast strains. Gene. 32:459-73.

Feng L, Wang B, Driscoll B, Jong A. (2000) Identification and characterization of

Saccharomyces cerevisiae Cdc6 DNA-binding properties. Mol Biol Cell. 11:1673-85.

Ferreirinha F, Quattrini A, Pirozzi M, Valsecchi V, Dina G, Broccoli V, Auricchio A, Piemonte F, Tozzi G, Gaeta L, Casari G, Ballabio A, Rugarli EI. (2004) Axonal

degeneration in paraplegin-deficient mice is associated with abnormal mitochondria and

impairment of axonal transport. J Clin Invest. 113:231-42.

Fields S, Song O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions.

Nature. 340:245-6.

Fiers W, Contreras R, Haegemann G, Rogiers R, Van de Voorde A, Van Heuverswyn H, Van Herreweghe J, Volckaert G, Ysebaert M. (1978) Complete nucleotide sequence of

SV40 DNA. Nature. 273:113-20.

Fisher CA, Wang J, Francis GA, Sykes BD, Kay CM, Ryan RO. (1997) Bacterial

overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human

apolipoprotein E. Biochem Cell Biol. 75:45-53.

Focher, F., Gassmann M., Hafkemeyer P., Ferrari E., Spadari S., Hübscher U. (1989).

Calf thymus DNA polymerase !"independent of proliferating cell nuclear antigen (PCNA).

Nucl. Acids Res. 17:1805-1821.

Formstecher E, Aresta S, Collura V, Hamburger A, Meil A, Trehin A, Reverdy C, Betin V, Maire S, Brun C, Jacq B, Arpin M, Bellaiche Y, Bellusci S, Benaroch P, Bornens M, Chanet R, Chavrier P, Delattre O, Doye V, Fehon R, Faye G, Galli T, Girault JA, Goud B, de Gunzburg J, Johannes L, Junier MP, Mirouse V, Mukherjee A, Papadopoulo D, Perez F, Plessis A, Rossé C, Saule S, Stoppa-Lyonnet D, Vincent A, White M, Legrain P, Wojcik J, Camonis J, Daviet L. (2005) Protein interaction mapping: a Drosophila case

study. Genome Res. 15:376-84.

Foury F. (1989) Cloning and sequencing of the nuclear gene MIP1 encoding the catalytic

subunit of the yeast mitochondrial DNA polymerase. J Biol Chem. 264:20552-60.

Foury F, Kolodynski J. (1983) pif mutation blocks recombination between mitochondrial

rho+ and rho- genomes having tandemly arrayed repeat units in Saccharomyces cerevisiae.

Proc Natl Acad Sci U S A. 80:5345-9.

Foury F, Roganti T, Lecrenier N, Purnelle B. (1998) The complete sequence of the

mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 440:325-31.

Foury F, Vanderstraeten S. (1992) Yeast mitochondrial DNA mutators with deficient

proofreading exonucleolytic activity. EMBO J. 11:2717-26.

Frank S, Gaume B, Bergmann-Leitner ES, Leitner WW, Robert EG, Catez F, Smith CL, Youle RJ. (2001) The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial

fission, in apoptosis. Dev Cell. 1:515-25.

Frezza C, Cipolat S, Martins de Brito O, Micaroni M, Beznoussenko GV, Rudka T, Bartoli D, Polishuck RS, Danial NN, De Strooper B, Scorrano L. (2006) OPA1 controls

apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126:177-89.

Friedberg E. C., Gerlach V. L. (1999). Novel DNA polymerases offer clues to the molecular

basis of mutagenesis. Cell. 98:413-6.

Fujita K, Shimazaki N, Ohta Y, Kubota T, Ibe S, Toji S, Tamai K, Fujisaki S, Hayano T, Koiwai O. (2003) Terminal deoxynucleotidyltransferase forms a ternary complex with a

novel chromatin remodeling protein with 82 kDa and core histone. Genes Cells. 8:559-71.

Gagnon P, Cheung CW, Yazaki PJ. (2009) Cooperative multimodal retention of IgG,

fragments, and aggregates on hydroxyapatite. J Sep Sci. en attente de publication.

Gan GN, Wittschieben JP, Wittschieben BØ, Wood RD. (2008) DNA polymerase zeta (pol

zeta) in higher eukaryotes. Cell Res. 18:174-83.

Garcia-Diaz M, Bebenek K, Krahn JM, Blanco L, Kunkel TA, Pedersen LC. (2004) A

structural solution for the DNA polymerase lambda-dependent repair of DNA gaps with

minimal homology. Mol Cell. 13:561-72.

García-Díaz M, Bebenek K, Kunkel TA, Blanco L. (2001) Identification of an intrinsic 5'-

deoxyribose-5-phosphate lyase activity in human DNA polymerase lambda: a possible role in

base excision repair. J Biol Chem. 276:34659-63.

García-Díaz M, Bebenek K, Sabariegos R, Domínguez O, Rodríguez J, Kirchhoff T, García-Palomero E, Picher AJ, Juárez R, Ruiz JF, Kunkel TA, Blanco L. (2002) DNA

polymerase lambda, a novel DNA repair enzyme in human cells. J Biol Chem. 277:13184-91.

García-Díaz M, Domínguez O, López-Fernández LA, de Lera LT, Saníger ML, Ruiz JF, Párraga M, García-Ortiz MJ, Kirchhoff T, del Mazo J, Bernad A, Blanco L. (2000)

DNA polymerase lambda (Pol lambda), a novel eukaryotic DNA polymerase with a potential

role in meiosis. J Mol Biol. 301:851-67.

Gavin AC, Bösche M, Krause R, Grandi P, Marzioch M, Bauer A, Schultz J, Rick JM, Michon AM, Cruciat CM, Remor M, Höfert C, Schelder M, Brajenovic M, Ruffner H, Merino A, Klein K, Hudak M, Dickson D, Rudi T, Gnau V, Bauch A, Bastuck S, Huhse B, Leutwein C, Heurtier MA, Copley RR, Edelmann A, Querfurth E, Rybin V, Drewes G, Raida M, Bouwmeester T, Bork P, Seraphin B, Kuster B, Neubauer G, Superti-Furga G. (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein

complexes. Nature. 2002 Jan 10;415(6868):141-7.

Gerik KJ, Li X, Pautz A, Burgers PM. (1998) Characterization of the two small subunits of

Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase delta. J Biol Chem. 273:19747-55.

Gerlach VL, Aravind L, Gotway G, Schultz RA, Koonin EV, Friedberg EC. (1999)

Human and mouse homologs of Escherichia coli DinB (DNA polymerase IV), members of

the UmuC/DinB superfamily. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:11922-7.

Gibbs P. E., McGregor W. G., Maher V. M., Nisson P., Lawrence C. W. (1998). A human

homolog of the Saccharomyces cerevisiae REV3 gene, which encodes the catalytic subunit of

DNA polymerase zeta. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 6876-80.

Gibbs PE, McDonald J, Woodgate R, Lawrence CW. (2005) The relative roles in vivo of

Saccharomyces cerevisiae Pol eta, Pol zeta, Rev1 protein and Pol32 in the bypass and

mutation induction of an abasic site, T-T (6-4) photoadduct and T-T cis-syn cyclobutane

dimer. Genetics. 169:575-82.

Gilfillan S, Dierich A, Lemeur M, Benoist C, Mathis D. (1993) Mice lacking TdT: mature

animals with an immature lymphocyte repertoire. Science. 261:1175-8. Erratum in: Science

262:1957.

Giot L, Bader JS, Brouwer C, Chaudhuri A, Kuang B, Li Y, Hao YL, Ooi CE, Godwin B, Vitols E, Vijayadamodar G, Pochart P, Machineni H, Welsh M, Kong Y, Zerhusen B, Malcolm R, Varrone Z, Collis A, Minto M, Burgess S, McDaniel L, Stimpson E, Spriggs F, Williams J, Neurath K, Ioime N, Agee M, Voss E, Furtak K, Renzulli R, Aanensen N, Carrolla S, Bickelhaupt E, Lazovatsky Y, DaSilva A, Zhong J, Stanyon CA, Finley RL Jr, White KP, Braverman M, Jarvie T, Gold S, Leach M, Knight J, Shimkets RA, McKenna MP, Chant J, Rothberg JM. (2003) A protein interaction map of Drosophila

melanogaster. Science. 302:1727-36.

Gloeckner CJ, Boldt K, Schumacher A, Roepman R, Ueffing M. (2007) A novel tandem

affinity purification strategy for the efficient isolation and characterisation of native protein

complexes. Proteomics. 7:4228-34.

Goto T, Laipis P, Wang JC. (1984) The purification and characterization of DNA

topoisomerases I and II of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 259:10422-9.

Gray MW, Burger G, Lang BF. (1999) Mitochondrial evolution. Science. 283:1476-81.

Graziewicz MA, Longley MJ, Copeland WC. (2006) DNA polymerase gamma in

mitochondrial DNA replication and repair. Chem Rev. 106:383-405.

Green DR, Kroemer G. (2004) The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science.

305:626-9.

Griffiths AJ. (1995) Natural plasmids of filamentous fungi. Microbiol Rev. 59:673-85.

