ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE LA ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE LA TRIGONELLINE EXTRAITE DE TRIGONELLINE EXTRAITE DE DIOSPYROS DIOSPYROS

MWEROENSISMWEROENSIS

UNIVERSITÉ DE LUBUMBASHI UNIVERSITÉ DE LUBUMBASHI

FACULTÉ DES SCIENCESFACULTÉ DES SCIENCES

Département de ChimieDépartement de Chimie

CT SHENGO LUTANDULACT SHENGO LUTANDULARecherches pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Supérieures (2006-2007)Recherches pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Supérieures (2006-2007)

Orientation: ChimieOrientation: Chimie

PLAN DE PRESENTATIONPLAN DE PRESENTATION

INTRODUCTIONINTRODUCTION

1. Choix de 1. Choix de Diospyros mweroensisDiospyros mweroensis

2. Données bibliographiques2. Données bibliographiques

3. Présentation du matériel végétal3. Présentation du matériel végétal

4. Résultats et discussions4. Résultats et discussions

CONCLUSIONCONCLUSION

IntroductionIntroduction

But de la rechercheBut de la recherche

Étudier les espèces végétales locales appartenant Étudier les espèces végétales locales appartenant au genre Diospyrosau genre Diospyros

caractériser leurs substances naturellescaractériser leurs substances naturelles Contribuer à la recherche des molécules d’intérêt Contribuer à la recherche des molécules d’intérêt

pharmacologiquepharmacologique

11.. Choix de Choix de Diospyros mweroensisDiospyros mweroensis Plantes tropicales appartenant aux EbenaceaePlantes tropicales appartenant aux Ebenaceae et accessibles au Katangaet accessibles au Katanga

Plantes très utilisées en médecine traditionnellePlantes très utilisées en médecine traditionnelle

Plantes ichtyotoxiquesPlantes ichtyotoxiques

Nombreuses recherches y relatives à cause de Nombreuses recherches y relatives à cause de l’intérêt suscité auprès des chercheurs l’intérêt suscité auprès des chercheurs notamment les chimistes et les pharmaciens notamment les chimistes et les pharmaciens

2. Données bibliographiques2. Données bibliographiques

Le genre Diospyros est une source:Le genre Diospyros est une source:

1.1. Des naphtoquinones et leurs dérivésDes naphtoquinones et leurs dérivés

2. Des triterpènes2. Des triterpènes

3. Des quelques hétérosides3. Des quelques hétérosides

- - Substances d’intérêt pharmacologiqueSubstances d’intérêt pharmacologique

- Sources potentielles des médicaments- Sources potentielles des médicaments

Quelques molécules activesQuelques molécules actives

CH3

OHOHO

[Glu]

O

[Glu]

CH3O

R3 R1

R2OH O

O1

2

3

7 9

510

4

8

6

CH3H3C

OH OHO

O

O

O

Molécules Molécules activesactives

Espèce Espèce végétalevégétale

PropriétésPropriétés StructuresStructures

Plumbagine Plumbagine et ses et ses dérivésdérivés

Diospyros Diospyros maritima maritima et et D. D. novoguinensinovoguinensiss

AntibactériennesAntibactériennes22

ElliptinoneElliptinone Diospyros Diospyros mweroensismweroensis

IchtyotoxiquesIchtyotoxiques3131

Diospyrol Diospyrol Diospyros Diospyros mollismollis AnthelminthiquesAnthelminthiques11

Nom scientifiqueNom scientifique Nom vernaculaireNom vernaculaire Langue vernaculaireLangue vernaculaire

Diospyros batocanaDiospyros batocana3333 LushilambotoLushilamboto BembaBemba

Diospyros Diospyros mespiliformismespiliformis3333

KasangolaKasangola SangaSanga

Diospyros mweroensisDiospyros mweroensis3131

KatulaKatula Bemba, Sanga, LambaBemba, Sanga, Lamba

Kampombwe ou Kampombwe ou MtumbatupaMtumbatupa BembaBemba

mupetamupeta TabwaTabwa

Diospyros pallensDiospyros pallens2424 MuntufitaMuntufita BembaBemba

3. Présentation du matériel végétal3. Présentation du matériel végétal

Diospyros mweroensisDiospyros mweroensis

Intérêt de la trigonellineIntérêt de la trigonelline

La trigonelline est une molécule active La trigonelline est une molécule active possédant les propriétés suivantes:possédant les propriétés suivantes:

- - AnticancéreuseAnticancéreuse

- AntiseptiqueAntiseptique

- AnticholestérolémiqueAnticholestérolémique

- hypoglycémiantehypoglycémiante

4. Résultats et discussions4. Résultats et discussions

4.1. Extraction des substances naturelles4.1. Extraction des substances naturelles

4.2. Travaux de purification 4.2. Travaux de purification 4.2.1. Purification par extraction 4.2.1. Purification par extraction solvant-solvantsolvant-solvant 4.2.2. Purification chromatographique4.2.2. Purification chromatographique

