Diagnostic rapide de la mammite clinique

Jean-Philippe Roy1, Jodi-Ann Wallace2 & Caroline Vézina3

1Professeur adjoint, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal

2Clinique vétérinaire Ormstown et étudiante M.Sc., FMV3Productrice, Ferme Tranquillity, Brownsburg-Chatham

Colloque sur la santé des troupeaux laitiers

12 décembre 2007, Québec – Atelier mammite

Introduction• La mammite clinique = raison #1 pour l’usage des

antibiotiques chez les vaches (Erskine et al., The Vet. Clinics of N.A., 2003)

• En basant certaines décisions de traitement sur les résultats bactériologiques, l’utilisation d’antibiotiques peut être significativement diminuée (Silva, NMC, Proc. 2004)

• Une réduction de l’usage des antibiotiques aiderait à :1) prévenir les pertes de lait 2) réduire le risque d’avoir des résidus dans le lait 3) améliorer les taux de succès des traitements en raison

de traitements mieux ciblés (Neeser et al., JAMVA, 2006)

Situation actuelle• Actuellement, la bactériologie standard du

lait permet peu d’aider à la prise de décision pour le traitement des mammites cliniques (délais 2 à 5 jours)

• Il y a maintenant des outils diagnostiques rapides de la mammite disponibles

• Comment intégrer ces outils dans la gestion de la santé du pis à la ferme ou en clinique vétérinaire ?

Les pathogènes retrouvés sur 500 cas de mammite clinique

Catégorie de traitement n (%)

Aucune croissance 116 (23,3)

Gram positif 277 (55,4)

Gram négatif 92 (18,4)

Autres (levures/algue) 15 (3)

Total 500G. Keefe, (RCRMB, cohorte nationale)

Pas de croissance

• 20 à 50 % des échantillons• Causes :

– Élimination spontanée des bactéries– Excrétion cyclique des bactéries– Faible nombre de colonies (< 100 CFU/ ml)– Bactéries phagocytées

Les agents pathogènes qui causent la mammiteGram positif Gram négatif Autres

Staphylococcus spp. Escherichia coli Mycoplasma spp.

Staphylococcus aureus Klebsiella spp. Levures

Streptococcus uberis Enterobacter spp. Prototheca

Streptococcus dysgalactiae Serratia spp.

Streptococcus agalactiae Pasteurella spp.

Corynebacterium bovis Proteus spp.A. pyogenes Pseudomonas spp.

Outils diagnostiques

Minnesota Bi-plates

• Développé par Université du Minnesota• Milieu sélectif : MacConkey et gélose au

sang avec 1 % esculine• Permet classification des bactéries en

Gram + ou Gram -• Parfois, peut permettre ID Staph aureus

Minnesota Tri-plates

• Développé par l’Université du Minnesota• Permet identification Gram +, Gram – et

streptocoques• Parfois peut permettre ID Staph aureus

Petrifilm™

Plaques Staph Express (STX)

ID Staph. aureus

22-26h - résultats finaux

• Milieux de culture sélectifs de 3M Microbiologie• Utilisés présentement dans le secteur alimentaire

(Tassinari et al, Food Quality Magazine, 2006; Ingham et al., J.Food Prot., 2003)

Num. Aérobie (PAC)

ID aérobies (Flore totale) (Streptocoques)24h & 48h - résultats

Petrifilm™

Num. rapide des Coliformes (RCC) ID Coliformes

Changement couleur 6 -12h

24h résultats finaux

Num. Coliformes (CC)ID Coliformes

24h résultats finaux

Mise en garde

• La qualité de l’échantillon de lait prélevéest primordiale

• La technique de prélèvement doit être le plus stérile possible afin d’éviter la contamination de l’échantillon et une interprétation erronée

Application à la ferme

Mammite clinique

Mammite Clinique

Examen

Pas de FIÈVRE, appétit normal = Mam. Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre résultats pour TX

FIÈVRE et/ou ne mange pas = Mam. Grade 3 : traitement avec anti-inflammatoires, fluides, surveille, +/-antibiotiques, ±prendre échantillon

