Diagnostic Microbiologique

1- Historique

Existence des micro-organismes et rôle

dans les maladies: Lucrèce (98-95 av. JC)

Première observation de micro-organismes :

Antonie Van Leeuwenhoek (1673)

2- Place des microorganismes dans la classification des êtres vivants

Principales différences entre cellules Procaryotes et Eucaryotes

Par organites externes, mouvements amaeboïdes ou

pseudopodes

Par organites externes

Mouvements cellulaires

PrésentesAbsentesOrganites intracellulaires

MitoseScissiparitéRéplication

> 11Nb de chromosomes par noyau

PrésenteAbsenteMembrane nucléaire

Cellules Eucaryotes(protistes,végétaux,animaux)

Cellules Procaryotes

(Bactéries)

Caractéristiques

Nomenclature

� êtres vivants unicellulaires (procaryotes)

� multiplication par scissiparité

� 0,1 à 2 µm diamètre/0,5 à 5 µm long

� Gram +, Gram -, Mycobactéries

� Spore bactérienne:forme de survie de certaines bactéries

Gram positif

3- Les bactéries

A. Les enveloppes : la capsule, le glycocalyx ,la paroi,la membrane cytoplasmique,

B Les constituants internes : le cytoplasme, l'appareil nucléaire

C. Les appendices externes : les flagelles, les pili

D. La spore bactérienne

4- Structure bactérienne

A:Les enveloppes : la capsule, le glycocalyx, la paroi la membrane cytoplasmique

B. Les constituants internes : le cytoplasme, l'appareil nucléaire C. Les appendices externes : les

flagelles, les pili

*La capsule: constituant inconstant et superficiel

Mise en évidence: Etat frais encre de Chine ou Bleu de méthylène, réaction Ag/Ac

Composition: Polysaccharides

A- Les enveloppes

Rôles de la capsule:

- virulence

- pouvoir pathogène

- antigénicité,

- typage,

- préparation de vaccins

- diagnostic

* Le glycocalyx:feutrage de fibres polysaccharidiques

Rôles- Adhésion

entre microorganismes

à une surface solide

- Concentration des sécrétions

- Réservoir

- Protection « biofilm » , « slime »

* La paroi : enveloppe rigide assurant l'intégrité de la cellule bactérienne et responsable de sa forme

Mise en évidence et structure

- Partie commune : le peptidoglycane

- Paroi des bactéries à Gram positif : + acides téchoïques

- Paroi des bactéries à Gram négatif : + lipopolysaccharides

- Paroi des Mycobactéries : + lipides

Propriétés et rôles de la paroi bactérienne

1 Coloration de Gram

2 Forme des bactéries

3 Antigénicité (Ag O des Gram-)

4 Toxicité (LPS)

5 Site d'action d'antibiotiques (bêtalactamines, glycopeptides, fosfomycine)

1 Coloration de Gram

1ère étape : cristal violet + Lugol

2ème étape : décoloration à l'alcool-acétone

3ème étape : recoloration à la fushine ou à la safranine

violet= Gram +

Rose= Gram -

2 formes de bactéries

* La membrane cytoplasmique

Structure: Structure trilamellaire, perméases

FonctionsEchanges bactérie/milieu extérieur

Enzymes respiratoires

Division bactérienne,

Fixation flagelles

Site d’action d’antibiotiques

* L'appareil nucléaireStructure80% ADN, 10% ARN,

10% protéinespas de membrane nucléaire

ADN du chromosome bactérien bicaténaire et circulaire

Fonctions Support caractères héréditairesDivision bactérienneSite d’action d’antibiotiques

Plasmides

B- Les constituants du cytoplasme

* Ribosomes

RôlesSynthèse et exportation des protéines

Site d’action d’antibiotiques (aminosides, tétracyclines,

chloramphénicol, macrolides)

* Les flagellesOrgane de locomotion

Structure Flagelline

Nombre (1 à 30)

disposition (polaire, péritriche) variables

RôlesAntigénicité (AgH),mobilité (+/- tactisme)

C- Les appendices externes

* Fimbriae ou pili Gram négatif

Rôles

Fixation des bactéries aux tissus (pili communs)