Grivell LA. (1995) Nucleo-mitochondrial interactions in mitochondrial gene expression. Crit

Rev Biochem Mol Biol. 30:121-64.

Gros MF, te Riele H, Ehrlich SD. (1987) Rolling circle replication of single-stranded DNA

plasmid pC194. EMBO J. 6:3863-9.

Grulich-Henn J, Spiess S, Heinrich U, Schönberg D, Bettendorf M. (1998) Ligand blot

analysis of insulin-like growth factor-binding proteins using biotinylated insulin-like growth

factor-I. Horm Res. 49:1-7.

Gu H, Marth JD, Orban PC, Mossmann H, Rajewsky K. (1994) Deletion of a DNA

polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science.

265103-6.

Guo C, Kosarek-Stancel JN, Tang TS, Friedberg EC. (2009) Y-family DNA polymerases

in mammalian cells. Cell Mol Life Sci. 66:2363-81.

Guo C, Sonoda E, Tang TS, Parker JL, Bielen AB, Takeda S, Ulrich HD, Friedberg EC. (2006) REV1 protein interacts with PCNA: significance of the REV1 BRCT domain in vitro

and in vivo. Mol Cell. 23:265-71.

Hager GL, Holland MJ, Rutter WJ. (1977) Isolation of ribonucleic acid polymerases I, II,

and III from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 16:1-8.

Hakonen AH, Heiskanen S, Juvonen V, Lappalainen I, Luoma PT, Rantamaki M, Goethem GV, Lofgren A, Hackman P, Paetau A, Kaakkola S, Majamaa K, Varilo T, Udd B, Kaariainen H, Bindoff LA, Suomalainen A. (2005) Mitochondrial DNA

polymerase W748S mutation: a common cause of autosomal recessive ataxia with ancient

European origin. Am J Hum Genet. 77:430-41.

Halliwell B, Gutteridge JM. (1990) Role of free radicals and catalytic metal ions in human

disease: an overview. Methods Enzymol. 186:1-85.

Halmer L, Gruss C. (1997) Accessibility to topoisomerases I and II regulates the replication

efficiency of simian virus 40 minichromosomes. Mol Cell Biol. 17:2624-30.

Handa H. (2008) Linear plasmids in plant mitochondria: peaceful coexistences or malicious

invasions? Mitochondrion. 8:15-25.

Hansen AB, Griner NB, Anderson JP, Kujoth GC, Prolla TA, Loeb LA, Glick E. (2006)

Mitochondrial DNA integrity is not dependent on DNA polymerase-beta activity. DNA

Repair (Amst). 5:71-9.

Haracska L, Johnson RE, Unk I, Phillips B, Hurwitz J, Prakash L, Prakash S. (2001)

Physical and functional interactions of human DNA polymerase eta with PCNA. Mol Cell

Biol. 21:7199-206.

Haracska L, Johnson RE, Prakash L, Prakash S. (2005) Trf4 and Trf5 proteins of

Saccharomyces cerevisiae exhibit poly(A) RNA polymerase activity but no DNA polymerase

activity. Mol Cell Biol. 25:10183-9.

Haracska L, Prakash S, Prakash L. (2002) Yeast Rev1 protein is a G template-specific

DNA polymerase. J Biol Chem. 277:15546-51.

Harris PV, Mazina OM, Leonhardt EA, Case RB, Boyd JB, Burtis KC. (1996) Molecular

cloning of Drosophila mus308, a gene involved in DNA cross-link repair with homology to

prokaryotic DNA polymerase I genes. Mol Cell Biol. 16:5764-71.

Hashiguchi K, Stuart JA, de Souza-Pinto NC, Bohr VA. (2004) The C-terminal alphaO

helix of human Ogg1 is essential for 8-oxoguanine DNA glycosylase activity: the

mitochondrial beta-Ogg1 lacks this domain and does not have glycosylase activity. Nucleic

Acids Res. 32:5596-608.

Hedges LM, Brownlie JC, O’Neill SL, Johnson KN. (2008) Wolbachia and virus protection

in insects. Science. 322:702.

Hirano Y, Sugimoto K. (2006) ATR homolog Mec1 controls association of DNA

polymerase zeta-Rev1 complex with regions near a double-strand break. Curr Biol. 16:586-

90.

Hishida T, Iwasaki H, Ohno T, Morishita T, Shinagawa H. (2001) A yeast gene, MGS1,

encoding a DNA-dependent AAA(+) ATPase is required to maintain genome stability. Proc


Holland HD. (2006) The oxygenation of the atmosphere and oceans. Philos Trans R Soc

Lond B Biol Sci. 361 : 903-915.

Hollenbeck PJ, Saxton WM. (2005) The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci.

118:5411-9.

Hori A, Yoshida M, Shibata T, Ling F. (2009) Reactive oxygen species regulate DNA copy

number in isolated yeast mitochondria by triggering recombination-mediated replication.

Nucleic Acids Res. 37:749-61.

Houseley J, Tollervey D. (2006) Yeast Trf5p is a nuclear poly(A) polymerase. EMBO Rep.

7:205-11.

Houstek J, Pícková A, Vojtísková A, Mrácek T, Pecina P, Jesina P. (2006) Mitochondrial

diseases and genetic defects of ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1757:1400-5.

Houstek J, Mrácek T, Vojtísková A, Zeman J. (2004) Mitochondrial diseases and ATPase

defects of nuclear origin. Biochim Biophys Acta. 1658:115-21.

Huse K, Böhme HJ, Scholz GH. (2002) Purification of antibodies by affinity

chromatography. J Biochem Biophys Methods. 51:217-31.

Iborra F, Huet J, Breant B, Sentenac A, Fromageot P. (1979) Identification of two

different RNase H activities associated with yeast RNA polymerase A. J Biol Chem.

254:10920-4.

Insdorf NF, Bogenhagen DF. (1989) DNA polymerase gamma from Xenopus laevis. I. The

identification of a high molecular weight catalytic subunit by a novel DNA polymerase

photolabeling procedure. J Biol Chem. 264:21491-7.

Jacobs HT. (1991) Structural similarities between a mitochondrially encoded polypeptide and

a family of prokaryotic respiratory toxins involved in plasmid maintenance suggest a novel

mechanism for the evolutionary maintenance of mitochondrial DNA. J Mol Evol. 32:333-9.

Jacobs MA, Payne SR, Bendich AJ. (1996) Moving pictures and pulsed-field gel

electrophoresis show only linear mitochondrial DNA molecules from yeasts with linear-

mapping and circular-mapping mitochondrial genomes. Curr Genet. 30:3-11.

Jazwinski SM, Edelman GM. (1984) Evidence for participation of a multiprotein complex

in yeast DNA replication in vitro.J Biol Chem. 259:6852-7.

Jendrach M, Mai S, Pohl S, Vöth M, Bereiter-Hahn. (2008) Short- and long-term

alterations of mitochondrial morphology, dynamics and mtDNA after transient oxidative

stress. Mitochondrion. 8 : 293-304.

Johnston EB, Lewis PJ, Griffith R. (2009) The interaction of Bacillus subtilis sigmaA with

RNA polymerase. Protein Sci. 18:2287-97.

Jordan DB, Chollet R. (1985) Subunit dissociation and reconstitution of ribulose-1,5-

bisphosphate carboxylase from Chromatium vinosum. Arch Biochem Biophys. 236:487-96.

Jun SH, Kim TG, Ban C. (2006) DNA mismatch repair system. Classical and fresh roles.

FEBS J. 273:1609-19.

Juneau K, Nislow C, Davis RW. (2009) Alternative splicing of PTC7 in Saccharomyces

cerevisiae determines protein localization. Genetics. 183:185-94.

Kadaba S, Krueger A, Trice T, Krecic AM, Hinnebusch AG, Anderson J. (2004) Nuclear

surveillance and degradation of hypomodified initiator tRNAMet in S. cerevisiae. Genes Dev.

18:1227-40.

Kaguni LS. (2004) DNA polymerase gamma, the mitochondrial replicase. Annu Rev

Biochem. 73:293-320.

Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetski! SI. (1980) Isolation and properties of DNA

polymerase from extreme thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1. Biokhimiia.

45:644-51.

Kalous M, Drahota Z. (1996) The role of mitochondria in aging. Physiol Res. 45:351-9.

Kalra J, Brosnan JT. (1974) The subcellular localization of glutaminase isoenzymes in rat

kidney cortex. J Biol Chem. 249:3255-60.

Kaltenbach LS, Romero E, Becklin RR, Chettier R, Bell R, Phansalkar A, Strand A, Torcassi C, Savage J, Hurlburt A, Cha GH, Ukani L, Chepanoske CL, Zhen Y, Sahasrabudhe S, Olson J, Kurschner C, Ellerby LM, Peltier JM, Botas J, Hughes RE.(2007) Huntingtin interacting proteins are genetic modifiers of neurodegeneration. PLoS

Genet. 3:e82.

Kang D, Miyako K, Kai Y, Irie T, Takeshige K. (1997) In vivo determination of replication

origins of human mitochondrial DNA by ligation-mediated polymerase chain reaction. J Biol

Chem. 272:15275-9.

