Défi Imag’In 2015 Projet ARKENCIEL EXPLORATION DES ......Démonstration de principe réussie mais...
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Journées de restitution – Défi Imag’In 2015 – Projet ARKENCIEL XLIM Research institute 24 février 2016 UGMA Photonics department E XPLORATION DES POTENTIALITÉS DES SOURCES LASER SUPERCONTINUUM POUR L ’ IMAGERIE MULTIPHOTONIQUE Claire Lefort , Rod O’Connor, Véronique Blanquet, Fabienne Baraige, Philippe Lévêque, Vincent Couderc, Philippe Leproux Université de Limoges – CNRS XLIM Research Institute UMR 7252 – – INRA Unité de Génétique Moléculaire Animale UMR 1061 – Projet ARKENCIEL
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Journées de restitution – Défi Imag’In 2015 – Projet ARKENCIEL
XLIM Research institute 24 février 2016 UGMA Photonics department
EXPLORATION DES POTENTIALITÉS DES
SOURCES LASER SUPERCONTINUUM POUR
L’IMAGERIE MULTIPHOTONIQUE
Claire Lefort, Rod O’Connor, Véronique Blanquet, Fabienne Baraige,Philippe Lévêque, Vincent Couderc, Philippe Leproux
Université de Limoges
– CNRS XLIM Research Institute UMR 7252 –– INRA Unité de Génétique Moléculaire Animale UMR 1061 –
Projet ARKENCIEL
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Consortium : l’interdisciplinarité
Physiciens Informaticien Biologistes Neuroscientifique
Claire Lefort
(coordinateur)
Philippe Lévêque
Vincent Couderc
Philippe Leproux Véronique Blanquet
Fabienne Baraige
Rod O’Connor
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Multiphoton microscopy in life sciences
Quantitative analysis of
dynamics intracellular
processes
Membrane potentials
measurements
Calcic flow for neural activities
Following of tumor
evolution
Peterdi 2009, Stosiek 2003, Jung 2004
Following of cancerous
biomarkers
Spectral Analysis of
keratin of human
epidermis
Pena 2005, Kirkpatrick 2007, Cheng 2012
Collagen structure
visualization
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Multiphoton multicolor microscopy: the interest of a wideband excitation
Exogenous labelling
We want to see Labelling 2P Absorption Emission
Blood vessels Texas Red 790 nm 610 nm
Tumor cells mVenus 950 nm 530 nm
Cell nucleus DAPI 740 nm 460 nm
Calcic flow Fura-2 700 nm 500 nm
Immune cells Alexa 568 850 nm 600 nm
Endogenous fluorophores
We want to see 2P Absorption Emission
Elastin 730 nm 610 nm
Retinol 720 nm 530 nm
NADH 700 nm 460 nm
A wideband laser excitation for:
Excite a large panel of exogenous or endogenous fluorophores
Image several fluorophores simultaneously even with very
distant TPA spectra
Adapt the excitation to the TPA spectra
Zone couverte par
la source standard
(10 nm de largeur)
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Wideband excitation for multiphoton imaging: literature
Typically: spectral broadening of femtosecond pulses in a photonic crystal fiber
(PCF) associated with a step of pulse shaping for temporal compressing
Dong Li 2009
(Applied Physics Letters)
Interesting solution answering the
questions, BUT:
Complex technically (not turn-key solution)
Expensive
Unstable in the time
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Multiphoton process with a nanosecond SC source: 1st experimental test
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Two proteins imaged:- Myosin (muscular contractions)
- Actin (structure)
Alternation of myosin and actin
Detected signals:- SHG for myosin
- 2PF for actin (labelling: Alexa fluor® 546)
Multiphoton process with a nanosecond SC source: 1st experimental test
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Scale bar : 10 µm
SC
Ti:Sa
Actine
Alexa 546 Myosine
SHGSuperimposition
Comparison on the image quality obtained
between nanosecond SC and Ti: Sa sources
Multiphoton process with a nanosecond SC source: 1st experimental test
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Scale bar : 10 µm
SC
Ti:Sa
Actine
Alexa 546
Myosine
SHGSuper-
position
Quantification of the signal contrasts
Same contrast for SHG
Better contrast in 2PF with Ti: Sa
Multiphoton process with a nanosecond SC source: 1st experimental test
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Why a nanosecond supercontinuum source allows multiphoton processesBooth et al.1998 : Imagerie 2P CW
Bewerdorf et al.1997 : Imagerie 2P ps 200 MHz
Denk et al. 2006 : Principes physiques de la MPM
𝛹 ∝
Multiphoton
emission flow
Laser peak
power Laser average power
Laser repetition rate
Laser pulse duration
Cste ∝ fluorophore,
objective…
𝜂 𝑃
Laser peak
power
Cste ∝ fluorophore,
objective…
𝜂 𝑃
Ti:Sa SC
f 80 MHz 250 kHz
τ 150 fs 1 ns
𝑷 10 mW 2.2 mW
For a constant Ψ
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Multicolor multiphoton microscopy
In vivo multiphoton imaging with a SC source
Tumor cells U87 labelled with eGFP
Blood vessels labelled with Texas Red
eGFP
SC
Texas Red
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Conclusion sur les résultats
Two-photon fluorescence and second harmonic generation
Similar between a nanosecond supercontinuum source and classical Ti: Sapphire laser
Good contrast in second harmonic generation
Progress to do for increasing the two-photon fluorescence contrast adjusting better the
excitation spectrum to the two-photon absorption one
Démonstration de principe réussie
mais utilisation d’un système commercial non adapté pour
l’objectif du projet ARKENCIEL
Achat d’un microscope 2P tout ouvert
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