Ensemence 1cc de lait sur 1.STX 2. CC

Positif S. aureus

Aucun Ab IMM;Tx avec anti-inflammatoires, fluides et surveille

Nouvelle infection: 1er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS : Thérapie prolongée

Vérifie CCSSi chronique, haut CCS; Aucun tx, ségrégation, réforme

Positif ColiformesNégatif S. aureus, Positif croissance

Croissance G+ :Vérifie CCS et histoire de mamm,

Tx IMM produit homologué

S’il n’y a aucun changement envoyer échantillon congelé

au laboratoire pour une bactériologie standard

Mammite Clinique

Examen

Pas de FIÈVRE, mange bien = Mam. Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre résultats pour TX

FIÈVRE et/ou mange pas = Mam. Grade 3 : traitement avec anti-inflammatoires, fluides, surveille, +/-antibiotiques, +/-prendre échantillon

Ensemencer sur Tri-plate

Croissance dans zone G+ seulement : S. aureusou Staph. spp.

Croissance dans zone rouge et brune; Strep. spp. = Tx avec Ab IMM

Croissance dans zone G-; Aucun tx Ab, continuer les fluides, anti-inflam. et surveille

Staph. spp.

Tx avec Ab IMM et surveille

Staph. aureus: Vérifie CCSSi chronique haut CCS = Aucun tx, ségrégation, réforme

Staph. aureus:1er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS : Thérapie prolongée

Ou

Adapté de L.Tikofsky

S’il n’y a aucun changement envoyer échantillon congelé

au laboratoire pour une bactériologie standard

Application à la ferme

Dépistage du Staph. aureus

+

S. aureus -

S. aureus +

S’il n’y a aucun changement envoyer échantillon congelé au laboratoire pour

bactériologie standard

DDéépistage de Staph. aureuspistage de Staph. aureus au vêlage : Ferme XYZau vêlage : Ferme XYZ

CMT

•Prendre échantillon

•Ensemence 1cc de lait sur Petrifilm STX

•congèle l’échantillon

Composite ou Surveille CCS

Vérifie CCSSi chronique haut CCS = Aucun tx, ségrégation, réforme

Nouvelle infection : 1er

cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS = Thérapie prolongée

Négatif S. aureus, Positif croissance

Croissance G+ :Vérifie CCS et histoire de mammites

Tx IMM produit homologué

Vêlage, haut CCS, achats

Aucune croissance

Surveille CCS

Résultats d’études

Mammite Clinique

Examen

Pas de FIÈVRE Mam Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre pour résultats de culture

FIÈVRE Mam. Grade 3 : prendre échantillon, traitement avec anti-inflammatoires, fluides, surveille

Culture standard à la ferme

S. aureus

ATB IMM, ségrégation, réforme

S. ag. Staph. spp Strep. spp Coliformes Pas de croissance

ATB IMMségrégation

ATB IMM ATB IMM Pas ATBAnti-inflammatoire, surveille

Pas ATBAnti-inflammatoire, surveille

Résultats

• Diminution 80 % de l’usage des antibiotiques lors de mammites cliniques

• 55 % pas de croissance, 25 % Gram –• Souvent signes de mammite absents 24h

plus tard• TX = pas de retour plus rapide en

production, pas moins de quartiers perdus, lait anormal aussi longtemps

Résultats d’étude

• Étude Université du Wisconsin, 2004– Implantation d’un protocole de traitement

avec cultures du lait sur STX, CC, PAC– 600 vaches– Comparaison des résultats de culture à la

ferme avec et sans protocole de traitement

Mammite Clinique

Examen

Pas de FIÈVRE Mam. Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre pour résultats de culture

FIÈVRE Mam. Grade 3 : prendre échantillon, traitement avec anti-inflammatoires, fluides, +/-antibiotiques & surveilleEnsemencer 1cc de lait

sur 1. STX 2. CC 3. PAC

Positif S. aureus

Aucun Ab IMM;Tx avec anti-inflammatoires, fluides et surveille

Nouvelle infection: 1er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS: Thérapie prolongée

Vérifie CCSSi chronique haut CCS; Aucun tx, ségrégation, réforme

Positif Coliformes ou aucune croissance

Négatif S. aureus, Positif croissance PAC +

Croissance G+:Vérifie CCS et histoire de mamm.,

Tx IMM produit homologué

Résultats d’étude

RésultatsSans protocole (n=100 cas)

