Diagnostic de laboratoire des parasitoses

sanguicoles et tissulaires-2 (suite)

DR: BOUOUDEN. Foued

2019-2020

4 EMME ANNEE PHARMACIE-

PARASITOLOGIE

I-LEISHMANIOSE VISCÉRALE

Parasitose due à un flagellé sanguicole et tissulaire : Leishmania infantum.

Transmise par insecte vecteur : Phlebotomus perniciosus femelle et admet

comme réservoir le chien.

Diagnostic biologique:

Éléments d’orientation:

Epidémiologique: les foyers sont localises dans le pourtour de la

Méditerranée, au Moyen-Orient, en Afrique de l’Est, en Inde et sur le continent

sud Américain,…

En Algérie existe surtout au niveau de la partie nord du pays (centre, est et

ouest).

Clinique: triade classique : fièvre folle rebelle , splénomégalie et pâleur

cutanéo-muqueuse (surtout chez un enfant en bas âge+ (≤5 ans))

Biologique: pancytopenie progressive.

Diagnostic parasitologique direct : recherche des leishmanies

dans les cellules du systeme reticulo- histio -macrophagique:

Prélèvements:

Ponction de MO +++

Ponction splénique (risque de rupture )

Aspiration ganglionnaire

Sang périphérique

1-Examen Direct :

Frottis de moelle osseuse ,apposition (biopsie) colorés au MGG:

Forme amastigote de Leishmania sp : intracellulaire obligatoire (cellules du

SRE : foie, rate, ganglions, moelle…). forme ronde ou ovalaire de 5 à 10

micron de taille, avec un noyau central et un kinétoplaste juxtaposé

Avantages: sensibilité élevée

Inconvénients de la ponction de MO :

• Geste invasive, douloureuse

• Lecture longue et fastidieuse.

Amastigotes de Leishmania sp

Les prélèvements sanguins ou de moelle peuvent être mis en culture sur

milieux spécifiques: NNN (Novy-Mac Neal-Nicolle): gélose + sang de

lapin), milieu de blanc d’œuf , milieu de Schneider,…

Incubation 25-28°C

1ere lecture: 01semaine, si négative repiquage, il faut 4 semaines avant de

rendre un résultat négatif

2-Culture:

Si culture positive: forme promastigote de Leishmania sp:

Forme allongée mobile de 20 à 25 micron de taille, avec un noyau central,

un kinétoplaste et un flagelle libre.

Promastigotes de Leishmania sp

Avantages:

Plus sensible / examen direct: intérêt surtout pour les parasitémies faibles

Inconvénients:

• Longue

• Contaminations bactériennes et fongiques

3-Leucocytoconcentration (LCC)

Principe: technique qui permet de concentrer les parasites sanguins sur la plus

petite surface possible d’une lame et à éliminer les globules rouges et les

plaquettes.

C’est une technique qui permet d’éviter la ponction de moelle mais sa de

sensibilité est faible

1-Hémolyse : dans un tube conique pour centrifugation, hémolyser 0,5 ml

de sang en le mélangeant avec 2,5 ml de la solution hémolysante.

Homogénéiser soigneusement le mélange par agitation au « vortex ».

Laisser hémolyser jusqu’à l’obtention d’une hémolyse parfaite (l’hémolyse

parfaite est obtenue en 10 à 20 mn lorsque le sang prend un aspect « laqué »)

Technique: a partir d’un prélèvement sanguin fait sur tube citraté

(l’héparine lèse les leishmanies).

Composition de la solution hémolysante: solution de saponine:

Saponine à 0,4%

Formol à 2,5%

Glycérine à 0,5%

Eau salée à 0,9% qsp 100 ml.

Filtrer soigneusement la solution obtenue à l’aide d’un filtre de 0,2 µm,

l’aliquoter en tubes coniques à centrifugation de 5ml et conserver au

congélateur à -20˚C.

2-Leucoconcentration: concentrer les leucocytes et les parasites par une

première centrifugation de 10 minutes à 2500 tours par mn, jeter le

surnageant, reprendre le culot dans 100 µl d’eau salée à 0,9%.

