Diversion dirigée du métabolisme cellulaire chez le tabac sauvage

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  • Diversion dirige du mtabolisme cellulaire chez le tabac sauvage Nicotiana benthamiana utilis comme hte pour lexpression htrologue de protines dintrt clinique

    Thse

    Stphanie Robert

    Doctorat en biologie vgtale

    Philosophi doctor (Ph. D.)

    Qubec, Canada

    Stphanie Robert, 2015

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    Rsum

    La molculture vgtale est une alternative abordable et scuritaire pour la production de protines

    recombinantes dintrt clinique. Cependant, ces protines sont souvent sujettes la dgradation par les

    protases endognes dans les cellules vgtales. Plusieurs stratgies ont t mises en place pour contrer ce

    phnomne, incluant notamment la co-expression dinhibiteurs de protases compagnons. Peu de donnes

    ont dcrit toutefois comment la physiologie de la plante hte, associe en particulier son dveloppement,

    a un impact sur lexpression et la protection dune protine dintrt. Dans ce projet, nous avons valu les

    activits de protases de types cystine et aspartate dans des feuilles agroinfiltres de la plante hte

    Nicotiana benthamiana, en fonction de leur stade de dveloppement. Nous dmontrons que lexpression

    de linhibiteur SlCYS8 de tomate, actif contre les protases de type cystine, permet daugmenter

    denviron 40% le rendement en anticorps monoclonal C5-1, notre protine modle, dans les feuilles jeunes

    et matures o les activits protolytiques sont moindres. Ces rsultats prometteurs sur le plan appliqu

    font ressortir, en revanche, la complexit des processus biochimiques en cause et la pertinence de

    dvelopper des stratgies complmentaires pour augmenter les teneurs en protine recombinante. Dans

    cette optique, une nouvelle approche base sur une diversion dirige du mtabolisme de dfense de la

    plante hte a t explore. Nous dmontrons quune activation du sentier de lacide jasmonique induit

    dans les feuilles la production de protines de stress, incluant des inhibiteurs de protases de classes

    fonctionnelles varies; et une diminution de la teneur en RuBisCO, un contaminant majeur pendant la

    purification des protines recombinantes. Sur cette base, nous avons adjoint notre procdure de

    transfection un prtraitement des plantes au jasmonate de mthyle, une forme volatile de lacide

    jasmonique. Ce prtraitement a permis dune part de rduire considrablement les teneurs en RuBisCO

    dans les feuilles, et de doubler dautre part le taux dexpression et le rendement en anticorps C5-1. Nos

    donnes appuient lutilit ventuelle dune manipulation du mtabolisme de dfense sur les rendements en

    protine recombinante, complmentaire aux approches bases sur la co-expression dinhibiteurs de

    protases recombinants.

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    Abstract

    Plant molecular farming is an affordable and safe alternative to conventional expression animal

    and microbial systems for the production of clinically-useful recombinant proteins. However, these

    proteins are often susceptible to degradation by endogenous proteases of the host plant cells. Several

    strategies have been described to counter degradation processes including the co-expression of companion

    protease inhibitors. Few data, however, were available describing how the host plants physiology,

    especially its developmental stage, could impact the expression and protection of a clinically useful

    heterologous protein. In this study, we assessed changes in the activity of cysteine and aspartate proteases

    in the widely adopted expression host Nicotiana benthamiana, as a function of leaf age. We demonstrate

    that the expression of a tomato cysteine protease inhibitor, SlCYS8, allows to increase by nearly 40% the

    total yield of a model protein, the blood-typing C5-1 monoclonal antibody, in young and mature leaves

    where proteolytic activities are lower. Our results, while promising in practice, highlighted on the other

    hand the complexity of biochemical processes involved and the relevance of developing additional

    strategies to boost recombinant protein accumulation in planta. Towards this end, a new approach based

    on a deliberate diversion of the host plant defense metabolism was explored. We show that an activation

    of the jasmonic acid pathway in leaves induces the production of stress-related proteins, including

    protease inhibitors of various functional classes; and a significant decrease in the content of RuBisCO, a

    major contaminant during the purification of recombinant proteins. Based on this we included in our

    transfection procedure a pretreatment of plants with methyl jasmonate, a volatile form of jasmonic acid.

    This pretreatment significantly reduced RuBisCO levels in leaves, concomitant with a more than twofold

    increase of C5-1 yield in mature leaves. Our data highlight, overall, the potential of manipulating the host

    plants defense metabolism to increase heterologous protein yields, in complement to current protein

    protection strategies involving the co-expression of recombinant protease inhibitors.