Avec protocole(n=267 cas)

P value

Jours lait jeté 19,7 7,8 <0,001

# tubes IMM/cas 33,3 5,3 * <0,001

Cas qui reçoit tubes IMM 87 % 33 % <0,001

Coût des tubes et lait jeté / cas 264 $ 90 $

*une partie de la réduction est due à une changement des tubes IMM à 1x/jr

Impact économique

• Étude Iowa State : Coût par 100 animaux présentant une mammite clinique– Traitement tous les cas : 285 $/100 cas– Traitement basé sur la culture : 99 $/100 cas– Le succès thérapeutiques n’était pas différent

entre les groupes malgré un délai de 24 heures

Impact économique

• Université de Cornell : Un troupeau de 100 vaches peut économiser 3 000 $ par an en utilisant les traitements basés sur les résultats de culture

• Si traitement seulement des streptocoques, économie jusqu’à 5 000 $ par an

Avantages d’un programme de contrôle incluant des traitements basés sur les résultats de culture• Réduction des coûts des Ab• Réduction du risque de résidus dans le lait• Réduction des pertes de lait car moins de

cas traités avec Ab• Réduction du délai d’attente pour la

réforme

Avantages de faire la culture à la ferme ou en clinique vétérinaire

• Accessibilité du laboratoire– fins de semaine et congés

• Rapidité– Résultats préliminaires sont disponibles en 24h

Limitations

• Ne permet pas l’identification des mycoplasmes

• Les levures peuvent croître sur les plaques comme un Gram + mais le traitement antibiotique risque d’empirer la situation

Coûts

Bi-plate : 1,75 $

Tri-plate : 2,80 $

Plus frais de transport

Coûts ($)

•Petrifilm Staph Express

•Staph Express Disques

•Petrifilm Coliformes

•Petrifilm Coliformes Rapides

•Petrifilm Count Aérobique

•Pipettes stériles

•Tubes de dilution

BoBoîîtete CaisseCaisse

2,34 1,99

1,53 1,37

1,00 0,81

2,14 1,65

0,91 0,76

0,17

1,10

Coûts de démarrage

EQUIPEMENT COÛTS ($)Incubateur (aérobie) 37OC 100 - 400Réfrigérateur/Congélateur 80 - 300Applicateurs stériles 20 - 40Matériel pour prise d’échantillons de lait VariablePièce propre, tempérée, bien éclairée VariablePoubelle pour déchets bio-médicaux VariableMEDIA

Matériel additionnel

• Microscope et coloration Gram• Test coagulase• Autres tests biochimiques

Prix des incubateurs

Incubateur portatif ~ 100 $

Compact Incubator#004-3100

Certified Incubator Thermometer #195-3032

Incubateur de laboratoire

557 $Disponible chez 3M

HovaBator ~ 125 $

Ranch Cunicole450-799-5170

St-Hyacinthe, QCNelson Jameson

800-826-8302

Conclusions

• Ces systèmes de culture ne remplacent pas les laboratoires commerciaux car ils ne permettent pas d’identifier tous les pathogènes présents

• La mise en place d’un protocole de traitement et de prévention adapté à la ferme est primordiale (collaboration producteur - médecin vétérinaire)

Conclusions

• Permettraient une utilisation plus rationnelle, économique et responsable des antibiotiques

• Les milieux de culture sélectifs Petrifilm et Bi & Tri-plates ont le potentiel d’être des outils diagnostics importants à la ferme ou en clinique vétérinaire

Ferme Tranquillity

Ferme Tranquillity

• < 2004 : 35 vaches en stabulation attachée• 2004 : nouvelle étable

– 6 rangées, 130 logettes– 115 vaches en lactation– Salon de traite D-8

Westfalia-Surge

Ferme Tranquillity

Ferme Tranquillity• 2005 : augmentation des mammites cliniques

– Mammites Grade 3/Sévères– Envoyer plusieurs échantillons au laboratoire

Mycoplasmes• Les vaches positives pour Mycoplasmes =

Réforme • Échantillon du réservoir mensuellement pour

prévention• Ne pas congeler le lait pour l’analyse des

mycoplasmes

Ferme Tranquillity

• Été 2005 : Beaucoup de mammites environnementales; Gram négatifs (coliformes), et des streptocoques