Homogénéiser soigneusement par agitation au « vortex ».

Centrifuger une deuxième fois pendant 10 mn à 2500 tours par mn, jeter le

surnageant.

3-Etalement des frottis sur lame porte-objet : confectionner des

frottis à partir du culot de centrifugation sur des lames porte-objet.

4-Coloration: sécher les lames et réaliser une coloration par le Giemsa,

après fixation au méthanol.

5-Lecture : lire au microscope optique au G x100 à la recherche des formes

amastigotes de Leishmania sp.

NB : le reste de prélèvement de tube citrate est destiné pour la culture :

Centrifuger à 2500 trs/mn pendant 10mn. jeter le surnageant et récupérer

l’interphase (la couche leucocytaire) et l’ensemencer sur milieux NNN ou

blanc d’œuf .

4-Biologie moléculaire: recherche d’ADN parasitaire par PCR

Tout type de prélèvement

Sensibilité > ED et culture

Coûteuse, réservée aux laboratoires spécialisés.

Diagnostic indirect : (séro immunologique) : recherche des

anticorps spécifiques dans le sérum du malade.

Plusieurs techniques peuvent être utilisées : ELISA, IFI, HAI, western blot,…

Il faut utiliser deux techniques, une qualitative (western blot,…) et l’autre

quantitative (ELISA, IFI,.. )

Inconvénients: sensibilité ↓ chez immunodéprimé (VIH+)

Réactions croisées: trypanosomoses, toxoplasmose, tuberculose

Intérêt dans le suivi thérapeutique limité: Ac persistent pendant des mois après

guérison.

Anthropozoonose cosmopolite, qui touche les animaux à sang chaud, y

compris l'être humain, due à un protozoaire intracellulaire obligatoire:

le Toxoplasma gondii.

II-TOXOPLASMOSE

Latente: sujets immunocompetants

Risque infectieux : femmes enceintes séro (-), sujets ID:

(sidéens, greffés…).

Diagnostic biologique:

I-Diagnostic direct: mise en évidence du parasite viable , ou de l’ ADN

parasitaire: ( ID+++ )

Prélèvements: placenta, liquide amniotique, LCR, LBA, ponction ganglionnaire, biopsie

cérébrale,…

Frottis ou apposition

lecture souvent difficile.

Inoculation à 'animal (souris)résultats longs à aboutir

Biologie moléculaire: PCRréponse rapide et sensible

PCR en temps réel +++

(MGG) (IFD)

Frottis coloré:(lecture difficile): tachyzoites de T gondii (forme de

croissant asymétrique ou d'un arc, de 5 à 8 μm de long / 2 à 4 μm)

II-Diagnostic indirect: séro-immunologique:

A la suite d'une infection toxoplasmique, l'organisme

synthétise des anticorps spécifiques (IgM, IgA, IgE,

IgG).

Meilleure connaissance de la cinétique

d'évolution de ces anticorps ++++

Interprétation correcte des résultats d’examens

sérologiques.

• IgM spécifiques apparaissent une semaine après la contamination.• atteignent leur maximum en 2 à 3 semaines.• pour disparaitre vers le 4ème ou 6mois.

IgG spécifiques apparaissent vers le 15

maximum vers le 2ème mois

restent en plateau à un taux élevé pendant plusieurs mois (6 mois)

s'abaissent lentement, jusqu'à un taux résiduel IgA ont une évolution parallèle à celle des IgM mais sont détectables au maximum pendant 6 mois

Techniques sérologiques utilisées

Selon la nature de l'antigène utilisé:

1-Techniques utilisant un Ag figuréImmunofluorescence indirecte (IFI) +++

Immuno-Sorbent Agglutination Assay (ISAGA)

2-Techniques utilisant un Ag soluble:Méthodes immuno-enzymatiques : ELISA +++

Techniques complémentaires: dater ou confirmer une

toxoplasmose: Test d’avidité des IgG , Western Blot,…

Valeur du titre des IgG

IgG < 10 UI/ml → (-)10 UI/ml ≤ IgG ≤ 300 UI/ml → f à moyen (+)

IgG > 300 UI/ml → Fortement (+)

Associée 02 techniques:Une technique pour doser les IgM

Une technique pour doser les IgG

Pour les IgG

Les résultats sont rendus en UI/ml

Pour chaque technique: seuil de positivité : 6 UI/ml ou 10 UI/ml.

