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Diagnostic des viroses

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Introduction

Le diagnostic est avant tout clinique.

Pourquoi (ou pour qui) aller plus loin en mettant en évidence le virus (direct) ou un stigmate du virus (indirect) ? :

• affirmer le rôle effectif d’un virus pour des patients immunodéprimés de façon à pouvoir traiter ou prévoir l’évolution de la maladie,

• détecter la présence effective du virus pour éviter la virose (prophylaxie pour : greffons, transfusions, rubéole pour les femmes enceintes, sida pour les sexuellement actifs…)

• surveiller une épidémie et préparer les futurs vaccins.

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1.Mise en évidence du virus

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1. Mettre en évidence le virus1.1. Par microscopie électronique

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1.2. Par immunolatex, immunofluorescence, immunochromatographie ou immunoenzymologie

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a. Recherche RT-PCR Identification

Détection des Norwalk-like par RT-PCR

Fabienne Loisy , Pierre Le Cann, Monique PommepuyInstitut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer - Direction de l'Environnement et de l'Aménagement LittoralDépartement Microbiologie et Phycotoxines, BP 21105, 44311 Nantes Cedex 3, France QuickTime™ et un

décompresseur TIFF (LZW)sont requis pour visionner cette image.

RNA extraits incluant le RNA viral recherché

Captation des RNA viraux spécifiques par une sonde biotynilée, fixée sur une bille magnétique streptavidinylée

Purification par lavage du RNA viral : l’aimant permet de récupérer spécifiquement la sonde.

Transcription inverse du RNA viral puis

Amplification par RT-PCR avec les amorces, les enzymes RT MuL V et DNA polymérase. L’amorce est la sonde

Détection des amplicons classique.

RT-PCR :

Amplification d’un RNA en DNA par transcription inverse en cDNA suivi d’une amplification classique.

1.3. Par des techniques de biologie moléculaire

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Fonctionnement de la PCR en temps réel :

La plupart des PCR quantitatives (temps réel) sont basées sur lamesure d’émission de fluorescence proportionnelle àla quantité de gènes amplifiés.Plusieurs techniques existent : elles utilisent

• soit des molécules se liant à l'ADN, • soit des sondes moléculaires spécifiques de la cible amplifiée.

Un seul exemple est développé.(voir notamment le site http://www.adiagene.fr/recherche.phpPour compléments)

b. PCR quantitative (dite en temps réel)

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Un exemple d’utilisation de sondes :La fluorescence est obtenue par l’utilisation d’une sonde marquée. Le but est de faire apparaître la fluorescence de manière proportionnelle à la quantité d'ADN cible présent. Deux marqueurs sont nécessaires : un marqueur R (reporter) émetteur de fluorescence et un marqueur Q (quencher) qui absorbe cette fluorescence lorsque R et Q sont proches.Lorsque Q et R sont séparés soit par hydrolyse de la sonde, soit lors de l’hybridation des amorces, soit lors de la synthèse du brin complémentaire, la fluorescence de R n’est plus absorbée. La mesure de la fluorescence est donc proportionnelle au nombre d'ADN produits par la PCR, lui même proportionnel au nombre d'ADN cibles présents au départ. L'utilisation de sondes spécifiques de l'ADN cible recherché permet d'obtenir une très grande sensibilité

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Les courbes obtenues ont cette allure :

Intensité de fluorescence

Cycles de PCR

Exemple d’application médicale : dosage de HCV dans le sérum.

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1.4. Mise en évidence du virus par culture

• problèmes de SÉCURITÉ

• Technique :

• prélèvement : écouvillons en gélose Charbon, aspirations ou sécrétions dans du milieu de Hanks, sellesConserver à 4°C

• culture sur MRC5 ou Véro après décontamination microbienne. Addition possible d’anticorps connus pour étudier l’inhibition de la culture en parallèle à la culture.

• examen des cultures pour déterminer les effets cytopathologiques (cytopathiques).

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2. Mise en évidence ou titrage d’anticorps

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2.1. introductionIntérêt :

• rapide

• économique

• dangers virologiques faibles

Inconvénients :

• fenêtre de séronégativité

• nécessite parfois deux prélèvements successifs et un titrage

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2.2. techniquesTechniques classiques :

• immunoenzymologie

• immunofluorescence

• fixation du complément, inhibition de l’hémagglutination…

Techniques particulières :

• neutralisation de l’ECP du virus par le sérum du malade

• western blot