• On a réalisé que les traitements IMM avec Ab de tous les cas de mammite n’étaient pas efficaces ou économiques– Commande de Tri-plates de Minnesota

Ferme Tranquillity

• Tri-plates– Commande 15 Tri-plates à la fois– Coût : 2,80 $/plaque + coût de transport

~ 77 $ pour 15 = 5,13 $/plaque• Achat Hova-Bater• Applicateurs coton-tige• Tubes d’échantillon pour le lait• Période d’entraînement

– Un guide d’utilisation (en anglais seulement)– Suggère de travailler avec votre vétérinaire

Les Tri-plates se conservent au frigo

Congélation des échantillons

(sauf pour mycoplasmes)

L’incubateur

L’incubateur

L’incubateur

Notre expérience• On traite beaucoup moins de cas de mammite

avec des antibiotiques– $$$ épargnés

• Un autre outil très important pour gérer la santédu pis

• Bonus : les résultats sont disponibles en 24h permet réagir rapidement

• Avertissements : - L’entraînement est essentiel- Quand vous êtes dans le doute : envoyer l’échantillon congelé au laboratoire

Procédures de mise en culture• Se laver les mains• Assainir la surface de travail• Sortir le matériel • Sortir les échantillons• Identifier les plaques• Inoculer les plaques• Incuber 24 heures @ 35°C

Technique d’ensemencement et interprétation

Bi-plates & Tri-plates

Technique d’ensemencement :Bi-plates / Tri-plates

• Prendre l’échantillon de lait• Mélanger l’échantillon• Tremper l’applicateur coton-tige dans le

lait & ensemencer sur chaque compartiment du média (retremper entre chaque section)

• Incuber pour 18-24 heures @ 37°C• Lecture des plaques pour la croissance

bactérienne

1

2

3

Technique d’interprétation : Bi-plate

Croissance sur le coté rouge (gélose au sang) = Gram +

Est-ce qu’il y a une zone claire (hémolyse) autour de la colonie ?

OUI = Probablement S. aureus

NON = prob. Staph spp. ou Strep.

Technique d’interprétation: Bi-plateCroissance sur le côté rose (MacConkey) = Gram -Est-ce que la colonie est rose-sec, et la zone autour de la colonie peut être rose ?

OUI = Probablement

E. coli

Interprétation : Bi-plateEst-ce que la colonie est rose-pâle/blanc, et a l’air muqueux/gluant ? OUI = Klebsiella

Technique d’interprétation : Tri-plate

Croissance sur le coté MTKT (brun) = Juste les Streptocoques• Laisse à la température de la pièce pour

30 min (pour la réaction esculine)• Strep. dysgalactiae : colonie bleue-grise

avec aucune hémolyse• Strep. uberis : colonie très foncée ou noire

Interprétation : Tri-plate

Interprétation : Tri-plate

Interprétation : Tri-plate

Interprétation : Tri-plate

MacConkey

Tri-plates à la ferme Tranquillity

S. aureus positif

NNÉÉGATIFGATIF

NNÉÉGATIFGATIF

Staph. spp.

Staph. spp.

Strep. spp.

Strep. spp. ou Strep. uberis

Gram - : Aucune croissance

Strep. uberis

Strep. dysgalactiae

Technique d’ensemencement et d’interprétation : Petrifilm

STX, RCC, CC, PAC

Technique d’ensemencement et d’interprétation Petrifilm - STX

1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque, déposer 1ml de lait au centre de la plaque

2. Abaisser délicatement la pellicule supérieure de haut en bas vers l’échantillon pour empêcher que des bulles d’air ne s’infiltrent (Ne pas laisser tomber la pellicule)

3. Répartir l’inoculum uniformément en zone circulaire en exerçant une légère pression avant que le gel ne se solidifie

4. Incuber les plaques en piles de 20 max à 35°C 24 heures +/- 2h

Technique - STX

5. Lecture des plaques à 24 ± 2 heures6. Si croissance de colonies Soulever la

pellicule supérieure & mettre un disque de Staph Express. Glisser fermement un doigt sur le dessus de la pellicule

