applications concernent le domainede la construction, comme revê-tement intérieur ou extérieur debâtiments dits « autonettoyants »ou des routes. Dans les produitsgrand public, on le trouve parexemple dans certains cosmé-tiques, des purificateurs d’air, desmeubles avec traitement anti-bactériens, des vêtements et mêmeen agroalimentaire, notammentdans le colorant E171 qui contien-drait des particules de quelque110 nm avec au moins 36 % deforme nano – <100 nm (2).

Les nano-objets peuvent êtreélaborés suivant deux approches,soit une approche descendante,dite « top-down », soit uneapproche ascendante, dite « bot-tom-up ». Dans la première, onpart de matériaux massifs pouraller vers une miniaturisationprogressive des éléments via diffé-rentes techniques, le broyage parexemple. Ceci permet d’obtenir degrandes quantités de matière maisle contrôle de l’état nanométriqueest délicat. Cette approche ne serapas plus développée ici. Dansla seconde approche, on part debriques élémentaires qui sontassemblées pour construire un

L es nanotechnologies, qui ex-ploitent les propriétés spécifi-ques des nano-objets (optiques,

mécaniques, électriques…), connais-sent un développement remar-quable depuis plusieurs années ettouchent des domaines très divers,comme la photocatalyse et l’éner-gie. Les dispositifs impliquant desnanobriques intègrent de plus enplus d’objets grand public (1).

DE LA SYNTHÈSE DESNANOPARTICULES DE TIO2…

Le dioxyde de titane (TiO2), undes photocatalyseurs le plus pro-metteurs, paraît appelé à jouer unrôle majeur pour relever les défisenvironnementaux, en termes depollution notamment. C’est aussiun candidat pour l’utilisation effi-cace de l’énergie solaire dans desdispositifs photovoltaïques ou deséparation de l’eau pour la pro-duction d’hydrogène. Parmi lesproduits nanométriques fabriquésindustriellement, une part croissanteconcerne la commercialisation deTiO2 nanométrique, qui représen-tera, en 2015, 3 % de la productionannuelle du TiO2, soit environ 200 000 tonnes. Ses principales

dispositif. Cette approche, richeen termes de diversité d’organi-sation et d’architectures, fait appelà des techniques aussi bien phy-siques que chimiques pour la syn-thèse des NP. Dans ce cadre, lestechniques de synthèse en phasegazeuse, qui permettent des syn-thèses en flux – les NP sont pro-duites dans une zone puis immé-diatement transférées par un fluxgazeux vers une autre zone oùelles sont collectées –, donc desproductions en continu, sont par-ticulièrement intéressantes dupoint de vue industriel. Bien qu’ilexiste diverses variantes des pro-cédés en phase gazeuse (combus-tion, pyrolyse, plasma…), tous ont en commun leurs mécanismesfondamentaux de formation(figure ci-dessous) (3).

La variabilité des premières études de bio- et écotoxicité des nanoparticules (NP) est liéeà la description souvent incomplète de leurs propriétés. Leur caractérisation détaillée estindispensable non seulement à l’état initial, en poudre le plus souvent, mais surtout aprèsdispersion dans les milieux où seront ensuite étudiées leur toxicité et leur réactivité.

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De la synthèse des nanoparticules de TiO2à l’étude de leur comportement

© J.N. ROUZAUD/ENS

les auteursNathalie Herlin-Boime*, Isabelle Michaud-Soret**, Caroline Fauquant**, Lucie Armand*** et Marie Carrière**** Service des Photons, atomes et molécules,

Laboratoire Francis Perrin,CEA-CNRS URA 2453,DSM/IRAMIS, CEA Saclay,Gif-sur-Yvette

** Laboratoire de chimie et biologie des métaux,UMR 5249 CEA-CNRS-Université Joseph Fourier,DSV/IRTSV,

*** Laboratoire Lésions des acides nucléiques,UMR E3 CEA-CNRS-Université Joseph Fourier,DSM/INAC/SCIB,Grenoble

Nanocristal de TiO2 vu enmicroscopie électronique.