Interprétation: sur 2 sérums à 1mois d’intervalle:

même technique, même laboratoire

Présence/ absence IgG/IgM

Stabilité/ascension significative des titres des IgG

Examens complémentaires : IgA, avidité des IgG

Dans la toxoplasmose congénitale:

Chez le fœtus et le nouveau-né: à côté du transfert passif

d’AC maternelles, il y a production d'Ac propres au fœtus:

IgM et IgA (5ème mois de la gestation )

Les IgM et IgA ne traversant pas le placenta, leur présence dans le

sérum du nouveau-né à la naissance = atteinte congénitale

Seules les IgG traversent le placenta. (3ème mois de la vie fœtale),

augmentent progressivement au cours de la grossesse

Après la naissance 02situations sont possibles:

Nouveau-né n’est pas infecté

Nouveau-né infecté

Diminution régulière du titre d’IgG

Négativation totale (6 à 9 mois après la

naissance)

du titre des IgG

Atteindre un maximum environ à 01an

Régression lente sans jamais disparaitre

complètement

Diagnostic prénatal : proposé en cas de séroconversion maternelle

Amniocentèse: réalisée à partir de 18 Semaines , au moins 4 semaines après

la date présumée de l’infection maternelle; prélever 15 – 20 ml de liquide

amniotique: PCR, Western blot

Sérologie de contrôle 10j après la naissance

Sérologie tous les mois puis tous les 2 mois durant la première année

Diagnostic néonatal: tout NN de mère contaminée en cours de grossesse

Prélèvement de sang de la mère et de l’enfant : western blot ou ELIFA

Calcul de la charge immunitaire de la mère et de l’enfant

CI =IgG spécifiques (en UI / ml) x 1000

IgG totales (en g / l)

Chez le sujet immunodéprimé

Recherche directe du parasite +++ : dans le sang, LCR,, LBA, moelle

osseuse,. ponction ganglionnaire, biopsie cérébrale,…

Sérologie: souvent difficile à interpréter:

IgM: en général absentes.

IgG: réponses diverses: titres faibles, élevés stables, ( des IgG)

Western Blot: production locale d'anticorps dans le LCR, HA

Toxoplasmose oculaire

Sérologie: mise en évidence d’une synthèse locale des anticorps

spécifiques (IgG , IgM) dans l’Humeur Aqueuse (HA),.

Comparaison de la charge immunitaire de l’ Humeur aqueuse avec

celle du sérum = Coefficient Desmonts.

Comparaison du profil immunologique sérum / HA = analyse

comparée des spécificités des anticorps par Western Blot

PCR: recherche du parasite dans l’ HA

III- TRYPANOSOMOSES

Trypanosomose Humaine Africaine (THA) : maladie de

sommeil)

Maladie parasitaire endémique touchant de nombreux pays de l’Afrique

subsaharienne, les parasites responsables sont des protozoaires flagellés

sanguicoles:

T. brucei gambiense : en Afrique de l’Ouest et Centrale.

T. brucei rhodesiense en Afrique de l’Est.

Ils sont transmis à l’homme par un arthropode vecteur hématophage :

la glossine ou mouche Tsé-Tsé.

Diagnostic biologique:

Le diagnostic de la THA est avant tout biologique: Il faut

• Mettre en évidence le parasite (dg de certitude),

• Établir la phase de la maladie (Phase lymphatico-sanguine ou méningo-

encéphalique), ce qui va orienter le traitement, et apprécier son

efficacité.

Séjour en zone d’endémie (Afrique équatoriale)

Fièvre, adénopathies cervicales et sous claviculaires, splénomégalie

Tout signe neurologique (sensitifs, psychiques, du sommeil ou moteurs),

qui signe alors le passage du parasite du systeme lymphatico-sanguin vers

le LCR

Eléments d’orientation:

Anémie, hyperleucocytose avec monocytose et plasmocytose (cellules de

Mott)

Elévation considérable des IgM sériques (4 à 20x la normale).