7. Lecture 1-3 hr après (suggère 3h)• Compter toutes les zones roses, qu’une

colonie soit présente ou non

Interprétation : Staph Express Petrifilm (STX) :

Si seulement des colonies rouges-violacées sont présentes :Colonies rouges-violacées sont comptées comme des S. aureus

DDéétection : tection : S. aureusS. aureus

Interprétation : STX

• Colonies autres que rouges-violacées sont présentes

• Disque est inséré• Plaque et disque sont

incubés à 35°C de 1-3 heures

• Les zones roses de DNase sont comptées comme des S. aureus

Utilisation du disque

1 ml en plaque direct1 ml en plaque direct150 et + colonies, colonies sont petites et les zones sont aussi très petites.

Dilution 1:10Dilution 1:10130 zones roses présentes Rapporter 1 300 UFC/ml

Staph. spp.

Technique – RCC &CC1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque

déposer 1ml de lait au centre de la plaque 2. Abaisser délicatement la pellicule supérieure de haut

en bas vers l’échantillon pour empêcher que des bulles d’air ne s’infiltrent (Ne pas laisser tomber la pellicule)

3. Répartir l’inoculum uniformément en zone circulaire en exerçant une légère pression avant que le gel ne se solidifie

4. Lecture des plaques :• RCC : À 6-14h : noter un changement de couleur (les

zones acides jaunes avec ou sans centre rouge) (Oui ou Non)

• RCC & CC : À 24h : noter le nombre de colonies et le nombre de types de colonie (1 ou 2)

Interprétation : Num. rapide des coliformes(RCC) :• Num. des coliformes

par les zones acides (6-14 heures)

• Dénombrer les zones acides jaunes avec ou sans centre rouge comme des coliformes

Interprétation : RCC

Num. des coliformes par les zones acides (6-14 heures)

Interprétation : RCC = TNTC

Plaque coliformes totaux Petrifilm (CC)

Toutes colonies rouges

avec gaz (bulle d’air)

Interpréter :

Détection : Coliformes(bâtonnets Gram (bâtonnets Gram ––) )

1 ml en plaque directBeaucoup de gaz et de petites coloniesTNTC

Dilution 1:10125 coliformes Rapporter 1250 UFC/ml

UFC/ml = (Nb de bactUFC/ml = (Nb de bactééries X facteur ries X facteur de dilution) / Nb ml mis en de dilution) / Nb ml mis en cultureculture

Technique d’ensemencement et d’interprétation Petrifilm - PAC

1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque, déposer 1ml de lait au centre de la plaque

2. Déposer la pellicule supérieure en la laissant tomber. Ne pas la déposer en la déroulant

3. Poser un étaleur, coté strié vers le bas, sur la pellicule supérieure de l’inoculum. Appliquer une légère pression sur l’étaleur afin d’étaler l’inoculum sur la zone circulaire. Ne pas tourner ni faire glisser l’étaleur

4. Lecture des plaques PAC :• À 24 h : noter le nombre de colonies

Technique d’interprétation : PAC

Est-ce applicable dans votre ferme ou votre clinique ?

1. Est-ce que vous avez des protocoles différents pour des types d’infections différentes ?

2. Est-ce que vous avez une personne fiable qui aura le temps de faire les cultures ?

3. Est-ce que vous avez un nombre d’échantillons suffisant de mammite/vêlage/aug. CCS pour qu’une personne développe une expertise ?

4. Est-ce que les producteurs et médecins vétérinaires sont prêts à embarquer dans ce type de protocole ?

Petrifilm ou Bi-plate/Tri-plate ?• Cela dépend de votre troupeau

– Le nombre de vaches, le nombre de cas cliniques et sous-cliniques

• Durée de vie du milieu de culture– La prévalence des différentes bactéries

(S. aureus vs streptocoques vs coliformes)

– Vos objectifs en santé du pis• Mammite clinique• Mammite sous-clinique : Contrôle S. aureus

Parlez-en à votre médecin vétérinaire!