Rôle dans la conjugaison (pili "sexuel") = transfert de matériel génétique entre les bactéries

Gram positif

Mise en évidence : Coloration au vert Malachite

Sporulation/GerminationDéclenchée par des modifications environnementales(déshydratation, densification, paroi épaisse)

FonctionsForme de survie de certaines espèces (transmission)

Résistance (température, temps, UV, ATS, ATB)

Classification(position, déformation)

D- La spore bactérienne

* Division bactérienne

Les bactéries se multiplient par fission binaire :- la cellule grandit- l'ADN se duplique- la cellule se divise en 2 cellules filles séparées par un septumde division formé par la paroi cellulaire

5- Croissance et nutrition bactérienne

* Dynamique de la croissanceEn milieu non renouvelé, on ensemence des bactéries qui ont des "âges" différents (non synchrones)on mesure par une méthode quelconque la croissance

→croissance en fonction du temps = courbe de croissance

→5 phases sont distincts

1.Phase de latence: taux de croissance nul Elle est fonction de l'état physiologique de la bactérie et de son adaptation au milieu.

2.Phase exponentielle: le taux de croissance augmente et atteint sa valeur maximale et reste constant

3.Phase de ralentissement: le taux de croissance diminue, épuisement des nutriments, début d’autolyse des bactéries

4.Phase stationnaire: valeur maximale possible de l'inoculum bactérien et arrêt de la croissance, le taux de croissance redevient nul (épuisement des nutriments et accumulation des déchets)

5.Phase de décroissance: ressources nutritives épuisées et accumulation de métabolites toxiques, entraînant une lyse des bactéries

In vitro, croissance variable en fonction du substrat énergétique fourni, du milieu de culture, de la bactérie. On peut obtenir des croissances continues par apport de milieu neuf → dans l'industrie

In vivo, variable en fonction des substrats (milieux complexes) des produits antibactériens, de la réaction cellulaire

* Croissance in vitroAugmentation masse cellulaire et nombre de cellules

Croissance en milieu liquide- mesure de la croissance bactérienne par

- Comptage direct des bactéries par repiquage �numération des individus viables (1 bactérie = 1 colonie)

- méthodes physicochimiques (pesée d'un culot, dosage N, mesure activité enzymatique/ATP)

- méthode optiques (densité optique, seuil de sensibilité105-106 UFC/mL)

- dosage du gaz carbonique libéré pendant la croissance (Bactec)

Croissance en milieu solide

Dépôt d'une cellule bactérienne à la surface d'une gélose nutritive ⇒ amas visible à l'œil nu (colonie) dès qu'elle

contient 106 bactéries (# 20 générations)

24-48120-240Mycobacterium tuberculosis

2-520Vibrio cholerae

440Pseudomonas aeruginosa

3-540Staphylococcus aureus

3-520-40Salmonella typhimurium

520-40Escherichia coli

TG IN VIVO (heures)TG IN VITRO (minutes)BACTERIE

* Croissance in vivoTG = Temps de génération = temps mis par une bactérie pour se diviser

µ = taux de croissance = nombre de divisions par unité de tempsEx : temps de génération = 20 mn → µ = 3 divisions/heure

Temps de génération (TG) in vitro et in vivode quelques bactéries

*Conditions physicochimiques de la croissance

Température : minimales et maximales de croissance

- mésophiles(20 à 40°C)

- thermophiles(> 40°C)

- psychrophiles(4 à 20°C)

- cryophiles (4°C)

pH : bactéries liées à l'écosystème humain se développant à pH neutre (entre 5,5 et 8, optimum 7)Neutrophiles (5,5 à 8,5), alcalophiles, acidophiles

Pression osmotique :

bactéries tolérantes aux variations de concentration ionique

certaines espèces halophiles (Vibrio, staphylocoques)

Pression partielle en oxygène:bactéries classées en fonction de leur rapport avec O2:

- aérobies stricts, air ou oxygène, oxydation des substrats

- aéro-anaérobies facultatifs, oxydation ou fermentation

- anaérobies stricts, absence d'oxygène, fermentation

- microaérophiles, pp oxygène < air

Aérobie strict

Micro-aérophile

Anaérobie strict

Aéro-anaérobie facultatif

* Besoins nutritifs

Substances nécessaires à l’énergie et à la synthèse cellulaire.