Examen direct de sang à l’état frais: entre lame et lamelle : les

trypanosomes ondulent entre les hématies

Prélèvements: sang, ponction ganglionnaire, LCR.

1-Phase sanguine:

Examen direct après différentes techniques d’enrichissement :

Centrifugation en tube capillaire hépariné (très utilisée sur le terrain)

Centrifugation après lyse des hématies (leuco-concentration)

Les trypanosomes, très mobiles, sont observés à l’interface

globules rouges – plasma.

Frottis sanguin, goutte épaisse, ponction ganglionnaire

colores au MGG : forme trypomastigote, forme allongée, 15 à 25 µm,

noyau central, kinétoplaste punctiforme postérieur, membrane ondulante

longeant le corps sur toute sa longueur et flagelle libre à partir de

l'extrémité antérieure

Trypomastigotes de Trypanosoma brucei

Trypomastigotes de Trypanosoma brucei

Culture su milieu NNN: peu pratiquée.

Résultat: forme épimastigote, forme allongée, de 15 à 20 µm, noyau

central, kinétoplaste proche du noyau, flagelle libre à partir de

l'extrémité antérieure

Épimastigote de Trypanosama sp

Autres techniques:

Filtration sur colonne échangeuse d’ions (DEAE cellulose):

Les trypanosomes seuls éléments du sang à passer à travers la colonne,

sont recueillis dans un tube et observés. sur le terrain, des mini-colonnes

sont utilisées. Inoculation a l’animal : peu pratiquée

Sérologie: recherche des Ac spécifiques

En cas de négativité des examens précédents, le recours aux

techniques sérologiques est nécessaire :

Immunofluorescence indirecte (IFI)

Techniques immuno-enzymatiques :ELISA

2-Phase méningo-encéphalique (tardive):

Dans le LCR: recherche des trypanosomes (après éventuel enrichissement par

centrifugation): souvent difficile de voir des trypanosomes.

Toute suspicion de THA impose la réalisation d’une ponction lombaire.

La numération des cellules constitue un bon critère de passage en phase

neurologique:

les IgM sont 4-20 fois supérieures a la normale. hyperleucocytose,

monocytose, et surtout plasmocytose (cellule de Mott) et protidémie forte

quasi pathognomonique de la trypanosomose

Trypanosomose Humaine Américaine (Maladie de

Chagas):

La Trypanosomose Américaine, ou maladie de Chagas, est provoquée par

Trypanosoma cruzi, transmis par les déjections des arthropodes

hématophages, réduves du genre Triatoma, Rhodnius ou Panstrongylus. Elle

sévit à l'état endémique en Amérique tropicale

Le diagnostic est évoqué sur des arguments:

Épidémiologiques: séjour en zone d’endémie (continent sud américain,

Mexique, sud de l’Argentine).

Cliniques : œdème bipalpebral, unilateral (signe de Romana), fièvre

irrégulière), lésions musculaires, atteinte myocardique et digestive,…

Diagnostic biologique

Eléments d’orientation:

Diagnostic de la phase aiguë: diagnostic parasitologique direct

La recherche du parasite se fait au niveau du sang

On utilise les mêmes techniques que pour les trypanosomoses Africaines

Examen direct (goutte de sang a l’état frais)

Examens après concentration: (méthodes de concentrations)

Frottis, goutte épaisse,..

Après coloration au MGG: forme trypomastigote de Trypanosoma cruzi

allongée de 15 a 25 μm, kinetoplaste volumineux postérieur, près duquel se

trouve le kinétosome sur lequel s’insère le flagelle

Trypanosoma cruzi se différencie du T. brucei par un kinétoplaste subterminal

très volumineux et une forme trapue en C

Trypanosoma cruzi (trypomastigote)

Trypanosoma cruzi (trypomastigote)

Trypanosoma cruzi (trypomastigote)

Rechercher les anticorps spécifiques de T. cruzi : IFI, ELISA, HAI

Diagnostic de la phase chronique: essentiellement sérologique

Autres techniques exceptionnellement pratiquées:

Le xénodiagnostic: les malades sont

piqués par des réduves non infectées élevées

au laboratoire. Les trypomastigotes seront

recherchés 30, 60 et 90 jours plus tard dans

leurs déjections,.