Kannouche P, Broughton BC, Volker M, Hanaoka F, Mullenders LH, Lehmann AR.(2001) Domain structure, localization, and function of DNA polymerase eta, defective in

xeroderma pigmentosum variant cells. Genes Dev. 15:158-72.

Kannouche P, Fernández de Henestrosa AR, Coull B, Vidal AE, Gray C, Zicha D, Woodgate R, Lehmann AR. (2002) Localization of DNA polymerases eta and iota to the

replication machinery is tightly co-ordinated in human cells. EMBO J. 21:6246-56.

Karniely S, Pines O. (2005) Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein

targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6:420-5.

Kaufman BA, Newman SM, Hallberg RL, Slaughter CA, Perlman PS, Butow RA. (2000)

In organello formaldehyde crosslinking of proteins to mtDNA: identification of bifunctional

proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:7772-7.

Kempken F. (1989) A tRNA-like structure from a linear plasmid of the fungus Ascobolus

immersus. Nucleic Acids Res. 17:6740.

Kessel D, Conley M, Vicente MG, Reiners JJ. (2005) Studies on the subcellular localization

of the porphycene CPO. Photochem Photobiol. 81:569-72.

Kesti T, Flick K, Keränen S, Syväoja JE, Wittenberg C. (1999) DNA polymerase epsilon

catalytic domains are dispensable for DNA replication, DNA repair, and cell viability. Mol

Cell. 3:679-85.

Kim SH, Chi JG. (1997) Characterization of a mitochondrial DNA deletion in patients with

mitochondrial myopathy. Mol Cells. 7:726-9.

Kimball SR, Heinzinger NK, Horetsky RL, Jefferson LS. (1998) Identification of

interprotein interactions between the subunits of eukaryotic initiation factors eIF2 and eIF2B.

J Biol Chem. 273:3039-44.

Kleff S, Kemper B, Sternglanz R. (1992) Identification and characterization of yeast

mutants and the gene for a cruciform cutting endonuclease. EMBO J. 11:699-704.

Klingbeil MM, Motyka SA, Englund PT. (2002) Multiple mitochondrial DNA polymerases

in Trypanosoma brucei. Mol Cell. 10:175-86.

Klinge S, Núñez-Ramírez R, Llorca O, Pellegrini L. (2009) 3D architecture of DNA Pol

alpha reveals the functional core of multi-subunit replicative polymerases. EMBO J. 28:1978-

87.

Knippers R. (1970) DNA polymerase II. Nature. 228:1050-3.

Koenig M, Mandel JL. (1997) Deciphering the cause of Friedreich ataxia. Curr Opin

Neurobiol. 7:689-94.

Korhonen JA, Gaspari M, Falkenberg M. (2003) TWINKLE Has 5' -> 3' DNA helicase

activity and is specifically stimulated by mitochondrial single-stranded DNA-binding protein.

J Biol Chem. 278:48627-32.

Korhonen JA, Pham XH, Pellegrini M, Falkenberg M. (2004) Reconstitution of a minimal

mtDNA replisome in vitro. EMBO J. 23:2423-9.

Kornberg A, Backer TA. (1992) DNA replication. 2nd. W.H.Freeman, New York.

Kornberg T, Gefter ML. (1971) Purification and DNA synthesis in cell-free extracts:

properties of DNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 68:761-4.

Kornberg T, Gefter ML. (1972) Deoxyribonucleic acid synthesis in cell-free extracts. IV.

Purification and catalytic properties of deoxyribonucleic acid polymerase III. J Biol Chem.

247:5369-75.

Kovác L, Lazowska J, Slonimski PP. (1984) A yeast with linear molecules of mitochondrial

DNA. Mol Gen Genet. 197:420-4.

Kucharczyk R, Rak M, di Rago JP. (2009) Biochemical consequences in yeast of the

human mitochondrial DNA 8993T>C mutation in the ATPase6 gene found in NARP/MILS

patients. Biochim Biophys Acta. 1793:817-24.

Kump LR. (2008) The rise of atmosphere oxygen. Nature. 448 : 1033-1036.

Kyriakidis D, Georgatsos JG. (1975) Complex formation between nuclear RNA and

mitochondrial proteins. Nucleic Acids Res. 2:1579-90.

LaCount DJ, Vignali M, Chettier R, Phansalkar A, Bell R, Hesselberth JR, Schoenfeld LW, Ota I, Sahasrabudhe S, Kurschner C, Fields S, Hughes RE. (2005) A protein

interaction network of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 438:103-7.

Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature. 227:680-5.

Lahaye A, Stahl H, Thines-Sempoux D, Foury F. (1991) PIF1: a DNA helicase in yeast

mitochondria. EMBO J. 10:997-1007.

Lang BF, Burger G, O'Kelly CJ, Cedergren R, Golding GB, Lemieux C, Sankoff D, Turmel M, Gray MW. (1997) An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial

genome in miniature. Nature. 387:493-7.

Langdon RG. (1966) Glucose 6-phosphate dehydrogenase from erythrocytes Methods

Enzymol. 9:126–131.

Lawrence CW, Das G, Christensen RB. (1985) REV7, a new gene concerned with UV

mutagenesis in yeast. Mol Gen Genet. 200:80-5.

Lawrence CW, Maher VM. (2001) Eukaryotic mutagenesis and translesion replication

dependent on DNA polymerase zeta and Rev1 protein. Biochem Soc Trans. 29:187-91.

Lawrence CW, O'Brien T, Bond J. (1984) UV-induced reversion of his4 frameshift

mutations in rad6, rev1, and rev3 mutants of yeast. Mol Gen Genet. 195:487-90.

Lecrenier N, Foury F. (2000) New features of mitochondrial DNA replication system in

yeast and man. Gene. 246:37-48.

Lee H. C., Wei Y. H. (2001) Mitochondrial alterations, cellular response to oxidative stress

and defective degradation of proteins in aging. Biogerontology. 2:231-44.

Lee CM, Sedman J, Neupert W, Stuart RA. (1999) The DNA helicase, Hmi1p, is

transported into mitochondria by a C-terminal cleavable targeting signal. J Biol Chem.

274:20937-42.

Lee MY, Tan CK, So AG, Downey KM. (1980) Purification of deoxyribonucleic acid

polymerase delta from calf thymus: partial characterization of physical properties.


Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A. (1958) Enzymatic synthesis of

deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from

Escherichia coli. J Biol Chem. 1958 233:163-70. (a).

Lehman IR, Zimmerman SB, Adler J, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A. (1958)

Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. V. Chemical composition of enzymatically

synthesized deoxyribonucleic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 44:1191-6. (b)

Lemasters JJ, Theruvath TP, Zhong Z, Nieminen AL. (2009) Mitochondrial calcium and

the permeability transition in cell death. Biochim Biophys Acta. 1787:1395-401.

Lentze N, Auerbach D. (2008) The yeast two-hybrid system and its role in drug discovery.

Expert Opin Ther Targets. 12:505-15.

Letellier T, Heinrich R, Malgat M, Mazat JP. (1994) The kinetic basis of threshold effects

observed in mitochondrial diseases: a systemic approach. Biochem J. 302:171-4.

Leulliot N, Cladière L, Lecointe F, Durand D, Hübscher U, van Tilbeurgh H. (2009) The

family X DNA polymerase from Deinococcus radiodurans adopts a non-standard extended

conformation. J Biol Chem. 284:11992-9.

Levens D, Lustig A, Rabinowitz M. (1981) Purification of mitochondrial RNA polymerase

from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 256:1474-81.

Li C, Goodchild J, Baril EF. (1994) DNA ligase I is associated with the 21 S complex of

enzymes for DNA synthesis in HeLa cells. Nucleic Acids Res. 22:632-8.

Li JJ, Kelly TJ. (1984) Simian virus 40 DNA replication in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A.

81:6973-7.

Li Y, Asahara H, Patel VS, Zhou S, Linn S. (1997) Purification, cDNA cloning, and gene

mapping of the small subunit of human DNA polymerase epsilon. J Biol Chem. 272:32337-

44.

Lim SE, Longley MJ, Copeland WC. (1999) The mitochondrial p55 accessory subunit of

human DNA polymerase gamma enhances DNA binding, promotes processive DNA

synthesis, and confers N-ethylmaleimide resistance. J Biol Chem. 274:38197-203.

Lin S, Hickey RJ, Malkas LH. (1997) The isolation of a DNA synthesome from human

leukemia cells. Leuk Res. 21:501-12.

Lin W, Wu X, Wang Z. (1999) A full-length cDNA of hREV3 is predicted to encode DNA

polymerase zeta for damage-induced mutagenesis in humans. Mutat Res. 433:89-98.

Ling F, Shibata T. (2002) Recombination-dependent mtDNA partitioning: in vivo role of

Mhr1p to promote pairing of homologous DNA. EMBO J. 21:4730-40.

Ling F, Shibata T. (2004) Mhr1p-dependent concatemeric mitochondrial DNA formation for

generating yeast mitochondrial homoplasmic cells. Mol Biol Cell. 15:310-22.

Lis JT. (1980) Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation.

Methods Enzymol. 65:347-53.