4.3. Détermination de la structure de la 4.3. Détermination de la structure de la trigonellinetrigonelline

4.14.1 Extraction des substances naturellesExtraction des substances naturelles

500g d’écorces de tiges

Ecorces de tiges séchées

750ml CH2Cl2

3x750ml MeOH

Filtrat

Filtrat évaporé(20.0g) Ecorces de tiges épuisées

(marc)

4.2.Travaux de purification4.2.Travaux de purification

4.2.1. Purification par extraction4.2.1. Purification par extraction solvant-solvant solvant-solvant 4.2.2.Purification chromatographique 4.2.2.Purification chromatographique

- - Sur colonne sur silice RP-C18Sur colonne sur silice RP-C18 - Par HPLC sur silice RP-C18 - Par HPLC sur silice RP-C18

Extrait brut(8.00g)

Filtrat Dépôts organiques

Phase aqueusePhase organique

Résidu(0.0902g)

Phase aqueusePhase organique

Résidunégligeable

Phase aqueuseRésidu(1.582g)

Phase org. Résidu

(0.0528g)

2x50ml Acétate d’éthyle

2x50ml Ether diéthylique

50ml HCl à 0,1%

2x50ml hexane

4.2.1. Extraction par solvants4.2.1. Extraction par solvants

4.2.2. Purification chromatographique4.2.2. Purification chromatographique

• Par chromatographie sur colonne remplie de silice RP-C18 Par chromatographie sur colonne remplie de silice RP-C18 avec le système des solvants MeOH/Havec le système des solvants MeOH/H22O exploitant le O exploitant le gradient de rapports en volume 80 à 40% du MeOHgradient de rapports en volume 80 à 40% du MeOH

• HPLC: Chromatographie liquide à haute performanceHPLC: Chromatographie liquide à haute performance

- - Sur silice RP-C18 avec le système des solvants MeOH/HSur silice RP-C18 avec le système des solvants MeOH/H22O O

- Débit d’injection 1ml/min et un gradient d’élution de 100 à - Débit d’injection 1ml/min et un gradient d’élution de 100 à

70 % en volume de MeOH 70 % en volume de MeOH

1582 mg

170,9mg(10,8%)

117,1mg(7,4%)

170,9mg(10,8%)

246,8mg246,8mg(15,6%)(15,6%)

189,8mg(12,0%)

118,6mg(7,5%)

378,1mg(23,9%)

189,8mg(12,0%)

Chromatographie sur silice RP-C18

Purification par HPLC

31,64mg de Trigonelline31,64mg de Trigonelline (0,40%) (0,40%)

0,40% du poids de l’extrait brut (20g) et Rf 0,39 sur couche mince de silice0,40% du poids de l’extrait brut (20g) et Rf 0,39 sur couche mince de silice dans dans EtOH/HEtOH/H22O 9:1 O 9:1

4.3 . 4.3 . Détermination de la structure de laDétermination de la structure de la trigonelline trigonelline

1. Spectre RMN-proton dans le méthanol deutérié avec 1. Spectre RMN-proton dans le méthanol deutérié avec TMS comme étalon interne à 300MHzTMS comme étalon interne à 300MHz

2. Spectre UV-visible dans le système des solvants 2. Spectre UV-visible dans le système des solvants MeOH/HMeOH/H22O (100 à 30% de MeOH) O (100 à 30% de MeOH)

3. Spectrométrie de masse à impact électronique utilisant 3. Spectrométrie de masse à impact électronique utilisant 70eV70eV

Données spectrales RMN-protonDonnées spectrales RMN-proton

+-5

6

-

N

O

O

CH3

4

1

2

3

Attribution des Attribution des signaux et signaux et

multiplicitémultiplicité

Données de la Données de la littératurelittérature37-3937-39

(δ en ppm)(δ en ppm)

Données Données obtenues obtenues

(δ en ppm)(δ en ppm)

CHCH33, s, s 4,454,45 4,434,43

H5, tH5, t 8.09 8.09 8.06 (7Hz)8.06 (7Hz)

H4 et H6, dH4 et H6, d 8,85 (8Hz)8,85 (8Hz)8.84 (6Hz)8.84 (6Hz)

8,90 (8Hz) 8,86 8,90 (8Hz) 8,86 (6Hz) (6Hz)

H2, sH2, s 9,139,13 9,209,20

4+6 522

Trigonelline Trigonelline 2626 MeOHMeOHHH22OO

N+

CH3

Données spectrales UV-VisibleDonnées spectrales UV-VisibleDonnées de la littératureDonnées de la littérature26, 26, 3636 Données obtenuesDonnées obtenues

Système de solvantsSystème de solvants(proportions)(proportions)

( longueurs d’onde en nm)( longueurs d’onde en nm)

Bande Bande d’absorption d’absorption

maximalemaximale(nm)(nm)

Système de solvantsSystème de solvants(proportions)(proportions)