L’hémoculture: milieu (LIT: Liver Infusion Tryptose) ;

Les cultures sont maintenues à 28 °C et sont observées mensuellement pendant 4

à 6 mois (recherche des epimastigotes identiques a celles de T. brucie )

Biologie moléculaire: recherche de l’ADN parasitaire par PCR

IV-MICROFILAIRES SANGUICOLES

Loa loa: filariose cutanéo-dermique par la localisation des adultes et

sanguicoles par la localisation des microfilaires.

Wuchereria bancrofti, Brugia malayi: filarioses lymphatiques par

la localisation des adultes et des microfilaires dans les voies lymphatiques, et

sanguicoles par la localisation des microfilaires.

Séjour en zone d’endémie

Hyper éosinophilie+++

Signes cliniques: très différents selon les espèces:

Loase: œdème allergique, migrateur et fugace ( œdème de Calabar),

localisé préférentiellement aux membres supérieurs , reptation de la filaire

adulte sous la conjonctive de l’œil.

Éléments d’orientation:

Filarioses lymphatiques: Wuchereria bancrofti, Brugia malayi

Lymphangites aigues et chroniques, sclérose et éléphantiasis des membres.

Recherche et identification des microfilaires:

Prélèvement sanguin:

Les microfilaires apparaissent dans le sang selon une périodicité qu’il faut

respecter pour optimiser le rendement diagnostique :

Loa loa : le jour, entre 10 h et 16 h

W. bancrofti: la nuit, entre 22 h et 4 h

B. malayi : la nuit, entre 22 h et 4 h

Techniques de mise en évidence

Examen direct: goutte de 10 μl de sang frais, entre lame et lamelle

permettant de voir facilement la microfilaire entre les globules rouges (Gx 10 )

Microfilaire de Loa loa.

Frottis sanguin ou goutte épaisse (MGG): facilitent le diagnostic

d’espèce.

Les critères morphologiques d’identification sont en particulier:

La taille des microfilaires

La présence ou non d’une gaine plus ou moins colorée au Giemsa,

La forme de l’extrémité postérieure plus ou moins effilée

L’extrémité céphalique grande ou petite

La présence plus ou moins terminale des noyaux somatiques

Microfilaires Loa loa Wuchereria

bancrofti

Brugia malayi

Critères

Taille 300 um 300 um 250 um

Présence d’une

gaine plus ou

moins colorée

Gaine courte mal colorée Gaine courte bien

colorée

Gaine longue bien colorée

L’espace

céphalique

Court Court Long

l’extrémité

postérieure

(caudale)

Effilée contenant des noyaux

terminaux

Effilée contenant des

noyaux subterminaux

2renflements

,1subterminal et

1terminal contenant

chacun un noyau

Principaux caractères des microfilaires sanguinoles

La gaine

Microfilaire de Loa loa

Frottis de sang coloré: Extrémité post effilée, avec noyaux terminaux allongés

Microilaire de Loa loa : frottis sanguin

Frottis de sang: microfilaire de Loa loa

Microfilaire de W. bancrofti GE colorée noyaux subterminaux

Microfilaires Wuchereria bancrofti

Brugia malayi. Espace céphalique long. Deux noyaux terminaux bien séparés

Frottis. Microfilaires Brugia malayi. Gaine longue bien colorée

Brugia malayi. Goutte épaisse. Attitude régulière. Coloration M.G.G. Obj. 10.

Technique de leuco-concentration: très utile en cas de pauci

parasitisme. Elle conserve la mobilité des microfilaires

Microfilaire de Loa loa (LCC)

Sérologie: les résultats obtenus doivent être interprètes avec beaucoup

de prudence du fait des réactions croisées nombreuses existant entre les

nématodes: ELISA, IFI, Electrosynerese …

Détection des antigènes circulants : kits spécifiques de Wuchereria

bancrofti par immuno-chromatographie, donne de bons résultats.