Liu G, Chen X. (2006) DNA polymerase eta, the product of the xeroderma pigmentosum

variant gene and a target of p53, modulates the DNA damage checkpoint and p53 activation.

Mol Cell Biol. 26:1398-413.

Longley MJ, Prasad R, Srivastava DK, Wilson SH, Copeland WC. (1998) Identification

of 5'-deoxyribose phosphate lyase activity in human DNA polymerase gamma and its role in

mitochondrial base excision repair in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 95:12244-8.

Lucas P, Laquel-Robert P, Plissonneau J, Schaeffer J, Tarrago-Litvak L, Castroviejo M.(1997) A second DNA polymerase activity in yeast mitochondria. C R Acad Sci III. 320:299-

305.

Lucas P, Lasserre JP, Plissonneau J, Castroviejo M. (2004) Absence of accessory subunit

in the DNA polymerase gamma purified from yeast mitochondria. Mitochondrion. 4:13-20.

Maga G, Hübscher U. (1996) DNA replication machinery: functional characterization of a

complex containing DNA polymerase alpha, DNA polymerase delta, and replication factor C

suggests an asymmetric DNA polymerase dimer. Biochemistry. 35:5764-77.

Majander A, Lamminen T, Juvonen V, Aula P, Nikoskelainen E, Savontaus ML, Wikström M. (1997) Mutations in subunit 6 of the F1F0-ATP synthase cause two entirely

different diseases. FEBS Lett. 412:351-4.

Maleszka R, Skelly PJ, Clark-Walker GD. (1991) Rolling circle replication of DNA in

yeast mitochondria. EMBO J. 10:3923-9.

Maleszka R, Clark-Walker GD. (1992) In vivo conformation of mitochondrial DNA in

fungi and zoosporic moulds. Curr Genet. 22:341-4.

Malka F, Lombès A, Rojo M. (2006) Organization, dynamics and transmission of

mitochondrial DNA: focus on vertebrate nucleoids. Biochim Biophys Acta. 1763:463-72.

Malkas LH, Hickey RJ, Li C, Pedersen N, Baril EF. (1990) A 21S enzyme complex from

HeLa cells that functions in simian virus 40 DNA replication in vitro. Biochemistry. 29:6362-

74.

Man PY, Turnbull DM, Chinnery PF. (2002) Leber hereditary optic neuropathy. J Med

Genet. 39:162-9.

Manfredi G., Beal M. F. (2000) The role of mitochondria in the pathogenesis of

neurodegenerative diseases. Brain Pathol. 10:462-72.

Margulis L. (1970) Recombination of non-chromosomal genes in Chlamydomonas:

assortment of mitochondria and chloroplasts? J Theor Biol. 26:337-42.

Margulis L. (1971) Symbiosis and evolution. Sci Am. 225:48-57.

Martin FN. (1995) Linear mitochondrial genome organization in vivo in the genus Pythium.

Curr Genet. 28:225-34.

Maynard S, Schurman SH, Harboe C, de Souza-Pinto NC, Bohr VA. (2009) Base

excision repair of oxidative DNA damage and association with cancer and aging.

Carcinogenesis. 30:2-10.

McCulloch SD, Kunkel TA. (2008) The fidelity of DNA synthesis by eukaryotic replicative

and translesion synthesis polymerases. Cell Res. 18:148-61.

McDonald J.P., Levine A.S., Woodgate R. (1997) The Saccharomyces cerevisiae RAD30

gene, a homologue of Escherichia coli dinB and umuC, is DNA damage inducible and

functions in a novel error-free postreplication repair mechanism. Genetics 147:1557-1568.

McDonald JP, Rapi"-Otrin V, Epstein JA, Broughton BC, Wang X, Lehmann AR, Wolgemuth DJ, Woodgate R. (1999) Novel human and mouse homologs of Saccharomyces

cerevisiae DNA polymerase eta. Genomics. 60:20-30.

McInnis M, O'Neill G, Fossum K, Reagan MS. (2002) Epistatic analysis of the roles of the

RAD27 and POL4 gene products in DNA base excision repair in S. cerevisiae. DNA Repair

(Amst). 1:311-5.

McKenzie M, Lazarou M, Thorburn DR, Ryan MT. (2006) Mitochondrial respiratory

chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361:462-9.

Meeusen S, Nunnari J. (2003) Evidence for a two membrane-spanning autonomous

mitochondrial DNA replisome. J Cell Biol. 163:503-10.

Meunier L, Usherwood YK, Chung KT, Hendershot LM. (2002) A subset of chaperones

and folding enzymes form multiprotein complexes in endoplasmic reticulum to bind nascent

proteins. Mol Biol Cell. 13:4456-69.

Minic Z, Hervé G. (2004) Biochemical and enzymological aspects of the symbiosis between

the deep-sea tubesworm Riftia pachyptila and its bacterial endosymbiont. Eur J Biochem. 271

: 3093-102.

Mirkin SM. (2006) DNA structures, repeat expansions and human hereditary disorders. Curr

Opin Struct Biol. 16:351-8.

Miyakawa I, Aoi H, Sando N, Kuroiwa T. (1984) Fluorescence microscopic studies of

mitochondrial nucleoids during meiosis and sporulation in the yeast, Saccharomyces

cerevisiae. J Cell Sci. 66:21-38.

Mizuno T, Yamagishi K, Miyazawa H, Hanaoka F. (1999) Molecular architecture of the

mouse DNA polymerase alpha-primase complex. Mol Cell Biol. 19:7886-96.

Monti M, Orrù S, Pagnozzi D, Pucci P. (2005) Interaction proteomics. Biosci Rep. 25:45-

56.

Moraes CT, Shanske S, Tritschler HJ, Aprille JR, Andreetta F, Bonilla E, Schon EA, DiMauro S. (1991) mtDNA depletion with variable tissue expression: a novel genetic

abnormality in mitochondrial diseases. Am J Hum Genet. 48:492-501.

Morelli C, Mungall AJ, Negrini M, Barbanti-Brodano G, Croce CM. (1998) Alternative

splicing, genomic structure, and fine chromosome localization of REV3L. Cytogenet Cell

Genet. 83:18-20.

Morland I, Rolseth V, Luna L, Rognes T, Bjørås M, Seeberg E. (2002) Human DNA

glycosylases of the bacterial Fpg/MutM superfamily: an alternative pathway for the repair of

8-oxoguanine and other oxidation products in DNA. Nucleic Acids Res. 30:4926-36.

Morrison A., Christensen R. B., Alley J., Beck A. K., Bernstine E. G., Lemontt J. F., Lawrence C. W. (1989). REV3, a Saccharomyces cerevisiae gene whose function is required

for induced mutagenesis, is predicted to encode a nonessential DNA polymerase. J Bacteriol.

171: 5659-67.

Morten KJ, Ashley N, Wijburg F, Hadzic N, Parr J, Jayawant S, Adams S, Bindoff L, Bakker HD, Mieli-Vergani G, Zeviani M, Poulton J. (2007) Liver mtDNA content

increases during development: a comparison of methods and the importance of age- and

tissue-specific controls for the diagnosis of mtDNA depletion. Mitochondrion. 7:386-95.

Mostoslavsky R, Chua KF, Lombard DB, Pang WW, Fischer MR, Gellon L, Liu P, Mostoslavsky G, Franco S, Murphy MM, Mills KD, Patel P, Hsu JT, Hong AL, Ford E, Cheng HL, Kennedy C, Nunez N, Bronson R, Frendewey D, Auerbach W, Valenzuela D, Karow M, Hottiger MO, Hursting S, Barrett JC, Guarente L, Mulligan R, Demple B, Yancopoulos GD, Alt FW. (2006) Genomic instability and aging-like phenotype in the

absence of mammalian SIRT6. Cell. 124:315-29.

Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. (1986) Specific enzymatic

amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant

Biol. 51:263-73.

Murakumo Y, Ogura Y, Ishii H, Numata S, Ichihara M, Croce CM, Fishel R, Takahashi M. (2001) Interactions in the error-prone postreplication repair proteins hREV1, hREV3, and

hREV7. J Biol Chem. 276:35644-51.

Murthy V, Pasupathy K. (1995) Isolation and characterization of a multienzyme complex

containing DNA replicative enzymes from mitochondria of S. cerevisiae. Multienzyme

complex from yeast mitochondria. Mol Biol Rep. 20:135-41.

Naamati A, Regev-Rudzki N, Galperin S, Lill R, Pines O. (2009) Dual targeting of Nfs1

and discovery of its novel processing enzyme, Icp55. J Biol Chem. 284:30200-8.

Nagley P, Linnane AW. (1972) Cellular regulation of mitochondrial DNA synthesis in

Saccharomyces cerevisiae. Cell Differ. 1:143-8.

Nakai K, Horton P. (1999) PSORT: a program for detecting sorting signals in proteins and

predicting their subcellular localization. Trends Biochem Sci. 24:34-6.

Nakai K, Kanehisa M. (1991) Expert system for predicting protein localization sites in gram-

negative bacteria. Proteins. 11:95-110.

Nass MM. (1995) Precise sequence assignment of replication origin in the control region of

chick mitochondrial DNA relative to 5' and 3' D-loop ends, secondary structure, DNA

synthesis, and protein binding. Curr Genet. 28:401-9.