Mécanismes impliqués dansla croissance et l’agglomérationdes NP. D’après (3).

Précurseur

Dissociation du précuseur Agrégation Agglomération

Nucléation homogène(germes) Croissance(particules primaires)

Réacteur apport d’énergie

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covalentes entre particules. Il estalors quasiment impossible derevenir aux NP élémentaires.L’agglomération correspond, quant à elle, à des liaisons élec-trostatiques, plus faibles, qui peu-vent être, au moins partiellement,cassées par des traitements dedispersion.

En fonction des applicationsvisées, cette agglomération/-agrégation des NP peut devenirun réel problème, qu’il est possiblede limiter en jouant sur les para-mètres expérimentaux tels quela température, la géométrie desréacteurs et surtout la vitesse derefroidissement (trempe) des NP.

… À LEUR CARACTÉRI-SATION ET PRÉPARATIONEN SUSPENSION

Le développement des nano-technologies a suscité des interro-gations quant aux conséquencesde l’exposition humaine et envi-ronnementale aux NP. Les pre-mières études de toxicité ontmontré une grande variabilité derésultats, attribuée à une carac-térisation souvent incomplète. Les propriétés physico-chimiquesdes NP – composition chimique,taille, forme, niveau d’organisa-tion (structure cristalline), état dedispersion/agglomération, solubi-lité, concentration, pureté, surfacespécifique, charge de surface*1,enrobage éventuel… – influencentgrandement leur réactivité. Et leurétat d’agglomération module leurtoxicité : des NP bien disperséespeuvent avoir des effets cytotoxi-ques différents de NP agglomérées.

Une caractérisation détaillée despropriétés des NP est donc indis-pensable non seulement à l’étatde poudre, mais aussi et surtoutaprès leur dispersion dans lesmilieux où elles seront étudiéespour leur toxicité et/ou leur réac-tivité. Ceci est réalisé par diversesapproches interdisciplinaires :imagerie par microscopie, mesurede la charge de surface, mesurepar diffusion de lumière dela taille et de la polydispersité,dosage des métaux par spectro-métrie de masse…

La préparation des suspensionsde NP est différente selon le type

Les caractéristiques physico-chimiques finales sont fortementdépendantes de la distribution detaille des NP et de leur morpho-logie, donc des toutes premièresétapes du processus, à savoir lagermination et la croissance àpartir de la dissociation de pré-curseurs. Ces étapes ont lieu surdes temps très brefs – quelquesmillisecondes. Pour favoriser lesfaibles tailles, on maximise, parle choix des paramètres de disso-ciation du précurseur, la créationdu plus grand nombre de germespossible par nucléation homogène(monomères), puis leur croissancepar des réactions de surface entreun précurseur ou ses sous-produitset les premiers germes. Au coursde l’éloignement de la zone deréaction, le refroidissement rapideconduit au phénomène de coagu-lation, particulièrement sensibledans les procédés industriels decroissance en phase gazeuse, danslesquels les densités de particulessont élevées. Cette coagulation cor-respond en particulier au « collage »des NP entre elles, lorsque l’éner-gie disponible ne permet plus lacroissance par fusion des entitéslors des collisions dues au mou-vement brownien. Le processusentre alors dans un régime d’agré-gation ou d’agglomération. L’agré-gation se produit plutôt lorsquel’énergie est encore élevée et cor-respond à la création de liaisons

d’études à réaliser. Notons que le transfert direct des NP dans les milieux de culture conduitsouvent à des phénomènes deprécipitation qui empêchent desétudes reproductibles et nécessi-tent donc le développement destratégies alternatives (4). Parexemple, des conditions « réalistes »correspondant à une éventuelleexposition naturelle dans l’envi-ronnement conduisent à conserverdes agglomérats formés sponta-nément, alors que si on s’intéresseà la clarification des mécanismesde toxicité à l’échelle de la cellule,des suspensions aussi disperséesque possible dans les milieux bio-logiques sont préférables. Nousnous intéressons ici à ce secondtype d’études, pour lesquelles lamise au point de protocoles repro-ductibles et applicables à tout type de particules reste d’actua-lité, aussi bien pour des celluleseucaryotes que procaryotes.

