Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel

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Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel Au laboratoire de Pellegrin. M. pneumoniae with respiratory epithelial cells. Infections respiratoires à M. pneumoniae. ● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie) - PowerPoint PPT Presentation

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Diagnostic bactériologique Diagnostic bactériologique de de Mycoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniae

par PCR en temps réelpar PCR en temps réel

Au laboratoire de PellegrinAu laboratoire de Pellegrin

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M. pneumoniae with respiratory epithelial cells

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● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie)

● Infections respiratoires aigues, souvent bénignes

● Transmission aérienne

● Enfant > 5ans, adulte jeune-Trachéobronchites +++- Pharyngites- Pneumopathies atypiques- Asymptomatique (20%)

● Mode endémique avec poussées épidémiques Tous les 4-7 ans

Probable : exacerbation de l’asthme chez enfant et adulte

Infections respiratoires à M. pneumoniae

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Manifestations extra-respiratoires

● Lésions cutanées +++éruption, exanthème, érythème noueux, Stevens Johnson

● Atteintes neurologiques encéphalites, neuropathies périphériques, Guillain Barré

● Arhrites, arthralgies

● Cardiaques (rares)myocardites, péricardites

● Anémie hémolytiques (rares)

Non spécifiques

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Diagnostic biologique

● Recherche directe de la bactérie

- Culture

- PCR

● Recherche indirecte : recherche d'anticorps

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Prélèvements pour détection directe

● Mêmes pour culture et PCR

● Respiratoires pvt gorge (infection diffuse)asp. naso-pharyngée (jeune enfant)LBA (formes sévères)expectorations peu adaptées

Autres (rares)

● Milieu de transport- Milieu 2SP (saccharose-phosphate)- conservation +4°C 24 h, puis -70°C

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Culture de M. pneumoniae

• Fastidieuse, longue • Exigence nutritionnelles milieux spéciaux enrichis

Hayflick modifié, SP4(20% sérum, extrait levure, -lactamines)Solide ou liquideGlucose 37°C +/- CO2 pendant 2-3 semaines

• Prop. métaboliques en milieu liquideFermentation glucose Changement de couleur du rouge de phénol

• Dilutions indispensables (inhibiteurs)

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Détection de la croissance en milieu solide

● Aspect des colonies sur agar (37°C, CO2) Loupe binoculaire, 50-300µm

2-3 sem

● Identification : aspect colonies, hémadsorption, PCR

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Détection de la croissance en milieu liquide

● Virage indicateur coloré

- Fermentation du glucose acidification : virage du rouge de phénol : rouge jaune

- 2-3 semaines en primo-isolement

M. pneumoniae

● Sensibilité vs PCR: 60%, spécificité : 100% rare (labo spécialisés)

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Détection par biologie moléculaire

● Hybridation par sonde : peu sensible

● 1ère publication de PCR en 1989 (Bernet, JCM, 89)

1989-2003 : 34 articles (Loens, JCM, 03)

● Cibles variées ATPase, gène tuf

ARNr 16S adhésine P1 +++ (meilleure sensibilité)

● Techniques variées- ADN : PCR, PCR multiplex, PCR en temps réel

- ARN : NASBA, RT-PCR

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● Extraction d’ADN- phénol-chloroforme et précipitation de l’ADN

+/- SDS, protéinase K- sonication- ébullition- kits commercialisés- Automate (ex: MagNAPure Roche diagnostic)

Sensibilité: 78-92%, spécificité: 92-100%

Détection par biologie moléculaire (2)

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Avantages Rapidité Grande spécificité Bonne sensibilité si infection Quantification possible Typage des souches, (groupe 1 et 2) Autres pathogènes respiratoires (PCR multiplex)

Limites Méthodes "maison" Contrôles indispensables

- Négatifs- Internes- Extraction

Présence possible comme commensal? Détection d’organismes non viables

Détection par biologie moléculaire (3)

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Diagnostic biologique

● Recherche directe de la bactérie

- Culture

- PCR

● Recherche indirecte : recherche d'anticorps

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Diagnostic indirect sérologique

• Très utilisé mais résultat tardif

• Cinétique des ACIgM : 1 sem après début infection, enfants +++IgG : pic à 3 semaines, décroissance plusieurs moisIgA ?

• Différentes techniques- agglutination de particules- immunofluorescence- Fixation du complément- ELISA (différents antigènes)

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IgG

IgM

Infection

Temps (semaines)

Qua

ntité

d'A

ntic

orps

Cinétique des anticorps

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En résumé

Diagnostic par PCR + sérologie

• Enfants, PCR + IgM (sérum en phase aigue)

degré maximal de certitude diagnostic en 1 ou 2 jours

• Une PCR positive isolée chez enfant avec pneumopathie atypique : très suggestif

• Adultes, PCR + FC ( 1/64) ou IgG X4 entre 2 sérums

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Aujourd'hui, recherche de M.pneumoniae

Prélèvement de gorge

Extraction d'ADN automatisée

PCR en temps réel Taqman

Interprétation des résultats

MagNAPure

Prism 7000

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Extraction d'ADN automatisée

MagNA Pure LC, Roche diagnostics

Principe

- Lyse cellulaire et dénaturation des protéines

- Digestion des protéines (Protéinase K)

- Liaison de l'ADN à la surface de particules de verre magnétiques

- Lavages (élimination des protéines, membranes, etc…)

- Elution de l'ADN purifié à haute température

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Amplification par PCR temps réel

ABI Prism 7000

PCR en temps réel

- Protocole Taqman

- Cible : Adhésine P12 amorces :

P1-204P1-328

1 sonde de 125 bp P1-284R (FAM-TAMRA)

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Sondes Taqman - Principe

Hybridation d'une sonde spécifique

Composition de la sonde ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5'Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein

● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

pas d'émission de fluorescence

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Cette méthode repose sur deux principes :- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)- l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

Spécificité l’amorce pour la PCR Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

5’

5’

3’

3’

FP

RP

Reporter Quencher

FAM, VIC TAMRA

Sondes Taqman - Principe

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5’

5’

3’

3’

FP

RP

R Q

Lumière

- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),

pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

Sondes Taqman - Principe

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- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde libération du reporter

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R

Q

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R

Q

- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

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Sondes Taqman

Avantage : - Spécificité accrue

Spécificité des primers pour la PCRSpécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

- Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents

Inconvénient :- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion

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Protocole opératoire

- Extraits dilués au 1/10ème

- Préparation du MixAmorcesSondesMix (dNTP, Taq Polymérse, tampon)+ Ajout de l'échantillon extrait au 1/10ème

- Contrôle interne : mélange précédent + culture extraite de Mpn permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR dans l'échantillon

- Amplification d'une gamme de concentrationCulture extraite, pure et dilutions au 1/10ème, 1/100ème et 1/1000ème

- Protocole du thermocycleur10min 95°C15 sec à 95°C1 min à 60°C 40 cycles

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Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100, 1/1000ème

pur10-1 10-2 10-3

Interprétation

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En rouge : patient positif pour M. pneumoniae

Patient

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Conclusion

Y a-t-il infection par M. pneumoniae ?

PCR positive : oui, très certainement

PCR négative : ne permet pas d'éliminer le diagnostic A confronter avec le résultat de la culture et des sérologies