Natsoulis G, Hilger F, Fink GR. (1986) The HTS1 gene encodes both the cytoplasmic and

mitochondrial histidine tRNA synthetases of S. cerevisiae. Cell. 46:235-43.

Nelson J. R., Lawrence C. W., Hinkle D. C. (1996). Deoxycytidyl transferase activity of

yeast REV1 protein. Nature. 382: 729-31.

Neubauer G, King A, Rappsilber J, Calvio C, Watson M, Ajuh P, Sleeman J, Lamond A, Mann M. (1998) Mass spectrometry and EST-database searching allows characterization of

the multi-protein spliceosome complex. Nat Genet. 20:46-50.

Neupert W. (1997) Protein import into mitochondria. Annu Rev Biochem. 66:863-917.

Nguyen M, Millar DG, Yong VW, Korsmeyer SJ, Shore GC. (1993) Targeting of Bcl-2 to

the mitochondrial outer membrane by a COOH-terminal signal anchor sequence. J Biol

Chem. 268:25265-8.

Nilsen H, Otterlei M, Haug T, Solum K, Nagelhus TA, Skorpen F, Krokan HE. (1997)

Nuclear and mitochondrial uracil-DNA glycosylases are generated by alternative splicing and

transcription from different positions in the UNG gene. Nucleic Acids Res. 25:750-5.

Nielsen-Preiss SM, Low RL. (2000) Identification of a beta-like DNA polymerase activity in

bovine heart mitochondria. Arch Biochem Biophys. 374:229-40.

Northam MR, Robinson HA, Kochenova OV, Shcherbakova PV. (2010) Participation of

DNA Polymerase {zeta} in Replication of Undamaged DNA in Saccharomyces cerevisiae.

Genetics. 184:27-42.

Ogi T, Kato T Jr, Kato T, Ohmori H. (1999) Mutation enhancement by DINB1, a

mammalian homologue of the Escherichia coli mutagenesis protein dinB. Genes Cells. 4:607-

18.

Ogi T, Shinkai Y, Tanaka K, Ohmori H. (2002) Polkappa protects mammalian cells against

the lethal and mutagenic effects of benzo[a]pyrene. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:15548-53.

Ogilvie I, Kennaway NG, Shoubridge EA. (2005) A molecular chaperone for mitochondrial

complex I assembly is mutated in a progressive encephalopathy. J Clin Invest. 115:2784-92.

Ohashi E, Murakumo Y, Kanjo N, Akagi J, Masutani C, Hanaoka F, Ohmori H. (2004)

Interaction of hREV1 with three human Y-family DNA polymerases. Genes Cells. 9:523-31.

Ohtsubo T, Nishioka K, Imaiso Y, Iwai S, Shimokawa H, Oda H, Fujiwara T, Nakabeppu Y. (2000) Identification of human MutY homolog (hMYH) as a repair enzyme

for 2-hydroxyadenine in DNA and detection of multiple forms of hMYH located in nuclei and

mitochondria. Nucleic Acids Res. 28:1355-64.

Ohlendieck K, Riesinger I, Adams V, Krause J, Brdiczka D. (1986) Enrichment and

biochemical characterization of boundary membrane contact sites from rat-liver mitochondria.

Biochim Biophys Acta. 860:672-89.

Oldenburg DJ, Bendich AJ. (1998) The structure of mitochondrial DNA from the liverwort,

Marchantia polymorpha. J Mol Biol. 276:745-58.

Olichon A, Baricault L, Gas N, Guillou E, Valette A, Belenguer P, Lenaers G. (2003)

Loss of OPA1 perturbates the mitochondrial inner membrane structure and integrity, leading

to cytochrome c release and apoptosis. J Biol Chem. 278:7743-6.

Olichon A, Emorine LJ, Descoins E, Pelloquin L, Brichese L, Gas N, Guillou E, Delettre C, Valette A, Hamel CP, Ducommun B, Lenaers G, Belenguer P. (2002) The human

dynamin-related protein OPA1 is anchored to the mitochondrial inner membrane facing the

inter-membrane space. FEBS Lett. 523:171-6.

Okamoto K, Shaw JM. (2005) Mitochondrial morphology and dynamics in yeast and

multicellular eukaryotes. Annu Rev Genet. 39:503-36.

Osinga KA, De Vries E, Van der Horst GT, Tabak HF. (1984) Initiation of transcription in

yeast mitochondria: analysis of origins of replication and of genes coding for a messenger

RNA and a transfer RNA. Nucleic Acids Res. 12:1889-900.

Ostergaard E, Brams P, Westergaard O, Nielsen OF. (1987) Purification and

characterization of an inducible mitochondrial DNA polymerase from Tetrahymena

thermophila. Biochim Biophys Acta. 908:150-7.

Otsuka C, Kunitomi N, Iwai S, Loakes D, Negishi K. (2005) Roles of the polymerase and

BRCT domains of Rev1 protein in translesion DNA synthesis in yeast in vivo. Mutat Res.

578:79-87.

Parker JL, Bielen AB, Dikic I, Ulrich HD. (2007) Contributions of ubiquitin- and PCNA-

binding domains to the activity of Polymerase eta in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids

Res. 35:881-9.

Parsons JL, Zharkov DO, Dianov GL. (2005) NEIL1 excises 3' end proximal oxidative

DNA lesions resistant to cleavage by NTH1 and OGG1. Nucleic Acids Res. 33:4849-56.

Paumard P, Vaillier J, Napias C, Arselin G, Brèthes D, Graves PV, Velours J. (2000)

Environmental study of subunit i, a F(o) component of the yeast ATP synthase. Biochemistry.

39:4199-205.

Pavlov YI, Shcherbakova PV, Kunkel TA. (2001) In vivo consequences of putative active

site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159:47-64.

Pederson T. (1998) The plurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res. 26:3871-6.

Pelletier H, Sawaya MR, Wolfle W, Wilson SH, Kraut J. (1996) Crystal structures of

human DNA polymerase beta complexed with DNA: implications for catalytic mechanism,

processivity, and fidelity. Biochemistry. 35:12742-61.

Phee BK, Shin DH, Cho JH, Kim SH, Kim JI, Lee YH, Jeon JS, Bhoo SH, Hahn TR.(2006) Identification of phytochrome-interacting protein candidates in Arabidopsis thaliana

by co-immunoprecipitation coupled with MALDI-TOF MS. Proteomics. 6:3671-80.

Piskur J. (1988) Transmission of yeast mitochondrial loci to progeny is reduced when nearby

intergenic regions containing ori sequences are deleted. Mol Gen Genet. 214:425-32.

Piskur J. (1989) Respiratory-competent yeast mitochondrial DNAs generated by deleting

intergenic regions. Gene. 81:165-8.

Porteous WK, James AM, Sheard PW, Porteous CM, Packer MA, Hyslop SJ, Melton JV, Pang CY, Wei YH, Murphy MP. (1998) Bioenergetic consequences of accumulating

the common 4977-bp mitochondrial DNA deletion. Eur J Biochem. 257:192-201.

Poynor M, Eckert R, Nussberger S. (2008) Dynamics of the preprotein translocation

channel of the outer membrane of mitochondria. Biophys J. 95:1511-22.

Prakash S, Johnson RE, Prakash L. (2005) Eukaryotic translesion synthesis DNA

polymerases: specificity of structure and function. Annu Rev Biochem. 74:317-53.

Prasad R, Beard WA, Strauss PR, Wilson SH. (1998) Human DNA polymerase beta

deoxyribose phosphate lyase. Substrate specificity and catalytic mechanism. J Biol Chem.

273:15263-70.

Prasad R, Longley MJ, Sharief FS, Hou EW, Copeland WC, Wilson SH. (2009). Human

DNA polymerase theta possesses 5'-dRP lyase activity and functions in single-nucleotide base

excision repair in vitro. Nucleic Acids Res. 37:1868-77.

Prasad R, Widen SG, Singhal RK, Watkins J, Prakash L, Wilson SH. (1993) Yeast open

reading frame YCR14C encodes a DNA beta-polymerase-like enzyme. Nucleic Acids Res.

21:5301-7.

Puig O, Caspary F, Rigaut G, Rutz B, Bouveret E, Bragado-Nilsson E, Wilm M, Séraphin B. (2001) The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of

protein complex purification. Methods. 24:218-29.

Pursell ZF, Kunkel TA. (2008) DNA polymerase epsilon: a polymerase of unusual size (and

complexity). Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 82:101-45.

Rain JC, Selig L, De Reuse H, Battaglia V, Reverdy C, Simon S, Lenzen G, Petel F, Wojcik J, Schächter V, Chemama Y, Labigne A, Legrain P. (2001) The protein-protein

interaction map of Helicobacter pylori. Nature. 409:211-5.

Rak M, Tetaud E, Godard F, Sagot I, Salin B, Duvezin-Caubet S, Slonimski PP, Rytka J, di Rago JP. (2007) Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase

subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J

Biol Chem. 282:10853-64.

Reifschneider NH, Goto S, Nakamoto H, Takahashi R, Sugawa M, Dencher NA, Krause F. (2006) Defining the mitochondrial proteomes from five rat organs in a physiologically

significant context using 2D blue-native/SDS-PAGE. J Proteome Res. 5:1117-32.