Dans le cas de TiO2, la plupartdes études s’orientent vers un pro-tocole de dispersion comportantplusieurs étapes, dont une dedispersion par ultrasons hautepuissance (figure ci-contre, en bas)dans l’eau, laquelle permet d’ob-tenir une suspension mère quiservira pour la dilution dans lesdifférents milieux biologiquesdans différentes gammes deconcentrations (5). La stabilité decette dispersion est, le plus sou-vent, suivie par des techniques dediffusion de lumière (DLS) quidonnent des indications sur lataille moyenne et la dispersion de taille des nano-objets dans lasuspension.

VERS L’ÉTUDE DE LEURCOMPORTEMENTDANS LES MILIEUXBIOLOGIQUES

Rappelons que l’objectif de cesétudes est la compréhension dela toxicité des NP par des expé-riences in vivo ou in vitro. Pourles secondes, les cellules modèleseucaryotes ou procaryotes sontcultivées dans des milieux de cul-ture différents qui ont un impactspécifique, en particulier vis-à-visde l’agglomération. Les protocolesseront donc sensiblement diffé-rents en vue de travailler avec desNP aussi dispersées que possibletout en restant dans des conditionsbiologiques pertinentes.

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À gauche, distribution detaille des NP de TiO2 P25en microscopie électroniqueen transmission. La poudrede TiO2 P25 est un photo-catalyseur commercial deréférence. Échelle : 50 nm.À droite, particulesindividuelles de TiO2 P25.Échelle : 5 nm

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Effet du temps de dispersionhaute puissance sur unesuspension de TiO2 P25Évolution du diamètre moyen des nano-objets en fonction dutemps de traitement aux ultrasonsà haute puissance. La dispersionest effectuée dans l’eau. Aprèsdispersion, la suspension dansl’eau est stable plusieurssemaines.

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*1 Charge électrique présente à une interface et

toujours présente quand l’objet est placé

dans un fluide

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(1) tinyurl.com/inventaire-nanoproduits

(2)Weir S et al. (2012)

Environ Sci Technol 46, 2242-50

(3) Pratsinis S et al. (1998) Progress in Energy

and combustion science 24, 197-219

(4)Bihari P et al. (2008) Part Fibre Toxicol 5, 14

(5)Carriere M et al. (2013) J Trans Tox 1, 1-11

(6) tinyurl.com/these-NP-manufacturees

(7)Saquib Q et al. (2012) Toxicol In Vitro 26, 351-61

(8)Petit AN et al. (2011) J Phys: Conf Ser 304, 012035

(9) Fauquant C et al. (2012)

Conférence Nanosafe, intervention O3d-7

(10) Zhang ZB et al. (1998)

J Phys Chem B 102, 10871-8

que dans duits dedes

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nécessaires à leur croissance. Lesbactéries modèles généralementutilisées sont Escherichia coli,celles du genre Pseudomonas ouencore Cupriavidus metallidurans,très résistante aux stress métal-liques. L’effet du TiO2 sur E. colia été étudié dans un milieu où les NP étaient bien dispersées etrelativement stables, et où lesbactéries étaient capables de sedévelopper. Il a donc fallu mettreau point un milieu de culturepermettant la croissance des bac-téries, pauvre en sel et contenantun agent enrobant. Les meilleursrésultats ont été obtenus avec le pyrophosphate (8). Dans cesconditions, les bactéries subis-saient un stress modéré auquelelles pouvaient s’adapter. Il a aussiété montré que de petits chéla-teurs*2 physiologiques sécrétés par les bactéries sont capablesde s’accrocher aux NP et même desolubiliser de petites quantités detitane qui peuvent être retrouvéesdans les bactéries et perturberleurs activités métaboliques (9).Les mécanismes d’interférences etde toxicité sont loin d’être touscompris (figure ci-dessous).