- Aliments énergétiques

Substrats utilisables par la bactérie pour produire de l'énergie au cours de réactions cataboliques

Substrats organiques, acide aminé, protéine

Le glucoseest le substrat énergétique carboné le plus couramment utilisé par les bactéries d'intérêt médical

- Aliments constitutifsSubstrats nécessaires à la synthèse des molécules devant constituer de nouvelles bactéries

Ions minéraux (Cl-,K+, Na++, Mg++, HPO4-) oligoéléments(Fe++)

Sources de carbone(CO2, substrats organiques, glucose)

Sources d'azote(ammoniac, sels d'ammonium, nitrate, nitrite,

dérivé azoté organique)

* Facteurs de croissanceMolécules organiques nécessaires à leur croissance

les bactéries auxotrophes ne savent pas faire la synthèses (≠ prototrophes)

Métabolites de structure/acides aminés, peptides, bases puriques ou pyrimidiques, acides gras vitamines ou coenzymes

- Pénétration des éléments constitutifs et des nutriments

*Paroi puis membrane cytoplasmique à traverser :

- Diffusion libre /gaz (O2, CO2), acides gras, certains nutriments liposolubles

- Protéines de transport → porines dans la paroi, perméases dans la membrane cytoplasmique

*Substrats métabolisés

équipement enzymatique et voies métaboliques propres à chaque espèce bactérienne

*Sortie des métabolites

protéines de transport, diffusion, ou lors de la lyse bactérienne

* Applications au laboratoire

- Culture et isolement des bactéries

Utilisation des besoins nutritifs et des conditions de croissance pour fabriquer des milieux permettant la culture et l’isolement des bactéries

Composition : Milieux synthétiques, semi-synthétiques, complexes

Utilisation: Milieux d’enrichissement, d’isolement, d’identification

SélectifStaphylocoque doré sur Chapman

E.coli et Proteus mirabilis sur Drigalski

IsolementAspiration bronchique sur GS (A), GC (B) et milieu avec

substrats chromogéniques (C)

Identification

Conditions de culture

- Température- Besoin en CO2- Anaérobiose

- Identification des bactéries(en + morphologie)

Milieux spécifiques (sucres, sels minéraux,indicateurs de pH, sélectif)

Etude des rapports avec l'oxygène

Recherche

de catalase H2O2 ���� H2O + O2

d'oxydase

de nitrate réductase

Etude du métabolisme glucidique(fermentation des sucres, utilisation des acides organiques,…)

Etude du métabolisme protéique(production d'H2S, d'indole, recherche

d'uréase, gélatinase,…)

Mise en évidence d’uneactivité enzymatique oud’une activité fermentaireen galerie d’identification

Automatisation

1- Flore commensale(1013 cellules et 1014 microorganismes)

� Implantation des microorganismes sur la peau et les muqueuses:- adhésion des bactéries aux cellules épithéliales- persistance des bactéries implantées- facteurs influençant la flore endogène

� Rôle de la flore commensale:- résistance à l'infection- contribution nutritionnelle

Corps humain

Entérobactéries, streptocoques, staphylocoques

107-108/ml

Intestin grêle

Anaérobies (Bacteroïdes, Clostridium, BGP non sporulés)

102-104/ml

Duodéno-jéjunum

0Estomac

Streptocoques, Neisseria, actinomycètes

109-1011/gr

Plaque dentaire

Streptocoques, Neisseria, anaérobies105-106/ml

Flore buccale

Flore des voies digestives

Flore résidente

Staphylocoques, microcoques, corynébactéries

Flore transitoire

102-105/cm2

Flore de la peau

Espèces principalesAbondance

Flores commensales

Ex : Flore digestive

- Micro-organismes « portage/pathogènes »

Tube digestif : - Salmonelles, Shigelles,

ORL :- Bordetella pertussis(coqueluche), -Neisseria meningitidis

- Corynebacterium diphteriae(diphtérie),Respiratoire :

- Mycobacterium tuberculosis- Pneumocoque- Haemophilus influenzae,

Génital :- Neisseria gonorrheae (gonococcie), - Treponema pallidum (syphillis),