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    Avant-propos

    Ce projet de doctorat a t ralis sous la direction du Professeur Dominique Michaud et la

    codirection du Dr. Frank Sainsbury, dans le cadre dun projet de recherche ralis en collaboration avec

    un partenaire industriel de longue date, lentreprise de biotechnologie vgtale Medicago inc. Jai ralis

    lessentiel des travaux de laboratoire dcrits dans la thse, rdig la premire version des manuscrits et

    conu lensemble des tableaux et figures. Mon directeur de thse, Dominique Michaud, a t le principal

    concepteur du projet; il a aussi grandement contribu l'interprtation des rsultats et la rvision des

    manuscrits, tout comme mon codirecteur, Frank Sainsbury. Lensemble des co-auteurs ont contribu

    linterprtation des rsultats et la correction des manuscrits avant soumission pour publication.

    Les expriences et rsultats inclus dans la thse sont prsents en bonne partie sous la forme

    d'articles scientifiques rdigs en anglais et destins la publication dans des priodiques avec comit de

    lecture. Le document est compos de quatre chapitres. Le Chapitre 1 est une revue de la littrature

    scientifique sur les avantages et les limites de la molculture vgtale. Les stratgies dveloppes pour la

    protection des protines recombinantes dans les plantes y sont aussi abordes, de mme que limpact

    ventuel du systme de dfense de la plante hte sur le rendement en protine. Le Chapitre 2, trs

    succinct, prsente les hypothses de recherche du projet et les objectifs raliss pour les vrifier. Les

    rsultats de mes travaux sont ensuite prsents et inclus pour lessentiel dans deux manuscrits

    scientifiques qui forment le corps de la thse. Le Chapitre 3 (Article 1, publi dans PLoS One) est

    intitul: Protection of recombinant mammalian antibodies from development-dependent proteolysis in

    leaves of Nicotiana benthamiana; y sont prsents les rsultats du projet relatifs lexpression transitoire

    et la protection dun anticorps recombinant dintrt clinique, lanticorps monoclonal C5-1, en fonction du

    stade de dveloppement des organes foliaires de la plante hte. Le Chapitre 4 (Article 2, publi

    rcemment dans Plant Biotechnology Journal) est intitul: Leaf proteome rebalancing in Nicotiana

    benthamiana for upstream enrichment of a transiently expressed recombinant protein; sont prsents

    dans cet article les rsultats du projet relatifs lactivation du systme de dfense associ lacide

    jasmonique et aux effets de cette hormone sur la teneur en RuBisCO dans les feuilles, le rendement en

    protine recombinante et la rponse de la plante linfection bactrienne lchelle molculaire. Le

    Chapitre 5, enfin, est une brve discussion gnrale sur l'ensemble du projet, o les hypothses de

    recherche formules au dpart sont reconsidres une une. Ce chapitre se termine par une conclusion

    gnrale o sont avances quelques pistes de recherche pour la suite des choses.

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    Remerciements

    Je tiens remercier tout particulirement mon directeur de thse, Dominique Michaud, pour avoir

    cru en moi et mavoir donn la chance dentreprendre des tudes doctorales au sein de son quipe. vrai

    dire, je ne le remercierai jamais assez pour cela. Je dois aussi remercier mon co-directeur, Frank

    Sainsbury, pour son aide, ses corrections et tous ses bons conseils, dont le fameux Trust but verify , que

    je noublierai jamais. Je n'aurais srement pas russi cette thse sans toute la confiance qu'ils ont mise en

    moi... Merci de mavoir endure et supporte!!!!

    Je remercie aussi notre partenaire pour ce projet, la compagnie Medicago Inc., en particulier le Dr.

    Marc-Andr DAoust et M. Pierre-Olivier Lavoie, pour leur intrt, leur aide technique et les runions

    productives en cours de projet.

    Je remercie par ailleurs la Dynastie des Goulet , comme je les appelle, Marie-Claire, Catherine

    et Charles, pour leur aide technique prcieuse, les conversations statistiques et les innombrables dners

    anims. Un merci particulier aussi Charles pour mavoir permis de travailler ses cts en tant

    quauxiliaire denseignement.

    Merci ceux qui ont joint lquipe en mme temps que moi: Moustafa Khalf, Asieh Rasoolizadeh,

    Ann-Julie Rhaume. Un grand merci aussi Aurlie Munger et ceux qui sont arrivs aprs moi: Philippe

    Varenne-Jutras, Marielle Gagn. Je noublie pas, bien sr, Hlne Matte pour son soutien et sa gentillesse.

    Sans vous tous, la vie au labo n'aurait pas t la mme!

    Un merci