Reungpatthanaphong P, Dechsupa S, Meesungnoen J, Loetchutinat C, Mankhetkorn S.(2003) Rhodamine B as a mitochondrial probe for measurement and monitoring of

mitochondrial membrane potential in drug-sensitive and -resistant cells. J Biochem Biophys

Methods. 57:1-16.

Reuven NB, Arad G, Maor-Shoshani A, Livneh Z. (1999) The mutagenesis protein UmuC

is a DNA polymerase activated by UmuD', RecA, and SSB and is specialized for translesion

replication. J Biol Chem. 274:31763-6.

Richardson CC, Inman RB, Kornberg A. (1964) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic

acid. 18. The repair of partially single-stranded DNA templates by DNA polymerase. J Mol

Biol. 9:46-69.

Richter C., Park J. W., Ames B. N. (1988). Normal oxidative damage to mitochondrial and

nuclear DNA is extensive. Proc Natl Acad Sci U S A. 85:6465-7.

Rigaut G, Shevchenko A, Rutz B, Wilm M, Mann M, Séraphin B. (1999) A generic

protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.

Nat Biotechnol. 17:1030-2.

Robin ED, Wong R. (1988) Mitochondrial DNA molecules and virtual number of

mitochondria per cell in mammalian cells. J Cell Physiol. 136:507-13.

Robinson NP, Bell SD. (2005) Origins of DNA replication in the three domains of life. FEBS

J. 272:3757-66.

Rose AM, Joyce PB, Hopper AK, Martin NC. (1992) Separate information required for

nuclear and subnuclear localization: additional complexity in localizing an enzyme shared by

mitochondria and nuclei. Mol Cell Biol. 12:5652-8.

Rual JF, Venkatesan K, Hao T, Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, Li N, Berriz GF, Gibbons FD, Dreze M, Ayivi-Guedehoussou N, Klitgord N, Simon C, Boxem M, Milstein S, Rosenberg J, Goldberg DS, Zhang LV, Wong SL, Franklin G, Li S, Albala JS, Lim J, Fraughton C, Llamosas E, Cevik S, Bex C, Lamesch P, Sikorski RS, Vandenhaute J, Zoghbi HY, Smolyar A, Bosak S, Sequerra R, Doucette-Stamm L, Cusick ME, Hill DE, Roth FP, Vidal M. (2005) Towards a proteome-scale map of the human protein-protein

interaction network. Nature. 437:1173-8.

Ruiz JF, Lucas D, García-Palomero E, Saez AI, González MA, Piris MA, Bernad A, Blanco L. (2004) Overexpression of human DNA polymerase mu (Pol mu) in a Burkitt's

lymphoma cell line affects the somatic hypermutation rate. Nucleic Acids Res. 32:5861-73.

Saito S, Tamura K, Aotsuka T. (2005) Replication origin of mitochondrial DNA in insects.

Genetics. 171:1695-705.

Saitoh S, Chabes A, McDonald WH, Thelander L, Yates JR, Russell P. (2002) Cid13 is a

cytoplasmic poly(A) polymerase that regulates ribonucleotide reductase mRNA. Cell.

109:563-73.

Sandoval JA, Grosfeld JL, Hickey RJ, Malkas LH. (2006) Structural analysis of the human

neuroblastoma DNA replication complex: insights into faulty proliferation. J Pediatr Surg.

41:266-70.

Sandoval JA, Hickey RJ, Malkas LH. (2005) Isolation and characterization of a DNA

synthesome from a neuroblastoma cell line. J Pediatr Surg. 40:1070-7.

Sastre J., Borras C., Garcia-Sala D., Lloret A., Pallardo F. V., Vina J. (2002)

Mitochondrial damage in aging and apoptosis. Ann N Y Acad Sci. 959:448-51.

Saxowsky TT, Choudhary G, Klingbeil MM, Englund PT. (2003) Trypanosoma brucei has

two distinct mitochondrial DNA polymerase beta enzymes. J Biol Chem. 278:49095-101.

Schägger H. (1995) Quantification of oxidative phosphorylation enzymes after blue native

electrophoresis and two-dimensional resolution: normal complex I protein amounts in

arkinson's disease conflict with reduced catalytic activities. Electrophoresis.16:763-70. P

Schägger H. (2001) Blue native gels to isolate protein complexes from mitochondria.

Methods Cell Biol. 65, 231-244.

Schägger H, Pfeiffer K. (2000) Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and

mammalian mitochondria. EMBO J. 19:1777-83.

Schägger H, von Jagow G. (1991) Blue native electrophoresis for isolation of membrane

protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199:223-31.

Schatz G, Dobberstein B. (1996) Common principles of protein translocation across

membranes. Science. 271:1519-26.

Schimmang T, Tollervey D, Kern H, Frank R, Hurt EC. (1989) A yeast nucleolar protein

related to mammalian fibrillarin is associated with small nucleolar RNA and is essential for

viability. EMBO J. 8:4015-24.

Schinkel AH, Tabak HF. (1989) Mitochondrial RNA polymerase: dual role in transcription

and replication. Trends Genet. 5:149-54.

Schinkel AH, Groot Koerkamp MJ, Tabak HF. (1988) Mitochondrial RNA polymerase of

Saccharomyces cerevisiae: composition and mechanism of promoter recognition. EMBO J.

7:3255-62.

Seki M, Marini F, Wood RD. (2003) POLQ (Pol theta), a DNA polymerase and DNA-

dependent ATPase in human cells. Nucleic Acids Res. 31:6117-26.

Seki M, Masutani C, Yang LW, Schuffert A, Iwai S, Bahar I, Wood RD. (2004) High-

efficiency bypass of DNA damage by human DNA polymerase Q. EMBO J. 23:4484-94.

Seligmann H. (2009) Mitochondrial tRNAs as light strand replication origins: Similarity

between anticodon loops and the loop of the light strand replication origin predicts initiation

of DNA replication. Biosystems. E-publicaction

Shachar S, Ziv O, Avkin S, Adar S, Wittschieben J, Reissner T, Chaney S, Friedberg EC, Wang Z, Carell T, Geacintov N, Livneh Z. (2009) Two-polymerase mechanisms

dictate error-free and error-prone translesion DNA synthesis in mammals. EMBO J. 28:383-

93.

Sharief FS, Vojta PJ, Ropp PA, Copeland WC. (1999) Cloning and chromosomal mapping

of the human DNA polymerase theta (POLQ), the eighth human DNA polymerase. Genomics.

59:90-6.

Shimizu K, Santocanale C, Ropp PA, Longhese MP, Plevani P, Lucchini G, Sugino A.(1993) Purification and characterization of a new DNA polymerase from budding yeast

Saccharomyces cerevisiae. A probable homolog of mammalian DNA polymerase beta. J Biol

Chem. 268:27148-53.

Shimizu K, Kawasaki Y, Hiraga S, Tawaramoto M, Nakashima N, Sugino A. (2002) The

fifth essential DNA polymerase phi in Saccharomyces cerevisiae is localized to the nucleolus

and plays an important role in synthesis of rRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:9133-8.

Shivji MK, Podust VN, Hübscher U, Wood RD. (1995) Nucleotide excision repair DNA

synthesis by DNA polymerase epsilon in the presence of PCNA, RFC, and RPA.


Sihag RK, Deutscher MP. (1983) Perturbation of the aminoacyl-tRNA synthetase complex

by salts and detergents. Importance of hydrophobic interactions and possible involvement of

lipids. J Biol Chem. 258:11846-50.

Simmons DT. (2000) SV40 large T antigen functions in DNA replication and transformation.

Adv Virus Res. 55:75-134.

Simpson L. (1987) The mitochondrial genome of kinetoplastid protozoa: genomic

organization, transcription, replication, and evolution. Annu Rev Microbiol. 41:363-82.

Sinclair JH, Stevens BJ. (1966) Circular DNA filaments from mouse mitochondria. Proc


Singh G., Lott M.T., Wallace D.C. (1989) A mitochondrial DNA mutation as a cause of

Leber’s hereditary optic neuropathy. N. Engl. J. Med. 320, 1300–1305.

Smith DR, Lee RW. (2008) Mitochondrial genome of the colorless green alga Polytomella

capuana: a linear molecule with an unprecedented GC content. Mol Biol Evol. 25:487-96.

Sobol RW, Horton JK, Kühn R, Gu H, Singhal RK, Prasad R, Rajewsky K, Wilson SH.(1996) Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair. Nature.

379:183-6.

Spelbrink JN, Li FY, Tiranti V, Nikali K, Yuan QP, Tariq M, Wanrooij S, Garrido N, Comi G, Morandi L, Santoro L, Toscano A, Fabrizi GM, Somer H, Croxen R, Beeson D, Poulton J, Suomalainen A, Jacobs HT, Zeviani M, Larsson C. (2001) Human

mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a

phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nat Genet. 28:223-31.

Stadtman ER. (1992) Protein oxidation and aging. Science. 257:1220-4.