La caractérisation des NPétudiées dans les milieux bio-logiques complexes et l’analysedans des conditions de dispersionreproductibles sont indispen-sables à la compréhension desmécanismes responsables d’uneéventuelle toxicité, adaptationou perturbation métabolique desbactéries.

Dans le cas de cellules euca-ryotes, pour de nombreuses étudesin vitro, le milieu des cellules estle DMEM (Dulbecco's ModifiedEagle Medium) auquel on rajoutedu sérum de veau fœtal (SVF),lequel contient principalement del’albumine. Le passage de la solu-tion mère au milieu biologique sefait via une étape d’enrobage desNP par un agent dispersant qui, en formant une couronne autourdes NP (corona), conduit à unemeilleure dispersion et permet d’enmoduler la réactivité de surface.L’enrobage par le SVF permet unetrès bonne stabilité sur plus de 48heures. Par comparaison, le trans-fert direct dans le DMEM conduità une agglomération immédiate– qui reste cependant limitée etpermet certaines études – et à unerelative stabilité sur environ 24h.En toxicologie cellulaire, on étu-die la pénétration des NP dans lescellules (6) ainsi que leur impactsur le métabolisme, notammentla génotoxicité induite et l’appa-rition d’un stress oxydant avec lagénération anormales de grandequantité d’espèces réactives del’oxygène (ERO : anion super-oxyde, peroxyde d’hydrogène etradical hydroxyl) (7). Différentessuspensions ont été élaborées soiten dispersant les NP par ultrasonshaute puissance, soit sans disper-sion, par transfert direct dans leDMEM ou via une étape d’enro-bage par le SVF avant transfertdans le DMEM. La générationd’ERO sur les différentes suspen-sions montre des différencessignificatives reliées à l’enrobageet/ou à la qualité de la dispersion(figure ci-dessus). En particulierl’enrobage par le SVF conduit àune nette diminution de la quan-tité d’ERO produite, donc poten-tiellement à une toxicité moindre.

Dans le cas des cellules pro-caryotes, les milieux de culturegénéralement utilisés pour lacroissance des bactéries – le milieuLB (Luria-Bertini), par exemple –conduisent à une précipitationquasi-immédiate des particules,attribuée principalement à laprésence des sels du milieu.Contrairement au cas du DMEM,l’agglomération est trop impor-tante et ne permet pas d’observerl’interaction entre les micro-orga-nismes et les NP. Il n’est pas nonplus possible de cultiver les bac-téries dans l’eau pure, qui necontient pas les éléments nutritifs

UN MAÎTRE-MOT :PLURIDISCIPLINARITÉ

Les modes de production indus-trielle de NP en phase gazeuseconduisent le plus souvent à la formation d’agglomérats oud’agrégats. Afin de répondre au questionnement concernantl’exposition aux NP, des études in vitro et in vivo sont indispen-sables. Les études in vitro visantà comprendre les mécanismesmoléculaires et cellulaires d’in-teraction tant pour les celluleseucaryotes que procaryotes,nécessitent de travailler avec desNP aussi dispersées que possibles.Au-delà d’une caractérisationdétaillée des NP et de leur dis-persion nécessaire avant touteétude d’interaction, il faut aussien caractériser la dispersion– voire l’état de surface, l’en-robage… – au cours des étudesd’exposition. La mise au point deprotocoles normalisés permettantla comparaison entre études estaussi un des sujets importantsd’actualité de ce domaine derecherches. Ce travail est, paressence, pluridisciplinaire et saréussite repose sur des allers-retours fréquents entre biologisteset physico-chimistes. �

Génération d’ERO pour dessuspensions non dispersées oudispersées par des ultrasonshaute puissance et transféréesdans le milieu avec ou sansenrobage par le SVF.

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Interférences possiblesd’une nanoparticuleavec les bactéries? : mécanismes en cours

d’investigation

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*2 Ligand qui permet de complexer fortement

les métaux

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