( longueurs d’onde en nm)( longueurs d’onde en nm)

Bande d’absorption Bande d’absorption maximalemaximale(nm)(nm)

DEA+AcOH DEA+AcOH (pH=5,3)/MeOH(pH=5,3)/MeOH

(7÷3)(7÷3)(260 à 400nm)(260 à 400nm)

263.3263.3MeOH / HMeOH / H

22OO

(1÷ 0, 8÷ 2 à 7÷3)(1÷ 0, 8÷ 2 à 7÷3)(210 à 390nm)(210 à 390nm)

265.5265.5

HH22O/MeOH/AcOHO/MeOH/AcOH

(20÷79÷1 à 0÷99÷1)(20÷79÷1 à 0÷99÷1)(260 à 400nm)(260 à 400nm)

264.0264.0

Données spectrales de masseDonnées spectrales de masse

Masse du fragment ionique Masse du fragment ionique (dalton)(dalton)

Intensité du signal ou Intensité du signal ou abondance relative du abondance relative du fragment (%)fragment (%)

138138 (M + H)(M + H) + +

4848

123 [(M + H)123 [(M + H) + + - °CH - °CH33]] 5353

107 [(M + H107 [(M + H++)- °OCH)- °OCH33]] 4949

94 [(M + H)94 [(M + H) + + - CO - CO22]]

((pic de basepic de base))100100

+-5

6

-4

1

2

3 , H

N

O

O

CH3Trigonelline Trigonelline 2626

ConclusionConclusion1.1. Extraction des substances naturelles : Extraction des substances naturelles : 4% (20g 4% (20g

d’extraits bruts obtenus à partir de 500g du matériel d’extraits bruts obtenus à partir de 500g du matériel végétal)végétal)

2.2. Purification des substances naturelles Purification des substances naturelles ((Extraction Extraction par solvant et chromatographiespar solvant et chromatographies)) : : elle a permis elle a permis d’obtenir 31,64mg de trigonelline (0,40%)d’obtenir 31,64mg de trigonelline (0,40%)

3.3. Données spectrales Données spectrales ( ( celles decelles de RMN-H, UV-Vis et SM RMN-H, UV-Vis et SM comparées à celles de la littératurecomparées à celles de la littérature): Elles sont ): Elles sont concordantes pour la structure de la trigonelline concordantes pour la structure de la trigonelline isolée de isolée de Diospyros mweroensisDiospyros mweroensis..

AnnexesAnnexes

Unité HPLC à double détection UV-Visible et SMUnité HPLC à double détection UV-Visible et SM

Pilotage d’une HPLC par un logiciel CHEM Pilotage d’une HPLC par un logiciel CHEM STATION (Agilent technologies Inc)STATION (Agilent technologies Inc)

Système d’injection de l’échantillonSystème d’injection de l’échantillon

Caractéristiques de la colonne HPLCCaractéristiques de la colonne HPLC

Précolonne ou colonne de gardePrécolonne ou colonne de garde:L=0,4-:L=0,4-1cm, DI=4,5mm avec traitement de 1cm, DI=4,5mm avec traitement de passivation, chemisage en verre ou PEEK passivation, chemisage en verre ou PEEK (polymère en (polymère en polyethylene-etherketonepolyethylene-etherketone))

Disque en verre frittéDisque en verre fritté: porosité 0,5µm: porosité 0,5µmColonne standard ZorbaxColonne standard Zorbax: L=10cm, : L=10cm,

DI=4,5mmDI=4,5mmColonne avec des faiblesColonne avec des faibles DI=2-4mm,1- DI=2-4mm,1-

2mm2mm et 0,1-1mm pour les capillaires et 0,1-1mm pour les capillaires

Silice RP-C18Silice RP-C18

Détecteurs utilisés en chromatographie

Détecteur à conductibilité Détecteur à conductibilité thermique (universel)thermique (universel)

Détecteur à ionisation de Détecteur à ionisation de flamme (spécifique aux flamme (spécifique aux composés organiques en composés organiques en CPG)CPG)

Détecteur Détecteur thermoionique(spécifique aux thermoionique(spécifique aux composés de P et de N)composés de P et de N)

Détecteurs utilisés en Détecteurs utilisés en chromatographiechromatographie

Détecteur à capture Détecteur à capture électronique (spécifique électronique (spécifique aux dérivés halocarbonés)aux dérivés halocarbonés)

Détecteurs à photo-Détecteurs à photo-ionisation (spécifique aux ionisation (spécifique aux hydrocarbures et les hydrocarbures et les composés de S et de P)composés de S et de P)

Détecteur par réfractométrie différentielleDétecteur par réfractométrie différentielle

Principe de l’analyse en spectroscopie RMNPrincipe de l’analyse en spectroscopie RMN

Appareil RMN (BRUKER avance 500)Appareil RMN (BRUKER avance 500)

Principe de la spectrométrie de masse

Spectromètre de masseSpectromètre de masse