Stelzl U, Worm U, Lalowski M, Haenig C, Brembeck FH, Goehler H, Stroedicke M, Zenkner M, Schoenherr A, Koeppen S, Timm J, Mintzlaff S, Abraham C, Bock N, Kietzmann S, Goedde A, Toksöz E, Droege A, Krobitsch S, Korn B, Birchmeier W, Lehrach H, Wanker EE. (2005) A human protein-protein interaction network: a resource for

annotating the proteome. Cell. 122:957-68.

Stuart RA, Nicholson DW, Neupert W. (1990) Early steps in mitochondrial protein import:

receptor functions can be substituted by the membrane insertion activity of apocytochrome c.

Cell. 60:31-43.

Stuart RA. (2008) Supercomplex organization of the oxidative phosphorylation enzymes in

yeast mitochondria. J Bioenerg Biomembr. 40:411-7.

Stucki M, Pascucci B, Parlanti E, Fortini P, Wilson SH, Hübscher U, Dogliotti E. (1998)

Mammalian base excision repair by DNA polymerases delta and epsilon. Oncogene. 17:835-

43.

Stumpf MP, Thorne T, de Silva E, Stewart R, An HJ, Lappe M, Wiuf C. (2008)

Estimating the size of the human interactome. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:6959-64.

Suen DF, Norris KL, Youle RJ. (2008) Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev.

22:1577-90.

Suter B, Kittanakom S, Stagljar I. (2008) Two-hybrid technologies in proteomics research.

Curr Opin Biotechnol. 19:316-23.

Suyama Y, Miura K. (1968) Size and structure variations of mitochondrial DNA. Proc Natl

Acad Sci U S A. 60:235-242.

Szostak JW, Orr-Weaver TL, Rothstein RJ, Stahl FW. (1983) The double-strand-break

repair model for recombination. Cell. 33:25-35.

Tagwerker C, Flick K, Cui M, Guerrero C, Dou Y, Auer B, Baldi P, Huang L, Kaiser P.(2006) A tandem affinity tag for two-step purification under fully denaturing conditions:

application in ubiquitin profiling and protein complex identification combined with in

vivocross-linking. Mol Cell Proteomics. 5:737-48.

Tang M, Shen X, Frank EG, O'Donnell M, Woodgate R, Goodman MF. (1999)

UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V. Proc Natl Acad Sci U

S A. 96:8919-24.

Taylor SW, Fahy E, Zhang B, Glenn GM, Warnock DE, Wiley S, Murphy AN, Gaucher SP, Capaldi RA, Gibson BW, Ghosh SS. (2003) Characterization of the human heart

mitochondrial proteome. Nat Biotechnol. 21:281-6.

Tell G, Damante G, Caldwell D, Kelley MR. (2005) The intracellular localization of

APE1/Ref-1: more than a passive phenomenon? Antioxid Redox Signal. 7:367-84.

Thakur M, Wernick M, Collins C, Limoli CL, Crowley E, Cleaver JE. (2001) DNA

polymerase eta undergoes alternative splicing, protects against UV sensitivity and apoptosis,

and suppresses Mre11-dependent recombination. Genes Chromosomes Cancer. 32:222-35.

Thoma RS, Smith JS, Sandoval W, Leone JW, Hunziker P, Hampton B, Linse KD, Denslow ND. (2009) The ABRF Edman Sequencing Research Group 2008 Study:

investigation into homopolymeric amino acid N-terminal sequence tags and their effects on

automated Edman degradation. J Biomol Tech. 20:216-25.

Ticho BS, Getz GS. (1988) The characterization of yeast mitochondrial RNA polymerase. A

monomer of 150,000 daltons with a transcription factor of 70,000 daltons. J Biol Chem.

263:10096-103.

Tissier A, Frank EG, McDonald JP, Iwai S, Hanaoka F, Woodgate R. (2000)

Misinsertion and bypass of thymine-thymine dimers by human DNA polymerase iota. EMBO

J. 19:5259-66.

Tissier A, Kannouche P, Reck MP, Lehmann AR, Fuchs RP, Cordonnier A. (2004) Co-

localization in replication foci and interaction of human Y-family members, DNA polymerase

pol eta and REVl protein. DNA Repair (Amst). 3:1503-14.

Torri AF, Englund PT. (1992) Purification of a mitochondrial DNA polymerase from

Crithidia fasciculata. J Biol Chem. 267:4786-92.

Torri AF, Englund PT. (1995) A DNA polymerase beta in the mitochondrion of the

trypanosomatid Crithidia fasciculata. J Biol Chem. 270:3495-7.

Torri AF, Kunkel TA, Englund PT. (1994) A beta-like DNA polymerase from the

mitochondrion of the trypanosomatid Crithidia fasciculata. J Biol Chem. 269:8165-71.

Trowbridge PW, Roy R, Simmons DT. (1999) Human topoisomerase I promotes initiation

of simian virus 40 DNA replication in vitro. Mol Cell Biol. 19:1686-94.

Tseng HM, Tomkinson AE. (2002) A physical and functional interaction between yeast Pol4

and Dnl4-Lif1 links DNA synthesis and ligation in nonhomologous end joining. J Biol Chem.

277:45630-7.

Tsurimoto T, Melendy T, Stillman B. (1990) Sequential initiation of lagging and leading

strand synthesis by two different polymerase complexes at the SV40 DNA replication origin.

Nature. 346:534-9.

Tua A, Wang J, Kulpa V, Wernette CM. (1997) Mitochondrial DNA topoisomerase I of

Saccharomyces cerevisiae. Biochimie. 79:341-50.

Turpen T, Garger SJ, Marks MD, Grill LK. (1987) Molecular cloning and physical

characterization of a Brassica linear mitochondrial plasmid. Mol Gen Genet. 209:227-33.

Tuteja N, Tuteja R. (2001) Unraveling DNA repair in human: molecular mechanisms and

consequences of repair defect. Crit Rev Biochem Mol Biol. 36:261-90.

Uetz P, Giot L, Cagney G, Mansfield TA, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart P, Qureshi-Emili A, Li Y, Godwin B, Conover D, Kalbfleisch T, Vijayadamodar G, Yang M, Johnston M, Fields S, Rothberg JM. (2000) A

comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature.

403:623-7.

Uljon SN, Johnson RE, Edwards TA, Prakash S, Prakash L, Aggarwal AK. (2004)

Crystal structure of the catalytic core of human DNA polymerase kappa. Structure. 12:1395-

404.

Unseld M, Marienfeld JR, Brandt P, Brennicke A. (1997) The mitochondrial genome of

Arabidopsis thaliana contains 57 genes in 366,924 nucleotides. Nat Genet. 15:57-61.

Van Bruggen EF, Borst P, Ruttenberg GJ, Gruber M, Kroon AM. (1966) Circular

mitochondrial DNA. Biochim Biophys Acta. 119:437-9.

Van Goethem G, Dermaut B, Löfgren A, Martin JJ, Van Broeckhoven C. (2001)

Mutation of POLG is associated with progressive external ophthalmoplegia characterized by

mtDNA deletions. Nat Genet. 28:211-2.

Vasilescu J, Guo X, Kast J. (2004) Identification of protein-protein interactions using in

vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4:3845-54.

Velours G, Boucheron C, Manon S, Camougrand N. (2002) Dual cell wall/mitochondria

localization of the ‘SUN’ family proteins. FEMS Microbiol Lett. 207 : 165-72.

Velours J, Guerin B, Duvert M. (1977) Preparation of an inner membrane-matrix fraction

from yeast yeast mitochondria. Arch Biochem Biophys. 182:295-304.

Veltri KL, Espiritu M, Singh G. (1990) Distinct genomic copy number in mitochondria of

different mammalian organs. J Cell Physiol. 143:160-4.

Vidal AE, Kannouche P, Podust VN, Yang W, Lehmann AR, Woodgate R. (2004)

Proliferating cell nuclear antigen-dependent coordination of the biological functions of human

DNA polymerase iota. J Biol Chem. 279:48360-8.

Vidal M, Braun P, Chen E, Boeke JD, Harlow E. (1996) Genetic characterization of a

mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system.

Proc Natl Acad Sci U S A. 93:10321-6.

Vongsamphanh R, Fortier PK, Ramotar D. (2001) Pir1p mediates translocation of the

yeast Apn1p endonuclease into the mitochondria to maintain genomic stability. Mol Cell Biol.

21:1647-55.

Waga S, Stillman B. (1998) The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annu Rev

Biochem. 1998;67:721-51.

Wagner J, Gruz P, Kim SR, Yamada M, Matsui K, Fuchs RP, Nohmi T. (1999) The dinB

gene encodes a novel E. coli DNA polymerase, DNA pol IV, involved in mutagenesis. Mol

Cell. 4:281-6.

Wagner K, Mick DU, Rehling P. (2009) Protein transport machineries for precursor

translocation across the inner mitochondrial membrane. Biochim Biophys Acta. 1793:52-9.

Wallace D. C., Ye J. H., Neckelmann S. N., Singh G., Webster K. A., Greenberg B. D.(1987) Sequence analysis of cDNAs for the human and bovine ATP synthase beta subunit:

mitochondrial DNA genes sustain seventeen times more mutations. Curr Genet. 12:81-90.

Walowsky C, Fitzhugh DJ, Castaño IB, Ju JY, Levin NA, Christman MF. (1999) The

topoisomerase-related function gene TRF4 affects cellular sensitivity to the antitumor agent

camptothecin. J Biol Chem. 274:7302-8.

Wang Y, Kaguni LS. (1999) Baculovirus expression reconstitutes Drosophila mitochondrial

DNA polymerase. J Biol Chem. 274:28972-7.

Wang Z, Castaño IB, Adams C, Vu C, Fitzhugh D, Christman MF. (2002)

Structure/function analysis of the Saccharomyces cerevisiae Trf4/Pol sigma DNA

polymerase. Genetics. 160:381-91.

Wang Z, Castaño IB, De Las Peñas A, Adams C, Christman MF. (2000) Pol kappa: A

DNA polymerase required for sister chromatid cohesion. Science. 289:774-9.

Watson JD, Crick FH. (1953) The structure of DNA. Cold Spring Harb Symp Quant Biol.

1953;18:123-31.

Weinert BT, Rio DC. (2007) DNA strand displacement, strand annealing and strand

swapping by the Drosophila Bloom's syndrome helicase. Nucleic Acids Res. 35:1367-76.

Weiser T, Gassmann M, Thömmes P, Ferrari E, Hafkemeyer P, Hübscher U. (1991)

Biochemical and functional comparison of DNA polymerases alpha, delta, and epsilon from

calf thymus. J Biol Chem. 266:10420-8.

Weissbach A. (1979) The functional roles of mammalian DNA polymerase. Arch Biochem

Biophys. D198:386-96.

Weissbach A, Baltimore D, Bollum F, Gallo R, Korn D. (1975) Nomenclature of

eukaryotic DNA polymerases. Science. 190:401-2.

Weissbach A, Schlabach A, Fridlender B, Bolden A. (1971) DNA polymerases from

human cells. Nat New Biol. 231:167-70.

Wernegreen JJ. (2004) Endosymbiosis : lessons in conflict resolution. Plos Biol. 2 : E68

Wernette CM, Kaguni LS. (1986) A mitochondrial DNA polymerase from embryos of

Drosophila melanogaster. Purification, subunit structure, and partial characterization. J Biol

Chem. 261:14764-70.

Wesolowski M, Fukuhara H. (1981) Linear mitochondrial deoxyribonucleic acid from the

yeast Hansenula mrakii. Mol Cell Biol. 1:387-93.

Westermann B. (2002) Merging mitochondria matters: cellular role and molecular machinery

of mitochondrial fusion.EMBO Rep.3:527-31.

Westermarck J, Weiss C, Saffrich R, Kast J, Musti AM, Wessely M, Ansorge W, Séraphin B, Wilm M, Valdez BC, Bohmann D. (2002) The DEXD/H-box RNA helicase

RHII/Gu is a co-factor for c-Jun-activated transcription. EMBO J. 21:451-60.

Wilkinson PA, Crosby AH, Turner C, Bradley LJ, Ginsberg L, Wood NW, Schapira AH, Warner TT. (2004) A clinical, genetic and biochemical study of SPG7 mutations in

hereditary spastic paraplegia. Brain. 127:973-80.

Willer M, Rainey M, Pullen T, Stirling CJ. (1999) The yeast CDC9 gene encodes both a

nuclear and a mitochondrial form of DNA ligase I. Curr Biol. 9:1085-94.

Williamson D. (2002) The curious history of yeast mitochondrial DNA. Nat Rev Genet.

3:475-81.

Williamson DH, Fennell DJ. (1979) Visualization of yeast mitochondrial DNA with the

fluorescent stain "DAPI". Methods Enzymol. 56:728-33.

Wilson DM 3rd, Bohr VA. (2007) The mechanics of base excision repair, and its

relationship to aging and disease. DNA Repair (Amst). 6:544-59.

Wilson TE, Lieber MR. (1999) Efficient processing of DNA ends during yeast

nonhomologous end joining. Evidence for a DNA polymerase beta (Pol4)-dependent

pathway. J Biol Chem. 274:23599-609.

Wingren C, James P, Borrebaeck CA. (2009) Strategy for surveying the proteome using

affinity proteomics and mass spectrometry. Proteomics. 9:1511-7.

Wintersberger U, Wintersberger E. (1970) Studies on deoxyribonucleic acid polymerases

from yeast. Parial purification and properties of two DNA polymerases from mitochondria-

free cell extracts. Eur J Biochem. 13:11-27.

Wittig I, Braun HP, Schägger H. (2006) Blue native PAGE. Nat Protoc. 1:418-28.

Wittig I, Schägger H. (2008) Features and applications of blue-native and clear-native

electrophoresis. Proteomics. 8:3974-90.

Wold MS. (1997) Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding

protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66:61-92.

Wolfe CL, Lou YC, Hopper AK, Martin NC. (1994) Interplay of heterogeneous

transcriptional start sites and translational selection of AUGs dictate the production of

mitochondrial and cytosolic/nuclear tRNA nucleotidyltransferase from the same gene in yeast.

J Biol Chem. 269:13361-6.

Wong TW, Clayton DA. (1985) Isolation and characterization of a DNA primase from

human mitochondria. J Biol Chem. 260:11530-5.

Wu Y, Li Q, Chen XZ. (2007) Detecting protein-protein interactions by Far western blotting.

Nat Protoc. 2:3278-84.

Xu B, Clayton DA. (1996) RNA-DNA hybrid formation at the human mitochondrial heavy-

strand origin ceases at replication start sites: an implication for RNA-DNA hybrids serving as

primers. EMBO J. 15:3135-43.

Yabu T, Shimuzu A, Yamashita M. (2009) A novel mitochondrial sphingomyelinase in

zebrafish cells. J Biol Chem. 284:20349-63.

Yamaguchi M, Matsukage A, Takahashi T. (1980) Chick embryo DNA polymerase

gamma. Purification and structural analysis of nearly homogeneous enzyme. J Biol Chem.

255:7002-9.

Yamashita N, Shimazaki N, Ibe S, Kaneko R, Tanabe A, Toyomoto T, Fujita K, Hasegawa T, Toji S, Tamai K, Yamamoto H, Koiwai O. (2001) Terminal

deoxynucleotidyltransferase directly interacts with a novel nuclear protein that is homologous

to p65. Genes Cells. 6:641-52.

Yang D, Oyaizu Y, Oyaizu H, Olsen GJ, Woese CR. (1985) Mitochondrial origins. Proc


Yang HC, Pon LA. (2003) Toxicity of metal ions used in dental alloys: a study in the yeast

Saccharomyces cerevisiae. Drug Chem Toxicol. 26:75-85.

Yang W, Rogozin IB, Koonin EV. (2003) Yeast POL5 is an evolutionarily conserved

regulator of rDNA transcription unrelated to any known DNA polymerases. Cell Cycle.

2:120-2.

Yen MY, Wang AG, Wei YH. (2006) Leber's hereditary optic neuropathy: a multifactorial

disease. Prog Retin Eye Res. 25:381-96.

Yeow EK, Clayton AH. (2007) Enumeration of oligomerization states of membrane proteins

in living cells by homo-FRET spectroscopy and microscopy: theory and application. Biophys

J. 92:3098-104.

Yu M, Zhou Y, Shi Y, Ning L, Yang Y, Wei X, Zhang N, Hao X, Niu R. (2007) Reduced

mitochondrial DNA copy number is correlated with tumor progression and prognosis in

Chinese breast cancer patients. IUBMB Life. 59:450-7.

Zhang H, Chatterjee A, Singh KK. (2006) Saccharomyces cerevisiae polymerase zeta

functions in mitochondria. Genetics. 172:2683-8.

Zhang H, Meng LH, Pommier Y. (2007) Mitochondrial topoisomerases and alternative

splicing of the human TOP1mt gene. Biochimie. 89:474-81.

Zhang Y, Yuan F, Wu X, Taylor JS, Wang Z.(2001) Response of human DNA polymerase

iota to DNA lesions. Nucleic Acids Res. 29:928-35

Ziv O, Geacintov N, Nakajima S, Yasui A, Livneh Z. (2009) DNA polymerase zeta

cooperates with polymerases kappa and iota in translesion DNA synthesis across pyrimidine

photodimers in cells from XPV patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:11552-7.

Zlotkin T, Kaufmann G, Jiang Y, Lee MY, Uitto L, Syväoja J, Dornreiter I, Fanning E, Nethanel T. (1996) DNA polymerase epsilon may be dispensable for SV40- but not cellular-

DNA replication. EMBO J. 15:2298-305.

Résumé:

Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le

processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN

polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré

jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie.

Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au

départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à

tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant

donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase !, dans

les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment

de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion

des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette

polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse

biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques

d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été

étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de

colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées

impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les 2 ADN polymérases mitochondriales avec 5 autres

protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa

ou au-delà de 1 MDa.

Abstract:

During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process

involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the

nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved

in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than

preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in

attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord

with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the pol ! in yeast

mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify

it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By

ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion

chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and

hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study

the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins

with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network,

including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I

determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa.

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 - Thèses · DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention...

Documents

Transcript of DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 - Thèses · DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention...